JP2012506998A - Method for identifying novel ligands for modulating orphan nuclear receptor RAR-related orphan receptor gamma (NR1F3) activity - Google Patents

Method for identifying novel ligands for modulating orphan nuclear receptor RAR-related orphan receptor gamma (NR1F3) activity Download PDF

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Abstract

本発明は、オーファン核内受容体ＲＯＲガンマのモジュレーター、並びにＲＯＲガンマ活性の新規モジュレーターの同定及びスクリーニング方法のほか、このような方法により同定された新規ＲＯＲガンマモジュレーターによるＲＯＲガンマ媒介性疾患の治療方法に関する。
【選択図】 図１The present invention provides a method for identifying and screening for modulators of orphan nuclear receptor ROR gamma, and novel modulators of ROR gamma activity, as well as treatment of ROR gamma mediated diseases with the novel ROR gamma modulators identified by such methods. Regarding the method.
[Selection] Figure 1

Description

発明の詳細な説明Detailed Description of the Invention

本発明は、オーファン核内受容体ＲＯＲガンマ（ＲＯＲｇａｍｍａ）のモジュレーター、並びにＲＯＲガンマ活性の新規モジュレーターの同定及びスクリーニングの方法のほか、このような方法により同定された新規ＲＯＲガンマモジュレーターによるＲＯＲガンマ媒介性疾患の治療方法を提供する。   The present invention provides methods for identifying and screening for modulators of the orphan nuclear receptor ROR gamma (RORgamma) and novel modulators of ROR gamma activity, as well as ROR gamma mediated by the novel ROR gamma modulators identified by such methods. Methods for treating sexually transmitted diseases are provided.

レチノイド受容体関連オーファン受容体は、３つのファミリーメンバー、すなわち、ＲＯＲα（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３年、１９４：１３７１〜１３７９頁）、ＲＯＲβ（Ａｎｄｒｅら、Ｇｅｎｅ １９９８年、５１６：２７７〜２８３頁）及びＲＯＲγ（Ｈｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９８年、９：７９７〜８０６頁）から成り、核内受容体スーパーファミリーのＮＲ１Ｆ（ＲＯＲ／ＲＺＲ）サブグループを構成する（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｃｅｌｌ １９９５年、８３：８３５〜８３９頁）。   The retinoid receptor-related orphan receptor has three family members: RORα (Becker-Andree, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 194: 1371-1379), RORβ (Andre et al., Gene 1998). 516: 277-283) and RORγ (He et al., Immunity 1998, 9: 797-806) and constitutes the NR1F (ROR / RZR) subgroup of the nuclear receptor superfamily (Mangelsdorf et al., Cell 1995, 83: 835-539).

核内受容体スーパーファミリーは、超可変Ｎ末端ドメイン、保存ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ヒンジ領域、及び保存リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）から成る共通のモジュール構造ドメインを共有する。ＤＢＤは特定のＤＮＡ配列（核ホルモン応答エレメント、すなわちＮＲＥ）に対する受容体をターゲットとし、ＬＢＤは内因性又は外因性化学リガンドの認識において機能する。構成的転写活性化ドメインはＮ末端（ＡＦ１）で見出され、リガンド調節転写活性化ドメインは、典型的なＮＲではＣ末端ＬＢＤ内に埋め込まれている。核内受容体は、核内受容体の標的ＮＲＥに結合した際に、転写活性化状態又は抑制状態で存在し得る。遺伝子活性化の基本的機構は、共調節タンパク質、すなわちコアクチベーター及びコリプレッサーのリガンド依存的交換を伴う（ＭｃＫｅｎｎａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．１９９９年、２０：３２１〜３４４頁）。抑制状態でのＮＲは、そのＤＮＡ認識エレメントに結合しており、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣＳ）を動員するコリプレッサータンパク質と結合している。アゴニストの存在下では、コリプレッサーはコアクチベーターと交換され、コアクチベーターはクロマチンリモデリング複合体の構築に寄与する転写因子を動員する。クロマチンリモデリング複合体は、ヒストンアセチル化を介して転写抑制を緩和し、転写開始を刺激する。ＬＢＤのＡＦ−２ドメインは、コリプレッサー又はコアクチベータータンパク質の相互作用面を提示する、及び核内受容体スーパーファミリーのメンバーにより共有される遺伝子活性化又は抑制の保存された機構を提供する、リガンド依存性分子スイッチとして作用する。   The nuclear receptor superfamily shares a common modular structural domain consisting of a hypervariable N-terminal domain, a conserved DNA binding domain (DBD), a hinge region, and a conserved ligand binding domain (LBD). DBD targets receptors for specific DNA sequences (nuclear hormone response elements, or NREs), and LBD functions in the recognition of endogenous or exogenous chemical ligands. A constitutive transcription activation domain is found at the N-terminus (AF1) and the ligand-regulated transcription activation domain is embedded within the C-terminal LBD in a typical NR. Nuclear receptors can exist in a transcriptionally activated or repressed state when bound to a nuclear receptor target NRE. The basic mechanism of gene activation involves ligand-dependent exchange of co-regulatory proteins, ie coactivators and corepressors (McKenna et al., Endocrine Rev. 1999, 20: 321-344). NR in the repressed state is bound to its DNA recognition element and bound to a corepressor protein that recruits histone deacetylase (HDACS). In the presence of an agonist, the corepressor is exchanged for a coactivator, which mobilizes transcription factors that contribute to the construction of the chromatin remodeling complex. The chromatin remodeling complex alleviates transcriptional repression through histone acetylation and stimulates transcription initiation. The AF-2 domain of LBD presents the interacting surface of corepressor or coactivator proteins and provides a conserved mechanism of gene activation or repression shared by members of the nuclear receptor superfamily. Acts as a ligand-dependent molecular switch.

核内受容体のＮＲ１Ｆファミリーのメンバー（ＲＯＲガンマなど）は、既知のリガンドの非存在下では、構成的活性型転写因子と考えられ、エストロゲン関連受容体アルファと類似する（Ｖａｎａｃｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９９年、１３：７６４〜７７３頁）。ＥＲＲアルファについては、ＥＲＲアルファ／ＰＧＣ１アルファシグナル伝達を妨害することによりＥＲＲアルファ転写活性を低減する合成インバースアゴニストが記載されている（Ｗｉｌｌｙら、ＰＮＡＳ ２００４年、１０１：８９１２〜８９１７頁）。ＲＯＲガンマのインバースアゴニストは、例えば、ＲＯＲガンマの転写活性を低減し、ＲＯＲガンマにより制御される生物学的経路に機能的にマイナスの影響を及ぼすことが予期され得る。   Members of the NR1F family of nuclear receptors (such as ROR gamma) are considered constitutively active transcription factors in the absence of known ligands and are similar to estrogen-related receptor alpha (Vanacker et al., Mol. Endocrinol. 1999, 13: 764-773). For ERRalpha, synthetic inverse agonists have been described that reduce ERRalpha transcriptional activity by interfering with ERRalpha / PGC1alpha signaling (Willy et al., PNAS 2004, 101: 8912-8917). Inverse agonists of ROR gamma, for example, can be expected to reduce the transcriptional activity of ROR gamma and negatively functionally affect biological pathways controlled by ROR gamma.

ＲＯＲは、選択的スプライシング又は選択的転写開始部位から生じるアイソフォームとして発現される。これまで、アイソフォームは、Ｎ末端ドメイン（Ａ／Ｂドメイン）のみが異なると記載されてきた。ヒトでは、４つの異なるＲＯＲαアイソフォームが同定されたが（ＲＯＲα１〜４）、ＲＯＲβ（１及び２）及びＲＯＲγ（１及び２）の両方については２つのアイソフォームのみが知られている（Ａｎｄｒｅら、Ｇｅｎｅ １９９８年、２１６：２７７〜２８３頁；Ｖｉｌｌｅｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９年、２９：４０７２〜４０８０頁）。ＲＯＲガンマは、ＲＯＲγ１及び／又はＲＯＲγ２の両方を記載する用語として使用される。   ROR is expressed as an isoform arising from alternative splicing or alternative transcription initiation sites. So far, isoforms have been described as differing only in the N-terminal domain (A / B domain). In humans, four different RORα isoforms have been identified (RORα1-4), but only two isoforms are known for both RORβ (1 and 2) and RORγ (1 and 2) (Andre et al. Gene 1998, 216: 277-283; Villey et al., Eur. J. Immunol. 1999, 29: 4072-4080). ROR gamma is used as a term describing both RORγ1 and / or RORγ2.

ＲＯＲアイソフォームは、異なる組織発現パターンを示し、異なる標的遺伝子及び生理学的経路を調節する。例えば、ＲＯＲγ２（ＲＯＲγ−ｔとも呼ばれる）はＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞に高度に限定されるのに対し、他の組織はＲＯＲγ１を発現する（Ｅｂｅｒｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４年、３０５：２４８〜２５１頁）。 ROR isoforms exhibit different tissue expression patterns and regulate different target genes and physiological pathways. For example, RORγ2 (also called RORγ-t) is highly restricted to CD4 + CD8 + thymocytes, whereas other tissues express RORγ1 (Eberl et al., Science 2004, 305: 248-251). .

ＲＯＲは、核内受容体に特有の構造的構成を示す。ＲＯＲは、４つの主要な機能ドメイン、すなわち、アミノ末端（Ａ／Ｂ）ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ヒンジドメイン、及びリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含有する（Ｅｖａｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８年、２４０：８８９〜８９５頁）。ＤＢＤは、ＡＴリッチ配列に先行されるコンセンサスモチーフＡＧＧＴＣＡから成るＲＯＲ応答エレメント（ＲＯＲＥ）の認識に関与する、２つの高度に保存されたジンクフィンガーモチーフから成る（Ａｎｄｒｅら、Ｇｅｎｅ １９９８年、２１６：２７７〜２８３頁）。該コンセンサスモチーフは、核内受容体Ｒｅｖ−ＥｒｂＡα及びＲｅｖ−Ｅｒｂβ（それぞれ、ＮＲ１Ｄ１及びＤ２）のコンセンサスモチーフと類似している（Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９５年、２８：５９６〜５９８年）。これらの認識エレメントはまた、エストロゲン関連受容体、及び特にＥＲＲα（ＥＲＲ、ＮＲ３Ｂ１、−２、−３）（Ｖａｎａｃｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９９年、１３：７６４〜７７３頁）、ステロイド合成因子１（ＳＦ−１、ＮＲ５Ａ）及びＮＧＦＩ−Ｂ（ＮＲ４Ａ１、−２、−３）（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９３年、１３：５７９４〜５８０４頁）について同定された認識エレメントとも高度な類似性を示している。   ROR shows the structural organization unique to nuclear receptors. ROR contains four major functional domains: an amino terminal (A / B) domain, a DNA binding domain (DBD), a hinge domain, and a ligand binding domain (LBD) (Evans et al., Science 1988, 240). : 889-895). DBD consists of two highly conserved zinc finger motifs (Andre et al., Gene 1998, 216: 277) that are involved in recognition of the ROR response element (RORE) consisting of a consensus motif AGGTCA preceded by an AT-rich sequence. ~ 283). The consensus motif is similar to the consensus motif of the nuclear receptors Rev-ErbAα and Rev-Erbβ (NR1D1 and D2, respectively) (Giguree et al., Genomics 1995, 28: 596-598). These recognition elements are also estrogen-related receptors, and in particular ERRα (ERR, NR3B1, -2, -3) (Vanacker et al., Mol. Endocrinol. 1999, 13: 764-773), steroid synthesis factor 1 ( High similarity to the recognition elements identified for SF-1, NR5A) and NGFI-B (NR4A1, -2, -3) (Wilson et al., Mol. Cell Biol. 1993, 13: 5794-5804). Show.

Ｒｅｖ−Ｅｒｂ受容体は構成的転写抑制因子として作用し、及び類似のＤＮＡ認識配列に結合することから、Ｒｅｖ−Ｅｒｂ受容体は、まさに同じＤＮＡ応答エレメントをＲＯＲと奪い合うことによりＲＯＲ媒介転写活性化を抑制することができる（Ｆｏｒｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９４年、８：１２５３〜１２６１頁）。このような相互作用の生理学的意義は、体内時計の制御に重要な役割を果たす概日リズムの制御において明らかであり、概日リズムにおいて、Ｒｅｖ−Ｅｒｂ及びＲＯＲαが、それぞれＢｍａｌ１転写因子の転写を抑制及び活性化する（Ａｋａｓｈｉ及びＴａｋｕｍｉ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５年、１２：４４１〜４４８頁）。ＲＯＲのファミリーメンバーと、類似の認識エレメントに結合するＥＲＲαのような他の核内受容体との間のこのようなクロストークは、他の生理学的経路の制御でも同様に作用する可能性がある。   Since Rev-Erb receptor acts as a constitutive transcriptional repressor and binds to similar DNA recognition sequences, Rev-Erb receptor activates ROR-mediated transcriptional activation by competing with the same DNA response element for ROR. (Forman et al., Mol. Endocrinol. 1994, 8: 1253-1261). The physiological significance of such interaction is apparent in the control of circadian rhythms that play an important role in the control of the circadian clock. In circadian rhythms, Rev-Erb and RORα each transcribe Bmal1 transcription factor. Inhibits and activates (Akashi and Takumi, Nat. Struct. Mol. Biol. 2005, 12: 441-448). Such crosstalk between family members of ROR and other nuclear receptors such as ERRα that bind to similar recognition elements may work in the control of other physiological pathways as well. .

ＲＯＲαは、異なる脳領域で高度に発現され、小脳及び視床で最も高度に発現される。ＲＯＲαノックアウトマウスは、いわゆるスタゲラー（ｓｔａｇｇｅｒｅｒ）突然変異体マウス（ＲＯＲαｓｇ／ｓｇ）で示される症状に高度に類似した、強度の小脳萎縮を有する運動失調を示す。スタゲラー突然変異体マウスはＲＯＲαに突然変異を保有し、これがＬＢＤを含有しない切断ＲＯＲαをもたらす（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６年、３７９：７３６〜７３９頁）。 RORα is highly expressed in different brain regions and is most highly expressed in the cerebellum and thalamus. RORα knockout mice exhibit ataxia with intense cerebellar atrophy, highly similar to the symptoms exhibited by so-called staggerer mutant mice (RORα sg / sg ). Staggered mutant mice carry a mutation in RORα, which results in a truncated RORα that does not contain LBD (Hamilton et al., Nature 1996, 379: 736-739).

ＲＯＲαｓｇ／ｓｇスタゲラー−マウスの分析はさらに、脂質代謝に対する強い影響、すなわち血清及び肝臓トリグリセリドの著しい減少、血清ＨＤＬコレステロールレベルの低下及び肥満減少を明らかにした。ＳＲＥＢＰ１ｃ並びにコレステロールトランスポーターＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１は、スタゲラーマウスの肝臓で減少し、ＣＨＩＰ分析は、ＲＯＲαが直接動員されＳＲＥＢＰ１ｃプロモーターを調節することを示唆している。さらに、ＰＧＣ１α、ＰＧＣ１β、リピン１及びβ２アドレナリン作動性受容体は、肝臓又は白色及び褐色脂肪組織などの組織で増加することが見出され、スタゲラーマウスでの食餌性肥満に対する観察された抵抗性を説明するのに役立つ可能性がある（Ｌａｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８年、２８３：１８４１１〜１８４２１頁）。 Analysis of RORα sg / sg staggerer-mouse further revealed a strong effect on lipid metabolism, namely a significant decrease in serum and liver triglycerides, a decrease in serum HDL cholesterol levels and a decrease in obesity. SREBP1c and cholesterol transporters ABCA1 and ABCG1 are reduced in the liver of staggered mice, and CHIP analysis suggests that RORα is directly recruited to regulate the SREBP1c promoter. Furthermore, PGC1α, PGC1β, Lipin 1 and β2 adrenergic receptors have been found to be increased in tissues such as liver or white and brown adipose tissue, and observed resistance to dietary obesity in staggered mice (Lau et al., J. Biol. Chem. 2008, 283: 18411-18421).

ＲＯＲβは、より特異的に、すなわち脳の特定の領域及び網膜で発現される。ＲＯＲβノックアウトマウスは、アヒルのような歩き及び失明に至る網膜変性を示す（Ａｎｄｒｅら、ＥＭＢＯ．Ｊ．１９９８年、１７：３８６７〜３８７７頁）。この網膜変性の背後にある分子機構は、依然としてあまり理解されていない。   RORβ is expressed more specifically, ie in certain areas of the brain and in the retina. RORβ knockout mice exhibit retinal degeneration leading to duck-like walking and blindness (Andre et al., EMBO. J. 1998, 17: 3867-3877). The molecular mechanism behind this retinal degeneration is still poorly understood.

ＲＯＲγ（特にＲＯＲγ２）ヌル突然変異体マウスは、リンパ節及びパイエル板が欠如し（Ｅｂｅｒｌ及びＬｉｔｔｍａｎｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２００３年、１９５：８１〜９０頁）、リンパ組織誘導（ＬＴｉ）細胞が脾臓腸間膜及び腸から完全に欠落している。さらに、胸腺の大きさ及び胸腺細胞の数は、ダブルポジティブＣＤ４＋ＣＤ８＋及びシングルポジティブＣＤ４−ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ＣＤ８−細胞の減少により、ＲＯＲγヌルマウスで大幅に減少し（Ｓｕｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００年、２８８：２３６９〜２３７３頁）、胸腺細胞の発生におけるＲＯＲγ２の極めて重要な役割を示唆している。 RORγ (especially RORγ2) null mutant mice lack lymph nodes and Peyer's patches (Eberl and Littmann, Immunol. Rev. 2003, 195: 81-90) and lymphoid tissue-derived (LTi) cells are splenic intestine Completely missing from the mesentery and intestine. Furthermore, thymus size and thymocyte numbers are significantly reduced in RORγ null mice due to a decrease in double positive CD4 + CD8 + and single positive CD4 − CD8 + or CD4 + CD8 − cells (Sun et al., Science 2000). 288: 2369-2373), suggesting a crucial role for RORγ2 in thymocyte development.

胸腺細胞の発生は、それらの微環境により捧げられる（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）細胞集団における増殖、分化、細胞死及び遺伝子組換えという協調したサイクルを伴う複雑なプログラムをたどる。胎児の肝臓又は成人の骨髄から胸腺に移動する多能性リンパ球前駆細胞は、Ｔ細胞系列にコミットメントしている。多能性リンパ球前駆細胞は、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ細胞からＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞への一連のステップを通じて成熟し、自己ＭＨＣペプチドに対し親和性の低いものは負の選択により排除される。これらは、ＣＤ４−ＣＤ８＋（キラー）又はＣＤ４＋ＣＤ８−（ヘルパー）Ｔ細胞系列へと成熟する。ＲＯＲγ２はダブルネガティブでは発現されず、未熟なシングルネガティブ胸腺細胞ではほとんど発現されない（Ｈｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年、１６４：５６６８〜５６７４頁）が、ダブルポジティブ胸腺細胞では高度にアップレギュレートされ、シングルポジティブ胸腺細胞では分化中にダウンレギュレートされる。ＲＯＲγ欠損は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞でのアポトーシスの増加をもたらし、抹消血胸腺細胞の数は６倍減少する（１０倍（ＣＤ４＋胸腺細胞）及び３倍（ＣＤ８＋胸腺細胞））。 The development of thymocytes follows a complex program with a coordinated cycle of proliferation, differentiation, cell death and genetic recombination in a population of cells that are dedicated to their microenvironment. Pluripotent lymphocyte progenitor cells that migrate from the fetal liver or adult bone marrow to the thymus are committed to the T cell lineage. Multipotent lymphoid progenitor cells, CD4 - CD8 - mature through a series of steps from the double negative cells CD4 + CD8 + into cells, those with respect to the self-MHC-peptide low affinity is eliminated by negative selection. These mature into the CD4 − CD8 + (killer) or CD4 + CD8 − (helper) T cell lineage. RORγ2 is not expressed in double negatives and is rarely expressed in immature single negative thymocytes (He et al., J. Immunol. 2000, 164: 5668-5684), but is highly upregulated in double positive thymocytes. In single positive thymocytes, it is down-regulated during differentiation. RORγ deficiency results in increased apoptosis in CD4 + CD8 + cells and the number of peripheral blood thymocytes is reduced 6-fold (10-fold (CD4 + thymocytes) and 3-fold (CD8 + thymocytes)).

アレルギー性気道疾患モデルとしての、マウスにおけるオボアルブミン（ＯＶＡ）誘発炎症モデルでの最近の実験は、ＲＯＲγ ＫＯマウスにおけるアレルギー性表現型の重度の発達障害を示し、ＯＶＡに曝露後の肺におけるＣＤ４＋細胞数の減少並びにＴｈ２サイトカイン／ケモカインタンパク質及びｍＲＮＡ発現の減少を示した（Ｔｉｌｌｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７年、１７８：３２０８〜３２１８頁）。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０産生は、ｗｔ脾細胞と比べてＯＶＡ抗原で再刺激後に脾細胞で増加し、Ｔｈ２型応答の減少と引き換えにＴｈ１型免疫応答へ移行することを示唆した。これは、リガンドによるＲＯＲγ転写活性の下方調節が、Ｔｈ２型応答への免疫応答の同様の移行をもたらし得、特定のアレルギー性炎症疾患（ｉｎｆｒａｍｍａｔｏｒｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）の治療に有益となり得ることを示唆している。 Recent experiments with the ovalbumin (OVA) -induced inflammation model in mice as an allergic airway disease model show severe developmental impairment of the allergic phenotype in RORγ KO mice, and CD4 + in the lung after exposure to OVA It showed a decrease in cell number and a decrease in Th2 cytokine / chemokine protein and mRNA expression (Tilley et al., J. Immunol. 2007, 178: 3208-3218). IFN-γ and IL-10 production increased in splenocytes after restimulation with OVA antigen compared to wt splenocytes, suggesting a shift to a Th1-type immune response in exchange for a decrease in Th2-type response. This suggests that down-regulation of RORγ transcriptional activity by ligands can lead to a similar transition of the immune response to a Th2-type response and can be beneficial in the treatment of certain allergic inflammatory diseases. .

ヘルパーＴ細胞は、以前はＴｈ１及びＴｈ２細胞から成ると考えられていた。しかし、Ｔｈ細胞の新たなクラスである、ＩＬ−１７を産生するＴｈ１７細胞が、炎症促進性であると考えられるヘルパーＴ細胞の１つの固有のクラスとして同定された。ＩＬ−１７発現が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及びクローン病などの炎症性腸疾患又は潰瘍性大腸炎など、自己免疫病因の可能性のある多くの炎症性疾患に関連していることから、Ｔｈ１７細胞は自己免疫及び炎症性疾患における中心的存在として認識されている（Ｉｖａｎｏｖら、Ｃｅｌｌ ２００６年、１２６：１１２１〜１１３３頁；Ｔｅｓｍｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２００８年、２２３：８７〜１１３頁）。強力な自己免疫病因要素を有する別の疾患は、１型糖尿病である。最近、Ｔｈ１７細胞の活性増加と１型糖尿病との関連が導き出された（Ｂｒａｄｓｈａｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年、１８３：４４３２〜４４３９頁；Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００９年 ５８：１３０２〜１３１１頁）。乾癬、神経皮膚炎及びアトピー性湿疹など自己免疫要素を有する炎症性皮膚疾患も、Ｔｈ１７細胞の活性増加と関連していると考えられる（Ｍｉｏｓｓｅｃ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２００９年、１１：６２５〜６３０頁）。   Helper T cells were previously thought to consist of Th1 and Th2 cells. However, a new class of Th cells, Th17 cells that produce IL-17, has been identified as one unique class of helper T cells that are believed to be pro-inflammatory. IL-17 expression is associated with many inflammatory diseases that may be of autoimmune etiology such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease or ulcerative colitis Thus, Th17 cells are recognized as a central presence in autoimmune and inflammatory diseases (Ivanov et al., Cell 2006, 126: 1121-1133; Tesmer et al., Immunol. Rev. 2008, 223: 87-113). Another disease that has a strong autoimmune etiological component is type 1 diabetes. Recently, an association between increased activity of Th17 cells and type 1 diabetes has been derived (Bradshaw et al., J. Immunol. 2009, 183: 4432-4439; Emamullee et al., Diabetes. 2009 58: 1302-1131). . Inflammatory skin diseases with autoimmune factors such as psoriasis, neurodermatitis and atopic eczema are also considered to be associated with increased activity of Th17 cells (Miossec, Microbes Infect. 2009, 11: 625-630). .

ＲＯＲγ２は、免疫系細胞でもっぱら発現され、及びＴｈ１７細胞分化のマスター調節因子として同定されている。ＲＯＲγ２発現はＴＧＦ−ベータ又はＩＬ−６により誘導され、ＲＯＲγ２の過剰発現はＴｈ１７細胞系列及びＩＬ−１７発現の増加をもたらす。ＲＯＲγ２ ＫＯマウスは、腸固有層でＴｈ１７細胞をほとんど示さないが、Ｔｈ１７細胞は依然として検出できる。最近Ｙａｎｇら（２００８年）は、ＳＴＡＴ３依存的様式でＴＧＦ−ベータ及びＩＬ−６により調節される、Ｔｈ１７細胞でのＲＯＲαの発現を報告した。ＲＯＲα及びＲＯＲγ２における二重突然変異は、インビトロ及びインビボでＴｈ１７の分化を完全に抑制し、及びＥＡＥ（実験的自己免疫性脳炎）モデルでの症状の出現を完全に阻害した（Ｙａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００８年、２８：２９〜３９頁）。これは、ＲＯＲγ２及びＲＯＲαがＴｈ１７の発生を相乗的に制御することを示唆している。ＲＯＲγ２及びＲＯＲαの両方の阻害剤は、炎症性疾患においてＴｈ１７細胞の発生及び炎症促進性ＩＬ−１７の発現を抑制することができる。Ｔｈ１７細胞発生の抑制によるＩＬ−１７産生の抑制はまた、ＩＬ−１７が深く関与するアトピー性皮膚炎及び乾癬でも有利になり得る。興味深いことに、ＩＬ−１０は、マクロファージ及びＴ細胞の両方に分泌されるＩＬ−１７の発現を抑制するという最近の証拠が示された。さらに、Ｔｈ１７転写因子ＲＯＲγ２の発現が抑制された（Ｇｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年、３８：１８０７〜１８１３頁）。さらに、ＩＬ−１０欠損マウスは、Ｔｈ１型炎症反応への移行がしばしば観察される、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の優れたモデルを提供する。経口ＩＬ−１０送達は、ＩＢＤの治療選択肢の可能性を有する。   RORγ2 is expressed exclusively in immune system cells and has been identified as a master regulator of Th17 cell differentiation. RORγ2 expression is induced by TGF-beta or IL-6, and overexpression of RORγ2 results in increased Th17 cell lineage and IL-17 expression. RORγ2 KO mice show few Th17 cells in the lamina propria, but Th17 cells can still be detected. Recently, Yang et al. (2008) reported the expression of RORα in Th17 cells regulated by TGF-beta and IL-6 in a STAT3-dependent manner. Double mutations in RORα and RORγ2 completely suppressed Th17 differentiation in vitro and in vivo and completely inhibited the appearance of symptoms in an EAE (experimental autoimmune encephalitis) model (Yang et al., Immunity 2008). Year 28: 29-39). This suggests that RORγ2 and RORα synergistically control Th17 generation. Inhibitors of both RORγ2 and RORα can suppress Th17 cell development and pro-inflammatory IL-17 expression in inflammatory diseases. Suppression of IL-17 production by suppression of Th17 cell development can also be advantageous in atopic dermatitis and psoriasis, where IL-17 is deeply involved. Interestingly, recent evidence has shown that IL-10 suppresses the expression of IL-17 secreted by both macrophages and T cells. Furthermore, the expression of Th17 transcription factor RORγ2 was suppressed (Gu et al., Eur. J. Immunol. 2008, 38: 1807-1813). Furthermore, IL-10 deficient mice provide an excellent model of inflammatory bowel disease (IBD), where a transition to a Th1-type inflammatory response is often observed. Oral IL-10 delivery has potential therapeutic options for IBD.

ＲＯＲγ１は、筋肉並びに膵臓、胸腺、前立腺、肝臓及び精巣を含むいくつかの他の組織で発現される。ＲＯＲγ１のドミナントアクティブ及びドミナントネガティブバージョンの異所性過剰発現は、この受容体が、脂質代謝（ＦＡＢＰ４、ＣＤ３６、ＬＰＬ及びＵＣＰ３）、コレステロール流出（ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１）（炭水化物代謝（ＧＬＵＴ５、アディポネクチン受容体２及びＩＬ−１５）及び筋肉量（ミオスタチン及びＩＬ−１５）に関与する遺伝子を制御することを示した。   RORγ1 is expressed in muscle and several other tissues including pancreas, thymus, prostate, liver and testis. Ectopic overexpression of dominant active and dominant negative versions of RORγ1 indicates that the receptors are lipid metabolism (FABP4, CD36, LPL and UCP3), cholesterol efflux (ABCA1, ABCG1) (carbohydrate metabolism (GLUT5, adiponectin receptor 2 And IL-15) and genes involved in muscle mass (myostatin and IL-15) have been shown to be regulated.

ＲＯＲα１及びＲＯＲγ１は肝臓で発現され、及び２４時間周期で変動する。ダブルＫＯマウスは、これらの遺伝子が、３−ベータ−ヒドロキシステロイド脱水素酵素、Ｃｙｐ４５０酵素及び硫酸転移酵素を含む第Ｉ相及び第ＩＩ相代謝酵素の調節に関与することを示し、ステロイド、胆汁酸及び異物代謝における重要な役割を示唆している（Ｋａｎｇら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００７年、３１：２８１〜２９４頁）。調節される遺伝子の１つは、コレステロール代謝に重要な役割を果たすＣｙｐ７ｂ１であることが示され、ＲＯＲαがＣｙｐ７ｂ１の調節に必要及び十分であることが示された。ＲＯＲα及びＬＸＲα ＫＯマウスにおける標的遺伝子の分析は、両方の受容体が、それぞれの標的遺伝子により相互に抑制されているという仮説を提起した（Ｗａｄａら、Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２００８年、２３３：１１９１〜１２０１頁）。   RORα1 and RORγ1 are expressed in the liver and vary with a 24-hour cycle. Double KO mice show that these genes are involved in the regulation of phase I and phase II metabolic enzymes, including 3-beta-hydroxysteroid dehydrogenase, Cyp450 enzyme and sulfotransferase, steroids, bile acids And suggests an important role in xenobiotic metabolism (Kang et al., Physiol. Genomics 2007, 31: 281-294). One of the genes that are regulated has been shown to be Cyp7b1, which plays an important role in cholesterol metabolism, and RORα has been shown to be necessary and sufficient for regulation of Cyp7b1. Analysis of target genes in RORα and LXRα KO mice raised the hypothesis that both receptors are repressed by their respective target genes (Wada et al., Exp. Biol. Med. 2008, 233: 1191). ~ 1201).

ＲＯＲに対するリガンド：
コレステロール及びその硫酸化誘導体は、ＲＯＲαリガンドとして機能する可能性があること、及び特にコレステロール硫酸は、コレステロール除去細胞においてＲＯＲαの転写活性を回復させ得ることが報告された（Ｋａｌｌｅｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２００２年、１０：１６９７〜１７０７頁）。以前、メラトニン（Ｍｉｓｓｂａｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８年、２７１：１３５１５〜１３５２２頁）及びチアゾリジンジオンは、ＲＯＲαに結合することが示唆された（Ｗｉｅｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９９５年、２３：３２７〜３３３頁）。しかし、これらのいずれも、ＲＯＲα又はいずれかの他のＲＯＲの機能的リガンドであることは示されていない。オールトランスレチノイド酸を含む特定のレチノイドは、ＲＯＲβに結合し、及びＲＯＲβの部分アンタゴニストとして機能することが示されたが、ＲＯＲαでは示されていない（Ｓｔｅｈｌｉｎ−Ｇａｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３年、１０：８２０〜８２５頁）。しかし、ＲＯＲガンマ調節化合物を求めて物質ライブラリーをスクリーニングする方法を生み出す潜在的基盤として、マウス及びヒトＲＯＲガンマ ｃＤＮＡのクローニング（Ｍｅｄｖｅｄｅｖら、Ｇｅｎｅ １９９６年、１８１：１９９〜２０６頁、国際公開第２０００／２４７５７号）が記載されているのにもかかわらず、これらのリガンド又はいずれか他のリガンドはどれもまだ、ＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２に結合及び／又はＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２の転写活性を調節することが記載されていない。 Ligand for ROR:
It has been reported that cholesterol and its sulfated derivatives may function as RORα ligands, and in particular that cholesterol sulfate can restore the transcriptional activity of RORα in cholesterol-depleted cells (Kallen et al., Structure 2002, 10: 1697-1707). Previously, melatonin (Missbach et al., J. Biol. Chem. 1998, 271: 13515-13522) and thiazolidinedione have been suggested to bind to RORα (Wiesenberg et al., Nucleic Acid Res. 1995, 23: Pp. 327-333). However, none of these have been shown to be functional ligands of RORα or any other ROR. Certain retinoids, including all-trans retinoid acids, have been shown to bind to RORβ and function as partial antagonists of RORβ, but not to RORα (Stehlin-Gaon et al., Nat. Struct. Biol. 2003. Year, 10: 820-825). However, as a potential basis for generating methods for screening substance libraries for ROR gamma-modulating compounds, cloning of mouse and human ROR gamma cDNA (Meddevev et al., Gene 1996, 181: 199-206, International Publication No. 2000). No./24757) is described, but any of these ligands or any other ligand is still described to bind to RORγ1 or RORγ2 and / or modulate the transcriptional activity of RORγ1 or RORγ2. Not.

したがって、オーファン核内受容体ＲＯＲγ１及び／又はＲＯＲγ２に結合する化合物を提供すること、並びに故に、自己免疫疾患、炎症性皮膚疾患又は多発性硬化症など、ＲＯＲガンマの調節に関連した疾患の新規の治療方法を公開することが本発明の目的である。   Accordingly, providing compounds that bind to the orphan nuclear receptor RORγ1 and / or RORγ2 and thus novel of diseases associated with modulation of RORgamma, such as autoimmune diseases, inflammatory skin diseases or multiple sclerosis It is an object of the present invention to disclose a method of treatment.

さらに、ＲＯＲガンマのリガンドを同定及び前記リガンドの活性を測定するためのスクリーニング方法を提供することが本発明の目的である。   Furthermore, it is an object of the present invention to provide a screening method for identifying a ligand for ROR gamma and measuring the activity of said ligand.

この目的は、ヒトＲＯＲガンマに対する低分子リガンドの驚くべき発見により解決される。これらのリガンドにはレチノイドがあるが、レキシノイドもある。   This object is solved by the surprising discovery of small molecule ligands for human ROR gamma. These ligands include retinoids, but there are also rexinoids.

故に、本発明は、ＲＯＲガンマ受容体の不活性化又は活性化に関連した疾患又は障害の治療又は予防に使用することができるＲＯＲガンマモジュレーターを提供する。   Therefore, the present invention provides ROR gamma modulators that can be used for the treatment or prevention of diseases or disorders associated with inactivation or activation of ROR gamma receptors.

本発明は、細胞培養系又は生化学無細胞インビトロアッセイ系においてＲＯＲガンマ活性の計測値を誘導又は低減するのに十分な、本明細書に記載されたようなＲＯＲガンマモジュレーターの有効量をこのような細胞培養系又はアッセイ系に投与するステップを含む、このような細胞培養系又は生化学アッセイ系におけるＲＯＲガンマ活性の調節方法をさらに提供する。   The present invention thus provides an effective amount of a ROR gamma modulator as described herein sufficient to induce or reduce a measurement of ROR gamma activity in a cell culture system or a biochemical cell-free in vitro assay system. Further provided is a method of modulating ROR gamma activity in such a cell culture system or biochemical assay system, comprising administering to such cell culture system or assay system.

さらに、本発明は、本明細書に記載された方法により同定された化合物に関する。   Furthermore, the present invention relates to compounds identified by the methods described herein.

ＲＯＲガンマ−リガンド結合ドメイン（ＲＯＲγ−ＬＢＤ）に結合した放射性Ｈ３−２５−ヒドロキシコレステロールの、本明細書に記載の化合物による置換が測定された、放射性リガンド置換アッセイの結果を示す図である。FIG. 4 shows the results of a radioligand displacement assay in which the displacement of radioactive H 3 -25-hydroxycholesterol bound to a ROR gamma-ligand binding domain (RORγ-LBD) with a compound described herein was measured. 本発明で使用される化合物の構造式を示す図である。It is a figure which shows the structural formula of the compound used by this invention. 本発明で使用される化合物の構造式を示す図である。It is a figure which shows the structural formula of the compound used by this invention. 用量反応様式での、抹消血ヒト単核細胞（ＰＢＭＣ）における化合物ＬＥ１３５によるＩＬ−１７レベルの低下を示す図である。FIG. 11 shows the reduction of IL-17 levels by compound LE135 in peripheral blood human mononuclear cells (PBMC) in a dose response manner.

本発明は、ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害の治療又は予防に使用するためのＲＯＲガンマモジュレーターに関する。   The present invention relates to ROR gamma modulators for use in the treatment or prevention of diseases or disorders associated with the inhibition or activation of ROR gamma receptors.

本発明はまた、ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害を治療又は予防する医薬品を調製するためのＲＯＲガンマモジュレーターの使用にも関する。   The invention also relates to the use of a ROR gamma modulator for the preparation of a medicament for treating or preventing a disease or disorder associated with inhibition or activation of the ROR gamma receptor.

本発明はまた、ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ＲＯＲガンマモジュレーターの有効量をこのような治療を必要とする被験者に投与することを含む方法にも関する。   The present invention is also a method of treating or preventing a disease or disorder associated with ROR gamma receptor inhibition or activation, wherein an effective amount of a ROR gamma modulator is administered to a subject in need of such treatment. It also relates to a method comprising:

ＲＯＲガンマ受容体の調節に関連した疾患又は障害を治療する場合、前記受容体の活性は好ましくは低減される。   When treating a disease or disorder associated with modulation of ROR gamma receptors, the activity of said receptors is preferably reduced.

好ましくは、疾患又は障害は、自己免疫疾患、炎症性皮膚疾患及び多発性硬化症から成る、Ｔｈ１７関連組織炎症を有する疾患群から選択される。   Preferably, the disease or disorder is selected from the group of diseases having Th17-related tissue inflammation consisting of autoimmune diseases, inflammatory skin diseases and multiple sclerosis.

本発明で使用されるＲＯＲガンマモジュレーターは、以下の構造を有する式（Ｉ）   The ROR gamma modulator used in the present invention has formula (I) having the following structure:

Figure 2012506998

の化合物又は溶媒和物又は薬学的に許容可能なこの塩（式中
Ｒ５はＣＯＮＨＲ８、ＮＨＣＯＲ８、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨＲ８、Ｃ≡ＣＲ８、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、５〜６員環ヘテロシクリル−Ｒ８であり、
Ｒ６は水素であり、
Ｒ５及びＲ６は共に
Figure 2012506998
Of the compound or a solvate or pharmaceutically acceptable salt thereof (wherein R 5 is CONHR 8, NHCOR 8, C ( O) R 8, CH = CHR 8, C (CH 3) = CHR 8, C≡ CR 8 , CH (OH) CH═CHR 8 , C (O) CH═CHR 8 , 5-6 membered heterocyclyl-R 8 ,
R 6 is hydrogen;
R 5 and R 6 are both

Figure 2012506998

も形成することができ
Ｒ７は水素、フッ素、塩素又はヒドロキシであり、
Ｒ８は４−イル−安息香酸又は６−イル−２−ナフトエ酸であり、
Ｒ９及びＲ１０は水素であり、又はＲ９及びＲ１０はこれらが付着する結合と共に融合５〜１０員のへテロ芳香族環又は芳香族環で、単環又は二環を形成する）
を好ましくは含む。
Figure 2012506998
R 7 is hydrogen, fluorine, chlorine or hydroxy,
R 8 is 4-yl-benzoic acid or 6-yl-2-naphthoic acid,
R 9 and R 10 are hydrogen, or R 9 and R 10 are a fused 5-10 membered heteroaromatic ring or aromatic ring together with the bond to which they are attached to form a monocyclic or bicyclic ring)
Is preferably included.

上記及び以下では、使用される用語は、下記の通り独立に意味を有する。   Above and below, the terms used have their meanings independently as follows.

５〜１０員の芳香族単環又は二環部分は、好ましくはフェニル、ビフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インデニル及びフェナントレニル、より好ましくはフェニル及びナフチルから選択される。   The 5- to 10-membered aromatic monocyclic or bicyclic moiety is preferably selected from phenyl, biphenyl, naphthyl, tetrahydronaphthyl, fluorenyl, indenyl and phenanthrenyl, more preferably phenyl and naphthyl.

５〜１０員のへテロ芳香族単環又は二環は、４〜９個の炭素原子並びにＯ、Ｎ及び／又はＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１個の環を有する環系である。好ましくは、ヘテロアリルは、Ｏ及び／又はＮから選択される１、２、３又は４個、より好ましくは１、２又は３個のヘテロ原子を含有し、並びにピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル及びフロピリジニルから好ましくは選択される。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。好ましいヘテロアリールには、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル及びトリアゾリルが含まれる。   A 5- to 10-membered heteroaromatic monocycle or bicycle comprises at least one ring containing 4 to 9 carbon atoms and at least one heteroatom selected from O, N and / or S. It has a ring system. Preferably the heteroallyl contains 1, 2, 3 or 4 heteroatoms selected from O and / or N, more preferably 1, 2 or 3 and pyridinyl, imidazolyl, pyrimidinyl, pyrazolyl, triazolyl , Pyrazinyl, tetrazolyl, furyl, thienyl, isoxazolyl, thiazolyl, oxazolyl, isothiazolyl, pyrrolyl, quinolinyl, isoquinolinyl, indolyl, benzimidazolyl, benzofuranyl, cinnolinyl, indazolyl, indolizinyl, phthalazinyl, pyridazinyl, triazinyl oxazolyl Triazolyl, thiadiazolyl, thiadiazolyl, furazanyl, benzofurazanyl, benzothiophenyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, key Zoriniru, quinoxalinyl, preferably from naphthyridinyl and furopyridinyl is selected. Spiro moieties are also included within this definition. Preferred heteroaryls include pyridinyl, imidazolyl, pyrimidinyl, pyrazolyl, triazolyl, pyrazinyl, tetrazolyl, isoxazolyl, oxazolyl, isothiazolyl, oxadiazolyl and triazolyl.

ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ及び／又はＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子並びに１、２、３、４、又は５個の炭素原子を含有する５〜６員の飽和環又は不飽和環である。好ましくは、ヘテロシクリルは、Ｏ及び／又はＮから選択される１、２、３又は４個、より好ましくは１、２又は３個のヘテロ原子を含有する。ヘテロシクリルには、単環系及び二環系が含まれ、並びにピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニルイミダゾリニル、イミダゾリジニル、アゼチジン−２−オン−１−イル、ピロリジン−２−オン−１−イル、ピペリド−２−オン−１−イル、アゼパン−２−オン−１−イル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、アザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、３Ｈ−インドリル及びキノリジニルから好ましくは選択される。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。   Heterocyclyl is a 5-6 membered saturated or unsaturated ring containing at least one heteroatom selected from O, N and / or S and 1, 2, 3, 4, or 5 carbon atoms. is there. Preferably, the heterocyclyl contains 1, 2, 3 or 4 selected from O and / or N, more preferably 1, 2 or 3 heteroatoms. Heterocyclyl includes monocyclic and bicyclic systems and includes pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, dihydrofuranyl, tetrahydrothienyl, tetrahydropyranyl, dihydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl, piperidino, morpholino, thiomorpholino, thioxanyl, Piperazinyl, homopiperazinyl, azetidinyl, oxetanyl, thietanyl, homopiperidinyl, oxepanyl, thiepanyl, oxazepinyl, diazepinyl, thiazepinyl, 1,2,3,6-tetrahydropyridinyl, 2-pyrrolinyl, 3-pyrrolinyl, indolinyl, 2H-pyranyl, 4H -Pyranyl, dioxanyl, 1,3-dioxolanyl, pyrazolinyl, dithianyl, dithiolanyl, dihydropyranyl, dihydrothienyl, dihydrofuranyl, pyrazolyl Nilimidazolinyl, imidazolidinyl, azetidin-2-one-1-yl, pyrrolidin-2-one-1-yl, piperid-2-one-1-yl, azepan-2-one-1-yl, 3-azabicyclo It is preferably selected from [3.1.0] hexanyl, 3-azabicyclo [4.1.0] heptanyl, azabicyclo [2.2.2] hexanyl, 3H-indolyl and quinolidinyl. Spiro moieties are also included within this definition.

本発明で使用される化合物の好ましい実施形態は、図２に示されている。   A preferred embodiment of the compound used in the present invention is shown in FIG.

本発明で使用される化合物は、薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物の形態であってもよい。用語「薬学的に許容可能な塩」は、無機塩基又は酸及び有機塩基又は酸を含む、薬学的に許容可能な非毒性塩基又は酸から調製される塩をいう。本発明の化合物が１つ又は複数の酸性基又は塩基性基を含有する場合、本発明は、これらの対応する薬学的に又は毒性学的に許容可能な塩、特にこれらの薬学的に利用可能な塩も含む。故に、酸性基を含有する本発明の化合物は、これらの基に存在することができ、及び例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩として、本発明により使用することができる。このような塩のより正確な例には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、又はアンモニア若しくは、例えば、エチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン若しくはアミノ酸などの有機アミンとの塩が含まれる。１つ又は複数の塩基性基（すなわちプロトン化することができる基）を含有する本発明の化合物は、無機又は有機酸との付加塩の形態で存在することができ、及び無機又は有機酸との付加塩の形態で本発明により使用することができる。適切な酸の例には、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸、及び当業者に既知の他の酸が含まれる。本発明の化合物が分子中に酸性及び塩基性基を同時に含有する場合、本発明には、言及された塩形態に加えて、分子内塩又はベタイン（双性イオン）も含まれる。各塩は、当業者に既知の慣習的方法により、例えば、溶媒若しくは分散剤中で有機若しくは無機酸若しくは塩基とこれらを接触させることにより、又は他の塩とのアニオン交換若しくはカチオン交換により得ることができる。本発明は、低い生理的適合性のために、医薬品での使用には直接適さないが、例えば、化学反応用又は薬学的に許容可能な塩の調製用の中間体として使用することができる本発明の化合物の全ての塩も含む。   The compounds used in the present invention may be in the form of pharmaceutically acceptable salts or solvates. The term “pharmaceutically acceptable salts” refers to salts prepared from pharmaceutically acceptable non-toxic bases or acids including inorganic bases or acids and organic bases or acids. Where the compounds of the present invention contain one or more acidic or basic groups, the present invention relates to their corresponding pharmaceutically or toxicologically acceptable salts, in particular their pharmaceutically usable Salt. Thus, the compounds of the invention containing acidic groups can be present in these groups and can be used according to the invention, for example as alkali metal salts, alkaline earth metal salts or ammonium salts. More precise examples of such salts include sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, or salts with ammonia or organic amines such as ethylamine, ethanolamine, triethanolamine or amino acids. . Compounds of the present invention containing one or more basic groups (ie, groups that can be protonated) can exist in the form of addition salts with inorganic or organic acids, and with inorganic or organic acids Can be used according to the invention in the form of an addition salt. Examples of suitable acids include hydrogen chloride, hydrogen bromide, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalene disulfonic acid, oxalic acid, acetic acid, tartaric acid, lactic acid, salicylic acid, benzoic acid, Formic acid, propionic acid, pivalic acid, diethyl acetic acid, malonic acid, succinic acid, pimelic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, sulfamic acid, phenylpropionic acid, gluconic acid, ascorbic acid, isonicotinic acid, citric acid, adipine Acids and other acids known to those skilled in the art are included. When the compounds of the present invention contain both acidic and basic groups in the molecule, the present invention includes internal salts or betaines (zwitterions) in addition to the mentioned salt forms. Each salt is obtained by conventional methods known to those skilled in the art, for example by contacting them with an organic or inorganic acid or base in a solvent or dispersant, or by anion or cation exchange with other salts. Can do. The present invention is not directly suitable for use in pharmaceuticals due to its low physiological compatibility, but can be used, for example, as an intermediate for chemical reactions or for the preparation of pharmaceutically acceptable salts. Also included are all salts of the compounds of the invention.

実用において、本発明に使用される化合物は、従来の薬学的配合技術により医薬担体との緊密な混合における活性成分として組み合わせることができる。担体は、投与（例えば、経口又は非経口（静脈内を含む））に望ましい製剤の形態に応じて多種多様な形態をとることができる。経口剤形のための組成物の調製では、例えば、懸濁液、エリキシル剤及び溶液などの経口液体製剤の場合、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存料、着色剤等などの通常の医薬媒体のいずれかを、又は例えば、粉末、硬及び軟カプセル並びに錠剤などの経口固体製剤の場合、デンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等などの担体を使用することができ、固体経口製剤は液体製剤よりも好ましい。   In practice, the compounds used in the present invention can be combined as active ingredients in intimate mixing with a pharmaceutical carrier by conventional pharmaceutical compounding techniques. The carrier may take a wide variety of forms depending on the form of preparation desired for administration (eg, oral or parenteral (including intravenous)). In the preparation of compositions for oral dosage forms, for example, in the case of oral liquid preparations such as suspensions, elixirs and solutions, for example, water, glycols, oils, alcohols, flavoring agents, preservatives, coloring agents, etc. Or in the case of oral solid preparations such as powders, hard and soft capsules and tablets, starches, sugars, microcrystalline cellulose, diluents, granulating agents, lubricants, binders In addition, carriers such as disintegrants can be used, and solid oral preparations are preferred over liquid preparations.

投与の容易さのために、錠剤及びカプセルは最も有利な経口投与単位形態であり、この場合明らかに固体医薬担体が使用される。所望の場合、錠剤は、標準の水性又は非水性法により被覆することができる。このような組成物及び製剤は、少なくとも０．１パーセントの活性化合物を含有するべきである。これらの組成物中の活性化合物のパーセンテージは、当然変えることができ、及び好都合には、単位の重量の約２パーセント〜約６０パーセントであってよい。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効用量が得られるような量である。活性化合物は、例えば、液滴又はスプレーとして鼻腔内投与することもできる。   Because of their ease of administration, tablets and capsules represent the most advantageous oral dosage unit form in which case solid pharmaceutical carriers are obviously employed. If desired, tablets can be coated by standard aqueous or nonaqueous methods. Such compositions and preparations should contain at least 0.1 percent of active compound. The percentage of active compound in these compositions can, of course, vary and may conveniently be from about 2 percent to about 60 percent of the weight of the unit. The amount of active compound in such therapeutically useful compositions is such that an effective dosage will be obtained. The active compound can also be administered intranasally, for example, as droplets or sprays.

錠剤、ピル、カプセル等は、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；及びショ糖、乳糖又はサッカリンなどの甘味剤も含有することができる。投与単位形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有してもよい。   Tablets, pills, capsules and the like are binders such as gum tragacanth, gum arabic, corn starch or gelatin; excipients such as dicalcium phosphate; disintegrants such as corn starch, potato starch and alginic acid; lubricants such as magnesium stearate; And sweetening agents such as sucrose, lactose or saccharin. When the dosage unit form is a capsule, it may contain, in addition to the above types of materials, a liquid carrier such as fatty oil.

さまざまな他の材料が、コーティングとして、又は投与単位の物理的形態を修飾するために存在してもよい。例えば、錠剤は、セラック、糖又は両方で被覆することができる。シロップ又はエリキシル剤は、活性成分に加えて、甘味料としてのショ糖、保存料としてのメチル及びプロピルパラベン、色素並びにサクランボ又はオレンジ風味などの香料を含有してもよい。   A variety of other materials may be present as coatings or to modify the physical form of the dosage unit. For instance, tablets may be coated with shellac, sugar or both. A syrup or elixir may contain, in addition to the active ingredient, sucrose as a sweetening agent, methyl and propylparabens as preservatives, a dye and flavoring such as cherry or orange flavor.

本発明で使用される化合物は、非経口投与することもできる。これらの活性化合物の溶液又は懸濁液は、ヒドロキシ−プロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及び油中のこれらの混合物中で調製することができる。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための保存料を含有する。   The compounds used in the present invention can also be administered parenterally. Solutions or suspensions of these active compounds can be prepared in water suitably mixed with a surfactant such as hydroxy-propylcellulose. Dispersions can also be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols and mixtures thereof in oil. Under ordinary conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.

注射用途に適した医薬品形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、該形態は、滅菌されていなければならず、及び容易に注射できる程度に流動性でなければならない。該形態は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、並びに細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。   Pharmaceutical forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. In all cases, the form must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. The form must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (eg glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol), suitable mixtures thereof, and vegetable oils.

ここから
任意の適切な投与経路が、哺乳動物、特にヒトに本発明の化合物の有効用量を提供するのに使用され得る。例えば、経口、直腸、局所、非経口、眼内、肺内、鼻腔内等が使用され得る。剤形には、錠剤、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、エアロゾル等が含まれる。好ましくは、本発明の化合物は経口投与される。 From here, any suitable route of administration can be used to provide an effective dose of a compound of the invention to a mammal, particularly a human. For example, oral, rectal, topical, parenteral, intraocular, intrapulmonary, intranasal, etc. can be used. Dosage forms include tablets, troches, dispersions, suspensions, solutions, capsules, creams, ointments, aerosols and the like. Preferably the compounds of the invention are administered orally.

使用される活性成分の有効用量は、使用される特定の化合物、投与様式、治療される疾患及び治療される疾患の重症度に応じて変わり得る。このような用量は、当業者に容易に確認され得る。   The effective dosage of active ingredient employed may vary depending on the particular compound employed, the mode of administration, the disease being treated and the severity of the disease being treated. Such dosage may be ascertained readily by a person skilled in the art.

式（Ｉ）の化合物が適応されるＲＯＲガンマ媒介性疾患を治療又は予防する場合、化合物が、動物の体重１キログラム当たり約０．１ミリグラム〜約１００ミリグラムの日用量で投与、好ましくは１日１回投与として若しくは１日２〜６回の分割投与で、又は持続放出形態で与えられる場合に、概ね満足な結果が得られる。大部分の大型哺乳動物について、合計日用量は約１ミリグラム〜約１，０００ミリグラム、好ましくは約１ミリグラム〜約５０ミリグラムである。７０ｋｇの成人の場合では、合計日用量は一般に約７ミリグラム〜約３５０ミリグラムとなろう。この投与レジメンは、最適な治療反応を得るように調節することができる。   When treating or preventing a ROR gamma mediated disease to which a compound of formula (I) is indicated, the compound is administered at a daily dose of about 0.1 milligrams to about 100 milligrams per kilogram of animal body weight, preferably one day Satisfactory results are obtained when given as a single dose or in divided doses 2-6 times daily or in sustained release form. For most large mammals, the total daily dose is from about 1 milligram to about 1,000 milligrams, preferably from about 1 milligram to about 50 milligrams. For a 70 kg adult, the total daily dose will generally be from about 7 milligrams to about 350 milligrams. This dosage regimen may be adjusted to provide the optimal therapeutic response.

初めて、本発明は、ＲＯＲガンマ受容体に結合するモジュレーター（以下ではリガンドとも呼ばれる）を記載する。驚くべきことに、式（Ｉ）の化合物などの特定の合成レチノイドは、ＲＯＲガンマ受容体のモジュレーターとして作用することが見出された。   For the first time, the present invention describes modulators (hereinafter also referred to as ligands) that bind to the ROR gamma receptor. Surprisingly, it has been found that certain synthetic retinoids such as compounds of formula (I) act as modulators of the ROR gamma receptor.

式（Ｉ）の化合物は、ＳＲＣ−１又はＴＩＦ−２などのコアクチベーター由来ペプチドとのＲＯＲγリガンド結合ドメインの構成的相互作用を用量依存的に調節する点で、拮抗活性を示す。   The compounds of formula (I) exhibit antagonistic activity in that they modulate the constitutive interaction of the RORγ ligand binding domain with coactivator-derived peptides such as SRC-1 or TIF-2 in a dose-dependent manner.

ＲＯＲγリガンド結合ドメインと該ペプチドとの間の相互作用は、均一ＦＲＥＴベースのリガンド検出アッセイにより判定することができることが驚くべきことに見出された。   It was surprisingly found that the interaction between the RORγ ligand binding domain and the peptide can be determined by a homogeneous FRET-based ligand detection assay.

飽和濃度（５００ｎＭ）で３Ｈ−２５−ヒドロキシコレステロールを用いる特定の放射性置換アッセイでは、非標識２５−ヒドロキシコレステロール、ＬＥ５４０、ＴＴＮＰＢ又はＣＨ５５による用量依存的競合置換が起こった（図１参照）。 In certain radioactive displacement assays using 3 H-25-hydroxycholesterol at a saturating concentration (500 nM), dose-dependent competitive displacement with unlabeled 25-hydroxycholesterol, LE540, TTNPB or CH55 occurred (see FIG. 1).

受容体活性調節特性を有する、ＲＯＲγに対する高親和性リガンドの同定は、該分野に精通した専門家が低分子ライブラリーから新規の作動性及び拮抗性ＲＯＲγリガンドを同定するアッセイを確立できるようにするための土台である。ＲＯＲγ１及びＲＯＲγ２に結合する並びにＲＯＲγ１及びＲＯＲγ２の活性を調節するリガンドの同定は、ＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２の活性により直接又は間接的に制御される疾患の治療のため開発される可能性を有する、新規の低分子ベースの薬剤を開発するための第一必須ステップである。このような疾患には、炎症性疾患、関節リウマチ、自己免疫疾患又は全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病）、潰瘍性大腸炎、１型糖尿病などの自己免疫要素を有する疾患、及びアトピー性湿疹又は乾癬などの炎症性皮膚疾患、多発性硬化症又は類似の疾患が含まれるが、これらに限定されない。   Identification of high-affinity ligands for RORγ with receptor activity-modulating properties enables experts familiar with the field to establish assays to identify new agonistic and antagonistic RORγ ligands from small molecule libraries It is the foundation for. The identification of ligands that bind to RORγ1 and RORγ2 and modulate the activity of RORγ1 and RORγ2 has the potential to be developed for the treatment of diseases that are directly or indirectly controlled by the activity of RORγ1 or RORγ2. This is the first essential step for developing molecular-based drugs. Such diseases include inflammatory diseases, rheumatoid arthritis, autoimmune diseases or systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel diseases (Crohn's disease), ulcerative colitis, diseases having autoimmune elements such as type 1 diabetes, and atopy Inflammatory skin diseases such as eczema or psoriasis, multiple sclerosis or similar diseases include, but are not limited to.

故に、本発明はまた、ＲＯＲガンマ受容体の新規のリガンドを同定する方法にも関する。   Thus, the present invention also relates to a method for identifying novel ligands for ROR gamma receptors.

一般に、さまざまなアッセイ系を核内受容体リガンドの新たな同定に使用することができる。このようなアッセイ系は、天然の細胞環境由来の精製受容体、若しくは好ましくは、研究中の核内受容体の精製組換えバージョンを使用するどちらかの生化学、無細胞アッセイであり、又はこれらは、細胞ベースのアッセイ系である。研究中の核内受容体は、通常、完全長受容体として、又は核内受容体のリガンド結合ドメインを構成するようなアミノ酸残基を少なくともカバーする、この部分として使用される。リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、ＤＮＡ結合ドメインを含有する高度に保存されたジンクフィンガーから遠位又はＣ末端に、及びより保存度の低いヒンジ領域から核内受容体のＣ末端まで伸展するような、核内受容体のタンパク質ドメインとして定義される。   In general, various assay systems can be used for new identification of nuclear receptor ligands. Such an assay system is either a biochemical, cell-free assay using purified receptors derived from the natural cellular environment, or preferably a purified recombinant version of the nuclear receptor under study, or these Is a cell-based assay system. The nuclear receptor under investigation is usually used as a full-length receptor or as this part that covers at least the amino acid residues that make up the ligand binding domain of the nuclear receptor. The ligand binding domain (LBD) extends from the highly conserved zinc finger containing the DNA binding domain to the distal or C-terminus and from the less conserved hinge region to the C-terminus of the nuclear receptor. , Defined as the protein domain of the nuclear receptor.

生化学アッセイでは、核内受容体又はこのＬＢＤ含有部分は、大腸菌、酵母、バキュロウイルス誘導昆虫細胞又は哺乳動物細胞培養系などの通常の発現系の１つにおいて組換え発現される。核内受容体発現コンストラクトは、天然、すなわち自然発生アミノ酸配列に完全に類似していてもよく、又は、好ましくは、該コンストラクトは、精製を容易にするため親和性タグに似た特定の人工アミノ酸ストレッチを含有してもよい。或いは、ＮＲコンストラクトは、親和性タグ（すなわち局在化タグ）として、又はフォールディング及び安定化の補助として作用する別のタンパク質又はタンパク質ドメインに融合されてもよい。   In biochemical assays, the nuclear receptor or this LBD-containing portion is recombinantly expressed in one of the normal expression systems such as E. coli, yeast, baculovirus derived insect cells or mammalian cell culture systems. The nuclear receptor expression construct may be completely similar to the natural, ie, naturally occurring amino acid sequence, or preferably the construct is a specific artificial amino acid that resembles an affinity tag to facilitate purification. You may contain a stretch. Alternatively, the NR construct may be fused to another protein or protein domain that acts as an affinity tag (ie, a localization tag) or as an aid to folding and stabilization.

組換え発現されたＮＲタンパク質は、次いでタンパク質発現及び精製の、当業者に利用可能な標準的な方法を用いて、リガンド結合活性の特徴付けを可能にする程度まで精製される。リガンドスクリーニングの目的のため、組換えＮＲタンパク質はこれ自体として使用されてもよく、又は該タンパク質は標識試薬でさらに標識若しくは装飾されてもよい。非修飾タンパク質は、放射性標識又は蛍光標識された本物のリガンドが参照リガンドとして利用可能な、放射性リガンド又は蛍光リガンド置換アッセイにおいて使用することができる。ＦＲＥＴ又はアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）（登録商標）型アッセイでの使用では、組換えＮＲタンパク質は、親和性タグに対するユーロピウム−キレートフルオロフォア含有抗体などのさらなる試薬で装飾されなければならない。このような装飾試薬は、第２試薬によりさらに転移、増強又は補足され得る１次シグナルを発する。ＦＲＥＴアッセイの場合では、第２試薬は、ＮＲタンパク質に付加される第１試薬により発せさられる波長光を吸収することができる発色団である。Ｅｕ−キレートが、ＮＲ装飾された試薬から生じる第１蛍光源である場合は、すなわちアロフィコシアニン（ＡＰＣ）が第２蛍光吸収体となり得る。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効果は、発光体及び吸収体が近接近する状態になる場合に生じるのみである。   The recombinantly expressed NR protein is then purified to the extent that allows characterization of ligand binding activity using standard methods available to those skilled in the art of protein expression and purification. For the purpose of ligand screening, the recombinant NR protein may be used as such, or the protein may be further labeled or decorated with a labeling reagent. Unmodified proteins can be used in radioligand or fluorescent ligand displacement assays where a radiolabeled or fluorescently labeled genuine ligand is available as a reference ligand. For use in FRET or Alphascreen® type assays, the recombinant NR protein must be decorated with additional reagents such as an europium-chelate fluorophore-containing antibody against the affinity tag. Such a decoration reagent emits a primary signal that can be further transferred, enhanced or supplemented by a second reagent. In the case of the FRET assay, the second reagent is a chromophore that can absorb light of the wavelength emitted by the first reagent added to the NR protein. If Eu-chelate is the first fluorescent source resulting from the NR decorated reagent, ie allophycocyanin (APC) can be the second fluorescent absorber. The fluorescence resonance energy transfer (FRET) effect only occurs when the emitter and absorber are in close proximity.

したがって、ほとんどの非放射性標識生化学核内受容体アッセイは、核内受容体のタンパク質動員機能を利用する。核内受容体は、一般に、クロマチン及び転写活性修飾タンパク質複合体に核内受容体をつなぎ止める特定のアダプタータンパク質を動員する傾向がある。リガンドの非存在下では、ほとんどのＮＲは、ヒストン脱アセチル化活性を含有するか、又はさらに動員し、故に転写的にサイレントなＮＲ応答エレメントの周りのクロマチン領域を維持する、いわゆるコリプレッサーを動員する。アゴニストである活性化リガンドが核内受容体に結合すると、コリプレッサーは、ヒストンアセチラーゼ活性を有する他のタンパク質を動員するアダプタータンパク質、コアクチベーターに取って代わられる。得られるクロマチング（ｃｈｒｏｍａｔｉｎｇ）オープニングは、次いでこれらのプロモーター領域から始まる転写活性の増加をもたらすことができる。   Thus, most non-radiolabeled biochemical nuclear receptor assays take advantage of the protein mobilization function of nuclear receptors. Nuclear receptors generally tend to recruit specific adapter proteins that anchor the nuclear receptor to chromatin and transcriptional activity-modifying protein complexes. In the absence of ligand, most NRs recruit so-called corepressors that contain or further recruit histone deacetylation activity and thus maintain a chromatin region around the transcriptionally silent NR response element. To do. When an activating ligand that is an agonist binds to a nuclear receptor, the corepressor is replaced by an adapter protein, a coactivator, that recruits other proteins with histone acetylase activity. The resulting chroming opening can then lead to an increase in transcriptional activity starting from these promoter regions.

故に、コアクチベーターの動員は、アゴニストリガンドにより開始される活性化カスケードに必須のステップである。したがって生化学アッセイ系は、コアクチベーターの動員の検出によりリガンド結合を検出することができる。このコアクチベーター動員は、同様に、コアクチベーターがこのアッセイタイプに必要な第２試薬により標識される場合に検出することができる。核内受容体リガンドは、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を利用する核内受容体−ペプチド相互作用アッセイを用いて同定することができる。このアッセイは、リガンドが、核内受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）内で結合するとコンフォメーション変化を誘導することができ、コンフォメーション変化が、コアクチベーター又はコリプレッサータンパク質との相互作用を変え、これが今度は転写活性の変化を媒介するという原理の発見に基づく。ＴＲ−ＦＲＥＴでは、蛍光ドナー分子は双極子−双極子相互作用を介して、（通常は蛍光）アクセプター分子にエネルギーを転移させる。この手法は、１０〜７０Å範囲の距離及び距離の変化を測定するための標準的な分光法であり、ドナー分子とアクセプター分子の間の距離Ｒ−６に依存する。９０Åの極めて大きなＲ０との相互作用は、発色団アロフィコシアニンに結合したユーロピウムクリプテートを用いて達成することができる（Ｍａｔｈｉｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９３年、３９：１９５３〜１９５９頁）。 Thus, recruitment of coactivators is an essential step in the activation cascade initiated by agonist ligands. Thus, biochemical assay systems can detect ligand binding by detection of coactivator recruitment. This coactivator mobilization can also be detected when the coactivator is labeled with the second reagent required for this assay type. Nuclear receptor ligands can be identified using a nuclear receptor-peptide interaction assay that utilizes time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET). This assay can induce a conformational change when a ligand binds within the ligand binding domain (LBD) of a nuclear receptor, which alters the interaction with a coactivator or corepressor protein. , Based on the discovery of the principle that this in turn mediates changes in transcriptional activity. In TR-FRET, the fluorescent donor molecule transfers energy to the (usually fluorescent) acceptor molecule via dipole-dipole interactions. This technique is a standard spectroscopic method for measuring distances and distance changes in the 10-70 Å range and depends on the distance R- 6 between the donor and acceptor molecules. The interaction of 90 極 め て with very large R 0 can be achieved using europium cryptate coupled to the chromophore allophycocyanin (Mathis et al., Clin. Chem. 1993, 39: 1953-1959).

核内受容体リガンド感受性ＦＲＥＴアッセイの目的のため、既知のコアクチベータータンパク質の１つ、好ましくはコアクチベーターに由来するペプチドにアクセプター標識を付加することができる。通常は、物理的なＮＲ−補因子相互作用に関与する明確に定義されたＬＸＸＬＬモチーフの１つに似た、２０〜３０ｍｅｒペプチドで十分である。フルオロフォア標識は、ペプチドのビオチン化及び例えばストレプトアビジン−ＡＰＣ複合体によるビオチンの捕捉を含むさまざまな手段により、このようなペプチドに付加することができる。   For the purposes of nuclear receptor ligand sensitive FRET assays, an acceptor label can be added to one of the known coactivator proteins, preferably a peptide derived from the coactivator. Usually, a 20-30mer peptide that resembles one of the well-defined LXXLL motifs involved in physical NR-cofactor interactions is sufficient. Fluorophore labels can be attached to such peptides by a variety of means including biotinylation of the peptides and capture of biotin by, for example, streptavidin-APC complexes.

ＲＯＲガンマの場合では、このような生化学アッセイ系における特定の構成的活性を観察することができる。これはまさに、補因子ペプチド及び全ての必要な試薬と共に、ＮＲが既にシグナルを生成していることを意味する。このような構成的に活性なＮＲの場合では、活性なＮＲコンフォメーションをさらに安定化又は増強するアゴニスト化合物により、このようなシグナルをさらに刺激することが可能であり得る。しかし、このような構成的に活性な受容体の場合に用量依存的シグナルの減少をもたらす化合物は、インバースアゴニストと呼ばれる。   In the case of ROR gamma, specific constitutive activities in such biochemical assay systems can be observed. This just means that NR already produces a signal with the cofactor peptide and all necessary reagents. In the case of such constitutively active NRs, it may be possible to further stimulate such signals with agonist compounds that further stabilize or enhance the active NR conformation. However, compounds that produce a dose-dependent signal decrease in the case of such constitutively active receptors are called inverse agonists.

ＲＯＲガンマ媒介性免疫疾患の寛解と関連して炎症促進性Ｔｈ１７細胞数を低減する目的のため、このようなインバースアゴニストの同定が求められる。   The identification of such inverse agonists is sought for the purpose of reducing the number of pro-inflammatory Th17 cells associated with remission of ROR gamma-mediated immune diseases.

細胞ベースの核内受容体アッセイでは、研究中の核内受容体の大部分が組換え発現されたバージョンが使用され、一過性のトランスフェクション、又はトランスフェクション及びこれに続く安定核内受容体コンストラクト発現細胞株の選択のどちらかにより細胞に導入される。核内受容体又はこのＬＢＤ含有部分を一過性又は安定発現するこのような細胞株は、これらが、レポータープロモーター中の核内受容体コンストラクト特異的ＤＮＡ応答エレメントの制御下で、前記核内受容体が特定のレポーター遺伝子の転写を開始できるプラスミドを保有しているか、又はトランスフェクトされる核内受容体コンストラクトが特定の天然標的遺伝子の転写を制御するプラスミドを保有しているかどちらかの場合に、リガンドスクリーニングに使用することができる。このような標的遺伝子に対するＮＲの転写制御を調節する特定のリガンドによりもたらされる内因性又は天然標的遺伝子発現の変化は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）インコーポレーション又は類似の手法のような定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）ベースの方法などの任意の標的遺伝子ｍＲＮＡ特異的検出系でモニターすることができる。コードされたレポーター酵素の活性をモニターして、発現レベルを直接モニターすることができるレポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ又は類似の明確に定義されたレポーター酵素である。   Cell-based nuclear receptor assays use a recombinantly expressed version of the majority of the nuclear receptors under study, transient transfection, or transfection followed by stable nuclear receptors It is introduced into the cell by either selection of a construct expressing cell line. Such cell lines that transiently or stably express the nuclear receptor or its LBD-containing portion are such that they are under the control of the nuclear receptor construct-specific DNA response element in the reporter promoter. Either the body has a plasmid that can initiate transcription of a specific reporter gene, or the transfected nuclear receptor construct has a plasmid that controls the transcription of a specific natural target gene Can be used for ligand screening. Changes in endogenous or native target gene expression brought about by specific ligands that regulate the transcriptional control of NR for such target genes are Taqman®, Light Cycler®, Sybr Green® It can be monitored with any target gene mRNA specific detection system, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) based methods such as corporations or similar techniques. Examples of reporter genes that can monitor the activity of the encoded reporter enzyme and directly monitor the expression level are luciferase, chloramphenicol-acetyltransferase or similar well-defined reporter enzymes.

このようなＲＯＲガンマ細胞ベースのレポーターアッセイでのアゴニストリガンドは、構成的レポーターシグナルをさらに刺激し、インバースアゴニストリガンドはレポーターシグナルを用量依存的に低減するであろう。   Agonist ligands in such ROR gamma cell based reporter assays will further stimulate the constitutive reporter signal, and inverse agonist ligands will reduce the reporter signal in a dose-dependent manner.

例でより詳細に記載される通り、ＧＳＴ−ＲＯＲガンマ−ＬＢＤ融合タンパク質は、大腸菌から発現され及び精製される。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、ＧＳＴに融合した２０〜６０ｎｇ／ウェルの組換え発現ＲＯＲγ−ＬＢＤ、２００〜６００ｎＭのＮ末端ビオチン化ペプチド（例えばＳＲＣ−１又はＴＩＦ−２由来の）、５０〜５００ｎｇ／ウェルのストレプトアビジン−ｘｌＡＰＣ複合体（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）及び２〜２０ｎｇ／ウェルのＥｕ Ｗ１０２４−抗ＧＳＴ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を含有するＴｒｉｓベースの緩衝系：１０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９；５０〜１００ｍＭ ＫＣｌ、１〜１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；２０〜１００ｎｇ／μｌ ＢＳＡ）を用いて、３８４ウェルプレートの個々のウェルにおける最終容積２５μｌで実施された。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、６６５ｎｍ及び６１５ｎｍで放射光を検出してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶＩＣＴＯＲ２Ｖ（商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて検出され、結果は６６５／６１５ｎｍの比としてプロットされた。 As described in more detail in the examples, the GST-ROR gamma-LBD fusion protein is expressed and purified from E. coli. The TR-FRET assay consists of 20-60 ng / well recombinantly expressed RORγ-LBD fused to GST, 200-600 nM N-terminal biotinylated peptide (eg from SRC-1 or TIF-2), 50-500 ng / well Tris-based buffer system containing 10 streptavidin-xlAPC complex (Prozyme) and 2-20 ng / well Eu W1024-anti-GST (Perkin Elmer): 10-50 mM Tris-HCl pH 7.9; 50-100 mM KCl, 1-10 mM MgCl 2 ; 20-100 ng / μl BSA) was performed in a final volume of 25 μl in individual wells of a 384 well plate. The TR-FRET signal was detected using a Perkin Elmer Victor2V ™ Multilabel Counter with detection of emitted light at 665 nm and 615 nm, and the results were plotted as a ratio of 665/615 nm.

ＧＳＴ融合タンパク質中のＲＯＲガンマ−ＬＢＤ部分が、より小さい又はより大きい（例えば完全長のＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２）タンパク質フラグメントを含有するＲＯＲガンマにより交換できることは当業者の共通の理解である。また、ＧＳＴ部分は、他の親和性タグ（例えばＨｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ）により、使用した親和性タグを検出するそれぞれのユーロピウム標識抗体と併用して交換することもできる。さらに、コアクチベータータンパク質（例えばＳＲＣ−１及びＴＩＦ−２）の核内受容体相互作用ドメイン由来のビオチン化ペプチドは、真核細胞系の原核細胞系で組換え発現され、及びインビトロ又はインビボでビオチン化される、前記コアクチベーターのより大きなフラグメント又はさらには完全長のコアクチベーターにより交換され得る。本明細書に記載された核内受容体−ペプチド相互作用アッセイは、蛍光偏光（ＦＰ（国際公開第１９９９／０２７３６５号パンフレット）核内ホルモン受容体薬スクリーニング）及びＦｕｓｉｏｎ Ａｌｐｈａ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社により市販）を用いるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎなどの代替検出方法を用いて実施することもできる。当業者には、蛍光標識ペプチド及び蛍光標識リガンドの両方を、ＲＯＲガンマとのリガンド相互作用又は補因子由来ペプチドとＲＯＲガンマとのリガンド媒介相互作用の検出に使用することができる。   It is a common understanding of those skilled in the art that the ROR gamma-LBD moiety in a GST fusion protein can be replaced by ROR gamma containing smaller or larger (eg, full length RORγ1 or RORγ2) protein fragments. The GST moiety can also be exchanged with other affinity tags (eg, His-tag, myc-tag, HA-tag) in combination with each europium labeled antibody that detects the affinity tag used. Furthermore, biotinylated peptides derived from nuclear receptor interaction domains of coactivator proteins (eg SRC-1 and TIF-2) are recombinantly expressed in eukaryotic prokaryotic systems and in vitro or in vivo. It can be exchanged with larger fragments of the coactivator or even full length coactivators that are biotinylated. The nuclear receptor-peptide interaction assay described herein is commercially available from Fluorescence Polarization (FP (WO 1999/027365) Nuclear Hormone Receptor Drug Screening) and Fusion Alpha Multilabel Reader (PerkinElmer). ) Using alternative detection methods such as AlphaScreen. For those skilled in the art, both fluorescently labeled peptides and fluorescently labeled ligands can be used to detect ligand interactions with ROR gamma or ligand mediated interactions between cofactor derived peptides and ROR gamma.

ＲＯＲガンマは、Ｔｈ１７細胞の主要な分化因子、及び分化したＴｈ１７細胞においてインターロイキン１７（ＩＬ−１７）遺伝子の転写を刺激する直接転写因子（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年、９：１２９７〜１３０６頁）であると考えられている。故にＴ細胞又はより一般的には、白血球由来の細胞培養上清中のＩＬ−１７を測定することは、Ｔｈ１７細胞分化及びこの活性に対するＲＯＲガンマ及びＲＯＲガンマ調節の影響を判定するための適切な手段になる可能性がある。このような白血球は、ヒト又は動物血液の低速遠心分離後の赤血球と血漿上清との境界面である、「バッフィーコート」として分離することができる。これらの「バッフィーコート」は、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）と血小板の混合物を含有し、このＴ細胞部分は、ＩＬ−１７を分泌するよう十分に刺激することができる。このようなＰＢＭＣ細胞培養は、既知の又は潜在的な免疫調節及び免疫抑制化合物の効果を確かめる優れたシステムである（Ｚｈａｎｇら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２００８年、４２：３４５〜３５２頁）。   ROR gamma is a major differentiation factor of Th17 cells and a direct transcription factor that stimulates transcription of the interleukin 17 (IL-17) gene in differentiated Th17 cells (Zhang et al., Nat. Immunol. 2008, 9: 1297- 1306). Thus, measuring IL-17 in T cell or, more generally, leukocyte-derived cell culture supernatants, is appropriate for determining the effects of ROR gamma and ROR gamma modulation on Th17 cell differentiation and this activity. May be a means. Such leukocytes can be separated as a “buffy coat”, which is the interface between red blood cells and plasma supernatant after low speed centrifugation of human or animal blood. These “buffy coats” contain a mixture of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and platelets that can be sufficiently stimulated to secrete IL-17. Such PBMC cell cultures are an excellent system for confirming the effects of known or potential immunomodulatory and immunosuppressive compounds (Zhang et al., Cytokine 2008, 42: 345-352).

以下の例は、本発明をより詳細に記載する。しかし、これらの例は、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。   The following examples describe the invention in more detail. However, these examples should not be construed as limiting the scope of the invention in any way.

タンパク質発現及び精製
核内受容体レチノイド酸受容体関連オーファン受容体ガンマ（ＲＯＲγ）とのリガンド相互作用を定量化するためのリガンド媒介補因子ペプチド相互作用の判定では、ＲＯＲガンマのそれぞれのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を大腸菌で発現させ、下記の通り精製した。 Protein expression and purification In determining ligand-mediated cofactor peptide interactions to quantify ligand interactions with the nuclear receptor retinoid acid receptor-related orphan receptor gamma (RORγ), each ligand binding of RORgamma Domain (LBD) was expressed in E. coli and purified as follows.

ヒトＲＯＲγリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、Ｎ末端グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識融合タンパク質として大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。ＲＯＲγリガンド結合ドメインをコードするＤＮＡを、ベクターｐＤＥＳＴ１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。リガンド結合ドメインのアミノ酸境界は、データベースエントリＮＭ＿００５０６０（ＲｅｆＳｅｑ）のアミノ酸２６７〜５１８であった。ｐＤＥＳＴ１５での発現はＩＰＴＧ誘導Ｔ７プロモーターにより制御し、大腸菌のクローニング及び形質転換は、基本的に、当業者に既知であって、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により提供された標準プロトコルに従って行った。   Human RORγ ligand binding domain (LBD) was expressed in E. coli strain BL21 (DE3) as an N-terminal glutathione-S-transferase (GST) labeled fusion protein. DNA encoding the RORγ ligand binding domain was cloned into the vector pDEST15 (Invitrogen). The amino acid boundary of the ligand binding domain was amino acids 267-518 of database entry NM_005060 (RefSeq). Expression in pDEST15 was controlled by the IPTG-inducible T7 promoter, and cloning and transformation of E. coli was basically performed according to standard protocols known to those skilled in the art and provided by Invitrogen.

ＲＯＲγ−ＬＢＤの発現及び精製：ｐＤＥＳＴ１５−ｈｕＲＯＲγ−ＬＢＤで形質転換した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の一晩の前培養物を、ＬＢ−アンピシリン培地で１：２０に希釈し、ＯＤ６００＝０．６の至適密度まで３０℃で増殖させた。遺伝子発現を次いで、最終濃度０．５ｍＭまでＩＰＴＧを添加して誘導した。細胞はさらに１６時間、１６℃、１８０ｒｐｍでインキュベートした。細胞を遠心分離（７，０００ｘｇ、１０分、室温）により回収した。細胞を、湿ペレット重量１グラム当たり１０ｍｌ溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び４ｍｇ／ｍｌリゾチーム）で再懸濁し、及び３０分間室温で放置した。続いて、１ｍｌ溶液当たり１μｌ ＤＮａｓｅＩ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ＭｇＣｌ２を２０ｍＭ最終濃度まで添加し、得られた溶液を氷上で１５分間インキュベートする。細胞は次いで超音波処理にかけ、細胞残屑を遠心分離（１４，０００ｘｇ、６０分、４℃）により除去した。オリジナル細胞培養物１ｌ当たり０．５ｍｌの予洗いしたグルタチオン４Ｂセファローススラリー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を添加し、懸濁液を１時間、４℃でゆっくり回転させ続けた。グルタチオン４Ｂセファロースビーズは遠心分離（１，０００ｘｇ、１分、４℃）によりペレット化し、及び洗浄緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。ペレットを、湿ペレット重量１グラム当たり５００μｌ溶出緩衝液で再懸濁した（溶出緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び粉末として使用する直前に添加した１０ｍＭグルタチオン）。懸濁液は１５分間、４℃で回転させ、ビーズをペレット化し、及び溶出緩衝液で５０ｍＭグルタチオンにより再び溶出した。この後のＴＲ ＦＲＥＴアッセイのため、グリセロールをこのタンパク質溶液に１０％（ｖ／ｖ）まで添加した。 Expression and purification of RORγ-LBD: An overnight preculture of E. coli strain BL21 (DE3) (Invitrogen) transformed with pDEST15-huRORγ-LBD was diluted 1:20 in LB-ampicillin medium and OD600 = Grow at 30 ° C. to an optimal density of 0.6. Gene expression was then induced by adding IPTG to a final concentration of 0.5 mM. The cells were further incubated for 16 hours at 16 ° C. and 180 rpm. Cells were harvested by centrifugation (7,000 × g, 10 minutes, room temperature). Cells were resuspended in 10 ml lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM NaCl, 5 mM EDTA and 4 mg / ml lysozyme) per gram wet pellet weight and left at room temperature for 30 minutes. Subsequently, 1 μl DNase I solution (2 mg / ml) per ml solution is added, MgCl 2 is added to a final concentration of 20 mM and the resulting solution is incubated on ice for 15 minutes. The cells were then sonicated and cell debris was removed by centrifugation (14,000 × g, 60 min, 4 ° C.). 0.5 ml of pre-washed glutathione 4B Sepharose slurry (Pharmacia) per liter of original cell culture was added and the suspension continued to rotate slowly at 4 ° C. for 1 hour. Glutathione 4B Sepharose beads are pelleted by centrifugation (1,000 × g, 1 min, 4 ° C.) and washed 3 times with wash buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM KCl, 4 mM MgCl 2 and 1 M NaCl). did. The pellet was resuspended in 500 μl elution buffer per gram wet pellet weight (elution buffer: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 60 mM KCl, 5 mM MgCl 2 and 10 mM glutathione added just before use as powder). . The suspension was spun for 15 minutes at 4 ° C., pelleted the beads, and eluted again with 50 mM glutathione in elution buffer. For subsequent TR FRET assays, glycerol was added to the protein solution to 10% (v / v).

放射性リガンド置換アッセイ（実施例３）のため、溶出液を６０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、及びアッセイで直接使用した。 For the radioligand displacement assay (Example 3), the eluate was dialyzed overnight against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 60 mM KCl, 5 mM MgCl 2 and used directly in the assay.

ヒトＲＯＲガンマリガンド結合ドメインとのリガンドの相互作用の判定は、時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）に基づきリガンド感受性アッセイを用いて行った。   Determination of ligand interaction with the human ROR gamma ligand binding domain was performed using a ligand sensitivity assay based on time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET).

ＴＲ−ＦＲＥＴ活性アッセイ
この方法は、精製細菌発現ＲＯＲγリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と、ＳＲＣ１（ＮｃｏＡ１）、ＳＲＣ２（ＮｃｏＡ２、ＴＩＦ２）、ＳＲＣ３（ＮｃｏＡ３）、ＰＧＣ１α、ＰＧＣ１β、ＣＢＰ、ＧＲＩＰ１、ＴＲＡＰ２２０、ＲＩＰ１４０など（但しこれらに限定されない）の核内受容体コアクチベータータンパク質に由来する合成Ｎ末端ビオチン化ペプチドとの間の相互作用を調節する推定リガンドの能力を測定する。実施例１及び実施例２用に使用したペプチドを、下の表１に列挙する。 TR-FRET activity assay This method consists of purified bacterial expression RORγ ligand binding domain (LBD) and SRC1 (NcoA1), SRC2 (NcoA2, TIF2), SRC3 (NcoA3), PGC1α, PGC1β, CBP, GRIP1, TRAP220, RIP140, etc. The ability of the putative ligand to modulate the interaction between (but not limited to) a synthetic N-terminal biotinylated peptide derived from a nuclear receptor coactivator protein is measured. The peptides used for Example 1 and Example 2 are listed in Table 1 below.

Figure 2012506998
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ＲＯＲγのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、ベクターｐＤＥＳＴ１５を用いてＢＬ−２１（ＢＬ３）細胞においてＧＳＴとの融合タンパク質として発現させた。細胞をリゾチーム処理及び超音波処理により溶解し、融合タンパク質を、メーカーの指示に従いグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上で精製した。ＲＯＲγ−ペプチド相互作用に対する影響について化合物をスクリーニングするため、ＬＡＮＣＥ技術（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を適用した。この方法は、ドナーフルオロフォアから目的の結合パートナーに付加したアクセプターフルオロフォアへの結合依存性エネルギー転移に依存する。取り扱いの容易さ及び化合物蛍光発光からのバックグラウンドの低下のため、ＬＡＮＣＥ技術は、一般的なフルオロフォア標識を利用し、時間分解検出アッセイは、ＧＳＴに融合した２０〜６０ｎｇ／ウェルの組換え発現ＲＯＲγ−ＬＢＤ、２００〜６００ｎＭのＮ末端ビオチン化ペプチド、２００ｎｇ／ウェルのストレプトアビジン−ｘｌＡＰＣ複合体（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）及び６〜１０ｎｇ／ウェルのＥｕ Ｗ１０２４−抗ＧＳＴ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を含有するＴｒｉｓベースの緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９；６０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２；３５ｎｇ／μｌ ＢＳＡ）中で、３８４ウェルプレートにおける最終容積２５μｌで行った。試料のＤＭＳＯ含有量は１％に保った。アッセイミックスの生成後、潜在的なＲＯＲγ調節リガンドを希釈した。このステップ後、アッセイを、ＦＩＡプレートブラック３８４ウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）で、室温、暗所で１時間平衡させた。ＬＡＮＣＥシグナルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶＩＣＴＯＲ２Ｖ（商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒにより検出した。結果は、６６５ｎｍ及び６１５ｎｍでの放射光間の比をプロットして視覚化した。ＲＯＲγ−ペプチド形成の基礎レベルは、添加リガンドの非存在下で観測する。複合体形成を促進するリガンドは、時間分解蛍光シグナルの濃度依存的増加を誘導する。単量体ＲＯＲγ及びＲＯＲγ−ペプチド複合体の両方に等しく十分に結合する化合物は、シグナルに変化を与えないことが予想されるのに対し、単量体受容体に優先的に結合するリガンドは、観測されるシグナルの濃度依存的減少を誘導すると予想される。 The ligand binding domain (LBD) of RORγ was expressed as a fusion protein with GST in BL-21 (BL3) cells using the vector pDEST15. Cells were lysed by lysozyme treatment and sonication and the fusion protein was purified on glutathione sepharose (Pharmacia) according to the manufacturer's instructions. To screen compounds for effects on RORγ-peptide interactions, LANCE technology (Perkin Elmer) was applied. This method relies on binding-dependent energy transfer from the donor fluorophore to the acceptor fluorophore attached to the binding partner of interest. Because of ease of handling and reduced background from compound fluorescence, LANCE technology utilizes common fluorophore labels, and time-resolved detection assays are used for recombinant expression of 20-60 ng / well fused to GST. Tris base containing RORγ-LBD, 200-600 nM N-terminal biotinylated peptide, 200 ng / well streptavidin-xlAPC complex (Prozyme) and 6-10 ng / well Eu W1024-anti-GST (Perkin Elmer) In a buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.9; 60 mM KCl, 5 mM MgCl 2 ; 35 ng / μl BSA) in a final volume of 25 μl in a 384 well plate. The DMSO content of the sample was kept at 1%. After generating the assay mix, the potential RORγ modulating ligand was diluted. After this step, the assay was equilibrated in FIA plate black 384 wells (Greiner) for 1 hour at room temperature in the dark. The LANCE signal was detected by a Perkin Elmer PICTOR2V ™ Multilabel Counter. The results were visualized by plotting the ratio between the emitted light at 665 nm and 615 nm. The basal level of RORγ-peptide formation is observed in the absence of added ligand. Ligands that promote complex formation induce a concentration-dependent increase in time-resolved fluorescence signal. Compounds that bind equally well both to monomeric RORγ and RORγ-peptide complexes are expected not to change the signal, whereas ligands that preferentially bind to the monomeric receptor are: It is expected to induce a concentration dependent decrease in the observed signal.

実施例１：
化合物の作動可能性及び拮抗可能性を評価するため、ＥＣ５０又はＩＣ５０値を、上記の通り、時間分解蛍光エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）に基づきリガンド感受性アッセイを用いて判定した。正規化したＴＲ ＦＲＥＴアッセイ値（以下の方程式：１０００＊６５５ｎｍ測定値／６１５ｎｍ測定値による）をプログラムＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍに移して以下の方程式によりグラフ及び用量反応曲線を生成した：
方程式：シグモイド用量反応（可変勾配）
Ｙ＝下限＋（上限−下限）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）＊Ｈｉｌｌ係数））
Ｘは濃度の対数である。Ｙは反応である。
Ｙは下限で始まり、シグモイドの形を有する上限に達する。 Example 1:
To assess compound operability and antagonism, EC 50 or IC 50 values were determined using a ligand-sensitive assay based on time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) as described above. Normalized TR FRET assay values (following equation: 1000 * 655 nm measurement / 615 nm measurement) were transferred to the program GraphPad Prism to generate graphs and dose response curves with the following equation:
Equation: Sigmoid dose response (variable slope)
Y = lower limit + (upper limit−lower limit) / (1 + 10 ^ ((LogEC50−X) * Hill coefficient))
X is the logarithm of concentration. Y is a reaction.
Y starts at the lower limit and reaches the upper limit with a sigmoid shape.

これは、「４つのパラメータロジスティック方程式」と同じである。ＥＣ５０又はＩＣ５０値はこの方程式により計算する。 This is the same as the “four parameter logistic equation”. EC 50 or IC 50 values are calculated according to this equation.

選択した化合物の例を、下の表２に列挙する：   Examples of selected compounds are listed in Table 2 below:

Figure 2012506998
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レチノイド構造を有する、上に列挙した全ての化合物（ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、Ａｍ５８０、Ｃｈ５５、ＴＴＮＰＢ、９ｃｉｓＲＡ及びＡＴＲＡ）は、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイにおいてシグナルを用量依存的様式で減少させ、ＩＣ５０値は相互作用ペプチドにＳＲＣ１を用いたＬＥ５４０での３，６００ｎＭから、相互作用ペプチドにＳＲＣ１を用いたＡｍ５８０での２３，４００ｎＭまで及ぶ。 All the compounds listed above (LE540, LE135, Am580, Ch55, TTNPB, 9cisRA and ATRA) with retinoid structure decrease the signal in a dose-dependent manner in the TR-FRET assay and IC 50 values interact. From 3,600 nM with LE540 using SRC1 as the peptide to 23,400 nM with Am580 using SRC1 as the interacting peptide.

対照的に、オキシステロール化合物２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、（２５Ｒ）−２６−ヒドロキシコレステロール、コレン酸メチルエステル及びＤＭＨＣＡは、高度に強力な様式で作動性に作用し、ＥＣ５０値はＴＩＦ２を相互作用ペプチドとするＤＭＨＣＡでの１０．７ｎＭから、ＴＩＦ２を相互作用ペプチドとするコレン酸メチルエステルでの２７．７ｎＭまで及ぶ。 In contrast, the oxysterol compounds 22R-hydroxycholesterol, 25-hydroxycholesterol, (25R) -26-hydroxycholesterol, cholenic acid methyl ester and DMHCA act ergonomically in a highly potent manner with EC 50 values of From 10.7 nM with DMHCA with TIF2 as the interacting peptide to 27.7 nM with cholenic acid methyl ester with TIF2 as the interacting peptide.

実施例２：
上記のアッセイのバリエーションでは、拮抗性化合物を飽和濃度（４μＭ）でアッセイミックスに添加した。次いで作動性化合物を希釈し、アッセイを暗所で１時間平衡化させた。飽和アンタゴニスト濃度に加えたアゴニストの滴定は、アゴニストに関する用量反応曲線を依然として生成したが、アンタゴニストの非存在下で得られたデータと比べてアゴニストのＥＣ５０値はより高度に明白であった（表２参照）。これは、アンタゴニストがアゴニストに取って代わられ得ることを示している。明白なＥＣ５０値は、下の表３に列挙されている通りであった： Example 2:
In the above assay variation, the antagonistic compound was added to the assay mix at a saturating concentration (4 μM). The agonist compound was then diluted and the assay was allowed to equilibrate in the dark for 1 hour. Titration of agonist added to saturated concentration of antagonist has been generated still the dose-response curves for agonists, EC 50 values for agonists compared with the data obtained in the absence of antagonist was more highly pronounced (Table 2). This indicates that antagonists can be replaced by agonists. The obvious EC 50 values were as listed in Table 3 below:

Figure 2012506998
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ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイのこのバリエーションでは、オキシステロール型化合物が、用量依存的様式で、飽和濃度（４μＭ）の拮抗性化合物を置換し、計算されたＥＣ５０値は、相互作用ペプチドにＴＩＦ２を用いたＤＭＨＣＡでの８５ｎＭから、及び相互作用ペプチドにＴＩＦ２を用いた２５−ヒドロキシコレステロールでの３６３ｎＭに及ぶ。 In this variation of the TR-FRET assay, an oxysterol-type compound displaced a saturating concentration (4 μM) of an antagonistic compound in a dose-dependent manner, and the calculated EC 50 values used TIF2 as the interacting peptide From 85 nM with DMHCA and 363 nM with 25-hydroxycholesterol using TIF2 as the interacting peptide.

実施例３：
放射性リガンド置換アッセイ
この方法は、ＲＯＲガンマリガンド結合ドメインに結合した放射活性標識化合物を置換する推定リガンドの能力を測定する。 Example 3:
Radioligand displacement assay This method measures the ability of putative ligands to displace radiolabeled compounds bound to the ROR gamma ligand binding domain.

ＲＯＲγのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、ベクターｐＤＥＳＴ１５を用いてＢＬ−２１細胞においてＧＳＴとの融合タンパク質として発現させた。細胞をリゾチーム処理及び超音波処理により溶解し、融合タンパク質を、メーカーの指示に従いグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上で精製した。ＲＯＲγに結合する能力について化合物をスクリーニングするため、市販の２５−［２６，２７−３Ｈ］−ヒドロキシコレステロール（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、ＮＥＴ６７４２５０ＵＣ）をタンパク質に結合させ、非放射活性リガンドによる置換を観察した。アッセイは、９６−ウェルのグルタチオン及びシンチラント被覆マイクロプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、ＳＭＰ１０９００１ＰＫ）で、最終容積１００μｌで行った。ＧＳＴに融合した５０〜２００ｎｇ／ウェルの組換え発現ＲＯＲγ−ＬＢＤを、Ｔｒｉｓベースの緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９；６０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２；４５ｎｇ／μｌ ＢＳＡ）中で、１００ｎＭ ２５−［２６，２７−３Ｈ］−ヒドロキシコレステロール及び４００ｎＭ ２５−ヒドロキシコレステロールと共にインキュベートした。試験化合物を滴定し、タンパク質−放射性リガンドミックスに添加した。試料のＤＭＳＯ含有量は１％に保った。化合物の添加後、アッセイを、室温で３０分間平衡化させた。このインキュベーション後、アッセイプレートウェルをＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５；６０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で２回洗浄し、続いてＬＵＭＩｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ（ＢＭＧ社）で１ウェル当たり５００秒間測定した。 The ligand binding domain (LBD) of RORγ was expressed as a fusion protein with GST in BL-21 cells using the vector pDEST15. Cells were lysed by lysozyme treatment and sonication and the fusion protein was purified on glutathione sepharose (Pharmacia) according to the manufacturer's instructions. To screen compounds for the ability to bind to ROR, commercial 25- [26,27- 3 H] - hydroxycholesterol (Perkin Elmer Corp., NET674250UC) is bound to the protein, was observed substitution with non-radioactive ligand. The assay was performed in 96-well glutathione and scintillant coated microplates (Perkin Elmer, SMP109001PK) with a final volume of 100 μl. 50-200 ng / well of recombinantly expressed RORγ-LBD fused to GST was added to 100 nM 25− in Tris-based buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.9; 60 mM KCl, 5 mM MgCl 2 ; 45 ng / μl BSA). Incubated with [26,27- 3 H] -hydroxycholesterol and 400 nM 25-hydroxycholesterol. Test compounds were titrated and added to the protein-radioligand mix. The DMSO content of the sample was kept at 1%. After compound addition, the assay was allowed to equilibrate for 30 minutes at room temperature. Following this incubation, assay plate wells were washed twice with Tris buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5; 60 mM KCl, 5 mM MgCl 2 ), followed by 500 seconds per well with LUMIstar OPTIMA (BMG).

アッセイの結果は図１に示されている。レチノイド様構造物、ＬＥ５４０、ＴＴＮＢＰ及びＣｈ５５（但しオキシステロール２５−ヒドロキシコレステロールも）は、ＲＯＲガンマリガンド結合ドメインに事前に結合された２５−［２６，２７−３Ｈ］−ヒドロキシコレステロールを、用量依存的様式で置換することができる。置換の明らかな強度及び有効性は、ＬＥ５４０及び２５−ヒドロキシコレステロールで最も高い。ＴＴＮＢＰは、強度は低いがどちらかといえば有効であるように思われるのに対し、Ｃｈ５５は、ＲＯＲガンマ相互作用リガンドの識別を可能にするこの置換アッセイにおいて最も低い強度及び有効性を示す。 The results of the assay are shown in FIG. Retinoid-like structure, LE540, TTNBP and Ch55 (although oxysterols 25-hydroxycholesterol cholesterol as well) was bound to the pre-ROR gamma ligand binding domain 25- [26,27- 3 H] - hydroxy cholesterol in a dose-dependent Can be substituted in a standard manner. The apparent strength and effectiveness of the substitution is highest with LE540 and 25-hydroxycholesterol. TTNBP appears to be less effective but rather effective, whereas Ch55 exhibits the lowest intensity and effectiveness in this displacement assay that allows for the identification of ROR gamma interacting ligands.

実施例４：
抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）刺激及びＩＬ−１７分泌アッセイ
凍結保存抹消血ヒト単核細胞（ＰＢＭＣ）を実験に使用した。細胞をＣＴＬ−Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ−Ｗａｓｈ（商標）溶液で解凍し、及びベンゾナーゼを含むＣＴＬ Ｗａｓｈ（商標）培地で１回洗浄した。ＣＴＬ無血清試験培地（ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地）で懸濁したＰＢＭＣを、９６ウェルＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ抗ヒトＣＤ３Ｔ細胞活性化プレートに、合計１×１０５細胞／ウェルで３通りに播種した。細胞は、異なる濃度でのＬＥ５４０、ＬＥ１３５及びＡｍ５８０の存在下又は非存在下、７２時間、３７℃、５％ＣＯ２で抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。化合物は時間０で添加した。上清を回収し、及び対応するＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からのプロトコルに従いＩＬ−１７についてアッセイした。検出範囲は１５．６〜１，０００．０ｐｇ／ｍｌであった。データを平均±標準偏差値で表す。 Example 4:
Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Stimulation and IL-17 Secretion Assay Cryopreserved peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were used in the experiments. Cells were thawed with CTL-Anti-Aggregate-Wash ™ solution and washed once with CTL Wash ™ medium containing Benzonase. PBMCs suspended in CTL serum-free test medium (CTL-Test ™ medium) were seeded in triplicate in 96-well BD BioCoat anti-human CD3 T cell activation plates in a total of 1 × 10 5 cells / well. Cells were incubated with anti-CD28 (2 μg / ml) at 37 ° C., 5% CO 2 for 72 hours in the presence or absence of LE540, LE135 and Am580 at different concentrations. The compound was added at time zero. The supernatant was collected and assayed for IL-17 according to the protocol from the corresponding ELISA kit (Invitrogen). The detection range was 15.6 to 1,000.0 pg / ml. Data are expressed as mean ± standard deviation values.

対照実験では、ＰＢＭＣを０．１％ＤＭＳＯの存在下、抗ＣＤ３（プレート）及び抗ＣＤ２８で刺激した。ＩＬ−１７の平均濃度は１，００３．３６±４５．１８ｐｇ／ｍｌであった。一方、非刺激細胞でのＩＬ−１７の濃度は検出範囲より下であった（＜１５．６ｐｇ／ｍｌ）。ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、及びＡｍ５８０は全て、ヒトＰＢＭＣによるＩＬ−１７の産生を抑制する。化合物は、時間０で抗ＣＤ２８ｍＡｂと共に細胞に添加した。結果は、濃度０．３μＭで添加したＬＥ５４０がＩＬ−１７の産生を強力に抑制することを示した（平均＝２８９．６９ｐｇ／ｍｌ；７１．１３％の低減）。より低い濃度のＬＥ５４０（０．１μＭ）もＰＢＭＣで極めて強力であった。ＩＬ−１７抑制のパーセンテージは、それぞれ３４．２８％（平均＝６５９．３９ｐｇ／ｍｌ）であった。これらの結果と比べて、ＬＥ１３５は、ＰＢＭＣでのＩＬ−１７タンパク質産生に対する抑制効果は低い。図３に示された結果は、ＬＥ１３５がＰＢＭＣにおけるＩＬ−１７レベルを用量反応様式で低減することを示した。ＩＬ−１７タンパク質の量は、３、１、及び０．３μＭのＬＥ１３５で細胞を処理後にダウンレギュレートされた（図３）。抑制のパーセンテージは、それぞれ７５．９１、６１．８５、及び３５．７８％であった。１０、５、及び１μＭのＡｍ５８０で刺激した細胞のインキュベーションは、１０μＭの投与群でのみＩＬ−１７タンパク質の低減をもたらした（６９．７３％の抑制）。５及び１μＭのＡｍ５８０の存在下では、ＩＬ−１７レベルは対照範囲内であった。   In control experiments, PBMC were stimulated with anti-CD3 (plate) and anti-CD28 in the presence of 0.1% DMSO. The average concentration of IL-17 was 1,03.36 ± 45.18 pg / ml. On the other hand, the concentration of IL-17 in unstimulated cells was below the detection range (<15.6 pg / ml). LE540, LE135, and Am580 all suppress IL-17 production by human PBMC. The compound was added to the cells with anti-CD28 mAb at time zero. The results showed that LE540 added at a concentration of 0.3 μM potently suppressed IL-17 production (mean = 289.69 pg / ml; 71.13% reduction). The lower concentration of LE540 (0.1 μM) was also very potent with PBMC. The percentage of IL-17 suppression was 34.28% (mean = 659.39 pg / ml), respectively. Compared to these results, LE135 has a low inhibitory effect on IL-17 protein production in PBMC. The results shown in FIG. 3 showed that LE135 reduces IL-17 levels in PBMC in a dose response manner. The amount of IL-17 protein was downregulated after treatment of the cells with 3, 1, and 0.3 μM LE135 (FIG. 3). The inhibition percentages were 75.91, 61.85, and 35.78%, respectively. Incubation of cells stimulated with 10, 5, and 1 μM Am580 resulted in IL-17 protein reduction only in the 10 μM dose group (69.73% inhibition). In the presence of 5 and 1 μM Am580, IL-17 levels were within the control range.

ＲＯＲγ（特にＲＯＲγ２）ヌル突然変異体マウスは、リンパ節及びパイエル板が欠如し（Ｅｂｅｒｌ及びＬｉｔｔｍａｎｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２００３年、１９５：８１〜９０頁）、リンパ組織誘導（ＬＴｉ）細胞が脾臓、腸間膜及び腸から完全に欠落している。さらに、胸腺の大きさ及び胸腺細胞の数は、ダブルポジティブＣＤ４＋ＣＤ８＋及びシングルポジティブＣＤ４−ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ＣＤ８−細胞の減少により、ＲＯＲγヌルマウスで大幅に減少し（Ｓｕｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００年、２８８：２３６９〜２３７３頁）、胸腺細胞の発生におけるＲＯＲγ２の極めて重要な役割を示唆している。 RORγ (especially RORγ2) null mutant mice lack lymph nodes and Peyer's patches (Eberl and Littmann, Immunol. Rev. 2003, 195: 81-90), lymphoid tissue-derived (LTi) cells are spleen , Completely missing from the mesentery and intestine. Furthermore, thymus size and thymocyte numbers are significantly reduced in RORγ null mice due to a decrease in double positive CD4 + CD8 + and single positive CD4 − CD8 + or CD4 + CD8 − cells (Sun et al., Science 2000). 288: 2369-2373), suggesting a crucial role for RORγ2 in thymocyte development.

胸腺細胞の発生は、それらの微環境により決定される細胞集団における増殖、分化、細胞死及び遺伝子組換えという協調したサイクルを伴う複雑なプログラムをたどる。胎児の肝臓又は成人の骨髄から胸腺に移動する多能性リンパ球前駆細胞は、Ｔ細胞系列にコミットメントしている。多能性リンパ球前駆細胞は、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ細胞からＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞への一連のステップを通じて成熟し、自己ＭＨＣペプチドに対し親和性の低いものは負の選択により排除される。これらは、ＣＤ４−ＣＤ８＋（キラー）又はＣＤ４＋ＣＤ８−（ヘルパー）Ｔ細胞系列へと成熟する。ＲＯＲγ２はダブルネガティブでは発現されず、未熟なシングルネガティブ胸腺細胞ではほとんど発現されない（Ｈｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年、１６４：５６６８〜５６７４頁）が、ダブルポジティブ胸腺細胞では高度にアップレギュレートされ、シングルポジティブ胸腺細胞では分化中にダウンレギュレートされる。ＲＯＲγ欠損は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞でのアポトーシスの増加をもたらし、抹消血胸腺細胞の数は６倍減少する（１０倍（ＣＤ４＋胸腺細胞）及び３倍（ＣＤ８＋胸腺細胞））。 The development of thymocytes follows a complex program with coordinated cycles of proliferation, differentiation, cell death and genetic recombination in the cell population determined by their microenvironment. Pluripotent lymphocyte progenitor cells that migrate from the fetal liver or adult bone marrow to the thymus are committed to the T cell lineage. Multipotent lymphoid progenitor cells, CD4 - CD8 - mature through a series of steps from the double negative cells CD4 + CD8 + into cells, those with respect to the self-MHC-peptide low affinity is eliminated by negative selection. These mature into the CD4 − CD8 + (killer) or CD4 + CD8 − (helper) T cell lineage. RORγ2 is not expressed in double negatives and is rarely expressed in immature single negative thymocytes (He et al., J. Immunol. 2000, 164: 5668-5684), but is highly upregulated in double positive thymocytes. In single positive thymocytes, it is down-regulated during differentiation. RORγ deficiency results in increased apoptosis in CD4 + CD8 + cells and the number of peripheral blood thymocytes is reduced 6-fold (10-fold (CD4 + thymocytes) and 3-fold (CD8 + thymocytes)).

ＲＯＲγ１は、筋肉並びに膵臓、胸腺、前立腺、肝臓及び精巣を含むいくつかの他の組織で発現される。ＲＯＲγ１のドミナントアクティブ及びドミナントネガティブバージョンの異所性過剰発現は、この受容体が、脂質代謝（ＦＡＢＰ４、ＣＤ３６、ＬＰＬ及びＵＣＰ３）、コレステロール流出（ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１）炭水化物代謝（ＧＬＵＴ５、アディポネクチン受容体２及びＩＬ−１５）及び筋肉量（ミオスタチン及びＩＬ−１５）に関与する遺伝子を制御することを示した。 RORγ1 is expressed in muscle and several other tissues including pancreas, thymus, prostate, liver and testis. Dominant active and dominant negative version ectopic overexpression of RORγ1, this receptor, lipid metabolism (FABP4, CD36, LPL and UCP3), cholesterol efflux (ABCA1, ABCG1) carbohydrate metabolism (GLUT5, adiponectin receptor 2 and IL-15) and the genes involved in muscle mass (myostatin and IL-15) have been shown to be regulated.

５〜１０員のへテロ芳香族単環又は二環は、４〜９個の炭素原子並びにＯ、Ｎ及び／又はＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１個の環を有する環系である。好ましくは、ヘテロアリルは、Ｏ及び／又はＮから選択される１、２、３又は４個、より好ましくは１、２又は３個のヘテロ原子を含有し、並びにピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル及びフロピリジニルから好ましくは選択される。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。好ましいヘテロアリールには、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル及びトリアゾリルが含まれる。 A 5- to 10-membered heteroaromatic monocycle or bicycle comprises at least one ring containing 4 to 9 carbon atoms and at least one heteroatom selected from O, N and / or S. It has a ring system. Preferably the heteroallyl contains 1, 2, 3 or 4 heteroatoms selected from O and / or N, more preferably 1, 2 or 3 and pyridinyl, imidazolyl, pyrimidinyl, pyrazolyl, triazolyl , Pyrazinyl, tetrazolyl, furyl, thienyl, isoxazolyl, thiazolyl, oxazolyl, isothiazolyl, pyrrolyl, quinolinyl, isoquinolinyl, indolyl, benzimidazolyl, benzofuranyl, cinnolinyl, indazolyl, indolizinyl, phthalazinyl, pyridazinyl, triazinyl oxazolyl triazolyl, Chiajiazori Le, furazanyl, benzofurazanyl, benzothiophenyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, quinazolinyl, keno Sariniru, preferably selected from naphthyridinyl and furopyridinyl. Spiro moieties are also included within this definition. Preferred heteroaryls include pyridinyl, imidazolyl, pyrimidinyl, pyrazolyl, triazolyl, pyrazinyl, tetrazolyl, isoxazolyl, oxazolyl, isothiazolyl, oxadiazolyl and triazolyl.

ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ及び／又はＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子並びに１、２、３、４、又は５個の炭素原子を含有する５〜６員の飽和環又は不飽和環である。好ましくは、ヘテロシクリルは、Ｏ及び／又はＮから選択される１、２、３又は４個、より好ましくは１、２又は３個のヘテロ原子を含有する。ヘテロシクリルには、単環系及び二環系が含まれ、並びにピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、アゼチジン−２−オン−１−イル、ピロリジン−２−オン−１−イル、ピペリド−２−オン−１−イル、アゼパン−２−オン−１−イル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、アザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、３Ｈ−インドリル及びキノリジニルから好ましくは選択される。スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。 Heterocyclyl is a 5-6 membered saturated or unsaturated ring containing at least one heteroatom selected from O, N and / or S and 1, 2, 3, 4, or 5 carbon atoms. is there. Preferably, the heterocyclyl contains 1, 2, 3 or 4 selected from O and / or N, more preferably 1, 2 or 3 heteroatoms. Heterocyclyl includes monocyclic and bicyclic systems and includes pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, dihydrofuranyl, tetrahydrothienyl, tetrahydropyranyl, dihydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl, piperidino, morpholino, thiomorpholino, thioxanyl, Piperazinyl, homopiperazinyl, azetidinyl, oxetanyl, thietanyl, homopiperidinyl, oxepanyl, thiepanyl, oxazepinyl, diazepinyl, thiazepinyl, 1,2,3,6-tetrahydropyridinyl, 2-pyrrolinyl, 3-pyrrolinyl, indolinyl, 2H-pyranyl, 4H -Pyranyl, dioxanyl, 1,3-dioxolanyl, pyrazolinyl, dithianyl, dithiolanyl, dihydropyranyl, dihydrothienyl, dihydrofuranyl, pyrazolyl Cycloalkenyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, azetidin-2-one-1-yl, pyrrolidin-2-one-1-yl, piperid-2-one-1-yl, azepan-2-one-1-yl, 3-azabicyclo [ 3.1.0] hexanyl, 3-azabicyclo [4.1.0] heptanyl, azabicyclo [2.2.2] hexanyl, 3H-indolyl and quinolidinyl are preferably selected. Spiro moieties are also included within this definition.

したがって、ほとんどの非放射性標識生化学核内受容体アッセイは、核内受容体のタンパク質動員機能を利用する。核内受容体は、一般に、クロマチン及び転写活性修飾タンパク質複合体に核内受容体をつなぎ止める特定のアダプタータンパク質を動員する傾向がある。リガンドの非存在下では、ほとんどのＮＲは、ヒストン脱アセチル化活性を含有するか、又はさらに動員し、故に転写的にサイレントなＮＲ応答エレメントの周りのクロマチン領域を維持する、いわゆるコリプレッサーを動員する。アゴニストである活性化リガンドが核内受容体に結合すると、コリプレッサーは、ヒストンアセチラーゼ活性を有する他のタンパク質を動員するアダプタータンパク質、コアクチベーターに取って代わられる。得られるクロマチンオープニングは、次いでこれらのプロモーター領域から始まる転写活性の増加をもたらすことができる。 Thus, most non-radiolabeled biochemical nuclear receptor assays take advantage of the protein mobilization function of nuclear receptors. Nuclear receptors generally tend to recruit specific adapter proteins that anchor the nuclear receptor to chromatin and transcriptional activity-modifying protein complexes. In the absence of ligand, most NRs recruit so-called corepressors that contain or further recruit histone deacetylation activity and thus maintain a chromatin region around the transcriptionally silent NR response element. To do. When an activating ligand that is an agonist binds to a nuclear receptor, the corepressor is replaced by an adapter protein, a coactivator, that recruits other proteins with histone acetylase activity. Resulting chromatin oleate Puningu then can result in an increase in transcriptional activity starting from these promoter regions.

例でより詳細に記載される通り、ＧＳＴ−ＲＯＲガンマ−ＬＢＤ融合タンパク質は、大腸菌から発現され及び精製される。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、ＧＳＴに融合した２０〜６０ｎｇ／ウェルの組換え発現ＲＯＲγ−ＬＢＤ、２００〜６００ｎＭのＮ末端ビオチン化ペプチド（例えばＳＲＣ−１又はＴＩＦ−２由来の）、５０〜５００ｎｇ／ウェルのストレプトアビジン−ｘｌＡＰＣ複合体（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）及び２〜２０ｎｇ／ウェルのＥｕ Ｗ１０２４−抗ＧＳＴ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を含有するＴｒｉｓベースの緩衝系（１０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９；５０〜１００ｍＭ ＫＣｌ、１〜１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；２０〜１００ｎｇ／μｌ ＢＳＡ）を用いて、３８４ウェルプレートの個々のウェルにおける最終容積２５μｌで実施された。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、６６５ｎｍ及び６１５ｎｍで放射光を検出してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶＩＣＴＯＲ２Ｖ（商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて検出され、結果は６６５／６１５ｎｍの比としてプロットされた。 As described in more detail in the examples, the GST-ROR gamma-LBD fusion protein is expressed and purified from E. coli. The TR-FRET assay consists of 20-60 ng / well recombinantly expressed RORγ-LBD fused to GST, 200-600 nM N-terminal biotinylated peptide (eg from SRC-1 or TIF-2), 50-500 ng / well Tris-based buffer system ( 10-50 mM Tris-HCl pH 7.9; 50-100 mM) containing 2 streptavidin-xlAPC complex (Prozyme) and 2-20 ng / well Eu W1024-anti-GST (Perkin Elmer) KCl, 1-10 mM MgCl 2 ; 20-100 ng / μl BSA) was performed in a final volume of 25 μl in individual wells of a 384 well plate. The TR-FRET signal was detected using a Perkin Elmer Victor2V ™ Multilabel Counter with detection of emitted light at 665 nm and 615 nm, and the results were plotted as a ratio of 665/615 nm.

ＧＳＴ融合タンパク質中のＲＯＲガンマ−ＬＢＤ部分が、より小さい又はより大きい（例えば完全長のＲＯＲγ１又はＲＯＲγ２）タンパク質フラグメントを含有するＲＯＲガンマにより交換できることは当業者の共通の理解である。また、ＧＳＴ部分は、他の親和性タグ（例えばＨｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ）により、使用した親和性タグを検出するそれぞれのユーロピウム標識抗体と併用して交換することもできる。さらに、コアクチベータータンパク質（例えばＳＲＣ−１及びＴＩＦ−２）の核内受容体相互作用ドメイン由来のビオチン化ペプチドは、真核細胞系又は原核細胞系で組換え発現され、及びインビトロ又はインビボでビオチン化される、前記コアクチベーターのより大きなフラグメント又はさらには完全長のコアクチベーターにより交換され得る。本明細書に記載された核内受容体−ペプチド相互作用アッセイは、蛍光偏光（ＦＰ（国際公開第１９９９／０２７３６５号パンフレット）核内ホルモン受容体薬スクリーニング）及びＦｕｓｉｏｎ Ａｌｐｈａ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社により市販）を用いるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎなどの代替検出方法を用いて実施することもできる。当業者には、蛍光標識ペプチド及び蛍光標識リガンドの両方を、ＲＯＲガンマとのリガンド相互作用又は補因子由来ペプチドとＲＯＲガンマとのリガンド媒介相互作用の検出に使用することができる。 It is a common understanding of those skilled in the art that the ROR gamma-LBD moiety in a GST fusion protein can be replaced by ROR gamma containing smaller or larger (eg, full length RORγ1 or RORγ2) protein fragments. The GST moiety can also be exchanged with other affinity tags (eg, His-tag, myc-tag, HA-tag) in combination with each europium labeled antibody that detects the affinity tag used. Furthermore, biotinylated peptides derived from the nuclear receptor interaction domain of coactivator proteins (eg SRC-1 and TIF-2) are recombinantly expressed in eukaryotic or prokaryotic systems and in vitro or in vivo. It can be exchanged with larger fragments of the coactivator or even full length coactivators that are biotinylated. The nuclear receptor-peptide interaction assay described herein is commercially available from Fluorescence Polarization (FP (WO 1999/027365) Nuclear Hormone Receptor Drug Screening) and Fusion Alpha Multilabel Reader (PerkinElmer). ) Using alternative detection methods such as AlphaScreen. For those skilled in the art, both fluorescently labeled peptides and fluorescently labeled ligands can be used to detect ligand interactions with ROR gamma or ligand mediated interactions between cofactor derived peptides and ROR gamma.

ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイのこのバリエーションでは、オキシステロール型化合物が、用量依存的様式で、飽和濃度（４μＭ）の拮抗性化合物を置換し、計算されたＥＣ５０値は、相互作用ペプチドにＴＩＦ２を用いたＤＭＨＣＡでの８５ｎＭから、相互作用ペプチドにＴＩＦ２を用いた２５−ヒドロキシコレステロールでの３６３ｎＭまで及ぶ。
In this variation of the TR-FRET assay, an oxysterol-type compound displaced a saturating concentration (4 μM) of an antagonistic compound in a dose-dependent manner, and the calculated EC 50 values used TIF2 as the interacting peptide from 85nM in DMHCA, ranging 363nM at 25-hydroxy cholesterol with TIF2 the peptide the interaction.

Claims (15)

ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害の治療又は予防に使用するためのＲＯＲガンマモジュレーター。   A ROR gamma modulator for use in the treatment or prevention of a disease or disorder associated with inhibition or activation of a ROR gamma receptor. ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害を治療又は予防する医薬品を調製するためのＲＯＲガンマモジュレーターの使用。   Use of a ROR gamma modulator for the preparation of a medicament for treating or preventing a disease or disorder associated with inhibition or activation of a ROR gamma receptor. ＲＯＲガンマ受容体活性が低減される、請求項１若しくは２に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項１若しくは２に記載の使用。   The ROR gamma modulator for use according to claim 1 or 2, or the use according to claim 1 or 2, wherein ROR gamma receptor activity is reduced. Ｔｈ１７細胞の分化及び活性並びにこれらの細胞からのＩＬ−１７の分泌が低減される、請求項３に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項３に記載の使用。   4. The ROR gamma modulator for use according to claim 3 or the use according to claim 3, wherein the differentiation and activity of Th17 cells and the secretion of IL-17 from these cells are reduced. 疾患又は障害が、Ｔｈ１７媒介性組織炎症、又は疼痛、掻痒、若しくは表皮剥脱などの、自己免疫疾患若しくは皮膚疾患に関連した症状である、請求項４に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項４に記載の使用。   5. A ROR gamma modulator for use according to claim 4, wherein the disease or disorder is a condition associated with an autoimmune disease or skin disease, such as Th17 mediated tissue inflammation, or pain, pruritus, or epidermal exfoliation. Item 4. Use according to Item 4. 疾患又は障害が、自己免疫疾患、炎症性皮膚疾患、及び多発性硬化症から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。   ROR gamma modulator for use according to any one of claims 1 to 5, wherein the disease or disorder is selected from the group consisting of autoimmune diseases, inflammatory skin diseases and multiple sclerosis. Use as described in any one of 1-5. 自己免疫疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病）、潰瘍性大腸炎及び１型糖尿病から選択される、請求項６に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項６に記載の使用。   7. ROR gamma modulator for use according to claim 6 or claim 6 wherein the autoimmune disease is selected from rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease (Crohn's disease), ulcerative colitis and type 1 diabetes. Use as described in. 自己免疫疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（クローン病）、及び潰瘍性大腸炎から選択される、請求項６に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項６に記載の使用。   7. The ROR gamma modulator for use according to claim 6 or the claim 6 wherein the autoimmune disease is selected from rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease (Crohn's disease), and ulcerative colitis. use. 炎症性皮膚疾患がアトピー性湿疹及び乾癬から選択される、請求項６に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項６に記載の使用。   7. The ROR gamma modulator for use according to claim 6 or the use according to claim 6, wherein the inflammatory skin disease is selected from atopic eczema and psoriasis. 式（Ｉ）
Figure 2012506998
の化合物又は溶媒和物又は薬学的に許容可能なこの塩
（式中
Ｒ５はＣＯＮＨＲ８、ＮＨＣＯＲ８、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨＲ８、Ｃ≡ＣＲ８、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、Ｃ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＲ８、５〜６員環ヘテロシクリル−Ｒ８であり、
Ｒ６は水素であり、
Ｒ５及びＲ６は共に
Figure 2012506998
も形成することができ、
Ｒ７は水素、フッ素、塩素又はヒドロキシであり、
Ｒ８は４−イル−安息香酸又は６−イル−２−ナフトエ酸であり、
Ｒ９及びＲ１０は水素であり、又はＲ９及びＲ１０はこれらが付着する結合と共に融合５〜１０員のへテロ芳香族環又は芳香族環で、単環又は二環を形成する）
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のためのＲＯＲガンマモジュレーター又は請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。 Formula (I)
Figure 2012506998
Of the compound or a solvate or pharmaceutically acceptable salt thereof (wherein R 5 is CONHR 8, NHCOR 8, C ( O) R 8, CH = CHR 8, C (CH 3) = CHR 8, C≡ CR 8 , CH (OH) CH═CHR 8 , C (O) CH═CHR 8 , 5-6 membered heterocyclyl-R 8 ,
R 6 is hydrogen;
R 5 and R 6 are both
Figure 2012506998
Can also be formed,
R 7 is hydrogen, fluorine, chlorine or hydroxy;
R 8 is 4-yl-benzoic acid or 6-yl-2-naphthoic acid,
R 9 and R 10 are hydrogen, or R 9 and R 10 are a fused 5-10 membered heteroaromatic ring or aromatic ring together with the bond to which they are attached to form a monocyclic or bicyclic ring)
10. The ROR gamma modulator for use according to any one of claims 1 to 9, or the use according to any one of claims 1 to 9, comprising: ＲＯＲガンマ受容体の抑制又は活性化に関連した疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ＲＯＲガンマモジュレーターの有効量をこのような治療を必要とする被験者に投与するステップを含む方法。   A method of treating or preventing a disease or disorder associated with inhibition or activation of ROR gamma receptors, comprising administering an effective amount of a ROR gamma modulator to a subject in need of such treatment. ＲＯＲガンマモジュレーターとしての化合物（Ｚ）−４−（１０，１０，１３，１３，１５−ペンタメチル−１１，１２，１３，１５−テトラヒドロ−１０Ｈ−ジナフト［２，３−ｂ：１’，２’−ｅ］［１，４］ジアゼピン−７−イル）安息香酸（ＬＥ５４０）、（Ｚ）−４−（５，７，７，１０，１０−ペンタメチル−７，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｅ］ナフト［２，３−ｂ］［１，４］ジアゼピン−１３−イル）安息香酸（ＬＥ１３５）、（Ｅ）−４−（２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロプ−１−エニル）安息香酸（ＴＴＮＢＰ）、（Ｅ）−４−（３−（３，５−ジ−テルト−ブチルフェニル）−３−オキソプロプ−１−エニル）安息香酸（Ｃｈ５５）。   Compound (Z) -4- (10,10,13,13,15-pentamethyl-11,12,13,15-tetrahydro-10H-dinaphtho [2,3-b: 1 ′, 2 ′ as ROR gamma modulator -E] [1,4] diazepin-7-yl) benzoic acid (LE540), (Z) -4- (5,7,7,10,10-pentamethyl-7,8,9,10-tetrahydro-5H -Benzo [e] naphtho [2,3-b] [1,4] diazepin-13-yl) benzoic acid (LE135), (E) -4- (2- (5,5,8,8-tetramethyl) -5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-2-yl) prop-1-enyl) benzoic acid (TTNBP), (E) -4- (3- (3,5-di-tert-butylphenyl)- 3-Oxoprop-1-enyl) benzoic acid (Ch5 ). 生化学無細胞インビトロアッセイ系でＲＯＲガンマ活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）このような細胞培養系又は生化学アッセイ系でＲＯＲガンマ活性の計測値を誘導又は低減するのに十分な、請求項１０又は１２に記載のＲＯＲガンマモジュレーターの有効量をこのようなアッセイ系に投与するステップと、
（ｂ）測定された活性を参照ＲＯＲガンマモジュレーターの活性と比較するステップ
とを含む方法。 A method for identifying a modulator of ROR gamma activity in a biochemical cell-free in vitro assay system comprising:
13. An effective amount of a ROR gamma modulator according to claim 10 or 12 sufficient to induce or reduce a measurement of ROR gamma activity in such a cell culture system or biochemical assay system. Administering to the system;
(B) comparing the measured activity to the activity of a reference ROR gamma modulator. 生化学アッセイ系が、配列ＳＥＱ１の組換え発現ＲＯＲガンマタンパク質及びＳＥＱ２又は３の配列を有するコアクチベーターペプチドと併用する、均一時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＨＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ、放射性リガンド結合及び置換アッセイから選択される、請求項１３に記載の方法。   Homogeneous time-resolved fluorescence resonance energy transfer (HTR-FRET) assay, radioligand binding and displacement, wherein the biochemical assay system is used in combination with a recombinantly expressed ROR gamma protein of sequence SEQ1 and a coactivator peptide having the sequence of SEQ2 or 3. 14. A method according to claim 13 selected from an assay. 参照ＲＯＲガンマモジュレーターが、請求項１０又は１２に記載の１つ又は複数の化合物であり、新たに同定されるモジュレーターの活性をモニターするための対照として使用される、請求項１３又は１４に記載の方法。   15. A reference ROR gamma modulator is one or more compounds according to claim 10 or 12, and is used as a control to monitor the activity of a newly identified modulator. Method.
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