JP2013033274A - Microscope objective and fluorescent observation apparatus using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、顕微鏡対物レンズ及びそれを用いた蛍光観察装置に関する。 The present invention relates to a microscope objective lens and a fluorescence observation apparatus using the same.
従来から、生物試料の内部の分子挙動の観察に蛍光タグをつけた蛍光観察装置が多く用いられている。蛍光タグは蛍光物質を特定の生物学的な分子に結びつけることによって、生物内の分子の挙動や結合状態や運動状態などを観察することが可能となる。ここで蛍光タグとして使われるものとして、蛍光色素や蛍光たんぱく質や量子ドットなどが知られている。 Conventionally, a fluorescence observation apparatus with a fluorescent tag is often used for observation of molecular behavior inside a biological sample. A fluorescent tag binds a fluorescent substance to a specific biological molecule, so that the behavior, binding state, movement state, etc. of the molecule in the living organism can be observed. Here, fluorescent dyes, fluorescent proteins, quantum dots, and the like are known as fluorescent tags.
また、近年の特徴として、蛍光タグの多色化が挙げられる。蛍光タグを多色化すると複数種類の分子を区別して観察することができ、生体内の分子たちの相互作用などの複雑な現象を捉えることもできる。 In addition, as a feature in recent years, there is an increase in the number of colors of fluorescent tags. When the fluorescent tag is multicolored, a plurality of types of molecules can be distinguished and observed, and complicated phenomena such as interactions between molecules in the living body can be captured.
そしてこの蛍光タグの多色化によって、蛍光観察では従来よりも広い波長の範囲が利用されるようになった。
また、例えばKaedeやPA−GFPなどのフォトアクチベーション蛍光タンパク質では440nmや405nmの波長が用いられる。この様な短波長光は従来ではあまり利用されてこなかった光である。その結果、従来よりも広い波長域で収差補正がされた対物レンズに対する要求が高まっている。
With the increase in the number of colors of the fluorescent tag, a wider wavelength range than in the past has been used for fluorescence observation.
For example, wavelengths of 440 nm and 405 nm are used for photoactivation fluorescent proteins such as Kaede and PA-GFP. Such short wavelength light is light that has not been used so far. As a result, there is an increasing demand for objective lenses that have been corrected for aberrations in a wider wavelength range than before.
一方で近年では、生物試料の観察対象も例えば細胞内の構造から分子レベルの挙動を観察することが多くなり、顕微鏡における試料平面内および光軸方向の分解能の要求レベルも高くなっている。また、共焦点顕微鏡の普及により、高分解能で観測することが可能になっている。つまり、高分解能を達成するための高開口数の対物レンズに対する要求も高い。 On the other hand, in recent years, the observation target of a biological sample often observes behavior at the molecular level from, for example, the structure in the cell, and the required level of resolution in the sample plane and in the optical axis direction in the microscope has increased. Moreover, with the widespread use of confocal microscopes, it is possible to observe with high resolution. That is, there is a high demand for an objective lens with a high numerical aperture for achieving high resolution.
以下に示す特許文献1と特許文献2では蛍光観察に適した高開口数の顕微鏡対物レンズが提案されている。しかしながら、これらの顕微鏡対物レンズでは上記のような背景による要求を十分には満たしてはいないといえる。 In Patent Document 1 and Patent Document 2 shown below, a microscope objective lens having a high numerical aperture suitable for fluorescence observation is proposed. However, it can be said that these microscope objective lenses do not sufficiently satisfy the above-described background requirements.
従来のアポクロマート顕微鏡対物レンズは、g線(435.83nm)〜C線(656.27nm)の波長域で収差補正を行うのが一般的であった。よって、近年では重要になっている405nmでの収差補正が十分でない場合があった。 Conventional apochromatic microscope objective lenses generally perform aberration correction in the wavelength range of g-line (435.83 nm) to C-line (656.27 nm). Therefore, aberration correction at 405 nm, which has become important in recent years, may not be sufficient.
また、従来のアポクロマート対物レンズは目視による観察を想定したものが多く、最近のレーザ走査型顕微鏡の解像度に対応しきれていない場合があった。
また、対物レンズの軸上色収差に起因して、対物レンズに入射する照明光の大きさによって集光位置が異なる場合があった。例えば、対物レンズの瞳を完全に満たす照明光束の場合と、対物レンズの瞳を完全には満たさない照明光束の場合では、照明光束の集光する位置が異なる。この現象は従来の対物レンズでは、NAに対する球面収差量の特性が波長ごとに異なることによって起きていた。
Further, many conventional apochromat objective lenses are assumed to be observed visually, and there are cases where the resolution of recent laser scanning microscopes cannot be fully met.
In addition, due to the longitudinal chromatic aberration of the objective lens, the condensing position may vary depending on the size of the illumination light incident on the objective lens. For example, the position where the illumination light beam is collected differs between an illumination light beam that completely fills the pupil of the objective lens and an illumination light beam that does not completely fill the pupil of the objective lens. This phenomenon has occurred in the conventional objective lens because the characteristic of the spherical aberration amount with respect to NA differs for each wavelength.
これにより、複数の波長の蛍光タグを同時に使用した場合、本来同じ場所にある複数の蛍光タグが、対物レンズの軸上色収差や倍率色収差に起因して、異なる場所にあるという間違った結果が観測される場合があった。或いは、本来異なる場所にある複数の蛍光タグが、対物レンズの軸上色収差や倍率色収差に起因して、同じ場所にあるという間違った結果が観測される場合があった。 As a result, when fluorescent tags with multiple wavelengths are used at the same time, the wrong result is observed that multiple fluorescent tags that are originally in the same location are in different locations due to axial chromatic aberration and lateral chromatic aberration of the objective lens. There was a case. Alternatively, a wrong result that a plurality of fluorescent tags originally located in different places are located at the same place may be observed due to axial chromatic aberration and lateral chromatic aberration of the objective lens.
本発明の目的は、蛍光タグの多色化に対応する波長域で収差補正された顕微鏡対物レンズを提供することである。また、複数の蛍光タグを用いて観察する場合でも最適な蛍光観察装置を提供することである。 An object of the present invention is to provide a microscope objective lens in which aberration correction is performed in a wavelength region corresponding to the multicolorization of a fluorescent tag. Another object of the present invention is to provide an optimum fluorescence observation apparatus even when observing using a plurality of fluorescence tags.
本発明の課題は、物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成され、前記正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズと2つの正の単レンズとからなり、前記正のレンズ群Gbは、1つの3枚接合の接合レンズからなり、前記レンズ群Gcは、少なくとも1つ以上の接合レンズを含み、前記レンズ群Gdは、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状のものであり、前記レンズ群Geは、物体側に強い凹面を向けた負レンズを含み、H1をレンズ群Gbから射出するマージナル光線の光線高、H2をレンズ群Gdに入射するマージナル光線の光線高、fを対物レンズ全系の焦点距離、f(Gb)をレンズ群Gbの焦点距離としたときに、次の条件式(1)および(2)を満足する液浸系顕微鏡対物レンズによって解決される。
(1) 0.5 ≦ H2/H1 ≦ 0.75
(2) 7.8 ≦ | f(Gb)/f | ≦ 20
条件式(1)は軸上色収差を良好に補正するための条件である。条件式(1)により、レンズ群Gbからレンズ群Gdへの光線高を規定し軸上色収差を補正しやすくしている。条件式(1)の下限を下回ると、レンズ群Gbからレンズ群Gdへの光線高が低くなりすぎて、像面湾曲やコマ収差を補正することが困難となる。条件式(1)の上限を超えると、レンズ群Gbからレンズ群Gdへの光線高が高くなりすぎて、軸上色収差を良好に補正することが困難となる。ここではマージナル光線は、対物レンズのNAにより決まる軸上従属光線の最も光線高の高いものとする。
The subject of the present invention is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side, and the positive lens group Ga is flat on the object side. A cemented lens in which a meniscus lens with a concave surface facing the object side is cemented with two positive single lenses, and the positive lens group Gb is composed of a single cemented lens with three lenses, The lens group Gc includes at least one cemented lens, the lens group Gd has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side, and the lens group Ge faces a strong concave surface toward the object side. H1 is the height of the marginal ray that exits from the lens group Gb, H2 is the height of the marginal ray that is incident on the lens group Gd, f is the focal length of the entire objective lens system, and f (Gb) is the lens When the focal length of the group Gb, are solved by the immersion microscope objective lens satisfies the following condition (1) and (2).
(1) 0.5 ≦ H2 / H1 ≦ 0.75
(2) 7.8 ≦ | f (Gb) / f | ≦ 20
Conditional expression (1) is a condition for satisfactorily correcting axial chromatic aberration. Conditional expression (1) prescribes the ray height from the lens group Gb to the lens group Gd and makes it easy to correct axial chromatic aberration. If the lower limit of conditional expression (1) is not reached, the light ray height from the lens group Gb to the lens group Gd becomes too low, and it becomes difficult to correct field curvature and coma. If the upper limit of conditional expression (1) is exceeded, the ray height from the lens group Gb to the lens group Gd becomes too high, and it becomes difficult to correct axial chromatic aberration well. Here, it is assumed that the marginal ray has the highest ray height of the axial dependent rays determined by the NA of the objective lens.
条件式(2)は球面収差等の諸収差を良好に補正するための条件である。条件式(2)により、レンズ群Gbのパワーを規定している。条件式(2)の下限を下回ると、レンズ群Gbのパワーが強くなりすぎて、ここでの球面収差の発生量が大きくなりすぎる。条件式(2)の上限を超えると、レンズ群Gbのパワーが弱くなりすぎて、条件式(1)を満たすことが困難となり、軸上色収差を良好に補正できなくなる。なお、次の条件式
(1)’ 0.55 ≦ H2/H1 ≦ 0.73
(2)’ 8 ≦ | f(Gb)/f | ≦ 20
を満たすことがより好ましい。
Conditional expression (2) is a condition for satisfactorily correcting various aberrations such as spherical aberration. Conditional expression (2) defines the power of the lens group Gb. If the lower limit of conditional expression (2) is not reached, the power of the lens group Gb becomes too strong, and the amount of spherical aberration generated here becomes too large. If the upper limit of conditional expression (2) is exceeded, the power of the lens group Gb becomes too weak, making it difficult to satisfy conditional expression (1), and axial chromatic aberration cannot be corrected well. The following conditional expression (1) ′ 0.55 ≦ H2 / H1 ≦ 0.73
(2) ′ 8 ≦ | f (Gb) / f | ≦ 20
It is more preferable to satisfy.
前記レンズ群Geは、物体側に強い凹面を向けた負レンズLenと、正レンズLepとを含み、νd(Len)を負レンズLenのガラスのアッベ数、νd(Lep)を正レンズLepのガラスのアッベ数としたときに、次の条件式を満たすことが望ましい。
(3)’ 45 ≧ νd(Len)−νd(Lep) ≧ 30
条件式(3)’は、レンズ群Geの負レンズと正レンズのアッベ数の差を大きくし、倍率の色収差を補正するための条件である。条件式の下限値を下回ると、倍率の色収差が補正不足となる。対物レンズ単独で軸上色収差および倍率色収差を補正するコンペンゼーションフリー対物レンズは、組み合わせるユニット(結像光学系や照明光学系)を選択する自由度が増える。
さらに、H3を前記レンズ群Geから射出するマージナル光線の光線高としたときに、次の条件式
(6) 0.5 ≦ H3/H1 ≦ 0.65
を満足することが望ましい。
条件式(6)は諸収差を良好に補正するための条件である。条件式(6)の下限値を下回ると、レンズ群Gaおよびレンズ群Gbのパワーが弱くなりすぎ、レンズ群Gc以降の後群に強いパワーが必要となり、後群での諸収差の発生量が大きくなる。条件式の上限値を上回ると、レンズ群Gaおよびレンズ群Gbのパワーが強くなりすぎ、レンズ群Gaおよびレンズ群Gbでの諸収差の発生量が大きくなる。
The lens group Ge includes a negative lens Len having a strong concave surface facing the object side and a positive lens Lep, and νd (Len) is the Abbe number of the glass of the negative lens Len, and νd (Lep) is the glass of the positive lens Lep. It is desirable to satisfy the following condition when the Abbe number is:
(3) '45 ≧ νd (Len) −νd (Lep) ≧ 30
Conditional expression (3) ′ is a condition for increasing the Abbe number difference between the negative lens and the positive lens in the lens group Ge and correcting the chromatic aberration of magnification. If the lower limit value of the conditional expression is not reached, the chromatic aberration of magnification becomes insufficiently corrected. A compensation-free objective lens that corrects longitudinal chromatic aberration and lateral chromatic aberration with an objective lens alone increases the degree of freedom in selecting a unit to be combined (imaging optical system or illumination optical system).
Furthermore, when H3 is the height of the marginal ray emitted from the lens group Ge, the following conditional expression (6) 0.5 ≦ H3 / H1 ≦ 0.65
It is desirable to satisfy
Conditional expression (6) is a condition for satisfactorily correcting various aberrations. If the lower limit of conditional expression (6) is not reached, the powers of the lens group Ga and the lens group Gb become too weak, and a strong power is required for the rear group after the lens group Gc, and the amount of various aberrations generated in the rear group. growing. If the upper limit value of the conditional expression is exceeded, the power of the lens group Ga and the lens group Gb becomes too strong, and the amount of various aberrations generated in the lens group Ga and the lens group Gb increases.
前記正レンズLepの光学ガラスは、Nb2O5成分、或いは、Ta2O5成分を含む光学ガラスであり、前記正レンズLepのd線の屈折率をnd(Lep)としたとき、次の条件式
(4) 1.65 ≦ nd(Lep) ≦ 1.8
(5) 25 ≦ νd(Lep) ≦ 41
を満足することが望ましい。
The optical glass of the positive lens Lep is an optical glass containing an Nb 2 O 5 component or a Ta 2 O 5 component, and when the refractive index of the d-line of the positive lens Lep is nd (Lep), Conditional expression (4) 1.65 ≦ nd (Lep) ≦ 1.8
(5) 25 ≦ νd (Lep) ≦ 41
It is desirable to satisfy
コマ収差や倍率の色収差を良好に補正するため、正レンズLepは屈折率が高く色分散の大きい(アッベ数νdの小さい)光学ガラスを用いる必要がある。Nb2O5成分、或いは、Ta2O5成分を含むこれらの光学ガラスは、屈折率が高く色分散が大きい。よって、コマ収差や倍率の色収差を良好に補正できる。更に、これらの光学ガラスは、自家蛍光が小さく、紫外域での透過率が高い。よって、蛍光観察時にコントラストが高く明るい観察が可能である。 In order to satisfactorily correct coma aberration and chromatic aberration of magnification, the positive lens Lep needs to use optical glass having a high refractive index and a large chromatic dispersion (small Abbe number νd). These optical glasses containing Nb 2 O 5 component or Ta 2 O 5 component have a high refractive index and a large chromatic dispersion. Therefore, coma and chromatic aberration of magnification can be corrected satisfactorily. Furthermore, these optical glasses have low autofluorescence and high transmittance in the ultraviolet region. Therefore, bright observation with high contrast is possible during fluorescence observation.
なお、前記レンズ群Gbは、正レンズと負レンズと正レンズとの3枚接合であることが望ましい。マージナル光線の光線高が高いレンズ群Gbに3枚接合レンズを配置することで、軸上色収差を良好に補正できる。 In addition, it is desirable that the lens group Gb is a three-piece cemented structure including a positive lens, a negative lens, and a positive lens. By disposing a three-piece cemented lens in the lens group Gb having a high marginal ray height, axial chromatic aberration can be corrected well.
また、前記正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズG1と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズG2と、正の単レンズG3とからなり、f(G1+G2)を接合レンズG1とメニスカスレンズG2との合成焦点距離、fを対物レンズ全系の焦点距離、Dを接合レンズG1とメニスカスレンズG2との間のマージナル光線の長さとしたときに、次の条件式(7)(8)を満足する構成も好ましい。
(7) 1 ≦ f(G1+G2)/f ≦ 2
(8) D/f ≦ 0.6
物体からの発散光束を収斂させるために、物体側のレンズ群は強いパワーを持つのが一般的である。特にNAが大きな液浸系対物レンズは、最も物体側のレンズ群は半球に近い形状を持つのが一般的である。しかし、最も物体側のレンズ群に大きな収斂パワーを持たせると、そこで発生する球面収差や軸上色収差が大きくなりすぎて補正が困難となる。本発明では、これまでは最も物体側のレンズ群のみに持たせていた強い収斂作用を、接合レンズG1とメニスカスレンズG2の2つのレンズ群に持たせることにより、収差の発生量を低減し、かつ、収差を補正するレンズ面を増やしている。
The positive lens group Ga includes a cemented lens G1 in which a plano-convex lens having a plane facing the object side and a meniscus lens having a concave surface facing the object side, and a positive meniscus lens G2 having a concave surface facing the object side. A positive single lens G3, f (G1 + G2) is the combined focal length of the cemented lens G1 and the meniscus lens G2, f is the focal length of the entire objective lens system, and D is between the cemented lens G1 and the meniscus lens G2. A configuration that satisfies the following conditional expressions (7) and (8) when the length of the marginal ray is:
(7) 1 ≦ f (G1 + G2) / f ≦ 2
(8) D / f ≦ 0.6
In order to converge the divergent light beam from the object, the lens group on the object side generally has strong power. In particular, an immersion objective lens having a large NA generally has a lens group closest to the hemisphere on the object side. However, if the lens group closest to the object side has a large converging power, the spherical aberration and the longitudinal chromatic aberration that occur in the lens group become excessively large and correction becomes difficult. In the present invention, the two lens groups, the cemented lens G1 and the meniscus lens G2, have a strong convergence effect that has been given only to the most object-side lens group until now, thereby reducing the amount of aberration generated, In addition, the number of lens surfaces for correcting aberrations is increased.
条件式(7)と(8)は、これらのレンズ群G1とG2について規定している。条件式(7)の下限を下回ると、レンズ群G1とG2のパワーが強くなりすぎ、ここでの球面収差量や軸上色収差量が増える。条件式(7)の上限を超えると、十分な収斂パワーが得られず、それ以後のレンズ群での光線高が上がり、球面収差や軸上色収差の補正が困難となる。条件式(8)の上限を超えると、レンズ群G1とG2の2つのレンズ群のパワーのバランスが保たれず、2つのレンズ群で従来の物体側レンズ群を代替するという目的を達成することができなくなる。なお、条件式(7)(8)を満たすことで、レンズ群G1が半球に近い形状になるのに加えて、レンズ群G2も半球に近い形状となる。すなわち球欠が深いレンズが2つある構成となる。この構成では、レンズ群G1の屈折力の負荷をレンズ群G2にも分担させることになり、レンズ群G1のレンズ厚の公差の影響をレンズ群G2に分散させることができ、レンズ群G1の加工性を良くする効果もある。 Conditional expressions (7) and (8) define these lens groups G1 and G2. If the lower limit of conditional expression (7) is not reached, the power of the lens groups G1 and G2 becomes too strong, and the amount of spherical aberration and the amount of axial chromatic aberration here increase. When the upper limit of conditional expression (7) is exceeded, sufficient convergent power cannot be obtained, and the height of light rays in the subsequent lens groups increases, making it difficult to correct spherical aberration and axial chromatic aberration. If the upper limit of conditional expression (8) is exceeded, the power balance of the two lens groups G1 and G2 is not maintained, and the objective of substituting the conventional object-side lens group with the two lens groups is achieved. Can not be. By satisfying conditional expressions (7) and (8), in addition to the lens group G1 having a shape close to a hemisphere, the lens group G2 also has a shape close to a hemisphere. That is, there are two lenses with deep spheres. In this configuration, the refractive power load of the lens group G1 is also shared by the lens group G2, and the influence of the tolerance of the lens thickness of the lens group G1 can be dispersed in the lens group G2. There is also an effect of improving the sex.
また、本発明の対物レンズの外形的特徴は、接合レンズG1の像側面の曲率半径が焦点距離fより小さく、かつ、メニスカスレンズG2の像側の曲率半径が焦点距離fの2倍よりも小さいことである。これらの特徴により、レンズ群G3以降の光線高を抑えることができ、高次の収差(球面収差、コマ収差)を補正しやすくしているのと同時に、全体のレンズの外径を小さくすることができレンズの加工性が向上している。 Further, the external features of the objective lens of the present invention are that the radius of curvature of the image side surface of the cemented lens G1 is smaller than the focal length f, and the radius of curvature of the meniscus lens G2 on the image side is smaller than twice the focal length f. That is. With these features, the height of the light beam after the lens group G3 can be suppressed, and it is easy to correct higher-order aberrations (spherical aberration, coma aberration), and at the same time, the outer diameter of the entire lens is reduced. The processability of the lens is improved.
なお、前記レンズ群Gcが光軸方向に移動可能であり、次の条件式(9)を満足することが望ましい。
(9) | f(Gc)/f | ≦ 50
ただし、fは対物レンズ全系の焦点距離、f(Gc)はレンズ群Gcの焦点距離である。
It is desirable that the lens group Gc is movable in the optical axis direction and satisfies the following conditional expression (9).
(9) | f (Gc) / f | ≦ 50
Here, f is the focal length of the entire objective lens system, and f (Gc) is the focal length of the lens group Gc.
生体細胞(屈折率1.33〜1.45)の深部を観察する場合、細胞とオイルの屈折率が近い方が屈折率の差による球面収差の発生を抑えることができる。ところが、オイルの屈折率を1.51より低いものを使用すると、カバーガラス(nd=1.52426)との屈折率差が大きくなる。そのため、カバーガラスの厚みが0.17mmからずれた場合、大きな球面収差が発生する。条件式(9)は、カバーガラスの厚みによる球面収差や、生体細胞(nd=1.33〜1.45)とオイルの屈折率差による球面収差を補正するための条件である。条件式(9)の上限を超えると、球面収差を十分に補正することができなくなる。 When observing a deep part of a living cell (refractive index: 1.33 to 1.45), the closer the refractive index of the cell and the oil, the smaller the occurrence of spherical aberration due to the difference in refractive index. However, if the oil has a refractive index lower than 1.51, the difference in refractive index from the cover glass (nd = 1.524426) becomes large. Therefore, large spherical aberration occurs when the thickness of the cover glass deviates from 0.17 mm. Conditional expression (9) is a condition for correcting spherical aberration due to the thickness of the cover glass and spherical aberration due to the refractive index difference between the living cells (nd = 1.33 to 1.45) and oil. If the upper limit of conditional expression (9) is exceeded, spherical aberration cannot be corrected sufficiently.
なお、条件式(9)の代わりに以下の条件式(10)を満たすことも考えられる。
(10) 10 ≦ |f(Gc)/f| ≦ 20
を満たすことが望ましい。この条件式の下限値を下回ると、レンズ群Gcのパワーが強くなりすぎて、レンズ群Gcでの収差の発生量が大きくなる。更に、レンズ群Gcの移動量が小さくなり、球面収差を補正する補正環の使用時に操作性が劣化する。
It may be considered that the following conditional expression (10) is satisfied instead of conditional expression (9).
(10) 10 ≦ | f (Gc) / f | ≦ 20
It is desirable to satisfy. If the lower limit value of this conditional expression is not reached, the power of the lens group Gc becomes too strong and the amount of aberration generated in the lens group Gc increases. Further, the movement amount of the lens group Gc is reduced, and the operability is deteriorated when the correction ring for correcting the spherical aberration is used.
本発明は、光源と、該光源からの光線を選択的に反射する光線分離手段と、試料を照明または観察する対物レンズと、試料を固定するステージと、該光線分離手段を通過した光線のうち所望の波長領域を選択する波長選択手段と、該波長選択手段を通過する光を検出する検出器を備えた蛍光観察装置において、2つ以上の波長で試料の照明を行ったときに得られる散乱または蛍光による2つ以上の波長を検出し、該照明における励起波長のうちで最も長波長側のものをλ1、最も短波長側のものをλ2とし、Δ1とΔ2をλ1とλ2の軸上の集光位置としたときに、以下の条件を満たすことを特徴とする蛍光観察装置によっても特徴付けられる。
(11) λ1−λ2≧180nm
(12) |Δ1−Δ2|<0.2μm
(11)と(12)式を満たすことができれば、試料内を複数の蛍光タグで染色しても色収差は無視できるレベルとなる。
The present invention relates to a light source, a light beam separating unit that selectively reflects light beams from the light source, an objective lens that illuminates or observes a sample, a stage that fixes the sample, and a light beam that has passed through the light beam separating unit. Scattering obtained when illuminating a sample at two or more wavelengths in a fluorescence observation apparatus equipped with a wavelength selection means for selecting a desired wavelength region and a detector for detecting light passing through the wavelength selection means Alternatively, two or more wavelengths due to fluorescence are detected, and among the excitation wavelengths in the illumination, the longest wavelength side is λ1, the shortest wavelength side is λ2, and Δ1 and Δ2 are on the axes of λ1 and λ2. It is also characterized by a fluorescence observation apparatus characterized by satisfying the following conditions when the light collecting position is set.
(11) λ1-λ2 ≧ 180nm
(12) | Δ1-Δ2 | <0.2 μm
If the expressions (11) and (12) can be satisfied, the chromatic aberration can be ignored even if the sample is stained with a plurality of fluorescent tags.
さらに、以下の条件を満たすことが望ましい。
(13) λ2≦442nm
近年蛍光タグには短波長側の刺激光を与えると特性が変化するフォトアクチベーション蛍光タグが用いられるようになっている。たとえばカエデやPA−GFPなどのフォトコンバージョン蛍光たんぱく質では405nmの波長を用いることが一般的である。また、442nmはCFP−YFPの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の観察などで用いられるため、(13)式を満たすとフォトアクチベーションや蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の観察に対応することが可能となる。
Furthermore, it is desirable to satisfy the following conditions.
(13) λ2 ≦ 442nm
In recent years, photo-activated fluorescent tags whose characteristics change when stimulating light on the short wavelength side is given to fluorescent tags have been used. For example, a wavelength of 405 nm is generally used for photoconversion fluorescent proteins such as maple and PA-GFP. In addition, since 442 nm is used for observation of fluorescence resonance energy transfer (FRET) of CFP-YFP, it is possible to cope with observation of photoactivation and fluorescence resonance energy transfer (FRET) when Expression (13) is satisfied. .
さらに、以下の条件を満たすことが望ましい。
(14) |δ1−δ2|≦0.3μm
ここでδ1とδ2はそれぞれλ1とλ2の視野数9での倍率の色収差を示す。
Furthermore, it is desirable to satisfy the following conditions.
(14) | δ1-δ2 | ≦ 0.3 μm
Here, δ1 and δ2 indicate the chromatic aberration of magnification at the field number 9 of λ1 and λ2, respectively.
このとき、前記対物レンズは、物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成され、前記正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズと正の単レンズとを含み、前記正のレンズ群Gbは、接合レンズからなり、前記レンズ群Gcは、少なくとも1つ以上の接合レンズを含み、前記レンズ群Gdは、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状のものであり、前記レンズ群Geは、物体側に強い凹面を向けた負レンズを含み、前記レンズ群Gbは正レンズと負レンズと正レンズとの3枚接合であることが考えられる。この構成の対物レンズを蛍光観察装置に利用することが、課題解決の一手段である。 At this time, the objective lens is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side. The positive lens group Gb includes a cemented lens, and the lens group Gc includes a cemented lens obtained by cementing a plano-convex lens having a flat surface facing the lens and a meniscus lens having a concave surface facing the object side. The lens group Gd includes at least one cemented lens, the lens group Gd has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side, and the lens group Ge includes a negative lens with a strong concave surface facing the object side, It is conceivable that the lens group Gb is a three-piece cemented structure including a positive lens, a negative lens, and a positive lens. Utilizing the objective lens having this configuration in a fluorescence observation apparatus is one means for solving the problem.
さらに、前記対物レンズが以下の条件を満たすことが望ましい。
(1) 0.5 ≦ H2/H1 ≦ 0.75
(2) 7.8 ≦ f(Gb)/f ≦ 20
さらに、前記対物レンズが単独で色収差を行っていることが望ましい。単独で色収差を補正した場合、組み合わせるユニット(結像光学系や照明光学系)を選択する自由度が増える。
Furthermore, it is desirable that the objective lens satisfies the following conditions.
(1) 0.5 ≦ H2 / H1 ≦ 0.75
(2) 7.8 ≦ f (Gb) / f ≦ 20
Furthermore, it is desirable that the objective lens has chromatic aberration alone. When chromatic aberration is corrected independently, the degree of freedom for selecting a unit to be combined (imaging optical system or illumination optical system) increases.
本発明による蛍光観察装置において、該励起波長λ1とλ2で該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成されるそれぞれ2つの画像を保存する画像保存手段と、該画像の重ね合せまたは差分または比率計算を行う画像解析手段とを備え、2つの画像の重ね合わせまたは差分または比率計算を行うことは好適である。 In the fluorescence observation apparatus according to the present invention, image storage means for storing two images respectively formed from detection results of the detector when the sample is illuminated with the excitation wavelengths λ1 and λ2, and It is preferable to provide image analysis means for performing superposition or difference or ratio calculation, and to perform superposition or difference or ratio calculation of two images.
また、該励起波長λ1とλ2とで励起した画像を保存する画像保存手段と、該画像の重ね合せまたは差分または比率計算を行う画像解析手段を備え、複数の画像の重ね合わせまたは差分または比率計算により蛍光タグで染色した試料内分子の解析が容易になる。近年FRETのように複数の蛍光波長のレシオをとって分子解析することが多くなっている。この場合は本発明のような色収差が補正された蛍光観察装置が適している。 Further, the image storage means for storing the images excited at the excitation wavelengths λ1 and λ2 and the image analysis means for performing the superposition or difference or ratio calculation of the images are provided, and the superposition, difference or ratio calculation of a plurality of images is performed. This facilitates analysis of molecules in the sample stained with a fluorescent tag. In recent years, molecular analysis is often performed by taking a ratio of a plurality of fluorescence wavelengths as in FRET. In this case, a fluorescence observation apparatus with corrected chromatic aberration as in the present invention is suitable.
また、本発明の実施では、該ステージまたは該対物レンズが光軸方向に移動可能であり、
該試料と該対物レンズの間隔を複数変えて該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を取得し、該取得された画像のうち該励起波長λ1、λ2で該試料の照明を行ったときの画像を各断面位置での画像保存位置に保存し、該試料と対物レンズの間隔が同じ位置で取得されたλ1、λ2の画像の演算を行うことが好適である。
In the implementation of the present invention, the stage or the objective lens is movable in the optical axis direction,
An image formed from the detection result of the detector when the sample is illuminated with a plurality of intervals between the sample and the objective lens is acquired, and among the acquired images, the excitation wavelengths λ1 and λ2 It is preferable that the image when the sample is illuminated is stored in the image storage position at each cross-sectional position, and the images of λ1 and λ2 obtained at the same position between the sample and the objective lens are calculated. It is.
色収差の補正された本システムでは試料の3次元像の構築に有効である。軸上色収差がある場合、λ1、λ2での光軸方向の像位置が光軸方向にずれてしまう。このためλ1、λ2の画像を重ね合わせる場合、従来では対物レンズの軸上色収差分の異なった断面位置の像の重ね合わせを必要としていた。本システムでは軸上色収差が無視できるほど小さいため、正確な3次元像構築が可能である。 This system with corrected chromatic aberration is effective for constructing a three-dimensional image of a sample. When there is axial chromatic aberration, the image position in the optical axis direction at λ1 and λ2 is shifted in the optical axis direction. For this reason, when images of λ1 and λ2 are superimposed, conventionally, it is necessary to superimpose images at different cross-sectional positions corresponding to the axial chromatic aberration of the objective lens. In this system, since the axial chromatic aberration is so small that it can be ignored, an accurate three-dimensional image can be constructed.
本発明による蛍光観察装置において、試料面にビームスポットを走査する走査手段をもち、共焦点式の検出手段を持つことは好ましい。
本発明は軸上色収差を補正しているため、前述の通り、試料の3次元像を観察することに適している。このため、3次元的な検出が可能となる共焦点式の検出手段をもっていることが望ましい。
In the fluorescence observation apparatus according to the present invention, it is preferable to have a scanning means for scanning the sample surface with a beam spot and to have a confocal detection means.
Since the present invention corrects axial chromatic aberration, it is suitable for observing a three-dimensional image of a sample as described above. For this reason, it is desirable to have a confocal detection means that enables three-dimensional detection.
また、本発明の実施による蛍光観察装置において、該複数のレーザ光源を備え、該複数波長のレーザを同一光路上に合成し、1本のファイバで蛍光観察装置に導入することが望ましい。 In the fluorescence observation apparatus according to the embodiment of the present invention, it is preferable that the plurality of laser light sources are provided, the lasers of the plurality of wavelengths are synthesized on the same optical path, and introduced into the fluorescence observation apparatus with one fiber.
通常レーザ光を顕微鏡に導入する場合は、システムレイアウトの自由度の高い光ファイバを用いることが多い。従来は、大きく異なる波長のレーザを顕微鏡に導入する場合に複数の光ファイバを用いることが多かった。波長が大きく異なることによる色収差はファイバの後段に配置されたコリメータの調整により補正可能であったが、各ファイバの調整が複雑であることが問題であった。近年に対応波長域の広い光ファイバが開発されてきた。この光ファイバを用いれば、本システムのような軸上色収差が十分補正されているシステムにきわめて有効である。 Usually, when laser light is introduced into a microscope, an optical fiber having a high degree of freedom in system layout is often used. Conventionally, a plurality of optical fibers are often used when lasers having greatly different wavelengths are introduced into a microscope. Chromatic aberration due to a large difference in wavelength can be corrected by adjusting a collimator arranged at the subsequent stage of the fiber, but the problem is that the adjustment of each fiber is complicated. In recent years, optical fibers having a wide wavelength range have been developed. Use of this optical fiber is extremely effective for a system in which longitudinal chromatic aberration is sufficiently corrected, such as this system.
本発明の実施による蛍光観察装置において、複数の蛍光タグにより標識された試料において、λ1とλ2の励起波長により取得された画像を重ね合わせ出力するとこにより2つ以上の標識された試料内分子の位置情報を解析することは好適である。 In the fluorescence observation apparatus according to the embodiment of the present invention, in a sample labeled with a plurality of fluorescent tags, the images acquired with the excitation wavelengths of λ1 and λ2 are superimposed and output, whereby two or more labeled molecules in the sample are detected. It is preferable to analyze the position information.
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)やフォトコンバージョンを使った観察の場合、2つの蛍光波長の重ね合わせ、またはその比率を求める必要がある。この場合、色収差があると画像の重ね合わせにずれが生じて、正確なデータが得られない可能性がある。本システムは異なる波長を重ね合わせた場合でも波長による位置ずれが少ないため、試料内の分子の正確な位置情報を得るのに優れている。 In the case of observation using fluorescence resonance energy transfer (FRET) or photoconversion, it is necessary to obtain a superposition of two fluorescence wavelengths or a ratio thereof. In this case, if there is chromatic aberration, there is a possibility that the overlay of the images is shifted and accurate data cannot be obtained. This system is excellent in obtaining accurate positional information of molecules in a sample because there is little positional shift due to wavelengths even when different wavelengths are superimposed.
本発明の実施による蛍光観察装置において、λ1とλ2の励起波長により該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を時間の経過に応じて複数取得し、該同一時刻に取得された時間経過のλ1とλ2における画像の比率を複数とることにより試料内の分子間の蛍光共鳴エネルギー移動を観察することは好適である。 In the fluorescence observation apparatus according to the embodiment of the present invention, a plurality of images formed from the detection results of the detector when the sample is illuminated with the excitation wavelengths of λ1 and λ2 are obtained as time passes, It is preferable to observe the fluorescence resonance energy transfer between molecules in the sample by taking a plurality of ratios of the images at λ1 and λ2 of the elapsed time acquired at the same time.
従来の共焦点顕微鏡では試料の3次元像を得るときに問題となる対物レンズの色収差を、複数の蛍光像を重ね合わせするときに、光軸方向に異なる断面の画像を重ねて表示する場合があった。このようにすれば、静止した試料での3次元像を得るときには問題ないが、細胞内の分子移動を見る場合は光軸方向に異なる断面を見る必要があり、波長により時間差が生じる。このため、この従来の方法ではたとえば細胞内の速い分子運動を見ることはできない。しかし、本発明のような色収差が補正された蛍光観察装置では速い分子運度も観察することが可能となる。 In conventional confocal microscopes, chromatic aberration of the objective lens, which is a problem when obtaining a three-dimensional image of a sample, may be displayed by superimposing images of different cross sections in the optical axis direction when a plurality of fluorescent images are superimposed. there were. In this way, there is no problem when obtaining a three-dimensional image with a stationary sample. However, when looking at the movement of molecules in a cell, it is necessary to look at different cross sections in the optical axis direction, and a time difference occurs depending on the wavelength. For this reason, for example, fast molecular motion in a cell cannot be observed by this conventional method. However, in the fluorescence observation apparatus in which chromatic aberration is corrected as in the present invention, it is possible to observe fast molecular mobility.
さらに、2種類以上の蛍光タグを有するサンプルの画像を取得し、得られた画像の輝度情報をピクセル毎に2次元化し、プロットすることにより各分子の局在を推定する分子局在判定をすることも好ましい。 Furthermore, it obtains an image of a sample having two or more types of fluorescent tags, makes the luminance information of the obtained image two-dimensional for each pixel, and plots the molecular localization to estimate the localization of each molecule. It is also preferable.
2種類以上の蛍光タグを有するサンプルの画像を取得し、得られた画像の輝度情報をピクセル毎に2次元化し、プロットすることにより各分子の局在を推定する方法はコローカリゼーションと呼ばれ、2つの分子が結合しているかどうかの判定に用いる。このような観察においても本発明の色収差が補正された本発明は優れている。 A method of obtaining the image of a sample having two or more types of fluorescent tags, two-dimensionally luminance information of the obtained image for each pixel, and estimating the localization by plotting is called colocalization, Used to determine whether two molecules are bound. Even in such observation, the present invention in which the chromatic aberration of the present invention is corrected is excellent.
本発明の実施による蛍光観察装置において、ある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定部分のみ光を照射して蛍光退色を行い、指定領域内または指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子拡散を検出することは好適である。 In the fluorescence observation apparatus according to the embodiment of the present invention, a sample image formed from the detection result of the detector when excitation with a certain wavelength is performed is output on a monitor, and a part of the sample image output on the monitor It is preferable to detect the molecular diffusion in the sample by designating the region, performing fluorescence fading by irradiating only the designated portion with light, and recording the temporal change of the fluorescence image inside or outside the designated region.
試料画像をある波長により取得し、モニタ上に出力し、モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定部分のみ光を照射して蛍光退色を行い、指定領域内または指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子拡散を求める方法はFRAPと呼ばれる手法である。この手法においても本発明のような色収差が補正された蛍光観察装置は適している。 A sample image is acquired at a certain wavelength, output on a monitor, a partial region of the sample image output on the monitor is specified, light is emitted only to the specified portion, and fluorescence fading is performed. A method for obtaining the molecular diffusion in the sample by recording the temporal change of the fluorescent image outside the region is a technique called FRAP. Also in this method, the fluorescence observation apparatus in which the chromatic aberration is corrected as in the present invention is suitable.
本発明の実施による蛍光観察装置において、試料画像をある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定部分のみ光を照射して試料内蛍光色素のアクチベーションを行い、指定領域内または指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子分析を行うことは好適である。 In the fluorescence observation apparatus according to the embodiment of the present invention, the sample image formed from the detection result of the detector when the sample image is excited by a certain wavelength is output on the monitor, and the sample image output on the monitor Designate a partial area of the sample, irradiate only the designated area with light to activate the fluorescent dye in the sample, record the temporal change of the fluorescent image in the designated area or outside the designated area, and perform molecular analysis in the sample That is preferred.
前述の通り、カエデやPA−GFPのように405nmの波長の光を用いてフォトコンバージョンする蛍光たんぱく質を用いる場合でも本発明のような蛍光観察装置は色収差が少ないため優れている。 As described above, even when a fluorescent protein that performs photoconversion using light having a wavelength of 405 nm, such as maple or PA-GFP, a fluorescence observation apparatus such as the present invention is excellent because it has little chromatic aberration.
本発明の実施による蛍光観察装置において、試料内に複数の蛍光タグをつけた分子が存在し、複数の励起光を同時に照射し、得られる蛍光を分離してλ1、λ2に相当する蛍光波長を検出し、検出された蛍光の時間変化を記録し、蛍光相互相関分光法によって試料内分子の拡散速度を求めることは好適である。 In the fluorescence observation apparatus according to the embodiment of the present invention, there are molecules with a plurality of fluorescent tags in the sample, a plurality of excitation lights are irradiated simultaneously, and the obtained fluorescence is separated to obtain fluorescence wavelengths corresponding to λ1 and λ2. It is preferable to detect, record the time variation of the detected fluorescence, and obtain the diffusion rate of the molecules in the sample by fluorescence cross-correlation spectroscopy.
蛍光の時間変化を記録し相関関数を計算する手法として代表的なものにFCSとFCCS呼ばれるものがある。この手法で複数の励起波長を用いて複数の蛍光波長を検出すると分子が結合しているかが分かる。この場合、試料への集光スポットが励起波長でずれがないことが必要のため、本発明の蛍光観察装置が適している。 Typical techniques for recording changes in fluorescence and calculating correlation functions include FCS and FCCS. If a plurality of fluorescence wavelengths are detected using a plurality of excitation wavelengths by this method, it can be seen whether molecules are bound. In this case, since it is necessary that the focused spot on the sample is not shifted by the excitation wavelength, the fluorescence observation apparatus of the present invention is suitable.
本発明によると、405nmから656nmまでの波長域で収差補正された顕微鏡対物レンズを提供することができる。また、複数の蛍光タグを用いて観察する場合でも最適な蛍光観察装置を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a microscope objective lens whose aberration is corrected in a wavelength region from 405 nm to 656 nm. In addition, an optimal fluorescence observation apparatus can be provided even when observation is performed using a plurality of fluorescence tags.
次に本発明の顕微鏡対物レンズの実施の形態を各実施例にもとづいて説明する。
ただし、実施例中において、sは各レンズ面の面番号、rは各レンズ面の曲率半径(単位mm)、dは各レンズ面間の間隔(単位mm)、ndは各レンズのd線の屈折率、νdは各レンズのd線におけるアッベ数である。また、βは倍率、NAは開口数、WDは作動距離(単位mm)、fは対物レンズ全系の焦点距離(単位mm)、f(G1+G2)は第1レンズ群と第2レンズ群との合成焦点距離(単位mm)、f(Ga)〜f(Ge)はレンズ群Ga〜レンズ群Geの各レンズ群の焦点距離(単位mm)、H1はレンズ群Gbから射出するマージナル光線の光線高(単位mm)、H2はレンズ群Gdに入射するマージナル光線の光線高(単位mm)、H3は対物レンズ射出側のマージナル光線の光線高(単位mm)である。
Next, an embodiment of the microscope objective lens of the present invention will be described based on each example.
In the examples, s is the surface number of each lens surface, r is the radius of curvature (unit mm) of each lens surface, d is the distance (unit mm) between the lens surfaces, and nd is the d-line of each lens. Refractive index, νd is the Abbe number of each lens at the d-line. Β is a magnification, NA is a numerical aperture, WD is a working distance (unit: mm), f is a focal length (unit: mm) of the entire objective lens system, and f (G1 + G2) is a first lens group and a second lens group. And f (Ga) to f (Ge) are the focal lengths (unit mm) of the lens groups Ga to Ge, and H1 is the marginal ray emitted from the lens group Gb. The ray height (unit: mm), H2 is the ray height (unit: mm) of the marginal ray incident on the lens group Gd, and H3 is the ray height (unit: mm) of the marginal ray on the objective lens exit side.
下記の各実施例で用いられる光学ガラスは、紫外域での透過率が優れ、自家蛍光の少ない光学ガラスを選択しており、各実施例は蛍光観察に最適な対物レンズとなっている。また、各光学ガラスは、環境対応ガラス(鉛フリーガラス)を選択しており、各実施例は環境に配慮した対物レンズとなっている。 As the optical glass used in each of the following examples, an optical glass having excellent transmittance in the ultraviolet region and low self-fluorescence is selected, and each example is an objective lens optimal for fluorescence observation. Further, as each optical glass, environmentally friendly glass (lead-free glass) is selected, and each example is an objective lens considering the environment.
なお、各媒質の各波長の屈折率は以下のとおりである。 In addition, the refractive index of each wavelength of each medium is as follows.
(結像レンズA)
(Imaging lens A)
ただし、収差図の光線追跡は、結像面(受光面)から物体面(試料面)への方向で行い、物体面での収差を表示している。また、(a)は球面収差、(b)は正弦条件違反量、(c)は非点収差、(d)はコマ収差を示す。これらの収差図から、本発明の対物レンズは405nmから656nmまで、軸上色収差、倍率色収差等の収差が良好に補正されていることが分かる。 However, ray tracing in the aberration diagram is performed in the direction from the imaging surface (light receiving surface) to the object surface (sample surface), and aberrations on the object surface are displayed. Further, (a) shows spherical aberration, (b) shows sine condition violation amount, (c) shows astigmatism, and (d) shows coma. From these aberration diagrams, it can be seen that the objective lens of the present invention is well corrected for aberrations such as axial chromatic aberration and lateral chromatic aberration from 405 nm to 656 nm.
本発明の実施例1は、図1に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成される。正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズからなる接合レンズG1と、正の単レンズG2とによって構成される。正のレンズ群Gbは正レンズと負レンズと正レンズとからなる3枚接合レンズG3からなる。レンズ群Gcは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズG4と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズG5とにより構成される。レンズ群Gdは正レンズと負レンズとからなる接合レンズG6からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Geは物体側に強い凹面を向けた負レンズG7と正レンズG8とにより構成されている。 The first embodiment of the present invention has a configuration as shown in FIG. That is, it is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side. The positive lens group Ga includes a cemented lens G1 including a plano-convex lens having a plane facing the object side, a meniscus lens having a concave surface facing the object side, and a positive single lens G2. The positive lens group Gb includes a three-piece cemented lens G3 including a positive lens, a negative lens, and a positive lens. The lens group Gc includes a cemented lens G4 including a negative lens and a positive lens, and a cemented lens G5 including a positive lens and a negative lens. The lens group Gd includes a cemented lens G6 including a positive lens and a negative lens, and has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side. The lens group Ge includes a negative lens G7 and a positive lens G8 having a strong concave surface facing the object side.
この実施例1のレンズデータは下記の通りである。実施例1の対物レンズは、nd=1.51483,νd=41.0の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。 The lens data of Example 1 is as follows. The objective lens of Example 1 uses an immersion liquid with nd = 1.51483 and νd = 41.0. This immersion liquid is a conventionally used oil for microscope objective lenses.
f(Ga) = 4.809
f(Gb) = 27.656
f(Gc) = 156.491
f(Gd) = −97.432
f(Ge) = −32.359
f(Ga)/f = 1.60
f(Gb)/f = 9.22
f(Gc)/f = 52.16
f(Gd)/f = −32.48
f(Ge)/f = −10.79
H1 = 7.27
H2 = 5.2
H3 = 4.2
νd(Len) = 63.3
νd(Lep) = 29.8
nd(Len) = 1.61800
nd(Lep) = 1.80000
(1) H2/H1 = 0.72
(2) f(Gb)/f = 9.22
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 33.5
(6) H3/H1 = 0.58
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図2によって示される。
f (Ga) = 4.809
f (Gb) = 27.656
f (Gc) = 156.491
f (Gd) = − 97.432
f (Ge) = − 32.359
f (Ga) /f=1.60
f (Gb) /f=9.22
f (Gc) /f=52.16
f (Gd) /f=−32.48
f (Ge) /f=-10.79
H1 = 7.27
H2 = 5.2
H3 = 4.2
νd (Len) = 63.3
νd (Lep) = 29.8
nd (Len) = 1.61800
nd (Lep) = 1.80000
(1) H2 / H1 = 0.72
(2) f (Gb) /f=9.22
(3) νd (Len) −νd (Lep) = 33.5
(6) H3 / H1 = 0.58
With the configuration as described above, in this embodiment, chromatic aberration and various aberrations are corrected in the wavelength region from 405 nm to 656 nm. The state of the correction is shown in FIG.
本発明の実施例2は、図3に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成される。正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズからなる接合レンズG1と、正の単レンズG2とによって構成される。正のレンズ群Gbは正レンズと負レンズと正レンズとからなる3枚接合レンズG3からなる。レンズ群Gcは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズG4と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズG5とにより構成される。レンズ群Gdは正レンズと負レンズとからなる接合レンズG6からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Geは物体側に強い凹面を向けた負レンズG7と正レンズG8とにより構成されている。 The second embodiment of the present invention has a configuration as shown in FIG. That is, it is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side. The positive lens group Ga includes a cemented lens G1 including a plano-convex lens having a plane facing the object side, a meniscus lens having a concave surface facing the object side, and a positive single lens G2. The positive lens group Gb includes a three-piece cemented lens G3 including a positive lens, a negative lens, and a positive lens. The lens group Gc includes a cemented lens G4 including a negative lens and a positive lens, and a cemented lens G5 including a positive lens and a negative lens. The lens group Gd includes a cemented lens G6 including a positive lens and a negative lens, and has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side. The lens group Ge includes a negative lens G7 and a positive lens G8 having a strong concave surface facing the object side.
この実施例2のレンズデータは下記の通りである。実施例2の対物レンズは、nd=1.51483,νd=41.0の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。 The lens data of Example 2 is as follows. The objective lens of Example 2 uses an immersion liquid with nd = 1.51483 and νd = 41.0. This immersion liquid is a conventionally used oil for microscope objective lenses.
f(Ga) = 4.587
f(Gb) = 28.014
f(Gc) = 158.735
f(Gd) = −68.519
f(Ge) = −36.452
f(Ga)/f = 1.53
f(Gb)/f = 9.34
f(Gc)/f = 52.91
f(Gd)/f = −22.84
f(Ge)/f = −12.15
H1 = 6.91
H2 = 4.72
H3 = 4.2
νd(Len) = 70.3
νd(Lep) = 29.8
nd(Len) = 1.48745
nd(Lep) = 1.80000
(1) H2/H1 = 0.68
(2) f(Gb)/f = 9.34
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 40.5
(6) H3/H1 = 0.61
(9) |f(Gc)/f| = 52.9
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図4によって示される。
f (Ga) = 4.587
f (Gb) = 28.014
f (Gc) = 158.735
f (Gd) = − 68.519
f (Ge) = − 36.452
f (Ga) /f=1.53
f (Gb) /f=9.34
f (Gc) /f=52.91
f (Gd) /f=−22.84
f (Ge) /f=-12.15
H1 = 6.91
H2 = 4.72
H3 = 4.2
νd (Len) = 70.3
νd (Lep) = 29.8
nd (Len) = 1.48745
nd (Lep) = 1.80000
(1) H2 / H1 = 0.68
(2) f (Gb) /f=9.34
(3) νd (Len) −νd (Lep) = 40.5
(6) H3 / H1 = 0.61
(9) | f (Gc) /f|=52.9
With the configuration as described above, in this embodiment, chromatic aberration and various aberrations are corrected in the wavelength region from 405 nm to 656 nm. The state of the correction is shown in FIG.
本発明の実施例3は、図5に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成される。正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズからなる接合レンズG1と、正の単レンズG2と、正の単レンズG3と、によって構成される。正のレンズ群Gbは正レンズと負レンズと正レンズとからなる3枚接合レンズG4からなる。レンズ群Gcは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズG5と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズG6とにより構成される。レンズ群Gdは正レンズと負レンズとからなる接合レンズG7からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Geは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズG8により構成されている。 The third embodiment of the present invention has a configuration as shown in FIG. That is, it is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side. The positive lens group Ga includes a cemented lens G1 including a plano-convex lens having a plane facing the object side and a meniscus lens having a concave surface facing the object side, a positive single lens G2, and a positive single lens G3. The The positive lens group Gb includes a three-piece cemented lens G4 including a positive lens, a negative lens, and a positive lens. The lens group Gc includes a cemented lens G5 including a negative lens and a positive lens, and a cemented lens G6 including a positive lens and a negative lens. The lens group Gd includes a cemented lens G7 including a positive lens and a negative lens, and has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side. The lens group Ge includes a cemented lens G8 including a negative lens and a positive lens with a strong concave surface facing the object side.
この実施例3のレンズデータは下記の通りである。実施例3の対物レンズは、nd=1.51483,νd=41.0の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。 The lens data of Example 3 is as follows. The objective lens of Example 3 uses an immersion liquid with nd = 1.51483 and νd = 41.0. This immersion liquid is a conventionally used oil for microscope objective lenses.
f(Ga) = 4.057
f(Gb) = 55.132
f(Gc) = 424.929
f(Gd) = −14.706
f(Ge) = 425.459
f(Ga)/f = 1.35
f(Gb)/f = 18.38
f(Gc)/f = 141.64
f(Gd)/f = −4.90
f(Ge)/f = 141.82
H1 = 6.7
H2 = 4.19
H3 = 4.2
νd(Len) = 70.3
νd(Lep) = 32.2
nd(Len) = 1.48745
nd(Lep) = 1.73800
(1) H2/H1 = 0.63
(2) f(Gb)/f = 18.38
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 38.1
(6) H3/H1 = 0.63
(9) |f(Gc)/f|= 141.6
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図6によって示される。
f (Ga) = 4.057
f (Gb) = 55.132
f (Gc) = 424.929
f (Gd) =-14.706
f (Ge) = 425.459
f (Ga) /f=1.35
f (Gb) /f=18.38
f (Gc) /f=141.64
f (Gd) /f=-4.90
f (Ge) /f=141.82
H1 = 6.7
H2 = 4.19
H3 = 4.2
νd (Len) = 70.3
νd (Lep) = 32.2
nd (Len) = 1.48745
nd (Lep) = 1.73800
(1) H2 / H1 = 0.63
(2) f (Gb) /f=18.38
(3) νd (Len) −νd (Lep) = 38.1
(6) H3 / H1 = 0.63
(9) | f (Gc) /f|=141.6
With the configuration as described above, in this embodiment, chromatic aberration and various aberrations are corrected in the wavelength region from 405 nm to 656 nm. The state of the correction is shown in FIG.
本発明の実施例4は、図7に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成される。正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとからなる接合レンズG1と、正の単レンズG2と、正の単レンズG3と、によって構成される。正のレンズ群Gbは正レンズと負レンズと正レンズとからなる3枚接合レンズG4からなる。レンズ群Gcは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズG5と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズG6とにより構成される。レンズ群Gdは正レンズと負レンズとからなる接合レンズG7からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Geは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズG8により構成されている。 The fourth embodiment of the present invention has a configuration as shown in FIG. That is, it is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side. The positive lens group Ga includes a cemented lens G1 including a plano-convex lens having a plane facing the object side and a meniscus lens having a concave surface facing the object side, a positive single lens G2, and a positive single lens G3. Is done. The positive lens group Gb includes a three-piece cemented lens G4 including a positive lens, a negative lens, and a positive lens. The lens group Gc includes a cemented lens G5 including a negative lens and a positive lens, and a cemented lens G6 including a positive lens and a negative lens. The lens group Gd includes a cemented lens G7 including a positive lens and a negative lens, and has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side. The lens group Ge includes a cemented lens G8 including a negative lens and a positive lens with a strong concave surface facing the object side.
この実施例4のレンズデータは下記の通りである。実施例4の対物レンズは、nd=1.51483,νd=41.0の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。 The lens data of Example 4 is as follows. The objective lens of Example 4 uses an immersion liquid with nd = 1.51483 and νd = 41.0. This immersion liquid is a conventionally used oil for microscope objective lenses.
f(Ga) = 4.178
f(Gb) = 39.814
f(Gc) = 133.751
f(Gd) = −13.142
f(Ge) = 350.726
f(Ga)/f = 1.39
f(Gb)/f = 13.27
f(Gc)/f = 44.58
f(Gd)/f = −4.38
f(Ge)/f = 116.91
H1 = 6.96
H2 = 4.1
H3 = 4.2
νd(Len) = 70.3
νd(Lep) = 32.2
nd(Len) = 1.48745
nd(Lep) = 1.73800
(1) H2/H1 = 0.59
(2) f(Gb)/f = 13.27
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 38.1
(6) H3/H1 = 0.60
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図8によって示される。
f (Ga) = 4.178
f (Gb) = 39.814
f (Gc) = 133.751
f (Gd) = − 13.142
f (Ge) = 350.726
f (Ga) /f=1.39
f (Gb) /f=13.27
f (Gc) /f=44.58
f (Gd) /f=−4.38
f (Ge) /f=116.91
H1 = 6.96
H2 = 4.1
H3 = 4.2
νd (Len) = 70.3
νd (Lep) = 32.2
nd (Len) = 1.48745
nd (Lep) = 1.73800
(1) H2 / H1 = 0.59
(2) f (Gb) /f=13.27
(3) νd (Len) −νd (Lep) = 38.1
(6) H3 / H1 = 0.60
With the configuration as described above, in this embodiment, chromatic aberration and various aberrations are corrected in the wavelength region from 405 nm to 656 nm. The state of the correction is shown in FIG.
本発明の実施例5は、図9に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成される。正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとからなる接合レンズG1と、正の単レンズG2とによって構成される。正のレンズ群Gbは正レンズと負レンズと正レンズとからなる3枚接合レンズG3からなる。レンズ群Gcは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズG4と、正レンズと負レンズからなる接合レンズG5とにより構成される。レンズ群Gdは正レンズと負レンズとからなる接合レンズG6からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Geは物体側に強い凹面を向けた負レンズG7と正レンズG8とにより構成されている。レンズ群Gcは光軸方向に移動可能である。 The fifth embodiment of the present invention has a configuration as shown in FIG. That is, it is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side. The positive lens group Ga includes a cemented lens G1 including a plano-convex lens having a plane facing the object side and a meniscus lens having a concave surface facing the object side, and a positive single lens G2. The positive lens group Gb includes a three-piece cemented lens G3 including a positive lens, a negative lens, and a positive lens. The lens group Gc includes a cemented lens G4 including a negative lens and a positive lens, and a cemented lens G5 including a positive lens and a negative lens. The lens group Gd includes a cemented lens G6 including a positive lens and a negative lens, and has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side. The lens group Ge includes a negative lens G7 and a positive lens G8 having a strong concave surface facing the object side. The lens group Gc is movable in the optical axis direction.
この実施例5のデータは下記の通りである。実施例5の対物レンズは、nd=1.40430,νd=52.0の液浸液を使用する。この液浸液は、シリコーンオイルである。シリコーンオイルの屈折率は、生体細胞(nd=1.33〜1.45)の屈折率に近く、生体細胞との屈折率ミスマッチが少ない。そのため、シリコーンオイルを用いた対物レンズは、生体細胞の深いところまで鮮明に見えるという利点がある。また、自家蛍光が少なく、蛍光観察に適している。また、揮発しにくく、屈折率の変化が少ないため、長時間の観察に適している。一方、一般的に用いられているグリセリン液浸液や、グリセリンと水の混合液の液浸液は、長時間の観察に不適である。なぜなら、グリセリンは吸湿性のために時間とともに屈折率が変化するためである。 The data of Example 5 is as follows. The objective lens of Example 5 uses an immersion liquid with nd = 1.40430 and νd = 52.0. This immersion liquid is silicone oil. The refractive index of silicone oil is close to the refractive index of living cells (nd = 1.33 to 1.45), and there are few refractive index mismatches with living cells. Therefore, an objective lens using silicone oil has an advantage that it can be seen clearly in a deep part of a living cell. In addition, there is little autofluorescence and it is suitable for fluorescence observation. In addition, it is less volatile and has little change in refractive index, so it is suitable for long-time observation. On the other hand, a glycerin immersion liquid generally used or an immersion liquid of a mixed liquid of glycerin and water is not suitable for long-time observation. This is because glycerin changes its refractive index with time because of its hygroscopicity.
f(Ga) = 5.006
f(Gb) = 28.159
f(Gc) = −43.184
f(Gd) = 34.104
f(Ge) = −68.746
f(Ga)/f = 1.67
f(Gb)/f = 9.39
f(Gc)/f = −14.39
f(Gd)/f = 11.37
f(Ge)/f = −22.92
H1 = 7.32
H2 = 4.49
H3 = 3.9
νd(Len) = 64.2
νd(Lep) = 32.2
nd(Len) = 1.51630
nd(Lep) = 1.73800
(1) H2/H1 = 0.61
(2) f(Gb)/f = 9.39
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 32.0
(6) H3/H1 = 0.53
(9) |f(Gc)/f| = 14.4
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図10によって示される。
f (Ga) = 5.006
f (Gb) = 28.159
f (Gc) = − 43.184
f (Gd) = 34.104
f (Ge) = − 68.746
f (Ga) /f=1.67
f (Gb) /f=9.39
f (Gc) /f=-14.39
f (Gd) /f=11.37
f (Ge) /f=−22.92
H1 = 7.32
H2 = 4.49
H3 = 3.9
νd (Len) = 64.2
νd (Lep) = 32.2
nd (Len) = 1.51630
nd (Lep) = 1.73800
(1) H2 / H1 = 0.61
(2) f (Gb) /f=9.39
(3) νd (Len) −νd (Lep) = 32.0
(6) H3 / H1 = 0.53
(9) | f (Gc) /f|=14.4
With the configuration as described above, in this embodiment, chromatic aberration and various aberrations are corrected in the wavelength region from 405 nm to 656 nm. The state of the correction is shown in FIG.
本発明の実施例6は、図11に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成される。正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとを接合した接合レンズG1と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズG2と、正の単レンズG3とによって構成される。正のレンズ群Gbは正レンズと負レンズと正レンズとからなる3枚接合レンズG4からなる。レンズ群Gcは正レンズと負レンズとからなる接合レンズG5と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズG6により構成される。レンズ群Gdは正レンズと負レンズとからなる接合レンズG7からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Geは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズG8により構成されている。 The sixth embodiment of the present invention has a configuration as shown in FIG. That is, it is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side. The positive lens group Ga includes a cemented lens G1 in which a plano-convex lens having a plane facing the object side and a meniscus lens having a concave surface facing the object side, a positive meniscus lens G2 having a concave surface facing the object side, And a single lens G3. The positive lens group Gb includes a three-piece cemented lens G4 including a positive lens, a negative lens, and a positive lens. The lens group Gc includes a cemented lens G5 including a positive lens and a negative lens, and a cemented lens G6 including a positive lens and a negative lens. The lens group Gd includes a cemented lens G7 including a positive lens and a negative lens, and has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side. The lens group Ge includes a cemented lens G8 including a negative lens and a positive lens with a strong concave surface facing the object side.
図11から読み取れるように、本実施例は最も物体側のレンズ群Gaに特徴的な形状を持っている。一般にNAが大きな液浸系の対物レンズはこの部分のレンズ群が半球に近い形状をもつ。しかし本実施例では、これを2つの半球状のレンズを含むことが形態上の特徴の一つとなっている。この形態により、レンズ群Gaによって発生する収差量を低減させている。また、接合レンズG1の像側面の曲率半径は焦点距離fより小さく、かつ、メニスカスレンズG2の像側の曲率半径は焦点距離fの2倍よりも小さい。これらの特徴により、レンズ群G3以降の光線高を抑えることができ、高次の収差(球面収差、コマ収差)を補正しやすくしているのと同時に、全体のレンズの外径を小さくすることができレンズの加工性が向上している。 As can be seen from FIG. 11, the present embodiment has a characteristic shape of the lens group Ga on the most object side. In general, an immersion type objective lens having a large NA has a lens group of this portion close to a hemisphere. However, in the present embodiment, one of the features in the form is that it includes two hemispherical lenses. With this configuration, the amount of aberration generated by the lens group Ga is reduced. The radius of curvature of the image side surface of the cemented lens G1 is smaller than the focal length f, and the radius of curvature of the meniscus lens G2 on the image side is smaller than twice the focal length f. With these features, the height of the light beam after the lens group G3 can be suppressed, and it is easy to correct higher-order aberrations (spherical aberration, coma aberration), and at the same time, the outer diameter of the entire lens is reduced. The processability of the lens is improved.
この実施例1のデータは下記の通りである。実施例6の対物レンズは、nd=1.51483,νd=41.0の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。 The data of Example 1 is as follows. The objective lens of Example 6 uses an immersion liquid with nd = 1.51483 and νd = 41.0. This immersion liquid is a conventionally used oil for microscope objective lenses.
f(Ga) = 4.835
f(Gb) = 24.100
f(Gc) = −66.770
f(Gd) = −30.153
f(Ge) = −436.809
f(Ga)/f = 1.61
f(Gb)/f = 8.03
f(Gc)/f = −22.26
f(Gd)/f = −10.05
f(Ge)/f = −145.60
f(G1+G2) = 5.740
H1 = 7.12
H2 = 4.47
H3 = 4.2
D = 1.33
νd(Len) = 64.2
νd(Lep) = 29.8
nd(Len) = 1.51630
nd(Lep) = 1.80000
(1) H2/H1 = 0.63
(2) f(Gb)/f = 8.03
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 34.4
(6) H3/H1 = 0.59
(7) f(G1+G2)/f = 1.91
(8) D/f = 0.44
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図12によって示される。
f (Ga) = 4.835
f (Gb) = 24.100
f (Gc) = − 66.770
f (Gd) = − 30.153
f (Ge) =-436.809
f (Ga) /f=1.61
f (Gb) /f=8.03
f (Gc) /f=-22.26
f (Gd) /f=-10.05
f (Ge) /f=-145.60
f (G1 + G2) = 5.740
H1 = 7.12
H2 = 4.47
H3 = 4.2
D = 1.33
νd (Len) = 64.2
νd (Lep) = 29.8
nd (Len) = 1.51630
nd (Lep) = 1.80000
(1) H2 / H1 = 0.63
(2) f (Gb) /f=8.03
(3) νd (Len) −νd (Lep) = 34.4
(6) H3 / H1 = 0.59
(7) f (G1 + G2) /f=1.91
(8) D / f = 0.44
With the configuration as described above, in this embodiment, chromatic aberration and various aberrations are corrected in the wavelength region from 405 nm to 656 nm. The state of the correction is shown in FIG.
本発明の実施例7は、図13に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Gaと正のレンズ群Gbとレンズ群Gcとレンズ群Gdとレンズ群Geとから構成される。正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとを接合した接合レンズG1と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズG2と、正の単レンズG3とによって構成される。正のレンズ群Gbは正レンズと負レンズと正レンズとからなる3枚接合レンズG4からなる。レンズ群Gcは正レンズと負レンズからなる接合レンズG5と正レンズと負レンズからなる接合レンズG6により構成される。レンズ群Gdは正レンズと負レンズとからなる接合レンズG7からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Geは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズG8により構成されている。 Embodiment 7 of the present invention has a configuration as shown in FIG. That is, it is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side. The positive lens group Ga includes a cemented lens G1 in which a plano-convex lens having a plane facing the object side and a meniscus lens having a concave surface facing the object side, a positive meniscus lens G2 having a concave surface facing the object side, And a single lens G3. The positive lens group Gb includes a three-piece cemented lens G4 including a positive lens, a negative lens, and a positive lens. The lens group Gc includes a cemented lens G5 including a positive lens and a negative lens, and a cemented lens G6 including a positive lens and a negative lens. The lens group Gd includes a cemented lens G7 including a positive lens and a negative lens, and has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side. The lens group Ge includes a cemented lens G8 including a negative lens and a positive lens with a strong concave surface facing the object side.
図13から読み取れるように、本実施例も最も物体側のレンズ群Gaに特徴的な形状を持っている。本実施例でもレンズ群Gaに2つの半球状のレンズを含むことが形態上の特徴の一つとなっている。この形態により、レンズ群Gaによって発生する収差量を低減させている。また、接合レンズG1の像側面の曲率半径は焦点距離fより小さく、かつ、メニスカスレンズG2の像側の曲率半径は焦点距離fの2倍よりも小さい。これらの特徴により、レンズ群G3以降の光線高を抑えることができ、高次の収差(球面収差、コマ収差)を補正しやすくしているのと同時に、全体のレンズの外径を小さくすることができレンズの加工性が向上している。 As can be seen from FIG. 13, this embodiment also has a characteristic shape in the lens group Ga on the most object side. Also in the present embodiment, one of the features in the form is that the lens group Ga includes two hemispherical lenses. With this configuration, the amount of aberration generated by the lens group Ga is reduced. The radius of curvature of the image side surface of the cemented lens G1 is smaller than the focal length f, and the radius of curvature of the meniscus lens G2 on the image side is smaller than twice the focal length f. With these features, the height of the light beam after the lens group G3 can be suppressed, and it is easy to correct higher-order aberrations (spherical aberration, coma aberration), and at the same time, the outer diameter of the entire lens is reduced. The processability of the lens is improved.
この実施例7のレンズデータは下記の通りである。実施例7の対物レンズは、nd=1.51483,νd=41.0の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。 The lens data of Example 7 is as follows. The objective lens of Example 7 uses an immersion liquid with nd = 1.51483 and νd = 41.0. This immersion liquid is a conventionally used oil for microscope objective lenses.
f(Ga) = 3.973
f(Gb) = 28.967
f(Gc) = 3756.617
f(Gd) = −19.235
f(Ge) = 671.695
f(Ga)/f = 1.32
f(Gb)/f = 9.66
f(Gc)/f = 1252.21
f(Gd)/f = −6.41
f(Ge)/f = 223.90
f(G1+G2) = 4.5
H1 = 7.01
H2 = 4.16
H3 = 4.2
D = 1.3
νd(Len) = 70.3
νd(Lep) = 32.2
nd(Len) = 1.48745
nd(Lep) = 1.73800
(1) H2/H1 = 0.59
(2) f(Gb)/f = 9.66
(3) νd(Len)−νd(Lep) = 38.1
(6) H3/H1 = 0.60
(7) f(G1+G2)/f = 1.50
(8) D/f = 0.43
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を405nmから656nmまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図14によって示される。
f (Ga) = 3.973
f (Gb) = 28.967
f (Gc) = 3756.617
f (Gd) = − 19.235
f (Ge) = 671.695
f (Ga) /f=1.32
f (Gb) /f=9.66
f (Gc) /f=1252.21
f (Gd) /f=−6.41
f (Ge) /f=223.90
f (G1 + G2) = 4.5
H1 = 7.01
H2 = 4.16
H3 = 4.2
D = 1.3
νd (Len) = 70.3
νd (Lep) = 32.2
nd (Len) = 1.48745
nd (Lep) = 1.73800
(1) H2 / H1 = 0.59
(2) f (Gb) /f=9.66
(3) νd (Len) −νd (Lep) = 38.1
(6) H3 / H1 = 0.60
(7) f (G1 + G2) /f=1.50
(8) D / f = 0.43
With the configuration as described above, in this embodiment, chromatic aberration and various aberrations are corrected in the wavelength region from 405 nm to 656 nm. The state of the correction is shown in FIG.
ここで上記実施例1から7における、400nmから700nmまでの軸上色収差を図23に示す。また、従来技術との比較のために、特許文献1と特許文献2に記載の対物レンズも併記した。図23における、比較例1は特許文献1における実施例1に記載の対物レンズであり、比較例2は特許文献1における実施例2に記載の対物レンズであり、比較例3は特許文献2における実施例4に記載の対物レンズである。なお、比較例1のレンズ断面図は図15に記載され、収差図は図16に記載されている。比較例2のレンズ断面図は図17に記載され、収差図は図18に記載されている。比較例3のレンズ断面図は図19に記載され、収差図は図20に記載されている。 Here, axial chromatic aberration from 400 nm to 700 nm in Examples 1 to 7 is shown in FIG. For comparison with the prior art, the objective lenses described in Patent Document 1 and Patent Document 2 are also shown. In FIG. 23, Comparative Example 1 is the objective lens described in Example 1 in Patent Document 1, Comparative Example 2 is the objective lens described in Example 2 in Patent Document 1, and Comparative Example 3 is in Patent Document 2. 4 is the objective lens described in Example 4. The lens cross-sectional view of Comparative Example 1 is shown in FIG. 15, and the aberration diagram is shown in FIG. The lens cross-sectional view of Comparative Example 2 is shown in FIG. 17, and the aberration diagram is shown in FIG. The lens cross-sectional view of Comparative Example 3 is shown in FIG. 19, and the aberration diagram is shown in FIG.
この図23はe線(546.07nm)を基準とした場合の、各波長での物体面での軸上の集光位置を表している。横軸は波長(nm)であり、縦軸はe線(546.07nm)を基準位置とした場合の各波長における集光位置のずれである。 FIG. 23 shows the condensing position on the axis on the object plane at each wavelength when the e-line (546.07 nm) is used as a reference. The horizontal axis is the wavelength (nm), and the vertical axis is the deviation of the condensing position at each wavelength when the e-line (546.07 nm) is the reference position.
図23から解るように、本発明の対物レンズは軸上色収差が良好に補正されており、400〜700nmにおいて、各波長の集光位置のずれが0.1μm(0.0001mm)以内に収まっている。このことは、本発明の対物レンズが多波長観察に対して非常に有効に機能することを意味している。 As can be seen from FIG. 23, the axial chromatic aberration of the objective lens according to the present invention is well corrected, and the shift of the condensing position of each wavelength is within 0.1 μm (0.0001 mm) at 400 to 700 nm. Yes. This means that the objective lens of the present invention functions very effectively for multi-wavelength observation.
また、各実施例の収差図(図2、図4、図6、図8、図10、図12、図14)と各比較例の収差図(図16、図18、図20)を比較すると解るように、本発明の実施例は球面収差の補正の仕方にも特徴を持つ。本願実施例の対物レンズは図24(b)のように、各波長ですべてのNAに渡って均等に球面収差を補正している。一方、従来技術である比較例では図24(a)のように、NAに関して球面収差が正の部分と負の部分があり、それらが相殺することによって、波長ごとの集光位置がほぼ等しく補正される。 Further, the aberration diagrams of the respective examples (FIGS. 2, 4, 6, 8, 8, 10, 12, and 14) and the aberration diagrams of the comparative examples (FIGS. 16, 18, and 20) are compared. As can be seen, the embodiment of the present invention is also characterized in how to correct spherical aberration. As shown in FIG. 24B, the objective lens according to the present embodiment corrects spherical aberration uniformly over all NAs at each wavelength. On the other hand, in the comparative example, which is a conventional technique, as shown in FIG. 24A, there are a positive part and a negative part of the spherical aberration with respect to NA, and they cancel each other, thereby correcting the light collection position for each wavelength almost equally. Is done.
上述の従来技術のような収差補正をした場合、対物レンズのNAの利用に偏りがある場合に大きな影響が生じる。例えばこのような影響は、対物レンズのNAを絞ったときや、ガウス分布をもったレーザ光を対物レンズに入射した場合に現れる。 When aberration correction is performed as in the above-described prior art, there is a significant effect when there is a bias in the use of NA of the objective lens. For example, such an effect appears when the NA of the objective lens is reduced, or when laser light having a Gaussian distribution is incident on the objective lens.
図25はこの現象を説明するための図である。同図に説明されるように、一般的な従来の対物レンズでは、NAの大きい位置からの光線は波長によらずほぼ同じ位置に集光されるように色収差を補正されているが、NAの小さい位置での光線は波長ごとに異なる位置に集光してしまう。この現象の直接的な原因が、従来技術における図24(a)のような球面収差の補正の仕方である。 FIG. 25 is a diagram for explaining this phenomenon. As illustrated in the figure, in a general conventional objective lens, chromatic aberration is corrected so that light rays from a position with a large NA are condensed at substantially the same position regardless of the wavelength. Light rays at a small position are condensed at different positions for each wavelength. The direct cause of this phenomenon is the method of correcting spherical aberration as shown in FIG.
一方、本発明の実施による対物レンズでは、図24(b)のように、球面収差が各波長ですべてのNAに渡って均等に球面収差を補正しているので、対物レンズのNAの利用に偏りがある場合でも影響が少ない。すなわち、本発明による対物レンズは、ガウシアンビームを対物レンズに入射して利用するレーザ走査型顕微鏡に対して非常に好適である。 On the other hand, in the objective lens according to the embodiment of the present invention, as shown in FIG. 24B, the spherical aberration is corrected evenly over all NAs at each wavelength, so that the NA of the objective lens can be used. Even if there is a bias, there is little influence. That is, the objective lens according to the present invention is very suitable for a laser scanning microscope that uses a Gaussian beam incident on the objective lens.
図26は実施例1から7および比較例1から3の倍率の色収差を示している。この図は、波長488nmを基準とした場合の、視野数9における倍率の色収差を表している。横軸は波長(nm)であり、縦軸は各波長の基準位置からの集光位置のずれである。なお、本発明の実施例はすべて60倍であるので、視野数9は物体面で物体高0.075mmに相当する。 FIG. 26 shows the chromatic aberration of magnification of Examples 1 to 7 and Comparative Examples 1 to 3. This figure shows chromatic aberration of magnification at a field number of 9 when the wavelength is 488 nm. The horizontal axis is the wavelength (nm), and the vertical axis is the deviation of the light collection position from the reference position of each wavelength. Since all the embodiments of the present invention are 60 times, the number of fields of view 9 corresponds to an object height of 0.075 mm on the object plane.
同図から読み取れるように、本発明の実施例では倍率の色収差も良好に補正されており、各波長での色収差が0.3μm(0.0003mm)以内に収まっている。
以下では本願発明の実施の形態をレーザ走査型顕微鏡の装置の視点から説明する。
As can be seen from the figure, in the embodiment of the present invention, the chromatic aberration of magnification is well corrected, and the chromatic aberration at each wavelength is within 0.3 μm (0.0003 mm).
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described from the viewpoint of a laser scanning microscope apparatus.
図27は従来のレーザ走査型顕微鏡の構成図を示す。従来のレーザ走査型顕微鏡では可視光レーザ2として例えばアルゴンイオンレーザ(波長488nm)とHe−Neグリーンレーザ(波長543nm)とHe−Neレーザ(波長633nm)を用いた場合、これらのレーザをダイクロイックミラー4で同一光路に合成し、集光レンズ6でシングルモードファイバ8に集光させる。シングルモードファイバはNAが0.1程度であり、コア径が数μmの大きさになっているので、レーザ光をファイバに入れるのは厳密な調整が必要となる。このため、ファイバへのレーザ光の傾きと横ずれを調整するファイバカップリング機構7を備えている。 FIG. 27 shows a configuration diagram of a conventional laser scanning microscope. In a conventional laser scanning microscope, when, for example, an argon ion laser (wavelength 488 nm), a He-Ne green laser (wavelength 543 nm), or a He-Ne laser (wavelength 633 nm) is used as the visible light laser 2, these lasers are dichroic mirrors. 4 is combined in the same optical path, and is condensed on the single mode fiber 8 by the condenser lens 6. Since the single mode fiber has an NA of about 0.1 and a core diameter of several μm, it is necessary to strictly adjust the laser light to enter the fiber. For this reason, a fiber coupling mechanism 7 for adjusting the inclination and lateral shift of the laser beam to the fiber is provided.
このとき、例えば波長405nmのレーザなどをさらに用いる場合は短波用レーザ1として別なファイバを用いてレーザ走査型顕微鏡に導入し、後段のダイクロイックミラー12によって合成させることが従来では多かった。これは対物レンズ18の色収差をファイバ後のコリメータレンズ10により調整していたためである。この様な調節していた理由は、従来の対物レンズでは色収差を補正している波長域が十分ではないので波長405nmなどのレーザを使う場合には特別な方法を採用しなければいけなかったのである。 At this time, for example, when a laser having a wavelength of 405 nm is further used, it has been often the case that a short-wave laser 1 is introduced into a laser scanning microscope using another fiber and synthesized by a subsequent dichroic mirror 12. This is because the chromatic aberration of the objective lens 18 is adjusted by the collimator lens 10 after the fiber. The reason for this adjustment is that the wavelength range for correcting chromatic aberration is not sufficient for conventional objective lenses, so a special method had to be adopted when using a laser with a wavelength of 405 nm. is there.
しかし、対物レンズはそれぞれが異なる色収差をもつので、この方法ではすべての対物レンズで対応することが非常に難しいという問題点がある。光ファイバはコア径が数ミクロンと非常に小さいため、顕微鏡への導入時のファイバの平行出しと傾け調整は非常に精密なファイバ傾き位置合わせ機構9の調整が必要となる。そのために、従来のレーザ走査型顕微鏡はこの調整が複雑であった。 However, since the objective lenses have different chromatic aberrations, this method has a problem that it is very difficult to cope with all objective lenses. Since the optical fiber has a very small core diameter of several microns, parallel alignment and tilt adjustment of the fiber at the time of introduction into the microscope requires adjustment of the fiber tilt alignment mechanism 9 with very high precision. Therefore, this adjustment is complicated in the conventional laser scanning microscope.
本発明のレーザ走査型顕微鏡の実施例を図28に示す。本発明の対物レンズは405nmから656nmまでの波長域で色収差が補正されているため、短波長側のレーザと可視レーザは同一の光で入射させることが可能となる。このため、1本のファイバ8を用いる。このファイバは使用波長域が広い光ファイバが適している。 An embodiment of the laser scanning microscope of the present invention is shown in FIG. Since the objective lens of the present invention has chromatic aberration corrected in the wavelength range from 405 nm to 656 nm, the short-wavelength laser and the visible laser can be incident with the same light. For this reason, one fiber 8 is used. As this fiber, an optical fiber having a wide operating wavelength range is suitable.
ファイバ8からの光線はコリメータレンズ10により平行光線となり、ミラーやダイクロイックミラーにより可視光レーザと短波長側レーザは同一光路に合成され、ダイクロイックミラー13で反射される。ダイクロイックミラーで反射後のレーザ光はガルバノミラー14でスキャンされ、瞳投影レンズ15、結像レンズ16によりリレーされ、対物レンズに入射する。試料からの蛍光は逆の光路を通り、ダイクロイックミラー13を通過し、結像レンズ20によって共焦点効果を出すためのピンホール19に集光させる。そしてピンホール19を通過することができた蛍光をダイクロイックミラー21を使い分光した後、バリアフィルタ23により所望の波長域の蛍光を光検出器24で検出する。なお、符号3、5、11、17、22は光路を曲げるためのミラーである。 The light beam from the fiber 8 is converted into a parallel light beam by the collimator lens 10, and the visible light laser and the short wavelength side laser are combined in the same optical path by the mirror or the dichroic mirror and reflected by the dichroic mirror 13. The laser light reflected by the dichroic mirror is scanned by the galvanometer mirror 14, relayed by the pupil projection lens 15 and the imaging lens 16, and enters the objective lens. The fluorescence from the sample passes through the reverse optical path, passes through the dichroic mirror 13, and is condensed by the imaging lens 20 into the pinhole 19 for producing a confocal effect. Then, after the fluorescence that has passed through the pinhole 19 is dispersed using the dichroic mirror 21, the fluorescence in a desired wavelength range is detected by the photodetector 24 using the barrier filter 23. Reference numerals 3, 5, 11, 17, and 22 are mirrors for bending the optical path.
また、ダイクロイックミラー13は切り替えをすることなく複数の波長のレーザを反射することができるマルチバンドタイプのダイクロイックミラーが望ましい。ダイクロイックミラーに楔がある場合、ダイクロイックミラーの切り替えで標本面での集光位置がわずかにずれる。しかし、マルチバンドのダイクロイックミラーを用いると1つのダイクロイックミラーで複数のレーザに対応できるため、切り替えの必要がなく、ダイクロの楔によって標本面の集光位置がずれることがない。また、複数の対物レンズを使用した場合も、従来技術だと複数の対物レンズに対して色収差を合わせることは不可能だったが、本発明の低色収差対物レンズを用いて、本発明の蛍光観察装置の構成を用いれば、色収差のずれが少ない観察が可能となる。 The dichroic mirror 13 is preferably a multiband dichroic mirror that can reflect a plurality of wavelengths of lasers without switching. When the dichroic mirror has a wedge, the condensing position on the sample surface is slightly shifted by switching the dichroic mirror. However, when a multi-band dichroic mirror is used, a single dichroic mirror can handle a plurality of lasers, so there is no need for switching, and the focusing position of the sample surface is not shifted by the dichroic wedge. In addition, even when a plurality of objective lenses are used, it is impossible to match chromatic aberration to a plurality of objective lenses with the conventional technique. However, using the low chromatic aberration objective lens of the present invention, the fluorescence observation of the present invention can be performed. If the configuration of the apparatus is used, observation with little deviation in chromatic aberration becomes possible.
また、本実施例の対物レンズは対物レンズ単独で色収差補正を行っている。このため、対物レンズ18と結像レンズ16の間にレーザ光を導入する場合に有利となる。結像レンズ16と対物レンズ18をコンペンゼーションして色収差補正を行う場合は、対物レンズ18と結像レンズ16の間からレーザなどを導入すると、集光位置のずれが生じる。一方、対物レンズ単独で色収差補正を行っている本実施例では集光位置のずれが生じないので、レーザ光で刺激しながらレーザ走査型顕微鏡で観察するような場合に有利となる。 In addition, the objective lens of this embodiment performs chromatic aberration correction by the objective lens alone. This is advantageous when laser light is introduced between the objective lens 18 and the imaging lens 16. When correcting the chromatic aberration by compensating the imaging lens 16 and the objective lens 18, if a laser or the like is introduced from between the objective lens 18 and the imaging lens 16, a condensing position shift occurs. On the other hand, in the present embodiment in which chromatic aberration correction is performed with the objective lens alone, there is no deviation of the condensing position, which is advantageous when observing with a laser scanning microscope while stimulating with laser light.
図28では、対物レンズ18とミラー17の間にダイクロイックミラー32を配置して、刺激用レーザ33を備えた構成を示している。ここでは、刺激用レーザ33の照射位置を調節するために可動式ミラー34を備えた構成とした。 FIG. 28 shows a configuration in which a dichroic mirror 32 is disposed between the objective lens 18 and the mirror 17 and a stimulation laser 33 is provided. Here, the movable mirror 34 is provided to adjust the irradiation position of the stimulation laser 33.
図29は本発明の実施によるレーザ走査型鏡焦点顕微鏡の外観構成例を示す。試料25はステージ26の上に置かれており、対物レンズ18は顕微鏡28のレボルバに取り付けられている。このレボルバには複数の対物レンズが取り付いていてもよい。対物レンズは光軸方向に移動する対物レンズ上下機構27を有しており、試料25の光軸方向の複数の断面像を得ることが可能である。試料の3次元像をとるために、共焦点スキャナー29が顕微鏡本体28に取り付けられており、ガルバノスキャナーやピンホールなどが内部に配置されている。図示していないが、レーザ光源は図28のようにファイバで共焦点スキャナー29に接続されている。共焦点スキャナー29で得られた信号を画像処理装置31に伝達し、画像表示装置30で表示する。試料の3次元像を構築するため、対物レンズを光軸方向に移動させ、複数の波長の蛍光像を取得する。各断面像は画像処理装置31に保存され、試料の3次元像を画像表示装置30に表示する。 FIG. 29 shows an example of the external configuration of a laser scanning mirror focus microscope according to the present invention. The sample 25 is placed on a stage 26, and the objective lens 18 is attached to a revolver of a microscope 28. A plurality of objective lenses may be attached to the revolver. The objective lens has an objective lens up-and-down mechanism 27 that moves in the optical axis direction, and a plurality of cross-sectional images of the sample 25 in the optical axis direction can be obtained. In order to take a three-dimensional image of the sample, a confocal scanner 29 is attached to the microscope main body 28, and a galvano scanner, a pinhole, and the like are arranged inside. Although not shown, the laser light source is connected to the confocal scanner 29 by a fiber as shown in FIG. The signal obtained by the confocal scanner 29 is transmitted to the image processing device 31 and displayed on the image display device 30. In order to construct a three-dimensional image of the sample, the objective lens is moved in the optical axis direction, and fluorescent images of a plurality of wavelengths are acquired. Each cross-sectional image is stored in the image processing device 31, and a three-dimensional image of the sample is displayed on the image display device 30.
本発明は色収差が十分補正されているため、複数の蛍光像は光軸方向のずれがない。このため、画像処理装置31に保存された複数の蛍光波長の試料の光軸方向の断面像を重ね合わせ表示するときに、波長が変わっても同じ断面像を重ね合わせするだけで正確な試料の3次元像を得ることができる。また、試料内の分子の高速な運動を見る場合にも本発明の構成は複数の蛍光画像を重ね合わせするときに、色収差補正のための光軸方向の対物レンズ駆動が不要となるため、試料内分子の高速運動も観察することが可能となる。 In the present invention, since the chromatic aberration is sufficiently corrected, the plurality of fluorescent images are not displaced in the optical axis direction. For this reason, when the cross-sectional images in the optical axis direction of the samples having a plurality of fluorescence wavelengths stored in the image processing device 31 are displayed in an overlapping manner, even if the wavelength is changed, the same cross-sectional image can be simply overlapped. A three-dimensional image can be obtained. In addition, when viewing a high-speed movement of molecules in a sample, the configuration of the present invention eliminates the need to drive an objective lens in the optical axis direction for correcting chromatic aberration when a plurality of fluorescent images are superimposed. It is also possible to observe high-speed movement of inner molecules.
また、本発明は共焦点顕微鏡以外の蛍光顕微鏡、蛍光観察装置でも有効である。例えば、細胞内のタンパク質を複数の波長の異なった蛍光タグで標識して、細胞膜からタンパク質がどう移動しているかを見る観察法がある。この場合、細胞膜自体に顕微鏡のピントを合わせる必要があるが、対物レンズに軸上色収差がある場合は、異なった蛍光タグでピントがずれてしまう現象が生じ、蛍光波長を変えると細胞膜からずれた位置を観察することになる。このよう場合にも本発明の対物レンズを用いれば、複数の蛍光波長が異なる蛍光タグを使用する場合、常に標本内の同一平面を観察することが可能となり、正確なデータを得ることが可能となる。 The present invention is also effective in a fluorescence microscope and a fluorescence observation apparatus other than the confocal microscope. For example, there is an observation method in which proteins in cells are labeled with a plurality of fluorescent tags having different wavelengths to see how proteins are moving from the cell membrane. In this case, it is necessary to focus the microscope on the cell membrane itself. However, if the objective lens has axial chromatic aberration, a phenomenon occurs in which the focus is shifted with a different fluorescent tag, and when the fluorescence wavelength is changed, the cell membrane is shifted from the cell membrane. You will observe the position. Even in such a case, if the objective lens of the present invention is used, it is possible to always observe the same plane in the specimen when using a plurality of fluorescent tags having different fluorescent wavelengths, and to obtain accurate data. Become.
図30は本発明の実施による蛍光観察装置のアプリケーションである蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の観察例を示す。この観察では、たとえばカメレオンなどの蛍光プローブを用いて細胞内のカルシュウムイオン濃度を測定する。カメレオン(cameleon)はCFP、YFPという2種類の蛍光タンパクをカルモジュリンMなどのたんぱく質で繋げた構造を持っている。細胞内のカルシュウムイオンが低い状態では波長442nmの励起光が照射されるとCFPからの波長485nmの蛍光しか放射されないが、カルシュウムイオン濃度が高くなると、CFPからYFPにエネルギー転移が起こり、YFPからの蛍光である波長530nmの蛍光が観察される。この現象から、CFPとYFPの蛍光強度の比をとることにより、カルシュウムイオン濃度を測定することが可能となる。 FIG. 30 shows an example of observation of fluorescence resonance energy transfer (FRET), which is an application of the fluorescence observation apparatus according to the present invention. In this observation, for example, the intracellular calcium ion concentration is measured using a fluorescent probe such as chameleon. Chameleon has a structure in which two types of fluorescent proteins, CFP and YFP, are connected by a protein such as calmodulin M. When excitation light with a wavelength of 442 nm is irradiated in a state where intracellular calcium ions are low, only fluorescence at a wavelength of 485 nm is emitted from the CFP. However, when the calcium ion concentration is high, energy transfer occurs from the CFP to the YFP, and Fluorescence with a wavelength of 530 nm, which is fluorescence, is observed. From this phenomenon, the calcium ion concentration can be measured by taking the ratio of the fluorescence intensities of CFP and YFP.
蛍光顕微鏡またはレーザ走査型顕微鏡にて485nmと530nmの2つの波長で画像を取得する。たとえば、図30の(1)を485nmの画像とし、図30の(2)を530nmの画像とする。この画像(1)と画像(2)の各画素毎に輝度の比をとった像を図29の(3)とする。このような操作によって得られた画像(3)は細胞内のカルシュウムイオン濃度の情報を持っている。上記の手順からも解るように、この観察方法では、異なる波長で取得した画像を、画素毎に正確に対応させることが必要となっている。本発明の実施による蛍光観察装置ではこのような観察に好適である。 Images are acquired at two wavelengths of 485 nm and 530 nm with a fluorescence microscope or a laser scanning microscope. For example, (1) in FIG. 30 is an image of 485 nm, and (2) in FIG. 30 is an image of 530 nm. An image obtained by taking a luminance ratio for each pixel of the image (1) and the image (2) is defined as (3) in FIG. The image (3) obtained by such an operation has information on the intracellular calcium ion concentration. As can be understood from the above procedure, in this observation method, it is necessary to accurately correspond images acquired at different wavelengths for each pixel. The fluorescence observation apparatus according to the embodiment of the present invention is suitable for such observation.
上記は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)について述べたが、fura2などのカルシュウム測光などの蛍光のレシオをとる観察法において、本発明の対物レンズを用いれば、常に標本面の同一平面でのレシオをとることができるので正確な測定が可能となる。 In the above description, fluorescence resonance energy transfer (FRET) has been described. In an observation method that takes fluorescence ratios such as calcium photometry such as fura2, if the objective lens of the present invention is used, the ratio in the same plane of the specimen surface is always taken. Accurate measurement is possible.
1 短波長レーザ
2 可視光レーザ
3 ミラー
4 ダイクロイックミラー
5 ミラー
6 集光レンズ
7 ファイバカップリング機構
8 ファイバ
9 ファイバ傾き位置合わせ機構
10 コリメータレンズ
11 ミラー
12 ダイクロイックミラー
13 ダイクロイックミラー
14 ガルバノミラー
15 瞳投影レンズ
16 結像レンズ
17 ミラー
18 対物レンズ
19 ピンホール
20 結像レンズ
21 ダイクロイックミラー
22 ミラー
23 バリアフィルタ
24 検出器
25 標本
26 ステージ
27 対物レンズ上下機構
28 顕微鏡本体
29 共焦点スキャナー
30 画像表示装置
31 画像処理装置
32 ダイクロイックミラー
33 刺激用レーザ
34 可動式ミラー
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Short wavelength laser 2 Visible light laser 3 Mirror 4 Dichroic mirror 5 Mirror 6 Condensing lens 7 Fiber coupling mechanism 8 Fiber 9 Fiber inclination alignment mechanism 10 Collimator lens 11 Mirror 12 Dichroic mirror 13 Dichroic mirror 14 Galvano mirror 15 Pupil projection lens DESCRIPTION OF SYMBOLS 16 Imaging lens 17 Mirror 18 Objective lens 19 Pinhole 20 Imaging lens 21 Dichroic mirror 22 Mirror 23 Barrier filter 24 Detector 25 Sample 26 Stage 27 Objective lens up-and-down mechanism 28 Microscope main body 29 Confocal scanner 30 Image display apparatus 31 Image processing Equipment 32 Dichroic mirror 33 Stimulation laser 34 Movable mirror
Claims (10)
前記正のレンズ群Gaは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズと2つの正の単レンズとからなり、
前記正のレンズ群Gbは、1つの3枚接合の接合レンズからなり、
前記レンズ群Gcは、少なくとも1つ以上の接合レンズを含み、
前記レンズ群Gdは、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状のものであり、
前記レンズ群Geは、物体側に強い凹面を向けた負レンズを含み、
H1をレンズ群Gbから射出するマージナル光線の光線高、H2をレンズ群Gdに入射するマージナル光線の光線高、fを対物レンズ全系の焦点距離、f(Gb)をレンズ群Gbの焦点距離としたときに、次の条件式
0.5 ≦ H2/H1 ≦ 0.75
7.8 ≦ f(Gb)/f ≦ 20
を満足する液浸系顕微鏡対物レンズ。 It is composed of a positive lens group Ga, a positive lens group Gb, a lens group Gc, a lens group Gd, and a lens group Ge in order from the object side.
The positive lens group Ga includes a cemented lens obtained by cementing a plano-convex lens having a plane facing the object side and a meniscus lens having a concave surface facing the object side, and two positive single lenses.
The positive lens group Gb is composed of one cemented lens of three lenses,
The lens group Gc includes at least one or more cemented lenses,
The lens group Gd has a meniscus shape with a strong concave surface facing the image side,
The lens group Ge includes a negative lens having a strong concave surface facing the object side,
H1 is the height of the marginal ray emitted from the lens group Gb, H2 is the height of the marginal ray incident on the lens group Gd, f is the focal length of the entire objective lens system, and f (Gb) is the focal length of the lens group Gb. When the following conditional expression 0.5 ≦ H2 / H1 ≦ 0.75
7.8 ≦ f (Gb) / f ≦ 20
Immersion microscope objective lens that satisfies the requirements.
1.65 ≦ nd(Lep) ≦ 1.8
25 ≦ νd(Lep) ≦ 41
を満足する請求項2に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 The optical glass of the positive lens Lep has the following conditional expression 1.65 ≦ nd (Lep) ≦ 1.8, where d-line refractive index is nd (Lep).
25 ≦ νd (Lep) ≦ 41
The immersion microscope objective lens according to claim 2, wherein:
f(G1+G2)を接合レンズG1とメニスカスレンズG2との合成焦点距離、fを対物レンズ全系の焦点距離、Dを接合レンズG1とメニスカスレンズG2との間のマージナル光線の長さとしたときに、次の条件式
1 ≦ f(G1+G2)/f ≦ 2
D/f ≦ 0.6
を満足する請求項1から請求項3の何れかに記載の液浸系顕微鏡対物レンズ The positive lens group Ga includes a cemented lens G1 in which a plano-convex lens having a plane facing the object side and a meniscus lens having a concave surface facing the object side, a positive meniscus lens G2 having a concave surface facing the object side, and a positive lens group Ga. Single lens G3,
When f (G1 + G2) is the combined focal length of the cemented lens G1 and the meniscus lens G2, f is the focal length of the entire objective lens system, and D is the length of the marginal ray between the cemented lens G1 and the meniscus lens G2. Conditional expression 1 ≦ f (G1 + G2) / f ≦ 2
D / f ≦ 0.6
The immersion microscope objective lens according to any one of claims 1 to 3, wherein:
Δ1、Δ2をそれぞれλ1、λ2の軸上の集光位置としたときに、以下の条件式
λ1−λ2≧180nm
|Δ1−Δ2|<0.2μm
を満足することを特徴とする請求項1から請求項4の何れかに記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 Let λ1 and λ2 be the wavelengths of two light beams that pass through the immersion microscope objective lens,
When Δ1 and Δ2 are focused positions on the axes of λ1 and λ2, respectively, the following conditional expression: λ1-λ2 ≧ 180 nm
| Δ1-Δ2 | <0.2 μm
The immersion microscope objective lens according to any one of claims 1 to 4, wherein:
λ2≦442nm
を満たすことを特徴とする請求項5に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 The following conditional expression λ2 ≦ 442nm
The immersion microscope objective lens according to claim 5, wherein:
|δ1−δ2|≦0.3μm
を満足することを特徴とする請求項5または請求項6に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 When δ1 and δ2 are chromatic aberration of magnification at the number of fields 9 of λ1 and λ2, respectively, the following conditional expression | δ1-δ2 | ≦ 0.3 μm
The immersion microscope objective lens according to claim 5 or 6, wherein:
fを対物レンズ全系の焦点距離、f(Gc)を前記レンズ群Gcの焦点距離としたときに、次の条件式
|f(Gc)/f| ≦ 50
を満足する請求項1から請求項7の何れかに記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 The lens group Gc is movable in the optical axis direction;
When f is the focal length of the entire objective lens system and f (Gc) is the focal length of the lens group Gc, the following conditional expression | f (Gc) / f | ≦ 50
The immersion microscope objective lens according to any one of claims 1 to 7, wherein:
10 ≦ |f(Gc)/f| ≦ 20
を満足する請求項8に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。 The following conditional expression 10 ≦ | f (Gc) / f | ≦ 20
The immersion microscope objective lens according to claim 8, wherein:
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