JP2012509852A - Polypeptides, antibody variable domains and antagonists - Google Patents

Polypeptides, antibody variable domains and antagonists Download PDF

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Abstract

本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、例えばプロテアーゼ耐性であるｄＡｂに、さらにまた眼送達のためのこのようなｄＡｂを含む製剤および組成物に、ならびに眼の疾患および症状を治療するためのそれらの使用に関する。
【選択図】図２The present invention treats immunoglobulin single variable domains (dAbs), such as dAbs that are protease resistant, and also in formulations and compositions comprising such dAbs for ocular delivery, as well as treating eye diseases and conditions. For their use for.
[Selection] Figure 2

Description

本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、例えばプロテアーゼ耐性であるｄＡｂに、さらにまた眼送達のためのこのようなｄＡｂを含む製剤および組成物に、ならびに眼の疾患および症状を治療するためのそれらの使用に関する。   The present invention treats immunoglobulin single variable domains (dAbs), such as dAbs that are protease resistant, and also in formulations and compositions comprising such dAbs for ocular delivery, as well as treating eye diseases and conditions. For their use for.

眼の疾患および症状を治療することの難しさは、眼に治療薬を送達することの非効率性にあった。薬剤が眼に送達される場合、それは、非常にしばしば、眼組織から極端に急速に出て行く。さらに、治療薬が眼に局所的に送達される場合、それらが眼の後部セグメント（網膜、硝子体および脈絡膜）に到達し得ない、という問題があった。それゆえ、多数の後部セグメント眼症状は、静脈内に薬剤を投与することにより、または硝子体内投与により、治療されてきた。これらの疾患、例えばＡＭＤ、緑内障、糖尿病性網膜症の多くは、最適に治療され得ない。したがって、眼送達に適しており、そして眼の疾患および症状を治療するかまたは予防し得るさらなる作用物質を提供する必要がある。   The difficulty in treating eye diseases and symptoms has been inefficiency in delivering therapeutic agents to the eye. When a drug is delivered to the eye, it very often exits the eye tissue extremely rapidly. Furthermore, when therapeutic agents are delivered locally to the eye, there has been the problem that they cannot reach the posterior segment of the eye (retinal, vitreous and choroid). Therefore, a number of posterior segment ocular symptoms have been treated by administering the drug intravenously or by intravitreal administration. Many of these diseases, such as AMD, glaucoma, diabetic retinopathy, cannot be optimally treated. Accordingly, there is a need to provide additional agents that are suitable for ocular delivery and that can treat or prevent ocular diseases and conditions.

ポリペプチドおよびペプチドは、次第に医療用、治療用および診断用作用物質として用いるための重要な作用物質になってきた。しかしながら、あるin vivo環境、例えば眼において、ならびにある生理学的状態、例えば癌および炎症状態において、組織、器官または動物中に存在するプロテアーゼの量は増大し得る。プロテアーゼのこの増大は、内因性タンパク質の、ならびに疾患を治療するために投与される治療用ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の分解および不活性化を加速し得る。したがって、in vivo使用（例えば、疾患を治療し、診断し、または予防するに際しての使用）への可能性を有するいくつかの作用物質は、それらがプロテアーゼにより迅速に分解され、不活性化されるため、限定された効力を有するに過ぎなかった。   Polypeptides and peptides have gradually become important agents for use as medical, therapeutic and diagnostic agents. However, in certain in vivo environments, such as the eye, and in certain physiological conditions, such as cancer and inflammatory conditions, the amount of protease present in tissues, organs or animals can increase. This increase in proteases can accelerate the degradation and inactivation of endogenous proteins, and therapeutic peptides, polypeptides and proteins administered to treat disease. Thus, some agents that have potential for in vivo use (eg, use in treating, diagnosing, or preventing disease) are rapidly degraded and inactivated by proteases. Therefore, it had only limited efficacy.

プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、いくつかの利点を提供する。例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、プロテアーゼ感受性作用物質より長くin vivoで活性のままであり、したがって、生物学的作用を生じるのに十分な時間の間、依然として機能的である。   Protease resistant polypeptides provide several advantages. For example, protease resistant polypeptides remain active in vivo longer than protease sensitive agents and are therefore still functional for a time sufficient to produce a biological effect.

ＶＥＧＦは、その一次転写物の代替的スプライシングのために、いくつかの代替形態で存在する分泌型ヘパリン結合性ホモ二量体糖タンパク質である（Leung et al., 1989, Science 246: 1306）。ＶＥＧＦは、炎症における重要な過程である血管漏出を誘導するその能力のため、血管透過性因子（ＶＰＦ）としても知られている。   VEGF is a secreted heparin-binding homodimeric glycoprotein that exists in several alternative forms due to alternative splicing of its primary transcript (Leung et al., 1989, Science 246: 1306). VEGF is also known as vascular permeability factor (VPF) because of its ability to induce vascular leakage, an important process in inflammation.

眼において、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体は、脈絡膜および網膜血管の血管新生をともに刺激し、このような血管の血管透過性を調節することが知られている。これらの特徴はともに、網膜損傷と、結果として起こる視力悪化（多数の網膜炎症性症状、血管障害および黄斑症に起因する）に関与する。ＶＥＧＦ活性またはＶＥＧＦ受容体活性を調節する試みは、動物モデルおよびヒト疾患の両方において、血管透過性を有効に管理することが以前に示されている（Gragoudas et al., 2004: N. Engl. J. Med 351: 2805）。   In the eye, VEGF and VEGF receptors are known to stimulate both choroidal and retinal vascular neovascularization and modulate the vascular permeability of such blood vessels. Both of these features are responsible for retinal damage and the resulting visual deterioration (due to numerous retinal inflammatory symptoms, vascular disorders and macular disease). Attempts to modulate VEGF activity or VEGF receptor activity have previously been shown to effectively manage vascular permeability in both animal models and human diseases (Gragoudas et al., 2004: N. Engl. J. Med 351: 2805).

現在入手可能な治療薬でＶＥＧＦをターゲッティングすることは、全ての患者に有効であるというわけではない。したがって、ＶＥＧＦにより媒介される病理学的状態、例えば血管増殖性疾患（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ））を治療するための改良された作用物質が必要とされている。   Targeting VEGF with currently available therapeutics is not effective for all patients. Therefore, there is a need for improved agents for treating pathological conditions mediated by VEGF, such as vascular proliferative diseases (eg, age-related macular degeneration (AMD)).

ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）は、ブドウ膜炎およびＡＭＤのような多数の眼炎症性症状に、ならびに炎症性構成成分が存在する網膜血管障害の発生に関連づけられてきた炎症促進性サイトカインである。加齢性黄斑性疾患に関連する脈絡膜新生血管性病変の発生は、関連炎症構成成分を有することが実証されている。この関連炎症構成成分の有効な管理は、その両方がヒト疾患に影響を及ぼし得る脈絡膜新生血管性病変ならびに血管透過性の発現に直接的に影響することが実証されている。ヒトＡＭＤ患者における近年の証拠は、抗ＴＮＦα治療薬の使用が、抗ＶＥＧＦ治療薬に非応答性である患者における疾患に影響を及ぼし得る、ということを示唆している（Theodossiadis et al., 2009: Am. J. Ophthalmol. 147: 825-830）。   TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) is a pro-inflammatory cytokine that has been linked to a number of ocular inflammatory conditions such as uveitis and AMD and to the development of retinal vascular disorders in which inflammatory components are present It is. The occurrence of choroidal neovascular lesions associated with age-related macular disease has been demonstrated to have an associated inflammatory component. Effective management of this related inflammatory component has been demonstrated to directly affect the development of choroidal neovascular lesions as well as vascular permeability, both of which can affect human disease. Recent evidence in human AMD patients suggests that the use of anti-TNFα therapeutics can affect disease in patients who are unresponsive to anti-VEGF therapeutics (Theodossiadis et al., 2009 : Am. J. Ophthalmol. 147: 825-830).

インターロイキン１（ＩＬ−１）は、いくつかの型の細胞に及ぼす生物学的影響を有する免疫応答の重要な媒介物質である。インターロイキン１は、２つの受容体、すなわち、ＩＬ−１の結合時に細胞中にシグナルを伝達するインターロイキン１受容体１型（ＩＬ−１Ｒ１、ＣＤ１２１ａ、ｐ８０）、ならびにＩＬ−１の結合時にシグナルを伝達せず、ＩＬ−１の内因性調節因子として作用するインターロイキン１受容体２型（ＩＬ−１Ｒ１、ＣＤｗ１２１ｂ）と結合する。ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒ１との相互作用を調節する別の内因性タンパク質は、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）である。ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１Ｒ１に結合するが、しかしシグナルを伝達するためにＩＬ−１Ｒ１を活性化することはない。   Interleukin 1 (IL-1) is an important mediator of immune responses with biological effects on several types of cells. Interleukin 1 has two receptors, namely interleukin 1 receptor type 1 (IL-1R1, CD121a, p80) that transmits signals into cells upon binding of IL-1, and a signal upon binding of IL-1. It binds to interleukin 1 receptor type 2 (IL-1R1, CDw121b), which acts as an endogenous regulator of IL-1. Another endogenous protein that regulates the interaction between IL-1 and IL-1R1 is an interleukin 1 receptor antagonist (IL-1ra). IL-1ra binds to IL-1R1, but does not activate IL-1R1 to transduce signals.

ＩＬ−１（例えば、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１β）の結合時にＩＬ−１Ｒ１を介して伝達されるシグナルは、病原性であり得る広範囲の生物学的活性を誘導する。例えば、ＩＬ−１の結合時にＩＬ−１Ｒ１を介して伝達されるシグナルは、局所性または全身性炎症を、ならびに付加的炎症媒介物質（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ）の生成（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）を引き起こし得る。したがって、ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒ１との相互作用は、眼疾患の病因に関連づけられてきた。   Signals transmitted through IL-1R1 upon binding of IL-1 (eg, IL-1α or IL-1β) induce a wide range of biological activities that can be pathogenic. For example, signals transmitted through IL-1R1 upon IL-1 binding can cause local or systemic inflammation, as well as the production of additional inflammatory mediators (eg, IL-6, IL-8, TNF) ( elaboration). Thus, the interaction between IL-1 and IL-1R1 has been linked to the pathogenesis of eye diseases.

インターロイキン１受容体１型（ＩＬ−１Ｒ１）に結合し、その活性を中和するある作用物質（例えばＩＬ−１ｒａ）は、ある炎症性症状のための有効な治療薬であることが立証されている。   Certain agents that bind to and neutralize the activity of interleukin 1 receptor type 1 (IL-1R1) (eg IL-1ra) have proven to be effective therapeutic agents for certain inflammatory conditions. ing.

Leung et al., 1989, Science 246: 1306Leung et al., 1989, Science 246: 1306 Gragoudas et al., 2004: N. Engl. J. Med 351: 2805Gragoudas et al., 2004: N. Engl. J. Med 351: 2805 Theodossiadis et al., 2009: Am. J. Ophthalmol. 147: 825-830Theodossiadis et al., 2009: Am. J. Ophthalmol. 147: 825-830

第一の態様に於いて、本発明は、眼への投与のための、例えば送達部位で所望の標的分子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α）と結合し得る免疫グロブリン単一可変ドメイン（またはｄＡｂ）を含むかまたはそれからなる組成物を提供する。   In a first aspect, the invention relates to an immunoglobulin single variable capable of binding to a desired target molecule (eg, VEGF, IL-1 or TNF-α) for administration to the eye, eg, at the delivery site. Compositions comprising or consisting of a domain (or dAb) are provided.

本発明は、眼の疾患または症状、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ブドウ膜炎、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症および糖尿病性浮腫を治療し、予防し、または診断するために用いるための、所望の標的分子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ−１ｒ）と結合し得る免疫グロブリン単一可変ドメイン（またはｄＡｂ）を含むかまたはそれからなる組成物も提供する。   The present invention is used to treat, prevent or diagnose ocular diseases or conditions such as age-related macular degeneration (AMD), uveitis, glaucoma, dry eye, diabetic retinopathy and diabetic edema A composition comprising or consisting of an immunoglobulin single variable domain (or dAb) capable of binding to a desired target molecule (eg, VEGF, IL-1 or TNF-α, TNFR1, TNFR2, IL-1r) Also provide.

一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、プロテアーゼ耐性であり得る、例えば、以下のうちの１つ以上に対して耐性であり得る：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えばカテプシンＧ）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ１、プロテイナーゼ２、プロテイナーゼ３）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ９、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメラインおよびセパラーゼ。特定の実施形態では、プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。このようなプロテアーゼ耐性ポリペプチドは、眼のようなin vivoでプロテアーゼに富む環境への送達に特に適している。プロテアーゼは、生物学的抽出物、生物学的ホモジネートまたは生物学的調製物によっても提供され得る。一実施形態では、プロテアーゼは、眼および／または涙中に見出されるものである。眼中に見出されるこのようなプロテアーゼの例としては、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）およびトロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、セクレターゼ、カテプシンＢおよびＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１、ユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）が挙げられる。一実施形態では、プロテアーゼは非細菌プロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは、動物、例えば哺乳動物、例えばヒトのプロテアーゼである。   In one embodiment, the immunoglobulin single variable domain can be protease resistant, eg, resistant to one or more of the following: serine protease, cysteine protease, aspartate protease, thiol protease, matrix Metalloprotease, carboxypeptidase (eg, carboxypeptidase A, carboxypeptidase B), trypsin, chymotrypsin, pepsin, papain, elastase, leukozyme, pancreatin, thrombin, plasmin (eg, cathepsin G), proteinase (eg, proteinase 1, Proteinase 2, proteinase 3), thermolysin, chymosin, enteropeptidase, caspase (eg, caspase 1, caspase 2, Supaze 4, caspase 5, caspase 9, caspase 12, caspase 13), calpain, ficain, clostripain, actinidain, bromelain, and separase. In certain embodiments, the protease is trypsin, elastase or leucozyme. Such protease resistant polypeptides are particularly suitable for delivery to protease-rich environments in vivo such as the eye. Proteases can also be provided by biological extracts, biological homogenates or biological preparations. In one embodiment, the protease is one found in the eye and / or tears. Examples of such proteases found in the eye include caspases, calpains, matrix metalloproteases, disintegrins, metalloproteinases (ADAMs) and ADAMs with thrombospondin motifs, proteosomes, tissue plasminogen activators, secretases, Cathepsins B and D, cystatin C, serine protease PRSS1, ubiquitin proteosome pathway (UPP). In one embodiment, the protease is a non-bacterial protease. In one embodiment, the protease is an animal, eg, mammalian, eg, human, protease.

組成物は、眼の異なる領域に、例えば眼の表面、角膜、もしくは涙管または涙腺に送達され得るし、あるいは眼内送達（例えば、硝子体液のような眼の前または後眼房への）ならびに虹彩、毛様体、涙腺のような眼構造への送達が存在し得る。そして組成物は、眼のこれらの部分で標的分子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α）と結合し得る。組成物は、眼周囲領域へも送達され得る。   The composition can be delivered to different regions of the eye, such as the surface of the eye, the cornea, or the lacrimal duct or lacrimal gland, or intraocular delivery (eg, to the anterior or posterior chamber of the eye such as vitreous humor) There may also be delivery to eye structures such as the iris, ciliary body, lacrimal gland. The composition can then bind to a target molecule (eg, VEGF, IL-1 or TNF-α) at these parts of the eye. The composition can also be delivered to the periocular region.

標的分子は、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αであり得るし、あるいはそれは、任意の他の所望の標的、例えば眼に、例えば眼の表面に、眼の中に、あるいは涙管または涙腺中に存在する標的分子であり、例えば標的は、ＩＬ−１、ＩＬ−１７またはＴＮＦ受容体、例えばＴＮＦＲ１、ＴＧＦβ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＣＤ２０、Ｎｏｇｏ−ａ、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）またはベータアミロイドであり得る。   The target molecule can be, for example, VEGF, IL-1, or TNF-α, or it can be any other desired target, such as the eye, eg, the surface of the eye, in the eye, or the lacrimal duct or lacrimal gland Target molecules present in, for example, targets such as IL-1, IL-17 or TNF receptors such as TNFR1, TGFβ, IL-6, IL-8, IL-21, IL-23, CD20, Nogo- a, may be myelin-related glycoprotein (MAG) or beta amyloid.

一実施形態では、本発明は、例えば点眼液の形態で、またはゲルとして、または例えば埋込み物中で、眼への投与のためのプロテアーゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン（またはｄＡｂ）を提供する。ｄＡｂは、例えば眼中に存在する標的分子、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αと結合し得る。   In one embodiment, the invention provides a protease resistant immunoglobulin single variable domain (or dAb) for administration to the eye, for example in the form of eye drops or as a gel or in an implant, for example. The dAb can bind to a target molecule present in, for example, the eye, such as VEGF, IL-1, or TNF-α.

眼への投与は、例えば、点眼液の形態で、局所投与により得る；代替的には、それは眼への注射により得る。   Administration to the eye is obtained by topical administration, for example in the form of eye drops; alternatively it is obtained by injection into the eye.

眼の表面、もしくは涙管または涙腺のような眼の特定領域中への免疫グロブリン単一可変ドメインの送達を標的にすることは有用であり得るし、あるいは眼内送達（例えば、硝子体液のような眼の前または後眼房への）が存在し得る。それゆえ、本発明は、眼に直接的に組成物を送達する方法であって、眼内注射、局所送達、点眼、眼周囲投与、ならびに緩徐放出製剤（例えば、高分子ナノまたはマイクロ粒子あるいはゲル）の使用から選択される方法により、もしくはイオン泳動を使用する送達デバイスを用いることにより、眼に前記組成物を投与することを包含する方法をさらに提供する。   Targeting the delivery of immunoglobulin single variable domains to the surface of the eye or to specific regions of the eye such as the lacrimal duct or lacrimal gland may be useful, or intraocular delivery (e.g., like vitreous humor) To the front or back chamber of the eye. Thus, the present invention is a method for delivering a composition directly to the eye, including intraocular injection, topical delivery, eye drops, periocular administration, and slow release formulations (eg, polymeric nano- or microparticles or gels). There is further provided a method comprising administering said composition to the eye by a method selected from the use of) or by using a delivery device using iontophoresis.

例えば局所送達により、例えば点眼液として、眼浸透増強剤、例えばカプリン酸ナトリウムとともに、または増粘剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）とともに、免疫グロブリン単一可変ドメインが眼に送達される場合も、有用であり得る。したがって、本発明は、例えば、眼への局所的送達のための、（ａ）例えば眼中の標的分子（例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α）と結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン、さらにまた（ｂ）眼浸透増強剤、および／または（ｃ）増粘剤を含む組成物をさらに提供する。   For example, when an immunoglobulin single variable domain is delivered to the eye, for example, by topical delivery, for example as eye drops, with an eye penetration enhancer, such as sodium caprate, or with a thickener, such as hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) Can be useful. Thus, the invention provides, for example, for local delivery to the eye, (a) an immunoglobulin single variable domain that binds to a target molecule (eg, VEGF, IL-1 or TNF-α), eg in the eye, Further provided is a composition comprising (b) an eye penetration enhancer and / or (c) a thickener.

一態様では、眼に送達されるべき免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＥＧＦと結合する、ＷＯ２００８／１４９１４６、ＷＯ２００８１４９１４７またはＷＯ２００８１４９１５０に開示されたＶＥＧＦ ｄＡｂのうちのいずれかであり得る。例えばそれは、ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（図１ａ：配列番号１で示される）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドであり得る。一実施形態では、同一性パーセントは、少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％または１００％である。一実施形態では、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、プロテアーゼ耐性ポリペプチドを単離するための本明細書中に記載される方法により得られる。眼への送達のためのＤＯＭ１５−２６−５９３は、さらに、抗体定常領域のドメインも含み得る。例えばそれは、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合物のアミノ酸配列（図１ｂ：配列番号２で示される）と同一のアミノ酸配列を有し得るし、あるいは同一性パーセントは、図１ｂに示される配列番号２と少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％であり得る。   In one aspect, the immunoglobulin single variable domain to be delivered to the eye can be any of the VEGF dAbs disclosed in WO2008 / 149146, WO2008149147 or WO2008149150 that bind to VEGF. For example, it can be a polypeptide encoded by an amino acid sequence that is at least 80% identical to the amino acid sequence of DOM15-26-593 (shown in FIG. 1a: SEQ ID NO: 1). In one embodiment, the percent identity is at least 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% or 100%. In one embodiment, the protease resistant polypeptide is obtained by a method described herein for isolating a protease resistant polypeptide. DOM15-26-593 for ocular delivery may further comprise antibody constant region domains. For example, it may have the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the DOM15-26-593-Fc fusion (shown in FIG. 1b: SEQ ID NO: 2), or the percent identity may be expressed as SEQ ID NO: shown in FIG. 2 and at least 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99%.

一態様では、ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列により（例えば、９７％またはそれ以上同一であるものにより）コードされるＶＥＧＦ ｄＡｂは、ＷＯ２００８１４９１５０およびＷＯ２００８１４９１４７（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されたように、位置６（Kabat番号付け）にバリン、および／または位置９９にロイシン、および／または位置３０にリシンを含み得る。   In one aspect, a VEGF dAb encoded by an amino acid sequence that is at least 80% identical to the amino acid sequence of DOM15-26-593 (eg, by being 97% or more identical) is WO200008149150 and WO200008149147 (these descriptions) The contents may include valine at position 6 (Kabat numbering), and / or leucine at position 99, and / or lysine at position 30, as described in (incorporated herein by reference).

さらなる一態様では、眼に送達されるべき免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＷＯ２００８／１４９１４４またはＷＯ２００８／１４９１４８に開示された抗ＴＮＦＲ１ ｄＡｂのいずれかであり得る。   In a further aspect, the immunoglobulin single variable domain to be delivered to the eye can be any of the anti-TNFR1 dAbs disclosed in WO2008 / 149144 or WO2008 / 149148.

一実施形態では、α−ＴＮＦ−αＲ１と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｄｏｍ １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（図４：配列番号６で示される）と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み得る。Ｄｏｍ １ｈ−１３１−２０６の調製および選択は、ＷＯ２００８１４９１４８に開示されている。   In one embodiment, the immunoglobulin single variable domain that binds α-TNF-αR1 has an amino acid sequence of Dom 1h-131-206 (shown in FIG. 4: SEQ ID NO: 6) and at least 97% (eg, 98% 99% or 100%) amino acid sequences that are identical. The preparation and selection of Dom 1h-131-206 is disclosed in WO200008149148.

さらなる一態様では、眼に送達されるべき免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＷＯ２００８／１４９１４９に開示された抗ＩＬ−１Ｒ１ ｄＡｂのいずれかであり得る。   In a further aspect, the immunoglobulin single variable domain to be delivered to the eye can be any of the anti-IL-1R1 dAbs disclosed in WO2008 / 149149.

一実施形態では、ＩＬ−１と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、（ａ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（図３：配列番号５で示される）と、または（ｂ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（図２：配列番号４で示される）と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含み得る。   In one embodiment, the immunoglobulin single variable domain that binds IL-1 is (a) the amino acid sequence of DOM4-130-54 (shown in FIG. 3: SEQ ID NO: 5), or (b) the amino acid of DOM0400PEG. It may comprise an amino acid sequence that is at least 97% (eg 98%, 99% or 100%) identical to the sequence (shown in FIG. 2: SEQ ID NO: 4)

ＤＯＭ ４−１３０−５４の調製および選択は、ＷＯ２００７０６３３１１に、そしてＷＯ２００８１４９１４９にも記載されている。Ｄｏｍ ０４００を調製するために、ＤＯＭ ４−１３０−５４ ｄＡｂ配列が取り上げられ、位置８０のシステインをＤＯＭ ４−１３０−５４中に存在するプロリンに取り替えるよう、突然変異化され、このｄＡｂは次に、ｄＡｂの位置８０での遊離システインとの標準マレイミドカップリングにより、４０ＫＤａ線状ＰＥＧ分子（NOF Corporation, Europeから得られる）に付着される。   The preparation and selection of DOM 4-130-54 is described in WO2007063311 and also in WO2008149149. To prepare Dom 0400, the DOM 4-130-54 dAb sequence is taken and mutated to replace the cysteine at position 80 with the proline present in DOM 4-130-54, which dAb is then , Attached to a 40 KDa linear PEG molecule (obtained from NOF Corporation, Europe) by standard maleimide coupling with a free cysteine at position 80 of the dAb.

本発明は、眼の症状または疾患の治療、予防または診断のための薬剤の製造における免疫グロブリン単一可変ドメインを含むかまたはそれからなる組成物のいずれかの使用も提供するが、例えばこの場合、上記眼疾患は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ブドウ膜炎、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症または糖尿病性浮腫である。   The present invention also provides any use of a composition comprising or consisting of an immunoglobulin single variable domain in the manufacture of a medicament for the treatment, prevention or diagnosis of an ocular condition or disease, for example in this case The eye disease is age-related macular degeneration (AMD), uveitis, glaucoma, dry eye, diabetic retinopathy or diabetic edema.

本発明は、眼の症状または疾患、例えばＡＭＤ、ブドウ膜炎、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症または糖尿病性浮腫の治療、予防または診断に用いるための、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α ｄＡｂを含むかまたはそれからなる組成物も提供する。   The present invention relates to immunoglobulin single variable domains, such as VEGF, for use in the treatment, prevention or diagnosis of ocular conditions or diseases such as AMD, uveitis, glaucoma, dry eye, diabetic retinopathy or diabetic edema. Also provided is a composition comprising, or consisting of, IL-1 or a TNF-α dAb.

代替的一実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（図１ａ：配列番号１で示される）でないか、またはＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合物のアミノ酸配列（図１ｂ：配列番号２で示される）でないものであり得る。   In an alternative embodiment, the immunoglobulin single variable domain for delivery to the eye is not the amino acid sequence of DOM15-26-593 (shown in FIG. 1a: SEQ ID NO: 1) or DOM15-26-593 -It may not be the amino acid sequence of the Fc fusion (Figure 1b: shown in SEQ ID NO: 2).

別の代替的実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、以下の出願に開示された分子のいずれかを含むかまたはそれからなる分子でないものであり得る：ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０３９９、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４００、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０６、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０５、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０３、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０４、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０７。   In another alternative embodiment, an immunoglobulin single variable domain for delivery to the eye may not be a molecule comprising or consisting of any of the molecules disclosed in the following application: PCT / GB2008 / 050039, PCT / GB2008 / 050400, PCT / GB2008 / 050406, PCT / GB2008 / 050405, PCT / GB2008 / 050403, PCT / GB2008 / 050404, PCT / GB2008 / 050407.

別の代替的実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４００に開示されたようなＤｏｍ１ｈ−１３１−５１１、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０１、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０２、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０３、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０４、Ｄｏｍ１ｈ−１３１−２０５のアミノ酸配列でないものであり得る。   In another alternative embodiment, an immunoglobulin single variable domain for delivery to the eye is Dom1h-131-511, Dom1h-131-201, Dom1h-131- as disclosed in PCT / GB2008 / 050400. 202, Dom1h-131-203, Dom1h-131-204, Dom1h-131-205 may not be the amino acid sequence.

別の代替的実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０６に開示されたようなＤｏｍ４−１３０−２０２のアミノ酸配列でないものであり得る。   In another alternative embodiment, an immunoglobulin single variable domain for delivery to the eye may be one that is not the amino acid sequence of Dom 4-130-202 as disclosed in PCT / GB2008 / 050406.

別の代替的実施形態では、眼への送達のための免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０５０４０５に開示されたようなＤｏｍ１ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列でないものであり得る。   In another alternative embodiment, the immunoglobulin single variable domain for delivery to the eye may be one that is not the amino acid sequence of Dom1h-131-206 as disclosed in PCT / GB2008 / 050405.

免疫グロブリン単一可変ドメインと組合せて、または関連して、眼にその他の作用物質を送達することも有用である。例えば、浸透増強剤、例えばカプリン酸ナトリウム、または粘性作用物質、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を送達することは有用であり得る。   It is also useful to deliver other agents to the eye in combination with or in association with an immunoglobulin single variable domain. For example, it may be useful to deliver a penetration enhancer, such as sodium caprate, or a viscous agent such as hydroxypropyl methylcellulose (HPMC).

眼送達のための単一免疫グロブリン可変ドメイン（ｄＡｂ）（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αと結合する）は、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体またはその少なくともトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付着により、あるいは抗体ドメインとの接合により、より大きな水力学的サイズを有するようフォーマット化され得る。例えば、ｄＡｂモノマー（例えば、ＶＥＧＦ ｄＡｂ）は、抗体のより大きな抗原結合断片としてフォーマット化され得る（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマット化される）。ｄＡｂの水力学的サイズおよびその血清半減期は、本明細書中に記載されるように、in vivoで半減期を増大する抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）にそれを接合するかまたは連結することによっても増大され得る（ＷＯ２００６０３８０２７（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）の付録１参照）。例えば、ＶＥＧＦ ｄＡｂは、抗血清アルブミンまたは抗新生児Ｆｃ受容体抗体または抗体断片、例えば抗ＳＡまたは抗新生児Ｆｃ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖに、あるいは抗ＳＡアフィボディまたは抗新生児Ｆｃ受容体アフィボディに接合されるかまたは連結され得る。 A single immunoglobulin variable domain (dAb) for ocular delivery (eg, that binds to VEGF, IL-1 or TNF-α) is, for example, a PEG group, serum albumin, transferrin, transferrin receptor or at least its transferrin binding It can be formatted to have a larger hydrodynamic size, partly, by attachment of an antibody Fc region, or by conjugation with an antibody domain. For example, a dAb monomer (eg, VEGF dAb) can be formatted as a larger antigen-binding fragment of an antibody (eg, formatted as Fab, Fab ′, F (ab) 2 , F (ab ′) 2 , IgG, scFv). ). The hydrodynamic size of a dAb and its serum half-life is determined by the binding domain (eg, antibody or antibody fragment) that binds to an antigen or epitope that increases half-life in vivo, as described herein. Can also be increased by joining or linking (see appendix 1 of WO2006038027, the description of which is incorporated herein by reference). For example, VEGF dAb can be anti-serum albumin or anti-neonatal Fc receptor antibody or antibody fragment, such as anti-SA or anti-neonatal Fc receptor dAb, Fab, Fab 'or scFv, or anti-SA affibody or anti-neonatal Fc receptor. Can be joined or linked to an Affibody.

例えばＶＥＧＦ結合ｄＡｂと連結される、本明細書中に記載される組成物中に用いるための適切なアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体の例は、ＷＯ ２００５／０７７０４２Ａ２およびＷＯ２００６０３８０２７（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。   Examples of suitable albumins, albumin fragments or albumin variants for use in the compositions described herein, eg linked to a VEGF binding dAb, are WO 2005 / 077042A2 and WO2006038027 (these descriptions are (Incorporated herein by reference).

フォーマット化ｄＡｂ（例えば、ＰＥＧ化によりフォーマットされるｄＡｂ）は、例えば３０ＫＤａ〜１００ＫＤａ、例えば約５０〜６０ＫＤａである分子量を有し得るし、網膜および／または脈絡膜および／または涙液への送達のために有用であり得る。   Formatted dAbs (eg, dAbs formatted by PEGylation) can have a molecular weight that is, for example, 30 KDa to 100 KDa, such as about 50-60 KDa, for delivery to the retina and / or choroid and / or tears Can be useful to.

約１５ＫＤａの分子量を有する裸（非フォーマット化）ｄＡｂは、硝子体液および／または眼房水および／または網膜および／または脈絡膜への送達のために有用であり得る。   Naked (unformatted) dAbs having a molecular weight of about 15 KDa may be useful for delivery to vitreous humor and / or aqueous humor and / or retina and / or choroid.

この開示全体を通して記載される本発明の他の実施形態では、本発明のアンタゴニストまたはリガンドにおいて単一免疫グロブリン可変ドメインまたは「ｄＡｂ」を用いる代わりに、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αに結合するｄＡｂのＣＤＲ（例えば、適切なタンパク質足場または骨格、例えばアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインまたはＥＧＦドメイン上にグラフトされるＣＤＲ）を含むか、あるいはＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αに関する結合部位を含むタンパク質ドメインであり得る（この場合、ドメインは、アフィボディ、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインまたはＥＧＦドメインから選択される）ドメインを当業者は用い得ることが意図される。したがって、全体としての開示は、アンタゴニスト、リガンド、ならびにｄＡｂの代わりにこのようなドメインを用いる方法の開示を提供するよう理解されるべきである。   In other embodiments of the invention described throughout this disclosure, instead of using a single immunoglobulin variable domain or “dAb” in an antagonist or ligand of the invention, for example, binds to VEGF, IL-1 or TNF-α. Or a CDR of a dAb that is grafted onto a suitable protein scaffold or scaffold, such as an Affibody, SpA scaffold, LDL receptor class A domain or EGF domain, or VEGF, IL-1 or TNF- It is contemplated that one skilled in the art can use a domain that can be a protein domain that includes a binding site for α (where the domain is selected from an affibody, SpA domain, LDL receptor class A domain or EGF domain). . Thus, the entire disclosure should be understood to provide disclosure of antagonists, ligands, and methods of using such domains in place of dAbs.

本明細書中に記載されるプロテアーゼ耐性ｄＡｂは、ＷＯ２００８１４９１４３（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載された方法および教示を用いて選択され得る。   The protease resistant dAbs described herein can be selected using the methods and teachings described in WO200008149143, the description of which is incorporated herein by reference.

一態様では、本発明は、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α結合部位を含むプロテアーゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメインであって、
（ｉ）３７℃で少なくとも１時間（ｔ）、少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度（ｃ）のプロテアーゼ；あるいは
（ｉｉ）３０℃で少なくとも１時間（ｔ）、少なくとも４０μｇ／ｍｌの濃度（ｃ’）のプロテアーゼ
とともにインキュベートされた場合にプロテアーゼに対して耐性である上記可変ドメインを提供する。一実施形態では、プロテアーゼ、例えばトリプシンの、可変ドメインに対する比（モル／モルに基づいて）は、８，０００対８０，０００ プロテアーゼ：可変ドメインであり、例えばＣが１０μｇ／ｍｌである場合、比は８００対８０，０００ プロテアーゼ：可変ドメインであり；あるいはＣまたはＣ’が１００μｇ／ｍｌである場合、比は８，０００対８０，０００ プロテアーゼ：可変ドメインである。一実施形態では、プロテアーゼ（例えばトリプシン）の可変ドメインに対する比（重量／重量、例えばμｇ／μｇに基づいて）は、１６，０００対１６０，０００ プロテアーゼ：可変ドメインであり、例えばＣが１０μｇ／ｍｌである場合、比は１，６００対１６０，０００ プロテアーゼ：可変ドメインであり；あるいはＣまたはＣ’が１００μｇ／ｍｌである場合、比は１６，０００対１６０，０００ プロテアーゼ：可変ドメインである。一実施形態では、濃度（ｃまたはｃ’）は、少なくとも１００または１０００μｇ／ｍｌ プロテアーゼである。ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーまたはライブラリーを用いて作業する場合（例えばｗ／ｗパラメーター）、用いるのに適したプロテアーゼのタンパク質分解活性の条件については、本明細書中の記述を参照されたい。これらの条件は、特定の免疫グロブリン単一可変ドメインのプロテアーゼ耐性を確定するための条件に用いられ得る。一実施形態では、時間（ｔ）は、１、３または２４時間あるいは一晩（例えば約１２〜１６時間）であるかまたはそれらのおよその値である。一実施形態では、可変ドメインは条件（ｉ）下で耐性であり、濃度（ｃ）は１０または１００μｇ／ｍｌまたはそれらのおよその値のプロテアーゼであり、時間（ｔ）は１時間である。一実施形態では、可変ドメインは条件（ｉｉ）下で耐性であり、濃度（ｃ’）は４０μｇ／ｍｌまたはそのおよその値のプロテアーゼであり、時間（ｔ）は３時間または約３時間である。一実施形態では、プロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される。一実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。一実施形態では、プロテアーゼは、痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液または涙液あるいは眼において見出されるプロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは眼および／または涙液中に見出されるものである。一実施形態では、プロテアーゼは非細菌プロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは動物、例えば哺乳動物、例えばヒトプロテアーゼである。 In one aspect, the invention is a protease resistant immunoglobulin single variable domain comprising, for example, a VEGF, IL-1 or TNF-α binding site comprising:
(I) protease at a concentration (c) of at least 10 μg / ml at 37 ° C. for at least 1 hour (t); or (ii) at least 1 hour (t) at 30 ° C. at a concentration (c ′) of at least 40 μg / ml. The variable domains are provided that are resistant to the protease when incubated with the protease. In one embodiment, the ratio of protease, eg, trypsin, to variable domain (based on moles / mole) is 8,000 to 80,000 protease: variable domain, eg, when C is 10 μg / ml Is 800: 80,000 protease: variable domain; or when C or C ′ is 100 μg / ml, the ratio is 8,000: 80,000 protease: variable domain. In one embodiment, the ratio of protease (eg, trypsin) to variable domain (based on weight / weight, eg, μg / μg) is 16,000 vs. 160,000 protease: variable domain, eg, C is 10 μg / ml. The ratio is 1,600 to 160,000 protease: variable domain; or if C or C ′ is 100 μg / ml, the ratio is 16,000 to 160,000 protease: variable domain. In one embodiment, the concentration (c or c ′) is at least 100 or 1000 μg / ml protease. When working with a repertoire or library of peptides or polypeptides (eg w / w parameters), see the description herein for conditions of proteolytic activity of proteases suitable for use. These conditions can be used to determine the protease resistance of a particular immunoglobulin single variable domain. In one embodiment, the time (t) is 1, 3 or 24 hours or overnight (eg, about 12-16 hours) or an approximate value thereof. In one embodiment, the variable domain is resistant under condition (i), the concentration (c) is 10 or 100 μg / ml or an approximate value thereof, and the time (t) is 1 hour. In one embodiment, the variable domain is resistant under conditions (ii), the concentration (c ′) is 40 μg / ml or an approximate value thereof, and the time (t) is 3 hours or about 3 hours. . In one embodiment, the protease is selected from trypsin, elastase, leucozyme and pancreatin. In one embodiment, the protease is trypsin. In one embodiment, the protease is found in sputum, mucus (eg, gastric mucus, nasal mucus, bronchial mucus), bronchoalveolar lavage fluid, lung homogenate, lung extract, pancreatic extract, gastric juice, saliva or tears or the eye. Protease. In one embodiment, the protease is that found in the eye and / or tears. In one embodiment, the protease is a non-bacterial protease. In one embodiment, the protease is an animal, eg, a mammal, eg, a human protease.

一実施形態では、可変ドメインは、トリプシン、および／またはエラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される少なくとも１つの他のプロテアーゼに対して耐性である。例えば、耐性は、トリプシンおよびエラスターゼ；トリプシンおよびロイコザイム；トリプシンおよびパンクレアチン；トリプシン、エラスターゼおよびロイコザイム；トリプシン、エラスターゼおよびパンクレアチン；トリプシン、エラスターゼ、パンクレアチンおよびロイコザイム；あるいはトリプシン、パンクレアチンおよびロイコザイムに対してである。   In one embodiment, the variable domain is resistant to trypsin and / or at least one other protease selected from elastase, leucozyme and pancreatin. For example, resistance is to trypsin and elastase; trypsin and leucozyme; trypsin and pancreatin; trypsin, elastase and leucozyme; trypsin, elastase and pancreatin; trypsin, elastase, pancreatin and leucozyme; or trypsin, pancreatin and leucozyme It is.

一実施形態では、条件（ｉ）または（ｉｉ）下で、例えば１０６〜１０１３、例えば１０８〜１０１２複製単位のファージライブラリーサイズ（感染性ビリオン）でインキュベートされる場合、可変ドメインはバクテリオファージ上に提示される。 In one embodiment, when incubated under a condition (i) or (ii), eg, a phage library size (infectious virion) of 10 6 to 10 13 , such as 10 8 to 10 12 replication units, the variable domain is Presented on bacteriophage.

一実施形態では、ＢｉａＣｏｒｅ （商標）またはＥＬＩＳＡ、例えばファージＥＬＩＳＡまたはモノクローナルファージＥＬＩＳＡを用いて査定される条件（ｉ）または（ｉｉ）下でのインキュベーション後、可変ドメインはＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αに特異的に結合する。   In one embodiment, after incubation under conditions (i) or (ii) assessed using BiaCore ™ or ELISA, eg, phage ELISA or monoclonal phage ELISA, the variable domain is VEGF, IL-1 or TNF- It binds specifically to α.

一実施形態では、可変ドメインは、プロテインＡまたはプロテインＬに特異的に結合する。一実施形態では、プロテインＡまたはＬとの特異的結合は、条件（ｉ）または（ｉｉ）下でのインキュベーション後に存在する。   In one embodiment, the variable domain specifically binds to protein A or protein L. In one embodiment, specific binding to protein A or L is present after incubation under conditions (i) or (ii).

一実施形態では、可変ドメインは、例えば条件（ｉ）または（ｉｉ）下でのインキュベーション後、少なくとも０．４０４のＥＬＩＳＡ（例えば、ファージＥＬＩＳＡまたはモノクローナルファージＥＬＩＳＡ）でのＯＤ４５０読取値を有し得る。 In one embodiment, the variable domain may have an OD 450 reading in an ELISA (eg, phage ELISA or monoclonal phage ELISA) of at least 0.404 after incubation under conditions (i) or (ii), for example. .

一実施形態では、可変ドメインは、例えば条件（ｉ）または（ｉｉ）下でのインキュベーション後に、ゲル電気泳動において（実質的に）単一の帯域を表示する。   In one embodiment, the variable domain displays (substantially) a single band in gel electrophoresis, eg after incubation under conditions (i) or (ii).

別の実施形態では、作用物質（ｄＡｂ）は、埋め込み可能な送達デバイスを介して眼に局所的に投与され得る。したがって、一実施形態では、本発明は、眼送達のための、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α ｄＡｂを含有する埋め込み可能な送達デバイスを提供する。   In another embodiment, the agent (dAb) can be administered locally to the eye via an implantable delivery device. Accordingly, in one embodiment, the present invention provides an implantable delivery device for ocular delivery, eg containing VEGF, IL-1 or TNF-α dAb.

さらなる態様において、本発明は、眼送達のための免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α ｄＡｂ）ならびに薬学的または生理学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。   In a further aspect, the present invention provides an immunoglobulin single variable domain (eg, VEGF, IL-1 or TNF-α dAb) for ocular delivery and a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier, excipient or diluent. A pharmaceutical composition is provided.

図１ａは、ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列を示す図である。図１ｂは、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合物のアミノ酸配列を示す図である。図１ｃは、抗体Ｆｃのアミノ酸配列を示す図である。FIG. 1a shows the amino acid sequence of DOM15-26-593. Figure 1b shows the amino acid sequence of the DOM15-26-593-Fc fusion. FIG. 1c shows the amino acid sequence of antibody Fc. ＤＯＭ ０４００ＰＥＧ（ＰＥＧ化抗ＩＬ１ ｄＡｂ、分子量約５２ＫＤａ）のアミノ酸配列を示す図である。It is a figure which shows the amino acid sequence of DOM 0400PEG (PEGylated anti-IL1 dAb, molecular weight about 52 KDa). ＤＯＭ４−１３０−５４（抗ＩＬ１ ｄＡｂ）のアミノ酸配列を示す図である。It is a figure which shows the amino acid sequence of DOM4-130-54 (anti-IL1 dAb). Ｄｏｍ １ｈ−１３１−２０６（抗ＴＮＦαＲ１ ｄＡｂ）のアミノ酸配列を示す図である。It is a figure which shows the amino acid sequence of Dom 1h-131-206 (anti-TNF (alpha) R1 dAb).

この明細書中で、明瞭且つ簡潔な明細書を書き表すよう、実施形態を参照しながら本発明を記載している。実施形態は、本発明を逸脱しない限り、種々に組合され、または切り離され得るよう意図されるし、そのように理解されるべきである。   In this specification, the invention has been described with reference to embodiments for the purpose of writing a clear and concise specification. The embodiments are and are to be understood as variously combined or disconnected without departing from the invention.

別記しない限り、本明細書中で用いられる技術および科学用語は全て、当該技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学）の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子的、遺伝学的および生化学的方法（一般的に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y.およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.参照）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）ならびに化学的方法のための標準技法が用いられる。   Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein are those commonly understood by one of ordinary skill in the art (eg, cell culture, molecular genetics, nucleic acid chemistry, hybridization techniques, and biochemistry). Has the same meaning. Molecular, genetic and biochemical methods (generally Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al. , Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th edition, John Wiley & Sons, Inc.) (these descriptions are incorporated herein by reference) as well as standard techniques for chemical methods used. It is done.

本明細書中で用いる場合、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニスト」または「抗ＶＥＧＦアンタゴニスト」等という用語は、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦの（すなわち１つ以上の）機能を抑制し得る作用物質（例えば分子、化合物）を指す。   As used herein, terms such as “an antagonist of vascular endothelial growth factor (VEGF)” or “anti-VEGF antagonist” and the like are actions that bind to VEGF and can inhibit the function (ie, one or more) of VEGF. Refers to a substance (eg, molecule, compound).

本明細書中で用いる場合、「ペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に繋がれる約２〜約５０アミノ酸を指す。   As used herein, “peptide” refers to about 2 to about 50 amino acids that are joined together through peptide bonds.

本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により一緒に繋がれる少なくとも約５０アミノ酸を指す。ポリペプチドは一般的に、三次構造を含み、機能的ドメインに折りたたまれる。   As used herein, “polypeptide” refers to at least about 50 amino acids joined together by peptide bonds. Polypeptides generally contain tertiary structure and are folded into functional domains.

本明細書中で用いる場合、「プロテアーゼ分解に対して耐性」であるペプチドまたはポリペプチド（例えば、ドメイン抗体（ｄＡｂ））は、プロテアーゼ活性に適した条件下でプロテアーゼとともにインキュベートされる場合、プロテアーゼにより実質的に分解されない。プロテアーゼ活性に適した温度で、例えば３７または５０℃で、約１時間、プロテアーゼとともにインキュベート後に、プロテアーゼにより約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下のタンパク質のタンパク質が分解されるか、または実質的に全くタンパク質が分解されない場合、ポリペプチド（例えばｄＡｂ）は実質的に分解されない。タンパク質分解は、本明細書中に記載されるような任意の適切な方法を用いて、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、または機能性検定（例えばリガンド結合）により査定され得る。   As used herein, a peptide or polypeptide that is “resistant to protease degradation” (eg, a domain antibody (dAb)) is subject to a protease when incubated with a protease under conditions suitable for protease activity. It is not substantially decomposed. About 25% or less, about 20% or less, about 15% or less, about 14% or less, about 13% or less after protease incubation with a protease at a temperature suitable for protease activity, for example, 37 or 50 ° C. for about 1 hour About 12% or less, about 11% or less, about 10% or less, about 9% or less, about 8% or less, about 7% or less, about 6% or less, about 5% or less, about 4% or less, about 3% or less The polypeptide (eg, dAb) is not substantially degraded if less than about 2%, less than about 1% protein of the protein is degraded, or substantially no protein is degraded. Proteolysis can be assessed using any suitable method as described herein, eg, by SDS-PAGE, or by a functional assay (eg, ligand binding).

本明細書中で用いる場合、「標的リガンド」は、ポリペプチドまたはペプチドにより特異的にまたは選択的に結合されるリガンドを指す。例えば、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合断片である場合、標的リガンドは任意の所望の抗原またはエピトープであり得る。標的抗原との結合は、機能性であるポリペプチドまたはペプチドに左右される。   As used herein, “target ligand” refers to a ligand that is specifically or selectively bound by a polypeptide or peptide. For example, if the polypeptide is an antibody or antigen-binding fragment thereof, the target ligand can be any desired antigen or epitope. Binding to the target antigen depends on the functional polypeptide or peptide.

本明細書中で用いる場合、抗体は、天然に抗体を産生する任意の種に由来するにせよ、または組換えＤＮＡ技術により作製されるにせよ；血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されるにせよ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥあるいは断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多特性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ジアボディ）を指す。 As used herein, an antibody, whether derived from any species that naturally produces the antibody or produced by recombinant DNA technology; serum, B cell, hybridoma, transfectoma, IgG, IgM, IgA, IgD or IgE or fragments (eg, Fab, F (ab ′) 2 , Fv, disulfide bond Fv, scFv, closed structure multi-characteristic antibody, disulfide bond scFv, whether isolated from yeast or bacteria , Diabody).

本明細書中で用いる場合、「抗体フォーマット」は、その構造上に抗原に対する結合特異性を付与するために１つ以上の抗体可変ドメインが組み入れられ得る任意の適切なポリペプチド構造を指す。種々の適切な抗体フォーマット、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、ならびに前記のいずれかの修飾バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の適切なポリマーの共有的結合により修飾されたもの、あるいはヒト化ＶＨＨ）が、当該技術分野で知られている。 As used herein, “antibody format” refers to any suitable polypeptide structure into which one or more antibody variable domains can be incorporated to confer binding specificity for an antigen on the structure. Various suitable antibody formats such as chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, single chain antibodies, bispecific antibodies, antibody heavy chains, antibody light chains, antibody heavy chains and / or antibody light chain homodimers And heterodimers, antigen binding fragments of any of the foregoing (eg, Fv fragments (eg, single chain Fv (scFv), disulfide bond Fv), Fab fragments, Fab ′ fragments, F (ab ′) 2 fragments) A single antibody variable domain (eg, dAb, V H , V HH , V L ), as well as any modified version of the foregoing (eg, those modified by covalent attachment of polyethylene glycol or other suitable polymer, Alternatively, humanized V HH ) is known in the art.

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という語句は、他のＶ領域またはドメインとは関係なく、一抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを有するフォーマット（例えば、ホモ−またはへテロ−多量体）中に存在し得るが、この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合のために必要でない（すなわち、この場合、免疫グロブリン単一可変ドメインは、付加的可変ドメインとは関係なく、抗原に結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、当該用語を本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、当該用語を本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一抗体可変ドメイン」は、当該用語を本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、しかし、齧歯類（例えば、ＷＯ ００／２９００４（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示）、テンジクザメおよびラクダ類ＶＨＨｄＡｂのような他の種からの単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ類ＶＨＨは、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含めた種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。ＶＨＨは、ヒト化され得る。 The phrase “immunoglobulin single variable domain” refers to an antibody variable domain (V H , V HH , V L ) that specifically binds to one antigen or epitope independent of other V regions or domains. An immunoglobulin single variable domain may be present in a format (eg, homo- or hetero-multimer) having other variable regions or variable domains, in which case the other regions or domains are single immunized. It is not required for antigen binding by a globulin variable domain (ie, in this case, the immunoglobulin single variable domain binds to the antigen independently of the additional variable domain). A “domain antibody” or “dAb” is the same as an “immunoglobulin single variable domain” as the term is used herein. A “single immunoglobulin variable domain” is the same as an “immunoglobulin single variable domain” as the term is used herein. A “single antibody variable domain” is the same as an “immunoglobulin single variable domain” as the term is used herein. The immunoglobulin single variable domain, in one embodiment, is a human antibody variable domain, but in rodents (eg, WO 00/29004, the description of which is incorporated herein by reference). Disclosure), single antibody variable domains from other species such as shark sharks and camels V HH dAbs. Camels V HH are immunoglobulin single variable domain polypeptides derived from species including camels, llamas, alpaca, dromedaries and guanacos that produce heavy chain antibodies that naturally lack light chains. V HH can be humanized.

「ドメイン」は、タンパク質の残部とは無関係な三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般的に、ドメインはタンパク質の別個の機能的特性の元をなし、多くの場合、残りのタンパク質および／またはドメインの機能の損失を伴わずに、他のタンパク質に付加され、除去され、または運ばれ得る。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン（例えば、１つ以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列により取り替えられる）、あるいは切断されているかまたはＮ−またはＣ−末端伸張を含む抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を包含する。   A “domain” is a folded protein structure that has a tertiary structure that is independent of the rest of the protein. In general, a domain is responsible for the distinct functional properties of a protein and is often added to, removed from, or transported to other proteins without loss of function of the remaining proteins and / or domains. It can be released. A “single antibody variable domain” is a folded polypeptide domain that includes sequences characteristic of antibody variable domains. Thus, it is a complete antibody variable domain and a modified variable domain (eg, one or more loops are replaced by sequences not characteristic of an antibody variable domain), or are cleaved or contain an N- or C-terminal extension. Antibody variable domains and folded fragments of variable domains that retain at least the binding activity and specificity of the full length domain are included.

本明細書中で用いる場合、「用量」は、全てを一度に（単位用量）、または限定時間に亘って２回以上投与で、被験者に投与されるリガンドの量を指す。例えば、用量は、１日（２４時間）（一日量）、２日、１週間、２週間、３週間、または１ヶ月以上の経過中に被験者に（例えば、１回投与により、または２回以上の投与により）投与されるリガンド（例えば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド）の量を示し得る。投与間の間隔は、任意の所望量の時間であり得る。   As used herein, “dose” refers to the amount of ligand administered to a subject, all at once (unit dose), or in two or more doses over a limited time. For example, the dose may be administered to a subject (e.g., by one dose or twice) over the course of one day (24 hours) (daily dose), two days, one week, two weeks, three weeks, or one month. The amount of ligand (eg, a ligand comprising an immunoglobulin single variable domain that binds to a target antigen) to be administered can be indicated. The interval between doses can be any desired amount of time.

「半減期」という語句は、例えば、自然の機序によるリガンドの分解および／またはリガンドのクリアランスまたは隔離のため、in vivoで５０％低減するためにリガンド（例えば、ｄＡｂ、ポリペプチドまたはアンタゴニスト）の血清濃度に関して要する時間を指す。本発明のリガンドは、in vivoで安定化され得るし、それらの半減期は、分解および／またはクリアランスまたは隔離を阻止する分子との結合により、増大され得る。典型的には、このような分子は、それ自体、in vivoで長い半減期を有する天然タンパク質である。リガンドの半減期は、その機能的活性が、半減期増大分子に特異的でない類似のリガンドより長い期間、in vivoで存続する場合に増大する。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的なリガンドおよび標的分子は同一リガンドと比較され、この場合、ＨＳＡに対する特異性は存在せず、すなわち、ＨＳＡに結合しないが、しかし別の分子に結合する。例えば、それは、細胞上の第三の標的に結合し得る。典型的には、半減期は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上増大される。半減期の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれ以上の範囲の増大が可能である。代替的には、あるいはさらに、半減期の３０倍まで、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍の範囲の増大が考えられ得る。   The phrase “half-life” refers to the ligand (eg, dAb, polypeptide or antagonist) to reduce by 50% in vivo, eg due to degradation of the ligand by natural mechanisms and / or clearance or sequestration of the ligand. Refers to the time required for serum concentration. The ligands of the invention can be stabilized in vivo and their half-life can be increased by binding to molecules that prevent degradation and / or clearance or sequestration. Typically, such molecules are themselves natural proteins with a long half-life in vivo. The half-life of a ligand is increased when its functional activity persists in vivo for a longer period than a similar ligand that is not specific for a half-life increasing molecule. For example, a ligand specific for human serum albumin (HSA) and a target molecule are compared to the same ligand, in which case there is no specificity for HSA, ie it does not bind to HSA, but binds to another molecule. . For example, it can bind to a third target on the cell. Typically, the half-life is increased by 10%, 20%, 30%, 40%, 50% or more. An increase in the range of 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times or more of the half-life is possible. Alternatively, or in addition, an increase in the range of up to 30 times the half-life, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times, 150 times can be considered.

本明細書中で用いる場合、「水力学的サイズ」は、水溶液を通した分子の拡散に基づいた分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見掛けのサイズを指す。溶液を通してのタンパク質の拡散または動きは、タンパク質の見掛けのサイズを誘導するよう処理され得るが、この場合、サイズは、タンパク質粒子の「ストークス半径」または「水力学的半径」により示される。タンパク質の「水力学的サイズ」は、質量および形状（立体配座）の両方によっており、したがって、同一分子量を有する２つのタンパク質は、タンパク質の全体的立体配座に基づいて種々の水力学的サイズを有し得る。   As used herein, “hydrodynamic size” refers to the apparent size of a molecule (eg, protein molecule, ligand) based on the diffusion of the molecule through an aqueous solution. The diffusion or movement of the protein through the solution can be treated to induce the apparent size of the protein, where the size is indicated by the “Stokes radius” or “hydraulic radius” of the protein particle. The “hydraulic size” of a protein depends on both mass and shape (conformation), so two proteins with the same molecular weight can have different hydrodynamic sizes based on the overall conformation of the protein. Can have.

本明細書中で言及される場合、「競合する」という用語は、第一標的とその同種標的結合ドメインとの結合が、上記同種標的に特異的である第二結合ドメインの存在下で抑制される、ということを意味する。例えば、結合は、標的に対するその親和性または結合力が低減されるよう、結合ドメインの物理的遮断により、あるいは結合ドメインの構造または環境の変更により、立体的に抑制され得る。第一および第二結合ドメイン間の競合を確定するために競合ＥＬＩＳＡおよび競合ＢｉａＣｏｒｅ実験を実施する方法の詳細に関しては、ＷＯ２００６０３８０２７を参照されたい。   As referred to herein, the term “competing” means that binding of a first target to its cognate target binding domain is inhibited in the presence of a second binding domain that is specific for the cognate target. It means that. For example, binding can be sterically suppressed by physical blocking of the binding domain, or by alteration of the binding domain structure or environment, such that its affinity or binding power to the target is reduced. See WO2006038027 for details on how to perform competition ELISA and competition BiaCore experiments to determine competition between the first and second binding domains.

２つの配列間の「相同性」または「同一性」または「類似性」（これらの用語は、本明細書中では互換的に用いられる）の算定は、以下のように実施される。配列は、最適比較目的のために整列される（例えば、最適アラインメントのためにギャップが第一および第二アミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され、非相同配列が比較目的に関して無視され得る）。一実施形態では、比較目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次に比較される。第一の配列中の位置は、第二配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合には、分子はその位置で同一である（本明細書中で用いる場合、アミノ酸または核酸「相同性」はアミノ酸または核酸「同一性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、（２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要がある）ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列が共有する同一位置の数の一関数である。本明細書中で定義されるようなアミノ酸およびヌクレオチド配列アラインメント、ならびに相同性、類似性または同一性は、デフォルトパラメーターを用いて、アルゴリズムＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを用いて、調製され、確定され得る（Tatusova, T.A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999)）。   Calculations of “homology” or “identity” or “similarity” between two sequences (these terms are used interchangeably herein) are performed as follows. The sequences are aligned for optimal comparison purposes (eg, gaps are introduced in one or both of the first and second amino acid or nucleic acid sequences for optimal alignment, and heterologous sequences can be ignored for comparison purposes) . In one embodiment, the length of the reference sequence aligned for comparison purposes is at least 30%, or at least 40%, or at least 50%, or at least 60%, or at least 70% of the length of the reference sequence, 80%, 90% and 100%. The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecule is identical at that position (as used herein) Amino acid or nucleic acid “homology” is equivalent to amino acid or nucleic acid “identity”). The percent identity between the two sequences is the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps (needed to be introduced for optimal alignment of the two sequences) and the length of each gap. It is a function. Amino acid and nucleotide sequence alignments as defined herein, as well as homology, similarity or identity, can be prepared and determined using the algorithm BLAST2 Sequences using default parameters (Tatusova, TA et al. al., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999)).

プロテアーゼ耐性：
本発明は、一実施形態において、眼への送達のためのｄＡｂ、例えば抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ、ＴＮＦＲ１ ｄＡｂ、ＩＬ−１ ｄＡｂに関するが、これらは、所望の生物学的活性、例えばＶＥＧＦ、ＴＮＦＲ１またはＩＬ−１との結合を有するプロテアーゼ耐性ｄＡｂに関する選択方法により選択されている。プロテアーゼ分解に対して高度に安定で且つ耐性であり、そして所望の生物学的活性を有するポリペプチドを選択するための効率的プロセスを生じるための方法に、２つの選択的圧力が用いられる。本明細書中で用いる場合、プロテアーゼ耐性ペプチドおよびポリペプチドは、一般的に、生物学的活性を保持する。これに対比して、プロテアーゼ感受性ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書中に記載される方法において、プロテアーゼにより切断されるかまたは消化され、したがって、それらの生物学的活性を失う。したがって、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、一般的に、それらの生物学的活性、例えば結合活性に基づいて選択される。 Protease resistance:
The present invention, in one embodiment, relates to dAbs for delivery to the eye, such as anti-VEGF dAbs, TNFR1 dAbs, IL-1 dAbs, which are of the desired biological activity, such as VEGF, TNFR1 or IL- Selected by a selection method for protease resistant dAbs having a binding to 1. Two selective pressures are used in a method to generate an efficient process for selecting polypeptides that are highly stable and resistant to protease degradation and that have the desired biological activity. As used herein, protease resistant peptides and polypeptides generally retain biological activity. In contrast, protease sensitive peptides and polypeptides are cleaved or digested by proteases and thus lose their biological activity in the methods described herein. Accordingly, protease resistant peptides or polypeptides are generally selected based on their biological activity, eg, binding activity.

眼環境は、プロテアーゼに富むものであり、それゆえ、本明細書中に記載されるような眼送達のためのプロテアーゼ耐性ｄＡｂの使用は、いくつかの利点を提供する。例えば、あるプロテアーゼ（例えばトリプシン）によるタンパク質分解に対する耐性に関して選択される可変ドメインは、他のプロテアーゼ（例えばエラスターゼ、ロイコザイム）による分解に対しても耐性である。プロテアーゼ耐性は、ペプチドまたはポリペプチドの高い融点（Ｔｍ）と相関し得る。融点が高いほど、より安定な可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドおよびポリペプチドであることを示す。プロテアーゼ分解に対する耐性は、標的リガンドに対する高親和性結合とも相関する。したがって、本明細書中で記載され、参照される方法（ＷＯ２００８１４９１４３）は、所望の生物学的活性を有し、そして、それらがプロテアーゼ耐性および安定性であるためin vivoでの治療的および／または診断的眼使用に十分に適しているｄＡｂを選択し、単離し、および／または回収するための効率的な方法を提供する。一実施形態では、プロテアーゼ耐性は、例えば、プロテアーゼ耐性でない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドより上回って改良された改良型ＰＫと相関し得る。改良型ＰＫは、改良型ＡＵＣ（曲線下面積）および／または改良型半減期であり得る。プロテアーゼ耐性は、例えば、プロテアーゼ耐性でない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドより上回って改良された、剪断および／または熱応力、および／または噴霧化中の凝集傾向低減に対する可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドの改良型安定性とも相関し得る。一実施形態では、プロテアーゼ耐性は、例えば、プロテアーゼ耐性でない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドより上回って改良された改良型貯蔵安定性と相関する。一態様では、利点のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは全てが提供され、利点はプロテアーゼ分解に対する耐性、高Ｔｍならびに標的リガンドとの高親和性結合である。   The ocular environment is rich in proteases and therefore the use of protease resistant dAbs for ocular delivery as described herein provides several advantages. For example, variable domains selected for resistance to proteolysis by certain proteases (eg, trypsin) are also resistant to degradation by other proteases (eg, elastase, leucozyme). Protease resistance can correlate with the high melting point (Tm) of a peptide or polypeptide. Higher melting points indicate more stable variable domains, antagonists, peptides and polypeptides. Resistance to protease degradation also correlates with high affinity binding to the target ligand. Accordingly, the methods described and referred to herein (WO200008149143) have the desired biological activity and are therapeutic and / or in vivo because they are protease resistant and stable. It provides an efficient method for selecting, isolating and / or recovering dAbs well suited for diagnostic eye use. In one embodiment, protease resistance can correlate with improved PK, for example, improved over variable domains, antagonists, peptides or polypeptides that are not protease resistant. The improved PK can be an improved AUC (area under the curve) and / or an improved half-life. Protease resistance is, for example, improved over shearing and / or thermal stress and / or aggregation tendency during atomization, improved over variable domains, antagonists, peptides or polypeptides that are not protease resistant. It can also correlate with improved stability of the polypeptide. In one embodiment, protease resistance correlates with improved storage stability, eg, improved over variable domains, antagonists, peptides or polypeptides that are not protease resistant. In one aspect, one, two, three, four or all of the advantages are provided, the advantages being resistance to protease degradation, high Tm as well as high affinity binding to the target ligand.

本明細書中で記載され、参照される方法（ＷＯ２００８１４９１４３）は、所望によりその他の適切な選択方法を含み得る、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド、例えばｄＡｂを単離するためのプログラムの一部として用いられ得る。これらの状況では、本明細書中に記載される方法は、プログラムの任意の所望の時点で、例えば他の選択方法が用いられる前または後に用いられ得る。   The method described and referred to herein (WO200008149143) is used as part of a program for isolating protease resistant peptides or polypeptides, eg dAbs, which may optionally include other suitable selection methods. Can be. In these situations, the methods described herein can be used at any desired point in the program, for example, before or after other selection methods are used.

ある実施形態では、眼送達のためのｄＡｂは、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムによる分解に対する耐性に関して選択され、ＶＥＧＦに特異的に結合する。これらの実施形態では、ｄＡｂを含むライブラリーまたはレパートリーが提供され、タンパク質分解性消化に適した条件下で、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイム（またはトリプシンを含む生物学的調製物、抽出物またはホモジネート）と組合される。ＶＥＧＦに結合する、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイム耐性ｄＡｂが選択される。例えば、プロテアーゼ耐性ｄＡｂは、少なくとも約２時間の期間中、プロテアーゼの０．０４％（ｗ／ｗ）溶液中で３７℃でインキュベートされる場合、実質的に分解されない。別の例では、プロテアーゼ耐性ｄＡｂは、少なくとも約３時間の期間中、プロテアーゼの０．０４％（ｗ／ｗ）溶液中で３７℃でインキュベートされる場合、実質的に分解されない。別の例では、プロテアーゼ耐性ｄＡｂは、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間または少なくとも約１２時間の期間中、プロテアーゼの０．０４％（ｗ／ｗ）溶液中で３７℃でインキュベートされる場合、実質的に分解されない。   In certain embodiments, dAbs for ocular delivery are selected for resistance to degradation by trypsin, elastase or leucozyme and specifically bind to VEGF. In these embodiments, a dAb-containing library or repertoire is provided and under conditions suitable for proteolytic digestion with trypsin, elastase or leucozyme (or a biological preparation, extract or homogenate containing trypsin) and Unioned. Trypsin, elastase or leucozyme resistant dAbs that bind to VEGF are selected. For example, protease resistant dAbs are not substantially degraded when incubated at 37 ° C. in a 0.04% (w / w) solution of protease for a period of at least about 2 hours. In another example, a protease resistant dAb is not substantially degraded when incubated at 37 ° C. in a 0.04% (w / w) solution of protease for a period of at least about 3 hours. In another example, the protease resistant dAb is at least about 4 hours, at least about 5 hours, at least about 6 hours, at least about 7 hours, at least about 8 hours, at least about 9 hours, at least about 10 hours, at least about 11 hours or When incubated at 37 ° C. in a 0.04% (w / w) solution of protease for a period of at least about 12 hours, it is not substantially degraded.

別の態様では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、ｄＡｂ）のレパートリーの産生方法が提供される。この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供すること；プロテアーゼ活性に適した条件下でペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼを組合せること；そしてＶＥＧＦに特異的に結合する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収し、それによりプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーが産生されることを包含する。本方法で用いるのに適しているプロテアーゼ、表示系、プロテアーゼ活性のための条件、ならびにペプチドまたはポリペプチドの選択方法は、他の方法と関連して本明細書中に記載される。   In another aspect, a method for producing a repertoire of protease resistant peptides or polypeptides (eg, dAbs) is provided. The method provides a repertoire of peptides or polypeptides; combining the repertoire of peptides or polypeptides with a protease under conditions suitable for protease activity; and a plurality of peptides or polypeptides that specifically bind to VEGF Including the production of a repertoire of protease resistant peptides or polypeptides. Proteases suitable for use in the present methods, display systems, conditions for protease activity, and methods for selecting peptides or polypeptides are described herein in connection with other methods.

いくつかの実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含む表示系（例えば、核酸のコード機能と核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴を連結する表示系）が用いられ、そして当該方法はさらに、複数の選択ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅するかまたは増大することを包含する。核酸は、任意の適切な方法を用いて、例えばファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得る。   In some embodiments, a display system comprising a repertoire of peptides or polypeptides (eg, a display system linking the coding function of the nucleic acid and the functional characteristics of the peptide or polypeptide encoded by the nucleic acid) is used, and The method further includes amplifying or increasing the copy number of the nucleic acid encoding the plurality of selected peptides or polypeptides. The nucleic acid can be amplified using any suitable method, for example, by phage amplification, cell growth or polymerase chain reaction.

特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂを含むプロテアーゼ耐性ポリペプチドのレパートリーの産生方法が提供される。この方法は、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂを含むポリペプチドのレパートリーを提供すること；プロテアーゼ活性に適した条件下でペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム）を組合せること；そしてＶＥＧＦに対する結合特異性を有するｄＡｂを含む複数のポリペプチドを回収することを包含する。この方法を用いて、ナイーブレパートリー、あるいは所望の結合特異性に偏向されるレパートリー、例えばＶＥＧＦに対する結合特異性を有する親ｄＡｂを基礎にした親和性成熟レパートリーを産生し得る。   In certain embodiments, methods of producing a repertoire of protease resistant polypeptides comprising anti-VEGF dAbs are provided. The method provides a repertoire of polypeptides comprising an anti-VEGF dAb; combining a peptide or polypeptide repertoire with a protease (eg, trypsin, elastase, leucozyme) under conditions suitable for protease activity; and VEGF Recovering a plurality of polypeptides comprising a dAb having binding specificity for. This method can be used to produce a naïve repertoire, or an affinity matured repertoire based on a parental dAb that has binding specificity for VEGF, eg, a repertoire that is biased to the desired binding specificity.

選択／単離／回収
プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドの集団）は、任意の適切な方法を用いて、レパートリーまたはライブラリー（例えば、表示系における）から選択され、単離され、および／または回収され得る。一実施形態では、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、選択可能な特徴（例えば、物理的特徴、化学的特徴、機能的特徴）に基づいて、選択されるかまたは単離される。適切な選択可能な機能的特徴としては、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドの生物学的活性、例えば一般的リガンド（例えば、超抗原）との結合、標的リガンド（例えば、抗原、エピトープ、基質）との結合、抗体との結合（例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現されるエピトープを介して）、および触媒活性が挙げられる（例えば、Tomlinson et al.、ＷＯ９９／２０７４９；ＷＯ０１／５７０６５；ＷＯ９９／５８６５５参照）。一実施形態では、選択は、ＶＥＧＦとの特異的結合に基づいている。別の実施形態では、選択は、成員がプロテアーゼ耐性である第二レパートリーを産生し、その後、ＶＥＧＦに特異的に結合する第二レパートリーから成員を選択するよう選択された機能的特徴に基づいている。 Selection / isolation / recovery A protease resistant peptide or polypeptide (eg, a population of protease resistant polypeptides) is selected and isolated from a repertoire or library (eg, in a display system) using any suitable method. And / or can be recovered. In one embodiment, the protease resistant polypeptide is selected or isolated based on selectable characteristics (eg, physical characteristics, chemical characteristics, functional characteristics). Suitable selectable functional characteristics include biological activity of peptides or polypeptides in the repertoire, such as binding to common ligands (eg, superantigens), target ligands (eg, antigens, epitopes, substrates) Binding, antibody binding (eg, via an epitope expressed on a peptide or polypeptide), and catalytic activity (eg, Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655). reference). In one embodiment, the selection is based on specific binding to VEGF. In another embodiment, the selection is based on a functional characteristic selected to produce a second repertoire in which the member is protease resistant and then select the member from the second repertoire that specifically binds to VEGF. .

いくつかの実施形態では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に全てのプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが共通の選択可能な特徴を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーから、選択され、および／または単離される。例えば、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に全てのプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが、共通の一般的リガンドに結合し、共通の標的リガンドに結合し、共通の抗体に結合し（またはそれにより結合され）、あるいは共通の触媒活性を保有するライブラリーまたはレパートリーから選択され得る。この型の選択は、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性成熟を実施する場合、所望の生物学的活性を有する親ペプチドまたはポリペプチドに基づいているプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを調製するために特に有用である。   In some embodiments, the protease resistant peptide or polypeptide is selected from a library or repertoire of peptides or polypeptides in which substantially all protease resistant peptides or polypeptides share common selectable characteristics; And / or isolated. For example, a protease resistant peptide or polypeptide is such that substantially all protease resistant peptides or polypeptides bind to a common common ligand, bind to a common target ligand, and bind to a common antibody (or thereby). Or can be selected from a library or repertoire that possesses a common catalytic activity. This type of selection, for example, when preparing affinity maturation of immunoglobulin single variable domains, prepares a repertoire of protease resistant peptides or polypeptides based on the parent peptide or polypeptide having the desired biological activity. It is particularly useful for

共通の一般的リガンドとの結合に基づいた選択は、元のライブラリーまたはレパートリーの構成成分であったプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのうちの全てまたは実質的に全てを含有するペプチドまたはポリペプチドのコレクションまたは集団を生じ得る。例えば、標的リガンドまたは一般的リガンド、例えばプロテインＡ、プロテインＬまたは抗体に結合するペプチドまたはポリペプチドは、適切な親和性マトリックスをパニング（panning）するかまたは用いることにより、選択され、単離され、および／または回収され得る。パニングは、適切な容器（例えば、試験管、ペトリ皿）にリガンド（例えば、一般的リガンド、標的リガンド）の溶液を付加し、そして容器の壁上にリガンドが沈着しまたは被覆するようにさせることにより成し遂げられ得る。過剰量のリガンドは洗い落とされ、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとともにインキュベートされたレパートリー）が容器に付加されて、固定化リガンドに結合するためにペプチドまたはポリペプチドに適した条件下で容器が保持される。任意の適切な方法、例えば削り落とすか、またはｐＨを下げることにより、非結合ペプチドまたはポリペプチドは洗い落とされて、結合ペプチドまたはポリペプチドが回収され得る。   Selection based on binding to a common common ligand is a collection of peptides or polypeptides containing all or substantially all of the protease resistant peptides or polypeptides that were components of the original library or repertoire Or it can produce a population. For example, a peptide or polypeptide that binds to a target ligand or a generic ligand, such as protein A, protein L or an antibody, is selected and isolated by panning or using an appropriate affinity matrix, And / or can be recovered. Panning involves adding a solution of a ligand (eg, generic ligand, target ligand) to a suitable container (eg, test tube, petri dish) and allowing the ligand to deposit or coat on the walls of the container. Can be accomplished by Excess ligand is washed away and a peptide or polypeptide (eg, a repertoire incubated with a protease) is added to the container and the container is opened under conditions suitable for the peptide or polypeptide to bind to the immobilized ligand. Retained. By any suitable method, such as scraping or lowering the pH, unbound peptide or polypeptide can be washed away and bound peptide or polypeptide can be recovered.

適切なリガンド親和性マトリックスは、一般的に、リガンドが共有的にまたは非共有的に結合される固体支持体またはビーズ（例えば、アガロース）を含有する。親和性マトリックスは、マトリックス上のリガンドとのペプチドまたはポリペプチドの結合に適した条件下で、バッチ法、カラム法または任意の他の適切な方法を用いて、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとともにインキュベートされたレパートリー）と組合され得る。親和性マトリックスを結合しないペプチドまたはポリペプチドは洗い落とされて、結合ペプチドまたはポリペプチドが溶離され、任意の適切な方法を用いて、例えば、低ｐＨ緩衝液を用いた、低刺激性変性剤（例えば、尿素）を用いた、あるいはリガンドとの結合に関して競合するペプチドを用いた溶離により、溶離され、回収され得る。一例では、ビオチニル化標的リガンドが、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドに適した条件下でレパートリーと組合されて、標的リガンド（ＶＥＧＦ）に結合する。結合ペプチドまたはポリペプチドは、固定化アビジンまたはストレプトアビジン（例えば、ビーズ上）を用いて回収される。   Suitable ligand affinity matrices generally contain a solid support or bead (eg, agarose) to which the ligand is covalently or non-covalently bound. The affinity matrix is a peptide or polypeptide (e.g., with a protease) using batch, column or any other suitable method under conditions suitable for binding of the peptide or polypeptide to a ligand on the matrix. Incubated repertoire). Peptides or polypeptides that do not bind the affinity matrix are washed away, and the bound peptide or polypeptide is eluted, using any suitable method, eg, a mild stimulating denaturant (eg, using a low pH buffer). For example, it can be eluted and recovered by elution with urea) or with a peptide that competes for binding to the ligand. In one example, the biotinylated target ligand binds to the target ligand (VEGF) in combination with the repertoire under conditions suitable for the peptide or polypeptide in the repertoire. The bound peptide or polypeptide is recovered using immobilized avidin or streptavidin (eg, on beads).

いくつかの実施形態では、一般的リガンドは、抗体またはその抗原結合断片である。ライブラリーまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチド中に実質的に保存されるペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴に結合する抗体または抗原結合断片は、一般的リガンドとして特に有用である。プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを単離し、選択し、および／または回収するためのリガンドとして用いるのに適した抗体および抗原結合断片は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得るし、任意の適切な方法を用いて調製され得る。   In some embodiments, the generic ligand is an antibody or antigen-binding fragment thereof. Antibodies or antigen-binding fragments that bind to structural features of peptides or polypeptides substantially conserved in peptides or polypeptides of the library or repertoire are particularly useful as general ligands. Antibodies and antigen-binding fragments suitable for use as ligands for isolating, selecting, and / or recovering protease resistant peptides or polypeptides can be monoclonal or polyclonal and can be used using any suitable method. Can be prepared.

核酸、宿主細胞およびプロテアーゼ耐性ポリペプチドの産生方法：
本明細書中に記載される方法により選択されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、適切なin vitro発現系、例えば大腸菌またはピキア種、例えばメタノール資化酵母において、化学合成により、または任意の他の適切な方法によっても産生され得る。 Methods for producing nucleic acids, host cells and protease resistant polypeptides:
Protease resistant peptides or polypeptides selected by the methods described herein can be obtained by chemical synthesis, in any suitable in vitro expression system such as E. coli or Pichia species such as methanol-utilizing yeast, or any other It can also be produced by appropriate methods.

ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニスト：
本明細書に記載されるように、プロテアーゼ耐性ｄＡｂは、一般に、高い親和性で標的リガンドに結合する。 Polypeptides, dAbs and antagonists:
As described herein, protease resistant dAbs generally bind target ligands with high affinity.

例えば、ＶＥＧＦ ｄＡｂは、３００ｎＭ〜１ｐＭ（すなわち、３×１０−７〜５×１０−１２Ｍ）、例えば５０ｎＭ〜１ｐＭ、例えば５ｎＭ〜１ｐＭおよび例えば１ｎＭ〜１ｐＭの親和性（ＫＤ；表面プラズモン共鳴により確定した場合、ＫＤ＝Ｋoff（ｋｄ）／Ｋon（ｋａ））；例えば１×１０−７Ｍ以下、例えば１×１０−８Ｍ以下、例えば１×１０−９Ｍ以下、例えば１×１０−１０Ｍ以下および例えば１×１０−１１Ｍ以下のＫＤ；および／または表面プラズモン共鳴により確定した場合に５×１０−１ｓ−１〜１×１０−７ｓ−１、例えば１×１０−２ｓ−１〜１×１０−６ｓ−１、例えば５×１０−３ｓ−１〜１×１０−５ｓ−１、例えば５×１０−１ｓ−１以下、例えば１×１０−２ｓ−１以下、例えば１×１０−３ｓ−１以下、例えば１×１０−４ｓ−１以下、例えば１×１０−５ｓ−１以下、および例えば１×１０−６ｓ−１以下のＫoff速度定数でＶＥＧＦに結合し得る。 For example, a VEGF dAb can have an affinity (KD; surface plasmon resonance) of 300 nM to 1 pM (ie, 3 × 10 −7 to 5 × 10 −12 M), such as 50 nM to 1 pM, such as 5 nM to 1 pM, and such as 1 nM to 1 pM. KD = K off (kd) / K on (ka)); for example 1 × 10 −7 M or less, for example 1 × 10 −8 M or less, for example 1 × 10 −9 M or less, for example 1 × 10 -10 M or less and for example 1 × 10 -11 M or less K D; and / or 5 × when determined by surface plasmon resonance 10 -1 s -1 ~1 × 10 -7 s -1, for example, 1 × 10 −2 s −1 to 1 × 10 −6 s −1 , for example, 5 × 10 −3 s −1 to 1 × 10 −5 s −1 , for example, 5 × 10 −1 s −1 or less, for example 1 × 10 − 2 s -1 or less, even if 1 × 10 -3 s -1 or less, for example, 1 × 10 -4 s -1 or less, for example 1 × 10 -5 s -1 or less, and for example, 1 × 10 -6 s -1 VEGF below a K off rate constant Can be combined.

任意の特定の理論に縛られることなく考えると、プロテアーゼに対して耐性であるペプチドおよびポリペプチドはより低いエントロピーおよび／またはより高い安定化エネルギーを有する。したがって、プロテアーゼ耐性と高親和性結合との間の相関は、本明細書中に記載される方法により選択されるペプチドおよびポリペプチドおよびｄＡｂの表面の緊密性および安定性と関連づけられ得る。   Considered without being bound by any particular theory, peptides and polypeptides that are resistant to proteases have lower entropy and / or higher stabilization energy. Thus, the correlation between protease resistance and high affinity binding can be related to the tightness and stability of the surfaces of peptides and polypeptides and dAbs selected by the methods described herein.

一実施形態では、ＶＥＧＦ ｄＡｂは、約１μＭ以下、約５００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下のＩＣ５０の濃度５０（ＩＣ５０）で、ＶＥＧＦの結合を抑制する。   In one embodiment, the VEGF dAb binds VEGF at an IC50 concentration 50 (IC50) of about 1 μM or less, about 500 nM or less, about 100 nM or less, about 75 nM or less, about 50 nM or less, about 10 nM or less, or about 1 nM or less. Suppress.

ある実施形態では、ＶＥＧＦ ｄＡｂはＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、そして表面プラズモン共鳴により確定した場合に、３００ｎＭ〜１ｐＭまたは３００ｎＭ〜５ｐＭ、または５０ｎＭ〜１ｐＭ、または５０ｎＭ〜５ｐＭ、または５０ｎＭ〜２０ｐＭまたは約１０ｐＭ、または約１５ｐＭ、または約２０ｐＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＶＥＧＦから解離する。ある実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、ＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、そして表面プラズモン共鳴により確定した場合に５×１０−１ｓ−１〜１×１０−７ｓ−１、例えば１×１０−２ｓ−１〜１×１０−６ｓ−１、例えば５×１０−３ｓ−１〜１×１０−５ｓ−１、例えば５×１０−１ｓ−１以下、例えば１×１０−２ｓ−１以下、例えば１×１０−３ｓ−１以下、例えば１×１０−４ｓ−１以下、例えば１×１０−５ｓ−１以下、および例えば１×１０−６ｓ−１以下のＫoff速度定数でヒトＶＥＧＦから解離する。 In certain embodiments, the VEGF dAb specifically binds to VEGF, eg, human VEGF, and as determined by surface plasmon resonance, 300 nM to 1 pM or 300 nM to 5 pM, or 50 nM to 1 pM, or 50 nM to 5 pM, or 50 nM Dissociate from human VEGF with a dissociation constant (K D ) of ˜20 pM or about 10 pM, or about 15 pM, or about 20 pM. In certain embodiments, the polypeptide, dAb or antagonist specifically binds to VEGF, eg, human VEGF, and is determined from 5 × 10 −1 s −1 to 1 × 10 −7 s − as determined by surface plasmon resonance. 1 , for example, 1 × 10 −2 s −1 to 1 × 10 −6 s −1 , for example, 5 × 10 −3 s −1 to 1 × 10 −5 s −1 , for example, 5 × 10 −1 s −1 or less For example, 1 × 10 −2 s −1 or less, for example 1 × 10 −3 s −1 or less, for example 1 × 10 −4 s −1 or less, for example 1 × 10 −5 s −1 or less, and for example 1 × 10 Dissociates from human VEGF with a K off rate constant of −6 s −1 or less.

ある実施形態では、ＶＥＧＦ ｄＡｂは、１×１０−３Ｍ−１ｓ−１〜１×１０−７Ｍ−１ｓ−１、または１×１０−３Ｍ−１ｓ−１〜１×１０−６Ｍ−１ｓ−１、または約１×１０−４Ｍ−１ｓ−１、または約１×１０−５Ｍ−１ｓ−１のＫonで、ＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合する。一実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、ＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、そして本段落で明示したような解離定数（ＫＤ）およびＫoffで、ヒトＶＥＧＦから解離する。一実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、ＶＥＧＦ、例えばヒトＶＥＧＦに特異的に結合し、そして本段落で明示したような解離定数（ＫＤ）およびＫonで、ヒトＶＥＧＦから解離する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはｄＡｂは、この段落で記述したようなＫＤおよび／またはＫoffおよび／またはＫonでＶＥＧＦ（例えばヒトＶＥＧＦ）に特異的に結合し、そしてＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列を有するｄＡｂのアミノ酸配列と少なくともまたは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。 In certain embodiments, the VEGF dAb is 1 × 10 −3 M −1 s −1 to 1 × 10 −7 M −1 s −1 , or 1 × 10 −3 M −1 s −1 to 1 × 10 −. Bind specifically to VEGF, eg, human VEGF, with a K on of 6 M −1 s −1 , or about 1 × 10 −4 M −1 s −1 , or about 1 × 10 −5 M −1 s −1. To do. In one embodiment, the polypeptide, dAb or antagonist specifically binds to VEGF, eg, human VEGF, and dissociates from human VEGF with a dissociation constant (K D ) and K off as specified in this paragraph. In one embodiment, the polypeptide, dAb or antagonist specifically binds to VEGF, eg, human VEGF, and dissociates from human VEGF with a dissociation constant (K D ) and K on as specified in this paragraph. In some embodiments, the polypeptide or dAb specifically binds to VEGF with K D and / or K off and / or K on as described in this paragraph (eg, human VEGF), and DOM15-26 A dAb having the amino acid sequence of −593 and at least or at least about 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99 It contains amino acid sequences that are% identical.

ｄＡｂは、大腸菌で、またはピキア種（例えば、メタノール資化酵母）で発現され得る。一実施形態では、リガンドまたはｄＡｂモノマーは、大腸菌で、またはピキア種（例えば、メタノール資化酵母）で発現される場合、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌの量で分泌される。本明細書中に記載されるリガンドおよびｄＡｂモノマーは、大腸菌で、またはピキア種（例えば、メタノール資化酵母）で発現される場合に分泌可能であり得るが、しかし、それらは、大腸菌またはピキア種を用いない任意の適切な方法、例えば合成化学的方法または生物学的産生方法を用いて産生され得る。   The dAb can be expressed in E. coli or in Pichia species (eg, methanol-utilizing yeast). In one embodiment, the ligand or dAb monomer is secreted in an amount of at least about 0.5 mg / L when expressed in E. coli or in Pichia species (eg, methanol-utilizing yeast). The ligands and dAb monomers described herein may be secretable when expressed in E. coli or in Pichia species (eg, methanol-utilizing yeast), however, they may be E. coli or Pichia species. Can be produced using any suitable method that does not use, such as synthetic chemical methods or biological production methods.

いくつかの実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、ラクダ類免疫グロブリン可変ドメイン、あるいは、例えば位置１０８、３７、４４、４５および／または４７で、ラクダ類生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリン可変ドメインに独特である１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない。   In some embodiments, the polypeptide, dAb or antagonist is encoded by a camelid immunoglobulin variable domain or alternatively by a camelid germline antibody gene segment, eg, at positions 108, 37, 44, 45 and / or 47. It does not contain one or more framework amino acids that are unique to immunoglobulin variable domains.

ＶＥＧＦのアンタゴニストは、一価または多価であり得る。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは一価であり、本発明のポリペプチドまたはｄＡｂにより提供される結合部位である、ＶＥＧＦと相互作用する１つの結合部位を含有する。一価アンタゴニストは１つのＶＥＧＦに結合し、受容体の活性化およびシグナル伝達を引き起こし得る細胞の表面上のＶＥＧＦの架橋またはクラスター化を誘導し得ない。   The antagonist of VEGF can be monovalent or multivalent. In some embodiments, the antagonist is monovalent and contains one binding site that interacts with VEGF, a binding site provided by a polypeptide or dAb of the invention. Monovalent antagonists cannot bind to one VEGF and induce VEGF cross-linking or clustering on the surface of cells that can cause receptor activation and signal transduction.

代替的には、ＶＥＧＦのアンタゴニストは多価である。ＶＥＧＦの多価アンタゴニストは、ＶＥＧＦに関する特定結合部位の２つ以上のコピーを含有するか、またはＶＥＧＦに結合する２つ以上の異なる結合部位を含有し得る（結合部位の少なくとも１つは、本発明のｄＡｂにより提供される）。例えば、本明細書中に記載されるように、ＶＥＧＦのアンタゴニストは、ＶＥＧＦに結合するｄＡｂの２つ以上のコピー、あるいはＶＥＧＦに結合する２つ以上の異なるｄＡｂを含む二量体、三量体または多量体であり得る。   Alternatively, the antagonist of VEGF is multivalent. A multivalent antagonist of VEGF may contain two or more copies of a specific binding site for VEGF, or may contain two or more different binding sites that bind to VEGF (at least one of the binding sites is defined in the present invention). DAb). For example, as described herein, an antagonist of VEGF is a dimer, trimer comprising two or more copies of a dAb that binds to VEGF, or two or more different dAbs that bind to VEGF. Or it can be multimeric.

他の実施形態では、ｄＡｂは、本明細書中に記載されるＫＤでＶＥＧＦに特異的に結合し、標準マウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖を抑制する（例えば、適切な対照と比較した場合、腫瘍増殖を少なくとも約１０％抑制する）。一実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、約１ｍｇ／ｋｇ以上、例えば約５または１０ｍｇ／ｋｇで投与される場合、標準マウス異種移植モデルにおいて、適切な対照と比較して、少なくとも約１０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％、腫瘍増殖を抑制する。 If in other embodiments, dAb specifically binds to VEGF with a K D that is described herein, inhibit tumor growth in standard murine xenograft model (e.g., compared to a suitable control, Inhibits tumor growth by at least about 10%). In one embodiment, the polypeptide, dAb or antagonist is at least about 10 compared to an appropriate control in a standard mouse xenograft model when administered at about 1 mg / kg or more, eg, about 5 or 10 mg / kg. %, Or at least about 25%, or at least about 50%, inhibits tumor growth.

他の実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストはＶＥＧＦに結合し、そして≦１００ｎＭのＮＤ５０で標準細胞検定においてＶＥＧＦの活性に拮抗する。 In other embodiments, the polypeptide, dAb or antagonist binds to VEGF and antagonizes VEGF activity in a standard cell assay with an ND 50 of ≦ 100 nM.

ある実施形態では、ｄＡｂは、有効量が投与される場合、眼疾患の動物モデルにおいて有効である。一般的に、有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇ）である。ｄＡｂは、例えば１日１回または２回、毎週１回または２回、毎月１回または２回の投与頻度で投与され得る。   In certain embodiments, the dAb is effective in an animal model of eye disease when an effective amount is administered. Generally, an effective amount is from about 1 mg / kg to about 10 mg / kg (eg, about 1 mg / kg, about 2 mg / kg, about 3 mg / kg, about 4 mg / kg, about 5 mg / kg, about 6 mg / kg, About 7 mg / kg, about 8 mg / kg, about 9 mg / kg or about 10 mg / kg). The dAb can be administered at a frequency of administration of, for example, once or twice daily, once or twice weekly, once or twice monthly.

一般的に、ｄＡｂは、眼送達のために薬理学的に適切な担体と一緒に、精製形態で利用される。典型的には、これらの担体としては、水性またはアルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液、整理食塩水および／または緩衝媒質を含む何れかが挙げられ得る。適切な生理学的に許容可能なアジュバントは、懸濁液中にポリペプチド複合体を保持する必要がある場合、濃化剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩から選択され得る。防腐剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスも存在し得る（Mack (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版）。種々の適切な製剤、例えば徐放性製剤が用いられ得る。これらは、埋込み物、ゲル、ナノ粒子およびマイクロ粒子を含み得る。薬剤負荷ＰＬＡナノ−およびマイクロ粒子は、製剤の結膜下送達後に眼の後部セグメントに薬剤を送達するために用いられてきた（Kompella et al IOVS 2003 44(3) 1192-1201）。特に、マイクロスフェアは送達部位に保持され、そしてより容易に除去され得るナノ粒子と比較して、腎薬剤送達により適していると思われる（Amrite et al ARVO abstract #5067/B391 2003）。   In general, dAbs are utilized in purified form together with a pharmacologically suitable carrier for ocular delivery. Typically, these carriers may include any including aqueous or alcoholic / aqueous solutions, emulsions or suspensions, saline and / or buffer media. Suitable physiologically acceptable adjuvants can be selected from thickening agents such as carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, gelatin and alginates if it is necessary to keep the polypeptide complex in suspension. Preservatives and other additives such as antibacterial agents, antioxidants, chelating agents and inert gases may also be present (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition). A variety of suitable formulations may be used, such as sustained release formulations. These can include implants, gels, nanoparticles and microparticles. Drug-loaded PLA nano- and microparticles have been used to deliver drugs to the posterior segment of the eye after subconjunctival delivery of the formulation (Kompella et al IOVS 2003 44 (3) 1192-1201). In particular, microspheres appear to be more suitable for renal drug delivery compared to nanoparticles that are retained at the delivery site and can be more easily removed (Amrite et al ARVO abstract # 5067 / B391 2003).

本発明のリガンド（例えばアンタゴニスト）は、別々に投与される組成物として、または他の作用物質とともに用いられ得る。これらの例としては、眼への眼送達のための種々の薬剤、および／または眼浸透増強剤および／または増粘剤が挙げられる。   The ligands (eg, antagonists) of the present invention can be used as separately administered compositions or with other agents. Examples of these include various agents for ocular delivery to the eye, and / or eye penetration enhancers and / or thickeners.

医薬組成物は、本発明のリガンドとともに種々の他の作用物質の、あるいは異なる特異性を有する本発明によるリガンド、例えば（それらが投与前にプールされていてもいなくても）異なる標的抗原またはエピトープを用いて選択されるリガンドの組合せの「カクテル」を包含し得る。   The pharmaceutical composition comprises a ligand according to the invention with various other agents, or a ligand according to the invention having a different specificity, eg different target antigens or epitopes (whether they are pooled before administration) Can include a “cocktail” of combinations of ligands selected using

眼へのｄＡｂの投与の精確な投与量および頻度は、患者の年齢、性別および症状、他の薬剤の同時投与、禁忌、ならびに臨床医が考慮すべきその他のパラメーターに左右される。   The exact dosage and frequency of administration of the dAb to the eye will depend on the patient's age, sex and symptoms, concurrent administration of other drugs, contraindications, and other parameters that the clinician should consider.

本発明のｄＡｂは、貯蔵のために凍結乾燥され、そして使用前に適切な担体中で再構成され得る。この技法は、慣用的免疫グロブリンを用いて有効であることが示されており、当該技術分野で既知の凍結乾燥および再構成技法が用いられ得る。凍結乾燥および再構成が種々の程度の抗体活性損失（例えば、慣用的免疫グロブリンに関しては、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より大きい活性を有する傾向がある）を引き起こし得る、そして使用レベルを補うように上向きに調整しなければならないこともある、と当業者は理解するであろう。   The dAbs of the present invention can be lyophilized for storage and reconstituted in a suitable carrier prior to use. This technique has been shown to be effective using conventional immunoglobulins and lyophilization and reconstitution techniques known in the art can be used. Lyophilization and reconstitution can cause varying degrees of antibody activity loss (eg, for conventional immunoglobulins, IgM antibodies tend to have greater activity than IgG antibodies) and upwards to compensate for use levels One skilled in the art will appreciate that adjustments may be necessary.

本発明のｄＡｂまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。ある治療的適用では、選択細胞の集団の、少なくとも部分的な抑制、抑圧、調整、死滅、あるいはいくつかの他の測定可能なパラメーターを成し遂げるための適切な量は、「治療的有効用量」と定義され得る。この投与量を達成するために必要とされる量は、患者自身の免疫系の疾患および全身状態の重症度に左右される。疾患を治療し、抑圧し、または防止するための適切な投与間隔を、熟練臨床医は確定し得る。   Compositions containing the dAbs of the invention or a cocktail thereof can be administered for prophylactic and / or therapeutic treatments. In some therapeutic applications, an appropriate amount to achieve at least partial suppression, suppression, modulation, killing, or some other measurable parameter of a population of selected cells is referred to as a “therapeutically effective dose”. Can be defined. The amount required to achieve this dosage depends on the disease of the patient's own immune system and the severity of the general condition. Skilled clinicians can determine appropriate dosing intervals for treating, suppressing, or preventing the disease.

本明細書中に記載される組成物を用いて実施される治療または療法は、治療前に存在するこのような症候に比して、あるいはこのような組成物で治療されない個体（ヒトまたはモデル動物）または他の適切な対照におけるこのような症候に比して、１つ以上の症候が低減される場合（例えば少なくとも１０％または臨床的査定尺度で少なくとも１点）、「有効」とみなされる。症候は、標的にされる疾患または障害によって明白に変わるが、しかし通常の熟練臨床医または技術者により測定され得る。このような症候は、例えば、疾患または障害の１つ以上の生化学的指標のレベル（例えば、疾患、罹患細胞数等と相関する酵素または代謝産物のレベル）をモニタリングすることにより、身体的症状発現をモニタリングすることにより、あるいは容認された臨床的査定尺度により、測定され得る。   Treatment or therapy performed using the compositions described herein is relative to such symptoms present prior to treatment or to individuals (human or model animals) not treated with such compositions. ) Or other suitable controls, where one or more symptoms are reduced (eg, at least 10% or at least one point on a clinical assessment scale), are considered “effective”. Symptoms will obviously vary depending on the disease or disorder targeted, but can be measured by a normal skilled clinician or technician. Such symptoms can be caused by, for example, monitoring the level of one or more biochemical indicators of the disease or disorder (eg, the level of an enzyme or metabolite that correlates with the disease, the number of affected cells, etc.). It can be measured by monitoring expression or by an accepted clinical assessment scale.

同様に、本明細書中に記載されるような組成物を用いて実施される予防は、当該組成物で治療されない類似の個体（ヒトまたは動物モデル）におけるこのような症候に比して、１つ以上の症候の開始または重症度が遅延され、低減され、または無効にされる場合、「有効」である。   Similarly, prophylaxis performed using a composition as described herein is 1 in comparison to such symptoms in a similar individual (human or animal model) not treated with the composition. “Effective” if the onset or severity of one or more symptoms is delayed, reduced, or nullified.

一実施形態では、本発明は、例えば癌（例えば固形腫瘍）、炎症性疾患、自己免疫疾患、血管増殖性疾患（例えば、ＡＭＤ（加齢性黄斑変性））から選択される眼の疾患または症状を治療し、抑圧し、または防止するための方法であって、それを必要とする哺乳動物に、治療的有効用量または量のポリペプチド、ｄＡｂ（これは、本発明によるＶＥＧＦまたはＶＥＧＦのアンタゴニストと、あるいはＩＬ−１またはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αＲと結合する）を投与することを包含する方法である。このような眼の疾患または症状の例としては、ＡＭＤ、ブドウ膜炎、ドライアイ、糖尿病性網膜症および糖尿病性黄斑浮腫が挙げられる。   In one embodiment, the invention provides an ophthalmic disease or condition selected from, for example, cancer (eg, solid tumors), inflammatory diseases, autoimmune diseases, vascular proliferative diseases (eg, AMD (age-related macular degeneration)). Wherein the mammal in need thereof is treated with a therapeutically effective dose or amount of the polypeptide, dAb (which comprises VEGF or an antagonist of VEGF according to the present invention). Or binds IL-1 or TNF-α or TNF-αR). Examples of such ophthalmic diseases or conditions include AMD, uveitis, dry eye, diabetic retinopathy and diabetic macular edema.

フォーマット：
半減期増大は、免疫グロブリン、特に抗体、最も特定的には小サイズの抗体断片のin vivo適用に有用である。このような断片（Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）は、身体からの急速なクリアランスを蒙り得る；したがって、それらは迅速に身体のほとんどの部分に到達し得るし、産生が素早く且つ取扱いが容易である一方で、それらのin vivo適用は、in vivoでのそれらのほんの短い持続性により限定されてきた。それゆえ、本明細書中に記載されるｄＡｂは、in vivoでの半減期増大と、その結果としてのより長い身体中持続時間を提供するよう修飾され得る。 format:
Increased half-life is useful for in vivo applications of immunoglobulins, particularly antibodies, most particularly small sized antibody fragments. Such fragments (Fv, disulfide bond Fv, Fab, scFv, dAb) can undergo rapid clearance from the body; therefore, they can quickly reach most parts of the body, produce quickly and While easy to handle, their in vivo applications have been limited by their only short persistence in vivo. Therefore, the dAbs described herein can be modified to provide increased half-life in vivo and the resulting longer duration in the body.

薬物動態分析およびリガンド半減期の確定のための方法は、当業者にはよく知られている。詳細は、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacistsに、ならびにPeters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)に見出され得る。”Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)（ｔアルファおよびｔベータ半減期ならびに曲線下面積（ＡＵＣ）のような薬物動態パラメーターを記載する）も参照され得る。 Methods for pharmacokinetic analysis and determination of ligand half-life are well known to those skilled in the art. Details can be found in Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, and in Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, ( describes pharmacokinetic parameters such as t alpha and t beta half-life and area under the curve (AUC)) published by Marcel Dekker , 2 nd Rev. ex edition (1982) also Reference may be made.

半減期（ｔ1/2アルファおよびｔ1/2ベータ）およびＡＵＣは、時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から確定され得る。例えば、この曲線をモデル化するために、WinNonlin分析パッケージ（Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USAから入手可能）が用いられ得る。第一相（アルファ相）では、リガンドは主に患者における分布を受けつつあり、多少の排除を伴う。第二相（ベータ相）は、リガンドが分布されて、リガンドが患者から***されるので、血清濃度が減少している末期相である。ｔアルファ半減期は第一相の半減期であり、ｔベータ半減期は第二相の半減期である。したがって、一実施形態では、本発明は、１５分またはそれ以上の範囲のｔα半減期を有する本発明によるリガンドまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、その範囲の下限は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、１２時間を含めて１２時間までの範囲のｔα半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上限は、１１、１０、９、８、７、６または５時間である。適切な範囲の一例は、１〜６時間、２〜５時間または３〜４時間である。   Half-life (t1 / 2 alpha and t1 / 2 beta) and AUC can be determined from curves of ligand serum concentration over time. For example, the WinNonlin analysis package (available from Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA) can be used to model this curve. In the first phase (alpha phase), the ligand is undergoing mainly distribution in the patient with some exclusion. The second phase (beta phase) is the terminal phase where the serum concentration is decreasing as the ligand is distributed and the ligand is excreted from the patient. The talpha half-life is the half-life of the first phase and the tbeta half-life is the half-life of the second phase. Accordingly, in one embodiment, the invention provides a ligand or a composition comprising a ligand according to the invention having a tα half-life in the range of 15 minutes or longer. In one embodiment, the lower limit of the range is 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 7 hours, 10 hours, 11 hours or 12 hours. Additionally or alternatively, a ligand or composition according to the invention has a tα half-life in the range of up to 12 hours, including 12 hours. In one embodiment, the upper limit of this range is 11, 10, 9, 8, 7, 6 or 5 hours. An example of a suitable range is 1-6 hours, 2-5 hours, or 3-4 hours.

一実施形態では、本発明によるｄＡｂまたはｄＡｂを含む組成物は、３０分またはそれ以上の範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、この範囲の下限は、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、２１日を含めて２１日までの範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上限は、１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日または２０日である。一実施形態では、本発明によるリガンドまたは組成物は、１２〜６０時間の範囲のｔβ半減期を有する。さらなる一実施形態では、それは、１２〜４８時間の範囲である。さらなる一実施形態では、それは１２〜２６時間の範囲である。   In one embodiment, a dAb or a composition comprising a dAb according to the present invention has a tβ half-life in the range of 30 minutes or more. In one embodiment, the lower limit of this range is 45 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 7 hours, 10 hours, 11 hours or 12 hours. Additionally or alternatively, a ligand or composition according to the invention has a tβ half-life ranging from 21 days to 21 days. In one embodiment, the upper limit of this range is 12 hours, 24 hours, 2 days, 3 days, 5 days, 10 days, 15 days or 20 days. In one embodiment, the ligand or composition according to the invention has a tβ half-life in the range of 12-60 hours. In a further embodiment, it ranges from 12 to 48 hours. In a further embodiment, it ranges from 12 to 26 hours.

上記判定基準のほかに、またはそれに代替的には、本発明は、１ｍｇ・分／ｍｌまたはそれ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する本発明によるｄＡｂまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、この範囲の下限は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ・分／ｍｌである。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、６００ｍｇ・分／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、この範囲の上限は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ・分／ｍｌである。一実施形態では、本発明によるリガンドは、以下からなる群から選択される範囲のＡＵＣを有する：１５〜１５０ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ・分／ｍｌおよび１５〜５０ｍｇ・分／ｍｌ。   In addition to or in place of the above criteria, the present invention provides a composition comprising a dAb or ligand according to the present invention having an AUC value (area under the curve) in the range of 1 mg · min / ml or more To do. In one embodiment, the lower limit of this range is 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 or 300 mg · min / ml. Additionally or alternatively, a ligand or composition according to the invention has an AUC in the range of up to 600 mg · min / ml. In one embodiment, the upper limit of this range is 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 or 50 mg · min / ml. In one embodiment, the ligand according to the invention has a range of AUC selected from the group consisting of: 15-150 mg · min / ml, 15-100 mg · min / ml, 15-75 mg · min / ml and 15 ~ 50 mg · min / ml.

本発明のｄＡｂは、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体またはその少なくともトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付着により、あるいは抗体ドメインとの接合により、より大きな水力学的サイズを有するようフォーマット化され得る。例えば、ｄＡｂは、抗体のより大きな抗原結合断片として、または抗体としてフォーマットされ得る（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマットされる）。別の実施形態では、本発明によるｄＡｂは、別のポリペプチドまたはペプチドとの融合体または接合体としてフォーマットされ得る。 The dAbs of the present invention are formatted to have a larger hydrodynamic size by attachment of PEG groups, serum albumin, transferrin, transferrin receptor or at least its transferrin binding portion, antibody Fc region, or by conjugation with antibody domains Can be done. For example, a dAb can be formatted as a larger antigen-binding fragment of an antibody or as an antibody (eg, formatted as Fab, Fab ′, F (ab) 2 , F (ab ′) 2 , IgG, scFv). In another embodiment, a dAb according to the present invention may be formatted as a fusion or conjugate with another polypeptide or peptide.

本発明のリガンド（例えば、ｄＡｂ単量体および多量体）の水力学的サイズは、当該技術分野で周知の方法を用いて確定され得る。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、リガンドの水力学的サイズを確定し得る。リガンドの水力学的サイズを確定するための適切なゲル濾過マトリックス、例えば架橋アガロースマトリックスがよく知られており、容易に入手可能である。   The hydrodynamic size of the ligands of the invention (eg, dAb monomers and multimers) can be determined using methods well known in the art. For example, gel filtration chromatography can be used to determine the hydrodynamic size of the ligand. Appropriate gel filtration matrices, such as cross-linked agarose matrices, for determining the hydrodynamic size of the ligand are well known and readily available.

リガンドのサイズ、すなわちｄＡｂフォーマット（例えば、ｄＡｂ単量体に付着されるＰＥＧ部分のサイズ）は所望の用途によって変わり得る。例えば、ｄＡｂが長時間、全身循環中に残存することが望ましい場合、そのサイズは、例えばＩｇ様タンパク質としてフォーマットすることにより増大され得る。   The size of the ligand, i.e. the dAb format (e.g. the size of the PEG moiety attached to the dAb monomer) may vary depending on the desired application. For example, if it is desired that the dAb remain in the systemic circulation for a long time, its size can be increased, for example, by formatting it as an Ig-like protein.

in vivoで半減期を増大する抗原またはエピトープを標的化することによる半減期延長
リガンドの水力学的サイズおよびその血清半減期は、本明細書中に記載されるように、in vivoで半減期を増大する抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）とｄＡｂを接合するかまたは会合させることによっても増大され得る。例えば、ＶＥＧＦ ｄＡｂは、抗血清アルブミンまたは抗新生児Ｆｃ受容体抗体または抗体断片、例えば抗ＳＡまたは抗新生児Ｆｃ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖに、あるいは抗ＳＡアフィボディまたは抗新生児Ｆｃ受容体アフィボディまたは抗ＳＡアビマー、あるいは抗ＳＡ結合ドメイン（ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌおよびフィブロネクチン（好ましくはこれらに限定されない）からなる群から選択される足場を含む）に接合されるかまたは連結され得る（これらの結合ドメインの開示に関しては、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００４５３（２００８年２月８日出願）参照。このドメインおよびそれらの配列は、参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する）。接合することは、血清アルブミンに結合する結合ドメインと（共有的にまたは非共有的に）結合される本発明のポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストを含む組成物を指す。 Hydrodynamic size of a half-life extended ligand and its serum half-life by targeting antigens or epitopes that increase half-life in vivo, as described herein, It can also be increased by joining or associating the dAb with a binding domain (eg, an antibody or antibody fragment) that binds to an increasing antigen or epitope. For example, VEGF dAb can be anti-serum albumin or anti-neonatal Fc receptor antibody or antibody fragment, such as anti-SA or anti-neonatal Fc receptor dAb, Fab, Fab 'or scFv, or anti-SA affibody or anti-neonatal Fc receptor. Conjugated to an affibody or anti-SA avimer, or anti-SA binding domain, including a scaffold selected from the group consisting of (but not limited to) CTLA-4, lipocalin, SpA, affibody, avimer, GroEl and fibronectin. (For disclosure of these binding domains, see PCT / GB2008 / 000453, filed February 8, 2008. This domain and their sequences are incorporated herein by reference. , Part of the disclosure of the text That). Conjugating refers to a composition comprising a polypeptide, dAb or antagonist of the invention that is bound (covalently or non-covalently) to a binding domain that binds serum albumin.

in vivoでの血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、例えば、トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経薬学的因子融合タンパク質（米国特許第５，９７７，３０７号（この教示は参照により本明細書中で援用される）参照）、脳毛細管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）受容体、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子Ｘ、α１−抗トリプシンおよびＨＮＦ １αが挙げられる。血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、アルファ−１糖タンパク質（オロソムコイド；ＡＡＧ）、アルファ−１抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、アルファ−１マイクログロブリン（プロテインＨＣ；ＡＩＭ）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）、アポリポプロテインＡ−１（アポＡ−１）、アポリポプロテインＢ（アポＢ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、補体成分Ｃ３（Ｃ３）、補体成分Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ ＩＮＨ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン（ＦＥＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミオグロビン（Ｍｙｏ）、プレアルブミン（トランスチレチン；ＰＡＬ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）およびリウマチ因子（ＲＦ）も挙げられる。   Suitable polypeptides that increase serum half-life in vivo include, for example, transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical factor fusion proteins (US Pat. No. 5,977,307, the teachings of which are herein incorporated by reference). (Incorporated herein)), brain capillary endothelial cell receptor, transferrin, transferrin receptor (eg, soluble transferrin receptor), insulin, insulin-like growth factor 1 (IGF1) receptor, insulin-like growth factor 2 ( IGF2) receptor, insulin receptor, blood coagulation factor X, α1-antitrypsin and HNF 1α. Suitable polypeptides that increase serum half-life include alpha-1 glycoprotein (orosomucoid; AAG), alpha-1 antichymotrypsin (ACT), alpha-1 microglobulin (protein HC; AIM), antithrombin III (AT III), apolipoprotein A-1 (apo A-1), apolipoprotein B (apo B), ceruloplasmin (Cp), complement component C3 (C3), complement component C4 (C4), C1 esterase inhibitor ( C1 INH), C-reactive protein (CRP), ferritin (FER), hemopexin (HPX), lipoprotein (a) (Lp (a)), mannose binding protein (MBP), myoglobin (Myo), prealbumin ( Transthyretin (PAL), retinol binding protein (RBP) And rheumatoid factor (RF).

細胞外マトリックスからの適切なタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチンが挙げられる。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要タンパク質である。約１５の型のコラーゲン分子が一般に知られており、身体の異なる部分に見出され、例えば、Ｉ型コラーゲン（身体コラーゲンの９０％を占める）は骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内部器官に見出され、あるいはＩＩ型コラーゲンは軟骨、椎骨円板、脊索および眼の硝子体液中に見出される。   Suitable proteins from the extracellular matrix include, for example, collagen, laminin, integrin and fibronectin. Collagen is the main protein of the extracellular matrix. About 15 types of collagen molecules are generally known and found in different parts of the body, for example, type I collagen (which accounts for 90% of body collagen) is bone, skin, tendon, ligament, cornea, internal organs Or type II collagen is found in cartilage, vertebral disc, notochord and ocular vitreous humor.

血液からの適切なタンパク質としては、例えば、血漿タンパク質（例えば、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン（例えば、フィブリノーゲンＡ、フィブリノーゲンＢ）、血清アミロイドプロテインＡ、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ−２−マイクログロブリン）、酵素および酵素阻害剤（例えば、プラスミノーゲン、ライソザイム、シスタチンＣ、アルファ−１−アンチトリプシンおよび膵臓トリプシン阻害剤）、免疫系のタンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリン軽鎖（カッパ／ラムダ））、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α−１マイクログロブリン）、デフェンシン（例えば、ベータ−デフェンシン１、好中球デフェンシン１、好中球デフェンシン２および好中球デフェンシン３）等が挙げられる。   Suitable proteins from blood include, for example, plasma proteins (eg, fibrin, α-2 macroglobulin, serum albumin, fibrinogen (eg, fibrinogen A, fibrinogen B), serum amyloid protein A, haptoglobin, profilin, ubiquitin, Uteroglobulin and beta-2-microglobulin), enzymes and enzyme inhibitors (eg plasminogen, lysozyme, cystatin C, alpha-1-antitrypsin and pancreatic trypsin inhibitor), proteins of the immune system, eg immunoglobulin proteins (Eg, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, immunoglobulin light chain (kappa / lambda)), transport protein (eg, retinol binding protein, α-1 microglobulin), diff Nshin (e.g., beta - defensin 1, neutrophil defensin 1, neutrophil defensin 2 and neutrophil defensin 3) and the like.

血液脳関門または神経組織で見出される適切なタンパク質としては、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体等が挙げられる。   Suitable proteins found at the blood brain barrier or neural tissue include, for example, melanocortin receptor, myelin, ascorbate transporter and the like.

in vivoでの血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、腎臓に限局されるタンパク質（例えば、ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン、有機陰イオン輸送体Ｋ１、ヘイマン抗原）、肝臓に限局されるタンパク質（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｇ２５０）、肺に限局されるタンパク質（例えば分泌成分。ＩｇＡに結合する）、心臓に限局されるタンパク質（例えばＨＳＰ２７。拡張心筋症と関連する）、皮膚に限局されるタンパク質（例えばケラチン）、骨特異的タンパク質、例えば形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（これは、骨形成活性を実証するタンパク質の形質転換増殖因子βスーパーファミリーのサブセットである（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８））、腫瘍特異的タンパク質（例えば、栄養芽細胞抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、カテプシンＢ。これは肝臓および脾臓中に見出され得る））も挙げられる。   Suitable polypeptides that increase serum half-life in vivo include proteins that are localized to the kidney (eg, polycystin, type IV collagen, organic anion transporter K1, Hayman antigen), proteins that are localized to the liver ( For example, alcohol dehydrogenase, G250), proteins restricted to the lung (eg secretory component; binds to IgA), proteins restricted to the heart (eg HSP27, associated with dilated cardiomyopathy), proteins restricted to the skin ( For example, keratin), bone-specific proteins such as morphogenic proteins (BMP) (which are a subset of the transforming growth factor β superfamily of proteins that demonstrate osteogenic activity (eg, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8)), tumor specific tag Park proteins (e.g., trophoblast antigen, herceptin receptor, estrogen receptor, cathepsins (e.g., cathepsins B. It can be found in liver and spleen)) may also be mentioned.

適切な疾患特異的タンパク質としては、例えば、活性化Ｔ細胞上でのみ発現される抗原、例えば、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ；Nature 402, 304-309 (1999)参照）、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体ファミリーの一成員。活性化Ｔ細胞上で発現され、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）産生細胞中で特異的に上方調節される；Immunol. 165(1): 263-70 (2000)参照）が挙げられる。適切な疾患特異的タンパク質としては、例えば、メタロプロテアーゼ（関節炎／癌と関連）、例えばＣＧ６５１２ショウジョウバエ、ヒト・パラプレジン、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、ネズミｆｔｓＨ；ならびに血管形成増殖因子、例えば、酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮細胞増殖因子／血管浸透性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦα）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、アンギオゲニン、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（Ｐ１ＧＦ）、ミドカイン血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）およびフラクタルカインも挙げられる。   Suitable disease-specific proteins include, for example, antigens expressed only on activated T cells, such as LAG-3 (lymphocyte activation gene), osteoprotegerin ligand (OPGL; Nature 402, 304-309 ( 1999)), OX40 (a member of the TNF receptor family, expressed on activated T cells and specifically upregulated in human T cell leukemia virus type I (HTLV-I) producing cells; Immunol. 165 (1): 263-70 (2000)). Suitable disease specific proteins include, for example, metalloproteases (associated with arthritis / cancer) such as CG6512 Drosophila, human parapresin, human FtsH, human AFG3L2, murine ftsH; and angiogenic growth factors such as acidic fibroblasts Growth factor (FGF-1), basic fibroblast growth factor (FGF-2), vascular endothelial growth factor / vascular permeability factor (VEGF / VPF), transforming growth factor-α (TGFα), tumor necrosis factor -Alpha (TNF-α), angiogenin, interleukin-3 (IL-3), interleukin-8 (IL-8), platelet derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF), placental growth factor (P1GF), Also included are midkine platelet derived growth factor-BB (PDGF) and fractalkine.

in vivoでの血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、ストレスタンパク質、例えば熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）も挙げられる。ＨＳＰは、細胞内に普通に見出される。それらが細胞外に見出される場合、それは、細胞が死んでおり、その内容物を外に出した、ということの指標である。このプログラムされない細胞死（壊死）は、外傷、疾患または損傷の結果として、細胞外ＨＳＰが免疫系からの応答を誘発した場合に起こる。細胞外ＨＳＰとの結合は、疾患部位への本発明の組成物の局在化を生じ得る。   Suitable polypeptides that increase serum half-life in vivo also include stress proteins such as heat shock proteins (HSPs). HSP is commonly found in cells. If they are found extracellularly, it is an indication that the cells are dead and have moved their contents out. This unprogrammed cell death (necrosis) occurs when extracellular HSP elicits a response from the immune system as a result of trauma, disease or injury. Binding to extracellular HSP can result in localization of the composition of the invention to the disease site.

Ｆｃ輸送に関与する適切なタンパク質としては、例えば、ブラムベル受容体（ＦｃＲＢとしても知られている）が挙げられる。このＦｃ受容体は２つの機能を有し、この両方が送達のために潜在的に有用である。この機能は、（１）胎盤を横断する母親から子供へのＩｇＧの輸送、（２）ＩｇＧを分解から防護し、それによりその血清半減期を延長することである。受容体はエンドソームからＩｇＧを再循環させる、と考えられる（Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7): 632-6 (1997)参照）。   Suitable proteins involved in Fc transport include, for example, Brambell receptor (also known as FcRB). This Fc receptor has two functions, both of which are potentially useful for delivery. This function is (1) transport of IgG from mother to child across the placenta, and (2) protect IgG from degradation, thereby extending its serum half-life. The receptor is thought to recycle IgG from the endosome (see Holliger et al, Nat Biotechnol 15 (7): 632-6 (1997)).

血清アルブミンに結合するｄＡｂ
本発明は、一実施形態において、眼標的分子、例えばＶＥＧＦ、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αと結合する第一ｄＡｂ、ならびに血清アルブミン（ＳＡ）に結合する第二ｄＡｂを提供し、上記の第二ｄＡｂは、表面プラズモン共鳴により確定した場合に、１ｎＭ〜１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、３００、４００または５００μＭ（すなわち、×１０−９〜５×１０−４）、または１００ｎＭ〜１０μＭ、または１〜５μＭ、または３〜７０ｎＭまたは１０ｎＭ〜１、２、３、４または５μＭ、例えば３０〜７０ｎＭ（表面プラズモン共鳴により確定した場合）のＫＤで、ＳＡに結合する。一実施形態では、第一ｄＡｂ（またはｄＡｂ単量体）は、表面プラズモン共鳴により確定した場合、約１、５０、７０、１００、１５０、２００、３００ｎＭ、あるいは１、２または３μＭのＫＤで、ＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。一実施形態では、第一抗ＳＡ ｄＡｂおよびＶＥＧＦに対する第二ｄＡｂを含む二重特異性リガンドに関して、その標的に対する第二ｄＡｂの親和性（例えば、ＢｉａＣｏｒｅを用いて、表面プラズモン共鳴により測定した場合のＫＤおよび／またはＫoff）は、ＳＡに対する第一ｄＡｂの親和性の１〜１０００００倍（例えば、１００〜１０００００、または１０００〜１０００００、または１００００〜１０００００倍）である。一実施形態では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。例えば、第一ｄＡｂは約１０μＭの親和性でＳＡに結合するが、一方、第二ｄＡｂは１００ｐＭの親和性でその標的に結合する。一実施形態では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。一実施形態では、第一ｄＡｂは、約５０、例えば７０、１００、１５０または２００ｎＭのＫＤでＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。二重特異性リガンドの詳細は、ＷＯ０３００２６０９、ＷＯ０４００３０１９およびＷＯ０４０５８８２１に見出される。 DAbs that bind to serum albumin
The present invention provides, in one embodiment, a first dAb that binds to an eye target molecule, such as VEGF, IL-1 or TNF-α, and a second dAb that binds serum albumin (SA), wherein dAb, as determined by surface plasmon resonance, is 1 nM to 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 or 500 μM (ie, × 10 −9 to 5 × 10 −4 ), or 100 nM to 10 μM, or 1 to 5 μM, or 3 to 70 nM or 10 nM to 1, 2, 3, 4 or 5 μM, for example 30 to 70 nM (determined by surface plasmon resonance) with a K D of cases), it binds to SA. In one embodiment, the first dAb (or a dAb monomer) binds, when determined by surface plasmon resonance, about 1,50,70,100,150,200,300nM or 1,2 or 3μM of K D, , Binds to SA (eg HSA). In one embodiment, for a bispecific ligand comprising a first anti-SA dAb and a second dAb for VEGF, the affinity of the second dAb for its target (eg, as measured by surface plasmon resonance using BiaCore) K D and / or K off ) is 1 to 100,000 times the affinity of the first dAb for SA (eg, 100 to 100,000, or 1000 to 100,000, or 10,000 to 100,000). In one embodiment, the serum albumin is human serum albumin (HSA). For example, the first dAb binds to SA with an affinity of about 10 μM, while the second dAb binds to its target with an affinity of 100 pM. In one embodiment, the serum albumin is human serum albumin (HSA). In one embodiment, the first dAb binds to about 50, for example, 70,100,150 or 200nM a K D in SA (eg, HSA). Details of bispecific ligands are found in WO0302609, WO04003019 and WO0405821.

本発明のｄＡｂは、一実施形態では、表面プラズモン共鳴により確定した場合に、１ｎＭ〜１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、３００、４００または５００μＭ（すなわち、×１０−９〜５×１０−４）、または１００ｎＭ〜１０μＭ、または１〜５μＭ、または３〜７０ｎＭまたは１０ｎＭ〜１、２、３、４または５μＭ、例えば３０〜７０ｎＭ（表面プラズモン共鳴により確定した場合）のＫＤで、血清アルブミン（ＳＡ）に結合するｄＡｂを含み得る。一実施形態では、第一ｄＡｂ（またはｄＡｂ単量体）は、表面プラズモン共鳴により確定した場合、約１、５０、７０、１００、１５０、２００、３００ｎＭ、あるいは１、２または３μＭのＫＤで、ＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。一実施形態では、第一および第二ｄＡｂは、リンカー、例えば１〜４アミノ酸、または１〜３アミノ酸、あるいは３より多くのアミノ酸、あるいは４より多い、５より多い、６より多い、７より多い、８より多い、９より多い、１０より多い、１５より多いまたは２０より多いアミノ酸を有するリンカーにより連結される。一実施形態では、より長いリンカー（３アミノ酸より長い）を用いて、効力（アンタゴニスト中のｄＡｂの一方または両方のＫＤ）を増強する。 The dAbs of the present invention, in one embodiment, are determined from 1 nM to 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, as determined by surface plasmon resonance. 300, 400 or 500 μM (ie, x10 −9 to 5 × 10 −4 ), or 100 nM to 10 μM, or 1 to 5 μM, or 3 to 70 nM or 10 nM to 1, 2, 3, 4 or 5 μM, for example 30 to with a K D of 70 nM (when determined by surface plasmon resonance) may include dAb that binds serum albumin (SA). In one embodiment, the first dAb (or a dAb monomer) binds, when determined by surface plasmon resonance, about 1,50,70,100,150,200,300nM or 1,2 or 3μM of K D, , Binds to SA (eg HSA). In one embodiment, the first and second dAbs are linkers, such as 1-4 amino acids, or 1-3 amino acids, or more than 3, or more than 4, more than 5, more than 6, more than 7, Linked by a linker having more than 8, more than 9, more than 10, more than 15 or more than 20 amino acids. In one embodiment, a longer linker (longer than 3 amino acids) is used to enhance potency (K D of one or both of the dAbs in the antagonist).

特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、アルブミンとの結合に関して、以下からなる群から選択されるｄＡｂと競合する：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６（これらの配列の開示に関してはＷＯ０４００３０１９参照（配列およびそれらの核酸相手は参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する））、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（これらの配列の開示に関しては、ＷＯ２００７０８０３９２参照。これらの配列およびそれらの核酸相手は参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する。この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）、ｄＡｂ １０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０（ＤＯＭ７ｒ２０）、ｄＡｂ７ｒ２１（ＤＯＭ７ｒ２１）、ｄＡｂ７ｒ２２（ＤＯＭ７ｒ２２）、ｄＡｂ７ｒ２３（ＤＯＭ７ｒ２３）、ｄＡｂ７ｒ２４（ＤＯＭ７ｒ２４）、ｄＡｂ７ｒ２５（ＤＯＭ７ｒ２５）、ｄＡｂ７ｒ２６（ＤＯＭ７ｒ２６）、ｄＡｂ７ｒ２７（ＤＯＭ７ｒ２７）、ｄＡｂ７ｒ２８（ＤＯＭ７ｒ２８）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ３１（ＤＯＭ７ｒ３１）、ｄＡｂ７ｒ３２（ＤＯＭ７ｒ３２）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｈ２２（ＤＯＭ７ｈ２２）、ｄＡｂ７ｈ２３（ＤＯＭ７ｈ２３）、ｄＡｂ７ｈ２４（ＤＯＭ７ｈ２４）、ｄＡｂ７ｈ２５（ＤＯＭ７ｈ２５）、ｄＡｂ７ｈ２６（ＤＯＭ７ｈ２６）、ｄＡｂ７ｈ２７（ＤＯＭ７ｈ２７）、ｄＡｂ７ｈ３０（ＤＯＭ７ｈ３０）、ｄＡｂ７ｈ３１（ＤＯＭ７ｈ３１）、ｄＡｂ２（ｄＡｂｓ ４、７、４１）、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２（ｄＡｂ７ｍ１２）、ｄＡｂ１３（ｄＡｂ １５）、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６（ｄＡｂ２１、ｄＡｂ７ｍ１６）、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５（ｄＡｂ２６、ｄＡｂ７ｍ２６）、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０（ｄＡｂ３５）、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８（ｄＡｂ５４）、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６（ｄＡｂｓ ４７、５２および５６）、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１（ＤＯＭ ７ｒ１）、ｄＡｂ７ｒ３（ＤＯＭ７ｒ３）、ｄＡｂ７ｒ４（ＤＯＭ７ｒ４）、ｄＡｂ７ｒ５（ＤＯＭ７ｒ５）、ｄＡｂ７ｒ７（ＤＯＭ７ｒ７）、ｄＡｂ７ｒ８（ＤＯＭ７ｒ８）、ｄＡｂ７ｒ１３（ＤＯＭ７ｒ１３）、ｄＡｂ７ｒ１４（ＤＯＭ７ｒ１４）、ｄＡｂ７ｒ１５（ＤＯＭ７ｒ１５）、ｄＡｂ７ｒ１６（ＤＯＭ７ｒ１６）、ｄＡｂ７ｒ１７（ＤＯＭ７ｒ１７）、ｄＡｂ７ｒ１８（ＤＯＭ７ｒ１８）、ｄＡｂ７ｒ１９（ＤＯＭ７ｒ１９）、ｄＡｂ７ｈ１（ＤＯＭ７ｈ１）、ｄＡｂ７ｈ２（ＤＯＭ７ｈ２）、ｄＡｂ７ｈ６（ＤＯＭ７ｈ６）、ｄＡｂ７ｈ７（ＤＯＭ７ｈ７）、ｄＡｂ７ｈ８（ＤＯＭ７ｈ８）、ｄＡｂ７ｈ９（ＤＯＭ７ｈ９）、ｄＡｂ７ｈ１０（ＤＯＭ７ｈ１０）、ｄＡｂ７ｈ１１（ＤＯＭ７ｈ１１）、ｄＡｂ７ｈ１２（ＤＯＭ７ｈ１２）、ｄＡｂ７ｈ１３（ＤＯＭ７ｈ１３）、ｄＡｂ７ｈ１４（ＤＯＭ７ｈ１４）、ｄＡｂ７ｐ１（ＤＯＭ７ｐ１）およびｄＡｂ７ｐ２（ＤＯＭ７ｐ２）（２００８年２月８日に出願され、これらの配列の開示に関してＷＯ ２００８／０９６１５８として公開されたＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００４５３を参照。これらの配列およびそれらの核酸相手は参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する）。代替的名称は、ｄＡｂの後の括弧内に示されており、例えばｄＡｂ８はｄＡｂ１０である代替的名称を有し、すなわちｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）である。 In certain embodiments, the dAb binds to human serum albumin and competes for binding to albumin with a dAb selected from the group consisting of:
MSA-16, MSA-26 (see WO04003019 for the disclosure of these sequences (sequences and their nucleic acid partners are hereby incorporated by reference and form part of the disclosure herein)),
DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-1 (SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (sequence) 478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h -4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 489) 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (sequence) DOM), DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503), DOM7r -20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 508) 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 11), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7r- 33 (SEQ ID NO: 517) (For disclosure of these sequences, see WO2007080392. These sequences and their nucleic acid partners are hereby incorporated by reference and form part of the disclosure of this text. SEQ ID NOs are those appearing in WO2007080392),
dAb8 (dAb10), dAb 10, dAb36, dAb7r20 (DOM7r20), dAb7r21 (DOM7r21), dAb7r22 (DOM7r22), dAb7r23 (DOM7r23), dAb7r24 (DOM7r24), dAb7r24 (DOM7r24) dAb7r28 (DOM7r28), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r31 (DOM7r31), dAb7r32 (DOM7r32), dAb7r33 (DOM7h33), dAb7h33 (DOM7h33) dAb 7h25 (DOM7h25), dAb7h26 (DOM7h26), dAb7h27 (DOM7h27), dAb7h30 (DOM7h30), dAb7h31 (DOM7h31), dAb2 (dAbs 4, 7, 41), dAb4, d12, A12, dAb7, d11b ), DAb15, dAb16 (dAb21, dAb7m16), dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 (dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30 (dAb35), dAb35, dAb35, dAb35, dAb35 ), DAb41, dAb46 (dAbs 47, 52 and 56), dAb47, dAb52, dAb 3, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1 (DOM 7r1), dAb7r3 (DOM7r3), dAb7r4 (DOM7r4), dAb7r5 (DOM7r5), DOM7r5 dAb7r14 (DOM7r14), dAb7r15 (DOM7r15), dAb7r16 (DOM7r16), dAb7r17 (DOM7r17), dAb7r18 (DOM7r18), dAb7r19 (DOM7h19), dAb7h2 (d7b7h1) dAb7h8 (DOM7h8), dAb7 9 (DOM7h9), dAb7h10 (DOM7h10), dAb7h11 (DOM7h11), dAb7h12 (DOM7h12), dAb7h13 (DOM7h13), dAb7h14 (DOM7h14), dAb7p1 (DOM7p1) and dAb7p1) See PCT / GB2008 / 000453 published as WO 2008/096158 for disclosure of these sequences. These sequences and their nucleic acid partners are incorporated herein by reference and form part of the disclosure herein). An alternative name is shown in parentheses after dAb, for example dAb8 has an alternative name that is dAb10, ie dAb8 (dAb10).

ある実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ １０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０、ｄＡｂ７ｒ２１、ｄＡｂ７ｒ２２、ｄＡｂ７ｒ２３、ｄＡｂ７ｒ２４、ｄＡｂ７ｒ２５、ｄＡｂ７ｒ２６、ｄＡｂ７ｒ２７、ｄＡｂ７ｒ２８、ｄＡｂ７ｒ２９、ｄＡｂ７ｒ３０、ｄＡｂ７ｒ３１、ｄＡｂ７ｒ３２、ｄＡｂ７ｒ３３、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、ｄＡｂ７ｈ２４、ｄＡｂ７ｈ２５、ｄＡｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１、ｄＡｂ７ｒ３、ｄＡｂ７ｒ４、ｄＡｂ７ｒ５、ｄＡｂ７ｒ７、ｄＡｂ７ｒ８、ｄＡｂ７ｒ１３、ｄＡｂ７ｒ１４、ｄＡｂ７ｒ１５、ｄＡｂ７ｒ１６、ｄＡｂ７ｒ１７、ｄＡｂ７ｒ１８、ｄＡｂ７ｒ１９、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、ｄＡｂ７ｈ１４、ｄＡｂ７ｐ１およびｄＡｂ７ｐ２。 In certain embodiments, the dAb binds to human serum albumin and has an amino acid sequence of a dAb selected from the group consisting of: at least about 80%, or at least about 85%, or at least about 90%, or at least about 95%. Or an amino acid sequence having at least about 96%, or at least about 97%, or at least about 98%, or at least about 99% amino acid sequence identity:
MSA-16, MSA-26,
DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-1 (SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (sequence) 478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h -4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 489) 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (sequence) DOM), DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503), DOM7r -20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 508) 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 11), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7r- 33 (SEQ ID NO: 517) (the SEQ ID NO in this paragraph is the one that appeared in WO2007080392),
dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, dAb7h24, dAb7h25, dAb7h26, dAb7h27, dAb7h30 , DAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb25, dAb26, dAb 35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p2 and dAb7p2.

例えば、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂは、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ １０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、ｄＡｂ７ｈ２４、ｄＡｂ７ｈ２５、ｄＡｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４
と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。 For example, dAbs that bind to human serum albumin are DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1. (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489) , DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 ( SEQ ID NO: 495) (SEQ ID NO: in this paragraph appears in WO2007080392) Those were),
dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, dAb7h24, dAb7h25, dAb7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, d11b , DAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54h, dAb55, dAb56h , DAb7h10, dAb7h 11, dAb7h12, dAb7h13 and dAb7h14
And an amino acid sequence having at least about 90%, or at least about 95%, or at least about 96%, or at least about 97%, or at least about 98%, or at least about 99% amino acid sequence identity.

ある実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、ｄＡｂ７ｈ２４、ｄＡｂ７ｈ２５、ｄＡｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４。 In certain embodiments, the dAb binds to human serum albumin and has an amino acid sequence of a dAb selected from the group consisting of: at least about 80%, or at least about 85%, or at least about 90%, or at least about 95%. Or an amino acid sequence having at least about 96%, or at least about 97%, or at least about 98%, or at least about 99% amino acid sequence identity:
DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7h-22 (sequence) No. 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h -27 (SEQ ID NO: 495) (SEQ ID NO: in this paragraph is what appeared in WO2007080392),
dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, dAb7h24, dAb7h25, dAb7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 and dAb7h14.

さらに特定の実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶκｄＡｂである：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４。 In a more specific embodiment, the dAb is a V κ dAb that binds to human serum albumin and has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496) (SEQ ID NO: 496 in this paragraph) Is what appeared in WO2007080392),
dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h13, dAbh7

さらに特定の実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、ｄＡｂ７ｈ３０およびｄＡｂ７ｈ３１から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨｄＡｂである。 In a more specific embodiment, the dAb is a V H dAb that binds to human serum albumin and has an amino acid sequence selected from dAb7h30 and dAb7h31.

さらに特定の実施形態では、ｄＡｂはｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４である。   In a more specific embodiment, the dAb is dAb7h11 or dAb7h14.

他の実施形態では、ｄＡｂ、リガンドまたはアンタゴニストは、ヒト血清アルブミンに結合し、前記のアミノ酸配列のいずれかのＣＤＲのうちの１、２または３つ、例えばｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４のＣＤＲのうちの１、２または３つを含む。   In other embodiments, the dAb, ligand or antagonist binds to human serum albumin and is one, two or three of the CDRs of any of the foregoing amino acid sequences, eg, one of the CDRs of dAb7h11 or dAb7h14, Includes two or three.

血清アルブミンに結合する適切なラクダ類ＶＨＨとしては、ＷＯ ２００４／０４１８６２（Ablynx N.V.）に、ならびにＷＯ２００７０８０３９２（このＶＨＨ配列およびそれらの核酸相手は、参照により本明細書中に組み入れられ、そして本文の開示の一部を構成する）に開示されたもの、例えば、配列Ａ（配列番号５１８）、配列Ｂ（配列番号５１９）、配列Ｃ（配列番号５２０）、配列Ｄ（配列番号５２１）、配列Ｅ（配列番号５２２）、配列Ｆ（配列番号５２３）、配列Ｇ（配列番号５２４）、配列Ｈ（配列番号５２５）、配列Ｉ（配列番号５２６）、配列Ｊ（配列番号５２７）、配列Ｋ（配列番号５２８）、配列Ｌ（配列番号５２９）、配列Ｍ（配列番号５３０）、配列Ｎ（配列番号５３１）、配列Ｏ（配列番号５３２）、配列Ｐ（配列番号５３３）、配列Ｑ（配列番号５３４）が挙げられ、これらの配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ ２００４／０４１８６２（Ablynx N.V.）に列挙されたものと対応する。ある実施形態では、ラクダ類ＶＨＨは、ヒト血清アルブミンに結合し、ＷＯ２００７０８０３９２に開示されたＡＬＢ１と、または配列番号５１８〜５３４（これらの配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ ２００４／０４１８６２に列挙されたものと対応する）のいずれか１つと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。 Suitable camelids V HH that bind to serum albumin include WO 2004/041862 (Ablynx NV), and WO 2007080392, whose V HH sequences and their nucleic acid partners are incorporated herein by reference and are For example, sequence A (SEQ ID NO: 518), sequence B (SEQ ID NO: 519), sequence C (SEQ ID NO: 520), sequence D (SEQ ID NO: 521), sequence E (SEQ ID NO: 522), F (SEQ ID NO: 523), G (SEQ ID NO: 524), H (SEQ ID NO: 525), I (SEQ ID NO: 526), J (SEQ ID NO: 527), K ( SEQ ID NO: 528), L (SEQ ID NO: 529), M (SEQ ID NO: 530), N (SEQ ID NO: 531), O (SEQ ID NO: 532), P (arrangement) No. 533), sequence Q (SEQ ID NO: 534). These sequences numbers corresponding to those listed in WO2007080392 or WO 2004/041862 (Ablynx NV). In certain embodiments, the camelids V HH bind to human serum albumin and may be combined with ALB1 disclosed in WO2007080392, or SEQ ID NOs: 518-534 (these SEQ ID NOs are those listed in WO2007080392 or WO 2004/041862). And at least about 80%, or at least about 85%, or at least about 90%, or at least about 95%, or at least about 96%, or at least about 97%, or at least about 98%. Or an amino acid sequence having at least about 99% amino acid sequence identity.

いくつかの実施形態では、ｄＡｂ組成物は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）との結合に関して本明細書中に開示される任意の抗血清アルブミンｄＡｂと競合する抗血清アルブミンｄＡｂを含む。   In some embodiments, the dAb composition comprises an anti-serum albumin dAb that competes with any anti-serum albumin dAb disclosed herein for binding to serum albumin (eg, human serum albumin).

半減期延長部分（例えばアルブミン）との接合
一実施形態では、（１つ以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにその断片および類似体）は、ＶＥＧＦ結合（またはＩＬ−１またはＴＮＦ−α結合、あるいはＴＮＦ−αＲ結合）ｄＡｂと接合されるかまたは会合される。ＶＥＧＦ（またはＩＬ−１、あるいはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αＲ）結合フォーマットに用いるための適切なアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体の例は、ＷＯ ２００５０７７０４２（この開示内容は参照により本明細書中に組み入れられて、本文の開示の一部を構成する）に記載されている。特に、以下のアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体が、本発明に用いられ得る：
・配列番号１（ＷＯ ２００５０７７０４２に開示。この配列は、参照により本開示中に明白に組み入れられる）；
・ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸１〜３８７を含むかまたはそれからなるアルブミン断片または変異体；
・（ａ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸５４〜６１；（ｂ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸７６〜８９；（ｃ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸９２〜ｌ００；（ｄ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸１７０〜１７６；（ｅ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸２４７〜２５２；（ｆ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸２６６〜２７７；（ｇ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸２８０〜２８８；（ｈ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸３６２〜３６８；（ｉ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸４３９〜４４７；（ｊ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸４６２〜４７５；（ｋ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸４７８〜４８６；および（ｌ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸５６０〜５６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアルブミンあるいはその断片または変異体。 Conjugation with a half-life extending moiety (eg, albumin) In one embodiment, the (one or more) half-life extending moieties (eg, albumin, transferrin and fragments and analogs thereof) are bound to VEGF binding (or IL-1 or TNF). -Α bond, or TNF-αR bond) joined or associated with dAb. Examples of suitable albumins, albumin fragments or albumin variants for use in VEGF (or IL-1, or TNF-α or TNF-αR) binding formats are described in WO 2005077042 (the disclosure of which is incorporated herein by reference). Which is incorporated by reference and constitutes part of the disclosure herein. In particular, the following albumins, albumin fragments or albumin variants may be used in the present invention:
SEQ ID NO: 1 (disclosed in WO 2005077042; this sequence is expressly incorporated into this disclosure by reference);
An albumin fragment or variant comprising or consisting of amino acids 1 to 387 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042;
(A) amino acids 54-61 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042; (b) amino acids 76-89 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042; (c) amino acids 92-l00 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042; (d) WO (E) amino acids 247 to 252 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042; (f) amino acids 266 to 277 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042; (g) SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042 (H) amino acids 362 to 368 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042; (i) amino acids 439 to 447 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042; ) Selected from the group consisting of amino acids 462 to 475 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042; (k) amino acids 478 to 486 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042; and (l) amino acids 560 to 566 of SEQ ID NO: 1 in WO 2005077042. Albumin containing an amino acid sequence or a fragment or variant thereof.

ＶＥＧＦ結合フォーマットに用いるための適切なアルブミン、断片および類似体のさらなる例は、ＷＯ ０３０７６５６７（この開示内容は参照により本明細書中に組み入れられて、本文の開示の一部を構成する）に記載されている。特に、以下のアルブミン、断片または変異体が本発明に用いられ得る：
・ＷＯ ０３０７６５６７に、例えば図３に記載されているようなヒト血清アルブミン（この配列情報は、参照により本開示中に明白に組み入れられる）；
・６６，５００の式分子量を有する５８５アミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖からなるヒト血清アルブミン（ＨＡ）（Meloun, et al., FEBS Letters 58: 136 (1975)；Behrens, et al., Fed. Proc. 34: 591 (1975)；Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9: 6102-6114 (1981)；Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261: 6747 (1986)参照）；
・Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37: 219 (1973)に記載されたようなアルブミンの多型性変異体または類似体または断片；
・ＥＰ ３２２０９４に記載されたようなアルブミン断片または変異体、例えばＨＡ（１〜３７３）、ＨＡ（１〜３８８）、ＨＡ（１〜３８９）、ＨＡ（１〜３６９）およびＨＡ（１〜４１９）ならびに１〜３６９および１〜４１９間の断片；
・ＥＰ ３９９６６６に記載されたようなアルブミン断片または変異体、例えばＨＡ（１〜１７７）およびＨＡ（１〜２００）ならびにＨＡ（１〜Ｘ）間の断片（ここで、Ｘは１７８から１９９までの任意の数である）。 Additional examples of suitable albumins, fragments and analogs for use in the VEGF binding format are described in WO 03076567, the disclosure of which is hereby incorporated by reference and forms part of the present disclosure. Has been. In particular, the following albumins, fragments or variants may be used in the present invention:
• Human serum albumin as described, for example, in FIG. 3, in WO 03076567 (this sequence information is expressly incorporated into the present disclosure by reference);
Human serum albumin (HA) consisting of a single 585 amino acid glycosylated polypeptide chain with a formula molecular weight of 66,500 (Meloun, et al., FEBS Letters 58: 136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34: 591 (1975); see Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9: 6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261: 6747 (1986));
A polymorphic variant or analogue or fragment of albumin as described in Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37: 219 (1973);
Albumin fragments or variants as described in EP 322094, for example HA (1-373), HA (1-388), HA (1-389), HA (1-369) and HA (1-419) And a fragment between 1-369 and 1-419;
-Albumin fragments or variants as described in EP 399666, eg fragments between HA (1-177) and HA (1-200) and HA (1-X), where X is from 178 to 199 Any number).

（１つ以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにその断片および類似体）が本発明のｄＡｂをフォーマットするために用いられる場合、それは、任意の適切な方法を用いて、例えば直接融合により、例えば融合タンパク質をコードする単一ヌクレオチド構築物を用いることにより（ここで、上記融合タンパク質は、ｄＡｂに対してＮ−またはＣ−末端に位置する半減期延長部分を有する単一ポリペプチド鎖としてコードされる）、接合され得る。代替的には、接合は、部分間にペプチドリンカー、例えばＷＯ ０３０７６５６７またはＷＯ ２００４００３０１９に記載されたようなペプチドリンカー（これらのリンカー開示は、参照により本発明の開示中に組み入れられて、本発明に用いるための例を提供する）を用いることにより、達成され得る。典型的には、in vivoで血清半減期を拡大するポリペプチドは、in vivoで天然に生じる、そして生物体（例えばヒト）から望ましくない物質を除去する内因性機序による分解または除去を阻止するポリペプチドである。例えば、in vivoで血清半減期を拡大するポリペプチドは、細胞外マトリックスからのタンパク質、血中に見出されるタンパク質、血液脳関門に、または神経組織中に見出されるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚または骨に限局されるタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、あるいはＦｃ輸送に関与するタンパク質から選択され得る。   When (one or more) half-life extending moieties (eg, albumin, transferrin and fragments and analogs thereof) are used to format a dAb of the invention, it can be obtained using any suitable method, for example directly By fusion, for example by using a single nucleotide construct encoding the fusion protein (wherein the fusion protein is a single polypeptide chain having a half-life extending moiety located at the N- or C-terminus relative to the dAb. Can be joined). Alternatively, the conjugation is a peptide linker between the moieties, such as peptide linkers as described in WO03076567 or WO 200403019 (the disclosure of these linkers is incorporated into the disclosure of the present invention by reference and incorporated herein) Can be achieved by using (provides examples for use). Typically, polypeptides that increase serum half-life in vivo prevent degradation or removal by endogenous mechanisms that naturally occur in vivo and remove unwanted substances from organisms (eg, humans) It is a polypeptide. For example, polypeptides that increase serum half-life in vivo include proteins from the extracellular matrix, proteins found in blood, proteins found in the blood brain barrier, or in neural tissue, kidney, liver, lung, heart May be selected from proteins restricted to the skin or bone, stress proteins, disease-specific proteins, or proteins involved in Fc transport.

本発明のｄＡｂは、第二免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第一免疫グロブリン単一可変ドメインを含有する融合タンパク質としてフォーマットされ得る。所望により、このようなフォーマットは、半減期延長部分をさらに含み得る。例えば、リガンドは、血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第二免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第一免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る。   The dAbs of the invention can be formatted as a fusion protein containing a first immunoglobulin single variable domain that is directly fused to a second immunoglobulin single variable domain. If desired, such a format can further include a half-life extending moiety. For example, the ligand can comprise a first immunoglobulin single variable domain that is fused directly to a second immunoglobulin single variable domain that is fused directly to an immunoglobulin single variable domain that binds serum albumin.

一般的に、標的に対する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインの配向は、リガンドがリンカーを含んでいてもいなくても、設計選択の問題である。しかしながら、いくつかの配向は、リンカーがあってもなくても、他の配向より良好な結合特性を提供する。全ての配向（例えば、ｄＡｂ１−リンカー−ｄＡｂ２；ｄＡｂ２−リンカー−ｄＡｂ１）が本発明に包含され、所望の結合特性を提供する配向を含有するリガンドは、スクリーニングにより容易に同定され得る。   In general, the orientation of a polypeptide domain with a binding site that has binding specificity for a target is a matter of design choice, whether or not the ligand includes a linker. However, some orientations provide better binding properties than others with or without a linker. All orientations (eg, dAb1-linker-dAb2; dAb2-linker-dAb1) are encompassed by the present invention, and ligands containing orientations that provide the desired binding properties can be readily identified by screening.

本発明によるｄＡｂは、ｄＡｂ単量体、二量体および三量体を含めて、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一方または両方と、任意にヒンジ領域を含む抗体Ｆｃ領域と連結され得る。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域に連結されるリガンドをコードするベクターを用いて、このようなポリペプチドを調製し得る。 A dAb according to the present invention can be linked to one or both of the C H 2 and C H 3 domains, including dAb monomers, dimers and trimers, and optionally to an antibody Fc region comprising a hinge region. For example, such a polypeptide can be prepared using a vector encoding a ligand linked to the Fc region as a single nucleotide sequence.

本発明の実施形態において、ｄＡｂは、例えば、ＷＯ２００８１４９１４７に記載されたようなメタノール資化酵母または大腸菌Ｅ．Ｇ．による発現に関して最適化されたコドン最適化ヌクレオチド配列によりコードされ得る。   In an embodiment of the present invention, the dAb is a methanol-utilizing yeast or E. coli E. coli as described, for example, in WO2008149147. G. Can be encoded by a codon optimized nucleotide sequence optimized for expression by.

ウサギの眼へのＤＯＭ１５−２６−５９３（ｍｙｃタグ化抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ）の局所的送達：
ＤＯＭ−１５−２６−５９３は、ＷＯ２００８１４９１４７に記載されたように選択され、調製され得るし、図１ａに示したアミノ酸配列（配列番号１）を有する。 Topical delivery of DOM15-26-593 (myc-tagged anti-VEGF dAb) to the rabbit eye:
DOM-15-26-593 can be selected and prepared as described in WO2008149147 and has the amino acid sequence shown in FIG. 1a (SEQ ID NO: 1).

ｍｙｃタグ化ＤＯＭ１５−２６−５９３（図１ａに示したアミノ酸配列（配列番号１）を有するＤｏｍ１５−２６−５９３ ｄＡｂを調製し、ｃ−ｍｙｃタグ化抗ＶＥＧＦ ｄＡｂとしてこの実験に用いた）を、１０４ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）トゥイーン８０、０．５％（ｗ／ｖ）カプリン酸ナトリウム、ならびに０．３％または１．５％（ｗ／ｖ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を補足した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に製剤化された２ｍｇ／ｍｌの濃度の内毒素無含有調製物として調製した。成体のチンチラバスタード・ウサギを、Charles River(Germany)から入手した。使用前に、動物を馴化させた。６匹の雌ウサギの左眼に、４時間の期間に亘って２０分毎に、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂの２ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌを投与した。各投与は、結膜嚢下に入れた。３匹には０．３％ＨＰＭＣ中に製剤化した抗ＶＥＧＦ ｄＡｂを投与し、３匹には１．５％ＨＰＭＣ中に製剤化した薬剤を用いた。最終投与の２時間後に、動物を屠殺した。安楽死が確証された時から出来るだけ近い時点で、各動物から両眼を摘出した。各眼をＰＢＳ中で洗浄して、過剰量の薬剤をその表面から除去した。眼房水および硝子体液の試料を収集し、分析前に凍結保存した（−２０℃）。サンドイッチＥＬＩＳＡ検定を用いて、存在するＤＯＭ１５−２６−５９３（抗ＶＥＧＦ−ｄＡｂ）の濃度に関して、眼房水および硝子体液の試料を試験した。この場合、ｄＡｂを組換えヒトＶＥＧＦタンパク質被覆プレート上に捕捉し、ｃ−ｍｙｃタグに関して特異性を有する抗体を用いて検出した。   myc-tagged DOM15-26-593 (prepared Dom15-26-593 dAb having the amino acid sequence shown in FIG. 1a (SEQ ID NO: 1) and used in this experiment as c-myc-tagged anti-VEGF dAb), 104 mM sodium chloride, 0.02% (w / v) Tween 80, 0.5% (w / v) sodium caprate, and 0.3% or 1.5% (w / v) hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) Was prepared as an endotoxin-free preparation at a concentration of 2 mg / ml formulated in 50 mM sodium acetate buffer (pH 7.0) supplemented with Adult chinchilla bust rabbits were obtained from Charles River (Germany). Animals were acclimated prior to use. The left eye of 6 female rabbits was administered 50 μl of a 2 mg / ml solution of anti-VEGF dAb every 20 minutes for a period of 4 hours. Each dose was placed under the conjunctival sac. Three animals received an anti-VEGF dAb formulated in 0.3% HPMC and 3 animals used a drug formulated in 1.5% HPMC. The animals were sacrificed 2 hours after the last dose. Both eyes were removed from each animal as close as possible from when euthanasia was confirmed. Each eye was washed in PBS to remove excess drug from its surface. Samples of aqueous humor and vitreous humor were collected and stored frozen (−20 ° C.) prior to analysis. Samples of aqueous humor and vitreous humor were tested for the concentration of DOM15-26-593 (anti-VEGF-dAb) present using a sandwich ELISA assay. In this case, dAbs were captured on recombinant human VEGF protein-coated plates and detected using antibodies with specificity for the c-myc tag.

上記のＶＥＧＦ ｄＡｂＥＬＩＳＡは、以下のように実施した：
本検定は、ＶＥＧＦ ｄＡｂを捕捉するために、Immunsorbプレート（Nuncから入手）の表面に被覆される組換えヒトＶＥＧＦ（ｒＶＥＧＦ、R&D Systemsから入手）を用いる。プレートを洗浄して、任意の非結合ｄＡｂを除去した。その後、ＶＥＧＦ ｄａｂのＭｙｃタグに対する抗体（Sigmaから入手）を用いて、結合ｄＡｂを検出した。過剰量の抗体を洗浄により除去し、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ接合体（Sigma）を用いて結合抗ｍｙｃ抗体を検出した。ＴＭＢ溶液を用いて検定を発現させ、酸を用いて停止した。検定からのシグナルは、ｄＡｂの量と比例する。検定における段階を以下に要約する：
プレートの被覆：
１．十分量のｒＶＥＧＦを０．２５μｇ／ｍｌで調製して、プレートを被覆した（各ＥＬＩＳＡプレートに関して５ｍｌ）。これを、各プレートに関して、ストックＶＥＧＦ２５μＬを５ｍＬの炭酸塩コーティング緩衝液（０．２Ｍ炭酸−重炭酸ナトリウムコーティング緩衝液、ｐＨ９．４（Pierce、カタログ番号２８３８２））に添加し、転倒混合することによって実行した。 The above VEGF dAb ELISA was performed as follows:
This assay uses recombinant human VEGF (rVEGF, obtained from R & D Systems) coated on the surface of an Immunosorb plate (obtained from Nunc) to capture the VEGF dAb. The plate was washed to remove any unbound dAb. The bound dAb was then detected using an antibody against the Myc tag of VEGF dab (obtained from Sigma). Excess antibody was removed by washing and bound anti-myc antibody was detected using anti-mouse IgG peroxidase conjugate (Sigma). The assay was developed with TMB solution and stopped with acid. The signal from the assay is proportional to the amount of dAb. The steps in the test are summarized below:
Plate coating:
1. A sufficient amount of rVEGF was prepared at 0.25 μg / ml to coat the plate (5 ml for each ELISA plate). For each plate, add 25 μL of stock VEGF to 5 mL of carbonate coating buffer (0.2 M carbonate-sodium bicarbonate coating buffer, pH 9.4 (Pierce, catalog number 28382)) and mix by inversion. Executed.

２．ｒＶＥＧＦ（０．２５μｇ／ｍＬ）溶液５０μＬを、マルチチャンネルピペットを用いてImmunsorb９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。     2. 50 μL of rVEGF (0.25 μg / mL) solution was added to each well of an Immunosorb 96-well ELISA plate using a multichannel pipette.

３．プレートにプラスチック蓋を被せて、４℃で約４２時間保存した。     3. The plate was covered with a plastic lid and stored at 4 ° C. for about 42 hours.

プレートの洗浄およびブロッキング：
４．プレートを４℃貯蔵から取り出した。 Plate washing and blocking:
4). The plate was removed from 4 ° C storage.

５．各プレートを、ＰＢＳ＋０．１％トゥイーン２０で６回洗浄した。     5. Each plate was washed 6 times with PBS + 0.1% Tween 20.

６．検定ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）１００μＬを、各プレートの全ウェルに添加した。     6). 100 μL of assay blocking buffer (1% BSA / PBS) was added to all wells of each plate.

７．プレートを、１時間撹拌しながら室温でインキュベートした。     7). Plates were incubated at room temperature with stirring for 1 hour.

試料および標準物質の調製：
８．標準物質および試料を、プレートをブロッキングする間、検定希釈液（０．１％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン２０／ＰＢＳ）中に希釈した。標準物質（参照物質、すなわちＤｏｍ１５−２６−５９３）を連続（１０倍）希釈して、対数希釈曲線を作成した。 Sample and standard preparation:
8). Standards and samples were diluted in assay diluent (0.1% BSA / 0.05% Tween 20 / PBS) while blocking the plate. Logarithmic dilution curves were generated by serial (10-fold) dilution of the standard (reference material, Dom 15-26-593).

試料の添加：
９．ブロッキングしたプレートを洗浄した（上記６．）。 Sample addition:
9. The blocked plate was washed (6. above).

１０．希釈試料または標準物質５０μｌを、適切なウェルに添加した。５０μｌ／ウェル検定希釈液をウェルに添加して、陰性対照として用いた。     10. 50 μl of diluted sample or standard was added to the appropriate wells. 50 μl / well assay diluent was added to the wells and used as a negative control.

１１．撹拌しながら室温で２時間、プレートをインキュベートした。     11. Plates were incubated for 2 hours at room temperature with agitation.

１２．プレートを６回洗浄し、ブロット乾燥した（上記６．）。     12 The plate was washed 6 times and blot dried (6. above).

１３．全ウェルに、１：５００に希釈した（検定希釈液：０．１％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン２０／ＰＢＳ中）抗ｍｙｃ抗体 ５０μＬ（９Ｅ１０ Sigma Ｍ５５４６）を添加した（すなわち、各プレートに関して、抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）１０μＬを検定希釈液５ｍｌに添加した）。     13. To all wells, 50 μL of anti-myc antibody (9E10 Sigma M5546) diluted 1: 500 (in assay diluent: 0.1% BSA / 0.05% Tween 20 / PBS) was added (ie, for each plate, 10 μL of anti-myc antibody (9E10) was added to 5 ml of assay diluent).

１４．室温で少なくとも１時間、ロッカー上でプレートをインキュベートした。     14 Plates were incubated on a rocker for at least 1 hour at room temperature.

１５．プレートを６回洗浄し、ブロット乾燥した（上記６．）。     15. The plate was washed 6 times and blot dried (6. above).

１６．５０μＬの抗マウスＩｇ ＨＲＰ（SigmaＡ９３０９）を１：１００００で全ウェルに添加した（すなわち、抗マウスＩｇ ＨＲＰ抗体５μＬを、検定希釈液（０．１％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン２０／ＰＢＳ）４５μＬに添加することにより、ストック抗体を１：１０に希釈する）。各プレートに関して、１：１０希釈ストック５μＬを検定希釈液５ｍｌに添加する。     16. 50 μL of anti-mouse Ig HRP (Sigma A9309) was added to all wells at 1: 10000 (ie 5 μL of anti-mouse Ig HRP antibody was added to the assay diluent (0.1% BSA / 0.05% Tween 20 / PBS). ) Dilute stock antibody 1:10 by adding to 45 μL). For each plate, add 5 μL of 1:10 dilution stock to 5 ml of assay dilution.

１７．室温で少なくとも１時間、ロッカー上でプレートをインキュベートした。     17. Plates were incubated on a rocker for at least 1 hour at room temperature.

１８．プレートを６回洗浄し、ブロット乾燥した（上記６．）。     18. The plate was washed 6 times and blot dried (6. above).

１９．ＴＭＢ基質５０μＬを全ウェルに添加した。この検定の発現は非常に迅速であるので、一度に３つ以下のプレートにＴＭＢを添加することが望ましい。ＴＭＢは、冷蔵庫から直接、あるいは室温で用いられ得る。     19. 50 μL of TMB substrate was added to all wells. Since the onset of this assay is so rapid, it is desirable to add TMB to no more than three plates at a time. TMB can be used directly from the refrigerator or at room temperature.

２０．（一旦、十分に発色したら、）全てのウェルに１Ｍ ＨＣｌ ５０μＬを添加することにより、反応を停止させた。     20. The reaction was stopped by adding 50 μL of 1M HCl to all wells (once enough color developed).

２１．プレートを、９６ウェルプレート読取器で４５０ｎｍで読み取った。     21. The plate was read at 450 nm with a 96 well plate reader.

結果：
結果を表１に示す。投与スケジュールは十分に耐容されて、発赤、刺激性または異常動物行動の徴候は観察されなかった。処置および対側（非処置）眼から得られた硝子体液および眼房水試料中に存在する抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）のレベルを調べるために実行されるＥＬＩＳＡ検定の結果は、検出されたｄＡｂのほとんどが処置眼の硝子体液中に存在する、ということを示した。硝子体液中に最高濃度を有したウサギ（動物３）は、処置眼の眼房水中に存在する検出レベルの抗ＶＥＧＦ ｄＡｂも示した。 result:
The results are shown in Table 1. The dosing schedule was well tolerated and no signs of redness, irritation or abnormal animal behavior were observed. The results of an ELISA assay performed to examine the levels of anti-VEGF dAb (DOM15-26-593) present in vitreous humor and aqueous humor samples obtained from treated and contralateral (untreated) eyes were detected It was shown that most of the applied dAbs are present in the vitreous humor of the treated eye. The rabbit with the highest concentration in the vitreous humor (Animal 3) also showed a detectable level of anti-VEGF dAb present in the aqueous humor of the treated eye.

１．５％ＨＰＭＣ（より粘性の溶液である）中に製剤化されたｄＡｂは、より流動性の０．３％ＨＰＭＣ含有製剤より有効に各投与後に、眼中に保持されると思われる、ということも観察された。低ＨＰＭＣ濃度で投与されたウサギは、それを瞬きして出すことにより、その後の投与物質を多少失うと思われた。

Figure 2012509852
A dAb formulated in 1.5% HPMC (which is a more viscous solution) appears to be retained in the eye after each administration more effectively than a more fluid 0.3% HPMC containing formulation. It was also observed. Rabbits administered at low HPMC concentrations seemed to lose some of the subsequent doses by blinking it out.
Figure 2012509852

結論：
抗ＶＥＧＦ ｄＡｂの用量を、結膜嚢中に入れた。多少のｄＡｂは角膜を通り抜けて、その後、眼房水中に検出され得る、と予測された。意外にも、検出された抗ＶＥＧＦ ｄＡｂの大部分は硝子体液中に存在し、この観察は、後眼房に進入するために強膜および脈絡膜を通して眼窩から分散することにより眼に入る抗ＶＥＧＦ ｄＡｂと一致する。 Conclusion:
A dose of anti-VEGF dAb was placed in the conjunctival sac. It was expected that some dAb would pass through the cornea and then be detected in the aqueous humor. Surprisingly, most of the detected anti-VEGF dAb is present in the vitreous humor and this observation is the anti-VEGF dAb that enters the eye by dispersing from the orbit through the sclera and choroid to enter the posterior chamber. Matches.

ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＭＣ）は、増粘剤として製剤中に含まれた。１．５％製剤は、より効果的に処置眼中に保持されると思われた。より流動性の０．３％製剤は十分には保持されず、これが、この群における３羽のウサギのうちの２羽で観察された対側眼への抗ＶＥＧＦ ｄＡｂの移動に関与し得る。   Hydroxypropyl cellulose (HPMC) was included in the formulation as a thickener. The 1.5% formulation appeared to be more effectively retained in the treated eye. The more fluid 0.3% formulation is not well retained, which may be responsible for the anti-VEGF dAb migration to the contralateral eye observed in 2 of the 3 rabbits in this group.

ウサギの眼への硝子体内投与後のＤＯＭ１５−２６−５９３の薬物動態：
硝子体液中へのＤＯＭ１５−２６−５９３の直接注入後に、抗ＶＥＧＦ免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体（抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ）ＤＯＭ１５−２６−５９３が眼中に保持される持続期間を調べるために、実験を実行した。図１ａに示したアミノ酸配列（配列番号１）を有するＤｏｍ１５−２６−５９３ ｄＡｂを調製し（１０４ｍＭ塩化ナトリウム、0.02％（ｗ／ｖ）トゥイーン８０を補足した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に製剤化された２ｍｇ／ｍｌ濃度）、この実験においてｃ−ｍｙｃ標的化抗ＶＥＧＦ ｄＡｂとして用いた。成体のチンチラバスタード・ウサギを、Charles River(Germany)から入手した。使用前に、動物を馴化させた。各ウサギを麻酔して、ｃ−ｍｙｃタグ化抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）の２ｍｇ／ｍｌ溶液（実施例１に記載したように調製した溶液）１０μｌを左眼の硝子体液中に直接注入した（総量２０μｇ）。注入後の種々の時点（２、２４および３０時間）でウサギを安楽死させて、両眼を摘出し、眼房水および硝子体液の試料を収集した。これらの試料を、分析前に凍結保存した（−２０℃）。サンドイッチＥＬＩＳＡ検定を用いて、存在するＤＯＭ１５−２６−５９３の濃度に関して、眼房水および硝子体液の試料を試験した。この場合、ｄＡｂを組換えＶＥＧＦタンパク質被覆プレート上に捕捉し、ｃ−ｍｙｃタグに関して特異性を有する抗体を用いて検出した。 Pharmacokinetics of DOM 15-26-593 after intravitreal administration to rabbit eyes:
Performed experiments to determine the duration of anti-VEGF immunoglobulin single variable domain antibody (anti-VEGF dAb) DOM15-26-593 retained in the eye after direct injection of DOM15-26-593 into vitreous humor did. A Dom15-26-593 dAb having the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) shown in FIG. 1a was prepared (50 mM sodium acetate buffer (pH 7.0) supplemented with 104 mM sodium chloride, 0.02% (w / v) Tween 80). 2 mg / ml concentration formulated in) and used in this experiment as c-myc targeted anti-VEGF dAb. Adult chinchilla bust rabbits were obtained from Charles River (Germany). Animals were acclimated prior to use. Each rabbit is anesthetized and 10 μl of a 2 mg / ml solution of c-myc-tagged anti-VEGF dAb (DOM15-26-593) (solution prepared as described in Example 1) directly into the vitreous humor of the left eye. Injection (total 20 μg). Rabbits were euthanized at various time points (2, 24 and 30 hours) after injection, both eyes were removed, and samples of aqueous humor and vitreous humor were collected. These samples were stored frozen (−20 ° C.) prior to analysis. Samples of aqueous humor and vitreous humor were tested for the concentration of DOM15-26-593 present using a sandwich ELISA assay. In this case, dAbs were captured on recombinant VEGF protein-coated plates and detected using antibodies with specificity for the c-myc tag.

結果：
ＤＯＭ１５−２６−５９３（抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ）の濃度を、以下の表２に示す：

Figure 2012509852
result:
The concentrations of DOM15-26-593 (anti-VEGF dAb) are shown in Table 2 below:
Figure 2012509852

結論：
実験の結果は、ＤＯＭ１５−２６−５９３の濃度が投与後２４時間目の注入濃度に近いレベルに保持された、ということを示した。ドメイン抗体は、投与後２４および３０時間目に硝子体液中に存在する。 Conclusion:
The results of the experiment showed that the concentration of DOM15-26-593 was maintained at a level close to the infusion concentration 24 hours after administration. Domain antibodies are present in the vitreous humor 24 and 30 hours after administration.

低濃度のＤＯＭ１５−２６−５９３（抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ）が、処置眼のいくつかの眼房液中で検出された。しかしながら、対側非処置眼へのＤＯＭ１５−２６−５９３の移入は最小であった。   Low concentrations of DOM15-26-593 (anti-VEGF dAb) were detected in some aqueous humor of treated eyes. However, transfer of DOM15-26-593 into the contralateral untreated eye was minimal.

ラットレーザー誘導脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）モデル：
５匹の２〜４月齢雌Dark Agouti（ＤＡ）ラットの群において、実験的脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）を片側で誘導した。レーザー光凝固（ＰＣ）を用いて、麻酔ラットのブルッフ膜を破裂させた。スリットランプ眼底検査鏡に取り付けられたダイオード励起５３２ｎｍアルゴンレーザー（Novus Omni, Coherent Inc., Santa Clara, CA）、ならびに視力（ocular power）を中和するために角膜に適用されるハンドヘルド平凹コンタクトレンズ（Moorfields Eye Hospital, London, UK）を用いて、色素レーザーＰＣを実施した。５つの病変（５３２ｎｍ、１５０ｍＷ、０．２秒、直径２００μｍ）を、各実験動物の片眼に作成した。視神経を中心に置いて半径５００μｍで、大きな血管を避けて、乳頭周囲分布および標準化方式で、病変を作成した。レーザー損傷の形態学的終点を、ブルッフ膜の崩壊に関連した徴候である空洞気泡の一過性出現として同定した。気泡の形成を生じないレーザースポットを、分析から除外した。レーザーＣＮＶ誘導直後に、各動物に（視神経円板を中心にして）５μＬ容積で硝子体内投与した（病変が作成された網膜域を被覆するのに十分な容積が存在すると算定されたので、この容積を選択した）。１０４ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）トゥイーン８０を補足した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に２ｍｇ／ｍｌの濃度として、ｄＡｂを処方した。５μＬ容積は、５０μｇの抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３；図１ａに示したアミノ酸配列（配列番号１）を有する）、５０μｇの抗ＶＥＧＦ ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体（図１ｂに示したアミノ酸配列（配列番号２）を有する）（あるいは化合物なし（ビヒクルのみ、陰性対照））を含有した。病変生成および注入後７および１４日目に、共焦点高分解能ＳＬＯ蛍光眼底造影（０．２ｍｌの１０％腹腔内注入フルオレセインナトリウム、ＦＳ）およびＯＣＴ（Heidelberg Spectralis, Heidelberg, Germany）を用いて、ＣＮＶおよび関連漏出のin vivo画像データを生成した。ベースライン反射率（４８８ｎｍおよび７９０ｎｍでの）および自己蛍光（励起 ４８８ｎｍ、発光 ＞４９８ｎｍ）画像をＦＳの注入前に作成して、蛍光眼底造影画像における病変の位置を示す手助けをした。ＦＳ注入直後に、動静脈相を記録した。その後、注入の１分後および４分後に再び、蛍光眼底造影を記録した。後期蛍光眼底造影の半定量的査定により、薬剤治療の効果を評価した。漏出は、後期血管撮影像において時間に伴ってサイズを増大する過蛍光病変の存在として定義された。後期蛍光眼底造影における染色の強度および面積を、遮蔽方式で２名の実験者が等級づけした。特定病変に関して示された２つのスコアが一致しなかった場合、高いほうのスコアを分析のために用いた。このような矛盾するスコアづけは分析された病変の＜１０％で観察され、矛盾は一等級より大きくはなかった。遮蔽方式で試験を実行し、一旦データがすべて収集されたら、物質の遮蔽を解いた。 Rat laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model:
Experimental choroidal neovascularization (CNV) was induced unilaterally in a group of 5 2-4 month old female Dark Agouti (DA) rats. Laser photocoagulation (PC) was used to rupture the Bruch's membrane of anesthetized rats. A diode-pumped 532 nm argon laser (Novus Omni, Coherent Inc., Santa Clara, Calif.) Attached to a slit lamp fundus examination mirror, as well as a hand-held plano-concave contact lens applied to the cornea to neutralize ocular power (Moorfields Eye Hospital, London, UK) was used to perform dye laser PC. Five lesions (532 nm, 150 mW, 0.2 seconds, diameter 200 μm) were created in one eye of each experimental animal. Lesions were created with a radius of 500 μm centered on the optic nerve, avoiding large blood vessels, with peripapillar distribution and a standardized manner. The morphological endpoint of laser damage was identified as the transient appearance of cavity bubbles, a sign related to Bruch's membrane collapse. Laser spots that did not cause bubble formation were excluded from the analysis. Immediately after laser CNV induction, each animal was administered intravitreally in a volume of 5 μL (centered around the optic disc) (it was estimated that there was sufficient volume to cover the retinal area where the lesion was created) Volume selected). The dAb was formulated at a concentration of 2 mg / ml in 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) supplemented with 104 mM sodium chloride, 0.02% (w / v) Tween 80. The 5 μL volume is 50 μg anti-VEGF dAb (DOM15-26-593; having the amino acid sequence shown in FIG. 1 a (SEQ ID NO: 1)), 50 μg anti-VEGF DOM15-26-593-Fc fusion (shown in FIG. 1 b) Having the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) (or no compound (vehicle only, negative control)). CNV using confocal high-resolution SLO fluorescence fundus angiography (0.2 ml 10% intraperitoneally injected fluorescein sodium, FS) and OCT (Heidelberg Spectralis, Heidelberg, Germany) 7 and 14 days after lesion generation and injection In vivo image data of and related leaks were generated. Baseline reflectance (at 488 nm and 790 nm) and autofluorescence (excitation 488 nm, emission> 498 nm) images were created prior to FS injection to help indicate the location of the lesion in the fluorescence fundus contrast image. The arteriovenous phase was recorded immediately after FS injection. Thereafter, fluorescein fundus angiography was recorded again 1 and 4 minutes after injection. The effect of drug treatment was evaluated by semi-quantitative assessment of late fluorescence fundus imaging. Leakage was defined as the presence of hyperfluorescent lesions that increase in size over time in late angiograms. The intensity and area of staining in late fluorescence fundus angiography were graded by two experimenters in a shielding manner. If the two scores shown for a particular lesion did not match, the higher score was used for analysis. Such inconsistent scoring was observed in <10% of the analyzed lesions and the inconsistency was not greater than one grade. The test was performed in a shielded manner and once the data was collected, the substance was unshielded.

結果
結果を、表３で以下に示す。ラット網膜にレーザー熱傷を用いた脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）の誘導後７および１４日目に、蛍光眼底造影を用いて、各病変を観察した。病変を、以下のように等級分けした：等級０＝漏出なし、等級１＝小漏出、等級２＝中等度漏出、および等級３＝大漏出。抗血管内皮細胞増殖因子ドメイン抗体（抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ、ＤＯＭ１５−２６−５９３）、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体で硝子体内処置されたラットの群に関する、ならびに陰性対照ビヒクル投与群に関する結果を、以下に表記する。結果は、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）またはＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体による処置が、対照（擬似処置）ラットと比較して、新血管新生および漏出の程度を低減した、ということを示す。

Figure 2012509852
The results are shown in Table 3 below. Each lesion was observed using fluorescence fundus angiography 7 and 14 days after induction of choroidal neovascularization (CNV) using laser burns on the rat retina. Lesions were graded as follows: Grade 0 = no leak, Grade 1 = small leak, Grade 2 = moderate leak, and Grade 3 = large leak. Results for the group of rats treated intravitreally with anti-vascular endothelial growth factor domain antibody (anti-VEGF dAb, DOM15-263-593), DOM15-593-Fc fusion, and for the negative control vehicle treated group, Described below. Results showed that treatment with anti-VEGF dAb (DOM15-26-593) or DOM15-26-593-Fc fusion reduced the extent of neovascularization and leakage compared to control (sham-treated) rats. It shows that.
Figure 2012509852

結論：
結果は、ＲＰＥ−脈絡膜のレーザー光凝固により誘導される実験的脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）が蛍光眼底造影により特性化されるラットモデルにおいて、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体（抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ−Ｆｃ）が有効であった、ということを示した。ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体に関する結果は、７および１４日目の両方での対照ビヒクル投与群より有意に良好であった。この群は、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）群よりわずかに高い活性を保持すると思われた。しかしながら、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）も有効であった（レーザー誘導性損傷後７および１４日目の両方で、対照より有意に良好であった）。 Conclusion:
The results show that in a rat model in which experimental choroidal neovascularization (CNV) induced by laser photocoagulation of RPE-choroid is characterized by fluorescence fundus angiography, the DOM15-593-Fc fusion (anti-VEGF dAb- Fc) was effective. The results for the DOM15-26-593-Fc fusion were significantly better than the control vehicle treated group on both days 7 and 14. This group appeared to retain slightly higher activity than the anti-VEGF dAb (DOM15-26-593) group. However, anti-VEGF dAb (DOM15-26-593) was also effective (significantly better than the control at both 7 and 14 days after laser-induced injury).

これらの結果は、抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ（ＤＯＭ１５−２６−５９３）および抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ−Ｆｃが実験的ラットＣＮＶモデルにおいて有効であった、ということを示す。眼疾患のin vivo齧歯類モデルにおける効能についてのこの実証は、ドメイン抗体が加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）における脈絡膜新血管新生の治療に有益であり得る、ということを示す。   These results indicate that anti-VEGF dAb (DOM15-26-593) and anti-VEGF dAb-Fc were effective in the experimental rat CNV model. This demonstration of efficacy in an in vivo rodent model of eye disease indicates that domain antibodies can be beneficial in the treatment of choroidal neovascularization in age-related macular degeneration (AMD).

ウサギへの抗ＴＮＦ−α抗体、Ｆｃ−フォーマット化抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ、ＰＥＧ化抗ＩＬ−１ ｄＡｂおよび抗ＩＬ−１ ｄＡｂの局所送達
方法
雌成体チンチラバスタード・ウサギを、Charles River(Germany)から入手した。使用前に、動物を馴化させた。投与の開始の５日前に、全ウサギの周縁耳静脈から血液試料を採取した。血液を室温で凝固させて、遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）して、血清を分離した。血清を新しい試験管に移して、凍結保存した（−２０℃）。 Local delivery of anti-TNF-α antibody, Fc-formatted anti-VEGF dAb, PEGylated anti-IL-1 dAb and anti-IL-1 dAb to rabbits
Methods Adult female chinchilla bustard rabbits were obtained from Charles River (Germany). Animals were acclimated prior to use. Blood samples were collected from the peripheral ear veins of all rabbits 5 days before the start of dosing. Blood was allowed to clot at room temperature and centrifuged (12000 rpm / 2 min) to separate serum. Serum was transferred to a new tube and stored frozen (−20 ° C.).

ＤＯＭ４−１３０−５４の調製および選択は、ＷＯ ２００７０６３３１１に、そしてＷＯ２００８１４９１４９にも記載されている。Ｄｏｍ０４００を調製するために、ＤＯＭ４−１３０−５４ ｄＡｂ配列を得て、位置８０のシステインがＤＯＭ４−１３０−５４ ｄＡｂ中に存在するプロリンに取って代わり、このｄＡｂが次に、ｄＡｂの位置８０の遊離システインとの標準マレイミドカップリングにより、４０ＫＤａ線状ＰＥＧ分子（NOF Corp., Europe）に付着される。   The preparation and selection of DOM4-130-54 is described in WO 20077063311 and also in WO2008149149. To prepare Dom0400, the DOM4-130-54 dAb sequence was obtained and the cysteine at position 80 replaced the proline present in the DOM4-130-54 dAb, which was then replaced at position 80 of the dAb. It is attached to a 40 KDa linear PEG molecule (NOF Corp., Europe) by standard maleimide coupling with free cysteine.

裸フォーマット（ＤＯＭ４−１３０−５４；ＩＬ−１裸ｄＡｂ、１２．０２６ｋＤａ；図３に示したアミノ酸配列（配列番号５）を有する）またはＰＥＧ化フォーマット（ＤＯＭ０４００ＰＥＧ；ＩＬ−１ＰＥＧ化ｄＡｂ、５２．０３２ｋＤａ；図２に示したアミノ酸配列（配列番号４）を有する）でのＩＬ−１に対する特異性を有するドメイン抗体（ｄＡｂ）を、２０ｍＭコハク酸塩、５％ソルビトール、ｐＨ６．０中でそれぞれ８．５および１０．４ｍｇ／ｍｌで製剤化した。Ｆｃフォーマット化α−ＶＥＧＦ ｄＡｂ（図１ｂに示したアミノ酸配列（配列番号２）を有するＶＥＧＦ１５−２６−５９３）を、５０ｍＭリン酸塩、１％Ｌ−アルギニン、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ポリソルベートおよび０．３％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で９．１ｍｇ／ｍｌで製剤化した。ＴＮＦ−α（市販）に対する特異性を有するモノクローナル抗体を、滅菌蒸留水をもちいて、１０ｍｇ／ｍｌでの凍結乾燥調製物から再構成した。４羽のウサギの群の左眼に、４．２日の期間に亘って１日５回（３時間間隔で）、投与した。各投与日間、動物には１２時間（一晩）の休止期間を与えた。各用量は、上眼瞼の下に入れられる関連化合物の溶液２５μｌで構成された。投与後、少なくとも３０秒間、動物を静止させた。投与スケジュールの前および最中の種々の時点で、多少の流体を吸収するために眼瞼下に紙の小吸収片を入れることにより、涙液（涙）の試料を収集した。涙液を含浸した紙の領域を、リン酸塩緩衝生理食塩水２００μＬを含有する試験管中に入れた。試験管を遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）し、紙を取り出し、回収試料を分析前に凍結保存した（−２０℃）。   Naked format (DOM4-130-54; IL-1 naked dAb, 12.026 kDa; having the amino acid sequence shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 5)) or PEGylated format (DOM0400PEG; IL-1 PEGylated dAb, 52.032 kDa) A domain antibody (dAb) having specificity for IL-1 with the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), in 20 mM succinate, 5% sorbitol, pH 6.0, respectively. Formulated at 5 and 10.4 mg / ml. Fc-formatted α-VEGF dAb (VEGF 15-26-593 having the amino acid sequence shown in FIG. 1b (SEQ ID NO: 2)) was added to 50 mM phosphate, 1% L-arginine, 0.05 mM EDTA, 0.02% Formulated at 9.1 mg / ml in polysorbate and 0.3% NaCl, pH 7.0. A monoclonal antibody with specificity for TNF-α (commercially available) was reconstituted from a lyophilized preparation at 10 mg / ml using sterile distilled water. The left eye of a group of 4 rabbits was administered 5 times a day (at 3 hour intervals) over a period of 4.2 days. On each dosing day, the animals were given a 12 hour (overnight) rest period. Each dose consisted of 25 μl of a solution of the relevant compound placed under the upper eyelid. Animals were allowed to rest for at least 30 seconds after dosing. At various times prior to and during the dosing schedule, tear (tear) samples were collected by placing small pieces of paper under the eyelid to absorb some fluid. The area of the paper impregnated with tears was placed in a test tube containing 200 μL of phosphate buffered saline. The test tube was centrifuged (12000 rpm / 2 minutes), the paper was removed, and the collected sample was stored frozen (−20 ° C.) before analysis.

最終投与の１時間後、全ウサギの周縁耳静脈から血液試料を採取した。血液を凝固させて、その結果、上記の方法により血清を分離し、保存し得た。その直後に、動物を安楽死させた。安楽死が確証された時から出来るだけ近い時点で、各動物から両眼を摘出した。各眼をＰＢＳ中で洗浄して、過剰量の薬剤をその表面から除去した。眼房水および硝子体液の試料を収集し、分析前に凍結保存した（−２０℃）。各検定で試験する前に、硝子体液を単一凍結／解凍サイクルに付した。眼を切り出して、網膜／脈絡膜を採取した。網膜／脈絡膜試料を計量し、１００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４；０．１％ＳＤＳ；プロテイナーゼ阻害剤カクテル（Roche）を有する）を、各々１５ｍｇの網膜／脈絡膜組織に添加した。２分周期の反復高および低周波バーストを用いる超音波破砕（Covaris S2 Sonolab Single）を用いて、試料をホモジナイズした。網膜／脈絡膜の試料を、微量遠心管（Heraeus）中で遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）した。上清を新しい試験管に移して、凍結保存した（−２０℃）。   One hour after the last dose, blood samples were collected from the peripheral ear vein of all rabbits. The blood was allowed to clot so that the serum could be separated and stored by the method described above. Immediately afterwards, the animals were euthanized. Both eyes were removed from each animal as close as possible from when euthanasia was confirmed. Each eye was washed in PBS to remove excess drug from its surface. Samples of aqueous humor and vitreous humor were collected and stored frozen (−20 ° C.) prior to analysis. The vitreous humor was subjected to a single freeze / thaw cycle before testing with each assay. The eyes were cut out and the retina / choroid was collected. Retina / choroid samples were weighed and 100 μl lysis buffer (10 mM Tris, pH 7.4; with 0.1% SDS; with proteinase inhibitor cocktail (Roche)) was added to each 15 mg of retinal / choroidal tissue. Samples were homogenized using sonication (Covaris S2 Sonolab Single) using a repetitive high and low frequency burst with a 2 minute period. Retina / choroid samples were centrifuged (12000 rpm / 2 min) in a microcentrifuge tube (Heraeus). The supernatant was transferred to a new tube and stored frozen (−20 ° C.).

サンドイッチフォーマットＥＬＩＳＡ検定を用いて、各試料の薬剤含量を試験し、測定した。α−ＴＮＦ−α抗体を、組換えヒトＴＮＦ−αタンパク質（Peprotech）で被覆したプレートを用いて捕捉し、アルカリホスファターゼ接合抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Sigma）を用いて検出した。ＩＬ−１およびＰＥＧ化ＩＬ−１ ｄＡｂを、組換えヒトＩＬ−１受容体１型Ｆｃ（Axxora）で被覆したプレートを用いて捕捉し、プロテインＬ−ペルオキシダーゼ（Sigma）を用いて検出した。ＶＥＧＦ−Ｆｃフォーマット化ｄＡｂを、組換えＶＥＧＦタンパク質の企業内調製物を用いて捕捉し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）アルカリホスファターゼ接合抗体（Sigma）で検出した。   Each sample was tested and measured for drug content using a sandwich format ELISA assay. α-TNF-α antibody was captured using a plate coated with recombinant human TNF-α protein (Peprotech) and detected using an alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG (Fc specific) antibody (Sigma). IL-1 and PEGylated IL-1 dAbs were captured using plates coated with recombinant human IL-1 receptor type 1 Fc (Axxora) and detected using protein L-peroxidase (Sigma). VEGF-Fc formatted dAbs were captured using an in-house preparation of recombinant VEGF protein and detected with an anti-human IgG (Fc specific) alkaline phosphatase conjugated antibody (Sigma).

結果
全症例において、薬剤投与は良好に耐容され、発赤、刺激性または異常動物行動の徴候はなかった。 Results In all cases, drug administration was well tolerated and there were no signs of redness, irritation or abnormal animal behavior.

眼房水および硝子体液中の、ならびに網膜／脈絡膜中の、種々のフォーマットのドメイン抗体の、ならびにα−ＴＮＦ−α抗体に関する結果を、以下の表に示す。結果を、（各試料が三重反復実験で試験された３つの別個の検定からの）平均濃度に関して、＋／−標準偏差（括弧内に示す）として示す。

Figure 2012509852
Figure 2012509852
Figure 2012509852
 The results for domain antibodies in various formats and in α-TNF-α antibodies in aqueous humor and vitreous humor and in the retina / choroid are shown in the table below. Results are shown as +/− standard deviation (shown in parentheses) with respect to mean concentration (from three separate assays, where each sample was tested in triplicate).
Figure 2012509852
Figure 2012509852
Figure 2012509852

投与２０および２１の直前に、ウサギから涙液（涙）試料を採取した。存在する薬剤の濃度に関する結果を、それぞれ表４および５に示す。左（投与）眼の全てにおいて、投与物質を検出し（しかし、個々のウサギ間の濃度には非常に多くの変動が認められた）、ほとんどの対側（投与されなかった右）眼への多少の移送も起きていた。投与２０の１２時間後には、投与物質は依然として存在した。ＤＯＭ０４００ＰＥＧ（ＰＥＧ化ＩＬ−１ ｄＡｂ）およびＶＥＧＦ−Ｆｃ（１５−２６−５９３）は、裸ＩＬ−１ ｄＡｂ（ＤＯＭ４−１３０−５４）より高い濃度で、投与２０および２１間の１２時間の期間中、保持されると思われた。   Tear (tears) samples were collected from rabbits immediately before dosing 20 and 21. The results for the concentration of drug present are shown in Tables 4 and 5, respectively. In all of the left (dosed) eyes, the dosing substance was detected (but there was a great deal of variation in the concentration between individual rabbits) and most contralateral (right) Some transfer was also happening. At 12 hours after dosing, the administered substance was still present. DOM0400PEG (PEGylated IL-1 dAb) and VEGF-Fc (15-26-593) at higher concentrations than naked IL-1 dAb (DOM4-130-54) during a 12 hour period between doses 20 and 21 Seemed to be retained.

種々のフォーマットのドメイン抗体の濃度に関する、ならびに涙液（涙）中の抗体に関する結果を、以下の表に示す（左眼のみに投与した）

Figure 2012509852
Figure 2012509852
 The results for domain antibody concentrations in various formats, as well as for antibodies in tears (tears) are shown in the table below (administered only to the left eye)
Figure 2012509852
Figure 2012509852

種々のフォーマットのドメイン抗体の濃度に関する、ならびにプレブリード（prebleed）中および血清中の抗体に関する結果を、以下の表に示す：

Figure 2012509852
The results for the concentrations of the domain antibodies in various formats and for the antibodies in prebleed and serum are shown in the following table:
Figure 2012509852

α−ＴＮＦ−αＲ１ ｄＡｂの局所的送達
方法
成体雄チンチラバスタード・ウサギを、Charles River(Germany)から入手した。使用前に、動物を馴化させた。投与の開始の７日前に、全ウサギの周縁耳静脈から血液試料を採取した。血液を室温で凝固させた後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）して、血清を分離した。血清を新しい試験管に移して、凍結保存した（−２０℃）。 Local delivery of α-TNF-αR1 dAb
Methods Adult male chinchilla bustard rabbits were obtained from Charles River (Germany). Animals were acclimated prior to use. Blood samples were collected from the peripheral ear vein of all rabbits 7 days before the start of dosing. The blood was allowed to clot at room temperature and then centrifuged (12000 rpm / 2 minutes) to separate the serum. Serum was transferred to a new tube and stored frozen (−20 ° C.).

図４に示したアミノ酸配列（配列番号６）を有するＤｏｍ １ｈ−１３１−２０６（Ｄｏｍ １ｈ−１３１−２０６の調製および選択は、ＷＯ２００８１４９１４８に記載されている）であるＴＮＦ−αＲ１（すなわち、抗ＴＮＦα受容体１型ｄＡｂ）に対する特異性を有するドメイン抗体（ｄＡｂ）を、１０ｍｇ／ｍｌでリン酸塩緩衝液中に製剤化した。４羽のウサギの群の左眼に、単一日に１０回（１時間間隔で）、投与した。各用量は、上眼瞼の下に入れられる１０ｍｇ／ｍｌ α−ＴＮＦ−αＲ１ ｄＡｂ溶液５０μｌで構成された。投与後、少なくとも３０秒間、動物を静止させた。投与スケジュールの前および最中の種々の時点で、多少の流体を吸収するために眼瞼下に紙の小吸収片を入れることにより、涙液（涙）の試料を収集した。涙液を含浸した紙の領域を、リン酸塩緩衝生理食塩水２００μＬを含有する試験管中に入れた。試験管を遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）し、紙を取り出し、回収試料を分析前に凍結保存した（−２０℃）。   The preparation and selection of Dom 1h-131-206 having the amino acid sequence shown in FIG. 4 (SEQ ID NO: 6) (Dom 1h-131-206 is described in WO200008149148) (ie, anti-TNFα A domain antibody (dAb) with specificity for receptor type 1 dAb) was formulated in phosphate buffer at 10 mg / ml. The left eye of a group of 4 rabbits was administered 10 times a day (at 1 hour intervals). Each dose consisted of 50 μl of a 10 mg / ml α-TNF-αR1 dAb solution placed under the upper eyelid. Animals were allowed to rest for at least 30 seconds after dosing. At various times prior to and during the dosing schedule, tear (tear) samples were collected by placing small pieces of paper under the eyelid to absorb some fluid. The area of the paper impregnated with tears was placed in a test tube containing 200 μL of phosphate buffered saline. The test tube was centrifuged (12000 rpm / 2 minutes), the paper was removed, and the collected sample was stored frozen (−20 ° C.) before analysis.

最終投与の１時間後、全ウサギの周縁耳静脈から血液試料を採取した。血液を凝固させて、その結果、上記の方法により血清を分離し得た。その直後に、動物を安楽死させた。安楽死が確証された時から出来るだけ近い時点で、各動物から両眼を摘出した。各眼をＰＢＳ中で洗浄して、過剰量の薬剤をその表面から除去した。眼房水および硝子体液の試料を収集し、分析前に凍結保存した（−２０℃）。各検定で試験する前に、硝子体液を１回の凍結／解凍サイクルに付した。眼を切り出して、網膜／脈絡膜を採取した。網膜／脈絡膜試料を計量し、９００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４；０．１％ＳＤＳ；プロテイナーゼ阻害剤カクテル（Roche）を有する）を、各試料に添加した。２分周期の反復高および低周波バーストを用いる超音波破砕（Covaris S2 Sonolab Single）を用いて、試料をホモジナイズした。網膜／脈絡膜の試料を、微量遠心管（Heraeus）中で遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）した。上清を新しい試験管に移して、凍結保存した（−２０℃）。サンドイッチＥＬＩＳＡ検定により、α−ＴＮＦ−αＲ１ ｄＡｂの濃度に関して試料を試験した。この場合、ｄＡｂを、組換えヒトＴＮＦ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／Ｆｃキメラ（R+D Systems）で被覆したプレートを用いて捕捉し、ヒトＩｇＧ（Ｆ（ａｂ）２）断片（Thermo）に対する特異性を用いて検出した。この抗体は接合されておらず、したがって、抗ヤギ／ヒツジ−ＨＲＰ試薬（Sigma）を用いて、結合抗体を検出した。   One hour after the last dose, blood samples were collected from the peripheral ear vein of all rabbits. The blood was allowed to clot so that serum could be separated by the method described above. Immediately afterwards, the animals were euthanized. Both eyes were removed from each animal as close as possible from when euthanasia was confirmed. Each eye was washed in PBS to remove excess drug from its surface. Samples of aqueous humor and vitreous humor were collected and stored frozen (−20 ° C.) prior to analysis. The vitreous humor was subjected to one freeze / thaw cycle before testing with each assay. The eyes were cut out and the retina / choroid was collected. Retina / choroid samples were weighed and 900 μl of lysis buffer (10 mM Tris, pH 7.4; with 0.1% SDS; with proteinase inhibitor cocktail (Roche)) was added to each sample. Samples were homogenized using sonication (Covaris S2 Sonolab Single) using a repetitive high and low frequency burst with a 2 minute period. Retina / choroid samples were centrifuged (12000 rpm / 2 min) in a microcentrifuge tube (Heraeus). The supernatant was transferred to a new tube and stored frozen (−20 ° C.). Samples were tested for concentration of α-TNF-αR1 dAb by sandwich ELISA assay. In this case, the dAb was captured using a plate coated with recombinant human TNF R1 / TNFRSF1A / Fc chimera (R + D Systems) and the specificity for the human IgG (F (ab) 2) fragment (Thermo) was used. Detected. This antibody was not conjugated and therefore bound antibody was detected using anti-goat / sheep-HRP reagent (Sigma).

結果
薬剤投与は良好に耐容され、発赤、刺激性または異常動物行動の徴候は観察されなかった。 Results The drug administration was well tolerated and no signs of redness, irritation or abnormal animal behavior were observed.

眼内液および血清中のα−ＴＮＦ−αＲ１ ｄＡｂの濃度を、三重反復実験で試験した試料に関して示す。試験した眼試料のすべてにおいて、α−ＴＮＦ−αＲ１ ｄＡｂを検出した。

Figure 2012509852
The concentration of α-TNF-αR1 dAb in intraocular fluid and serum is shown for samples tested in triplicate experiments. Α-TNF-αR1 dAb was detected in all of the eye samples tested.
Figure 2012509852

投与２、６、１０の直前に、同時に、最終投与の１時間後に、ウサギから涙液（涙）試料を採取した。試料中に検出されたα−ＴＮＦ−αＲ１ ｄＡｂの濃度を表８に示す。左（投与）眼の全てにおいて、α−ＴＮＦ−αＲ１ ｄＡｂを検出し、ほとんどの対側（投与されなかった右）眼への多少の移送も起きていた。

Figure 2012509852
Tear (tears) samples were collected from rabbits immediately before dosing 2, 6, 10 and simultaneously 1 hour after the last dosing. Table 8 shows the concentration of α-TNF-αR1 dAb detected in the sample. In all of the left (administered) eyes, α-TNF-αR1 dAb was detected, and some transfer to most contralateral (unadministered right) eyes also occurred.
Figure 2012509852

初回投与前ならびに安楽死時に血清に関して血液を採取した。その結果生じたデータを、表９に示す。最終投与の１時間後に、４羽のウサギの各々から得た血清中で、低濃度のα−ＴＮＦ−αＲ１ ｄＡｂを検出した。

Figure 2012509852
Blood was collected for serum before the first dose and at euthanasia. The resulting data is shown in Table 9. One hour after the last dose, low concentrations of α-TNF-αR1 dAb were detected in serum obtained from each of the four rabbits.
Figure 2012509852

Claims (35)

眼送達のための、標的分子と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む組成物。   A composition comprising an immunoglobulin single variable domain that binds to a target molecule for ocular delivery. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインがプロテアーゼに耐性である請求項１記載の組成物であって、前記プロテアーゼが、眼プロテアーゼ、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）およびトロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、セクレターゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１およびユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）からなる群から選択される眼送達のための組成物。   The composition of claim 1, wherein said immunoglobulin single variable domain is resistant to protease, wherein said protease is ocular protease, caspase, calpain, matrix metalloprotease, disintegrin, metalloproteinase (ADAM) and thrombosponge Composition for ocular delivery selected from the group consisting of ADAM having a motif, proteosome, tissue plasminogen activator, secretase, cathepsin B, cathepsin D, cystatin C, serine protease PRSS1 and ubiquitin proteosome pathway (UPP) object. 眼送達のための、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦαＲ、ＩＬ−１、ＩＬ−１ｒ、ＴＮＦαＲ１、ＴＧＦβ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＣＤ２０、Ｎｏｇｏ−ａ、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびベータアミロイドの群から選択される標的分子と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む請求項１または２記載の組成物。   VEGF, TNFα, TNFαR, IL-1, IL-1r, TNFαR1, TGFβ, IL-6, IL-8, IL-17, IL-21, IL-23, CD20, Nogo-a, for ocular delivery 3. The composition of claim 1 or 2, comprising an immunoglobulin single variable domain that binds to a target molecule selected from the group of myelin-related glycoprotein (MAG) and beta amyloid. ＶＥＧＦと結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（配列番号１で示される）または（ｂ）ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む請求項３記載の組成物。   The immunoglobulin single variable domain that binds to VEGF is (a) the amino acid sequence of DOM15-26-593 (shown by SEQ ID NO: 1) or (b) the amino acid sequence of DOM15-26-593-Fc (SEQ ID NO: 2). 4. The composition of claim 3 comprising an amino acid sequence that is at least 97% identical to. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Kabatによる番号付けで位置６にバリンを含む請求項４記載の組成物。   5. The composition of claim 4, wherein the immunoglobulin single variable domain comprises valine at position 6 as numbered by Kabat. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Kabatによる番号付けで位置９９にロイシンを含む請求項４記載の組成物。   5. The composition of claim 4, wherein the immunoglobulin single variable domain comprises a leucine at position 99 as numbered by Kabat. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Kabatによる番号付けで位置３０にリシンを含む請求項４記載の組成物。   5. The composition of claim 4, wherein the immunoglobulin single variable domain comprises a lysine at position 30 as numbered by Kabat. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（配列番号１で示される）、（ｂ）ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２で示される）から選択される配列と同一であるアミノ酸配列を含む請求項４記載の組成物。   The immunoglobulin single variable domain comprises (a) the amino acid sequence of DOM15-26-593 (shown by SEQ ID NO: 1), (b) the amino acid sequence of DOM15-26-593-Fc (shown by SEQ ID NO: 2) 5. The composition of claim 4, comprising an amino acid sequence that is identical to a sequence selected from: ＩＬ−１と結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（配列番号５で示される）と、または（ｂ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（配列番号４で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む請求項３記載の組成物。   The immunoglobulin single variable domain that binds IL-1 is (a) the amino acid sequence of DOM4-130-54 (shown by SEQ ID NO: 5), or (b) the amino acid sequence of DOM0400PEG (shown by SEQ ID NO: 4). 4. The composition of claim 3 comprising an amino acid sequence that is at least 97% identical to ＩＬ−１と結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（配列番号５で示される）と、または（ｂ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（配列番号４で示される）と同一であるアミノ酸配列を含む請求項９記載の組成物。   The immunoglobulin single variable domain that binds IL-1 is (a) the amino acid sequence of DOM4-130-54 (shown by SEQ ID NO: 5), or (b) the amino acid sequence of DOM0400PEG (shown by SEQ ID NO: 4). 10. The composition of claim 9 comprising an amino acid sequence that is identical to α−ＴＮＦ−αＲ１と結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Ｄｏｍ １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（配列番号６で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む請求項３記載の組成物。   4. The immunoglobulin single variable domain that binds α-TNF-αR1 comprises an amino acid sequence that is at least 97% identical to the amino acid sequence of Dom 1h-131-206 (shown in SEQ ID NO: 6). Composition. α−ＴＮＦ−αＲ１と結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、Ｄｏｍ １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（配列番号６で示される）と同一であるアミノ酸配列を含む請求項３記載の組成物。   4. The composition of claim 3, wherein said immunoglobulin single variable domain that binds to [alpha] -TNF- [alpha] R1 comprises an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of Dom 1h-131-206 (shown by SEQ ID NO: 6). 抗体定常領域の一ドメインをさらに含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物であって、前記抗体定常領域が抗体Ｆｃ領域である組成物。   The composition according to any one of claims 1 to 12, further comprising one domain of an antibody constant region, wherein the antibody constant region is an antibody Fc region. 前記抗体Ｆｃ領域が配列番号３で示されるアミノ酸Ｆｃ配列を有する請求項９記載の組成物。   The composition according to claim 9, wherein the antibody Fc region has an amino acid Fc sequence represented by SEQ ID NO: 3. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインがＦｃとの融合体として存在し、ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃ融合体のアミノ酸配列（配列番号２で示される）と同一のアミノ酸配列を有する請求項９記載の組成物。   The composition according to claim 9, wherein the immunoglobulin single variable domain exists as a fusion with Fc and has the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the DOM15-593-Fc fusion (shown by SEQ ID NO: 2). object. 硝子体液、眼房水、網膜および脈絡膜から選択される眼領域のうちの１つ以上への送達のための、標的分子と結合する裸の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む組成物。   A composition comprising a naked immunoglobulin single variable domain that binds to a target molecule for delivery to one or more ocular regions selected from vitreous humor, aqueous humor, retina and choroid. 前記標的分子が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＴＮＦα、ＴＮＦα受容体、ＩＬ−１、α−ＴＮＦ−αＲ１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、Ｎｏｇｏ−ａ、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびベータアミロイドから選択される請求項１６記載の組成物。   The target molecule is VEGF, VEGF antagonist, TNFα, TNFα receptor, IL-1, α-TNF-αR1, IL-6, IL-8, IL-17, IL-21, IL-23, Nogo-a, 17. A composition according to claim 16 selected from myelin-related glycoprotein (MAG) and beta amyloid. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインがプロテアーゼに耐性である請求項１６または１７記載の組成物であって、前記プロテアーゼが、眼プロテアーゼ、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）およびトロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、セクレターゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１ならびにユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）の群から選択される組成物。   18. The composition of claim 16 or 17, wherein said immunoglobulin single variable domain is resistant to protease, wherein said protease is ocular protease, caspase, calpain, matrix metalloprotease, disintegrin, metalloproteinase (ADAM) and A composition selected from the group of ADAM having a thrombospondin motif, proteosome, tissue plasminogen activator, secretase, cathepsin B, cathepsin D, cystatin C, serine protease PRSS1, and ubiquitin proteosome pathway (UPP). 前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＶＥＧＦと結合し、（ｉ）ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（配列番号１で示される）または（ｉｉ）ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｂ）ＩＬ−１と結合し、（ｉ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（配列番号５で示される）と、または（ｉｉ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（配列番号４で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｃ）α−ＴＮＦ−αＲ１と結合し、Ｄｏｍ １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（配列番号６で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインからなる群から選択される請求項１６または１７記載の組成物。   The immunoglobulin single variable domain binds to (a) VEGF, and (i) the amino acid sequence of DOM15-26-593 (shown by SEQ ID NO: 1) or (ii) the amino acid sequence of DOM15-26-593-Fc An immunoglobulin single variable domain comprising an amino acid sequence that is at least 97% identical to (shown in SEQ ID NO: 2); (b) binds IL-1 and (i) the amino acid sequence of DOM4-130-54 (SEQ ID NO: Or (ii) an immunoglobulin single variable domain comprising an amino acid sequence that is at least 97% identical to the amino acid sequence of DOM0400PEG (shown in SEQ ID NO: 4); (c) α-TNF-αR1 Amino that binds and is at least 97% identical to the amino acid sequence of Dom 1h-131-206 (shown in SEQ ID NO: 6) The composition of claim 16 or 17, wherein is selected from the group consisting of an immunoglobulin single variable domain comprising the sequence. 網膜、脈絡膜および涙液から選択される眼領域のうちの１つ以上への送達のための、標的分子と結合するフォーマット化免疫グロブリン単一可変ドメインを含む組成物。   A composition comprising a formatted immunoglobulin single variable domain that binds to a target molecule for delivery to one or more of the ocular regions selected from the retina, choroid and tears. 前記標的分子が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＴＮＦα、ＴＮＦα受容体、ＩＬ−１、α−ＴＮＦ−αＲ１、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、Ｎｏｇｏ−ａ、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびベータアミロイドから選択される請求項２０記載の組成物。   Said target molecules are VEGF, VEGF antagonist, TNFα, TNFα receptor, IL-1, α-TNF-αR1, IL-17, IL-21, IL-23, Nogo-a, myelin-related glycoprotein (MAG) and 21. The composition of claim 20, selected from beta amyloid. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインがプロテアーゼに耐性である請求項２０または２１記載の組成物であって、前記プロテアーゼが、眼プロテアーゼ、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）およびトロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、セクレターゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１ならびにユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）の群から選択される組成物。   22. The composition of claim 20 or 21, wherein the immunoglobulin single variable domain is resistant to a protease, wherein the protease is an ocular protease, caspase, calpain, matrix metalloprotease, disintegrin, metalloproteinase (ADAM) and A composition selected from the group of ADAM having a thrombospondin motif, proteosome, tissue plasminogen activator, secretase, cathepsin B, cathepsin D, cystatin C, serine protease PRSS1, and ubiquitin proteosome pathway (UPP). 前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、（ａ）ＶＥＧＦと結合し、（ｉ）ＤＯＭ１５−２６−５９３のアミノ酸配列（配列番号１で示される）または（ｉｉ）ＤＯＭ１５−２６−５９３−Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｂ）ＩＬ−１と結合し、（ｉ）ＤＯＭ４−１３０−５４のアミノ酸配列（配列番号５で示される）と、または（ｉｉ）ＤＯＭ０４００ＰＥＧのアミノ酸配列（配列番号４で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｃ）α−ＴＮＦ−αＲ１と結合し、Ｄｏｍ １ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列（配列番号６で示される）と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインからなる群から選択される請求項１６または１７記載の組成物。   The immunoglobulin single variable domain binds to (a) VEGF, and (i) the amino acid sequence of DOM15-26-593 (shown by SEQ ID NO: 1) or (ii) the amino acid sequence of DOM15-26-593-Fc An immunoglobulin single variable domain comprising an amino acid sequence that is at least 97% identical to (shown in SEQ ID NO: 2); (b) binds IL-1 and (i) the amino acid sequence of DOM4-130-54 (SEQ ID NO: Or (ii) an immunoglobulin single variable domain comprising an amino acid sequence that is at least 97% identical to the amino acid sequence of DOM0400PEG (shown in SEQ ID NO: 4); (c) α-TNF-αR1 Amino that binds and is at least 97% identical to the amino acid sequence of Dom 1h-131-206 (shown in SEQ ID NO: 6) The composition of claim 16 or 17, wherein is selected from the group consisting of an immunoglobulin single variable domain comprising the sequence. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインが約５０ＫＤａの分子量を有する請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。   24. The composition of any one of claims 20-23, wherein the immunoglobulin single variable domain has a molecular weight of about 50 KDa. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインがＰＥＧ化または抗体Ｆｃとの融合によりフォーマット化される請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。   25. A composition according to any one of claims 20 to 24, wherein the immunoglobulin single variable domain is formatted by PEGylation or fusion with an antibody Fc. 眼浸透増強剤および増粘剤から選択される１つ以上のエンハンサーをさらに含む請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。   26. The composition according to any one of claims 1 to 25, further comprising one or more enhancers selected from eye penetration enhancers and thickeners. 薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。   27. The composition according to any one of claims 1 to 26, further comprising a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier, diluent or excipient. 眼に直接的に請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を送達する方法であって、点眼液によるような眼への局所送達、または眼内注射、眼周囲投与、あるいは緩徐放出製剤による群から選択される方法により眼に前記組成物を投与することを包含する方法。   28. A method of delivering a composition according to any one of claims 1 to 27 directly to the eye, comprising local delivery to the eye, such as by eye drops, or intraocular injection, periocular administration, or slow. Administering the composition to the eye by a method selected from the group with a release formulation. 眼内注射、硝子体内注射、例えば点眼液によるような眼への局所送達、または眼周囲投与による、および緩徐放出製剤からなる群から選択される方法により、眼に直接的に請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を投与することを包含する眼症状を治療し、予防し、または診断するための方法。   Claims 1-27 directly to the eye by a method selected from the group consisting of intraocular injection, intravitreal injection, local delivery to the eye, such as by eye drops, or periocular administration, and slow release formulations. A method for treating, preventing or diagnosing an ocular condition comprising administering a composition according to any one of the above. 前記組成物が、眼の表面、涙管、涙腺、眼内領域、前眼房、後眼房および硝子体液の群から選択される眼の１つ以上の領域に投与される請求項２８または２９記載の方法。   30. The composition is administered to one or more regions of the eye selected from the group of the surface of the eye, lacrimal duct, lacrimal gland, intraocular region, anterior chamber, posterior chamber and vitreous humor. The method described. 硝子体液、眼房水、網膜および脈絡膜の群から選択される眼の１つ以上の領域への請求項１６〜１９および２６〜２７のいずれか一項に記載の組成物の送達方法であって、局所的送達により、例えば点眼液を用いることにより、眼に前記組成物を投与することを包含する方法。   28. A method of delivering a composition according to any one of claims 16-19 and 26-27 to one or more regions of the eye selected from the group of vitreous humor, aqueous humor, retina and choroid. A method comprising administering the composition to the eye by topical delivery, for example by using eye drops. 網膜、脈絡膜および涙液の群から選択される眼の１つ以上の領域への請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の組成物の送達方法であって、局所的送達により、例えば点眼液を用いることにより、眼に前記組成物を投与することを包含する方法。   28. A method of delivering a composition according to any one of claims 20 to 27 to one or more regions of the eye selected from the group of the retina, choroid and tear, comprising topical delivery, for example eye drops A method comprising administering the composition to the eye by using a liquid. （ａ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を（ｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と混合することを包含する医薬組成物の製造方法。   (A) A method for producing a pharmaceutical composition comprising mixing the composition according to any one of claims 1 to 27 with (b) a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient. 前記医薬組成物が眼の症状または疾患を治療し、予防し、または診断するためのものである請求項３３記載の方法。   34. The method of claim 33, wherein the pharmaceutical composition is for treating, preventing, or diagnosing an ocular condition or disease. 前記眼の症状または疾患が、ＡＭＤ、ブドウ膜炎、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫およびブドウ膜炎の群から選択される請求項３４記載の方法。   35. The method of claim 34, wherein the ocular condition or disease is selected from the group of AMD, uveitis, glaucoma, dry eye, diabetic retinopathy, diabetic macular edema and uveitis.
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