JP2012509270A - 生理的条件下での高分子の凝集を低減するための方法及び製剤 - Google Patents
生理的条件下での高分子の凝集を低減するための方法及び製剤 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、2000〜54000ダルトンの分子量を有するポリビニルピロリドン(PVP)を5%〜20%添加することによる、生理的条件下での大きな高分子、例えばタンパク質の凝集を低減及び凝結を妨げるための方法を提供する。本発明はさらに、大きな高分子の皮下投与の間の注射部位の炎症を最小化するための方法を提供する。更なる態様では、本発明は、大きな高分子の皮下投与のための薬学的製剤、及び、ヒト化抗CD20抗体を含む本発明の薬学的製剤を投与することを含むCD20陽性癌又は自己免疫性疾患の治療方法を提供する。本発明はさらに、生理的条件下での抗体又は他の大きな高分子の凝集を低減する賦形剤の能力を評価するための、インビトロ透析方法を提供する。
Description
凝集工程の分子詳細が一般に知られていないので、凝集の防止は主に経験によるものである。代表的な方策は、安定剤をタンパク質溶液に加えることである。一般的に用いられる安定剤には、糖類、塩類、L−アルギニン及びL−グルタミンのような遊離アミノ酸(Golovanov, A.P. et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 8933-8939 (2004))、ポリオール(Singh, S. and Singh, J., AAPS Pharm. Sci. Tech 4: 1-9 (2003);Mishra, R. et al., J. Biol. Chem. 280:15553-15560 (2005))、ポリエチレングリコール(PEG)、及び、タンパク質-タンパク質相互作用を低減しうるポリソルベート又はポロキサマーといった他のポリマー(上掲のFrokjaer and Otzen;Lee, R.C. et al., Ann. Biomed. Eng. 34: 1190-1200 (2006);(Nema, S. et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 51: 166-171 (1997))が含まれる。
PVPは、錠皮援助として医薬品工業において、そして、粘性促進剤として眼及び局所的な調製物において広く使われている。 また、PVPは、本来は血漿増量剤として非経口投与に用いられ、その後注射可能な製剤(例えば抗生物質、ホルモン類、鎮痛剤)に使用され、粘性を与える。これらの製剤は、ホルモン類のような、通常500ダルトン未満の小分子化合物又は小タンパク質に限られる。PVPを含有する現在利用可能な薬剤には、バイシリンC-RTM(Wyeth)、WycillinTM(Wyeth)及びPfizerpenTM(Pfizer)が含まれ、これらすべては、非常に低い濃度(0.6%以下)のPVPと共に小分子ペニシリンGを含有する。Depo-SubQ Provera104TM(Pharmacia and Upjohn)は、小分子メドロキシプロゲステロンアセテートと共に5%のPVPを含有する。BexxarTM(Glaxo Smith Kline)は、4.4〜6.6%のPVPと共に放射性標識した抗CD20抗体を含有する。Bexxarの場合、PVPは、付着した放射性同位体によって放射性標識した抗体の自己放射線分解を低減するために放射性保護剤として特異的に用いられる(米国特許第5961955号及び米国特許第6338835号)。
また、PVP及びポリエチレングリコールは、溶解されたタンパク質を沈殿させるために、生化学者によって使用される(米国特許第5525519号)。
本発明は、2000〜54000ダルトンの分子量を有するポリビニルピロリドン(PVP)を5%〜20%添加することによる、生理的条件下での高分子、例えばタンパク質の凝集を低減及び凝結を妨げるための方法を提供する。また、PVPの添加による凝集と凝結の有意な低減は、ラットの皮下注射部位での炎症の有意な減少と相関した。更に、本発明は、皮下製剤に、2000〜54000ダルトンの分子量を有するポリビニルピロリドン(PVP)を5%〜20%添加することによる、タンパク質などの大きな高分子の皮下投与の間の、注射部位での炎症を最小化するための方法を提供する。本発明の様々な実施態様では、高分子は抗体である。本発明の他の実施態様では、抗体は治療用抗体又は診断用抗体である。
上述した疾患の治療方法のある実施態様では、疾患に罹患している被検体又は患者は霊長類、好ましくはヒトである。
さらに、本発明は、皮下に投与される抗体の生物学的利用能を増やす方法であって、抗体を含む水溶性皮下製剤に、2000〜54000ダルトンの分子量を有する5%〜20%のポリビニルピロリドン(PVP)を添加することを含む方法を提供する。
「凝集すること」という動詞の様々な形態は、個々のタンパク質分子又は複合体が関連して凝集が形成されるプロセスを指す。「凝集体」は、タンパク質の分子又は複合体を含む重合集合体である。凝集は、可視的な沈殿物が形成される程度にまで進行しうる。このような可視的な沈殿物の形成は、本明細書中で「凝結」とも称する。
高分子の相対的な沈殿量は、例えば視覚的コントロールとの比較によって決定されうる。沈殿をアッセイする他の方法は当分野で公知であり、例えば実施例2に詳細に記載したインビトロ透析法や実施例3に記載したインビボモデル等、以降に記載する。
「高分子」なる用語は、少なくとも10000ダルトンの分子量を有する分子を指し、抗体といったタンパク質を含みうる。
「賦形剤」又は「医薬賦形剤」なる用語は、高分子の凝集を低減しうる化合物を指す。賦形剤には、糖質、塩類、遊離アミノ酸、例えばL−アルギニン及びL−グルタミン、ポリオール、ポリエチレングリコール(PEG)及び他のポリマー、例えばポリソルベート、ポロキサマー又はPVPが含まれうる。
「PVP」なる用語は、線形に重合化した1−ビニル−2−ピロリジノン(ビニルピロリドン)から基本的になるポリマーを指し、その重合程度により様々な分子量のポリマーが生じる。ポリビニルピロリドンの同義語には、PVP、ポリ(1−ビニル−2−ピロリドン)、ポビドン及びコリドンが含まれる。
「診断用抗体」なる用語は、疾患のための診断試薬として用いられる抗体を指す。診断用抗体は、特異的に関連する標的に結合しうるか、又は特定の疾患における発現の増加を示す。診断用抗体は、例えば、患者からの生物学的試料、又は、患者の罹患部位(例えば腫瘍)の画像診断において標的を検出するために用いられうる。
「抗体」なる用語は、最も広義に用いられ、特にモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、多重特異的抗体(例えば二重特異的抗体)、及びそれらが所望の生物学的活性又は機能を示す限り、抗体断片を包含する。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小限抗体断片である。この断片は、一重鎖と一軽鎖可変領域ドメインが密接に非共有結合した二量体からなる。この2つのドメインのフォールディングから6つの高頻度可変ループ(それぞれH鎖及びL鎖から3ループ)が生じ、それにより抗原結合にアミノ酸残基を寄与させて抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一可変ドメイン(又は抗原に特異的なCDRを3つしか含まないFvの半分)でさえ、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を持つ。
「可変」という用語は、可変ドメインのあるセグメントが、抗体間で配列が広く異なることを意味する。Vドメインは抗原結合を仲介し、その特異的抗原に対する特異的抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は可変ドメインの110アミノ酸スパンにわたって均一には分布していない。代わりに、V領域は、それぞれ9−12アミノ酸長の「高頻度可変領域」と呼ばれる高度可変性のより短い領域により分離される15−30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる相対的にインバリアントな伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々4つのFR領域を含み、これは主にβシート配置をとり、3つの高頻度可変領域に結合してループ状結合を形成するが、βシート構造の一部を形成する場合もある。各鎖の高頻度可変領域は、FR領域の直ぐ近傍に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照)。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的細胞障害(ADCC)への抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同である重鎖及び/又は軽鎖の一部を有するものであり、残りの鎖は他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同であり、並びに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる(米国特許第4816567号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで用いるヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
本発明は、2000〜54000ダルトンの分子量を有するポリビニルピロリドン(PVP)を5%〜20%含んでなる、タンパク質などの高分子の皮下投与用薬学的組成物を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、30mg/ml〜200mg/mlの濃度の抗体と、5%〜20%の2000〜54000ダルトンの分子量を有するポリビニルピロリドン(PVP)とを含有してなる、抗体の皮下投与のための薬学的製剤を提供する。ある実施態様では、抗体濃度範囲は10〜150mg/mlである。更なる実施態様では、抗体濃度範囲は100〜150mg/mlである。ある実施態様では、PVPの濃度は10%である。ある実施態様では、PVPの分子量は7000〜11000ダルトンである。具体的な実施態様では、本発明は、100mg/mlのヒト化2H7抗体と、7000〜11000ダルトンの分子量を有する10%のPVPとを含有してなる、抗体の皮下投与用の薬学的組成物を提供する。更なる実施態様では、薬学的組成物は、30mM 酢酸ナトリウム;5% トレハロース二水和物;及び0.03% ポリソルベート20、pH5.3を更に含む。
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重鎖可変配列(VH):
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EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号14)
を含む。
IgG中のNグリコシル化部位はCH2ドメイン内のAsn297にある。本発明のヒト化2H7抗体組成物は、Fc領域を有する前述の何れかのヒト化2H7抗体の組成物を含み、ここで組成物中の抗体の約80−100%(好ましくは約90−99%)は糖タンパク質のFc領域に結合した、フコースを欠く成熟コア糖鎖構造を含む。そのような組成物は、FcγRIIIA(F158)への結合に驚くべき改善を示すことがここで実証されており、これは、ヒトIgGとの相互作用においてFcγRIIIA(V158)ほど効果的ではない。FcγRIIIA(F158)は、正常で健常なアフリカ系アメリカ人及び白人においてはFcγRIIIA(V158)より一般的である。Lehrnbecher et al. Blood 94:4220 (1999)を参照。歴史的に、最も一般的に用いられる産業用宿主の一つであるチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)で産生される抗体は、フコシル化されていない集団におよそ2〜6%を含有する。しかしながら、YB2/0及びLec13は、78〜98%のフコシル化されていない種を有する抗体を産生しうる。Shinkawa et al. J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)は、YB2/0及びLec13細胞で産生される抗体であってFUT8活性をほとんど持たない抗体がインビトロで有意に増加したADCC活性を示すことを報告した。また、フコース含量が低い抗体の作製は、例としてLi et al. (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris" in Nature Biology online publication 22 Jan. 2006;Niwa R. et al. Cancer Res. 64(6): 2127-2133 (2004);米国公開特許2003/0157108(Presta);米国特許第6602684号及び米国公開特許2003/0175884(Glycart Biotechnology);米国公開特許2004/0093621、米国公開特許2004/0110704、米国公開特許2004/0132140 (すべてKyowa Hakko Kogyo)に記載されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過器による濾過によって容易に達成される。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4816567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離して、次いでポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
好ましい融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、融合していない親の細胞に対して選択する選択培地に感受性である細胞である。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系、例えば、the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手し得るMOPC-21及びMPC-11マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, Rockville, Maryland USAから入手し得るSP-2及びその誘導体、例えばX63-Ag8-653細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、例えばマウスに細胞を腹腔内注入することによって、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィ(例えばプロテインA又はプロテインG-セファロース)又はイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などの常套的な抗体精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(nM範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性及び、抗体がヒトの治療用途に意図される場合にはHAMA応答(ヒト抗マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトVドメイン配列を同定して、その中のヒトフレームワーク領域(FR)をヒト化抗体とする(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
ヒト化抗体は、抗体断片、例えばFab、場合によっては免疫コンジュゲートを作製するために1又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体は、完全長抗体、例えば完全長IgG1抗体であってもよい。
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993);Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993);米国特許第5545806号、同第5569825号、同第5591669号(すべてGenPharm)、同第5545807号;及び国際公開公報97/17852を参照されたい。
前記したように、またヒト抗体は、活性化B細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第5567610号及び同第5229275号を参照)。
特定の状況では、全抗体よりもむしろ抗体断片を使用する利点がある。より小さいサイズの断片は迅速にクリアランスされ、固形腫瘍へのアクセスが向上しうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Fab、Fv及びScFv抗体断片はすべて大腸菌で発現されて分泌されるため、これら断片の大量の生産が容易である。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有するインビボ半減期が増加したFab及びF(ab')2断片は、米国特許第5,869,046号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である。国際公開93/16185;米国特許第5571894号;及び米国特許第5587458号を参照のこと。Fv及びsFvは、定常領域が欠けている完全な結合部位を有する唯一の種類である;したがって、それらは、インビボ使用の間の非特異的結合を減らすために適する。sFv融合タンパク質は、sFvのアミノ末端又はカルボキシ末端で、エフェクタータンパク質の融合を得るために設定されうる。上記のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5641870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
ここで記載のCD20結合抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。抗CD20抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗CD20抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗CD20抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数の変化などの抗CD20抗体の翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にある抗CD20抗体の特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸とCD20抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗CD20抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗CD20抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、FR変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して以下の表に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表に「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性の親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly、pro; 及び
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異がある。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば6−7部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたM13の遺伝子III産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトCD20の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、N結合又はO結合の何れかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。O結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(N結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(O-結合グリコシル化部位の場合)。
エフェクター機能、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)及び/又は補体依存性細胞障害性(CDC)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい。このことは、抗体のFc領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりに又は加えて、Fc領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上及び/又は補体媒介性細胞障害及び抗体依存性細胞障害(ADCC)を増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能***差結合を用いて調製されうる。又は、抗体を二重のFc領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解及びADCC能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
本発明のヒト化2H7 CD20結合抗体を含む開示した方法及び組成物は、多くの悪性腫瘍及び非悪性疾患、例えばB細胞リンパ腫及び白血病などのCD20陽性B細胞癌及び自己免疫性疾患の治療に有用である。骨髄の幹細胞(B細胞プロジェニター)はCD20抗原を欠損しており、治療後には健康なB細胞の再産生が可能となり、数か月以内には正常レベルにまで回復する。
CD20陽性B細胞癌は、細胞表面上にCD20を発現するB細胞の異常な増殖を含むものである。CD20陽性B細胞腫瘍には、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)を含むCD20陽性ホジキン病;非ホジキンリンパ腫(NHL);濾胞性中心細胞(FCC)リンパ腫;急性リンパ球性白血病(ALL);慢性リンパ球性白血病(CLL);線毛細胞白血病が含まれる。
低悪性度リンパ腫は成長が遅い難病であり、平均的な患者は緩解と再発を繰返し6から10年生存するものである。一実施態様では、ヒト化CD20結合抗体又はその機能的断片は低悪性度NHL、例えば再発した低悪性度NHL及びリツキシマブ抵抗性低悪性度NHLの治療に用いられる。再発した低悪性度NHL患者は、予め1クールのリツキシマブを投与し、6か月より長い期間応答したリツキシマブ応答者でありうる。
このヒト化2H7抗体又はその機能的断片は、例えば、再発性ないし抵抗性の低グレードないし濾胞性のCD20陽性のB細胞NHLのための単一薬剤治療(単一療法)として有用であるか、多剤投与計画において他の薬剤と組み合わせて患者に投与されうる。
本発明は、さらに、本発明のヒト化2H7抗体によるフルダラビン治療に失敗した患者を含むCLL患者を治療する方法を提供する。
症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、リンパ節炎、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
次の文献は、リンパ腫及びCLL、それらの診断、治療、及び治療効果を測定するための標準的な医学的手法について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998;van Besien K及びCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, 70章, pp 1293-1338, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000;及びRai, K及びPatel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, 72章, pp1350-1362, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫又は自己免疫関連疾患の治療の効果又は成功を評価するためのパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の徴候や症状の減退を求めるであろう。以下は例として挙げる。
RAは、二百万を超える米国人が罹っており患者の日常の活動を妨げる消耗性自己免疫疾患である。RAは身体自体の免疫系が不適切に関節組織を攻撃し健康な組織を破壊する慢性的な炎症を引き起こし関節内に損傷を生じる。症状には関節の炎症、腫れ、凝り、及び疼痛が含まれる。また、RAは全身性の疾患であるので、肺、眼及び骨髄のような他の組織に影響を持ちうる。知られている治療法はない。治療には、様々なステロイド系及び非ステロイド系薬剤、免疫抑制剤、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)、及び生物製剤が含まれる。しかしながら、多くの患者は治療に対して不十分な応答性のままである。
1.視覚的アナログ尺度(VAS)による患者の疼痛評価
2.疾患活動性の患者の全体評価(VAS)
3.疾患活動性の医師の全体評価(VAS)
4.Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、及び
5.急性反応物質、CRP又はESR
ACR50及び70も同様に定義される。好ましくは少なくともACR20のスコア、好ましくは少なくともACR30、より好ましくは少なくともACR50、更により好ましくは少なくともACR70、最も好ましくは少なくともACR75より高いスコアに達する用量の本発明のCD20結合抗体を患者に投与する。
本発明の更に他の態様は、本発明の治療的有効量のヒト化CD20結合抗体を含む薬学的組成物が、SLE又はループス腎炎に罹患している患者に投与されることによるSLE又はループス腎炎の治療方法である。SLEDAIスコアは疾患活動性の数値的定量化を付与する。SLEDAIは疾患活動性に相関することが知られている24の臨床及び治験パラメータの荷重指数であり、0−103の数的範囲である。Bryan Gescuk及びJohn Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照のこと。他のスコア法にはBILAGスコア法がある。二本鎖DNAに対する抗体は腎性発赤及び他のループスの症状を引き起こすと考えられている。抗体治療を受けている患者を、血清クレアチニン、尿タンパク、又は尿中の血液の有意で再現可能な増加として定義される腎性発赤までの時間についてモニターすることができる。あるいは又は加えて、抗核抗体及び二本鎖DNAに対する抗体のレベルについて患者をモニターできる。SLEの治療は高用量のコルチコステロイド及び/又はシクロホスファミド(HDCC)を含む。本明細書では、成功したループス治療は、紅斑が減少する、すなわち次の紅斑までの時間及び/又は重症度が軽減するであろう。
脈管炎に関しては、全身性血管炎の患者のおよそ75%が抗好中球細胞質抗体を持ち、小/中サイズ血管を冒す3種の症状の一つにクラスター化される:ヴェーゲナー肉芽腫症(WG)、顕微鏡的多発性血管炎(MPA)及びチャーグ・ストラウス症候群(CSS)で、集合的にANCA関連脈管炎(AAV)として知られているもの。
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価(PGA)変化、及び乾癬領域及び重症度指数(PASI)スコア、乾癬症状評価(PSA)を含む臨床兆候及び疾患の症状の変化をモニターし、ベースライン症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的アナログ尺度で処置を通して定期的に、hu2H7.511などの本発明のヒト化CD20結合抗体で治療された乾癬患者を測定することができる。
患者はその治療抗体の最初の注入で注入反応又は注入関連症状を経験する場合がある。これらの症状の重症度はまちまちで、一般に医学的介入で改善することが可能である。これらの症状には、限定されるものではないが、インフルエンザに似た発熱、悪寒/寒気、吐き気、掻痒、頭痛、気管支痙攣、血管性浮腫が含まれる。本発明の疾患治療法が注入反応を最小にすることが望ましい。そのような副作用を軽減又は最小にするために、患者には、抗体の初期順化又は寛容化用量の後に治療的に有効な用量が投与されうる。順化用量は治療的に有効な用量よりも少なく、患者をより多い用量に耐えるように順化させる。
治療される徴候及び当分野の技量のある医師が理解する投薬に関連する因子に応じて、本発明の抗体は、毒素及び副作用を最小化する一方で、その徴候の治療に効果のある用量で投与される。所望の用量は、疾患及び疾患の重症度、疾患の段階、望ましいB細胞調節のレベル、及び当分野の技量のある医師に知られる他の因子に依存しうる。
本発明の抗体は、様々な投薬頻度、例えば毎週、隔週、毎月などで投与されてよい。例として、投薬頻度は、6か月に1用量か又は6か月ごとに2週間空けて2用量である。注入される抗体溶液の体積は、1注入につきおよそ0.1〜およそ3ml、より好ましくは1注入につきおよそ0.5ml〜およそ1.5mlに変動してよい。1注入において投与されるヒト化2H7抗体の総量は、1注入につき最高およそ150mgであってよい。所望の用量を達成するために複数回の注入が用いられてよい。
「慢性」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
上述のB細胞腫瘍の治療では、患者を、一又は複数の治療剤、例えば多剤併用療法の化学療法剤での治療と併せて本発明のヒト化2H7抗体で治療することができる。ヒト化2H7抗体は、化学療法剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性後に、投与することができる。リンパ腫の治療に対する標準的な化学療法には、シクロホスファミド、シタラビン、メルファラン及びミトキサントロン+メルファランが含まれうる。CHOPは非ホジキンリンパ腫の治療に対する最も一般的な化学療法の一つである。次のものはCHOP療法で用いられる薬剤である:シクロホスファミド(商品名シトキサン、ネオザール(neosar));アドリアマイシン(ドキソルビシン/ヒドロキシドキソルビシン);ビンクリスチン(オンコビン);及びプレドニゾロン(しばしばデルタゾン又はオラゾン(Orasone)と呼ばれる)。特定の実施態様では、CD20結合抗体は、次の化学療法剤:ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの一又は複数と併用して、それを必要とする患者に投与される。特定の実施態様では、リンパ腫(例えば非ホジキンリンパ腫)の患者はCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロン)化学療法と併用して本発明のヒト化2H7抗体で治療される。他の実施態様では、癌患者がCVP(シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロン)化学療法と併用して本発明のヒト化2H7 CD20結合抗体で治療されうる。具体的な実施態様では、CD20陽性NHLの患者はCVPと組み合わせてヒト化2H7.v511又はv114が、例えば3週ごとに8サイクル投与される。CLLの治療の具体的な実施態様では、2H7.v511抗体が、フルダラビン及びシトキサンの一又は双方での化学療法と併用して投与される。
上述の自己免疫疾患又は自己免疫関連症状の治療では、患者を、例えば多剤治療法においては、免疫抑制剤のような第二の治療剤と併用して一又は複数のhu2H7抗体で治療することができる。hu2H7抗体は、免疫抑制剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性時に、投与することができる。免疫抑制剤は、当該分野で決められたものと同じか又は少ない用量で投与することができる。好適な補助免疫抑制剤は、治療される疾患のタイプ並びに患者の病歴を含む多くの因子に依存する。
エタネルセプトは、ヒトIgG1のFc部分に結合されるヒトの75kD(p75)腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)の細胞外リガンド結合部分からなる「イムノアドヘシン」融合タンパク質である。エタネルセプト(ENBREL(登録商標))は、活動中のRAの治療のために米国で承認された注射剤である。エタネルセプトはTNFαと結合して、関節及び血液からほとんどのTNFαを取り除くように働くことによって、TNFαが関節リウマチの炎症及び他の症状を促進するのを防止する。この薬剤は、深刻な感染及び敗血症を含むネガティブな副作用である、多発性硬化症(MS)などの神経系疾患と関係している。例として、www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.htmlを参照のこと。
一例では、CD20抗体の注入の30分前に、メチルプレドニゾロン100mg静注と、第2〜7日目にプレドニゾン60mg経口、第8〜14日目に30mg経口、第16日までに基礎用量に戻すことからなる副腎皮質ステロイド投薬計画と共に、併用MTX(一経口投与(p.o.)又は一非経口投与につき10〜25mg/週)も患者に投与される。患者はまた、単回用量又は分割した一日量の何れかで、葉酸塩(5mg/週)が投与されうる。患者は、場合によって、治療期間の全体にわたって任意のバックグラウンド量の副腎皮質ステロイド(10mg/日 プレドニゾン又は等量)が投与され続ける。
SLEの治療は、高用量コルチコステロイド及び/又はシクロホスファミド(HDCC)とのCD20抗体の併用を含む。SLE、AAV及びNMOの患者は、次のコルチコステロイドの任意のものと併用して本発明のhu2H7抗体で治療することができる:コルチコステロイド、NSAID、鎮痛薬、COX-2インヒビター、糖質コルチコステロイド、一般的なDMARD(例えばメトトレキセート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド)、生物学的DMARD、例えば抗Blys(例えばベリムマブ)、抗IL6R、例えばトシリツマブ;CTLA4-Ig(アバタセプト)、(抗CD22、例えばエプラツズマブ)、免疫抑制剤(例えばアザチオプリン;ミコフェノール酸モフェチル(CellCept(登録商標); Roche))、及び細胞毒性剤(シクロホスファミド)。
毒性を最小にするために、伝統的な全身療法剤は、本投薬量のCD20結合抗体組成物と共により低用量の併用計画で、又は循環、連続、組合せ、又は間欠的な治療計画で投与することができる。
本発明の他の実施態様は、自己免疫性疾患及び関連症状及び非ホジキンリンパ腫などのCD20陽性癌の治療に有用な本発明の製剤を具備する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を具備してなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。製剤又は組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のhu2H7であり、抗体は投薬の下で上記の用量を運搬する量で、シリンジなどの容器に存在する。hu2H7の濃度は、10mg/mlから200mg/mlであり、30〜150mg/ml又は100〜150mg/mlである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に抗体組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。
パッケージ挿入物は、慣習的に治療用製品の市販パッケージに含まれる指示書を指し、効能、使用、用量、投与、禁忌及び/又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含むものである。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられることを示す。
実施例1
rhuMab 2H7の初期皮下製剤
rhuMAb 2H7について高濃度皮下製剤(150mg/mL)を開発した。この製剤は、150mg/mlの2H7、30mM 酢酸ナトリウム;7% トレハロース二水和物;0.03% ポリソルベート20、pH5.3を含む。この製剤は、推奨される条件下での最終的なバイアル貯蔵において長期間安定である。カニクイザルに皮下注射によってこの材料を投与すると、注射部位での重度の炎症と低い生物学的利用能(およそ30%)が生じる。これらの動物において皮下層での軽度から中度のマクロファージ浸潤物が観察された。刺激の原因は、異物材料(すなわち2H7試験材料)によるものであると考えられた。注射部位で生成物が触れたものを刺激した条件下でこの製剤を試験して、タンパク質が生理的条件下で有意に凝集したことを確認し(図1)、カニクイザルで観察された炎症結果を裏付けた。観察された沈殿はpH推移後の塩析効果と一致しうる。
皮下注射の生理的条件下での高分子凝集を試験するためのインビトロ透析方法
インビトロ透析方法を開発して、皮下注射の間に遭遇する生理的条件下での2H7凝集を低減する異なる賦形剤の能力を試験した。このモデルのために変更PBS溶液を開発して、間質液を模擬実験した。このインビトロシステムを用いて、2H7凝集を遅延させる際の糖質、ポリマー、界面活性剤及びアミノ酸の効果を評価した。次いで、インビトロでの生成物放出を示した候補製剤をインビボで試験し(ラット皮下モデル;実施例3を参照)、この改善がインビボでの炎症減少に一致したか否かを決定した。
インビトロ透析モデルのセットアップを図2に示す。250mlのガラス広口瓶に37℃の220mlの変更PBS溶液(167mM ナトリウム、140mM 塩化物、17mM リン酸塩、4mM カリウム)を満たした。6cm長の透析管(Spectra Por 1 Million分子量カットオフ(MWCO) PVDF透析管12mm直径)を純水に浸した。透析管の一端を固定し、管をおよそ1mlの試験試料(試験賦形剤を有する2H7)で満たした。過剰な空気を取り除き、管の他端を広口瓶のシール部分に留めた。満たしたバッグを変更PBS溶液を含む250mlのガラス広口瓶に加え、広口瓶を一定に撹拌しながら37℃に置いた。500μl試料の変更PBS放出培地を、2.5、6、12、24、33及び48時間後に取り除いた。試料の濁度及び放出培地に存在するタンパク質の量を、UV光度測定スキャンにて測定した。さらに、放出培地及び透析管内部の溶液を、沈殿について視覚的に調べた。
・試験賦形剤を有する2H7の累積的な放出が、ネガティブコントロールより大きかった(元の2H7製剤−150mg/mlの2H7、30mM 酢酸ナトリウム;7% トレハロース二水和物;0.03% ポリソルベート20、pH5.3)。これは2H7特徴の改善を示す。
・ポジティブコントロール(RaptivaTM;rhuMAb抗CD11a、皮下に投与される抗体)が沈殿を示さず、ネガティブコントロールより大きな放出を示した。
・2H7の沈殿が減少したか又は取り除かれた。
・放出培地の濁度が低減した。
次いで、許容判定基準に合う候補を、インビボラットモデルにおいて試験し、インビトロでの凝集の遅延がインビボでの炎症の減少と一致したか否かを決定した。
インビトロ透析方法における試験コントロールの代表的な放出プロファイルを図3に示す。このモデルのコントロールを選択し、生理的条件下で、容易に凝集しなかったタンパク質(rhuMAb CD11a)の放出と、一般的に凝集したタンパク質(原物の2H7)の放出をまとめた。2本の放出曲線間の領域は、コントロールと比較したときの、凝集を遅延させる試験賦形剤の相対的な能力を測定する。
元の2H7製剤の累積的な放出は低い(30%未満)。2H7が透析バッグから変更PBS溶液へ放出されたので、放出培地の濁度の増加が観察された。これは、材料がその環境において凝集していたことを示す。24時間以内に透析バッグ内部の広範囲な凝結が観察され、試験開始時の150mg/mLから48時間の試験の終わりには4〜5mg/mLへと2H7濃度の劇的な減少と一致した。これらの所見のすべては、2H7が生理的条件下で容易に凝集することを示す。この所見は、2H7の元の製剤が37℃のガラスバイアルに貯蔵されている場合には観察されない。
これに反して、rhuMAb CD11aは透析バッグから変更PBS溶液へ素早く放出される。試験中ずっと放出培地は透明なままであり、透析バッグ内で凝結は観察されなかった。これは、rhuMAb CD11aが生理的条件下で凝集せず、このモデルのコントロールとして関連することを示す。表3に、放出したタンパク質の割合、放出培地濁度及び凝結の存在をまとめる。
高分子凝集を試験するためのインビボラット皮下モデル
ラット皮下モデルは、皮下炎症の特徴の類似性に基づく関連するモデルである。元の2H7製剤を摂取しているラットの炎症反応は、カニクイザルにおいて観察される炎症反応と一致していた(実施例1を参照)。ヒト免疫グロブリンの免疫組織化学染色は2H7を注入したラット皮膚の切片において陽性であった。これは、炎症の領域での抗体の存在又は持続を示し、被験物質の沈殿により注射部位に炎症が生じたという理論を裏付けるものである。
インビボラットスクリーニングアッセイは以下の通りに行った。
試験又はコントロール製剤(0.25ml)のそれぞれを皮下投与した。投薬の72時間後に動物を検視した。注射部位の皮膚切片を横断し、ホルマリンに固定し、炎症を下げる試験賦形剤の効果を組織学的に測定した。以下のように、炎症スコアを組織切片に割り当てた。
+/-:極小/わずかな炎症
1:軽度の炎症
2:中程度
3:重度
肉芽腫の存在は病理学にて測定した。注射部位からの組織を切片化し、染色し、肉芽腫の有無について光学顕微鏡下で観察した。
インビボラットモデルの許容判定基準は、(1) rhuMAb CD11a(ネガティブコントロール)に相当する炎症、及び(2) 注射部位での肉芽腫の欠如とした。
2H7の凝集を低減させる界面活性剤の能力
界面活性剤は、高分子の凝集を遅延させるために一般に使用される。2H7の凝集及び凝結を低減させる界面活性剤の能力を、実施例2に記載したインビトロモデルを使用して評価した。試験した界面活性剤は、親水−親油性バランス(HLB)の範囲をカバーする。ポリソルベート20、ポロキサマー及びスパン20及び80の界面活性剤の添加は、元の2H7製剤と比較して2H7放出をさほど改善しなかった。ポリソルベート80によってインビトロでの2H7放出の適度な改善が観察されたが、他の試験したいずれの界面活性剤によっても2H7放出の有意な改善は観察されなかった。しかしながら、透析バッグ内の凝結はすべての症例において観察された(表4)。ゆえに、以前からタンパク質凝集を低減するために用いられているが、界面活性剤は、インビトロモデルにおいて2H7の凝集を遅延させることに有効でないことが示された。
2H7の凝集に対するPVPの効果
インビトロモデルにおける2H7の凝集に対するPVPの効果を試験した。使用する材料は以下の通りであった。
・BASF Kollidon 30(重量平均分子量44K−54Kダルトン)
・BASF Kollidon 17 PF(重量平均分子量7K−11Kダルトン)
・BASF Kollidon 12 PF(重量平均分子量2K−3Kダルトン)
・BASF Kollidon 90 F(重量平均分子量1M−1.5Mダルトン)
・スペクトルポリビニルピロリドンK−15(BASF Kollidon 17 PFに相当)
低分子量のPVP(重量平均MW9Kダルトン)の添加により、インビトロモデルにおける2H7の放出が有意に改善した(図4)。透析バッグの大多数の2H7が放出され、その量はrhuMAb CD11aコントロールに相当した。凝結が透析バッグにおいて観察され、放出培地は試験中ずっと透明なままであった。これらすべては、低分子量のPVPが生理的条件下での2H7の凝集を阻害する指標である。使用するPVPの分子量は重要である。高分子量のPVP(重量平均MW1200000ダルトン)の添加により、変更PBS溶液への2H7放出が低減し、透析バッグ内にかなりの凝結が生じた(図4)。
インビボラット皮下モデルにおける炎症に対するPVPの効果
次いで、インビトロ試験において有意な改善を示した低分子量PVP(平均MW9Kダルトン)を含有する抗体製剤を、インビボラット皮下モデルにおいて試験した。この実験の目的は、インビトロ生理的条件下での2H7の凝集を取り除くことが注射部位の炎症の低減につながるか否かを決定することであった。動物モデルの成功判定基準は、(1) rhuMAb CD11a試験コントロールに相当する試験製剤での低い炎症と、(2) 注射部位の肉芽腫の欠如とした。
各々の試験製剤の組織病理学的結果の概要を表6に示す。ネガティブコントロール、rhuMAb CD11a及びタンパク質を含有していない20%のPVPベヒクルは、ごくわずかな皮下炎症を誘導した。元の150mg/mLの2H7製剤の注入を、ポジティブコントロールとして用い、注射部位で中程度から重度(2〜3+)の炎症を引き起こした。2H7に対する5%を超えるPVP(重量平均MW9Kダルトン)の添加は炎症を減少させた。100mg/mLの2H7と10%の最適濃度のPVPは、注射部位の炎症を、成功基準であるネガティブコントロールレベル(+/−)に低減した。炎症の増加は、2H7タンパク質濃度の増加と相関した。高濃度の2H7(150mg/mL)への20%のPVPの添加は、炎症を軽度(1+)にまで有意に低減した。いずれの試験動物でも肉芽腫は観察されなかった。
まとめると、5%〜20%のポリビニルピロリドン(重量平均分子量2Kから54Kダルトン)の添加は、2H7の凝集を有意に低減し、生理的条件下での2H7の凝結を取り除くのに有効であった。PVPと2H7による結果は、PVPの過去の使用を考えると予想外であり、ゆえに、手法の新規性及び進歩性を示す。また、従来タンパク質凝集を低減するために使用された界面活性剤も発明者等のインビトロモデルにおいて評価したが、いずれも2H7の凝集を遅延させることに有効ではなかった。
最終的に、この環境において2H7の凝集を低減することにより、2H7を注射した動物の注射部位での炎症が有意に低減された。この炎症は、10%の低分子量PVPを含んだ2H7製剤では、重度(元の2H7)から極小〜軽度にまで低減した。これらの条件下で凝集するタンパク質の能力を低減すると、生物学的利用能の増加につながりうる。最後に、発明者等は、タンパク質凝集を低減する賦形剤の能力を測定するためのインビトロ透析モデルを成功裏に開発し、その有用性を示した。
特許、公開特許及び他の出版物を含む本明細書中で引用される文献は、出典明記によってここに援用される。
本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学などの、当分野の技術の範囲内である従来の技術を使用する。このような技術は文献において十分に説明されている。例として、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989);Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987 updated);Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991);Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991);Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. eds., Bartlett Publ. 1990);Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990);Recombinant DNA Methodology II (R. Wu et al. eds., Academic Press 1995);PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991);Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984);Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987);Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991);Animal Cell Culture (J. Pollard et al. eds., Humana Press 1990);Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987);Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990);the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M. and Hauser H. (1993);Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996;Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989);Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.);Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al. eds. 1991);Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996);Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988;Antibody Engineering, 2nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995);及び、the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunologyを参照のこと。
Claims (42)
- 大きな高分子の皮下投与の間の注入部位での炎症を最小化する方法であって、高分子を含有する製剤に、2000〜54000ダルトンの分子量を有するポリビニルピロリドン(PVP)を5%〜20%添加することを含む方法。
- 大きな高分子がタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- タンパク質が抗体である、請求項2に記載の方法。
- 抗体が治療用抗体である、請求項3に記載の方法。
- 抗体が診断用抗体である、請求項3に記載の方法。
- 抗体が抗CD20抗体である、請求項3に記載の方法。
- 抗体が、表1に示す抗体変異体A、B、C、D、F、G、H又はIを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:1−15からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:1の軽鎖可変ドメインと配列番号:2の重鎖可変ドメインとを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:3の軽鎖可変ドメインと配列番号:4の重鎖可変ドメインとを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:3の軽鎖可変ドメインと配列番号:5の重鎖可変ドメインとを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:6の完全長軽鎖と配列番号:7の完全長重鎖とを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:6の完全長軽鎖と配列番号:15の完全長重鎖とを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:9の完全長軽鎖と配列番号:10の完全長重鎖とを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:9の完全長軽鎖と配列番号:11の完全長重鎖とを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:9の完全長軽鎖と配列番号:12の完全長重鎖とを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:9の完全長軽鎖と配列番号:13の完全長重鎖とを含む、請求項6に記載の方法。
- 抗体が、配列番号:9の完全長軽鎖と配列番号:14の完全長重鎖とを含む、請求項6に記載の方法。
- 10mg/ml〜200mg/mlの濃度の抗体と、2000〜54000ダルトンの分子量を有する5%〜20%のポリビニルピロリドン(PVP)とを含有してなる、抗体の皮下投与のための薬学的製剤。
- 抗体が30mg/ml〜150mg/mlの濃度で存在する、請求項19に記載の製剤。
- 抗体が100mg/ml〜150mg/mlの濃度で存在する、請求項19に記載の製剤。
- PVPの濃度が10%である、請求項19に記載の製剤。
- PVPの分子量範囲が7000〜11000ダルトンである、請求項19に記載の製剤。
- 100mg/mlのヒト化2H7抗体と、7000〜11000ダルトンの分子量を有する10%のPVPとを含有してなる、請求項19に記載の製剤。
- ヒト化2H7抗体が、表1に示す抗体変異体A、B、C、D、F、G、H又はIを含む、請求項24に記載の製剤。
- 30mM 酢酸ナトリウム;5% トレハロース二水和物;及び0.03% ポリソルベート20、pH5.3を更に含有してなる、請求項24に記載の製剤。
- ヒト化2H7抗体が、表1に示す抗体変異体A、B、C、D、F、G、H又Iを含む、請求項26に記載の製剤。
- CD20陽性B細胞癌の治療方法であって、癌を有する患者に、2000〜54000ダルトンの分子量を有する5%〜20%のポリビニルピロリドン(PVP)を含有してなる薬学的製剤中の、表1のヒト化2H7抗体の治療上有効な量を投与することを含む方法。
- CD20陽性B細胞癌がB細胞リンパ腫又は白血病である、請求項28に記載の方法。
- CD20陽性B細胞癌が、非ホジキンリンパ腫(NHL)、再発性低悪性度NHL及びリツキシマブ抵抗性低悪性度NHL、リンパ球優位型ホジキン病(LPHD)、小リンパ球リンパ腫(SLL)、及び慢性リンパ球性白血病(CLL)からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- ヒト化2H7抗体が、表1の変異体A、B、C、D又はHである、請求項29に記載の方法。
- 自己免疫性疾患の治療方法であって、自己免疫性疾患を有する患者に、2000〜54000ダルトンの分子量を有する5%〜20%のポリビニルピロリドン(PVP)を含有する薬学的製剤中の表1のヒト化2H7抗体の治療上有効量を投与することを含む方法。
- 自己免疫性疾患は、メトトレキセート(Mtx)への応答が不十分である者及びTNFαアンタゴニストへの応答が不十分な者を含む関節リウマチ(RA)及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、例えばループス腎炎、多発性硬化症(MS)、例として再発性寛解多発性硬化症(RRMS)、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgAネフロパシ、IgM多発性神経炎、重症筋無力症、ANCA関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(NMO)及び糸球体腎炎からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
- ヒト化2H7抗体が、表1の変異体A、B、C、D又はHである、請求項33に記載の方法。
- 患者の注射部位での注入による水溶性皮下製剤中の抗体の可溶化を向上又は維持するか又は沈殿を最小化する方法であって、水溶性の皮下製剤に2000〜54000ダルトンの分子量を有する5%〜20%のポリビニルピロリドン(PVP)を添加することを含む方法。
- 抗体が、表1に示すヒト化抗CD20抗体変異体A、B、C、D、F、G、H又はIである、請求項35に記載の方法。
- 皮下に投与される抗体の生物学的利用能を増やす方法であって、抗体を含む水溶性皮下製剤に、2000〜54000ダルトンの分子量を有する5%〜20%のポリビニルピロリドン(PVP)を添加することを含む方法。
- 抗体が、表1に示すヒト化抗CD20抗体変異体A、B、C、D、F、G、H又はIである、請求項37に記載の方法。
- 生理的条件下での抗体又は他の大きな高分子の凝集を低減する賦形剤の能力を評価するためのインビトロ透析方法であって、
(a) 一定に撹拌しながら、37℃で、変更PBS溶液(167mM ナトリウム、140mM 塩化物、17mM リン酸塩、4mM カリウム)に対して試験賦形剤を含む場合と含まない場合の高分子の製剤を透析し、
(b) 変更PBS溶液の試験試料を取り除き、そして、
(c) 濁度及び試験試料中に存在するタンパク質の量を測定することを含み、このとき賦形剤を欠いているコントロールと比較して、試験賦形剤を含むアッセイにおける試料中のタンパク質濃度が増加し濁度が低減している場合に、高分子の凝集を低減する試験賦形剤の能力が示される、方法。 - 製剤が、1000000ダルトン分子量カットオフを有する透析管において透析される、請求項39に記載の方法。
- 試験試料中のタンパク質濃度及び濁度が、UV吸光度測定法を使用して測定される、請求項39に記載の方法。
- 変更PBS培地と沈殿のための透析管内の溶液とを視覚的に調査することをさらに含み、このとき賦形剤を欠いているコントロールと比較して、試験賦形剤を含む透析管において沈殿が減少した場合に、高分子の凝集を低減する試験賦形剤の能力が示される、請求項39に記載の方法。
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