JP2012507289A - Differentiation of human embryonic stem cells into the pancreatic endocrine system - Google Patents

Differentiation of human embryonic stem cells into the pancreatic endocrine system Download PDF

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Abstract

本発明は、多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。具体的には本発明は、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、ＧＤＦ＿８、ＧＤＦ＿１１、又はＧＤＦ＿１５などのＴＥＦ＿β受容体拮抗剤を用いて増加させる方法を提供する。  The present invention provides a method for promoting differentiation of pluripotent stem cells. Specifically, the present invention provides a method for increasing the expression level of a marker associated with the pancreatic endocrine system using a TEF_β receptor antagonist such as activin A, activin B, activin C, GDF_8, GDF_11, or GDF_15. To do.

Description

本発明は、米国特許出願シリアル番号第６１／１１０，２７８号（２００８年１０月３１日出願）に対する優先権を請求する。   The present invention claims priority to US Patent Application Serial No. 61 / 110,278 (filed October 31, 2008).

（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。具体的には本発明は、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法を提供する。 (Field of Invention)
The present invention provides a method for promoting differentiation of pluripotent stem cells. Specifically, the present invention provides a method for increasing the expression level of a marker associated with the pancreatic endocrine system.

Ｉ型糖尿病の細胞置換療法における進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法は、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することである。   Due to advances in cell replacement therapy for type I diabetes and the lack of transplantable islets of Langerhans, attention has been focused on developing a source of insulin producing cells or beta cells suitable for engraftment. One approach is to generate functional β cells from pluripotent stem cells such as, for example, embryonic stem cells.

脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘｌ１、ＣＸＣＲ４及びＳｏｘ−１７などの多くのマーカーを発現する。   In vertebrate embryonic development, pluripotent cells produce a group of cells that contain three germ layers (ectodermal, mesoderm, and endoderm) in a process known as gastrulation. For example, tissues such as thyroid, thymus, pancreas, intestine, and liver develop from the endoderm through an intermediate stage. An intermediate stage in this process is the formation of definitive endoderm. Definitive endoderm cells express many markers such as HNF-3β, GATA4, Mix11, CXCR4 and Sox-17.

膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤｘ１を発現する。ＰＤｘ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤｘ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程となっている。成熟した膵臓は、他の細胞型間で外分泌組織及び内分泌組織を含有する。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。   The formation of the pancreas occurs by the differentiation of definitive endoderm into pancreatic endoderm. Pancreatic endoderm cells express the pancreas-duodenal homeobox gene, PDx1. In the absence of PDx1, the pancreas does not develop beyond the formation of ventral and dorsal buds. Therefore, PDx1 expression is an important step in pancreatic organ formation. The mature pancreas contains exocrine tissue and endocrine tissue among other cell types. Exocrine and endocrine tissues arise from the differentiation of pancreatic endoderm.

島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３８９、２００１年）は、マウスの胚性幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１５７、２０００年）は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。   It has been reported that cells retaining the characteristics of islet cells were derived from mouse embryonic cells. For example, Lumelsky et al. (Science 292: 1389, 2001) report the differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin secretory structures similar to islets. Soria et al. (Diabetes 49: 157, 2000) report that insulin-secreting cells derived from mouse embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-diabetic mice.

一例において、Ｈｏｒｉら（ＰＮＡＳ ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。   In one example, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) disclosed that treating mouse embryonic stem cells with an inhibitor of phosphoinositide 3-kinase (LY294002) resulted in cells similar to β cells. Yes.

他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ １００：９９８、２００３年）が、Ｐａｘ４を構成的に発現しているマウス胚性幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。   In another example, Blyszczuk et al. (PNAS 100: 998, 2003) report the production of insulin-producing cells from mouse embryonic stem cells that constitutively express Pax4.

Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐｄｘ１発現の誘発に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１、２００５年）。   Micallef et al. Report that retinoic acid can control the involvement of embryonic stem cells in the formation of Pdx1-positive pancreatic endoderm. Retinoic acid is most effective in inducing Pdx1 expression when added to the culture medium on day 4 of embryonic stem cell differentiation during the period corresponding to the end of gastrulation in the embryo (Diabetes 54: 301, 2005). Year).

Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現しているマウス胚性幹細胞株を報告している。Ｍｉｙａｚａｋｉらの結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、Ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３：１０３０、２００４年）。   Miyazaki et al. Report a mouse embryonic stem cell line overexpressing Pdx1. The results of Miyazaki et al. Showed that exogenous Pdx1 expression clearly increased the expression of insulin, somatostatin, glucokinase, neurogenin 3, P48, Pax6, and HNF6 genes in the resulting differentiated cells. (Diabetes 53: 1030, 2004).

Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用した場合に認められた。Ｓｋｏｕｄｙ ｅｔ ａｌ．はまた、インスリン及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸により影響されなかったが、３ｎＭのＦＧＦ７による処理によりＰｄｘ１の転写産物のレベルが増大したことも観察している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。   Skudy et al., In mouse embryonic stem cells, activin A (a member of the TGF-β superfamily) upregulates the expression of pancreatic exocrine genes (p48 and amylase) and endocrine genes (Pdx1, insulin and glucagon). Has been reported. The greatest effect was observed when 1 nM activin A was used. Skuddy et al. Also observed that expression levels of insulin and Pdx1 mRNA were not affected by retinoic acid, but treatment with 3 nM FGF7 increased levels of Pdx1 transcripts (Biochem. J. 379: 749, 2004).

Ｓｈｉｒａｋｉらは、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性細胞への分化を特異的に増大させる増殖因子の効果を研究した。彼らは、ＴＧＦ−β２によってＰｄｘ１陽性細胞が高い比率で再現可能に得られたことを観察している（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５ Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６．）。   Shiraki et al. Studied the effects of growth factors that specifically increase the differentiation of embryonic stem cells into Pdx1-positive cells. They observe that TGF-β2 reproducibly obtained a high proportion of Pdx1 positive cells (Genes Cells. 2005 Jun; 10 (6): 503-16.).

Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下で、マウス胚性幹細胞からｂｒａｃｈｙｕｒｙ+／ＨＮＦ−３β+内胚葉細胞が誘導されることを示している（米国特許出願公開２００６／０００３４４６（Ａ１）号）。 Gordon et al. Have shown that brachyury + / HNF-3β + endoderm cells are derived from mouse embryonic stem cells in the absence of serum and in the presence of activin and Wnt signaling inhibitors (US patent). Application Publication 2006/0003446 (A1)).

Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ １０３，ｐ １６８０６，２００６）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。   Gordon et al. (PNAS, Vol 103, p 16806, 2006) state that “simultaneous Wnt and TGF-β / nodal / activin signaling was required for preprimitive streak formation”.

しかしながら、胚性幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒトなどのより高等な哺乳動物における発達プログラムを正確には模倣しない恐れがある。   However, mouse models of embryonic stem cell development may not accurately mimic developmental programs in higher mammals such as, for example, humans.

Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚性幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８年）。同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児性腺組織から、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８）。白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養するのみでも分化を阻止し得るマウス胚性幹細胞とは異なり、ヒト胚性幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１号；同第０１／５１６１６号）。   Thomson et al. Isolated embryonic stem cells from human blastocysts (Science 282: 114, 1998). At the same time, Garhart and co-workers derived human embryonic germ (hEG) cell lines from fetal glandular tissue (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998). Unlike mouse embryonic stem cells that can inhibit differentiation only by culturing with leukemia inhibitory factor (LIF), human embryonic stem cells need to be maintained under very specific conditions (US Pat. No. 6,200, 806, WO 99/20741; 01/51616).

Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓被膜下に移植することにより、一部の内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が得られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、Ｐｄｘ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４（Ａ１）号）。   D'Amour et al. States that enriched cultures of definitive endoderm from human embryonic stem cells were prepared in the presence of high concentrations of activin and low concentrations of serum (Nature Biotechnology 2005). . By transplanting these cells under the kidney capsule of mice, differentiation into more mature cells with characteristics of some endoderm organs was obtained. Definitive endoderm cells derived from human embryonic stem cells can be further differentiated into Pdx1-positive cells after addition of FGF-10 (US Patent Application Publication No. 2005/0266554 (A1)).

Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「我々は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンといった膵臓ホルモンを合成可能な内分泌細胞に転換させる分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。   D'Amour et al. (Nature Biotechnology-24, 1392-1401 (2006)), “We are able to synthesize human embryonic stem cells (hES) and pancreatic hormones such as insulin, glucagon, somatostatin, pancreatic polypeptides and ghrelin. We have developed a differentiation process that transforms into endocrine cells, which direct cells through a stage similar to that of definitive endoderm, intestinal endoderm, pancreatic endoderm and endocrine precursors towards cells expressing endocrine hormones. To mimic pancreatic organ formation in vivo. "

別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７（Ａ１）号）。この場合、分化経路は３つのステージに分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡの組み合わせを用いて内胚葉に分化した。次に細胞をノギンなどのＴＧＦ−βアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンの組み合わせと培養してＰｄｘ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。   In another example, Fisk et al. Report a system that produces islet cells from human embryonic stem cells (US 2006/0040387 (A1)). In this case, the differentiation pathway was divided into three stages. First, human embryonic stem cells were differentiated into endoderm using a combination of sodium butyrate and activin A. The cells are then cultured with a combination of a TGF-β antagonist such as Noggin and EGF or betacellulin to produce Pdx1-positive cells. Terminal differentiation was induced by nicotinamide.

１つの例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、Ｐｄｘ１の過剰発現が膵臓に多く見られる遺伝子の発現を高めたことを結論付ける。インスリン発現の誘導には、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４：１９２３〜１９３０）。   In one example, Benvenistry et al., “We conclude that overexpression of Pdx1 increased the expression of genes commonly found in the pancreas. Induction of insulin expression is accompanied by additional signals that exist only in vivo. May be required "(Benventry et al., Stem Cells 2006; 24: 1923-1930).

したがって、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上の必要性に対処するよう拡張できる、多能性幹細胞株を確立するための条件を開発する有意な必要性が今尚存在する。本発明者らは、膵臓内分泌細胞に向かうヒト胚幹細胞の分化の効率を改善する代替的な手法を採用した。   Therefore, to establish a pluripotent stem cell line that can be expanded to address current clinical needs while maintaining the potential to differentiate into pancreatic endocrine cells, pancreatic hormone-expressing cells, or pancreatic hormone-secreting cells There is still a significant need to develop these conditions. The inventors have taken an alternative approach to improve the efficiency of human embryonic stem cell differentiation towards pancreatic endocrine cells.

一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞を分化させるための方法を提供し、この方法は、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む。 In one embodiment, the present invention provides a method for differentiating pluripotent stem cells, comprising:
a. Culturing pluripotent stem cells;
b. Differentiating pluripotent stem cells into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system;
c. Differentiating cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system;
d. Differentiating a cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm system into a cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endocrine system.

一実施形態では、本発明は、膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法を提供し、本方法は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のＴＧＦ−β受容体作動剤を含む培地で処理することで、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させることを含む。   In one embodiment, the present invention provides a method of increasing the expression level of a marker associated with the pancreatic endocrine system, the method comprising a sufficient amount of cells expressing a marker characteristic of the pancreatic endocrine system. Treatment with a medium containing a TGF-β receptor agonist of the above, thereby increasing the expression level of a marker associated with the pancreatic endocrine system.

本発明で採用される分化プロトコルの概要を示す。The outline | summary of the differentiation protocol employ | adopted by this invention is shown. 本発明で採用される分化プロトコルの様々なステージに関連付けられるマーカーの、発現量を示す。パネルａ）は、ステージ１へと分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞のＦＡＣＳにより測定されたものとして、ＣＸＣＲ４の発現量を示す。パネルｂ）は、ステージ１へと分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞のリアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして、ステージ１に関連付けられるマーカーの発現量を示す。The expression levels of markers associated with various stages of the differentiation protocol employed in the present invention are shown. Panel a) shows the expression level of CXCR4 as measured by FACS of human embryonic stem cell line H1 cells differentiated to stage 1. Panel b) shows the expression level of the marker associated with stage 1 as measured by real-time PCR of human embryonic stem cell line H1 cells differentiated to stage 1. 本発明で採用した分化プロトコルのステージ６へと分化させ、次いでアクチビンＡで処理（ステージ７）したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の、ジチゾン染色を示す。パネルａ）は、４０μｍセルストレイナーで濾過する前にジチゾンで染色した細胞の位相差顕微鏡写真を示す。パネルｂ）は、４０μｍセルストレイナーにより濾過された、ジチゾン染色した細胞の位相差顕微鏡写真を示す。パネルｃ）は、４０μｍセルストレイナーにより濾過されなかった、ジチゾン染色した細胞の位相差顕微鏡写真を示す。FIG. 2 shows dithizone staining of human embryonic stem cell line H1 cells differentiated to stage 6 of the differentiation protocol employed in the present invention and then treated with activin A (stage 7). Panel a) shows a phase contrast micrograph of cells stained with dithizone before filtering with a 40 μm cell strainer. Panel b) shows a phase contrast micrograph of dithizone-stained cells filtered through a 40 μm cell strainer. Panel c) shows a phase contrast micrograph of dithizone-stained cells that were not filtered by a 40 μm cell strainer. リアルタイムＰＣＲにより測定されるものとして、本発明で採用された分化プロトコルのステージ６へと分化させ、実施例２に記載の方法に従ってステージ６へと分化させた後にアクチビンＡで処理したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞での、ｐｄｘ−１（パネルａ）、ｎｋｘ６−１（パネルｂ）、Ｐａｘ４（パネルｃ）、ｎｋｘ２．２（パネルｄ）、インスリン（パネルｅ）及びグルカゴン（パネルｆ）の発現量を示す。As measured by real-time PCR, human embryonic stem cells treated with activin A after differentiation into stage 6 of the differentiation protocol employed in the present invention, differentiation into stage 6 according to the method described in Example 2 Expression levels of pdx-1 (panel a), nkx6-1 (panel b), Pax4 (panel c), nkx2.2 (panel d), insulin (panel e) and glucagon (panel f) in the strain H1 cells Indicates.

開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。   For clarity of disclosure, the following detailed description of the present invention, without limiting the present invention, is intended to describe or illustrate specific features, embodiments, or applications of the present invention. Divide into items.

定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。 Definition Stem cells are undifferentiated cells defined by their ability to self-renew at a single cell level and differentiate to produce progeny cells. Progeny cells include self-renewing progenitor cells, non-regenerative cells Progenitor cells and terminally differentiated cells are included. Stem cells also give rise to multiple germ layer tissues in vitro and the ability to differentiate into functional cells of various cell lines from multiple germ layers (endoderm, mesoderm and ectoderm) and into blastocysts It is also characterized by the ability to provide most if not all tissue after injection.

幹細胞は、発生上の能力によって、（１）全ての胚性又は胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、（２）全ての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化万能性、（３）細胞系のサブセットを生ずる能力を有するが、それらが全て特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような、分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び、血液の通常の成分である全ての細胞種及び要素（例えば、血小板）を生じうる）、（４）多能性幹細胞よりも限定された細胞系のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性、及び（５）単一の細胞系（例えば、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する、分化単一性に分類される。   Stem cells have, by virtue of developmental capacity, (1) totipotency, meaning that they have the ability to generate all embryonic or extraembryonic cell types, and (2) the ability to generate all embryonic cell types. Pluripotency, meaning to have, (3) pluripotency (eg, having the ability to generate a subset of cell lines, all of which are of a particular tissue, organ, or physiological system) , Hematopoietic stem cells (HSC) can give rise to HSC (self-renewal), blood cell-restricted competent progenitors, and all cell types and elements that are normal components of blood (eg, platelets)), 4) differentiation competence, meaning having the ability to generate a more limited subset of cell lines than pluripotent stem cells, and (5) the ability to generate single cell lines (eg, spermatogonial stem cells). Means to have, minutes It is classified into a single property.

分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化していない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわち、その細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。   Differentiation is the process by which non-specialized (“neutral”) or relatively unspecialized cells acquire the characteristics of specialized cells such as, for example, nerve cells or muscle cells. A cell that has differentiated or has been induced to differentiate is a cell that exhibits a more specialized ("tilted") situation within a cell line. The term “tilted” when applied to a differentiation process is a progression to a point of a differentiation pathway that continues to differentiate into a specific cell type or a subset of cell types under normal circumstances, and different cells under normal circumstances. Refers to a cell that has differentiated into a type or cannot return to a less differentiated cell type. Dedifferentiation refers to the process of returning a cell to a situation that is relatively specialized (or not tilted) within the cell line. As used herein, a cell line defines the inheritance of a cell, that is, from which cell it originated and which cell it can produce. Cell lines place cells within a genetic scheme of development and differentiation. A system-specific marker refers to a feature that is specifically associated with the phenotype of a cell of the subject system and can be used in assessing the differentiation of neutral cells into the subject system.

「β−細胞系」は、転写因子ＰＤＸ−１、及び以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも１つについて遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞を含む。   “Β-cell line” includes transcription factor PDX-1, and the following transcription factors: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 β, MAFA, Pax4, and It refers to cells that are positive for gene expression for at least one of Pax6. Cells expressing markers characteristic of the β cell line include β cells.

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」、又は「ステージ１細胞」、又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。   As used herein, “cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system”, or “stage 1 cells”, or “stage 1” refers to the following markers: SOX-17 , GATA-4, HNF-3β, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-like homeobox protein, FGF4 CD48, eomedermin (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99 or Refers to a cell expressing at least one of OTX2. Examples of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system include primitive streak precursor cells, primitive streak cells, mesendoderm cells, and definitive endoderm cells.

本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１ α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。   As used herein, “cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system” refer to the following markers: PDX-1, HNF-1β, PTF-1α, HNF-6, or Refers to a cell that expresses at least one of HB9. Examples of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system include pancreatic endoderm cells, gastrointestinal cells, and posterior foregut cells.

本明細書で使用するとき、「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞」、又は「ステージ５細胞」、又は「ステージ５」とは、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１ αのうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系の細胞が挙げられる。   As used herein, “cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system” or “stage 5 cells” or “stage 5” refer to the following markers: NGN-3, NeuroD, It refers to a cell that expresses at least one of Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, or PTF-1α. Examples of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system include pancreatic endocrine cells, pancreatic hormone-expressing cells and pancreatic hormone-secreting cells, and β-cell lineage cells.

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーを発現する：ＨＮＦ−３ β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１。   As used herein, “definitive endoderm” refers to cells that originate from the upper blastoder layer during gastrulation and retain the characteristics of the cells forming the gastrointestinal tract and its derivatives. Definitive endoderm cells express the following markers: HNF-3β, GATA-4, SOX-17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99, and Mix11.

本明細書で使用するとき、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣのうちの少なくとも１つを発現する細胞の集団を指す。   As used herein, “extraembryonic endoderm” refers to a population of cells that express at least one of the following markers: SOX-7, AFP, and SPARC.

本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。   As used herein, a “marker” is a nucleic acid or polypeptide molecule that is differentially expressed in a cell of interest. In this context, differential expression means an increase in the level of positive markers and a decrease in the level of negative markers. The detectable level of the marker nucleic acid or polypeptide is sufficiently high or low in the cell of interest compared to other cells, and thus can be determined using any of a variety of methods known in the art. Cells can be identified and distinguished from other cells.

本明細書で使用するとき、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカー、すなわち、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。   As used herein, a “mesendoderm cell” is one of the following markers: CD48, eomedermin (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 β, GSC, FGF17, GATA-6. Refers to a cell that expresses at least one.

本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す。   As used herein, “pancreatic endocrine cell” or “pancreatic hormone-expressing cell” means expressing at least one of the following hormones: insulin, glucagon, somatostatin, and pancreatic polypeptide. It refers to a cell that can.

本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉細胞」、又は「ステージ４細胞」、又は「ステージ４」とは、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＰＡＸ−４又はＮＫＸ２．２のうちの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す。   As used herein, “pancreatic endoderm cells” or “stage 4 cells” or “stage 4” refers to the following markers: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, Refers to a cell capable of expressing at least one of PAX-4 or NKX2.2.

本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン産生細胞」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを産生することができる細胞を指す。   As used herein, “pancreatic hormone producing cell” refers to a cell capable of producing at least one of the following hormones: insulin, glucagon, somatostatin, and pancreatic polypeptide.

本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン分泌細胞」、又は「ステージ６細胞」、又は「ステージ６」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。   As used herein, “pancreatic hormone secreting cell” or “stage 6 cell” or “stage 6” means at least one of the following hormones: insulin, glucagon, somatostatin, and pancreatic polypeptide. Refers to a cell that can secrete one.

本明細書で使用するとき、「前腸後部細胞」、又は「ステージ３細胞」、又は「ステージ３」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１、ＰＴＦ−１Ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ−９、ＰＲＯＸ−１のうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。   As used herein, “posterior foregut cells” or “stage 3 cells” or “stage 3” refers to the following markers: PDX-1, HNF-1, PTF-1A, HNF− 6, refers to a cell capable of secreting at least one of HB-9, PROX-1.

本明細書で使用するとき、「前原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。   As used herein, “preprimitive streak cells” refers to cells that express at least one of the following markers: Nodal, or FGF8.

本明細書で使用するとき、「原始腸管細胞」、又は「ステージ２細胞」、又は「ステージ２」とは、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ−１、又はＨＮＦ−４Ａのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。   As used herein, “primitive gut cell”, or “stage 2 cell”, or “stage 2” refers to at least one of the following markers: HNF-1 or HNF-4A. Refers to cells that can be secreted.

本明細書で使用するとき、「原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。   As used herein, “primitive streak cells” refers to cells that express at least one of the following markers: Brachyury, Mix-like homeobox protein, or FGF4.

多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーを発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．））によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、一般にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現する。 Isolation, proliferation and culture of pluripotent stem cells Characterization of pluripotent stem cells Pluripotent stem cells are one or more of stage-specific embryonic antigens (SSEA) 3 and 4, and Tra-1-60 and Tra-1- A marker detectable by an antibody called 81 can be expressed (Thomson et al., Science 282: 1145, 1998). When pluripotent stem cells are differentiated in vitro, the expression of SSEA-4, Tra-1-60, and Tra-1-81 is lost (if present) and the expression of SSEA-1 is increased. Undifferentiated pluripotent stem cells usually have alkaline phosphatase activity, after fixing the cells with 4% paraformaldehyde, substrate the Vector Red as described by the manufacturer (Vector Laboratories (Burlingame Calif.)) Can be detected by developing. Undifferentiated pluripotent stem cells also generally express Oct-4 and TERT, as detected by RT-PCR.

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉のすべての細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚細胞層からの細胞種の証拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。   Another desirable phenotype of expanded pluripotent stem cells is the ability to differentiate into all three germ layers of endoderm, mesoderm, and ectoderm tissue. The pluripotency of pluripotent stem cells is determined, for example, by injecting the cells into severe combined immunodeficiency (SCID) mice, fixing the teratoma formed with 4% paraformaldehyde, and Can be confirmed by histological examination for evidence of cell types. Alternatively, pluripotency can be determined by forming embryoid bodies and evaluating the embryoid bodies for the presence of markers associated with the three germ layers.

増殖した多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、これは細胞が正倍数体であることを意味し、全ヒト染色体が存在し、かつ、著しく変更されてはいない。   Proliferated pluripotent stem cell lines can be karyotyped using standard G-band methods and compared to the established primate karyotype. It is desirable to obtain cells with a “normal karyotype”, which means that the cells are euploid, all human chromosomes are present and not significantly altered.

多能性幹細胞の源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞等）、胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。 Sources of pluripotent stem cells The types of pluripotent stem cells that can be used include pre-embryonicity collected at any time during pregnancy (although not necessarily, usually before about 10-12 weeks of gestation). Included are cell lines of pluripotent cells derived from tissues formed after pregnancy, such as tissues (eg, blastocysts), embryonic tissues, fetal tissues, and the like. Non-limiting examples are human embryonic stem cells or established embryos of human embryonic germ cells, such as human embryonic stem cell lines H1, H7, and H9 (WiCell). It is also envisaged to use the compositions of the present disclosure during the initial establishment or stabilization of those cells, in which case the source cell is a primary pluripotent cell harvested directly from the source tissue. Also suitable are cells harvested from a pluripotent stem cell population already cultured in the absence of feeder cells. For example, mutant human embryonic stem cell lines such as BG01v (BresaGen, Athens, GA) are also suitable.

一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）に記載されているように生成される。   In one embodiment, human embryonic stem cells are prepared by Thomson et al. (US Pat. No. 5,843,780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad.Sci.U.S.A. 92: 7844, 1995).

多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞は、一般にフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を基本的に含まないにも関わらず、細胞を実質的に分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するような培養システム中で培養する。フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、あらかじめ他の細胞種を培養することにより条件づけした培地を使用して支持される。あるいはフィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、合成培地を使用して支持される。 Culture of pluripotent stem cells In one embodiment, pluripotent stem cells are generally cultured on a layer of feeder cells that support the pluripotent stem cells in a variety of ways. Alternatively, pluripotent stem cells are cultured in a culture system that supports the growth of pluripotent stem cells without essentially differentiating the cells despite essentially no feeder cells. Proliferation without differentiation of pluripotent stem cells in feeder cell-free culture is supported using media previously conditioned by culturing other cell types. Alternatively, proliferation without differentiation of pluripotent stem cells in feeder cell-free culture is supported using a synthetic medium.

例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）は、マウス胚性繊維芽フィーダー細胞層を用いてヒト胚盤胞からの多能性幹細胞系を培養することについて開示している。   For example, Rebinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) and Thompson et al. (Science 6 Novel 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1451 to 1147) have mouse embryonic fibroblast feeder cell layers. And culturing pluripotent stem cell lines from human blastocysts.

Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１種類の異なるヒトの成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力の評価を行っている。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、「成人の皮膚線維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。   Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003) are evaluating the ability to support the culture of human pluripotent stem cells for 11 different human adult, fetal, and neonatal feeder cell layers. Richards et al. States that "The human embryonic stem cell line cultured on adult dermal fibroblast feeder cells has the morphology of human embryonic stem cells and maintains pluripotency."

米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、無フィーダー細胞培養中で霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、この細胞系の１次フィーダー細胞層としての使用を更に開示している。   US Patent Publication No. 20020072117 discloses a cell line that produces a medium that supports the growth of primate pluripotent stem cells in feeder-free cell culture. The cell lines used are mesenchymal and fibroblast-like cell lines obtained from embryonic tissue or differentiated from embryonic stem cells. US 20020072117 further discloses the use of this cell line as a primary feeder cell layer.

別の例として、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でヒト多能性幹細胞を長期にわたって増殖させるための方法を開示している。   As another example, Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) discloses a method for proliferating human pluripotent stem cells over a long period on a feeder cell layer derived from human embryonic stem cells.

別の例として、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自然分化により誘導されたフィーダー細胞システムを開示している。   As another example, Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) discloses a feeder cell system induced by spontaneous differentiation of human embryonic stem cells.

更なる別の例として、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。   As yet another example, Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004) discloses a source of feeder cells obtained from the human placenta.

Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６、２００３年）は、ヒト***に由来するフィーダー細胞層を開示している。   Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) disclose a feeder cell layer derived from human foreskin.

別の例として、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒトの出生直後産児の***線維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。   As another example, Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) discloses a feeder cell layer obtained from human forensic foreskin fibroblasts.

米国特許第６６４２０４８号は、無フィーダー細胞培養中での霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。   U.S. Pat. No. 6,642,048 discloses media that support the growth of primate pluripotent stem (pPS) cells in feeder-free cell culture, and cell lines useful for the production of such media. US Pat. No. 6,642,048, “The present invention includes mesenchymal and fibroblast-like cell lines obtained from embryonic tissue or differentiated from embryonic stem cells. The present disclosure induces such cell lines. Describes and illustrates a method for preparing a medium and growing stem cells using this conditioned medium. "

別の例として、国際公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための条件培地を開示している。国際公開第２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて製造される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と称される分化及び不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化される」と述べている。   As another example, WO2005014799 discloses a conditioned medium for the maintenance, growth and differentiation of mammalian cells. WO 2005014799 states, “The medium produced according to the present invention is conditioned by the cell secretory activity of mouse cells, in particular differentiated and immortalized transgenic hepatocytes called MMH (Met mouse hepatocytes). "

別の例として、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られた馴化培地を開示している。   As another example, Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004) disclose conditioned media obtained from human embryonic stem cell-derived cells that have been genetically modified to overexpress human telomerase reverse transcriptase. ing.

別の例において、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための合成培地を開示している。   In another example, US Patent Application Publication No. 2007010011 discloses a synthetic medium for maintaining pluripotent stem cells.

代替的な一培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生を誘発することが可能な異なる増殖因子を添加した非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持された、無フィーダー細胞かつ無血清の培養システムを開示している。   An alternative culture system uses a serum-free medium supplemented with growth factors that can promote the growth of embryonic stem cells. For example, Cheon et al. (BioReprod DOI: 10.1095 / bioreprod. 105.046870, October 19, 2005), unconditioned serum supplementation (SR) supplemented with different growth factors capable of inducing self-renewal of embryonic stem cells. ) Disclosed is a feeder-free and serum-free culture system in which embryonic stem cells are maintained in the medium.

別の例において、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、線維芽細胞又は馴化培地の非存在下で、ｂＦＧＦを添加した培地を使用して、胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。   In another example, Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) uses a medium supplemented with bFGF in the absence of fibroblasts or conditioned medium for a long-term culture of embryonic stem cells. Is disclosed.

別の例において、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、血清及び繊維芽細胞フィーダー細胞方法を含まない合成培地中でのヒト胚幹細胞の培養方法を開示し、同方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代替物を含有する培地中で細胞を培養し、この培地は、本質的に哺乳動物胎児血清を含有せず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有し、ここで増殖因子は、線維芽細胞フィーダー層のみでなく他の源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は馴化培地なしで、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。   In another example, US Patent Publication No. 20050148070 discloses a method of culturing human embryonic stem cells in a synthetic medium that does not include serum and fibroblast feeder cell methods, comprising: albumin, amino acid, vitamin, Cells are cultured in a medium containing mineral, at least one transferrin or transferrin substitute, at least one insulin or insulin substitute, which medium is essentially free of mammalian fetal serum and fibroblast proliferation Contains at least about 100 ng / mL fibroblast growth factor capable of activating factor signaling receptors, where growth factor is supplied not only from the fibroblast feeder layer but also from other sources, and the medium is feeder cells Or, in the absence of conditioned medium, supported proliferation of undifferentiated stem cells.

別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養おいて、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の各々とを含有する。   In another example, US Patent Application Publication No. 200502233446 discloses a synthetic medium useful for culturing stem cells containing undifferentiated primate primordial stem cells. In solution, the medium is substantially isotonic compared to the cultured stem cells. In a given culture, a particular medium contains a basal medium and an amount of each of bFGF, insulin, and ascorbic acid necessary to support the growth of substantially undifferentiated progenitor stem cells.

別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「１つの実施形態において、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基礎培地を含む細胞培地を提供する。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な栄養素血清、並びに、フィーダー細胞、及びフィーダー細胞から誘導される細胞外基質成分からなる群から選択される基質と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びに、ヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む。」と述べている。   As another example, U.S. Pat. No. 6,800,600 states, “In one embodiment, a cell culture medium for growing primate-derived primate stem cells that are substantially undifferentiated, comprising: A cell culture medium comprising a low osmotic, low endotoxin basal medium that is effective in supporting growth, wherein the basal medium is a nutrient serum effective in supporting the growth of primate-derived primordial stem cells, And a substrate selected from the group consisting of a feeder cell and an extracellular matrix component derived from the feeder cell, wherein the medium further comprises a non-essential amino acid, an antioxidant, and a group consisting of nucleoside and pyruvate. A first growth factor selected from: ".

別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「１つの態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳動物の胎児血清を基本的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも基本的に含まない）培養中で、単に繊維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい１つの形態では、充分な量の繊維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた繊維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる。」と述べている。   In another example, U.S. Patent Application Publication No. 20050244942 states, “In one aspect, the invention provides a method of culturing primate embryonic stem cells. Essentially free of mammalian fetal serum (preferably Is essentially free of any animal serum), and is cultured in the presence of fibroblast growth factor supplied from a source other than the fibroblast feeder cell layer in culture. By adding a sufficient amount of fibroblast growth factor, the need for a fibroblast feeder cell layer that was conventionally required to maintain stem cell culture is eliminated. "

更なる例として、国際特許出願公開第２００５０６５３５４号は、基本的に無フィーダー細胞かつ無血清の合成等張培地であって、ａ．基礎培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のｂＦＧＦ、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のインスリン、及びｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のアスコルビン酸、を含む培地を開示している。   As a further example, International Patent Publication No. 2005065354 is essentially a feeder-free and serum-free synthetic isotonic medium comprising: a. Basal medium, b. A sufficient amount of bFGF to support the growth of substantially undifferentiated mammalian stem cells, c. A sufficient amount of insulin to support the growth of substantially undifferentiated mammalian stem cells, and d. A medium containing an amount of ascorbic acid sufficient to support the growth of substantially undifferentiated mammalian stem cells is disclosed.

別の例として、国際公開第２００５０８６８４５号は、幹細胞を、細胞を未分化な状態に維持するのに十分な量の、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリータンパク質のメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリータンパク質のメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間曝露することを含む、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示している。   As another example, WO2005086845 describes a sufficient amount of stem cells to maintain the cells in an undifferentiated state, a member of the transforming growth factor beta (TGF-beta) family protein, fibroblast proliferation. Disclosed is a method for maintaining undifferentiated stem cells comprising exposing to a member of a factor (FGF) family protein, or nicotinamide (NIC) for a time sufficient to achieve a desired result.

多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態では、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。   Pluripotent stem cells can be seeded on a suitable culture substrate. In one embodiment, suitable culture substrates are extracellular matrix components such as those derived from the basement membrane or those that can form part of an adhesion molecule receptor-ligand bond. In one embodiment, a suitable culture substrate is MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® is a soluble formulation from Engelbreth-Holm Swarm tumor cells that gels at room temperature to form a reconstituted basement membrane.

他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。   Other extracellular matrix components and component mixtures are suitable as an alternative. Depending on the cell type being grown, this may include laminin, fibronectin, proteoglycan, entactin, heparan sulfate, and the like, alone or in various combinations.

多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な分布にて播かれてもよい。これら全特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益を得、当業者は容易に決定することができる。   Pluripotent stem cells may be seeded in a suitable distribution on the substrate in the presence of a medium that promotes cell survival, proliferation, and maintenance of desired characteristics. All these features benefit from meticulous attention to the sowing distribution and can be readily determined by one skilled in the art.

好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基礎培地、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１５０３９−０２７；非不可欠アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１３２５６−０２９などから調製することができる。   Suitable media include the following ingredients, such as Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Gibco No. 11965-092; Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (KO DMEM), Gibco No. 10829-018; Ham F12 / 50% DMEM basal medium, 200 mM L-glutamine, Gibco No. 15039-027; non-essential amino acid solution, Gibco No. 11140-050; β-mercaptoethanol, Sigma No. 11 M7522; human recombinant basic fibroblast growth factor (bFGF), Gibco No. It can be prepared from 13256-029 or the like.

多能性幹細胞からの膵臓ホルモン産生細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞を作製するための方法を提供し、かかる方法は、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む。 Formation of Pancreatic Hormone Producing Cells from Pluripotent Stem Cells In one embodiment, the present invention provides a method for making pancreatic hormone producing cells from pluripotent stem cells, such methods comprising:
a. Culturing pluripotent stem cells;
b. Differentiating pluripotent stem cells into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system;
c. Differentiating cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system;
d. Differentiating a cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm system into a cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endocrine system.

本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン産生細胞である。別の態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｐｄｘ１、並びに以下の転写因子、すなわちＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４及びＰａｘ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。   In one embodiment of the present invention, the pancreatic endocrine cell is a pancreatic hormone-producing cell. In another aspect, the pancreatic endocrine cell is a cell that expresses a marker characteristic of the beta cell line. Cells expressing markers characteristic of the β cell line are Pdx1, as well as the following transcription factors: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 β, MAFA, Express at least one of Pax4 and Pax6. In one aspect of the invention, the cell expressing a marker characteristic of the β cell line is a β cell.

本発明での使用に好適な多能性幹細胞としては、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、すなわちＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も本発明での使用に適している。   Examples of pluripotent stem cells suitable for use in the present invention include human embryonic stem cell line H9 (NIH code: WA09), human embryonic stem cell line H1 (NIH code: WA01), and human embryonic stem cell line H7 (NIH). code: WA07), and human embryonic stem cell line SA002 (Cellartis, Sweden). The following markers characteristic of pluripotent cells: ABCG2, clipto, CD9, FoxD3, connexin 43, connexin 45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4 , Tra1-60, Tra1-81 expressing cells are also suitable for use in the present invention.

胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。   Markers characteristic of the definitive endoderm system are SOX-17, GATA4, Hnf-3β, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-like homeobox protein, FGF4 CD48, omesodermin (EOMES), DKK4, FGF17, It is selected from the group consisting of GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, and OTX2. Suitable for use in the present invention are cells expressing at least one of the markers characteristic of the definitive endoderm system. In one embodiment of the present invention, the cell expressing a marker characteristic of the definitive endoderm system is a primitive streak precursor cell. In another embodiment, the cell expressing a marker characteristic of the definitive endoderm system is a mesendoderm cell. In another embodiment, the cell expressing a marker characteristic of the definitive endoderm system is a definitive endoderm cell.

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。   Markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage are selected from the group consisting of Pdx1, HNF-1β, PTF1a, HNF-6, HB9 and PROX1. Suitable for use in the present invention are cells expressing at least one marker exhibiting features of the pancreatic endoderm system. In one embodiment of the present invention, the cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm system is a pancreatic endoderm cell.

膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、及びＰＴＦ−１ αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。代替的に、膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。   Markers characteristic of the pancreatic endocrine system are selected from the group consisting of NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, and PTF-1α. In one embodiment, pancreatic endocrine cells can express at least one of the following hormones: insulin, glucagon, somatostatin, and pancreatic polypeptide. Suitable for use in the present invention are cells that express at least one marker that is characteristic of the pancreatic endocrine system. In one embodiment of the present invention, the cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endocrine system is a pancreatic endocrine cell. The pancreatic endocrine cell may be a pancreatic hormone-expressing cell. Alternatively, pancreatic endocrine cells may be pancreatic hormone secreting cells.

本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１、並びに以下の転写因子、すなわちＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４及びＰａｘ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。   In one aspect of the invention, pancreatic endocrine cells are cells that express markers characteristic of the β cell line. Cells expressing markers characteristic of the β cell line are Pdx1, and the following transcription factors: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 β, MAFA, Pax4 and Expresses at least one of Pax6. In one aspect of the invention, the cell expressing a marker characteristic of the β cell line is a β cell.

胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。 Formation of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system Pluripotent stem cells can be identified by any method in the art or any method proposed in the present invention. You may differentiate into the cell to express.

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells that express markers characteristic of the definitive endoderm system according to the method disclosed in D'Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).

例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２（２００４）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells that express markers characteristic of the definitive endoderm system according to the method disclosed in Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004).

例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells that express markers characteristic of the definitive endoderm system according to the method disclosed in McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007).

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells can be differentiated into cells that express markers characteristic of the definitive endoderm system according to the method disclosed in D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。   For example, pluripotent stem cells are cultured in a medium containing activin A in the absence of serum, then the cells are cultured with activin A and serum, and then the cells are activated with activin A and different concentrations of serum. Can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system. An example of this method is disclosed in Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).

例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡと、別の濃度の血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５に開示されている。   For example, pluripotent stem cells are embryos by culturing pluripotent stem cells in the absence of serum in a medium containing activin A, and then culturing the cells with activin A in the presence of another concentration of serum. It can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the endoderm system. An example of this method is disclosed in D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2005.

例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去し、細胞をアクチビンＡと、血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。   For example, pluripotent stem cells are cultured in a medium containing activin A and Wnt ligand in the absence of serum, then the pluripotent stem cells are removed and the cells are removed in the presence of activin A and serum. By culturing, the cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system. An example of this method is disclosed in Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells are available from LifeScan, Inc. Can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system by treating pluripotent stem cells according to the method disclosed in US patent application Ser. No. 11 / 736,908 assigned to.

例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells are available from LifeScan, Inc. Can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system by treating pluripotent stem cells according to the method disclosed in US patent application Ser. No. 11 / 779,311 assigned to.

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells are differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system by treating the pluripotent stem cells according to the method disclosed in US Patent Application No. 60 / 990,529. Can do.

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells are differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system by treating the pluripotent stem cells according to the method disclosed in US Patent Application No. 61 / 076,889. Can do.

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９００号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells are differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system by treating the pluripotent stem cells according to the method disclosed in US Patent Application No. 61 / 076,900. Can do.

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells are differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system by treating the pluripotent stem cells according to the method disclosed in US Patent Application No. 61 / 076,908. Can do.

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９１５号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。   For example, pluripotent stem cells are differentiated into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system by treating the pluripotent stem cells according to the method disclosed in US Patent Application No. 61 / 076,915. Can do.

胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にかかるマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。 Differentiation of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system The formation of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system was tested for the presence of the marker before and after the following specific protocols: Can be determined. Pluripotent stem cells generally do not express such markers. Thus, differentiation of pluripotent cells is detected when the cells start their expression.

分化効率は、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより測定することができる。   Differentiation efficiency is measured by exposing the treated cell population to drugs (such as antibodies) that specifically recognize protein markers expressed by cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system. Can do.

培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。   Methods for assessing the expression of protein and nucleic acid markers in cultured or isolated cells are standard techniques in the art. These include quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), Northern blotting, in situ hybridization (see, eg, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 2001 supplement)), and immune tissue of section material. Flow cytometric analysis (FACS) (eg, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory) for immunoassays such as anatomical analysis, Western blots, and markers that can reach intact cells. Press (1998)).

多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。例えば、多能性幹細胞マーカーとしては以下の：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１の１種以上の発現が挙げられる。   The characteristics of pluripotent stem cells are well known to those skilled in the art, and further characteristics of pluripotent stem cells are continually identified. For example, the pluripotent stem cell markers are as follows: ABCG2, clipto, FoxD3, connexin 43, connexin 45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, One or more types of expression of Tra1-81 can be mentioned.

多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４などのタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。   After treating the pluripotent stem cells with the method of the present invention, the treated cell population is specifically expressed by a cell marker expressing a marker characteristic of the definitive endoderm system, for example, a protein marker such as CXCR4. Differentiated cells can be purified by exposure to a recognizing agent (such as an antibody).

膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。 Formation of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system Cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system may be any method in the art or any of those proposed in the present invention. The method can differentiate into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system.

例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。   For example, cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage are characterized by the pancreatic endoderm lineage according to the method disclosed in D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006). It can be differentiated into cells expressing the marker.

例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化させられる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。   For example, a cell expressing a marker characteristic of the definitive endoderm system is expressed as a cell that expresses a marker characteristic of the definitive endoderm system as a fibroblast growth factor and a hedgehog signaling pathway inhibitor KAAD. -After treatment with cyclopamine, by removing the medium containing fibroblast growth factor and KAAD-cyclopamine and subsequently culturing the cells in a medium containing retinoic acid, fibroblast growth factor and KAAD-cyclopamine The cells are further differentiated into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system. An example of this method is disclosed in Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は更に、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に記載の方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で一定時間処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化する。   In one aspect of the present invention, cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system may further comprise LifeScan, Inc. Cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system for a period of time with retinoic acid and at least one fibroblast growth factor according to the method described in US patent application Ser. No. 11 / 736,908 assigned to By treatment, the cells differentiate into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system.

本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は更に、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に記載の方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で一定時間処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化する。   In one aspect of the present invention, cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system may further comprise LifeScan, Inc. Cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system for a period of time with retinoic acid and at least one fibroblast growth factor according to the method described in US patent application Ser. No. 11 / 779,311 assigned to By treatment, the cells differentiate into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system.

本発明の１つの態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第６０／９９０，５２９号に記載の方法に従って処理することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を更に分化させる。   In one aspect of the invention, the cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage are treated according to the method described in US Patent Application No. 60 / 990,529 to characterize the pancreatic endoderm lineage. The cells expressing a marker characteristic of the definitive endoderm system are further differentiated into cells expressing a specific marker.

膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系に特異的なマーカーとしては、例えば、Ｈｌｘｂ９、ＰＴＦ−１ａ、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−６、ＨＮＦ−１βなどの転写因子の１つ以上のものの発現が挙げられる。 Detection of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system Markers characteristic of the pancreatic endoderm system are well known to those skilled in the art, and additional markers that are characteristic of the pancreatic endoderm system are continually identified. Has been. These markers can be used to confirm that cells treated according to the present invention have differentiated and acquired properties indicative of pancreatic endoderm lineage. Examples of markers specific to the pancreatic endoderm system include expression of one or more transcription factors such as Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, and HNF-1β.

分化効率は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、処理した細胞集団を曝露することにより測定することができる。   Differentiation efficiency is measured by exposing the treated cell population to agents (such as antibodies) that specifically recognize protein markers expressed by cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system. Can do.

培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。   Methods for assessing the expression of protein and nucleic acid markers in cultured or isolated cells are standard techniques in the art. These include quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), Northern blotting, in situ hybridization (see, eg, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 2001 supplement)), and immune tissue of section material. Flow cytometric analysis (FACS) (eg, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory) for immunoassays such as anatomical analysis, Western blots, and markers that can reach intact cells. Press (1998)).

膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。 Formation of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system Cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system can be obtained by any method in the art or any method proposed in the present invention. Thus, the cells can be differentiated into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system.

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。   For example, cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system can be obtained by using markers characteristic of the pancreatic endocrine system according to the method disclosed in D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006). Can be differentiated into cells expressing.

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。   For example, a cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm system is cultured in a medium containing DAPT and exendin 4, and the cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm system is cultured. By removing the medium containing DAPT and exendin 4, and then culturing the cells in a medium containing exendin 1, IGF-1 and HGF, a marker characteristic to the pancreatic endocrine system is expressed. Further differentiation into cells. An example of this method is disclosed in Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。   For example, cells expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm system are cultured in a medium containing exendin 4, and then the cells expressing the marker characteristic of the pancreatic endoderm system are cultured. By removing the medium containing Din 4 and subsequently culturing the cells in a medium containing Exendin 1, IGF-1 and HGF, cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system are obtained. Differentiate further. An example of this method is disclosed in D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。   For example, a cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm system is obtained by culturing a cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm system in a medium containing DAPT and exendin 4. Further differentiation into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system. An example of this method is disclosed in D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。   For example, cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system can be obtained by culturing cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system in a medium containing exendin-4. Further differentiation into cells expressing markers characteristic of the endocrine system. An example of this method is disclosed in D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.

本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。   In one embodiment of the present invention, cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system are obtained from LifeScan, Inc. Cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system by treatment with a factor that inhibits the Notch signaling pathway according to the method disclosed in US patent application Ser. No. 11 / 736,908 assigned to US Pat. Is further differentiated into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system.

本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。   In one embodiment of the present invention, cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system are obtained from LifeScan, Inc. Cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system by treatment with factors that inhibit the Notch signaling pathway according to the method disclosed in US patent application Ser. No. 11 / 779,311 assigned to Is further differentiated into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system.

本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第６０／９５３，１７８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。   In one embodiment of the present invention, cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system are obtained from LifeScan, Inc. Cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system by treatment with a factor that inhibits the Notch signaling pathway according to the method disclosed in US Patent Application No. 60 / 953,178 assigned to Is further differentiated into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system.

本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。   In one aspect of the present invention, cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage are treated according to the method disclosed in US Patent Application No. 60 / 990,529, resulting in pancreatic endoderm lineage. Cells expressing a characteristic marker are further differentiated into cells expressing a marker characteristic of the pancreatic endocrine system.

本発明の一態様では、本発明は、膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法を提供し、この方法は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のＴＧＦ−β受容体作動剤を含む培地で処理することで、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させることを含む。   In one aspect of the present invention, the present invention provides a method of increasing the expression level of a marker associated with the pancreatic endocrine system, the method comprising: Treatment with a medium containing a sufficient amount of a TGF-β receptor agonist to increase the expression level of a marker associated with the pancreatic endocrine system.

ＴＧＦ−β受容体作動剤は、ＴＧＦ−β受容体に結合し、かつこの受容体を活性化することのできる、任意の剤であり得る。一実施形態では、ＴＧＦ−β受容体作動剤は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、及びアクチビンＣからなる群から選択される。   The TGF-β receptor agonist can be any agent that can bind to and activate the TGF-β receptor. In one embodiment, the TGF-β receptor agonist is selected from the group consisting of activin A, activin B, and activin C.

別の実施形態では、ＴＧＦ−β受容体作動剤は、アクチビンＡのペプチド変異体であり得る。このようなペプチド変異体の例は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される。   In another embodiment, the TGF-β receptor agonist can be a peptide variant of activin A. Examples of such peptide variants are described in Centocor R & D, Inc. U.S. Patent Application No. 61 / 076,889, assigned to U.S. Pat.

一実施形態では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させるのに十分な量のアクチビンＡで、約１〜約５日間にわたって処理する。あるいは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させるのに十分な量のアクチビンＡで、約３〜約５日間にわたって処理する。あるいは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させるのに十分な量のアクチビンＡで、約５日間にわたって処理する。   In one embodiment, cells expressing a marker characteristic of the pancreatic endocrine system are treated with an amount of activin A sufficient to increase expression of the marker associated with the pancreatic endocrine system for about 1 to about 5 days. Process over. Alternatively, cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system are treated with an amount of activin A sufficient to increase the expression of markers associated with the pancreatic endocrine system for about 3 to about 5 days. . Alternatively, cells expressing a marker characteristic of the pancreatic endocrine system are treated with an amount of activin A sufficient to increase the expression level of the marker associated with the pancreatic endocrine system for about 5 days.

別の実施形態では、ＴＧＦ−β受容体作動剤は、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ １１、及びＧＤＦ−１５からなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ １１、及びＧＤＦ−１５、並びに少なくとも１種の他の因子からなる群から選択されるＴＧＦ−β受容体作動剤で処理される。一実施形態では、少なくとも１種の他の因子は環式アニリン−ピリジノトリアジン化合物である。このような環式アニリン−ピリジノトリアジン化合物の例は、米国特許出願番号第６１／０７６，９００号（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃに譲渡）に記載される。別の実施形態では、少なくとも１種の他の因子はアニリン−ピリジノトリアジン化合物である。このようなアニリン−ピリジノトリアジン化合物は、米国特許出願番号第６１／０７６，９０８号（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．に譲渡）に記載される。別の実施形態では、少なくとも１種の他の因子は、米国特許出願番号第６１／０７６，９１５号（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．に譲渡）に記載される化合物である。   In another embodiment, the TGF-β receptor agonist is selected from the group consisting of GDF-8, GDF 11, and GDF-15. In one embodiment, the cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endocrine system is TGF- selected from the group consisting of GDF-8, GDF 11, and GDF-15, and at least one other factor. Treated with a beta receptor agonist. In one embodiment, the at least one other factor is a cyclic aniline-pyridinotriazine compound. Examples of such cyclic aniline-pyridinotriazine compounds are described in US Patent Application No. 61 / 076,900 (assigned to Centocor R & D, Inc). In another embodiment, the at least one other factor is an aniline-pyridinotriazine compound. Such aniline-pyridinotriazine compounds are described in US Patent Application No. 61 / 076,908 (assigned to Centocor R & D, Inc.). In another embodiment, the at least one other factor is a compound described in US Patent Application No. 61 / 076,915 (assigned to Centocor R & D, Inc.).

本発明の一態様では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は続いて濃縮される。濃縮工程は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＴＧＦ−β受容体作動剤で処理する前に実施され得る。あるいは濃縮工程は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＴＧＦ−β受容体作動剤で処理した後に実施され得る。   In one aspect of the invention, cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system are subsequently enriched. The enrichment step can be performed prior to treating cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system with a TGF-β receptor agonist. Alternatively, the enrichment step can be performed after treating cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system with a TGF-β receptor agonist.

一実施形態では、濃縮は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の懸濁液を得て、４０μｍセルストレイナーで濾過することにより実施される。   In one embodiment, the concentration is performed by obtaining a suspension of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system and filtering through a 40 μm cell strainer.

膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の検出
膵内分泌系に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、膵内分泌系の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵内分泌系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内分泌系に特異的なマーカーとしては、例えば、ＮＧＮ−３、ニューロＤ（ＮｅｕｒｏＤ）、Ｉｓｌｅｔ−１などの転写因子の１つ以上のものの発現が挙げられる。 Detection of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system Markers characteristic of the pancreatic endocrine system are well known to those skilled in the art, and additional markers that are characteristic of the pancreatic endocrine system are continually identified . These markers can be used to confirm that cells treated according to the present invention have differentiated and acquired properties indicative of the pancreatic endocrine system. Examples of markers specific for the pancreatic endocrine system include expression of one or more transcription factors such as NGN-3, NeuroD, and Islet-1.

β細胞系の細胞に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、β細胞系の細胞の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、β−細胞系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用することができる。β細胞系に特異的な特徴としては、１つ以上の、中でも例えば、Ｐｄｘ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３β、及びＭａｆＡなどの転写因子の発現が挙げられる。これらの転写因子は、内分泌細胞の同定について当該技術分野で十分に確立されている。例えば、Ｅｄｌｕｎｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：５２４〜６３２（２００２年））を参照されたい。   Markers characteristic of β-cell lineage cells are well known to those skilled in the art, and additional markers that are characteristic of β-cell lineage cells are continually identified. These markers can be used to confirm that cells treated according to the present invention have differentiated and acquired properties characteristic of β-cell lines. Specific features of the β cell line include one or more, among others, for example, Pdx1 (pancreas and duodenal homeobox gene-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf Examples include expression of transcription factors such as -6, Hnf-3β, and MafA. These transcription factors are well established in the art for the identification of endocrine cells. For example, see Edrund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).

分化効率は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。あるいは分化効率は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。   Differentiation efficiency can be measured by exposing the treated cell population to agents (such as antibodies) that specifically recognize protein markers expressed by cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system. it can. Alternatively, the differentiation efficiency is measured by exposing the treated cell population to an agent (such as an antibody) that specifically recognizes a protein marker expressed by a cell expressing a marker characteristic of the β cell line. Can do.

培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。   Methods for assessing the expression of protein and nucleic acid markers in cultured or isolated cells are standard techniques in the art. These include quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), Northern blotting, in situ hybridization (see, eg, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 2001 supplement)), and immune tissue of section material. Flow cytometric analysis (FACS) (eg, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory) for immunoassays such as anatomical analysis, Western blots, and markers that can reach intact cells. Press (1998)).

本発明の一態様では、分化効率は、処理後の所定の細胞培養物中のインスリン陽性細胞の百分率を測定することによって求められる。一実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１００％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約９０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約８０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約７０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約６０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約４０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約３０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約２０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５％のインスリン陽性細胞を生成する。   In one aspect of the invention, differentiation efficiency is determined by measuring the percentage of insulin positive cells in a given cell culture after treatment. In one embodiment, the methods of the invention produce about 100% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the invention produce about 90% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the invention produce about 80% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the invention produce about 70% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the invention produce about 60% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the invention produce about 50% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the invention produce about 40% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the invention produce about 30% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the present invention produce about 20% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the invention produce about 10% insulin positive cells in a given culture. In another embodiment, the methods of the invention produce about 5% insulin positive cells in a given culture.

本発明の一態様では、分化効率は、グルコース刺激によるインスリン分泌を、細胞が放出するＣ−ペプチドの量を測定することで検出し、測定することにより求められる。一実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１０００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。   In one aspect of the present invention, the differentiation efficiency is determined by detecting and measuring insulin secretion by glucose stimulation by measuring the amount of C-peptide released by the cells. In one embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 1000ng C-peptide / pg DNA. In another embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 900ng C-peptide / pg DNA. In another embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 800ng C-peptide / pg DNA. In another embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 700ng C-peptide / pg DNA. In another embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 600ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 500ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 400ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 500ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 400ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 300ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 200ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 100ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 90ng C-peptide / pg DNA. In another embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 80ng C-peptide / pg DNA. In another embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 70ng C-peptide / pg DNA. In another embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 60ng C-peptide / pg DNA. In another embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 50ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 40ng C-peptide / pg DNA. In another embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 30ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 20ng C-peptide / pg DNA. In an alternate embodiment, cells produced by the methods of the present invention produce about 10ng C-peptide / pg DNA.

治療
一態様では、本発明は、Ｉ型糖尿病に罹患しているかあるいはＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、この多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系へと分化させ、β細胞系の細胞を患者に埋め込むことを含む。 Treatment In one aspect, the present invention provides a method of treating a patient suffering from or at risk for developing type I diabetes. The method includes culturing pluripotent stem cells, differentiating the pluripotent stem cells into a β cell line in vitro, and implanting cells of the β cell line into a patient.

更に別の態様では、本発明は、ＩＩ型糖尿病に罹患しているかあるいはＩＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系に分化させ、β細胞系の細胞を患者に埋め込むことを含む。   In yet another aspect, the present invention provides a method of treating a patient suffering from or at risk for developing type II diabetes. The method comprises culturing pluripotent stem cells, differentiating the cultured pluripotent stem cells into a β cell line in vitro, and implanting cells of the β cell line in a patient.

適切であるならば、移植した細胞の生存及び機能を亢進する医薬品又は生理活性物質で患者を更に処置してもよい。こうした薬剤としては、例えば、特にインスリン、ＴＧＦ−β１、２及び３などのＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどが挙げられる。他の医薬化合物としては例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２模倣体（mimetibody）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物のようなＭＡＰＫ阻害剤などが挙げられる。   If appropriate, the patient may be further treated with a pharmaceutical or bioactive substance that enhances the survival and function of the transplanted cells. Such agents include, for example, insulin, members of the TGF-β family such as TGF-β1, 2 and 3 and bone morphogenetic proteins (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12, and -13), fibroblast growth factor-1 and -2, platelet-derived growth factor-AA and -BB, platelet-rich plasma, insulin-like growth factor (IGF-I, II), proliferative differentiation Factors (GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), vascular endothelial cell-derived growth factor (VEGF), pleiotrophin, endothelin and the like can be mentioned. Other pharmaceutical compounds include, for example, nicotinamide, glucagon-like peptide-I (GLP-1) and II, GLP-1 and 2 mimetibody, exendin-4, retinoic acid, parathyroid hormone such as US Patent And MAPK inhibitors such as the compounds disclosed in Japanese Patent Application Publication Nos. 2004/0209901 and 2004/0132729.

多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にインスリン産生細胞に分化させてもよい。具体的な実施形態では、多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にβ細胞へと完全に分化させる。あるいは多能性幹細胞は、未分化又は一部が分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化はレシピエント内で行われ得る。   Pluripotent stem cells may be differentiated into insulin producing cells prior to transplantation into the recipient. In a specific embodiment, pluripotent stem cells are fully differentiated into β cells prior to transplantation into the recipient. Alternatively, pluripotent stem cells may be transplanted into a recipient in an undifferentiated state or partially differentiated state. Further differentiation can be performed within the recipient.

胚体内胚葉細胞、又は代替的には膵臓内胚葉細胞、又は代替的にはβ細胞を、分散した細胞として埋め込んでもよく、又は肝門静脈内に注入され得るクラスターとして編成してもよい。あるいは細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい。埋め込み部位としては、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。   Definitive endoderm cells, or alternatively pancreatic endoderm cells, or alternatively beta cells, may be implanted as dispersed cells or organized as clusters that can be injected into the hepatic portal vein. Alternatively, the cells may be provided in a biocompatible degradable polymer support, a porous non-degradable device, or encapsulated to be protected from a host immune response. The cells may be implanted within an appropriate site within the recipient. Examples of implantation sites include the liver, natural pancreas, subrenal space, net, peritoneum, subserosa space, intestine, stomach, or subcutaneous pocket.

埋め込まれた細胞の更なる分化、生存又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。所定の実施形態において、増殖因子は、インビボで、投与された細胞を分化させるよう使用される。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にその場で（in situ）で曝露されてもよい。埋め込まれた細胞には、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘発させることもできる。   In order to improve further differentiation, survival or activity of the implanted cells, additional factors such as growth factors, antioxidants or anti-inflammatory agents are administered before, simultaneously with or after administration of the cells. May be. In certain embodiments, growth factors are used to differentiate administered cells in vivo. These factors may be secreted by endogenous cells and exposed to the administered cells in situ. The implanted cells can also be induced to differentiate by any combination of endogenous and exogenous growth factors known in the art.

埋め込みに使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に基づいて当業者により決定され得る。   The amount of cells used for implantation can be determined by those skilled in the art based on a number of different factors, including the patient's condition and response to therapy.

一態様では、本発明は糖尿病に罹患しているかあるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をインビトロでβ細胞系に分化させ、この細胞を３次元支持体に埋め込むことを含む。細胞は、患者に埋め込む前に、インビトロでこの支持体上に維持してもよい。あるいは細胞を含む支持体を、インビトロで更に培養することなく直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。   In one aspect, the present invention provides a method of treating a patient suffering from or at risk for developing diabetes. The method comprises culturing pluripotent stem cells, differentiating the cultured cells into a β cell line in vitro, and embedding the cells in a three-dimensional support. The cells may be maintained on this support in vitro prior to implantation in the patient. Alternatively, the support containing the cells may be implanted directly into the patient without further culturing in vitro. The support may optionally incorporate at least one pharmaceutical agent that enhances the survival and function of the implanted cells.

本発明の目的のために使用するのに好適な支持体材料には、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア及びリザーバが挙げられる。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、インビトロ及びインビボで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に適切である。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、同第６，０２２，７４３号、同第５，５６７，６１２号、同第５，７５９，８３０号、同第６，６２６，９５０号、同第６，５３４，０８４号、同第６，３０６，４２４号、同第６，３６５，１４９号、同第６，５９９，３２３号、同第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３ Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号及び同第６，３３３，０２９号に開示されている材料を参照されたい。   Support materials suitable for use for the purposes of the present invention include tissue templates, conduits, barriers and reservoirs useful for tissue repair. More particularly, synthetic and natural materials having the form of foams, sponges, gels, hydrogels, wovens, and non-woven structures, used in vitro and in vivo to reconstruct or regenerate biological tissue, and Materials that deliver chemotactic agents to induce tissue growth are suitable for use in the practice of the methods of the invention. For example, U.S. Pat. Nos. 5,770,417, 6,022,743, 5,567,612, 5,759,830, 6,626,950, 6,534,084, 6,306,424, 6,365,149, 6,599,323, 6,656,488, US Patent Application Publication No. 2004 / See the materials disclosed in 0062753 A1, US Pat. Nos. 4,557,264 and 6,333,029.

医薬品が組み込まれた支持体を形成するために、支持体を形成するのに先立ち、薬剤をポリマー溶液と混合することもできる。あるいは加工された支持体上に、医薬品を好ましくは医薬担体の存在下で被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の他の適切な物理的形態として存在し得る。あるいは医薬品の放出速度を変更するために、支持体に賦形剤を加えてもよい。別の実施形態では、抗炎症性化合物である少なくとも１種の医薬化合物（例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示される化合物）を支持体に組み込む。   To form a support incorporating the pharmaceutical product, the drug can be mixed with the polymer solution prior to forming the support. Alternatively, the medicament may be coated on the processed support, preferably in the presence of a pharmaceutical carrier. The medicament may exist as a liquid, a finely divided solid, or any other suitable physical form. Alternatively, excipients may be added to the support to alter the drug release rate. In another embodiment, at least one pharmaceutical compound that is an anti-inflammatory compound (eg, a compound disclosed in US Pat. No. 6,509,369) is incorporated into a support.

支持体には、抗アポトーシス化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示されている化合物を組み込んでもよい。   The support may incorporate at least one pharmaceutical compound that is an anti-apoptotic compound, such as the compounds disclosed in US Pat. No. 6,793,945.

支持体には、線維症阻害剤である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示されている化合物も組み込まれ得る。   The support can also incorporate at least one pharmaceutical compound that is a fibrosis inhibitor, such as the compounds disclosed in US Pat. No. 6,331,298.

支持体には、血管新生を促進させることができる少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び同第２００４／０２０９９０１号に開示されている化合物も組み込まれ得る。   The support can also incorporate at least one pharmaceutical compound capable of promoting angiogenesis, such as the compounds disclosed in US Patent Application Publication Nos. 2004/0220393 and 2004/0209901.

支持体には、免疫抑制化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示されている化合物も組み込まれ得る。   The support can also incorporate at least one pharmaceutical compound that is an immunosuppressive compound, such as the compounds disclosed in US Patent Application Publication No. 2004/0171623.

例えば支持体には、特に、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの増殖因子である、少なくとも１種の医薬化合物も組み込まれ得る。他の医薬化合物としては、例えばニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−Ｉ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、並びにＩＩ、エキセンディン４、ｎｏｄａｌ、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞−及びヘパリン−結合ドメインを含む生物ペプチド、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物などのＭＡＰＫ阻害剤を挙げることができる。   For example, the support includes, among others, members of the TGF-β family, including TGF-β1, 2, and 3, bone morphogenetic proteins (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11 -12 and -13), fibroblast growth factor-1 and -2, platelet-derived growth factor-AA and -BB, platelet-rich plasma, insulin growth factor (IGF-I, II), growth differentiation factor (GDF) -5, -6, -8, -10, -15), at least one pharmaceutical compound that is a growth factor such as vascular endothelial growth factor (VEGF), pleiotrophin, endothelin may also be incorporated. Other pharmaceutical compounds include, for example, nicotinamide, hypoxia-inducing factor 1-α, glucagon-like peptide-I (GLP-I), GLP-1 and GLP-2 mimetics, and II, exendin 4, nodal, noggin , NGF, retinoic acid, parathyroid hormone, tenascin-C, tropoelastin, thrombin-derived peptide, cathelicidin, defensin, laminin, cell- and heparin-binding domains of adherent extracellular matrix proteins such as fibronectin and vitronectin Mention may be made of peptides, for example MAPK inhibitors such as the compounds disclosed in U.S. Patent Application Publication Nos. 2004/0209901 and 2004/0132729.

スキャフォールド内への本発明の細胞の組み込みは、細胞をスキャフォールド上に単に沈着させることにより達成できる。細胞は、単純拡散によりスキャフォールド内に入れることができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１ Ｐｔ２）：３〜９（１９８８））。細胞播種の効率を向上させるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸スキャフォールド上に播種する際に、スピナーフラスコが使用されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２（１９９８））。細胞播種のための他の手法は遠心法の使用であり、これは播種する細胞に与えるストレスを最小にし、かつ播種効率を高める。例えば、Ｙａｎｇらは、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＣＣＩ）と呼ばれる、細胞播種法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６（２００１））。   Incorporation of the cells of the invention into the scaffold can be accomplished by simply depositing the cells on the scaffold. Cells can be placed in the scaffold by simple diffusion (J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt2): 3-9 (1988)). Several other approaches have been developed to improve the efficiency of cell seeding. For example, spinner flasks have been used when seeding chondrocytes on polyglycolic acid scaffolds (Biotechnol. Prog. 14 (2): 193-202 (1998)). Another technique for cell seeding is the use of centrifugation, which minimizes stress on the seeded cells and increases seeding efficiency. For example, Yang et al. Developed a cell seeding method called Centrifugal Cell Immobilization (CCI) (J. Biomed. Mater. Res. 55 (3): 379-86 (2001)).

以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。   The present invention is further illustrated by the following examples, but the present invention is not limited by these examples.

（実施例１）
ウシ胎児血清の非存在下での、ヒト胚性幹細胞の細胞株Ｈ１の膵内分泌細胞への分化
継代数５２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）をコートしたディッシュ上で培養し、２％ ＢＳＡ（カタログ＃ １５２４０１，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃ １００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地に１日にわたって曝露した後、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理した。次いで培養物をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）で２日間にわたって処理し、次いでＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）中で４日間にわたってインキュベートした。 Example 1
Differentiation of human embryonic stem cell line H1 into pancreatic endocrine cells in the absence of fetal bovine serum Coat MATRIGEL ™ (1:30 dilution) cells of passage 52 human embryonic stem cell line H1 2% BSA (Catalog # 152401, MP Biomedical, Ohio), 100 ng / mL Activin A (R & D Systems, MN), 20 ng / mL WNT-3a (Catalog # 1324-WN-002) R & D Systems, MN), and 8 ng / mL bFGF (Catalog # 100-18B, PeproTech, NJ) for 1 day exposure to RPMI medium followed by 2% BSA, 100 ng / mL activin A, and 8 ng / mL 2 more days in RPMI medium supplemented with mL bFGF And management. Cultures were then treated with DMEM / F12 + 2% BSA + 50 ng / mL FGF7 + 0.25 μM cyclopamine-KAAD (# 239804, Calbiochem, Calif.) For 2 days, then DMEM / F12 + 1% B27 (Invitrogen, Calif.) + 50 ng / mL FGF7 + 0. Incubated for 4 days in 25 μM cyclopamine-KAAD + 2 μM retinoic acid (RA) (Sigma, MO) +100 ng / mL noggin (R & D Systems, MN).

ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤）（カタログ＃ ５６５７８４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃ ６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）＋１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）中で３日間にわたってインキュベートし、更にＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）中で７日間にわたってインキュベートすることにより、細胞を膵内分泌細胞へと分化させた。内分泌腺培養物を更に成熟させるために、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）での７日間の処理からなる最後のステージを加えた。最後のステージを除き、他のすべてのステージでは毎日培地を交換した。この手順の概要を図１に示す。各ステージにおいて血球計数器を用いて細胞数を計算し、ＰＣＲ分析用にＲＮＡを採取した。試料はすべて３つ組複製で採取した。   DMEM / F12 + 1% B27 (Invitrogen, CA) +100 ng / mL Noggin + 1 μM DAPT (γ secretase inhibitor) (Catalog # 565784, Calbiochem, CA) +1 μM ALK5 inhibitor II (Catalog # 616452, Calbiochem, Ca) +100 ng / mL By incubating in Netrin-4 (R & D Systems, MN) for 3 days and further in DMEM / F12 + 1% B27 (Invitrogen, CA) +1 μM ALK5 inhibitor II (Calbiochem, Ca) for 7 days, Cells were differentiated into pancreatic endocrine cells. To further mature the endocrine culture, a final stage consisting of 7 days of treatment with DMEM / F12 + 1% B27 (Invitrogen, CA) was added. Except for the last stage, the medium was changed daily in all other stages. An outline of this procedure is shown in FIG. At each stage, the number of cells was calculated using a hemocytometer and RNA was collected for PCR analysis. All samples were collected in triplicate.

図２のパネルａ及びｂは、ＦＡＣＳ及びリアルタイムＰＣＲデータにより測定されたものとして、ステージ１に対応する３日目の時点での細胞中の、ＣＸＣＲ４発現について示す。未分化のＨ１ ＥＳ細胞に対する発現の倍数変化が示されている。   Panels a and b in FIG. 2 show CXCR4 expression in the cells at day 3 corresponding to stage 1, as measured by FACS and real-time PCR data. A fold change in expression relative to undifferentiated H1 ES cells is shown.

（実施例２）
ステージ６の培養物へのアクチビンＡの添加は、膵内分泌マーカーの発現量を有意に増加させた
継代数４３のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）コートディッシュ上で培養し、実施例１に記載の方法に従って膵内分泌細胞へと分化させた。ステージ６で、一部の培養物を１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で７日間にわたって処理した。７日目に、細胞を室温で５分間にわたって１Ｘアキュターゼ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）で処理した後、続いてアキュターゼは除去してＤＭＥＭ／１２＋１％ Ｂ２７を加えた。接着した細胞をセルスクレーパーを用いて取り外し、穏やかに再懸濁し、４０μｍのセルストレイナーで濾過した。ストレイナーに保持されたフロースルーと細胞を取り外し、サンプルをＰＣＲとジチゾン染色のために回収した。ジチゾン（ＤＴＺ）は、島に存在することが示されてきた亜鉛へと、選択的に結合する色素である。図３のパネルａ〜ｃは、４０μｍセルストレイナーを用いて分離する前、及び分離した後にＤＴＺ染色した培養物を示す。４０μｍを超えるクラスターの有意な（およそ８０％）部分がＤＴＺに対して陽性に染色された。これは内分泌腺に富むクラスターを濃縮する、迅速で簡単な方法として提供される。図４のパネルａ〜ｆは、ステージ６で＋／−１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで処理し、続いて４０μｍのフィルタを用いて濃縮した細胞の、遺伝子発現プロファイルを示す。ステージ６へのアクチビンＡの添加は、全ての重要な膵内分泌マーカーの発現を、有意に増幅させた。 (Example 2)
Addition of activin A to the culture of stage 6 significantly increased the expression level of pancreatic endocrine marker. Passage 43 human embryonic stem cell line H1 cells on a MATRIGEL ™ (1:30 dilution) coat dish And were differentiated into pancreatic endocrine cells according to the method described in Example 1. At stage 6, some cultures were treated with 10 ng / mL activin A (R & D Systems, MN) for 7 days. On day 7, cells were treated with 1 × actase (Sigma, MO) for 5 minutes at room temperature, after which the actase was removed and DMEM / 12 + 1% B27 was added. Adherent cells were removed using a cell scraper, gently resuspended, and filtered through a 40 μm cell strainer. The flow-through and cells retained on the strainer were removed and samples were collected for PCR and dithizone staining. Dithizone (DTZ) is a dye that selectively binds to zinc that has been shown to be present on islands. Panels a-c in FIG. 3 show cultures that have been DTZ stained before and after separation using a 40 μm cell strainer. A significant (approximately 80%) portion of the clusters above 40 μm stained positive for DTZ. This is provided as a quick and simple way to enrich endocrine-rich clusters. Panels af of FIG. 4 show gene expression profiles of cells treated with +/− 10 ng / mL activin A at stage 6 and subsequently concentrated using a 40 μm filter. Addition of activin A to stage 6 significantly amplified the expression of all important pancreatic endocrine markers.

本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。   Publications cited throughout this specification are hereby incorporated by reference in their entirety. While various aspects of the present invention have been described with reference to examples and preferred embodiments, the scope of the present invention is not limited by the foregoing description, but is construed as appropriate under the principles of patent law. It will be appreciated that it is as defined by the following claims.

Claims (7)

膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法であって、該方法は、膵内分泌系に関連付けられるマーカーを発現している細胞を、十分な量のＴＧＦ−β受容体作動剤を含む培地で処理することで、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させることを含む、方法。   A method of increasing the expression level of a marker associated with the pancreatic endocrine system, the method comprising containing a sufficient amount of a TGF-β receptor agonist in a cell expressing a marker associated with the pancreatic endocrine system. The method comprising increasing the expression level of a marker associated with the pancreatic endocrine system by treating with a medium. 前記ＴＧＦ−β受容体作動剤が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡのペプチド変異体、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１及びＧＤＦ−１５からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。   The TGF-β receptor agonist is selected from the group consisting of activin A, activin B, activin C, peptide variants of activin A, GDF-8, GDF-11 and GDF-15. the method of. 前記膵内分泌系に関連付けられるマーカーを発現している細胞が濃縮される、請求項１に記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein cells expressing markers associated with the pancreatic endocrine system are enriched. 多能性幹細胞を分化させるための方法であって、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む、方法。 A method for differentiating pluripotent stem cells,
a. Culturing pluripotent stem cells;
b. Differentiating pluripotent stem cells into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system;
c. Differentiating cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm system into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm system;
d. Differentiating a cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endoderm system into a cell expressing a marker characteristic of the pancreatic endocrine system. 前記膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のＴＧＦ−β受容体作動剤を含む培地で処理することで、前記膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させることにより、前記膵内分泌系に特徴的なマーカーの発現量が増加する、請求項４に記載の方法。   Treating cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine system with a medium containing a sufficient amount of a TGF-β receptor agonist increases the expression level of the marker associated with the pancreatic endocrine system The method according to claim 4, wherein the expression level of a marker characteristic of the pancreatic endocrine system is increased. 前記ＴＧＦ−β受容体作動剤が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡのペプチド変異体、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１及びＧＤＦ−１５からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。   5. The TGF-β receptor agonist is selected from the group consisting of activin A, activin B, activin C, a peptide variant of activin A, GDF-8, GDF-11 and GDF-15. the method of. 前記膵内分泌系に関連付けられるマーカーを発現している細胞が濃縮される、請求項４に記載の方法。   5. The method of claim 4, wherein cells expressing markers associated with the pancreatic endocrine system are enriched.
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