JP2012530785A - 組成物および黄色ブドウ球菌(Staphylococcusaureus)血清型5および8莢膜多糖コンジュゲート免疫原性組成物を調製するための方法 - Google Patents
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Abstract
【図4】
Description
本出願は、2009年6月22日出願の米国仮特許出願第61/219,143号および第61/219,151号の優先権の利益を主張するものであり、それらの全開示は、それらの全体が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれるものとする。
本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5および8莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートならびにそれらを調製および使用するための方法に関する。本発明の免疫原性コンジュゲートの新規な特徴は、多糖および得られたコンジュゲートの分子量プロファイル、CRM197担体タンパク質当たりのコンジュゲートしているリシンと多糖と共有結合しているリシンの数の比、多糖の反復単位の関数としての担体タンパク質と多糖の間の共有結合の数、および総多糖と比較した遊離多糖の相対量を包含する。本明細書で使用されている「遊離多糖」という用語は、担体タンパク質とコンジュゲートしていないが、それにも関わらずコンジュゲート組成物中に存在する多糖を意味する。
上に記載されているように、本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5または8莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートに関する。本発明の一実施形態は、下記の特徴のうちの1つまたは複数を有する担体分子またはタンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5または8莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを提供し:多糖は、50kDaから700kDaの間の分子量を有し;免疫原性コンジュゲートは、500kDaから2500kDaの間の分子量を有し;コンジュゲートは、総多糖に対して約30%未満の遊離多糖を含む。一部の実施形態において、多糖は、20kDaから1000kDaの間の分子量を有する。一部の実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、200kDaから5000kDaの間の分子量を有する。他の実施形態において、コンジュゲートは、総多糖に対して約25%、約20%、約15%、約10%、または約5%未満の遊離多糖を含む。
[→4)−β−D−ManNAcA−(1→4)−3−O−Ac−α−L−FucNAc−(1→3)−β−D FucNAc−(1→]n
および血清型8
[→3)−4−O−Ac−β−D−ManNAcA−(1→3)−α−L−FucNAc−(1→3)−β−D FucNAc−(1→]n
Jones(2005)Carbohydr.Res.340:1097〜1106を参照されたい。血清型8莢膜多糖は、血清型5莢膜多糖と類似した三糖反復単位を有し、しかしながら、それらは、糖結合およびO−アセチル化部位の点で異なり、免疫反応性の血清学的に相異なるパターンを生み出す(Fournierら(1984)Infect.Immun.45:87〜93;およびMoreauら(1990)Carbohydr.Res.201:285〜297)。したがって、血清型8および5莢膜多糖は、水に可溶で、通常は酸性である比較的複雑な炭水化物であり、おおよそ25kDaの分子量を有するとこれまで考えられていた(Fattom(1990)Infect.Immun.58、2367〜2374)。
本発明の免疫原性組成物は、単位投与量または複数回投与形態(例えば、2投与量、4投与量、またはそれ以上)で包装することができる。複数回投与形態については、バイアルが典型的であるが、必ずしも充填済み注射器より好ましいわけではない。適当な複数回投与フォーマットは、1投与量当たり0.1〜2mLにて1容器当たり2〜10投与量を包含するが、それらに限定されるものではない。ある種の実施形態において、投与量は、0.5mL投与量である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている国際特許出願WO2007/127668を参照されたい。
本発明は、本明細書に記載されている免疫原性コンジュゲートを作製する方法も包含する。本発明の免疫原性コンジュゲートを作製するための方法には、CDI(1,1−カルボニルジイミダゾール)、CDT(1,1−カルボイル−ジ−1,2,4−トリアゾール)またはPDPH(3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド)を伴うコンジュゲーション化学反応を使用する莢膜多糖の担体タンパク質との共有結合コンジュゲーションを伴う。
本発明は、本明細書に記載されている免疫原性組成物についての使用方法も包含する。例えば、本発明の一実施形態は、免疫原性量の本明細書に記載されている免疫原性組成物のうちのいずれかを対象に投与することを含む黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本発明の一実施形態は、黄色ブドウ球菌(S.aureus)による感染から対象を防御する方法、または黄色ブドウ球菌(S.aureus)による感染を予防する方法、または黄色ブドウ球菌(S.aureus)により引き起こされる感染に関係する少なくとも1つの症状の重症度を軽減するかその発症を遅らせる方法であって、免疫原性量の本明細書に記載されている免疫原性組成物のうちのいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。本発明の一実施形態は、対象においてブドウ球菌性の感染、ブドウ球菌属種(Staphylococcus sp.)に関係する疾患または状態を治療または予防する方法であって、対象に治療的または予防的に有効な量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ブドウ球菌性の感染、疾患または状態を治療または予防する方法は、ヒトの、家畜の、動物の、または農業の処置を含む。別の実施形態は、対象においてブドウ球菌性の感染、ブドウ球菌属種(Staphylococcus sp.)に関係する疾患または状態を治療または予防する方法であって、本明細書に記載されている免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成させ、前記抗体調製物を使用し、対象に受動免疫を与えるステップを含む方法を提供する。本発明の一実施形態は、手術手順を受けている対象においてブドウ球菌性感染を予防する方法であって、手術手順の前に対象に予防的に有効な量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
細胞系(例えば、HL60)の分化したエフェクター細胞または製造者のプロトコル通りにLYMPHOLYTE(登録商標)−ポリ溶液(Cedarlane laboratories limited、Ontario、Canada)を使用してドナーヒト血液から単離された多形核細胞(PMN)をこのアッセイのために使用することができる。エフェクター細胞を、おおよそ2×107細胞/mlの濃度にてアッセイ緩衝液(1%ウシ血清アルブミンを含有する変法イーグル培地)に再懸濁し、使用する準備ができるまで37℃のインキュベーターに入れる。黄色ブドウ球菌(S.aureus)PFESA0266株を、トリプチックソイ寒天プレート上で一夜にわたって生育させた。細菌細胞をすくい取り、2回洗浄し、おおよそ5×108cfu/mlの濃度と等しいOD600=1まで5%グリセロールを含有するアッセイ緩衝液に再懸濁した。細菌懸濁液の1mlアリコートを凍結させ、使用する準備ができるまで−40℃にて保存した。凍結した細菌懸濁液を解凍し、アッセイ緩衝液中で106cfu/mlの濃度に調整し、氷上に置いた。アッセイは、無菌の96ディープウェル1mlポリプロピレンプレートを使用して行った。抗体試料の2倍段階希釈液(50μl)を調製し、続いて、抗体ミックスにアッセイ緩衝液300μlを添加した。細菌をプレートに添加し(50μl)、30分にわたって4℃にて回転振盪機上に置いた。オプソニン化ステップに続いて、ヒト補体50μlを添加した(1%最終濃度)。最後に、エフェクター細胞50μl(107細胞/mlの濃度)をプレートに添加し、懸濁液を、ピペッティングを繰り返すことにより十分に混合した。懸濁液の50μlアリコートを、無菌の1%サポニン溶液中で10倍段階希釈し、細菌の凝集を最小限に抑えるためにボルテックスにかけ、二つ組でトリプチックソイ寒天上にプレートした。アッセイプレートを、ロティセリー(rotisserie)スタイルの振盪機を使用して連続して混合しながら1時間にわたって37℃にてインキュベートした。インキュベーションが終わったら、懸濁液の50μlアリコートを、無菌の1%サポニン溶液中で10倍段階希釈し、細菌の凝集を最小限に抑えるためにボルテックスすることにより混合し、二つ組でトリプチックソイ寒天上にプレートした。致死率は、抗体を欠くが細菌、補体およびエフェクター細胞を含有する管の中で生存しているcfu数に対する、細菌、抗体、補体およびエフェクター細胞を含むウェル中で60分に生存しているcfu数の比を決定することにより算出した。細菌、補体、および血清を含有する対照を、凝集に起因するcfuの低下について調整するために包含させた。
黄色ブドウ球菌(S.aureus)PFESA0266株、PFESA0286およびPFESA0270に対して吸着されたヒトドナーの血清は、アッセイにおける補体源として使用することができる。黄色ブドウ球菌(S.aureus)株を、37℃にてTSAプレート上で生育させた。細胞を、プレートからすくい取り、無菌のPBSに再懸濁した。細菌細胞を、4℃にて10分にわたって10,000rpmにて遠心分離し、細胞ペレットを、吸着のためにヒト血清に再懸濁した。血清を、30分にわたって4℃にてヌテイター(nutator)上で細菌と共にインキュベートした。細胞を遠心分離し、血清を、細菌を含有する別の管に移し、吸着ステップを、30分にわたって再び繰り返した。最後に、細胞を遠心分離し、血清を、0.2ミクロンのフィルターに通した後、0.5mlアリコートを、液体窒素中で凍結させた。
HL−60細胞を、S.Romero−Steiner、ら、Clin Diagn Lab Immunol 4(4)(1997)、pp.415〜422に従って分化させた。収集されたHL−60細胞を、おおよそ108細胞/mlにてアッセイ緩衝液(1%ウシ血清アルブミンを含有する変法イーグル培地)に再懸濁し、使用する準備ができるまで37℃のインキュベーターに入れた。黄色ブドウ球菌(S.aureus)を、トリプチックソイ寒天プレート上で一夜にわたって生育させた。細菌細胞をすくい取り、2回洗浄し、おおよそ5×108cfu/mlの濃度と等しいOD600=1まで5%グリセロールを含有するアッセイ緩衝液に再懸濁した。細菌懸濁液の1mlアリコートを凍結させ、使用する準備ができるまで−40℃にて保存した。凍結した細菌懸濁液を解凍し、アッセイ緩衝液中で106cfu/mlの濃度に調整し、氷上に置いた。アッセイは、無菌の96ディープウェル1mlポリプロピレンプレートを使用して行った。モノクローナル抗体試料の2倍段階希釈液(25μl)を調製し、続いて、抗体懸濁液にアッセイ緩衝液150μlを添加した。細菌をプレートに添加し(25μl)、30分にわたって4℃にて回転振盪機上に置き、続いて、ヒト補体25μlを添加した(1%最終濃度)。最後に、HL−60細胞25μl(107細胞/ml)をプレートに添加し、懸濁液を、ピペッティングを繰り返すことにより十分に混合した。懸濁液の25μlアリコートを、無菌の1%サポニン溶液中で10倍段階希釈し、細菌の凝集を最小限に抑えるためにボルテックスすることにより混合し、二つ組でトリプチックソイ寒天上にプレートした。アッセイプレートを、ロティセリースタイルの振盪機を使用して連続して混合しながら1時間にわたって37℃にてインキュベートした。インキュベーションが終わったら、懸濁液の25μlアリコートを、無菌の1%サポニン溶液中で10倍段階希釈し、ボルテックスすることにより混合し、二つ組でトリプチックソイ寒天上にプレートした。致死率は、抗体を欠くが細菌、補体およびHL−60細胞を含有する管の中で生存しているcfu数に対する、細菌、抗体、補体およびHL−60細胞を含むウェル中で60分に生存しているcfu数の比を決定することにより算出した。細菌、補体、およびmAbを含有する対照を、凝集に起因するcfuの低下について調整するために包含させた。
この実施例には、様々なサイズ範囲の黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖の製造が記載されている。構造黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖反復単位は、図1に示されている。本明細書に記載されている方法は、分子量が約20kDaから700kDaまでの範囲である血清型8莢膜多糖を製造するのに有効である。条件の適切な選択により、高分子量血清型8莢膜多糖を、分子量で50kDaから700kDaまでの範囲で単離および精製することができる。免疫原性組成物において使用するため、血清型8莢膜多糖を、分子量で70kDaから300kDaまでの範囲および多くの望ましい範囲で単離および精製することができる。生育特性および産生される莢膜の量に基づき、PFESA0005株またはPFESA0286株を、血清型8莢膜多糖を製造するために使用した。PFESA0005株またはPFESA0286株から単離された莢膜は、同一であることが分かった。
図3Aに示されているように、より低いpHは、多糖の分子量を下げるのにより有効であった。300kDaから600kDaの間の分子量は、15分から120分の間にわたって95℃にて5のpHを使用して生成させることができる。同様に、250kDaから450kDaの間の分子量は、15分から120分の間にわたって95℃にて4のpHを使用して生成させることができる。さらに、120kDaから450kDaの間の分子量は、15分から120分の間にわたって95℃にて3.5のpHを使用して生成させることができる。
この実施例は、黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖−CRM197コンジュゲートの製造において使用されるプロセスおよび特徴付けアッセイについて記載している。黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖をこの担体タンパク質とコンジュゲートさせるための異なるコンジュゲーション化学反応を開発した。例えば、PDPH(3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド)を使用するコンジュゲーションは、CPと担体タンパク質の間に共有チオエーテル結合をもたらす。代替方法として、CDI/CDT(1,1−カルボニルジイミダゾール/1,1−カルボイル−ジ−1,2,4−トリアゾール)を使用するコンジュゲーションは、CPと担体タンパク質の間に1炭素または0炭素リンカーをもたらす。
PDPHコンジュゲーション化学反応は、多糖の活性化、チオール保護基の除去、活性化された多糖中間体の精製、CRM197タンパク質の活性化および精製、ならびに活性化された構成成分のコンジュゲーションと、続く、精製を伴う多段階プロセスである。多糖へのリンカーを含有するチオール基およびCRM197タンパク質担体へのハロアセチル基の導入後、黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖を、チオエーテル結合を通じてタンパク質担体と結合させた。ブロモアセチル基は、アミノ基のブロモ酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によりCRM197タンパク質中に導入した。チオール化された多糖を生成するため、多糖中のN−アセチルマンノサミノウロン酸のカルボジイミドで活性化されたカルボキシレート基を、スルフヒドリル反応性ヒドラジドヘテロ二官能性リンカー3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド(PDPH)のヒドラジド基とカップリングさせた。PDPHチオール化多糖のチオールを、DTTによる還元により生成させ、Sephadex G25カラム上のSECにより精製し、活性化されたタンパク質のブロモアセチル基と反応させると、多糖と担体タンパク質の間の臭素置換により形成される共有チオエーテル結合が得られた。未反応のブロモアセチル基は、システアミン塩酸塩(2−アミノエタンチオール塩酸塩)で「キャップ」した。次いで、反応混合物を濃縮し、透析濾過した。残ったコンジュゲートしていないブロモアセチル基をシステアミン塩酸塩でキャップし、反応性ブロモアセチル基がコンジュゲーション後に残っていないことを保証した。これは、臭素の置換後にシステアミンのチオール末端とリシン残基上のアセチル基との間で共有結合を形成した。
CDIおよびCDTは、多糖を、無水環境(DMSO)中で活性化し、利用可能なヒドロキシルとイミダゾールまたはトリアゾールカルバメート部分およびカルボン酸とアシルイミダゾールまたはアシルトリアゾール部分を形成する1段階コンジュゲーションプロセスを提供する。タンパク質担体の添加(DMSO中)は、リシンによるイミダゾールまたはトリアゾールの求核置換ならびにカルバメート結合(活性化されたヒドロキシルの場合)およびアミド結合(活性化されたカルボン酸の場合)の形成をもたらす。
上に記載されているように、本発明の免疫原性コンジュゲートを作製するための方法には、CDI(1,1−カルボニルジイミダゾール)、CDT(1,1−カルボイル−ジ−1,2,4−トリアゾール)またはPDPH(3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド)を伴うコンジュゲーション化学反応を使用する莢膜多糖の担体タンパク質との共有結合コンジュゲーションを伴う。CDI/CDTの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間の1炭素または0炭素リンカーをもたらすが、PDPHの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間の共有チオエーテル結合をもたらす。
多糖の活性化:血清型8多糖を、血清型8 1g当たり10gのトリアゾールと混合し、凍結乾燥した。得られたケーキを、2.0mg血清型8多糖/mLにてDMSOに溶かした。含水量を決定した。DMSO中で100mg/mLにて新たに調製したCDTのストック溶液を添加し、水と等しいモル量のCDTを達成した。代替方法として、添加されるCDTの量を調整し、より高いかより低い活性化度を達成した。これを、23℃にて30分保持した。
CRM197マトリックス交換:CRM197を透析濾過し、おおよそ10mMホスフェート/80mM NaCl/15%スクロース、pH7のバルクマトリックスから5mMイミダゾール/0.72%NaCl/15mMオクチル−β−D−グルコシド、pH7へ交換した。交換は、コンジュゲーションに有害であり、コンジュゲーション中に運ばれる塩化ナトリウム含量を規定するホスフェートおよびスクロースの除去を可能にした。オクチル−β−D−グルコピラノシドは、無菌濾過後の粒子形成を防ぐために添加される。
この実施例は、予め選択された範囲の分子量の莢膜多糖を、ワンポットプロセスかまたは複合プロセスにおけるコンジュゲーションのために使用することができることを示している。初めに、より大きな多糖が細菌細胞により産生され、得られる精製された分子量範囲は、実施例1における加水分解プロセスのpHおよび熱により制御することができる(表3に示されている通り)。
機能的抗体応答の誘導についてのコンジュゲーション前の天然血清型8莢膜多糖上に存在するO−アセチル基の重要性を、莢膜多糖コンジュゲートについて評価した。血清型8莢膜多糖を、穏和な塩基性条件下で脱O−アセチル化すると、NMRとイオンクロマトグラフィー(IC)は共に、血清型8莢膜多糖脱O−Ac−CRM中にO−アセチル化がないことを裏付けた。CP8脱O−Ac−CRMコンジュゲートを、実施例2に記載されているPDPH化学反応による脱O−Ac CP8多糖のCRMとのコンジュゲーションにより調製した。
血清型8莢膜多糖コンジュゲートを、腎盂腎炎モデルにおいてマウスを防御するそれらの能力について評価した。i.p.黄色ブドウ球菌(S.aureus)チャレンジを受けたマウスの血液における細菌数は、PBSで免疫化された対照と比較して有意に減少した。
ワクチン接種研究からの血清型8莢膜多糖力価が高い選択されたマウス血清(n=5)を、PFESA0005株を使用してオプソニン活性について比較した。OPA結果(表10)は、天然の血清型8莢膜多糖のコンジュゲーションにより調製されたコンジュゲートのみが、マウスにおいてオプソニン抗体を誘発したことを示している。脱OAc血清型8莢膜多糖コンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であったが、誘発された抗体は、このアッセイにおいてオプソニン性でなかったことは注目に値する。OPA力価は、40%致死が観察された希釈度の逆数として報告される。
致死の特異性を確認するため、オプソニン化貪食性アッセイを、本質的に上に記載されているように、天然血清型8莢膜多糖または関係のない肺炎球菌多糖(Pn14poly)の存在下で行った。
すべてのコンジュゲーション化学反応は、担体タンパク質CRM197と共有結合している血清型8莢膜多糖を生じた。これらの方法により生成されるコンジュゲートの遊離糖、血清型8莢膜多糖:タンパク質の比および収率に有意差はなかった。
この実施例には、様々なサイズ範囲の黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5莢膜多糖の製造が記載されている。黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5莢膜多糖反復単位の構造は、図6に示されている。本明細書に記載されている方法は、分子量が約20kDaから800kDaの範囲である血清型5莢膜多糖を製造するのに有効である。条件の適切な選択により、高分子量血清型5莢膜多糖を、分子量で50kDaから800kDaまでの範囲で単離および精製することができる。免疫原性組成物において使用するため、血清型5莢膜多糖を、分子量で70kDaから300kDaまで、70kDaから150kDaまでの範囲および多くの望ましい範囲で単離および精製することができる。生育特性および産生される莢膜の量に基づき、PFESA0266株を、血清型5莢膜多糖製造のために選択した。
図8Aに示されているように、より低いpHは、多糖の分子量を下げるのにより有効であった。この実施例では、約300kDaから約600kDaの間の分子量の範囲は、15分から120分の間にわたって95℃にて5のpHを使用して生成することができる。図8Aを参照されたい。同様に、15分から120分の間にわたって95℃にて4.5のpHを選択すると、200kDaから400kDaの間の多糖分子量範囲を得ることができる。さらに、15分から120分の間にわたって95℃にて4.0のpHを選択すると、120kDaから300kDaの間の多糖分子量範囲を得ることができる。
この実施例は、黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5莢膜多糖−CRM197コンジュゲートの製造において使用されるプロセスおよび特徴付けアッセイについて記載している。黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5莢膜多糖をこの担体タンパク質とコンジュゲートさせるための異なるコンジュゲーション化学反応を開発した。例えば、PDPH(3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド)を使用するコンジュゲーションは、CPと担体タンパク質の間に共有チオエーテル結合をもたらし;一方、CDT(1,1−カルボイル−ジ−1,2,4−トリアゾール)を使用するコンジュゲーションは、莢膜多糖と担体タンパク質の間に1炭素または0炭素リンカーをもたらす。
PDPHコンジュゲーション化学反応は、多糖の活性化、チオール保護基の除去、活性化された多糖中間体の精製、CRM197タンパク質の活性化および精製、ならびに活性化された構成成分のコンジュゲーションと、続く、精製を伴う多段階プロセスである。多糖へのリンカーを含有するチオール基およびCRM197タンパク質担体へのハロアセチル基の導入後、黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5莢膜多糖を、チオエーテル結合を通じてタンパク質担体と結合させた。ブロモアセチル基は、アミノ基のブロモ酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によりCRM197タンパク質中に導入した。チオール化された多糖を生成するため、多糖中のN−アセチルマンノサミノウロン酸のカルボジイミドで活性化されたカルボキシレート基を、スルフヒドリル反応性ヒドラジドヘテロ二官能性リンカー3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド(PDPH)のヒドラジド基とカップリングさせた。PDPHチオール化多糖のチオールを、DTTによる還元により生成させ、Sephadex G25カラム上のSECにより精製し、活性化されたタンパク質のブロモアセチル基と反応させると、多糖と担体タンパク質の間の臭素置換により形成される共有チオエーテル結合が得られた。未反応のブロモアセチル基は、システアミン塩酸塩(2−アミノエタンチオール塩酸塩)で「キャップ」した。次いで、反応混合物を濃縮し、透析濾過した。残ったコンジュゲートされていないブロモアセチル基をシステアミン塩酸塩でキャップし、反応性ブロモアセチル基がコンジュゲーション後に残っていないことを保証した。これは、臭素の置換後にシステアミンのチオール末端とリシン残基上のアセチル基との間に共有結合を形成した。
CDTは、多糖を、無水環境(DMSO)中で活性化し、利用可能なヒドロキシルとトリアゾールカルバメート部分およびカルボン酸とアシルイミダゾールまたはアシルトリアゾール部分を形成する1段階コンジュゲーションプロセスを提供する。タンパク質担体の添加(DMSO中)は、リシンによるトリアゾールの求核置換ならびにカルバメート結合(活性化されたヒドロキシルの場合)およびアミド結合(活性化されたカルボン酸の場合)の形成をもたらす。反応溶液は、平行流濾過による精製のために調製中に水溶液中に10倍希釈される。
上に記載されているように、本発明の免疫原性コンジュゲートを作製するための方法には、CDT(1,1−カルボイル−ジ−1,2,4−トリアゾール)またはPDPH(3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド)を伴うコンジュゲーション化学反応を使用する莢膜多糖の担体タンパク質との共有結合コンジュゲーションを伴う。CDTの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間の1炭素または0炭素リンカーをもたらすが、PDPHの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間に共有チオエーテル結合を含有する5炭素リンカーをもたらす。
血清型5莢膜多糖の活性化:血清型5莢膜多糖を、血清型5莢膜多糖1g当たり10gのトリアゾールと混合し、凍結乾燥した。得られたケーキを、2.0mg血清型5莢膜多糖/mLにてDMSOに溶かした。含水量を決定し、0.2%に調整した。DMSO中で100mg/mLにて新たに調製したCDTのストック溶液を添加し、CP5の量と比較して20倍モル過剰量のCDTを達成した。代替方法として、添加されるCDTの量を調整し、より高いかより低い活性化度を達成した。これを、23℃にて30分保持した。
CRM197マトリックス交換:CRM197を透析濾過し、おおよそ10mMホスフェート/80mM NaCl/15%スクロース、pH7から5mMイミダゾール/0.72%NaCl/15mMオクチル−β−D−グルコピラノシド、pH7へ交換した。交換は、コンジュゲーションに有害であり、コンジュゲーション中に運ばれる塩化ナトリウム含量を規定するホスフェートおよびスクロースの除去を可能にした。オクチル−β−D−グルコピラノシドは、無菌濾過後の粒子形成を防ぐために添加される。
この実施例は、予め選択された範囲の分子量の莢膜多糖を、ワンポットプロセスかまたは複合プロセスのコンジュゲーションに使用することができることを示している。初めに、より大きな多糖が細菌細胞により産生され、得られる精製された分子量範囲は、実施例9における加水分解プロセスのpHおよび熱により制御することができる。この実施例では、血清型5莢膜多糖が、約90kDaから約140kDaまでの分子量範囲である8個のバッチを選択し、コンジュゲーションは、上に記載されているワンポットプロセスかまたは複合プロセスでトリアゾール(CDT)による活性化を使用して行った。表19を参照されたい。得られたコンジュゲートの分子量は、1125kDaから2656kDaまでの範囲であった。CRM当たりのコンジュゲートしているリシン数は、最高で22個から最低で15個までの範囲であった。遊離糖は、最高で23%から最低で11%までの範囲であった。
血清型5莢膜多糖コンジュゲートを、それらが腎盂腎炎モデルにおいてマウスを防御する能力について評価した。i.p.黄色ブドウ球菌(S.aureus)チャレンジを受けているマウスの血液における細菌数は、PBSで免疫化された対照と比較して有意に減少した。
マウス腎盂腎炎モデルにおける能動的免疫化研究を、PDPH化学反応かまたはCDT化学反応により調製された血清型5莢膜多糖コンジュゲートで行った。莢膜多糖をCRM197とコンジュゲートさせるための方法は、上に記載されている。結果は、両コンジュゲートが、偽免疫化された動物と比較してマウスにおけるコロニー形成を低減することを示した(表20)。
4つの研究を、CP5−CRM197PDPHコンジュゲートで行った。血清型5莢膜多糖コンジュゲートは、3つのうちの2つの実験において心臓と腎臓の両方で黄色ブドウ球菌(S.aureus)PFESA0266によるチャレンジ後に回収されたCFUを有意に減少させた(表21)。第三の研究では、幾何平均力価(GMT)抗CP5力価は、3つの実験のうちで最も低かったが、前の実験よりわずかに低いに過ぎなかった。
マウス腎盂腎炎研究を行い、異なるCP5コンジュゲート製剤の免疫原性および有効性を評価した。2つの製剤を試験した:第一の製剤は、CRM197とコンジュゲートしている高分子量(HMW)CP5(おおよそ300kDa)からなった。第二の製剤は、CRM197とコンジュゲートしている低分子量(HMW)CP5(おおよそ25kDa)からなった。3つの投与量レベルをHMWワクチンについて試験した(1、0.1および0.01mcg)。LMWワクチンは、1mcgにて試験した。CRM197とコンジュゲートしている肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)由来の多糖コンジュゲートワクチン(PP5)からなる陰性対照群も包含した。多糖を、0、3、6週目に22mcg AlPO4と共に製剤化し、8週目に黄色ブドウ球菌(S.aureus)PFESA0266をチャレンジした。腎臓を収集し、細菌コロニーを、チャレンジの48時間後に数えた。両ワクチンは、免疫応答を生成するのに有効であり、黄色ブドウ球菌(S.aureus)PFESA0266のCFUの減少は、HMWワクチンとLMWワクチンの両方の1μg群をワクチン接種されたマウスの腎臓から観察された。これは、より低いワクチン用量の有効性低下により示されるように用量依存的であった(図10)。CFU読み出しは、HMWおよびLMWワクチンについての有効性の差を検出するのに十分敏感ではなかった。したがって、マウスの血清を、OPAにより試験した。OPA力価は、OPAアッセイにおいて黄色ブドウ球菌(S.aureus)PFESA0266株の40%を致死させるのに必要とされる血清の希釈度として定義した。増強されたOPA力価は、LMW製剤と比較してHMWワクチンについて見られた(図11)。
非ヒト霊長類(NHP)研究を行い、異なる莢膜コンジュゲート製剤の免疫原性を評価した。2つの製剤を、2つの異なる用量レベル(2および20μg)にて試験した。第一の製剤は、CRM197とコンジュゲートしている高分子量(HMW)多糖(おおよそ130kDa)を含有した。第二の製剤は、CRM197とコンジュゲートしている低分子量(LMW)多糖(おおよそ25kDa)を含有した。5匹の霊長類の群に、単回のいずれかのワクチンをワクチン接種し、免疫力価を、ワクチン接種の前におよびワクチン接種の2週後にモニターした。OPA力価は、OPAアッセイにおいて黄色ブドウ球菌(S.aureus)PFESA0266株の40%を致死させるのに必要とされる血清の希釈度として定義した。抗体力価も、ELISAによりモニターした。増強された活性は、LMWワクチンと比較してHMWワクチンについての抗体力価の10倍上昇により示されるように、LMW製剤と比較してHMWワクチンについて見られた(表22)。HMWワクチンを受けたNHPについてのOPAレスポンダー率もより高かった(40%と比較して80%)。
血清型5莢膜多糖のO−アセチル化の重要性を評価するため、天然の莢膜多糖を脱O−アセチル化(dOAc)し、上で論じられているように、PDPHコンジュゲーション化学反応を使用してCRM197(dOAc−CRM197)とコンジュゲートさせた。dOAcCP−CRM197コンジュゲートの有効性を、マウス腎盂腎炎モデルにおいてCP5−CRM197と並行して比較した。
OAc+(CP5−7−1)、OAc+/−(CP5−5−1)およびOAc−(CP5−6−1)に対する特異性をもつ血清型5莢膜多糖モノクローナル抗体を、5型PFESA0266株に対するOP致死活性について評価した(表24)。血清型8莢膜多糖(CP8 OAc+に対して特異的なCP8−3−1)に対するモノクローナル抗体を、陰性対照として使用した。
非ヒト霊長類(NHP)研究を行い、異なる莢膜コンジュゲート製剤の免疫原性を評価した。2つの製剤を、2つの異なる用量レベル(2および20μg)にて試験した。第一の製剤は、CRM197とコンジュゲートしている高分子量(HMW)多糖(おおよそ130kDa)からなった。第二の製剤は、CRM197とコンジュゲートしている低分子量(LMW)多糖(おおよそ25kDa)を含有した。5匹の霊長類の群に、単回投与のいずれかのワクチンをワクチン接種し、免疫力価を、ワクチン接種の前におよびワクチン接種の2週後にモニターした。OPA力価は、OPAアッセイにおいて黄色ブドウ球菌(S.aureus)PFESA0266株の40%を致死させるのに必要とされる血清の希釈度として定義した。抗体力価も、ELISAによりモニターした。増強された活性は、LMW製剤と比較してHMWワクチンについて見られた(表25)。LMWワクチンと比較してHMWワクチンについては抗体力価の3〜10倍の上昇があった。HMWワクチンを受けたNHPについてのOPAレスポンダー率もより高かった(40%と比較して80%)。
本明細書に記載されている両コンジュゲーション化学反応は、担体タンパク質CRM197と共有結合している血清型5莢膜多糖を生じた。これらの2つの方法により生成されるコンジュゲートの遊離多糖、血清型5多糖:タンパク質の比および収率に有意差はなかった。
Claims (103)
- 担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型8莢膜多糖を含む免疫原性の多糖タンパク質コンジュゲートであって、
a)多糖が、20kDaから1000kDaの間の分子量を有する免疫原性コンジュゲート。 - 200kDaから5000kDaの間の分子量を有する、請求項1に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型5莢膜多糖を含む免疫原性の多糖タンパク質コンジュゲートであって、
a)多糖が、20kDaから1000kDaの間の分子量を有する免疫原性コンジュゲート。 - 200kDaから5000kDaの間の分子量を有する、請求項3に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 多糖が、70kDaから300kDaの間の分子量範囲を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 500kDaから2500kDaの間の分子量範囲を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 多糖が、10〜100%の間のO−アセチル化度を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 多糖が、50〜100%の間のO−アセチル化度を有する、請求項7に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 多糖が、75〜100%の間のO−アセチル化度を有する、請求項7に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食性致死アッセイのいずれかにおける細菌の致死により測定されて機能的である抗体を生じさせることができる、請求項7から9のいずれかに記載の免疫原性コンジュゲート。
- 担体タンパク質が、CRM197である、請求項1から10のいずれかに記載の免疫原性コンジュゲート。
- CRM197が、カルバメート結合、アミド結合、または両方を通じて多糖と共有結合している、請求項11に記載の免疫原性コンジュゲート。
- CRM197に対するコンジュゲートしているリシンのモル比が、約10:1〜約25:1である、請求項11または12に記載の免疫原性コンジュゲート。
- CRM197と多糖の間の少なくとも1つの共有結合が、少なくとも多糖の5〜10個の糖反復単位毎に存在する、請求項13に記載の免疫原性コンジュゲート。
- CRM197と多糖の間の少なくとも1つの結合が、多糖の5個の糖反復単位毎に存在する、請求項13または14に記載の免疫原性コンジュゲート。
- CRM197が、多糖と共有結合している5〜22個のリシンを含む、請求項11から15のいずれかに記載の免疫原性コンジュゲート。
- CRM197が、多糖と共有結合している8〜15個のリシンを含む、請求項16に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 5または8型多糖の総量と比較して30%未満の遊離5または8型多糖を含む、請求項1から17のいずれかに記載の免疫原性コンジュゲート。
- 5または8型多糖の総量と比較して20%未満の遊離5または8型多糖を含む、請求項18に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 請求項1から19のいずれかに記載の免疫原性コンジュゲートおよびアジュバント、希釈剤、または担体のうちの少なくとも1つを含む免疫原性組成物。
- アジュバントが、アルミニウムベースのアジュバントである、請求項20に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項21に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが、リン酸アルミニウムである、請求項21に記載の免疫原性組成物。
- 5または8型多糖の総量と比較して30%未満の遊離5または8型多糖を含む、請求項20から23のいずれかに記載の免疫原性組成物。
- 5または8型多糖の総量と比較して20%未満の遊離5または8型多糖を含む、請求項24に記載の免疫原性組成物。
- 対象において黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型5または血清型8莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の請求項20から25のいずれかに記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- 担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型8莢膜多糖を含む免疫原性の多糖タンパク質コンジュゲートを製造する方法であって、
a)単離された黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖を有機溶媒中でカルボニルジトリアゾール(CDT)と反応させて、活性化された血清型8多糖を生じさせるステップと、
b)活性化された血清型8多糖を有機溶媒中で担体タンパク質と反応させて、血清型8多糖:担体タンパク質コンジュゲートを生じさせるステップとを含み、
黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性コンジュゲートが生じる方法。 - 担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型5莢膜多糖を含む免疫原性の多糖タンパク質コンジュゲートを製造する方法であって、
a)単離された黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5莢膜多糖を有機溶媒中でカルボニルジトリアゾール(CDT)と反応させて、活性化された血清型8多糖を生じさせるステップと、
b)活性化された血清型5多糖を有機溶媒中で担体タンパク質と反応させて、血清型5多糖:担体タンパク質コンジュゲートを生じさせるステップとを含み、
黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性コンジュゲートが生じる方法。 - 単離された多糖を凍結乾燥するステップと、凍結乾燥された多糖を有機溶媒に再懸濁するステップとをさらに含む、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 活性化された単離多糖が、担体タンパク質と反応させる前に活性化反応から単離される、請求項27から29のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)が、
i)単離された活性化された単離多糖を凍結乾燥して、凍結乾燥された活性化された単離多糖を生じさせるステップと、
ii)担体タンパク質を凍結乾燥して、凍結乾燥された担体タンパク質を生じさせるステップと、
iii)凍結乾燥された活性化された単離多糖および凍結乾燥された担体タンパク質を有機溶媒に再懸濁して、担体タンパク質と混合された活性化された単離多糖を生じさせるステップとを含む、請求項30に記載の方法。 - 緩衝液中へステップb)の反応混合物を希釈し、約20℃〜約26℃にて少なくとも4時間にわたって約8.8〜約9.2のpHを維持するステップをさらに含む、請求項27から31のいずれかに記載の方法。
- 緩衝液中へステップb)の反応混合物を希釈し、約23℃にて少なくとも4時間にわたって約9.0のpHを維持するステップをさらに含む、請求項27から31のいずれかに記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを単離するステップをさらに含む、請求項27から33のいずれかに記載の方法。
- 有機溶媒が、極性非プロトン性溶媒である、請求項27から34のいずれかに記載の方法。
- 極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド、N−メチル−2−ピロリドン、およびヘキサメチルリン酸アミド(HMPA)からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
- 有機溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)である、請求項36に記載の方法。
- 多糖をCDTと反応させるステップが、黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖中に存在する水を決定するステップと有機溶媒中でCDT:水の約1:1モル比にCDT濃度を調整するステップとを含む、請求項27および29から37のいずれかに記載の方法。
- 多糖をCDTと反応させるステップが、黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖中に存在する水を決定するステップと、有機溶媒中でCDT:水の約0.5:1モル比にCDT濃度を調整するステップとを含む、請求項27および29から38のいずれかに記載の方法。
- 多糖をCDTと反応させるステップが、黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖中に存在する水を決定するステップと、有機溶媒中でCDT:水の約0.75:1モル比にCDT濃度を調整するステップとを含む、請求項27および29から38のいずれかに記載の方法。
- 血清型5多糖をCDTと反応させるステップが、多糖と比較して約20倍モル過剰のCDTを提供するステップを含む、請求項28から37のいずれかに記載の方法。
- 有機溶媒混合物中の血清型5多糖CDTが、0.1から0.3%の間の水濃度に調整される、請求項28から37および41のいずれかに記載の方法。
- 水濃度が、0.2%に調整される、請求項42に記載の方法。
- 活性化された血清型多糖を単離するステップが、透析濾過を含む、請求項29から43のいずれかに記載の方法。
- 凍結乾燥の前に、担体タンパク質が、NaClに対して透析濾過され、NaCl/タンパク質担体タンパク質のw/w比が、約0.5〜約1.5に調整される、請求項27から44のいずれかに記載の方法。
- 担体タンパク質が、CRM197である、請求項27から45のいずれかに記載の方法。
- 活性化された血清型多糖が、約1:1の重量比でCRM197と反応する、請求項46に記載の方法。
- 単離された黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型莢膜多糖が、有機溶媒中でCDTと混合される前にイミダゾールまたはトリアゾールと混合される、請求項27から47のいずれかに記載の方法。
- 血清型多糖担体タンパク質コンジュゲートを加水分解して、未反応の活性化基を除去するステップをさらに含む、請求項27から48のいずれかに記載の方法。
- 担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型8莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを作製する方法であって、
a)黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖を、有機溶媒中で3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド(PDPH)およびカルボジイミドと反応させて、PDPH結合型多糖を生じさせるステップと、
b)PDPH結合型多糖を還元剤と反応させて、活性化された多糖を生じさせるステップと、
c)活性化された血清型8多糖を単離して、単離された活性化された血清型8多糖を生じさせるステップと、
d)活性化された担体タンパク質を提供するステップと、
e)単離された活性化された血清型8多糖を活性化された担体タンパク質と反応させて、血清型8多糖担体タンパク質コンジュゲートを生じさせるステップとを含み、それによって、担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型8莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートが生じる方法。 - 担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型5莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを作製する方法であって、
a)黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5莢膜多糖を、有機溶媒中で3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド(PDPH)およびカルボジイミドと反応させて、PDPH結合型多糖を生じさせるステップと、
b)PDPH結合型多糖を還元剤と反応させて、活性化された多糖を生じさせるステップと、
c)活性化された血清型5多糖を単離して、単離された活性化された血清型5多糖を生じさせるステップと、
d)活性化された担体タンパク質を提供するステップと、
e)単離された活性化された血清型5多糖を活性化された担体タンパク質と反応させて、血清型5多糖担体タンパク質コンジュゲートを生じさせるステップとを含み、それによって、担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型5莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートが生じる方法。 - 活性化された担体タンパク質が、活性化された担体タンパク質を活性化された多糖と反応させる前に単離される、請求項50または請求項51に記載の方法。
- ステップc)が、単離された活性化された血清型8多糖を凍結乾燥して、凍結乾燥された活性化された血清型多糖を生じさせるステップをさらに含む、請求項50から52のいずれか一項に記載の方法。
- 有機溶媒が、極性非プロトン性溶媒である、請求項50から53のいずれかに記載の方法。
- 極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド、N−メチル−2−ピロリドン、およびヘキサメチルリン酸アミド(HMPA)からなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)である、請求項55に記載の方法。
- カルボジイミドが、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDAC)である、請求項50から56のいずれかに記載の方法。
- 血清型莢膜多糖を、有機溶媒中でPDPHおよびEDACと反応させるステップが、約1:5:3の多糖:PDPH:EDAC重量比を維持するステップを含む、請求項50から57のいずれかに記載の方法。
- 還元剤が、ジチオスレイトール(DTT)である、請求項50から58のいずれかに記載の方法。
- 担体タンパク質の活性化が、担体タンパク質をブロモ酢酸と反応させるステップを含む、請求項50から59のいずれかに記載の方法。
- ブロモ酢酸が、ブロモ酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(BAANS)を含む、請求項60に記載の方法。
- 活性化された血清型多糖を単離するステップが、透析濾過を含む、請求項50から61のいずれかに記載の方法。
- 活性化された担体タンパク質を単離するステップが、透析濾過を含む、請求項50から62のいずれかに記載の方法。
- 血清型多糖担体タンパク質コンジュゲートを加水分解して、未反応の活性化基を除去するステップをさらに包含する、請求項50から63のいずれかに記載の方法。
- 血清型多糖担体タンパク質コンジュゲートを加水分解するステップが、システアミン塩酸塩の添加を含む、請求項64に記載の方法。
- 担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌(S.aureus)血清型莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを単離するステップをさらに含む、請求項50から65のいずれかに記載の方法。
- 血清型多糖:担体タンパク質コンジュゲートの単離が、透析濾過を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記担体タンパク質が、CRM197である、請求項50から67のいずれかに記載の方法。
- 活性化された血清型多糖が、約1:1の重量比でCRM197と反応する、請求項68に記載の方法。
- 活性化された多糖が、約20kDaから約1000kDaの間のサイズを有する、請求項27から69のいずれかに記載の方法。
- 活性化された多糖が、約50kDaから約500kDaの間のサイズを有する、請求項70に記載の方法。
- 免疫原性の多糖タンパク質コンジュゲートが、400kDaから約5000kDaの間のサイズを有する、請求項27から71のいずれかに記載の方法。
- 請求項27から72のいずれかに記載の方法により製造される免疫原性コンジュゲート。
- 約1%を超える遊離多糖および約30%未満の遊離多糖を含む、請求項73に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 約20%未満の遊離多糖を含む、請求項73に記載の免疫原性コンジュゲート。
- 請求項73から75のいずれかに記載の免疫原性コンジュゲートおよびアジュバント、希釈剤、または担体のうちの少なくとも1つを含む免疫原性組成物。
- アジュバントが、アルミニウムベースのアジュバントである、請求項76に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項77に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが、リン酸アルミニウムである、請求項78に記載の免疫原性組成物。
- 型多糖の総量と比較して30%未満の遊離型多糖を含む、請求項76から79のいずれかに記載の免疫原性組成物。
- 型多糖の総量と比較して20%未満の遊離型多糖を含む、請求項80に記載の免疫原性組成物。
- 担体タンパク質と共有結合している20kDaから1000kDaの間の分子量を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)8型莢膜多糖であって、担体タンパク質と共有結合している多糖の合わせた分子量が、約200kDaから5000kDaの間である多糖。
- 担体タンパク質と共有結合している20kDaから1000kDaの間の分子量を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)5型莢膜多糖であって、担体タンパク質と共有結合している多糖の合わせた分子量が、約200kDaから5000kDaの間である多糖。
- 70kDaから300kDaの間の分子量範囲を有する、請求項82または請求項83に記載の担体タンパク質と共有結合している多糖。
- 500kDaから2500kDaの間の分子量範囲を有する、請求項82または請求項83に記載の担体タンパク質と共有結合している多糖。
- 担体タンパク質が、CRM197である、請求項82または請求項83に記載の担体タンパク質と共有結合している多糖。
- CRM197が、カルバメート結合、アミド結合、または両方を通じて多糖と共有結合している、請求項86に記載の担体タンパク質と共有結合している多糖。
- CRM197に対するコンジュゲートしているリシンのモル比が、約10:1〜約25:1である、請求項86または請求項87に記載の担体タンパク質と共有結合している多糖。
- CRM197と多糖の間の少なくとも1つの共有結合が、多糖の5〜10個の糖反復単位毎に存在する、請求項88のいずれか一項に記載の担体タンパク質と共有結合している多糖。
- CRM197と多糖の間の少なくとも1つの共有結合が、多糖の5個の糖反復単位毎に存在する、請求項88または請求項89に記載の担体タンパク質と共有結合している多糖。
- CRM197が、多糖と共有結合している5〜22個のリシンを含む、請求項88から89のいずれかに記載の担体タンパク質と共有結合している多糖。
- CRM197が、多糖と共有結合している8〜15個のリシンを含む、請求項91に記載の担体タンパク質と共有結合している多糖。
- 請求項82から92のいずれかに記載の担体タンパク質と共有結合している多糖およびアジュバント、希釈剤、または担体のうちの少なくとも1つを含む免疫原性組成物。
- アジュバントが、アルミニウムベースのアジュバントである、請求項93に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項94に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが、リン酸アルミニウムである、請求項95に記載の免疫原性組成物。
- 対象においてブドウ球菌属(Staphylococcus)細菌に関係するブドウ球菌性の感染、疾患または状態を軽減または予防する方法であって、免疫学的に有効な量の請求項20から25および76から81および93から96のいずれかに記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法。
- 感染、疾患または状態が、侵襲性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、敗血症および保菌からなる群から選択される、請求項97に記載の方法。
- 手術手順を受けている対象においてブドウ球菌性感染を軽減または予防する方法であって、手術手順の前に対象に免疫学的に有効な量の請求項20から25および76から81および93から96のいずれかに記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- 対象が、ヒト、家庭のペット、または家畜動物である、請求項97から99のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌細胞懸濁液を酸性熱処理に供するステップを含む、分子量が20〜1000kDaの黄色ブドウ球菌(S.aureus)莢膜多糖を単離する方法。
- 本発明の莢膜多糖、免疫原性コンジュゲート、または免疫原性組成物により生成される抗体。
- 動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食性致死アッセイにおいて細菌を致死させることにより測定されて機能的である、請求項102に記載の抗体。
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