JP2012524883A - 腎臓障害生物マーカとしてのwnt1 - Google Patents
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Abstract
Description
a)患者から単離した生体サンプル中のWNT1またはそのフラグメントを定量すること;
b)工程a)のサンプル中のWNT1量を、健常個体から単離したサンプル中のWNT1量と比較すること;
を含む。
本発明に関連して、用語WNT1は、他に明確に特定しない限り、遺伝子無翅関連MMTV組込み部位1の生物学的形状(遺伝子座12q12−q13;ホモサピエンス)およびその組合せのいずれかに関係する。前記生物学的形状は、限定されるものではないが、DNA、その変異体および突然変異体、その制御領域(例えば、レギュレータ、モジュレータープロモータ及びエンハンサ);cDNAおよびそれを含んでなる構築物;RNAとその翻訳物のいずれか(mRNAおよびそのタンパク質を含む)、翻訳後修飾体、突然変異体およびその変異体とそのフラグメントである。生物マーカはまた、生理病理学的過程を識別する生物学的分子とも理解される。本発明の場合、前記過程は間質性線維症および尿細管萎縮に相当し、これらは腎機能障害の特徴である。
a)患者からのサンプル採取。サンプルはその性質に応じて、直ちに使用するか、または適当に保存する。
例えば、サンプルは直ちに処理してもよいし、またはWNT1の生物学的形状の分解を防止するために、その分析時まで真空包装するか、もしくは−80℃で凍結することができる。それらの採取後のサンプル処理は、如何なる場合にも本発明の目的を制限するものではなく、本発明の方法を実施する時点で、当業者周知の最良のプロトコールに従って実施されよう。
b)サンプルからのフラクションの単離およびその中のWNT1の選択した生物学的形状の検出。
c)選択肢として、工程b)にて単離したフラクション中のWNT1の選択した生物学的形状の定量。
c)患者から単離した生体サンプル中のWNT1またはそのフラグメントの定量;
d)工程a)のサンプル中のWNT1量と、健常個体から単離したサンプル中のWNT1量の比較;
[この場合、WNT1量の存在または相対的増加は、腎機能障害の兆候を示す]
を含む方法を含む。
1.1 患者
腎移植患者の朝の2回目の尿を、移植後の異なる時間で採取した。試験対象患者基準は以下の通りとした:1)男性;2)安定な腎機能;3)6ヶ月以上の移植後の時間;4)正常沈降物および非血尿;5)Tac+MMF±Pdでの免疫抑制剤処置;および6)最近、腎生検に急性の拒絶反応がなく、慢性病変の評価をバンフ(Banff)分類に従って実施。
感染と血尿のないことを試験片(コンバーテスト;Combur-Test;ロシュ)により確認する。プロテアーゼインヒビタ(コンプリートミニ(Complete Mini)およびペファブロック(Pefabloc);ロシュ)処置患者から2回目の朝尿から100ml採取した。尿はワットマン3mm濾紙(ワットマン、メイドストーン、英国)で濾過し、尿から可能な溶質を除去し、次いで、1,000gで5分間遠心分離した。上清を使用時まで40mlずつとして−80℃で保存した。
尿タンパク質は、最終濃度10%としてTCA(フルカ)で沈殿させる。タンパク質沈殿物は、−20℃のアセトンにより2回洗った。次いで、沈殿物を4℃で乾燥放置し、再懸濁バッファ(7M尿素(GEヘルスケア)、2Mチオウレア(GEヘルスケア)、4%CHAPS(GEヘルスケア)、0.1%DTT(シグマ)、および0.2%両性電解質(pH4〜7の範囲;GEヘルスケア)含有)に溶解した。サンプルのpHを1M−NaOHでpH8〜8.5として、DIGEアッセイの蛍光色素での標識を最適化した。タンパク質濃度をRcDcキット(バイオラッド;販売業者のプロトコールに従う)により定量した。30μlずつを採り、その使用時まで−80℃で保存した。
[等電点電気泳動]
24cmのポリアクリルアミドゲルストリップを、2%(w/v)CHAPS(GEヘルスケア)、7M尿素(GEヘルスケア)、2Mチオウレア(GEヘルスケア)、0.5%(v/v)両性電解質(pH4〜7の範囲;GEヘルスケア),2mg/mlジチオトレイトール(シグマ)および痕跡量のブロモフェノールブルー(GEヘルスケア)含有再水和バッファ(450μl)により、pH4から7の直線pH勾配により受動的に再水和した(IPGストリップ;GEヘルスケア)。タンパク質250μgをカップ−ローディング法により負荷した(GEヘルスケア)。IGPストリップを表1に特定した等電点電気泳動プログラムにより、エッタン(Ettan)IPGフォア(GEヘルスケア)中、20℃で等電点電気泳動に付した。等電点電気泳動後、直ちに、二次元SDS−PAGEを実施するまでストリップを−80℃に凍結する。
二次元分離に先立って、亜硫酸水素塩架橋を除去するために、SDS(50mMトリス−Cl pH8.8(GEヘルスケア)、6M尿素(GEヘルスケア)、30%(v/v)グリセロール(GEヘルスケア)、2%(w/v)SDS(フルカ)、痕跡量のブロモフェノールブルー(GEヘルスケア)、0.5%(w/v)1−4ジチオトレイトール(DTT)(GEヘルスケア))を含む平衡化バッファ中、タンパク質を室温で15分間インキュベートした。次いで、IPGストリップをヨードアセトアミドを含む平衡化バッファで15分間インキュベートする(該バッファは、DTTの代わりに2.5%ヨードアセトアミド(GEヘルスケア)を含む以外、先のバッファと正確に同じとする)。バッファ溶液IIはバッファ溶液Iと同一であるが、ただし、DTTよりもむしろヨードアセトアミドを含んでいる。タンパク質はエッタンDALTシステム(GEヘルスケア)において、12.5%ポリアクリルアミドゲル中、ゲルあたり2W、20℃で、ブロモフェノールブルー前端が溶出されるまで(10〜14時間)、二次元で分離した。
分離したタンパク質は常套の銀染色により可視化した。簡単に説明すると、タンパク質は定着液(40%エタノール(メルク)および10%酢酸(パンクレアック))により30分間、ゲルに固定した;ゲルは増感液(30%エタノール、0.2%(w/v)Na2S2O3(アマーシャム・バイオサイエンス)および6.8%(w/v)酢酸ナトリウム(アマーシャム・バイオサイエンス))により30分間増感した。mQ水にて5分ずつ3回洗浄した後、ゲルを2.5%(w/v)硝酸銀溶液(フルカ)に20分間、含侵した。次いで、mQ水にて1分ずつ2回洗浄した。現像液(2.5%重炭酸ナトリウム(フルカ)および0.4mL/Lのホルムアルデヒド(シグマ))が複数スポットを示した。現像液を1.46%(w/v)EDTA−Na2・H2O液(フルカ)と10分間置き換えて、反応停止させた。最後に、脱イオン水でそれぞれ5分間ずつ3回洗浄し、モレキュラー・イメージャ(登録商標)GS−800(商標)校正濃度計(バイオ−ラッド)により走査した。
[蛍光標識]
DIGE法により6枚のゲルを調製した;それぞれのゲルにおいて、1群から合計2人の患者のプロテオームを、別の1群からの合計2人の患者と比較する(表2参照)。各サンプルはDIGE蛍光色素、Cy2、Cy3、またはCy5(GEヘルスケア)のそれぞれで標識する。タンパク質は、指定された蛍光色素(1μgタンパク質当たり8pmolの蛍光色素の最終濃度)と暗所、4℃にてインキュベーションすることにより標識した。反応は、蛍光色素1mole当たり25moleのリジンにより停止させた。分析すべき異なる群に相当するサンプルは、疾患の段階に応じて発現の変化を分析する目的で、蛍光色素Cy3およびCy5で標識する。蛍光色素Cy2はゲル間対照を標識するために保存する。これは同一比率のすべてのアッセイサンプルを混合することにより実施する。各ゲルにおいて、このゲル間対照50μgを2つの目的で各ゲルに負荷した。第一に、ゲル間対照は、対照と実験条件双方のすべてのタンパク質を含んでいるため、分析用および分取用ゲル双方のパターンを比較するための参照用パターンを生じる。第二に、Cy2で染色したスポットの強度は、対照および実験条件の強度を比較するための役割を有する。ゲルに負荷する前に、3種の蛍光色素で染色したサンプルを、表2に示すように混合した。
等電点電気泳動および二次元分離は、すでに記載した通りに実施したが、その工程はすべて暗所にて実施した。
二次元分離が終了した後、直ちに、ゲルを蒸留水で洗い、DIGE対応タイフーン・スキャナ(GEヘルスケア)により走査した。タンパク質は、タイフーン・バリアブルモード・イメージャ(GEヘルスケア)で可視化した。デサイダ(DeCyder)示差ゲル内分析ソフトウエア(GEヘルスケア)を用いて、スポットの強度を分析した。異なるゲルのスポットは、Cy2で標識したアッセイ間のパターンを用いて整列させた。特に、発現はゲルそれぞれについて分析したが、その際、存在する1000個のスポットの初期値を用いるデサイダプログラムのDIAモジュールを並行して使用した。DIA分析を用いて、1枚の同一ゲルの異なるサンプル間の特異的スポット強度を直接比較した。この場合、比較したタンパク質の強度は、CANI、CANII−IIIおよびCAN0の群の尿中プロテオームの強度である。これらのDIA分析は、次いで、デサイダのBVAモジュールにより分析した;このモジュールは、3条件間の発現比率を包括的に分析することを可能とする。
(ゲル内消化)
目標のタンパク質は、手動スポット採取器により、直径1.5mmに切り出した(ゲルカンパニ)。タンパク質は、インベスティゲータープロゲスト(Investigator ProGest)ロボット(ゲノミックソリューション)中、トリプシン(修飾した配列決定等級;プロメガ)により消化した。簡単に説明すると、切り出したスポットを重炭酸アンモニウムとアセトニトリルで連続的に洗った。10mM−DTTと30分間インキュベートしてタンパク質を還元し、さらに55mMヨードアセトアミドと30分間インキュベートした後、タンパク質を逐次バッファとアセトニトリルの洗浄に付した。タンパク質は、0.27nmolのトリプシンにより、37℃で一夜、消化した。トリプシン消化により得られたペプチドを、10%ギ酸とアセトニトリルによりゲルから抽出し、抽出物をプールし、真空遠心分離により乾燥した。
二次元ゲルから切り出したタンパク質をESI−MS−MS(Q−TOFグローバル、マイクロマス−ウォーターズ)により分析した。トリプシン消化由来のペプチドを質量分析法と組み合わせた液体クロマトグラフィ(CapLC−ナノ−ESI−Q−TOF)(CapLC、マイクロマス−ウォーターズ)により分析した。この場合、サンプルは15μlの1%ギ酸に再懸濁し、4μLをクロマトグラフに注入し、C18(内径75μm、長さ15cm;ペップマップカラム;LCパッキングス)での逆相分離を実施した。溶出したペプチドをナノ針(ピコチップ(PicoTip;商標)、ニューオブジェクティブ)によりイオン化した。1800〜2200Vの電圧を80Vの錘状電圧と共にキャピラリに負荷した。CID(衝突解離)の衝突は20〜35eVであり、使用した衝突ガスはアルゴンである。記述されるデータはPKLフォーマットを有し、MASCOTまたはNCBI−エントレッズなどの検索手段を用いるデータベース検索に付すことができる。
厚さ1.55mmの12%アクリルアミドミニゲル(ミニプロテアン、バイオラッド)を調製した。異なる程度のCAN患者からの尿タンパク質抽出物25μgを負荷し、60Vで10分間移動させ、引き続き100Vで移動させた。ブロモフェノールブルー前端が溶出した際、直ちにタンパク質をニトロセルロース膜(プロタン、直径45μm)に、トランスブロット・セミドライ(バイオラッド)により、10Vで30分間転写した。
ELISAプレートをwnt−1抗体で被覆するために、該抗体(ロークランド)の適切な希釈液を4℃で一夜インキュベート放置する。ウエルをddH2Oで洗い、プレートはPBS−トリトンで2回洗う。プレートは1%BSA/PBSにより、室温で30〜60分間、ブロックする。標準液(既知のバイオノバwnt−1タンパク質希釈液)100μlおよび100μl(希釈が必要な場合には実施する)。これを4℃で1時間インキュベートする。サンプルを除去し、アルカリ性ホスファターゼ(AP)またはペルオキシダーゼ(共にシグマから)に結合した二次抗体の適当な希釈液と1時間インキュベートする。抗体に結合しない要素を除去し、ウエスタンの呈色に必要な基質100μlを加える。これを暗所で1時間、4℃に放置し、インキュベートする。引き続き、プレートをプレートにより、適当な波長で読み取り、各サンプルの横軸が補間された校正直線を得る;この直線は、wnt−1の定量を可能とする。結果はwnt−1のμg/カルニチンとして表す。
ロークランドの市販抗−ヒトwnt−1抗体を一次抗体として使用する。切片を正に荷電したスライド(ジェネックス−ブランド;登録商標)上に載せた。
パラフィン除去処理は、切片をキシレン(10分間)に通過させ、エチルアルコールの強度を低下させること(100℃ 10分間、96℃ 5分間、および70℃ 5分間)により実施した。
切片をメタノール中の3%過酸化水素溶液中で15分間インキュベートし、さらに蒸留水中で10分間インキュベートする。
切片を10mMクエン酸バッファ溶液(pH6)に浸漬し、オートクレーブ中、121℃に15分間加熱する。5分間、冷却放置し、次いで、TBSTバッファ溶液(50mMトリス−HCl、300mM−NaCl、0.1%トゥイーン20、pH7.6)浴に15分間留めて洗浄した。
非特異的結合部位を遮断する目的で、組織切片をTBSTバッファ中の1%ウシ血清アルブミンフラクションV溶液(シグマ)と5分間インキュベートした。次いで、抗−wnt−1抗血清を適当に希釈して、4℃の湿潤チャンバ中に一夜放置する。
ダコ(DAKO)LSAB2(登録商標)法を色素原基質としてのAECと共に使用する。
切片をメイヤのヘマトキシリンに15秒間浸漬し、次いで、呈色のために流水下に置いた。
マウンティング(配置)は水性マウント媒体(ベクタマウント(商標)AQ、ベクターラボ・インダストリ)により実施する。
標本はライツ・ダイアラックス(Leitz Dialux)20EB顕微鏡下で観察する。顕微鏡に装着したオリンパスC4000デジタルカメラで写真撮影する。
4.1 尿中RNA抽出プロトコール:
少なくとも30mlの新鮮尿を採取し、その最初の処理加工時(採取後1時間未満に開始)まで冷蔵庫に保管する。
キットが許容する30mlを、ZR URINE RNA単離キット(ザイモ・リサーチカタログNo.R1038)が備えるフィルタ(ZRC GF(商標)フィルタ)に通過させる。
キット(RNA抽出バッファプラス(商標))の溶解バッファ700μLを、1mL容量のシリンジを用いてカラムに通し、清浄に調製した無RNアーゼ・エッペンドルフ・チューブに細胞溶解液を集める。この溶解液に1容量(700μl)の95〜100%エタノールを加え、暫時よく混合し、混合物をアフィニティカラム(ザイモ−スピンIC(商標)カラム)に通し、そこでRNAを保持する。カラムを採集チューブに取り付ける。≧10,000rpmで1分間、遠心分離する。濾液を除去する。洗浄バッファ(RNA洗浄バッファ)300μlをカラムに加える。≧10,000rpmで1分間、遠心分離する。濾液を除去する。さらに300μlの洗浄バッファ(RNA洗浄バッファ)をカラムに加える。≧10,000rpmで1分間、遠心分離する。濾液を除去する。カラムを清浄に調製した無RNアーゼ・エッペンドルフ・チューブに取り付ける。20μLの溶出バッファを加え、1分間待つ。≧10,000rpmで1分間、遠心分離する。溶出したRNAを含有する濾液を集める。分光光度計(ナノドロップ)により定量する。直ちに使用するか、または−80℃で保存する。
cDNAは、100Uの逆転写酵素スーパースクリプトIIRNアーゼH−、および40Uのリボヌクレアーゼインヒビタ(インビトロジェン)と共に、プライマとして20pmolのオリゴdTsを供給元の説明書に従って使用し、総RNA1μgから20μlの最終容量で得た。
Claims (15)
- 腎機能の障害の予知における、および/または前記障害と関連する腎障害の診断における生物マーカとしてのWNT1の使用。
- 前記腎機能または腎障害が移植腎臓のものである請求項1記載の使用。
- 腎機能の障害を予知する方法および/または前記障害と関連する腎障害を診断する方法であって、患者から単離した生体サンプル中に、生物マーカWNT1もしくはそのフラグメントの存在または不存在を測定することを特徴とする方法。
- 前記生体サンプルが、尿、血液、血清または組織生検であり、WNT1のタンパク質、RNAもしくはDNAまたはそのフラグメントの存在または不存在を測定することを特徴とする請求項3記載の方法。
- 前記患者が、腎臓移植治療を受けた患者である請求項3または4のいずれかに記載の方法。
- 生物マーカWNT1を定量することを特徴とする請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 慢性同種異系移植腎障害をインビトロで診断する方法であって、
a)患者から単離した生体サンプル中のWNT1またはそのフラグメントを定量すること;
b)工程a)のサンプル中のWNT1量を、健常個体から単離したサンプル中のWNT1量と比較すること;ここで、WNT1が存在すること、またはその量が相対的に増大していることは、腎機能の障害の兆候を示している、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記生体サンプルが尿サンプルである請求項7記載の方法。
- 腎機能の障害または前記障害と関連する腎障害の予知および/または診断をモニタするためのキットであって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、またはそのフラグメントから選択され、その検出のために標識されていてもよい配列に結合し、認識し得る少なくとも1種の分子または組成物を含んでなるキット。
- 腎機能の障害または前記障害と関連する腎障害をモニタ、予知および/または診断するためのキットであって、生物マーカWNT1またはそのフラグメントを含んでなるキット。
- 線維形成過程から生じる疾患の処置を企図する薬物を製造または開発するための、有効成分のスクリーニングにおける請求項9または10に記載のキットの使用。
- 薬物の製造または開発のために、有効成分をスクリーニングする方法であって、前記有効成分をWNT1に結合させアッセイすることを特徴とする方法。
- 腎機能の障害と関連する腎障害が、同種異系移植腎障害である請求項9または10のいずれかに記載のキット。
- 腎障害の処置または予防のための薬物の製造および/または選択におけるWNT1またはそのフラグメントの使用。
- 前記腎障害が慢性同種異系移植腎障害である請求項14記載の使用。
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