JP2013014555A - Promotion method of collagen production - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アスコルビン酸サイクルを駆動することによるコラーゲン産生の促進方法、並びにアスコルビン酸サイクルを駆動する化合物を含むコラーゲン産生促進剤に関する。 The present invention relates to a method for promoting collagen production by driving an ascorbic acid cycle, and a collagen production promoter containing a compound that drives the ascorbic acid cycle.
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞、及びコラーゲン等の細胞外マトリクスにより構成されており、これらの皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことによって、皮膚の保湿機能や柔軟性、弾力性などが確保され、張りや艶のあるみずみずしい肌の状態が維持される。ところが、紫外線の照射や乾燥などの外的因子の影響、又は加齢によって、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少すると、皮膚の保湿機能や弾力性が低下し、皮膚の張りや艶が失われ、荒れ、しわ、たるみが発生する。このような、外見上の加齢変化は、多くの中高年齢者に限らず、肌を若々しく保ちたいという女性にとって切実な問題となっている。 The skin epidermis and dermis are composed of extracellular matrix such as epidermal cells, fibroblasts, and collagen. By maintaining the homeostasis of these skin tissue interactions, the skin moisturizing function and flexibility, Elasticity, etc. are secured, and a fresh, skiny state with tension and gloss is maintained. However, if the production of collagen, which is a major component of the extracellular matrix, decreases due to the influence of external factors such as UV irradiation and drying, or aging, the skin's moisturizing function and elasticity decrease, The tension and luster are lost, and roughening, wrinkling and sagging occur. Such an appearance of aging changes is a serious problem not only for many middle-aged and elderly people but also for women who want to keep their skin youthful.
しわ・たるみの要因の一つは、皮膚組織が加齢に伴い菲薄化することによる。老化した皮膚においては、真皮の主要なマトリックス成分であるコラーゲン線維の減少が著しく、このことが皮膚の厚さが減少する主たる原因となっている。したがって、コラーゲンの産生を促進させてコラーゲン量を維持することが、しわ・たるみの予防・改善に有効であると考えられる。コラーゲン産生を促進する物質として、様々な物質が研究されてきており、酵母抽出物、ブナ属植物の幼芽、アスコルビン酸などがコラーゲン産生を促進することが分かっている（特許文献１〜３）。 One of the causes of wrinkles and sagging is that the skin tissue thins with age. In aging skin, the decrease in collagen fibers, which are the main matrix component of the dermis, is significant, which is the main cause of the reduction in skin thickness. Therefore, it is considered that promoting collagen production and maintaining the amount of collagen is effective in preventing and improving wrinkles and sagging. Various substances have been studied as substances that promote collagen production, and it has been found that yeast extract, beech sprout, ascorbic acid and the like promote collagen production (Patent Documents 1 to 3). .
コラーゲンは、美容を目的として特に若い女性を中心に、栄養補助食品として服用されているが、巨大分子であるコラーゲンが体内に吸収されるためには消化されることが必要であることから、コラーゲン摂取による美容効果は疑問視されている。その一方で、コラーゲンペプチドは、分子量２５０から１５，０００程度のペプチドまでは腸管から吸収されるという報告されており（非特許文献１）、コラーゲンペプチドが体内で増加することにより、体内のコラーゲンの分解が生じたと誤認識し、コラーゲン生産の促進が図られるという説もあり、コラーゲン摂取による美容効果は未だよく分かっていない。 Collagen is taken as a dietary supplement, especially for young women, for cosmetic purposes, but it must be digested in order for the macromolecule collagen to be absorbed into the body. The cosmetic effect of ingestion has been questioned. On the other hand, collagen peptides have been reported to be absorbed from the intestinal tract up to peptides having a molecular weight of about 250 to 15,000 (Non-patent Document 1). There is also the theory that collagen production is misrecognized and promotes collagen production, and the cosmetic effects of collagen intake are not well understood.
コラーゲンは、動物の体タンパク質の約３０％を占め、皮膚のみならず、骨、歯、腱などを構成する主要なタンパク質である。コラーゲンは特徴あるアミノ酸組成を有し、グリシンが全アミノ酸の３分の１、ヒドロキシプロリンとプロリンの総量が全アミノ酸の４分の１を占める。そしてコラーゲンは、一般のタンパク質に含まれない特殊なアミノ酸として、ヒドロキシリジンとヒドロキシプロリンを含む。ヒドロキシプロリンは、コラーゲンの基本構造である三重らせん構造を安定化させる役割を担い、ヒドロキシリジンは、コラーゲン生合成の最終段階である線維の熟成、架橋形成に重要な役割を果たしている。 Collagen accounts for about 30% of animal body proteins, and is a major protein constituting not only skin but also bones, teeth, tendons and the like. Collagen has a characteristic amino acid composition, with glycine accounting for one third of all amino acids and the total amount of hydroxyproline and proline accounting for one quarter of all amino acids. Collagen contains hydroxylysine and hydroxyproline as special amino acids not included in general proteins. Hydroxyproline plays a role in stabilizing the triple helix structure, which is the basic structure of collagen, and hydroxylysine plays an important role in fiber ripening and crosslinking, which are the final stages of collagen biosynthesis.
コラーゲン前駆体中のプロリン残基やリジン残基をヒドロキシル化して、コラーゲン特有のヒドロキシプロリン残基に変える課程にアスコルビン酸（ビタミンＣ）が関与していることが知られており、アスコルビン酸が欠乏することにより生成するコラーゲン線維の性質が変化し、壊血病を引き起こす（非特許文献２）。 It is known that ascorbic acid (vitamin C) is involved in the process of hydroxylating proline and lysine residues in collagen precursors and converting them to hydroxyproline residues peculiar to collagen. As a result, the nature of the collagen fibers produced changes, causing scurvy (Non-Patent Document 2).
アスコルビン酸は強い還元性を有し、プロリン残基やリジン残基をヒドロキシル化すると、デヒドロアスコルビン酸へと酸化される。デヒドロアスコルビン酸は、生体内において、グルタチオンを水素供与体としてデヒドロアスコルビン酸レダクターゼにより、又はシステイン、グルタチオンなどのチオール化合物により非酵素的にアスコルビン酸に還元される（非特許文献３）。 Ascorbic acid has strong reducibility, and when proline residue or lysine residue is hydroxylated, it is oxidized to dehydroascorbic acid. Dehydroascorbic acid is reduced to ascorbic acid non-enzymatically in vivo by glutathione as a hydrogen donor by dehydroascorbate reductase or by thiol compounds such as cysteine and glutathione (Non-patent Document 3).
アスコルビン酸がコラーゲン産生を促進することは知られていた（特許文献１及び特許文献２）が、グルタチオンとコラーゲン産生との関係については、線維芽細胞内グルタチオン量の減少が、コラーゲン産生量の増加と関係している（特許文献３）と記載されているに過ぎなかった。 It has been known that ascorbic acid promotes collagen production (Patent Documents 1 and 2). Regarding the relationship between glutathione and collagen production, a decrease in the amount of glutathione in fibroblasts indicates an increase in collagen production. (Patent Document 3).
したがって、アスコルビン酸サイクルにおいて、グルタチオンを水素供与体としてデヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸に変換する工程が知られていたものの、グルタチオン量の減少が、コラーゲン産生量の増加と関係していることから、グルタチオンの増加が必ずしもアスコルビン酸サイクルを駆動しているわけではないという結論が導かれていた。この結論は、グルタチオンが、生体内で細胞内チオール環境の維持や毒物・薬物などの細胞外排出といった多岐にわたる生理機能を有することに起因すると考えられていた。 Therefore, although a process for converting dehydroascorbic acid to ascorbic acid using glutathione as a hydrogen donor in the ascorbic acid cycle has been known, glutathione is associated with an increase in collagen production because glutathione is decreased. The conclusion has been drawn that the increase in is not necessarily driving the ascorbic acid cycle. This conclusion was thought to be due to the fact that glutathione has a wide variety of physiological functions such as maintaining an intracellular thiol environment and extracellular excretion of toxins and drugs in vivo.
コラーゲン又はコラーゲンペプチドの摂取によるコラーゲン産生促進作用を確認すること、アスコルビン酸サイクルを駆動することによりコラーゲン産生を促進する方法を提供すること、並びにアスコルビン酸サイクルを駆動する物質を提供することが本発明の課題である。 The present invention is to confirm the collagen production promoting action by ingesting collagen or collagen peptide, to provide a method for promoting collagen production by driving the ascorbic acid cycle, and to provide a substance that drives the ascorbic acid cycle. It is a problem.
本発明者らがコラーゲンペプチド含有食品を摂取させたヒトにおいて、メタボローム解析を実施して鋭意研究した結果、コラーゲンペプチド含有食品の摂取により、アスコルビン酸サイクルに関与するグルタチオン（システイン）がコラーゲンペプチドの含有食品を摂取した後に減少することを見出した（図４）。 As a result of intensive studies by conducting metabolomic analysis in humans ingested by the present inventors with collagen peptide-containing foods, glutathione (cysteine) involved in the ascorbic acid cycle is contained in collagen peptides by ingesting collagen peptide-containing foods. We found that it decreased after ingesting food (FIG. 4).
これらの結果は、コラーゲンペプチド含有食品の摂取により、デヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸へと変換するサイクルが駆動された結果、グルタチオンが減少したということを示すものである。すなわち、コラーゲンペプチドの単独摂取によってコラーゲン産生は促進し、アスコルビン酸サイクルが駆動された結果、体内におけるグルタチオンが枯渇してしまい、コラーゲンペプチドの単独摂取ではコラーゲン産生が限定的になるという驚くべき知見を得た。 These results indicate that glutathione decreased as a result of driving the cycle of converting dehydroascorbic acid to ascorbic acid by ingestion of collagen peptide-containing foods. That is, collagen production is promoted by ingestion of collagen peptide alone, and ascorbic acid cycle is driven.As a result, glutathione in the body is depleted. Obtained.
そこで、本発明者らは、コラーゲン産生を促進するには、アスコルビン酸サイクルを継続的に駆動することが必要であるという結論に到り、本発明に到った。すなわち、本発明は、アスコルビン酸サイクルを駆動することによるコラーゲン産生の促進方法に関する。アスコルビン酸サイクルの駆動は、グルタチオン及び／又はシステインを投与することによる。このアプローチは、特許文献３に記載のコラーゲン産生量を増加させるためにグルタチオンを減少させる化合物を投与する手法とは真逆である。特許文献３は、グルタチオン量の減少が、コラーゲン産生量の増加と関係していることを見出したが、この関係はコラーゲン産生量が増加することにより、グルタチオンが枯渇した結果を見出したにすぎない。したがって、特許文献３に記載されるようにグルタチオンを減少させる化合物を投与したとしても、コラーゲン産生量の増加は期待できず、本願に記載されるようにグルタチオン（又はシステイン）を投与するか、又はグルタチオン（又はシステイン）を増加させる化合物を投与することで始めて、アスコルビン酸サイクルを継続的に駆動することができ、結果としてコラーゲン産生量の増加を導くことが可能となる。
Thus, the present inventors have come to the conclusion that it is necessary to continuously drive the ascorbic acid cycle in order to promote collagen production. That is, the present invention relates to a method for promoting collagen production by driving an ascorbic acid cycle. The drive of the ascorbic acid cycle is by administering glutathione and / or cysteine. This approach is the opposite of the technique of administering a compound that decreases glutathione in order to increase the amount of collagen production described in
グルタチオン又はシステインを投与することにより、アスコルビン酸サイクルが継続的に駆動されて、コラーゲン産生が促進され（図１及び５）、さらにアスコルビン酸とグルタチオンの組合せ、並びにアスコルビン酸とシステインの組合せを投与することにより、高い効果でコラーゲン産生を促進することが明らかになった（図７）。 By administering glutathione or cysteine, the ascorbic acid cycle is continuously driven to promote collagen production (FIGS. 1 and 5), and further a combination of ascorbic acid and glutathione and a combination of ascorbic acid and cysteine are administered. As a result, it was revealed that collagen production was promoted with a high effect (FIG. 7).
本発明により、アスコルビン酸サイクルを継続的に駆動することにより、コラーゲン及び／又はコラーゲンペプチドを単独摂取した場合よりも、皮膚におけるコラーゲン産生が促進される。これにより、皮膚の荒れ、しわ、たるみが改善し、皮膚の老化防止、並びに皮膚の張りや艶、弾力性の向上が期待される。 According to the present invention, by continuously driving the ascorbic acid cycle, collagen production in the skin is promoted more than when collagen and / or collagen peptide is ingested alone. As a result, rough skin, wrinkles and sagging are improved, and anti-aging of the skin, as well as enhancement of skin tension, gloss and elasticity are expected.
グルタチオン、システイン、アスコルビン酸、コラーゲンは、いずれも体内に存在する化合物であり、すでにその安全性が認められているものであることから、これらを投与する方法、又はこれらを含む組成物についてもその安全性は極めて高い。 Glutathione, cysteine, ascorbic acid, and collagen are all compounds existing in the body, and their safety has already been recognized. Therefore, the method of administering them, and the composition containing them are also included. Safety is extremely high.
本発明の１の態様は、アスコルビン酸サイクルを駆動することによるコラーゲン産生の促進方法に関する。アスコルビン酸サイクルの駆動は、グルタチオン及びシステインからなる群から選ばれるいずれか１つ以上を投与することにより、酸化型アスコルビン酸をアスコルビン酸へと還元する反応を促進し、結果としてコラーゲンの産生を増大させることである（図１及び図５を参照のこと）。さらにはアスコルビン酸サイクルの駆動は、グルタチオン及び／又はシステインを増加させる薬剤を投与することにより達成することもできる。このようなコラーゲン産生の促進方法は、コラーゲン産生を必要とするヒトに対して行われることが好ましい。コラーゲン産生を必要とするヒトとは、シワやたるみの予防・改善、ひいては皮膚老化の防止を望むヒトのことを指すが、それらに限られるものではなく、その場合本発明のコラーゲン産生の促進方法は、シワやたるみの予防・改善方法、皮膚老化の予防方法になる。 One aspect of the present invention relates to a method for promoting collagen production by driving an ascorbic acid cycle. The driving of the ascorbic acid cycle promotes the reaction of reducing oxidized ascorbic acid to ascorbic acid by administering at least one selected from the group consisting of glutathione and cysteine, resulting in increased collagen production. (See FIGS. 1 and 5). Furthermore, driving of the ascorbic acid cycle can also be achieved by administering an agent that increases glutathione and / or cysteine. Such a method for promoting collagen production is preferably performed for humans who require collagen production. The human in need of collagen production refers to a person who wants to prevent or improve wrinkles and sagging, and hence prevention of skin aging, but is not limited thereto, in which case the method for promoting collagen production of the present invention Is a method for preventing and improving wrinkles and sagging, and a method for preventing skin aging.
本発明の他の実施態様では、上記コラーゲン産生の促進方法において、さらにアスコルビン酸が投与されてもよい。アスコルビン酸の投与は、コラーゲン産生のために駆動されているアスコルビン酸サイクルを増強し、結果としてコラーゲンの産生を促進する（図７を参照のこと）。 In another embodiment of the present invention, ascorbic acid may be further administered in the method for promoting collagen production. Administration of ascorbic acid enhances the ascorbic acid cycle that is driven for collagen production and consequently promotes collagen production (see FIG. 7).
本発明のさらなる実施態様では、上記コラーゲン産生の促進方法において、コラーゲン及び／又はコラーゲンペプチドがさらに投与されてもよい。コラーゲン及び／又はコラーゲンペプチドは、皮膚においてコラーゲン特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンを増加する（図２を参照のこと）。皮膚におけるヒドロキシプロリンの増加は、皮膚におけるコラーゲンの増加を示す。コラーゲン及び／又はコラーゲンペプチドの投与が、皮膚におけるコラーゲンを増加させる点については、ヒト線維芽細胞を用いた実験においても示されている（図３を参照のこと）。したがって、コラーゲン及び／又はコラーゲンペプチドを、グルタチオン及び／又はシステインと併せて投与することにより、コラーゲン産生により減少するアスコルビン酸を補充しつつ、コラーゲンを継続的に産生させることを可能にし、結果として大幅にコラーゲン産生を促進することができる。さらにアスコルビン酸を投与することによりアスコルビン酸サイクルを増強することができる。 In a further embodiment of the present invention, collagen and / or collagen peptide may be further administered in the method for promoting collagen production. Collagen and / or collagen peptide increases hydroxyproline, an amino acid unique to collagen in the skin (see FIG. 2). An increase in hydroxyproline in the skin indicates an increase in collagen in the skin. The fact that administration of collagen and / or collagen peptide increases collagen in the skin has also been shown in experiments using human fibroblasts (see FIG. 3). Therefore, by administering collagen and / or collagen peptide in combination with glutathione and / or cysteine, it is possible to continuously produce collagen while supplementing ascorbic acid that decreases due to collagen production. In addition, collagen production can be promoted. Furthermore, the ascorbic acid cycle can be enhanced by administering ascorbic acid.
本発明の１の態様では、本発明は、グルタチオン及びシステインからなる群から選ばれる１つ以上を含んでなるコラーゲン産生促進剤に関する。当該コラーゲン産生促進剤は、アスコルビン酸サイクルを駆動することによりコラーゲン産生を促進する。皮膚においてコラーゲンの産生が促進されることにより、しわ、たるみの予防・改善することができるため、コラーゲン産生促進剤は、しわ、たるみ予防・改善用の組成物、及び抗老化用組成物として用いられる。 In one aspect of the present invention, the present invention relates to a collagen production promoter comprising one or more selected from the group consisting of glutathione and cysteine. The collagen production promoter promotes collagen production by driving the ascorbic acid cycle. Collagen production promoter is used as a composition for wrinkle, sagging prevention / improvement, and an anti-aging composition because collagen production in skin can be promoted to prevent / improve wrinkles and sagging. It is done.
本発明の他の実施態様では、上記コラーゲン産生促進剤は、アスコルビン酸をさらに含んでもよい。アスコルビン酸を含めることで、アスコルビン酸サイクルが増強され、結果としてコラーゲン産生が大幅に促進される（図７）。 In another embodiment of the present invention, the collagen production promoter may further contain ascorbic acid. Inclusion of ascorbic acid enhances the ascorbic acid cycle and, as a result, greatly promotes collagen production (FIG. 7).
本発明のさらなる実施態様では、上記コラーゲン産生促進剤は、さらにコラーゲン及び／又はコラーゲンペプチドを含む。コラーゲン及び／又はコラーゲンペプチドを含むことで、コラーゲン産生が大幅に促進される。 In a further embodiment of the present invention, the collagen production promoter further comprises collagen and / or collagen peptide. By including collagen and / or collagen peptide, collagen production is greatly promoted.
本発明の１の態様では、本発明は、グルタチオン、システイン、コラーゲン若しくはコラーゲンペプチドからなる群から選ばれる２以上の組合せを含んでなる食品に関する。好ましくは、上記食品は、グルタチオン、システイン、コラーゲン、及びアスコルビン酸を含む。 In one aspect of the present invention, the present invention relates to a food comprising a combination of two or more selected from the group consisting of glutathione, cysteine, collagen or collagen peptide. Preferably, the food product comprises glutathione, cysteine, collagen, and ascorbic acid.
本発明において、投与されるコラーゲンは、動物由来の任意のコラーゲンが含まれ、例えばブタ、ウシ、魚などに由来するコラーゲンである。このようなコラーゲンのペプチドであってもよい。 In the present invention, the collagen to be administered includes any collagen derived from animals, for example, collagen derived from pigs, cows, fish and the like. Such a collagen peptide may be used.
本発明において、アスコルビン酸には、体内においてアスコルビン酸に変換されるプロビタミンＣも含むものとする。プロビタミンＣとしては、例えば、アスコルビン酸−２−リン酸−６−パルミテートナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 In the present invention, ascorbic acid includes provitamin C that is converted into ascorbic acid in the body. Examples of provitamin C include, but are not limited to, ascorbic acid-2-phosphate-6-palmitate sodium and the like.
本発明において、投与とは、経口投与、経皮投与、静脈内投与、腹腔内投与、舌下投与などが挙げられるがそれらに限られない。これらの中で経口投与が好ましい。 In the present invention, administration includes oral administration, transdermal administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, sublingual administration, and the like, but is not limited thereto. Of these, oral administration is preferred.
本発明において、アスコルビン酸サイクルとは、図１において表されるようにコラーゲン前駆体のプロリン及び／又はリジン残基のヒドロキシル化により、アスコルビン酸（Ａｓｃ）がデヒドロアスコルビン酸（酸化型ＡＳＣ）に酸化し、このデヒドロアスコルビン酸をグルタチオン（ＧＳＨ）が還元してアスコルビン酸に戻すサイクルを言う。グルタチオンにより還元されたアスコルビン酸は再びプロリン及び／又はリジン残基をヒドロキシル化するのに用いられる。デヒドロアスコルビン酸を還元する反応により、グルタチオンは、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）に変換され、こうして生じた酸化型グルタチオンは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の作用によりグルタチオンへと再び還元される。グルタチオンは、システイン、グルタミン酸、及びグリシンのトリペプチドであり、システインの投与によりグルタチオン量を増やすことができる。 In the present invention, ascorbic acid cycle means that ascorbic acid (Asc) is oxidized to dehydroascorbic acid (oxidized ASC) by hydroxylation of proline and / or lysine residue of collagen precursor as shown in FIG. The dehydroascorbic acid is reduced by glutathione (GSH) and returned to ascorbic acid. Ascorbic acid reduced by glutathione is again used to hydroxylate proline and / or lysine residues. By the reaction of reducing dehydroascorbic acid, glutathione is converted to oxidized glutathione (GSSG), and the resulting oxidized glutathione is reduced again to glutathione by the action of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH). . Glutathione is a tripeptide of cysteine, glutamic acid, and glycine, and the amount of glutathione can be increased by administration of cysteine.
実施例１：コラーゲン摂取がヒトの皮膚におけるヒドロキシプロリン量に与える影響
メタボローム解析
４０００ｍｇのコラーゲンペプチド（HACP-U2 ゼライス社製）、４００ｍｇのクエン酸、１２ｍｇの甘味料（スクラロース、アセスルファムK）、及び２００ｍｇの香料、及び１００ｍｇのカラメル色素を含んでなる４ｇコラーゲン含有ドリンクを、４週間にわたり被験者に１日１本与えた。４ｇコラーゲン含有ドリンク摂取前および４週間後に、被験者の臀部より皮膚組織を採取した。消毒薬（0.05%ヒビテン）で皮膚採取部位を消毒し、局所麻酔薬（1%エピネフリン含有キシロカイン）を採取部位に注射し、パンチバイオプシーを内径3mmのデルマパンチを用いて実施し、皮膚組織を採取した。皮膚組織にメタノールを加えてホモジナイズし、皮膚成分を抽出した後、水・クロロホルムを加えて液―液分配を行い、脂質類の除去を行った。その後、限外ろ過フィルター（ミリポア社、UFC3 LCC 00）を用いて、ろ過を行った後、遠心エバポレーターを用いて乾固させた。その後、組織重量に応じたミリＱ水を加えて再溶解した後、CE-TOFMS（アジレント社）を用いて、分析を行った。データの解析には解析ソフトMaster Hands（慶応大）を用い、ヒドロキシプロリンに該当するピーク面積を測定した（図２）。
Example 1: Effect of collagen intake on the amount of hydroxyproline in human skin
Metabolomic analysis A 4 g collagen-containing drink comprising 4000 mg collagen peptide (HACP-U2 Zelice), 400 mg citric acid, 12 mg sweetener (sucralose, acesulfame K), 200 mg flavor, and 100 mg caramel pigment. Subjects were given one daily for 4 weeks. Skin tissue was collected from the buttocks of the subject before ingesting the 4 g collagen-containing drink and after 4 weeks. Disinfect the skin collection site with disinfectant (0.05% Hibiten), inject local anesthetic (1% epinephrine-containing xylocaine) into the collection site, perform punch biopsy using a derma punch with an inner diameter of 3 mm, and collect skin tissue did. Methanol was added to the skin tissue and homogenized to extract skin components, and then water / chloroform was added to perform liquid-liquid partition to remove lipids. Then, after filtering using an ultrafiltration filter (Millipore, UFC3 LCC 00), it was made to dry using a centrifugal evaporator. Thereafter, milli-Q water corresponding to the tissue weight was added and redissolved, and then analysis was performed using CE-TOFMS (Agilent). For analysis of the data, analysis software Master Hands (Keio Univ.) Was used to measure the peak area corresponding to hydroxyproline (FIG. 2).
実施例２：コラーゲン摂取がヒトの皮膚におけるグルタチオン量に与える影響
メタボローム解析
実施例１と同じ処方の４ｇコラーゲン含有ドリンクを、４週間にわたり被験者に１日１本与えた。４ｇコラーゲン含有ドリンク摂取前および４週間後に、被験者の臀部より皮膚組織を採取した。消毒薬（0.05%ヒビテン）で皮膚採取部位を消毒し、局所麻酔薬（1%エピネフリン含有キシロカイン）を採取部位に注射し、パンチバイオプシーを内径3mmのデルマパンチを用いて実施し、皮膚組織を採取した。皮膚組織にメタノールを加えてホモジナイズし、皮膚成分を抽出した後、水・クロロホルムを加えて液―液分配を行い、脂質類の除去を行った。その後、限外ろ過フィルター（ミリポア社、UFC3 LCC 00）を用いて、ろ過を行った後、遠心エバポレーターを用いて乾固させた。その後、組織重量に応じたミリＱ水を加えて再溶解した後、CE-TOFMS（アジレント社）を用いて、分析を行った。データの解析には解析ソフトMaster Hands（慶応大）を用いた。４ｇコラーゲン含有ドリンク摂取前のグルタチオンの平均量を１００とすると、４週間後のグルタチオンの平均量は３５．４に減少した（図４）。
Example 2: Effect of collagen intake on glutathione content in human skin
Metabolomic Analysis A 4 g collagen-containing drink having the same formulation as in Example 1 was given to the subject once a day for 4 weeks. Skin tissue was collected from the buttocks of the subject before ingesting the 4 g collagen-containing drink and after 4 weeks. Disinfect the skin collection site with disinfectant (0.05% Hibiten), inject local anesthetic (1% epinephrine-containing xylocaine) into the collection site, perform punch biopsy using a derma punch with an inner diameter of 3 mm, and collect skin tissue did. Methanol was added to the skin tissue and homogenized to extract skin components, and then water / chloroform was added to perform liquid-liquid partition to remove lipids. Then, after filtering using an ultrafiltration filter (Millipore, UFC3 LCC 00), it was made to dry using a centrifugal evaporator. Thereafter, milli-Q water corresponding to the tissue weight was added and redissolved, and then analysis was performed using CE-TOFMS (Agilent). Analysis software Master Hands (Keio Univ.) Was used for data analysis. Assuming that the average amount of glutathione before ingesting the 4 g collagen-containing drink was 100, the average amount of glutathione after 4 weeks decreased to 35.4 (FIG. 4).
実施例３：ヒト線維芽細胞によるコラーゲン産生についてのコラーゲンペプチドの影響
２４ウェルプレートに１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を加え、ヒト線維芽細胞を６×１０4細胞／ウェルで播種し接着を確認後、培地を吸引した。１ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳで洗浄後、０．５ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳを加えた。２日目に、ニッピ社コラーゲンペプチドＦＣＰ、１００μｇ／ｍｌのゼライス社コラーゲンペプチドＨＡＣＰを終濃度が各１００μｇ/ｍｌになるように加え、対照については添加せずに４８時間培養した。培養後、培地を採取し、−２０℃で保存した後にコラーゲンアッセイに用いた。培養上清を除去した後に０．５ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳで細胞を洗浄し、１０％アラマブルー／ＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳを０．５ｍＬ添加し、すぐに０時間における蛍光値を測定した。その後３時間培養して、３時間目における蛍光値を測定した。（３時間後蛍光値）−（０時間蛍光値）の値をもとに細胞生存率を計算した。ＰＩＰ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｉ型コラーゲン産生量測定キット：タカラバイオ社）を用いて、製品説明書に従い、上記で採取し保存した培地中のコラーゲン量を測定し、コラーゲン産生量を細胞生存率で補正した（コラーゲン産生／細胞生存率）。結果を図３に示す。
Example 3 Influence of Collagen Peptide on Collagen Production by Human Fibroblasts After adding DMEM medium with 10% FBS to a 24-well plate and seeding human fibroblasts at 6 × 10 4 cells / well, and confirming adhesion, The medium was aspirated. After washing with 1 mL of DMEM / 0.5% FBS, 0.5 mL of DMEM / 0.5% FBS was added. On the second day, Nippi Collagen Peptide FCP, 100 μg / ml Zelice Collagen Peptide HACP was added to a final concentration of 100 μg / ml, and the control was cultured for 48 hours without addition. After culturing, the medium was collected and stored at −20 ° C. and then used for collagen assay. After removing the culture supernatant, the cells were washed with 0.5 mL of DMEM / 0.5% FBS, and 0.5 mL of 10% Arama Blue / DMEM / 0.5% FBS was added. It was measured. Thereafter, the cells were cultured for 3 hours, and the fluorescence value at the 3rd hour was measured. The cell viability was calculated based on the value of (fluorescence value after 3 hours) − (0 hour fluorescence value). Using the PIP EIA Kit (type I collagen production measurement kit: Takara Bio Inc.), according to the product instructions, the amount of collagen in the medium collected and stored as above was measured, and the amount of collagen production was corrected by the cell viability (Collagen production / cell viability). The results are shown in FIG.
実施例４：ヒト線維芽細胞によるコラーゲン産生についてのグルタチオン又はシステインの影響
２４ウェルプレートに１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を加え、ヒト繊維芽細胞を６×１０4細胞／ウェルの密度で播種し接着を確認後、培地を吸引した。１ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳで洗浄後、０．５ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳを加えた。２日目に、グルタチオン及びシステインを終濃度が各１mＭとなるように添加し、対照については添加せずに４８時間培養した。培養後、培地を採取し、−２０℃で保存した後にコラーゲンアッセイに用いた。培地を除去した細胞に０．５ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳで細胞を洗浄し、１０％アラマブルー／ＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳを０．５ｍＬ添加し、すぐに０時間における蛍光値を測定した。その後３時間培養して、３時間目における蛍光値を測定した。（３時間後蛍光値）−（０時間蛍光値）の値をもとに細胞生存率を計算した。ＰＩＰ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｉ型コラーゲン産生量測定キット：タカラバイオ社）を用いて、製品説明書に従い、上記で採取し保存した培地中のコラーゲン量を測定し、コラーゲン産生量を細胞生存率で補正した（コラーゲン産生／細胞生存率）。結果を図５に示す。
Example 4: Effect of glutathione or cysteine on collagen production by human fibroblasts DMEM medium supplemented with 10% FBS was added to a 24-well plate, and human fibroblasts were seeded at a density of 6 × 10 4 cells / well to adhere. After confirmation, the medium was aspirated. After washing with 1 mL of DMEM / 0.5% FBS, 0.5 mL of DMEM / 0.5% FBS was added. On the second day, glutathione and cysteine were added to a final concentration of 1 mM each, and the control was cultured for 48 hours without addition. After culturing, the medium was collected and stored at −20 ° C. and then used for collagen assay. The cells after removing the medium were washed with 0.5 mL of DMEM / 0.5% FBS, 0.5 mL of 10% Arama Blue / DMEM / 0.5% FBS was added, and the fluorescence value at 0 hour was immediately measured. did. Thereafter, the cells were cultured for 3 hours, and the fluorescence value at the 3rd hour was measured. The cell viability was calculated based on the value of (fluorescence value after 3 hours) − (0 hour fluorescence value). Using the PIP EIA Kit (type I collagen production measurement kit: Takara Bio Inc.), according to the product instructions, the amount of collagen in the medium collected and stored as above was measured, and the amount of collagen production was corrected by the cell viability (Collagen production / cell viability). The results are shown in FIG.
実施例５：ヒト線維芽細胞によるコラーゲン産生についてのアスコルビン酸とコラーゲンペプチドの作用
２４ウェルプレートに１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を加え、ヒト線維芽細胞を６×１０4細胞／ウェルで播種し接着を確認後、培地を吸引した。１ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳで洗浄後、０．５ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳを加えた。２日目に、アスコルビン酸、アスコルビン酸＋ニッピ社コラーゲンペプチドＦＣＰ、アスコルビン酸＋ゼライス社コラーゲンペプチドＨＡＣＰをアスコルビン酸は終濃度１０μMに、コラーゲンペプチドは１００μｇ/mLになるように加え、対照については添加せずに４８時間培養した。培養後、培地を採取し、−２０℃で保存した後にコラーゲンアッセイに用いた。培養上清を除去した後に０．５ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳで細胞を洗浄し、１０％アラマブルー／ＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳを０．５ｍＬ添加し、すぐに０時間における蛍光値を測定した。その後３時間培養して、３時間目における蛍光値を測定した。（３時間後蛍光値）−（０時間蛍光値）の値をもとに細胞生存率を計算した。ＰＩＰ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｉ型コラーゲン産生量測定キット：タカラバイオ社）を用いて、製品説明書に従い、保存された培地中のコラーゲン量を測定し、コラーゲン産生量を細胞生存率で補正した（コラーゲン産生／細胞生存率）。結果を図６に示す。
Example 5: Effect of Ascorbic Acid and Collagen Peptide on Collagen Production by Human Fibroblasts Add DMEM medium with 10% FBS to a 24-well plate and seed human fibroblasts at 6 × 10 4 cells / well for adhesion. After confirmation, the medium was aspirated. After washing with 1 mL of DMEM / 0.5% FBS, 0.5 mL of DMEM / 0.5% FBS was added. On the second day, ascorbic acid, ascorbic acid + Nippi collagen peptide FCP, ascorbic acid + Zelais collagen peptide HACP were added to a final concentration of 10 μM for ascorbic acid and 100 μg / mL for collagen peptide, and added for control. Without culturing for 48 hours. After culturing, the medium was collected and stored at −20 ° C. and then used for collagen assay. After removing the culture supernatant, the cells were washed with 0.5 mL of DMEM / 0.5% FBS, and 0.5 mL of 10% Arama Blue / DMEM / 0.5% FBS was added. It was measured. Thereafter, the cells were cultured for 3 hours, and the fluorescence value at the 3rd hour was measured. The cell viability was calculated based on the value of (fluorescence value after 3 hours) − (0 hour fluorescence value). Using a PIP EIA Kit (type I collagen production measurement kit: Takara Bio Inc.), the amount of collagen in the stored medium was measured according to the product instructions, and the collagen production was corrected with the cell viability (collagen production / Cell viability). The results are shown in FIG.
実施例６：ヒト線維芽細胞によるコラーゲン産生についてのアスコルビン酸とグルタチオン又はシステインの作用
２４ウェルプレートに１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を加え、ヒト繊維芽細胞を６×１０4細胞／ウェルの密度で播種し接着を確認後、培地を吸引した。１ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳで洗浄後、０．５ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳを加えた。２日目に、アスコルビン酸、アスコルビン酸＋グルタチオン、及びアスコルビン酸＋システインを、アスコルビン酸は終濃度１０μMに、グルタチオンおよびシステインは１ｍMになるように添加し、対照については添加せずに４８時間培養した。培養後、培地を採取し、−２０℃で保存した後にコラーゲンアッセイに用いた。培地を除去した細胞に０．５ｍＬのＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳで細胞を洗浄し、１０％アラマブルー／ＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳを０．５ｍＬ添加し、すぐに０時間における蛍光値を測定した。その後３時間培養して、３時間目における蛍光値を測定した。（３時間後蛍光値）−（０時間蛍光値）の値をもとに細胞生存率を計算した。ＰＩＰ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｉ型コラーゲン産生量測定キット：タカラバイオ社）を用いて、製品説明書に従い、保存された培地中のコラーゲン量を測定し、コラーゲン産生量を細胞生存率で補正した（コラーゲン産生／細胞生存率）。結果を図７に示す。
Example 6: Effect of Ascorbic Acid and Glutathione or Cysteine on Collagen Production by Human Fibroblasts DMEM medium supplemented with 10% FBS is added to a 24-well plate, and human fibroblasts are seeded at a density of 6 × 10 4 cells / well. After confirming adhesion, the medium was aspirated. After washing with 1 mL of DMEM / 0.5% FBS, 0.5 mL of DMEM / 0.5% FBS was added. On
結論
本発明者らの研究により、コラーゲンペプチドの摂取が、ヒトにおいて、コラーゲン特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンの量を増加させること（図２）、並びにin vitroにおいてコラーゲンペプチドがヒト線維芽細胞においてコラーゲン産生を増加させること（図３）が示された。その一方で、コラーゲンペプチドの摂取が、ヒトにおいてグルタチオン量の低下を招くことが明らかになり（図４）、コラーゲン産生をさらに増加させるためにはコラーゲンペプチドの投与に加えアスコルビン酸サイクルを駆動するグルタチオンの投与が必要であることが示された（図５）。また、コラーゲンペプチドをアスコルビン酸とともに投与すること、並びにアスコルビン酸を、グルタチオンと供に投与することで、ヒト線維芽細胞において高いコラーゲン産生の効果を生ずることが示された（図６及び図７）。コラーゲンペプチドによるコラーゲン産生効果と、アスコルビン酸の添加が相乗効果を示すことから、アスコルビン酸サイクルを駆動するグルタチオン・システインの投与によるコラーゲン産生効果とコラーゲンペプチドによるコラーゲン産生効果も高い効果を示すと考えられる。
CONCLUSION According to our studies, ingestion of collagen peptides increases the amount of hydroxyproline, a unique amino acid of collagen, in humans (FIG. 2), and collagen peptides in human fibroblasts in vitro It was shown to increase production (Figure 3). On the other hand, it has been clarified that intake of collagen peptide leads to a decrease in glutathione level in humans (FIG. 4), and in order to further increase collagen production, glutathione that drives the ascorbic acid cycle in addition to administration of collagen peptide. Was shown to be necessary (FIG. 5). It was also shown that administration of a collagen peptide together with ascorbic acid and administration of ascorbic acid together with glutathione produced a high collagen production effect in human fibroblasts (FIGS. 6 and 7). . Collagen production effect by collagen peptide and addition of ascorbic acid show synergistic effect, so it is thought that collagen production effect by administration of glutathione cysteine that drives ascorbic acid cycle and collagen production effect by collagen peptide also show high effect .
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