JP2012501191A

JP2012501191A - Transgenic plants with enhanced growth characteristics

Info

Publication number: JP2012501191A
Application number: JP2011525278A
Authority: JP
Inventors: アンキーファー，パット，ジェー．; アンダーソン，ぺネロペ，エス．; ジェー．ナイト，トマス
Original assignee: University of Maine System; Los Alamos National Security LLC
Current assignee: University of Maine System; Los Alamos National Security LLC
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2009-08-31
Publication date: 2012-01-19
Anticipated expiration: 2029-08-31
Also published as: AU2016202733B2; IL211421A; JP5779095B2; BRPI0917919A2; RU2582260C2; AU2009287446A1; CN102405289A; AU2009287446C1; MX2011002110A; AU2009287446B2; EP2334166A4; WO2010025466A2; CO6341510A2; CL2011000396A1; WO2010025466A3; JP6163514B2; MX357276B; EP2334166A2; RU2011111344A; NZ591185A

Abstract

本発明は、劇的に増強された成長速度、増大した種子および果実／さやの収量、促進され、より生産的な開花、より効率的な窒素利用、塩分環境に対して増強された耐性、ならびに増大されたバイオマス収量を示すトランスジェニック植物に関する。一実施形態では、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）およびグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）をともに過剰に発現するように設計されたトランスジェニック植物を提供する。本発明に係るＧＰＴ＋ＧＳの二重トランスジェニック植物は、野生型の相当物よりも５０％から３００％以上のバイオマスの増加を示すＴ０世代系統を含み、増強された成長特性を常に示す。雌雄交雑および／または自家受粉により得られた世代は、典型的により優れた機能を有する（いくつかの二重トランスジェニック植物は、野生型植物よりも驚異的な４倍のバイオマス増加を達成する）。 The present invention provides dramatically enhanced growth rates, increased seed and fruit / pod yields, accelerated and more productive flowering, more efficient nitrogen utilization, enhanced tolerance to a salt environment, and It relates to transgenic plants exhibiting increased biomass yield. In one embodiment, a transgenic plant designed to overexpress both glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) and glutamine synthetase (GS) is provided. The GPT + GS double transgenic plants according to the present invention always contain enhanced growth characteristics, including T0 generation lines that show an increase in biomass of 50% to 300% or more over their wild type counterparts. Generations obtained by sexual crossing and / or self-pollination typically have better function (some double transgenic plants achieve a phenomenal 4-fold increase in biomass over wild type plants). .

Description

発明の詳細な説明Detailed Description of the Invention

〔連邦政府が後援する研究または開発に基づいてなされる発明に対する権利に関する明細書〕
本発明は、米国エネルギー省がカルフォルニア大学の理事に対して与えた規約番号Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６、および米国エネルギー省がロスアラモス国家安全保障有限責任会社に対して与えた規約番号ＤＥ−ＡＣ５２−０６ＮＡ２５３９６に基づく支援によってなされた。政府は本発明の所定の権利を有する。 [Specification on rights to inventions based on federal-sponsored research or development]
The present invention relates to a contract number W-7405-ENG-36 given to the director of the University of California by the US Department of Energy, and a contract number DE-AC52- Made with support based on 06NA25396. The government has certain rights in this invention.

〔関連文献〕
本明細書は、２００８年８月２９日に提出された米国仮特許番号第６１／１９０，５２０号に対して優先権を主張するものである。 [Related Literature]
This specification claims priority to US Provisional Patent No. 61 / 190,520, filed Aug. 29, 2008.

〔背景技術〕
世界的に人口が増加し、使用可能な農地が失われるか、または使用不能になり続けるため、より効率的で、かつ、地球に優しい農業システムに対する必要性は、人類にとって興味のある最優先事項である。収穫率、タンパク質含有量、および植物の成長速度を向上させることは、より効率的に目下の課題に対処し得る農業システムの開発において主な目的になっている。 [Background Technology]
The need for a more efficient and earth-friendly farming system is a top priority of interest to mankind as populations grow globally and available farmland continues to be lost or unusable It is. Improving yield, protein content, and plant growth rate has become a major goal in the development of agricultural systems that can address current challenges more efficiently.

近年では、十分に開発された多くの農作物の生産量は横這い状態になる傾向にあるため、改良された農作物の生産技術の重要性が高まるばかりである。多くの農作業は、コストおよび収益が農作物の迅速な回転率または市場までの時間に依存することから、時間に敏感である。そのため、価値の高い農作物（穀物、野菜、ベリーおよび他の果物など）に関する多くの農業ビジネスにとって、植物の早い成長が経済的に重要な目標である。 In recent years, the production of many well-developed crops tends to be flat, and the importance of improved crop production techniques is only increasing. Many farming operations are time sensitive because costs and revenues depend on the rapid turnover of crops or time to market. Therefore, fast plant growth is an economically important goal for many agricultural businesses involving high value crops (such as cereals, vegetables, berries and other fruits).

遺伝子工学は、いまだ持続的な農業技術の開発において賛否両論があるもののますます重要な役割を果たしており、今後もその役割を果たし続ける。近年、数多くの遺伝的に改変された植物および関連技術が開発されており、今日では当該植物および関連技術の多くが広く用いられている（Factsheet: Genetically Modified Crops in the United States, Pew Initiative on Food and Biotechnology, August 2004, (pewagbiotech.org/resources/factsheets)）。現在、採用されるトランスジェニック植物の種類は非常に多く、また増加しており、２００６年には約２億５０００万エーカーでトランスジェニック植物を栽培している。 Genetic engineering is playing an increasingly important role in the development of sustainable agricultural technologies, but continues to play a role in the future. In recent years, many genetically modified plants and related technologies have been developed, and many of these plants and related technologies are widely used today (Factsheet: Genetically Modified Crops in the United States, Pew Initiative on Food and Biotechnology, August 2004, (pewagbiotech.org/resources/factsheets)). Currently, the variety of transgenic plants adopted is very large and increasing, and in 2006, about 250 million acres were cultivated.

トランスジェニック植物技術の承認は徐々に増加しているかもしれないが（特に、米国、カナダおよびオーストラリアにおいて）、世界中の多くの地域（特に、ヨーロッパ）では農業における遺伝的に改変された植物の導入は未だに遅れている。そのため、信頼性があり、永続的な農業という目的を追い求めるとともに、毒素または他の潜在的に問題のある物質を植物および／または環境に取り込むことのない、遺伝的に設計された植物の開発への強い関心がある。また、目的（除草剤耐性、ペストおよび疾病への抵抗性、ならびに総生産量を改良することなど）達成のコストを最小限にすることへの強い関心がある。したがって、これらの目的を満足させることが可能なトランスジェニック植物に関する必要性がいまだにある。 Although approval of transgenic plant technology may be increasing gradually (especially in the United States, Canada and Australia), many regions around the world (especially in Europe) will have genetically modified plants in agriculture. Implementation is still delayed. Therefore, to develop a genetically engineered plant that pursues the goal of reliable and permanent agriculture and does not incorporate toxins or other potentially problematic substances into the plant and / or environment. Have a strong interest. There is also a strong interest in minimizing the cost of achieving the objectives (such as improving herbicide resistance, pest and disease resistance, and total production). Therefore, there remains a need for transgenic plants that can satisfy these objectives.

植物の早い成長という目標は、様々な植物調節システムに関する数多くの研究によって追求されている。この調節システムの多くはいまだ完全には理解されていない。特に、炭素および窒素の代謝を調整する植物調節機構は、完全に明らかになっていない。これらの調節機構は植物の成長および発達に欠かせない影響力があると推定される。 The goal of fast plant growth has been pursued by numerous studies on various plant regulatory systems. Many of these regulation systems are not yet fully understood. In particular, the plant regulatory mechanisms that regulate carbon and nitrogen metabolism have not been fully elucidated. These regulatory mechanisms are presumed to have an indispensable influence on plant growth and development.

光合成生物における炭素および窒素の代謝は、植物資源およびエネルギーの効果的な利用を保証する調整方法において調節されなければならない。炭素および窒素の代謝に関する従来の理解は、所定のステップおよびより大きなシステムのサブシステムである代謝経路の詳細を含む。光合成生物において炭素代謝はＣＯ₂固定によって始まり、２つの主な処理（Ｃ−３代謝およびＣ−４代謝と呼ばれる）によって進行する。Ｃ−３代謝を伴う植物において、酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ribulose bisphosphate carboxylase：RuBisCo）は、ＣＯ₂とリブロース二リン酸との結合を触媒し、３−ホスホグリセリン酸塩を産生する。当該３−ホスホグリセリン酸塩は、植物が炭素含有化合物を合成するために用いる３炭素化合物（Ｃ−３）である。Ｃ−４代謝を伴う植物において、ＣＯ₂は、酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって触媒される反応において、ホスホエノールピルビン酸塩と結合されて４炭素を含有する酸を形成する。この酸は、脱炭酸されてＣＯ₂を放出する場である維管束鞘細胞に輸送されて、その後、Ｃ−３植物に用いられた同じ反応中でリブロース二リン酸と結合される。 Carbon and nitrogen metabolism in photosynthetic organisms must be regulated in a coordinated manner that ensures the effective use of plant resources and energy. Conventional understanding of carbon and nitrogen metabolism includes details of metabolic pathways that are subsystems of the given steps and larger systems. In photosynthetic organisms, carbon metabolism begins with CO ₂ fixation and proceeds by two main processes (called C-3 metabolism and C-4 metabolism). In plants with C-3 metabolism, the enzyme ribulose bisphosphate carboxylase (RuBisCo) catalyzes the binding of CO ₂ and ribulose diphosphate to produce 3-phosphoglycerate. The said 3-phosphoglycerate is a 3 carbon compound (C-3) which a plant uses in order to synthesize | combine a carbon containing compound. In plants with C-4 metabolism, CO _2, in a reaction catalyzed by the enzyme phosphoenolpyruvate carboxylase to form acids containing 4 carbon coupled with phosphoenolpyruvate salt. This acid is transported to vascular sheath cells where it is decarboxylated to release CO ₂ and then combined with ribulose diphosphate in the same reaction used for C-3 plants.

数多くの研究では、様々な代謝産物が窒素代謝の植物調整に重要であることがわかっている。これらの化合物としては、有機酸であるリンゴ酸、ならびにアミノ酸であるグルタミン酸およびグルタミンが挙げられる。窒素は、酵素であるグルタミンシンテターゼ（glutamine synthetase：ＧＳ）の働きによって光合成生物に吸収される。グルタミンシンテターゼは、アンモニアとグルタミン酸との結合を触媒し、グルタミンを作る。ＧＳは、植物における窒素吸収に重要な役割を果たしており、グルタミン酸に対するアンモニアの付加を触媒することによってＡＴＰ依存性反応の中でグルタミンを作り出す（Miflin and Habash, 2002, Journal of Experimental Botany, Vol. 53, No. 370, pp. 979-987）。また、ＧＳは、光吸収ならびにタンパク質および窒素輸送化合物の機能停止の結果として放出されたアンモニアを再吸収する。ＧＳ酵素は２つの一般分類に分けられ得る。その１つは細胞質の形態（ＧＳ１）を表し、もう１つは色素体（すなわち、葉緑体）の形態（ＧＳ２）を表す。 Numerous studies have shown that various metabolites are important for plant regulation of nitrogen metabolism. These compounds include malic acid, which is an organic acid, and glutamic acid and glutamine, which are amino acids. Nitrogen is absorbed by photosynthetic organisms by the action of the enzyme glutamine synthetase (GS). Glutamine synthetase catalyzes the binding of ammonia and glutamic acid to produce glutamine. GS plays an important role in nitrogen absorption in plants and produces glutamine in an ATP-dependent reaction by catalyzing the addition of ammonia to glutamic acid (Miflin and Habash, 2002, Journal of Experimental Botany, Vol. 53). , No. 370, pp. 979-987). GS also reabsorbs ammonia released as a result of light absorption and cessation of protein and nitrogen transport compound function. GS enzymes can be divided into two general categories. One represents the cytoplasmic form (GS1) and the other represents the plastid (ie, chloroplast) form (GS2).

これまでの研究では、ＧＳ１の増大した発現量がＧＳ活性および植物成長のレベルを増加させることを証明しているが、報告は一貫性が欠けている。例えば、Fuentesらには、タバコ中のＣａＭＶＳ３５プロモーターによるアルファルファＧＳ１（細胞質の形態）の過剰発現は、葉組織内におけるＧＳ発現およびＧＳ活性のレベルを増加させたり、窒素欠乏状態で成長を増大させたりするが、最適な窒素肥沃状態における成長に影響を及ぼさないことが報告されている（Fuentes et al., 2001, J. Exp. Botany 52: 1071-81）。Templeらには、非常に高いレベルのＧＳ転写産物を含有する、全長アルファルファＧＳ１をコードする配列を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物、および活性な酵素に組み込まれるＧＳポリペプチドについて報告されているが、成長における表現型の作用について報告されていない（Temple et al., 1993, Molecular and General Genetics 236: 315-325）。Corruziらには、ＣａＭＶＳ３５プロモーターの制御下でエンドウマメの細胞質ゾルＧＳ１導入遺伝子を過剰に発現するトランスジェニックタバコが、増加されたＧＳ活性、増加された細胞質ゾルＧＳタンパク質、および改善された成長特性を示すことが報告されている（米国特許出願第６，１０７，５４７号明細書）。さらに最近、Unkeferらには、葉状組織内においてアルファルファＧＳ１を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物（葉から根において増大されたＧＳ活性に関してスクリーニングした後、増大したＳ１導入遺伝子のコピー数が得られるように、自家受粉によって遺伝的に分離した植物）が、それらの葉状部位において増大された量の２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンを製造することを見出したことが報告されている。当該２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンは、野生型のタバコ植物全体に顕著に増大された成長率を導くことが見出されている（米国特許出願第６，５５５，５００号明細書、米国特許出願第６，５９３，２７５号明細書、米国特許出願第６，８３１，０４０号明細書を参照）。 Previous studies have demonstrated that increased expression of GS1 increases the level of GS activity and plant growth, but the reports are inconsistent. For example, Fuentes et al. Show that overexpression of alfalfa GS1 (cytoplasmic form) by the CaMV S35 promoter in tobacco increases the level of GS expression and GS activity in leaf tissue and increases growth in nitrogen deficient conditions. However, it has been reported that it does not affect growth in optimal nitrogen fertile conditions (Fuentes et al., 2001, J. Exp. Botany 52: 1071-81). Temple et al. Reported on transgenic tobacco plants overexpressing the sequence encoding full-length alfalfa GS1, containing very high levels of GS transcripts, and GS polypeptides incorporated into active enzymes, No phenotypic effect on growth has been reported (Temple et al., 1993, Molecular and General Genetics 236: 315-325). Corruzi et al. Have reported that transgenic tobacco overexpressing the pea cytosolic GS1 transgene under the control of the CaMV S35 promoter has increased GS activity, increased cytosolic GS protein, and improved growth characteristics. (US Patent Application No. 6,107,547). More recently, Unkefer et al. Have reported that transgenic tobacco plants overexpressing alfalfa GS1 in foliar tissues (after screening for increased GS activity in leaves to roots, an increased S1 transgene copy number is obtained. , Plants genetically isolated by self-pollination) have been found to produce increased amounts of 2-hydroxy-5-oxoproline in their foliate sites. The 2-hydroxy-5-oxoproline has been found to lead to significantly increased growth rates throughout wild-type tobacco plants (US Pat. No. 6,555,500, US Pat. (See application 6,593,275, US patent application 6,831,040).

さらに、Unkeferらには、植物の発育を改良するための２−ヒドロキシ−５−オキソプロリン（また、２−オキソグルタラメート（2-oxoglutaramate）として知られる）の使用について記載されている（米国特許第６，５５５，５００号明細書、米国特許第６，５９３，２７５号明細書、米国特許第６，８３１，０４０号明細書）。特に、Unkeferらには、葉状組織（根幹組織に関連する）における増加された濃度の２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンが、植物発育特性を増強させることになる事象のカスケードの引き金になることが開示されている。Unkeferらには、２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの葉状濃度が植物発育特性を増強させる引き金となるために増加され得る（具体的には、植物の葉状部分に直接２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの溶液を投与し、葉組織に特異的にグルタミンシンテターゼを過剰発現させることによって）方法が記載されている。 In addition, Unkefer et al. Describe the use of 2-hydroxy-5-oxoproline (also known as 2-oxoglutaramate) to improve plant development (US No. 6,555,500, U.S. Pat. No. 6,593,275, U.S. Pat. No. 6,831,040). In particular, Unkefer et al. Show that increased concentrations of 2-hydroxy-5-oxoproline in leafy tissue (related to root tissue) trigger a cascade of events that will enhance plant growth characteristics. It is disclosed. Unkefer et al. Show that the leaf concentration of 2-hydroxy-5-oxoproline can be increased to trigger plant growth properties (specifically, 2-hydroxy-5-oxo directly on the plant leaf. A method has been described (by administering a solution of proline and overexpressing glutamine synthetase specifically in leaf tissue).

動物の２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成に関連があることが知られる数多くのトランスアミナーゼおよびヒドロリアーゼ酵素は、動物の肝組織および膵組織において同定されている（Cooper and Meister, 1977, CRC Critical Reviews in Biochemistry, pages 281-303; Meister, 1952, J. Biochem. 197: 304）。植物では２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの生化学的合成が知られているが、十分に特性が示されていない。さらに、植物における２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの機能、およびその液溜まりの大きさ（組織濃度）の重要性は知られていない。結局、当該技術では、どのような（複数の）トランスアミナーゼまたは（複数の）加水分解酵素が存在し得るか、および／またはどのような（複数の）トランスアミナーゼまたは（複数の）加水分解酵素が植物中で２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成を触媒するときに機能し得ることに関してはっきりと明確な指針を提供しておらず、当該植物トランスアミナーゼが報告されたり、単離または特徴づけられたりしていない。 A number of transaminases and hydrolyase enzymes known to be related to the synthesis of animal 2-hydroxy-5-oxoproline have been identified in animal liver and pancreatic tissues (Cooper and Meister, 1977, CRC Critical Reviews in Biochemistry, pages 281-303; Meister, 1952, J. Biochem. 197: 304). Although the biochemical synthesis of 2-hydroxy-5-oxoproline is known in plants, it has not been fully characterized. Furthermore, the importance of the function of 2-hydroxy-5-oxoproline in plants and the size of the pool (tissue concentration) is not known. Ultimately, in the art what transaminase or hydrolase (s) may be present and / or what transaminase or hydrolase (s) is present in the plant Provides no clear guidance on what can function when catalyzing the synthesis of 2-hydroxy-5-oxoproline, and the plant transaminase has been reported, isolated or characterized Absent.

〔発明の概要〕
本発明は、劇的に増強された成長速度、増大された種子および果実／さやの収量、早期、かつ、より生産力のある開花、より効率的な窒素利用、高い塩分環境に対して増強された耐性、および増大されたバイオマス収量を示すトランスジェニック植物に関する。一実施形態において、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（glutamine phenylpyruvate transaminase：ＧＰＴ）およびグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）の両者を過剰に発現するように設計されたトランスジェニック植物が提供される。本発明に係るＧＰＴ＋ＧＳの二重トランスジェニック植物は増強された成長特性を示しており、Ｔ０世代の系統では野生型の植物よりも５０％から３００％のバイオマスの増加を示している。雌雄交雑および／またはより多く典型的に行なわれる自家受粉から得られる世代では、いくつかの二重トランスジェニック植物が野生型の植物よりも４倍という驚異的なバイオマス増加を達成している。同様に、花の収量および果実またはさやの収量もまた大いに向上しており、Ｔ０世代の系統では典型的に野生型の収率よりも５０％から７０％の増加を示し、いくつかの場合には１００％の増加を示す。このような増強された成長表現型の特性を示すトランスジェニック植物は、本明細書において提供される多くの実施例によって実証されるように、様々な形質転換方法、種々の発現ベクターおよびプロモーター、ならびに多くの種からの異種導入遺伝子配列および同種導入遺伝子配列によって、個々の植物種の範囲にわたって首尾よく生成されている。よって、本発明は、実質的にすべての分野の農業を変貌させる可能性を秘めている抜本的な躍進技術を提供する。 [Summary of the Invention]
The present invention is enhanced for dramatically enhanced growth rates, increased seed and fruit / pod yields, early and more productive flowering, more efficient nitrogen utilization, and high salinity environments. Relates to transgenic plants exhibiting high tolerance and increased biomass yield. In one embodiment, a transgenic plant is provided that is designed to overexpress both glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) and glutamine synthetase (GS). The GPT + GS double transgenic plants according to the present invention show enhanced growth characteristics, with the T0 generation line showing a 50% to 300% increase in biomass over the wild type plant. In generations derived from male and female crossings and / or more typically self-pollination, some double transgenic plants have achieved a phenomenal biomass increase of four times that of wild-type plants. Similarly, flower yields and fruit or pod yields have also been greatly improved, with T0 generation strains typically showing a 50% to 70% increase over wild type yields, in some cases Indicates a 100% increase. Transgenic plants exhibiting such enhanced growth phenotypic characteristics are, as demonstrated by the many examples provided herein, various transformation methods, various expression vectors and promoters, and Heterologous and homologous transgene sequences from many species have been successfully generated across a range of individual plant species. Thus, the present invention provides a radical breakthrough technology that has the potential to transform agriculture in virtually all fields.

出願人は、酵素であるグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を植物における２−ヒドロキシ−５−オキソプロリン（２−オキソグルタラメート）シンテターゼの触媒として同定する。２−オキソグルタラメートは、光合成用途、炭素固定および窒素代謝に関連のある多数の遺伝子の機能を調節する強力なシグナル代謝産物である。本発明は、ＧＰＴをコードする単離された核酸分子を提供する。また、本発明は、コードされた酵素が２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成に直接的に関与するという新規の知見を開示する。本発明のこの観点は、本明細書において、いくつかの種からのＧＰＴｓをコードするＧＰＴポリヌクレオチドの開示によって実証される。当該種としては、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ブドウ、イネ、ダイズ、オオムギ、バンブー、およびゼブラフィッシュからの非植物ホモログが挙げられる。これらの多くは組換えＧＰＴｓとして発現しており、ＧＰＴ活性を有することが確認されている。 Applicants identify the enzyme glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) as a catalyst for 2-hydroxy-5-oxoproline (2-oxoglutamate) synthetase in plants. 2-Oxoglutaramate is a powerful signal metabolite that regulates the function of many genes involved in photosynthesis applications, carbon fixation and nitrogen metabolism. The present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding GPT. The present invention also discloses the novel finding that the encoded enzyme is directly involved in the synthesis of 2-hydroxy-5-oxoproline. This aspect of the invention is demonstrated herein by the disclosure of GPT polynucleotides that encode GPTs from several species. Such species include non-plant homologs from Arabidopsis, grapes, rice, soybeans, barley, bamboo, and zebrafish. Many of these are expressed as recombinant GPTs and have been confirmed to have GPT activity.

さらに、本発明は、ＧＰＴ導入遺伝子およびＧＳ導入遺伝子の両者を発現するトランスジェニック植物を提供する。「二重導入遺伝子（double-transgene）」植物などにおけるこれら２種類の導入遺伝子の発現は、これらの植物が、極めて顕著であり、また、ときに大いに増強された成長速度および花／果実／さや／種子の収量を示すため、実質的に増加された二酸化炭素固定率、および非常に強い成長増強効果をもたらす。このように成長が増強されたトランスジェニック植物を産生する方法を提供する。 Furthermore, the present invention provides a transgenic plant that expresses both a GPT transgene and a GS transgene. The expression of these two transgenes, such as in “double-transgene” plants, is very prominent in these plants and sometimes greatly enhanced growth rates and flowers / fruits / pods / Indicates a substantially increased carbon dioxide fixation rate and very strong growth enhancing effect to show seed yield. Thus, a method for producing a transgenic plant with enhanced growth is provided.

シグナル代謝産物２−オキソグルタラメートの濃度を特異的に増加させることによって（すなわち、葉状組織において）、本発明の導入遺伝子植物は短期間でより高い総収量を生産することが可能であるため、幅広い農作物にわたって増強された生産性を有する農業を提供し得る。重要なことに、今日までに記載されている多くのトランスジェニック植物とは異なり、本発明は天然の植物酵素をコードする天然の植物遺伝子を利用する。本発明のトランスジェニック植物の増強された成長特性は、植物に追加のＧＰＴおよびＧＳの能力を取り込むことによって本質的に達成される。このように、本発明のトランスジェニック植物は、有毒な物質、成長ホルモン、ウイルス性または細菌性の遺伝産物のいずれも発現せず、またそれゆえ、世界の一部の地域においてこれまで遅れていたトランスジェニック植物の採用についての多くの懸念がなくなる。 By specifically increasing the concentration of the signal metabolite 2-oxoglutaramate (ie, in leaf tissue), the transgene plants of the present invention can produce higher total yields in a short period of time. Can provide agriculture with enhanced productivity across a wide range of crops. Importantly, unlike the many transgenic plants described to date, the present invention utilizes natural plant genes that encode natural plant enzymes. The enhanced growth characteristics of the transgenic plants of the present invention are essentially achieved by incorporating additional GPT and GS capabilities into the plant. Thus, the transgenic plants of the present invention did not express any toxic substances, growth hormones, viral or bacterial genetic products and were therefore delayed in some parts of the world so far Many concerns about the adoption of transgenic plants disappear.

一実施形態において、本発明は、ＧＰＴ導入遺伝子およびＧＳ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物であって、上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子は、植物プロモーターに操作可能に結合される、トランスジェニック植物を提供する。特定の実施形態において、上記ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１導入遺伝子である。別の特定の実施形態において、上記ＧＰＴ導入遺伝子は、（ａ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に示すアミノ酸配列、ならびに（ｂ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のいずれか１つと少なくとも７５％の同一性を有し、かつ、ＧＰＴ活性を有するアミノ酸配列、からなる群の形態を選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。さらに別の特定の実施形態において、上記ＧＳ導入遺伝子は、（ａ）残基１１からの配列番号４および配列番号７に示すアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号４または配列番号７と少なくとも７５％の同一性のあるアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子は、植物のゲノムに取り込まれている。本発明に係るトランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得る。 In one embodiment, the present invention provides a transgenic plant comprising a GPT transgene and a GS transgene, wherein the GPT transgene and the GS transgene are operably linked to a plant promoter. provide. In certain embodiments, the GS transgene is a GS1 transgene. In another specific embodiment, the GPT transgene comprises (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, sequence SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36, and (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24 An amino acid having at least 75% identity with any one of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, and SEQ ID NO: 36, and having GPT activity A polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the sequences. In yet another specific embodiment, the GS transgene comprises (a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7 from residue 11, and (b) SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 7 and at least 75% A polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: In some embodiments, the GPT transgene and the GS transgene are incorporated into the genome of the plant. The transgenic plant according to the present invention may be a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.

また、本発明は、本発明に係るトランスジェニック植物の任意の世代の子孫を提供する。ここで、当該子孫は、上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子を含む。また、本発明は、本発明に係るトランスジェニック植物の任意の世代の種子を提供する。ここで、当該種子は、上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子を含む。本発明に係るトランスジェニック植物は、類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して、１つ以上の増強された成長特性を示してもよい。増強された成長特性としては、限定されないが、増強された成長速度、増大されたバイオマス収量、増大された種子の収量、増大された花または花芽の収量、増大された果実またはさやの収量、大型の葉が挙げられる。また、本発明に係るトランスジェニック植物は、類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して、増大されたＧＰＴおよび／もしくはＧＳ活性のレベル、ならびに／または増大された２−オキソグルタラメートのレベルを示し得る。いくつかの実施形態において、本発明に係るトランスジェニック植物は、向上された窒素利用効率または塩または塩分を含んだ環境に対して増強された耐性を示す。 The present invention also provides progeny of any generation of the transgenic plant according to the present invention. Here, the progeny include the GPT transgene and the GS transgene. The present invention also provides seeds of any generation of the transgenic plant according to the present invention. Here, the seed contains the GPT transgene and the GS transgene. A transgenic plant according to the present invention may exhibit one or more enhanced growth characteristics compared to similar wild-type or non-transformed plants. Enhanced growth characteristics include, but are not limited to, enhanced growth rate, increased biomass yield, increased seed yield, increased flower or flower bud yield, increased fruit or pod yield, large size Leaves. Also, the transgenic plants according to the present invention have increased levels of GPT and / or GS activity and / or increased 2-oxoglutaramate compared to similar wild-type or non-transformed plants. Can indicate the level. In some embodiments, the transgenic plants according to the present invention exhibit enhanced nitrogen utilization efficiency or enhanced resistance to a salt or salt-containing environment.

また、本発明のトランスジェニック植物およびその種子を生産する方法を提供しており、類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増強された成長特性、増大された窒素利用効率、および塩または食塩水の環境において発芽または成長に対して増大された耐性を有する植物の生産に関する方法を含む。 Also provided are methods for producing the transgenic plants of the present invention and seeds thereof, with enhanced growth characteristics, increased nitrogen utilization efficiency, and salts compared to similar wild-type or non-transformed plants. Or a method relating to the production of plants having increased resistance to germination or growth in a saline environment.

〔図面の簡単な説明〕
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。このカラー図面を含む特許または特許出願書類の公報のコピーは、請求および必要な手数料を支払いに基づいて特許庁により提供される。 [Brief description of the drawings]
A patent or application file contains at least one drawing executed in color. A copy of the patent or patent application publication containing this color drawing will be provided by the Patent Office upon request and payment of the necessary fee.

図１．窒素吸収および２−オキソグルタラメートの生合成：概略的な代謝経路。 FIG. Nitrogen absorption and biosynthesis of 2-oxoglutaramate: a schematic metabolic pathway.

図２．野生型のタバコ植物に対して、ＧＳ１またはＧＰＴのいずれかが過剰に発現しているトランスジェニックタバコ植物の比較を示す写真である。左から右に向かって、野生型植物、アルファルファ（Alfalfa）ＧＳ１導入遺伝子、シロイヌナズナＧＰＴ導入遺伝子。後述する実施例３および５を参照。 FIG. It is a photograph which shows the comparison of the transgenic tobacco plant which overexpresses either GS1 or GPT with respect to a wild-type tobacco plant. From left to right, wild type plant, Alfalfa GS1 transgene, Arabidopsis GPT transgene. See Examples 3 and 5 below.

図３．野生型のトマト植物に対してＧＳ１またはＧＰＴのいずれかを過剰に発現するトランスジェニックマイクロトム（Micro-Tom）トマト植物の比較を示す写真である。左から右に向かって、野生型植物、アルファルファＧＳ１導入遺伝子、シロイヌナズナＧＰＴ導入遺伝子。後述する実施例４および６を参照。 FIG. FIG. 6 is a photograph showing a comparison of transgenic Micro-Tom tomato plants that overexpress either GS1 or GPT relative to wild-type tomato plants. From left to right, wild type plant, alfalfa GS1 transgene, Arabidopsis GPT transgene. See Examples 4 and 6 below.

図４．野生型のタバコ植物とＧＳ１またはＧＰＴトランスジェニックタバコ植物との葉の大きさの比較を示す写真である。Ａ：ＧＳ１トランスジェニックタバコからの葉（下の葉）と、野生型からの葉（上の葉）との比較。Ｂ：ＧＰＴトランスジェニックタバコからの葉と（下の葉）と、野生型からの葉（上の葉）との比較。 FIG. It is a photograph which shows the comparison of the leaf size of a wild-type tobacco plant and a GS1 or GPT transgenic tobacco plant. A: Comparison of leaves from GS1 transgenic tobacco (bottom leaves) and leaves from wild type (top leaves). B: Comparison of leaves from GPT transgenic tobacco with (lower leaves) and wild type leaves (upper leaves).

図５．ＧＳ１トランスジェニックタバコ系統とＧＰＴトランスジェニックタバコ系統との多様な交雑から生成されたトランスジェニックタバコ植物と、野生型の植物と、１種類の導入遺伝子植物との比較を示す写真である。Ａ−Ｃ：それぞれ２、３、および７の交雑。後述する実施例７を参照。 FIG. It is a photograph showing a comparison between a transgenic tobacco plant generated from various crosses between a GS1 transgenic tobacco line and a GPT transgenic tobacco line, a wild type plant, and one type of transgene plant. A-C: 2, 3, and 7 crosses, respectively. See Example 7 below.

図６．野生型の植物と、ＧＳ１およびＧＰＴを交雑したトランスジェニックタバコ植物との葉の大きさの比較を示す写真である。Ａ：ＧＳ×ＧＰＴ交雑３からの葉（下の葉）と野生型からの葉（上の葉）との比較。Ｂ：ＧＳ×ＧＰＴ交雑７からの葉（下の葉）と野生型からの葉（上の葉）との比較。後述する実施例７を参照。 FIG. It is a photograph showing a comparison of leaf size between a wild type plant and a transgenic tobacco plant hybridized with GS1 and GPT. A: Comparison of leaves from GS × GPT hybrid 3 (lower leaves) and leaves from wild type (upper leaves). B: Comparison of leaves from GS × GPT hybrid 7 (lower leaves) and leaves from wild type (upper leaves). See Example 7 below.

図７．トランスジェニックペッパー植物（右）および野生型のコントロールペッパー植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して大型のペッパー果実収穫高を示す。 FIG. It is a photograph of a transgenic pepper plant (right) and a wild type control pepper plant (left), and the transgenic plant shows a large pepper fruit yield relative to the wild type control plant.

図８．トランスジェニックマメ植物を野生型のコントロールマメ植物と比較した（いくつかのトランスジェニック系統はシロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現している）。上段左：様々な日数における草高；上段右：花芽の数；下段左：花の数；下段右：マメさやの数。野生型はコントロールであり、系統２Ａ、４Ａおよび５Ｂはすべてトランスジェニック植物の系統である。後述する実施例９を参照。 FIG. Transgenic bean plants were compared to wild-type control bean plants (some transgenic lines express Arabidopsis GPT and GS transgenes). Upper left: plant height in various days; upper right: number of flower buds; lower left: number of flowers; lower right: number of bean pods. Wild type is the control and lines 2A, 4A and 5B are all transgenic plant lines. See Example 9 below.

図９．トランスジェニックマメ植物（右）および野生型のコントロールマメ植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して増加された成長を示す。トランスジェニック系統はシロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現している。後述する実施例９を参照。 FIG. Fig. 6 is a photograph of a transgenic bean plant (right) and a wild type control bean plant (left), where the transgenic plant shows increased growth relative to the wild type control plant. The transgenic lines express Arabidopsis GPT and GS transgenes. See Example 9 below.

図１０．トランスジェニックマメ植物のさや、花および花芽を、野生型のコントロールマメ植物と比較した（トランスジェニック系統はブドウＧＰＴおよびシロイヌナズナＧＳの導入遺伝子を発現している）。後述する実施例１０を参照。 FIG. The pods, flowers, and flower buds of transgenic bean plants were compared to wild-type control bean plants (transgenic lines expressing grape GPT and Arabidopsis GS transgenes). See Example 10 below.

図１１．トランスジェニックマメ植物（右）および野生型のコントロールマメ植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して増加された成長を示す。トランスジェニック系統はブドウＧＰＴおよびシロイヌナズナＧＳの導入遺伝子を発現している。後述する実施例１０を参照。 FIG. Fig. 6 is a photograph of a transgenic bean plant (right) and a wild type control bean plant (left), where the transgenic plant shows increased growth relative to the wild type control plant. The transgenic lines express grape GPT and Arabidopsis GS transgenes. See Example 10 below.

図１２．トランスジェニックササゲ（Cowpea）系統Ａ植物を野生型のコントロールササゲ植物と比較した（トランスジェニック系統はシロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現している）。このトランスジェニック植物は野生型のコントロール植物よりも早い成長、ならびにより早い開花およびさやの固定を示す。（Ａ）５月２１日時点における高さおよび葉の長さの寸法の比較、（Ｂ）６月１８日時点における三つ葉および花芽の比較、（Ｃ）６月２２日時点における花、花芽およびエンドウマメのさやの数の比較。後述する実施例１１を参照。 FIG. Transgenic cowpea (Cowpea) line A plants were compared to wild type control cowpea plants (transgenic lines expressing Arabidopsis GPT and GS transgenes). This transgenic plant exhibits faster growth and faster flowering and pod fixation than wild-type control plants. (A) Comparison of height and leaf length dimensions as of May 21, (B) Comparison of trefoil and flower buds as of June 18, (C) Flowers, flower buds and peas as of June 22. Comparison of the number of bean pods. See Example 11 below.

図１３．トランスジェニックササゲ系統Ａ植物（右）および野生型のコントロールササゲ植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して増加された成長を示す。トランスジェニック系統はシロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現している。後述する実施例１１を参照。 FIG. FIG. 5 is a photograph of a transgenic cowpea line A plant (right) and a wild type control cowpea plant (left), where the transgenic plant shows increased growth relative to the wild type control plant. The transgenic lines express Arabidopsis GPT and GS transgenes. See Example 11 below.

図１４．トランスジェニックササゲ系統Ｇ植物を野生型のコントロールササゲ植物と比較した（トランスジェニック系統はブドウＧＰＴおよびシロイヌナズナＧＳの導入遺伝子を発現している）。このトランスジェニック植物は野生型のコントロール植物よりも早い成長、ならびにより早い開花およびさやの固定を示す。（Ａ）草高、（Ｂ）花およびエンドウマメのさやの数、（Ｃ）葉芽および三つ葉の数。後述する実施例１２を参照。 FIG. Transgenic cowpea line G plants were compared to wild type control cowpea plants (transgenic lines expressing grape GPT and Arabidopsis GS transgenes). This transgenic plant exhibits faster growth and faster flowering and pod fixation than wild-type control plants. (A) Plant height, (B) Number of flowers and pea pods, (C) Number of leaf buds and trefoil. See Example 12 below.

図１５．トランスジェニックササゲ系統Ｇ植物（右）および野生型のコントロールササゲ植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して増加された成長を示す。トランスジェニック系統はブドウＧＰＴおよびシロイヌナズナＧＳの導入遺伝子を発現している。後述する実施例１２を参照。 FIG. Fig. 6 is a photograph of a transgenic cowpea line G plant (right) and a wild type control cowpea plant (left), where the transgenic plant shows increased growth relative to the wild type control plant. The transgenic lines express grape GPT and Arabidopsis GS transgenes. See Example 12 below.

図１６．トランスジェニックカンタループ（Cantaloupe）植物（右）および野生型のコントロールカンタループ植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して増加された成長を示す。トランスジェニック系統はシロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現している。後述する実施例１４を参照。 FIG. Fig. 6 is a photograph of a transgenic cantaloupe plant (right) and a wild type control cantaloupe plant (left), where the transgenic plant shows increased growth relative to the wild type control plant. The transgenic lines express Arabidopsis GPT and GS transgenes. See Example 14 below.

図１７．トランスジェニックカボチャ植物（右）および野生型のコントロールカンタループ植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して増加された成長を示す。トランスジェニック系統はシロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現している。後述する実施例１５を参照。 FIG. FIG. 3 is a photograph of a transgenic pumpkin plant (right) and a wild type control cantaloupe plant (left), where the transgenic plant shows increased growth relative to the wild type control plant. The transgenic lines express Arabidopsis GPT and GS transgenes. See Example 15 below.

図１８．トランスジェニックシロイヌナズナ植物（右）および野生型のコントロールシロイヌナズナ植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して増加された成長を示す。トランスジェニック系統はシロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現している。後述する実施例１６を参照。 FIG. It is a photograph of a transgenic Arabidopsis plant (right) and a wild type control Arabidopsis plant (left), where the transgenic plant shows increased growth relative to the wild type control plant. The transgenic lines express Arabidopsis GPT and GS transgenes. See Example 16 below.

図１９．シロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現しているトランスジェニックトマト植物を野生型のコントロールトマト植物と比較した。（Ａ）トランスジェニック植物の葉（右）対野生型のコントロールの葉（左）の写真であり、トランスジェニック植物においてより大型の葉を示す。（Ｂ）トランスジェニックトマト植物（右）および野生型のコントロール植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して増加された成長を示す。後述する実施例１７を参照。 FIG. Transgenic tomato plants expressing Arabidopsis GPT and GS transgenes were compared to wild-type control tomato plants. (A) A photograph of a transgenic plant leaf (right) versus a wild-type control leaf (left), showing larger leaves in the transgenic plant. (B) Photographs of transgenic tomato plants (right) and wild type control plants (left) showing increased growth relative to wild type control plants. See Example 17 below.

図２０．トランスジェニックカメリナ（Camelina）植物（右）および野生型のコントロールカメリナ植物（左）の写真であり、トランスジェニック植物では野生型のコントロール植物に対して増加された成長を示す。トランスジェニック系統はシロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現している。後述する実施例１８を参照。 FIG. Fig. 4 is a photograph of a transgenic Camelina plant (right) and a wild type control camelina plant (left), where the transgenic plant shows increased growth relative to the wild type control plant. The transgenic lines express Arabidopsis GPT and GS transgenes. See Example 18 below.

〔発明の詳細な説明〕
（定義）
特に規定されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語、注釈、および他の科学専門用語は、本発明に関連する分野の当業者に通常理解される意味を有することが意図される。ある場合には、一般的に理解される意味を有する用語が本明細書において定義づけされており、関係を明らかにしたり、および／または整えたりする。また、本明細書においてそのような定義に含まれるものは、当該分野において一般的に理解されるものに対して実質的に差異を表すために必ずしも説明されるべきではない。本明細書において説明されるか、または参照される技術および方法は、従来の理論を用いて当業者に一般的に十分理解され、通常用いられる。当該技術および方法としては、例えば、Sambrookらにおいて広く用いられる分子クローニングの手法などがあり、分子クローニング：A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y、分子生物学における従来のプロトコル（Ausbel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001）、トランスジェニック植物：方法およびプロトコル（Leandro Pena, ed., Humana Press, 1^st edition, 2004）、およびアグロバクテリウムプロトコル（Wan, ed., Humana Press, 2^nd edition, 2006）が挙げられる。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を含む方法は、他に記載されていない限り、工業的に規定されるプロトコルおよび／またはパラメータによって一般的に実施される。 Detailed Description of the Invention
(Definition)
Unless defined otherwise, all technical terms, annotations, and other scientific terms used herein are intended to have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the areas relevant to the present invention. In some cases, terms having a generally understood meaning are defined herein to clarify and / or arrange relationships. Also, what is included in such definitions herein should not necessarily be described in order to represent substantial differences from what is commonly understood in the art. The techniques and methods described or referenced herein are generally well understood and routinely used by those skilled in the art using conventional theory. Such techniques and methods include, for example, molecular cloning techniques widely used in Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual 3rd. Edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Molecular Biology Conventional protocols (Ausbel et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001), transgenic plants: methods and protocols (Leandro Pena, ed., Humana Press, 1 ^st edition, 2004), and Agrobacterium um protocol (Wan, ed., Humana Press , 2 nd edition, 2006) can be mentioned. Where appropriate, methods involving the use of commercially available kits and reagents are generally performed according to industrially defined protocols and / or parameters unless otherwise stated.

用語「核酸」は、一本鎖か、または二本鎖いずれかの形態におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマー（「ポリヌクレオチド」）を指す。特に制限されない限り、用語「ポリヌクレオチド」は天然ヌクレオチドの公知の類似物を含んでいる核酸を包含する。当該類似物は、参照核酸と同様の結合特性を有しており、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される。また、他に指示されない限り、特定の核酸配列は保存的に改変されたそれらのバリアント（例えば、変質コドン置換体）および相補的な配列、ならびに明示的に示された配列を暗に含む。具体的には、変質コドン置換体は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位に生成している配列が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換されることによって取得され得る（Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al., 1985 J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; and Cassol et al., 1992; Rossolini et al., 1994, Mol. Cell. Probes 8: 91-98）。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子にコードされるｍＲＡＮと同義的に用いられる。 The term “nucleic acid” refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides and polymers thereof (“polynucleotides”) in either single-stranded or double-stranded form. Unless otherwise limited, the term “polynucleotide” encompasses nucleic acids containing known analogues of natural nucleotides. Such analogs have similar binding properties as the reference nucleic acid and are metabolized in a manner similar to naturally occurring nucleotides. Also, unless otherwise indicated, certain nucleic acid sequences implicitly include conservatively modified variants (eg, altered codon substitutes) and complementary sequences, as well as explicitly indicated sequences. Specifically, an altered codon substitute is such that the sequence generated at position 3 of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al., 1985 J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; and Cassol et al., 1992; Rossolini et al. , 1994, Mol. Cell. Probes 8: 91-98). The term nucleic acid is used interchangeably with gene, cDNA, and mRAN encoded by a gene.

用語「プロモーター」は、操作可能に結合された核酸の転写を方向づける核酸制御配列のアレイを指す。本明細書において用いられるとき、「植物プロモーター」とは植物の中で機能するプロモーターである。プロモーターは、転写の開始領域（ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ因子など）付近の核酸配列を必然的に含む。また、プロモーターは、任意により、末端部のエンハンサー因子またはレセプター因子を含む。当該エンハンサー因子またはレセプター因子は、転写の開始領域からほぼ数千塩基対に配置され得る。「恒常的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下および発生条件下において活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境または発生調節下において活性なプロモーターである。用語「操作可能に結合された」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイ）と、第２の核酸配列との機能的な結合を指す。ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を方向づける。 The term “promoter” refers to an array of nucleic acid control sequences that direct transcription of an operably linked nucleic acid. As used herein, a “plant promoter” is a promoter that functions in plants. A promoter necessarily includes a nucleic acid sequence near the initiation region of transcription (such as a TATA factor in the case of a polymerase type II promoter). The promoter also optionally includes a terminal enhancer factor or receptor factor. The enhancer factor or receptor factor can be located approximately several thousand base pairs from the start region of transcription. A “constitutive” promoter is a promoter that is active under most environmental and developmental conditions. An “inducible” promoter is a promoter that is active under environmental or developmental regulation. The term “operably linked” refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters or transcription factor binding sites) and a second nucleic acid sequence. Here, the expression control sequence directs transcription of the nucleic acid corresponding to the second sequence.

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に用いられており、アミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーの人為的な化学擬態であるアミノ酸ポリマーに適用される。 The terms “polypeptide”, “peptide” and “protein” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acid residues. The term applies to naturally occurring amino acids to which one or more amino acid residues correspond, as well as amino acid polymers that are artificial chemical mimics of naturally occurring and non-naturally occurring amino acid polymers.

用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成的なアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸とある程度同様に機能するアミノ酸類似物およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされたアミノ酸、および後修飾されるアミノ酸である。そのようなアミノ酸としては、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンが挙げられる。アミノ酸類似物とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合するα炭素）を有する化合物を指す。当該アミノ酸類似物としては、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。当該類似物は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸のような同じ基本化学構造を維持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸とある程度同じように機能する化学物質を指す。 The term “amino acid” refers to naturally occurring and synthetic amino acids, as well as amino acid analogs and amino acid mimetics that function in a manner similar to the naturally occurring amino acids. Naturally occurring amino acids are those encoded by the genetic code and those that are post-modified. Examples of such amino acids include hydroxyproline, γ-carboxyglutamic acid, and O-phosphoserine. Amino acid analogs refer to compounds having the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid (i.e., the alpha carbon bonded to hydrogen, carboxyl group, amino group, and R group). Examples of the amino acid analog include homoserine, norleucine, methionine sulfoxide, and methionine methylsulfonium. Such analogs have modified R groups (eg, norleucine) or modified peptide backbones, but retain the same basic chemical structure as naturally occurring amino acids. Amino acid mimetics refers to chemical compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.

本明細書において、アミノ酸は、一般的に知られる３つの文字記号か、または国際純正応用化学連合−国際生化学連合（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ）生化学命名委員によって推奨されている１つの記号によって表され得る。同様に、ヌクレオチドは一般的に認められている１つの文字コードによって表され得る。 As used herein, amino acids are represented by the three letter symbols commonly known, or by one symbol recommended by the International Pure Chemical Association-International Biochemical Association (IUPAC-IUB) Biochemical Nomenclature. obtain. Similarly, nucleotides can be represented by the generally accepted single letter code.

用語「植物」は、植物全体、植物組織（例えば、葉、幹、花、根など）、種子および植物細胞、ならびにそれらの子孫を含む。本発明の方法に用いられ得る植物の分類は、通常、形質転換技術に影響を受け易い高等植物の分類と同様である。当該高等植物としては、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）および裸子植物が挙げられる。これらは、多様な倍数性段階（多数体、二倍体、半数体および半接合が挙げられる）の植物を含む。 The term “plant” includes whole plants, plant tissues (eg, leaves, stems, flowers, roots, etc.), seeds and plant cells, and their progeny. The classification of plants that can be used in the method of the present invention is usually similar to the classification of higher plants that are susceptible to transformation techniques. Such higher plants include angiosperms (monocotyledons and dicotyledons) and gymnosperms. These include plants at various ploidy stages, including multiploid, diploid, haploid and hemizygous.

用語「ＧＰＴポリヌクレオチド」および「ＧＰＴ核酸」は本明細書において同義的に用いられており、２−オキソグルタラメートの合成を触媒することに関連するポリヌクレオチドをコードする遺伝子の全長か、もしくは一部の長さのポリヌクレオチド配列を指す。当該「ＧＰＴポリヌクレオチド」および「ＧＰＴ核酸」としては、翻訳（コーディング）配列および非翻訳配列、ならびにそれらの相補体を共に包含するポリヌクレオチドが挙げられる。用語「ＧＰＴコード配列」は、転写されてＧＰＴタンパク質をコードする遺伝子の一部を指す。用語「ターゲッティング配列」は、タンパク質を細胞の細胞内コンパートメント（例えば、植物細胞内の葉緑体）に方向づけるタンパク質のアミノ末端部を指す。さらに、ＧＰＴポリヌクレオチドは、規定条件下でＧＰＴポリヌクレオチドと、またはＧＰＴポリヌクレオチド由来のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせる能力によって規定される。 The terms “GPT polynucleotide” and “GPT nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to the full-length gene encoding a polynucleotide associated with catalyzing the synthesis of 2-oxoglutaramate, or Refers to a length of polynucleotide sequence. The “GPT polynucleotide” and “GPT nucleic acid” include polynucleotides that include both translated (coding) and untranslated sequences, and their complements. The term “GPT coding sequence” refers to the portion of the gene that is transcribed and encodes the GPT protein. The term “targeting sequence” refers to the amino terminus of a protein that directs the protein to the intracellular compartment of the cell (eg, the chloroplast in a plant cell). In addition, GPT polynucleotides are defined by their ability to hybridize to GPT polynucleotides or PCR products derived from GPT polynucleotides under defined conditions.

「ＧＰＴ導入遺伝子」は、核酸分子をもち、トランスジェニック植物または植物胚、組織もしくは種子に対して外因性であるか、またはＧＰＴポリヌクレオチドをもつトランスジェニック植物の原種植物またはその植物胚、組織もしくは種子に対して外因性であるＧＰＴポリヌクレオチドを含む核酸分子である。 A “GPT transgene” has a nucleic acid molecule and is exogenous to a transgenic plant or plant embryo, tissue or seed, or a transgenic plant progenitor plant or plant embryo, tissue or plant having a GPT polynucleotide. A nucleic acid molecule comprising a GPT polynucleotide that is exogenous to the seed.

用語「ＧＳポリヌクレオチド」および「ＧＳ核酸」は、本明細書において同義的に用いられており、グルタミンシンテターゼタンパク質をコードする遺伝子の全長または部分的な長さのポリヌクレオチド配列を指す。また、当該用語は、翻訳される（コーディング）配列および翻訳されない配列、ならびにそれらの相補体をともに含んでいるポリヌクレオチドを包含する。用語「ＧＳコード配列」とは、遺伝子のうち、転写されてＧＳタンパク質をコードする部分を指す。用語「ＧＳ１ポリヌクレオチド」および「ＧＳ１核酸」は、本明細書において同義的に用いられており、グルタミンシンテターゼのアイソフォーム１タンパク質をコードする遺伝子の全長または部分的な長さのポリヌクレオチド配列を指す。また、当該用語は、翻訳される（コーディング）および翻訳されない配列、ならびにこれらの相補体をともに含んでいるポリヌクレオチドを包含する。用語「ＧＳ１コード配列」とは、遺伝子のうち、転写されてＧＳ１タンパク質をコードする部分を指す。 The terms “GS polynucleotide” and “GS nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a full-length or partial-length polynucleotide sequence of a gene encoding a glutamine synthetase protein. The term also encompasses polynucleotides that include both translated (coding) and non-translated sequences, and their complements. The term “GS coding sequence” refers to the portion of a gene that is transcribed and encodes a GS protein. The terms “GS1 polynucleotide” and “GS1 nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a full-length or partial length polynucleotide sequence of a gene encoding an isoform 1 protein of glutamine synthetase. . The term also encompasses polynucleotides that contain both translated (coding) and untranslated sequences, as well as complements thereof. The term “GS1 coding sequence” refers to the portion of a gene that is transcribed and encodes a GS1 protein.

「ＧＳ導入遺伝子」は核酸分子であり、当該核酸分子を有するトランスジェニック植物または植物の胚、器官もしくは種子に対して外来性であるか、またはＧＰＴポリヌクレオチドを有するトランスジェニック植物の、祖先の植物または植物の胚、器官もしくは種子に対して外来性である、ＧＳポリヌクレオチドを含んでいる。「ＧＳ１導入遺伝子」は核酸分子であり、当該核酸分子を有するトランスジェニック植物または植物の胚、器官もしくは種子に対して外来性であるか、またはＧＰＴポリヌクレオチドを有するトランスジェニック植物の祖先の、植物または植物の胚、器官若しくは種子に対して外来性であるＧＳ１ポリヌクレオチドを含んでいる。 A “GS transgene” is a nucleic acid molecule that is foreign to an embryo, organ or seed of a transgenic plant or plant having the nucleic acid molecule, or an ancestral plant of a transgenic plant having a GPT polynucleotide. Or a GS polynucleotide that is foreign to the embryo, organ or seed of the plant. A “GS1 transgene” is a nucleic acid molecule, a plant that is foreign to the embryo, organ or seed of a transgenic plant or plant having the nucleic acid molecule, or is an ancestor of a transgenic plant having a GPT polynucleotide. Or a GS1 polynucleotide that is foreign to the embryo, organ or seed of the plant.

本発明のＧＰＴポリヌクレオチドの例は本明細書に示されており、当該ＧＰＴポリヌクレオチドとしては、シロイヌナズナ、イネ、オオムギ、バンブー、ダイズ、ブドウ、およびゼブラフィッシュのＧＰＴが挙げられる。 Examples of GPT polynucleotides of the present invention are provided herein and include GPT polynucleotides of Arabidopsis, rice, barley, bamboo, soybeans, grapes, and zebrafish.

部分長ＧＰＴポリヌクレオチドとしては、Ｎ末端またはＣ末端がトランケートしたＧＰＴをコードするポリヌクレオチド配列、成熟ＧＰＴ（ターゲッティング配列を含まない）をコードするポリヌクレオチド配列、およびＧＰＴのドメインをコードする配列が挙げられる。Ｎ末端がトランケートしたＧＰＴをコードするＧＰＴポリヌクレオチドの例としては、シロイヌナズナの−３０コンストラクト、−４５コンストラクト、および−５６コンストラクトが挙げられる。これらは、配列番号２の全長ＧＰＴ構造のアミノ酸からそれぞれ最初の３０、４５、および５６のアミノ酸が除去されているコード配列である。 Partial length GPT polynucleotides include polynucleotide sequences encoding NPT or C-terminal truncated GPT, polynucleotide sequences encoding mature GPT (not including targeting sequences), and sequences encoding GPT domains. It is done. Examples of GPT polynucleotides encoding GPT truncated at the N-terminus include Arabidopsis thaliana −30, −45, and −56 constructs. These are coding sequences in which the first 30, 45, and 56 amino acids have been removed from the amino acids of the full length GPT structure of SEQ ID NO: 2, respectively.

形質転換された細胞およびトランスジェニック植物の生産において、本発明のＧＰＴポリヌクレオチドを用いるとき、挿入されたポリヌクレオチド配列が同一である必要はないが、以下にさらに述べるように、由来する本発明のＧＰＴポリヌクレオチドの遺伝子の配列と「実質的に同一」でありさえすればよいことを当業者は理解する。用語「ＧＰＴポリヌクレオチド」は、厳密に言うと、当該実質的に同一のバリアントを包含する。同様に、当業者は、コドン縮重のために数多くのポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードし、すべての当該ポリヌクレオチド配列が用語ＧＰＴポリヌクレオチドの中に含まれると意図されることを理解する。さらに、具体的にいうと、当該用語は、本明細書において開示されるＧＰＴポリヌクレオチド配列と実質的に同一であり、野生型ＧＰＴポリペプチドの突然変異によるか、またはＧＰＴポリペプチドの機能（例えば、ＧＰＴポリペプチドにおけるアミノ酸の保存的な置換に起因する）を保持するポリペプチドをコードする配列（後述のように決定される）を含む。よって、用語「ＧＰＴポリヌクレオチド」もまた、当該実質的に同一のバリアントを含む。 When using the GPT polynucleotides of the present invention in the production of transformed cells and transgenic plants, the inserted polynucleotide sequences need not be identical, but as described further below, Those skilled in the art will appreciate that they need only be “substantially identical” to the gene sequence of a GPT polynucleotide. The term “GPT polynucleotide”, strictly speaking, encompasses such substantially identical variants. Similarly, one skilled in the art will understand that due to codon degeneracy, many polynucleotide sequences will encode the same polypeptide and all such polynucleotide sequences are intended to be included within the term GPT polynucleotide. . More specifically, the term is substantially identical to a GPT polynucleotide sequence disclosed herein and is due to a mutation in the wild-type GPT polypeptide or the function of the GPT polypeptide (eg, , Resulting from a conservative substitution of amino acids in the GPT polypeptide) (which is determined as described below). Thus, the term “GPT polynucleotide” also includes such substantially identical variants.

用語「保存的に改変されたバリアント」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両者に適用できる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントは同一の、または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または実質的に同一の配列に対してアミノ酸配列をコードしない核酸を指す。遺伝コードの縮退が原因で、数多くの機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、すべてアミノ酸アラニンをコードする。このように、コドンによってアラニンが指定されるすべての位置において、当該コドンは、コードされるタンパク質が変更されることなく対応する任意のコドンへ変換され得る。当該核酸バリアントは「サイレントバリアント」であり、保存的に修飾されるバリアントの一種である。また、本明細書においてポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、当該核酸の起こり得るサイレントバリアントすべてを表現する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに関するコドンのみであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに関するコドンのみであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一の分子を産生するように修飾され得ることを理解する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸配列のサイレントのバリエーションはそれぞれ記載される各配列に関与している。 The term “conservatively modified variant” applies to both amino acid and nucleic acid sequences. With respect to a particular nucleic acid sequence, a conservatively modified variant refers to a nucleic acid that encodes the same or substantially the same amino acid sequence, or a nucleic acid that does not encode an amino acid sequence relative to a substantially identical sequence. Point to. Due to the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, the codon can be converted to any corresponding codon without altering the encoded protein. The nucleic acid variant is a “silent variant” and is a type of variant that is conservatively modified. Also, as used herein, all nucleic acid sequences that encode a polypeptide represent all possible silent variants of the nucleic acid. One skilled in the art will recognize that each codon in a nucleic acid (except AUG, which is usually only the codon for methionine, and TGG, which is usually only the codon for tryptophan), can be modified to produce a functionally identical molecule. to understand. Thus, silent variations of the nucleic acid sequences encoding polypeptides are each associated with each described sequence.

アミノ酸配列に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的に修飾されたバリアント」であることを理解する。当該置換、欠失または付加では、コードされた配列のうち１つのアミノ酸または数パーセントのアミノ酸を変更、付加または削除しており、「保存的に修飾されたバリアント」において、変更は化学的に類似しているアミノ酸とのアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似しているアミノ酸を示す同類置換表は、本技術分野において公知である。当該保存的に修飾されたバリアントは本発明の多形性バリアント、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えられ、取り除かれない。 With respect to amino acid sequences, one skilled in the art understands that individual substitutions, deletions or additions to the sequence of a nucleic acid, peptide, polypeptide or protein are “conservatively modified variants”. Such substitutions, deletions or additions alter, add or delete one amino acid or a few percent of the encoded sequence, and in “conservatively modified variants” the changes are chemically similar Result in the substitution of an amino acid with the amino acid being Conservative substitution tables showing amino acids that are functionally similar are known in the art. Such conservatively modified variants are added to polymorphic variants, interspecies homologs and alleles of the present invention and are not removed.

以下の８つの群は互いに同類置換であるアミノ酸をそれぞれ含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照）。 The following eight groups each contain amino acids that are conservative substitutions: 1) alanine (A), glycine (G); 2) aspartic acid (D), glutamic acid (E); 3) asparagine (N), glutamine ( Q); 4) Arginine (R), Lysine (K); 5) Isoleucine (I), Leucine (L), Methionine (M), Valine (V); 6) Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W); 7) serine (S), threonine (T); and 8) cysteine (C), methionine (M) (see, eg, Creighton, Proteins (1984)).

高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は、組織体の様々な段階の観点から説明され得る。この組織体の一般的な議論に関しては、例えば、 Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3^rd ed., 1994) およびCantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)を参照すればよい。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は局所的に配置されたポリペプチド内の３次元構造を指す。これらの構造は、通常ドメインとして知られる。ドメインはポリペプチドの小型の単位を形成するポリペプチドの一部であり、典型的に、２５からおよそ５００のアミノ酸長である。標準的なドメインは、さらに小さなユニットの組織体からなる（例えば、β−シートおよびα−ヘリックスの一帯）。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立した三次単位の非共有の関係によって形成される三次元構造を指す。また、異方性という用語は、エネルギーの表現として知られる。 Macromolecular structures (eg, polypeptide structures) can be described in terms of various stages of the tissue. For a general discussion of this organization, see, for example, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3 ^rd ed., 1994) and Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). You can refer to it. “Primary structure” refers to the amino acid sequence of a particular peptide. “Secondary structure” refers to a three-dimensional structure within a locally arranged polypeptide. These structures are commonly known as domains. A domain is a portion of a polypeptide that forms a small unit of the polypeptide, typically 25 to about 500 amino acids in length. A standard domain consists of smaller units of organization (eg, a zone of β-sheets and α-helices). “Tertiary structure” refers to the complete three-dimensional structure of a polypeptide monomer. “Quaternary structure” refers to a three-dimensional structure formed by a non-covalent relationship of independent tertiary units. The term anisotropy is also known as an expression of energy.

用語「単離された」は、野生型か、もしくは天然の状態において見られるような物質と通常同時に生じる成分から、実質的または本質的に遊離した物質を指す。しかしながら、当該用語「単離された」は、電気泳動ゲルか、または別の分離培地に存在する成分を指すことを意図するものではない。単離された成分は、この分離培地から離れて、別の用途に使用する状態にあるか、またはすでに新たな用途／環境において使用されている状態にある。「単離された」抗体は、特定されて自然環境の成分から分離されるか、および／または回収された抗体である。自然環境の汚染成分は、診断上の抗体の利用、または薬学的な抗体の利用に干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性の溶質もしくは非タンパク性の溶質を含み得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法で測定したとき、９５％（抗体重量）以上であり、最も好ましくは９９％（重量）以上に精製されるか、（２）回転キャップ配列決定装置によって少なくとも１５残基のＮ末端のアミノ酸配列または内部のアミノ酸配列を得るのに十分な量に精製されるか、または（３）クマシーブルー、または好ましくは銀染色により還元条件または非還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質に精製される。自然環境の抗体の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体としては、組換え細胞内のインシチュにある抗体を含む。しかし、通常、単離された抗体は少なくとも１回の精製工程によって調製される。 The term “isolated” refers to material that is substantially or essentially free from components that normally occur simultaneously with the material, either in the wild-type or as found in nature. However, the term “isolated” is not intended to refer to components present in the electrophoresis gel or in another separation medium. The isolated components are either away from this separation medium and are ready for use in another application or are already in use in a new application / environment. An “isolated” antibody is an antibody that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminants in the natural environment are substances that can interfere with the use of diagnostic antibodies, or the use of pharmaceutical antibodies, and can include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the antibody is (1) purified to 95% (antibody weight) or higher, most preferably 99% (weight) or higher as measured by the Raleigh method, or (2) rotational cap sequencing. Purified to an amount sufficient to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues by the device, or (3) in reducing or non-reducing conditions by Coomassie Blue, or preferably silver staining Purified to homogeneity by SDS-PAGE. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one component of the antibody in the natural environment will not be present. Ordinarily, however, isolated antibody will be prepared by at least one purification step.

核酸の一部に対して用いられるとき、用語「異種」とは、当該核酸が２つ以上のサブ配列（天然において、互いに同じ関係に見られない）を含むことを示す。例えば、新たな機能的な核酸を作るために配置された、関連のない遺伝子からの２つ以上の配列（例えば、１つの原料からのタンパク質をコードする核酸、および別の原料からのペプチド配列をコードする核酸）を有している核酸が、典型的に組換えにより作られる。同様に、異種タンパク質とは、当該タンパク質が、天然において互いに同じ関係に見られない２つ以上のサブ配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。 The term “heterologous” when used with respect to a portion of a nucleic acid indicates that the nucleic acid contains two or more subsequences that are not found in the same relationship to each other in nature. For example, two or more sequences from unrelated genes (eg, a nucleic acid encoding a protein from one source, and a peptide sequence from another source, arranged to create a new functional nucleic acid. A nucleic acid having a nucleic acid encoding is typically produced recombinantly. Similarly, a heterologous protein indicates that the protein comprises two or more subsequences that are not found in the same relationship to each other in nature (eg, a fusion protein).

２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、用語「同一の」または割合の「同一性」とは、比較領域全体を比較して整列させたときか、または配列比較アルゴリズムもしくは手動の配列検査および目視によって測定されるような領域を指定したとき、最大限の一致を考慮して同一か、または同じ（すなわち、特定の領域全体で約７０％の同一性、好ましくは約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％の同一性である）アミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で含む２つ以上の配列またはサブ配列を指す。また、この定義は、試験配列が基準配列と実質的に同一であるとき、実質的に配列相補性またはサブ配列相補性を有している試験配列の相補体を指す。また、この定義は、試験配列が基準配列と実質的に同一であるとき、実質的に配列相補性またはサブ配列相補性を有している試験配列の相補体を指す。 With respect to two or more nucleic acid or polypeptide sequences, the term “identical” or percentage of “identity” refers to when the entire comparison region is compared and aligned, or to a sequence comparison algorithm or manual sequence test and When specifying regions as measured by eye, they are the same or the same for maximum matching (ie, about 70% identity across a particular region, preferably about 75%, about 80% , About 85%, about 90%, or about 95% identity) refers to two or more sequences or subsequences that contain a certain percentage of amino acid residues or nucleotides. This definition also refers to the complement of a test sequence that has substantial sequence complementarity or subsequence complementarity when the test sequence is substantially identical to a reference sequence. This definition also refers to the complement of a test sequence that has substantial sequence complementarity or subsequence complementarity when the test sequence is substantially identical to a reference sequence.

配列同一性の割合がポリペプチドに関して用いられるとき、同一でない残基部分はしばしばアミノ酸の同類置換によって異なるということが理解される。ここで、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸残基と置き換えられるため、ポリペプチドの機能特性は変化しない。配列が同類置換ではない場合、保存的な天然の置換に関して修正するために、配列同一性の割合が上流に向かって修正され得る。 When percentage sequence identity is used in reference to a polypeptide, it is understood that portions of residues that are not identical often differ by conservative substitutions of amino acids. Here, since the amino acid residue is replaced with another amino acid residue having similar chemical properties (eg, charge or hydrophobicity), the functional properties of the polypeptide do not change. If the sequence is not a conservative substitution, the percent sequence identity can be modified upstream to correct for conservative natural substitutions.

配列比較に関して、典型的に１つの配列は基準配列として働き、試験配列は当該基準配列と比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列および基準配列はコンピュータに入力され、サブ配列座標が指定され、必要ならば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。初期設定プログラムのパラメータが用いられるか、または代替的なパラメータが指定される。そして、配列比較アルゴリズムは、当該プログラムのパラメータに基づき、基準配列に対する試験配列の配列同一性の割合を算出する。 For sequence comparison, typically one sequence acts as a reference sequence, and a test sequence is compared to that reference sequence. When using a sequence comparison algorithm, test and reference sequences are entered into a computer, subsequence coordinates are designated, if necessary, and sequence algorithm program parameters are designated. Default program parameters are used, or alternative parameters are specified. The sequence comparison algorithm then calculates the ratio of sequence identity of the test sequence to the reference sequence based on the program parameters.

本明細書において用いられるとき、「比較領域（comparison window）」は、２つの配列を最適に配列させた後、同数の連続した位置の基準配列と比較され得る配列のうち、２０から６００、通常は約５０から約２００、より通常は約１００から約１５０からなる群から選択される複数の連続した位置の任意の１つのセグメントに関する。比較のための配列の配置方法は、当分野において周知である。比較のための配列の最適な配置は、例えば、Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482の局所相同アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同配置アルゴリズムによって、Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似方法に関する研究によって、これらアルゴリズム（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピュータ制御の実施によって、または手動の位置合わせによって、および目視（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照）によって、実行され得る。 As used herein, a “comparison window” is 20 to 600 of sequences that can be compared to a reference sequence at the same number of consecutive positions after optimal alignment of the two sequences. Relates to any one segment at a plurality of consecutive positions selected from the group consisting of about 50 to about 200, more usually about 100 to about 150. Methods for arranging sequences for comparison are well known in the art. The optimal arrangement of the sequences for comparison is described, for example, in the Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 by the local homology algorithm of Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482. By homologous placement algorithms, Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, research on similar methods, these algorithms (the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., By performing computer control of Madison, WI's GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA) or by manual alignment and visually (eg, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 1995 supplement) ).

配列同一性および配列類似性の割合の測定に適したアルゴリズムの好ましい例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（それぞれ、Altschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402および Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている）が挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、典型的に本明細書に記載される初期パラメータとともに使用され、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性の割合を決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターによって公に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、クエリシーケンスにおいて長さＷの短いワードを特定することによって、ハイスコアの配列ペア（high scoring sequence pairs：ＨＳＰｓ）を特定することを含む。ここで、当該クエリシーケンスは、データベースシーケンスにおいて同じ長さのワードとともに配列されたとき、ある正の数の基準スコアＴと一致するか、または満足する。Ｔは、基準点に近いワードとみなされる（上述のAltschul ら）。これら冒頭付近のワードのヒットは、当該ワードを含んでいる長いＨＳＰｓを見つけるための検索を開始するための根源として働く。当該ワードのヒットは、累積の配列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。ヌクレオチド配列に関して、累積のスコアはパラメータＭ（一致する残基の対に関するリワードスコア；常に＞０）、およびパラメータＮ（一致しない残基に関するペナルティスコア；常に＜０）によって算出される。アミノ酸配列に関して、採点マトリクスが用いられて、累積のスコアを算出する。それぞれの方向におけるワードのヒットの拡張は、累積の配列スコアが数量Ｘによって達成される最大値から低減したときか、累積スコアが１つ以上の負に採点された残基の配列の累積のためにゼロもしくはそれ以下になったときか、またはいずれかの配列の末端が標的に到達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ，ＴおよびＸは、配列の検出感度および配列の速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）では、ワード長（Ｗ）１１を初期設定値、１０を期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較として用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、ワード長３を初期設定値、１０を期待値（Ｅ）、および５０をＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) 配置（Ｂ）、１０を期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較として用いる。 Preferred examples of algorithms suitable for measuring percent sequence identity and sequence similarity include the BLAST and BLAST 2.0 algorithms (Altschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al., Respectively). al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). BLAST and BLAST 2.0 are typically used with the initial parameters described herein to determine the percent sequence identity of the nucleic acids and proteins of the invention. Software for performing BLAST analyzes is publicly available by the National Center for Biotechnology Information. The algorithm first involves identifying high scoring sequence pairs (HSPs) by identifying short words of length W in the query sequence. Here, the query sequence matches or satisfies a certain positive number of reference scores T when arranged with words of the same length in the database sequence. T is considered the word close to the reference point (Altschul et al. Above). These hits near the beginning of the word serve as the root for initiating searches to find long HSPs containing that word. The word hits are extended in both directions along each sequence as long as the cumulative sequence score can be increased. For nucleotide sequences, the cumulative score is calculated by parameter M (reward score for matching residue pairs; always> 0) and parameter N (penalty score for mismatching residues; always <0). For amino acid sequences, a scoring matrix is used to calculate a cumulative score. The expansion of word hits in each direction is due to the accumulation of the sequence of residues whose cumulative score is one or more negatively scored when the cumulative sequence score is reduced from the maximum achieved by the quantity X Is stopped when it reaches zero or less, or when the end of either sequence reaches the target. The BLAST algorithm parameters W, T and X determine the detection sensitivity of the sequence and the speed of the sequence. In the BLASTN program (for nucleotide sequences), word length (W) 11 is used as the default value, 10 is the expected value (E), M = 5, N = -4, and comparison of both strands. Regarding the amino acid sequence, the BLASTP program uses a word length of 3 as a default value, 10 as an expected value (E), and 50 as a BLOSUM62 score matrix (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989). ) Arrangement (B), 10 is used as expected value (E), M = 5, N = -4, and comparison of both strands

また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性に関して統計に基づく分析を実行する（例えば、Karlin & Altschul, 1993, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の測定の１つには、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））がある。この最小合計確率は、２つのヌクレオチド配列間か、または２つのアミノ酸配列間の一致が偶然生じ得ることによる確率の表れを示す。例えば、核酸は、参照核酸との試験核酸の比較において最小合計確率が約０．２以下、より好ましくは約０．０１以下、最も好ましくは約０．００１以下である場合に、基準配列と類似しているとみなされる。 The BLAST algorithm also performs statistical analysis on the similarity between two sequences (see, eg, Karlin & Altschul, 1993, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787). One similarity measure provided by the BLAST algorithm is the minimum total probability (P (N)). This minimum total probability indicates an indication of the probability that a match between two nucleotide sequences or between two amino acid sequences may occur by chance. For example, a nucleic acid is similar to a reference sequence when the minimum total probability is about 0.2 or less, more preferably about 0.01 or less, and most preferably about 0.001 or less in comparison of a test nucleic acid to a reference nucleic acid. Is considered to be.

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、典型的に、核酸の複合混合物においてその標的サブ配列へハイブリダイズするが、別の配列にハイブリダイズしないプローブにおける条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、様々な環境において異なる。長い配列は特に高い温度にてハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広範な指針は、Tijssen（生化学および分子生物学における技術――核酸によるハイブリダイゼーション、「ハイブリダイゼーションの原理および核酸アッセイの概論」（１９９３））において見出される。一般的に、高いストリンジェント条件では、特定の配列に関して、規定されたイオン強度のｐＨにおいて融解点（Ｔｍ）以下の約５〜１０℃になるよう選択される。Ｔｍは、５０％のプローブが平衡状態でのターゲットシーケンスに対するターゲットハイブリダイズに相補的な温度である（ターゲットシーケンスが過度に存在し、Ｔｍにおいて５０％のプローブが平衡状態にあるとき）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン以下、典型的には、ｐＨ７．０から８．３において約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に関しては温度が少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド以上）に関しては少なくとも約６０℃であることが条件である。また、ストリンジェントな条件は、不安定化試薬（ホルムアミドなど）の付加によって達成され得る。選択的な、または特定のハイブリダイゼーションに関して、ポジティブシグナルは少なくとも２倍のバックグラウンドであり、好ましくは１０倍のバックグラウンドのハイブリダイゼーションである。 The term “stringent hybridization conditions” typically refers to conditions in a probe that hybridize to its target subsequence in a complex mixture of nucleic acids but not to another sequence. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Long sequences hybridize at particularly high temperatures. Extensive guidance for nucleic acid hybridization can be found in Tijssen (Technology in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acids, "Introduction to Hybridization Principles and Nucleic Acid Assays" (1993)). In general, at high stringency conditions, a particular sequence is selected to be about 5-10 ° C. below the melting point (Tm) at a defined ionic strength pH. Tm is the temperature complementary to target hybridization to a target sequence with 50% of the probes in equilibrium (when the target sequence is present excessively and 50% of the probes are in equilibrium at Tm). Stringent conditions are salt concentrations of about 1.0 M sodium ion or less, typically about 0.01 to 1.0 M sodium ion concentration (or other salts) at pH 7.0 to 8.3, The condition is that the temperature is at least about 30 ° C. for short probes (eg, 10 to 50 nucleotides) and at least about 60 ° C. for long probes (eg, 50 nucleotides or more). Stringent conditions may also be achieved with the addition of destabilizing reagents (such as formamide). For selective or specific hybridization, a positive signal is at least 2-fold background, preferably 10-fold background hybridization.

ストリンジェントな条件において互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるのであれば、実質的に同一のままである。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝コードによって許容されるコドンの最大量の縮退によって作られるときに、生じる。そのような場合において、核酸は適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において典型的にハイブリダイズする。 Nucleic acids that do not hybridize to each other under stringent conditions remain substantially the same if the polypeptides they encode are substantially identical. This occurs, for example, when a copy of a nucleic acid is made by a degeneracy of the maximum amount of codons allowed by the genetic code. In such cases, the nucleic acid typically hybridizes under moderately stringent hybridization conditions.

ＧＰＴポリペプチドを含んでいるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、本明細書に開示されるＧＰＴポリヌクレオチド配列によって、ストリンジェントな条件下での標準的なサザンブロットにおいて同定され得る。この目的に関して、当該ハイブリダイゼーションに最適なストリンジェントな条件としては、４０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液において、３７℃でのハイブリダイゼーション、および少なくとも約５０℃、通常、約５５℃から約６０℃の温度で２０分間０．２ＸＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄を含む。 Genomic DNA or cDNA containing a GPT polypeptide can be identified in standard Southern blots under stringent conditions by the GPT polynucleotide sequences disclosed herein. For this purpose, the most stringent conditions for the hybridization include hybridization at 37 ° C. in a buffer of 40% formamide, 1M NaCl, 1% SDS, and at least about 50 ° C., usually about 55 ° C. And at least one wash in 0.2 X SSC for 20 minutes at a temperature of about 60 ° C.

２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるというさらなる目安としては、基準配列（一対のオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅される）がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件においてプローブとして使用されるとき、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから試験配列を単離することが可能であるか、または、例えばノウザンもしくはサザンブロットで試験配列を同定することが可能であるかである。 A further indication that two polynucleotides are substantially identical is that a cDNA or genomic library when a reference sequence (amplified by a pair of oligonucleotide primers) is used as a probe in stringent hybridization conditions. Is it possible to isolate the test sequence from or to be able to identify the test sequence, for example with a Northern or Southern blot.

（トランスジェニック植物）
本発明は、農学的な性質が十分に向上している新規なトランスジェニック植物を提供する。十分に向上した農学的な性質は、促進された生育、増大した成熟植物の生体重および全現存量、より早期かつより豊富な量の開花、ならびに果実、さやおよび種子におけるより多くの収量を含む。本発明のトランスジェニック植物は、１つ以上の発現可能な遺伝的コンストラクトを植物に対して導入することにより生成される。この遺伝的コンストラクトは、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）およびグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの発現を促進することができる。一実施例において、ＧＰＴまたはＧＳ１導入遺伝子コード配列を有する１つの導入遺伝子系統の親が生成される（好ましくは、導入遺伝子に関して同型の遺伝子がその後両遺伝子を含有している植物の子孫を生成するまで自己自身）。 (Transgenic plant)
The present invention provides a novel transgenic plant having sufficiently improved agricultural characteristics. Fully improved agronomic properties include accelerated growth, increased mature plant weight and total biomass, earlier and more abundant flowering, and higher yields in fruits, pods and seeds . The transgenic plants of the present invention are generated by introducing one or more expressible genetic constructs into the plant. This genetic construct can facilitate the expression of one or more polynucleotides encoding glutamine synthetase (GS) and glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT). In one embodiment, a parent of one transgene line having a GPT or GS1 transgene coding sequence is generated (preferably a gene of the same type with respect to the transgene then generates the progeny of the plant containing both genes. Up to myself).

本発明における安定な形質転換の実施形態では、発現可能な遺伝的コンストラクトの１つ以上のコピーが宿主植物ゲノム中に組み込まれるようになる。これによって、植物内におけるＧＳおよびＧＰＴ酵素能力を増加させる。これは、２−オキソグルタラメート（2-oxoglutaramate）の合成、言い換えればシグナル代謝遺伝子発現、の増加を仲介するのに役立つ。その結果、植物の生育が増大し、かつ他の農学的な性質が向上する。２−オキソグルタラメートは、代謝産物であり、遺伝子発現、代謝および植物生育における極めて強力なエフェクターである（米国特許第６，５５５，５００号）。そして、この代謝産物は、炭素および窒素の代謝システムの調整において極めて重要な役割を果たし得る（Lancien et al., 2000, Enzyme Redundancy and the Importance of 2-Oxoglutarate in Higher Plants Ammonium Assimilation, Plant Physiol. 123: 817-824）。図１に示す２−オキソグルタラメート経路の概略図も参照されたい。 In the stable transformation embodiment of the present invention, one or more copies of the expressible genetic construct will be integrated into the host plant genome. This increases the GS and GPT enzyme capacity in the plant. This serves to mediate an increase in the synthesis of 2-oxoglutaramate, in other words, signal metabolic gene expression. As a result, plant growth is increased and other agricultural properties are improved. 2-Oxoglutaramate is a metabolite and a very powerful effector in gene expression, metabolism and plant growth (US Pat. No. 6,555,500). This metabolite can then play a pivotal role in regulating the carbon and nitrogen metabolic system (Lancien et al., 2000, Enzyme Redundancy and the Importance of 2-Oxoglutarate in Higher Plants Ammonium Assimilation, Plant Physiol. 123 : 817-824). See also the schematic diagram of the 2-oxoglutarate pathway shown in FIG.

本発明の一局面において、出願人らは、シロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）酵素をコードする核酸分子を同定した（後述する実施例１を参照）。そして、発現された組換え酵素が活性を有し、シグナル代謝産物、２−オキソグルタラメートの合成を促進させ得ることを最初に示した（後述する実施例２）。さらに、出願人らは、このシロイヌナズナのグルタミントランスアミナーゼ遺伝子を、形質転換された異種植物において過剰発現させた結果、ＣＯ₂固定の割合を向上させ、かつ生育特性を増加させることを最初に示した（後述する実施例３）。 In one aspect of the invention, Applicants have identified a nucleic acid molecule encoding an Arabidopsis glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) enzyme (see Example 1 below). It was first shown that the expressed recombinant enzyme has activity and can promote the synthesis of the signal metabolite, 2-oxoglutaramate (Example 2 described later). In addition, Applicants have first shown that this Arabidopsis glutamine transaminase gene is overexpressed in transformed heterologous plants, resulting in improved CO ₂ fixation and increased growth characteristics ( Example 3 described later).

出願人らは、以前の研究で、強固な構成的プロモーターの制御下にある過剰発現のアルファルファＧＳ１遺伝子が、葉内に高レベルのＧＳ活性を有するトランスジェニックタバコ植物を生じさせることを実証した。これらの植物は、野生型の植物よりも早く成長し、ＣＯ₂を速く固定し、グルタミンおよび２−オキソグルタラメート濃度の増大と同様に、全タンパク質の濃度が増大し、根を介した硝酸塩の吸収速度の増大を示す。 Applicants have demonstrated in previous studies that an overexpressed alfalfa GS1 gene under the control of a strong constitutive promoter gives rise to transgenic tobacco plants with high levels of GS activity in the leaves. These plants grow faster than wild-type plants, fix CO ₂ faster, increase the concentration of total protein, as well as increase glutamine and 2-oxoglutaramate concentrations, and nitrate through the roots. Shows an increase in the absorption rate.

また、本明細書に記載するように（後述する実施例３を参照）、トランスジェニックタバコ植物において、シロイヌナズナのＧＰＴコード配列の全長を含む導入遺伝子を過剰発現させると、ＣＯ₂固定を速め、かつ全タンパク質、グルタミンおよび２−オキソグルタラメートの量を増加させる結果となる。また、これらのトランスジェニック植物は、野生型の植物よりも速く生育する（図２）。同様に、トマト植物に関する予備試験では（後述する実施例４を参照）、シロイヌナズナのＧＰＴ導入遺伝子が形質転換されたトマト植物は、野生型のコントロール植物と比較して、生育速度、開花、および種子収量の顕著な向上を示した（図３および後述する実施例４）。 Also, as described herein (see Example 3 below), in a transgenic tobacco plant, overexpression of a transgene containing the full length of the GPT coding sequence of Arabidopsis accelerates CO ₂ fixation, and This results in increasing the amount of total protein, glutamine and 2-oxoglutaramate. In addition, these transgenic plants grow faster than wild-type plants (FIG. 2). Similarly, in a preliminary test on tomato plants (see Example 4 below), the tomato plants transformed with the Arabidopsis GPT transgene are compared to wild type control plants in terms of growth rate, flowering and seeds. The yield was significantly improved (FIG. 3 and Example 4 described later).

本明細書において実施例３、５および７（後述する）によって説明されるある特定の実施形態において、５’および３’非翻訳領域を含むアルファルファＧＳ１遺伝子を有する、第１組の親の１種類の導入遺伝子タバコ植物系統は、選択的な圧力下のもと、最も早く成長する表現型のスクリーニングおよび導入遺伝子／表現型ホモ接合体の自家受精をするとともに、アグロバクテリウムを介した遺伝子の形質転換によって作製した（後述の実施例５参照）。シロイヌナズナＧＰＴの全長コード配列を有する、第２組の親の１種類の導入遺伝子タバコ植物系統は、同様の方法で作成した（後述の実施例３）。それぞれの親系統由来の成長速度が速い植物を、子系統を得るために有***雑した（後述の実施例７）。 In certain embodiments described herein by Examples 3, 5 and 7 (discussed below), one of the first set of parents having an alfalfa GS1 gene comprising a 5 ′ and 3 ′ untranslated region The transgenic plant line of tobacco has the ability to screen for the fastest-growing phenotype and self-fertilize the transgene / phenotype homozygote under selective pressure, as well as Agrobacterium-mediated gene traits Prepared by conversion (see Example 5 below). A second set of parental transgene tobacco plant lines having the full-length coding sequence of Arabidopsis GPT was prepared in a similar manner (Example 3 described below). Plants with fast growth speed derived from each parent line were sexually crossed to obtain offspring lines (Example 7 described later).

シロイヌナズナＧＳ１およびＧＰＴトランスジェニックタバコ植物の多系交雑によって生じた子孫は、野生型植物だけでなくシングルトランスジーンの親系統に比べ、成長速度においてはるかに優れ、非常に驚くべき増大を示した。図５は、野生型およびシングルトランスジーンの親植物と比較した、シングルトランスジーンＧＳ１植物×ＧＰＴ植物の交配からの二重導入遺伝子の子孫の写真を示す。図６は、二重導入遺伝子の子孫および野生型植物の葉の大きさを比較した写真を示す。これらの二重トランスジェニック植物において、実験的に観察された成長速度は、野生型植物の２００％から３００％に及んだ（後述の実施例７）。さらに、全現存量は二重導入遺伝子植物において十分に増加されており、植物の全生体量は典型的に野生型植物の約２倍から３倍である。同様に、種子の収穫量は、二重導入遺伝子植物内で類似の増加を示した。また、二重導入遺伝子植物において、種子のさやの収穫量は、典型的に野生型植物の平均値の２倍から３倍、および全種子の収穫量は野生型植物の３００％から４００％も上回る種子の総収穫量を示した。 The offspring generated by multi-crossing of Arabidopsis GS1 and GPT transgenic tobacco plants were much superior in growth rate and showed a very surprising increase compared to the single-transgene parent lines as well as the wild-type plants. FIG. 5 shows a photograph of double transgene progeny from a cross of a single transgene GS1 plant × GPT plant compared to a wild type and single transgene parent plant. FIG. 6 shows a photograph comparing the double transgene progeny and wild type plant leaf size. In these double transgenic plants, experimentally observed growth rates ranged from 200% to 300% of wild type plants (Example 7 below). Furthermore, the total existing amount is sufficiently increased in double transgene plants, and the total biomass of the plant is typically about 2 to 3 times that of the wild type plant. Similarly, seed yields showed a similar increase within the double transgene plants. Also, in double transgene plants, the seed pod yield is typically two to three times the average of wild type plants, and the total seed yield is 300% to 400% of wild type plants. The total yield of seed exceeded.

上述したトランスジェニックタバコ植物に加えて、ＧＰＴおよびＧＳ導入遺伝子を含む様々な他の種類のトランスジェニック植物を本明細書において具体的に例示する。本明細書に例示されるように、２種のトマト（実施例４および実施例１７を参照）、トウガラシ（Ｐｅｐｐｅｒ）（実施例８）、マメ（Ｂｅａｎｓ）（実施例９および実施例１０）、ササゲ（実施例１１および実施例１２）、アルファルファ（実施例１３）、カンタロープ（実施例１４）、カボチャ（実施例１５）、シロイヌナズナ（実施例１６）、およびアマナズナ（実施例１８）において、増大された生育特性を示すトランスジェニック植物を作製した。本発明のこれらのトランスジェニック植物は種々の形質転換方法を用いて生成された。種々の形質転換方法は、アグロバクテリウム媒介されたカルス、花の浸漬、種子の播種、さやの播種、および花の直接の接種、これらの組合せ、ならびに本明細書に例示されているような１種類の導入遺伝子を持つ植物における有性の異種交配を介する方法を含む。様々なＧＰＴおよびＧＳ導入遺伝子を、本明細書において例示されるように、本発明のトランス下ニック植物の生成に首尾よく採用した。 In addition to the transgenic tobacco plants described above, various other types of transgenic plants containing GPT and GS transgenes are specifically exemplified herein. As illustrated herein, two tomatoes (see Example 4 and Example 17), pepper (Example 8), beans (Examples 9 and 10), Increased in cowpea (Examples 11 and 12), alfalfa (Example 13), cantaloupe (Example 14), pumpkin (Example 15), Arabidopsis (Example 16), and Amana (Example 18) A transgenic plant showing the growth characteristics produced was produced. These transgenic plants of the present invention were generated using various transformation methods. Various transformation methods include Agrobacterium-mediated callus, flower soaking, seed sowing, pod sowing, and direct inoculation of flowers, combinations thereof, and 1 as exemplified herein. Including methods through sexual crossing in plants with different types of transgenes. A variety of GPT and GS transgenes have been successfully employed in the generation of the trans-trans nick plants of the present invention, as exemplified herein.

本発明はまた、生育および他の農学的性質が向上されたトランスジェニック植物を生成する方法を提供する。一実施形態において、生育および他の農学的性質が向上されたトランスジェニック植物を生成する方法は、ＧＰＴ導入遺伝子をコードする核酸分子を含む発現カセットを植物細胞に導入することにより形質転換された植物細胞を生産する工程と、コードされたＧＰＴを発現するトランスジェニック植物を取得する工程とを含む。ＧＰＴ導入遺伝子は、この導入遺伝子の発現を促進することが可能な適切なプロモーターの制御下にある。他の実施形態において、生育および他の農学的性質が向上されたトランスジェニック植物を生成する方法は、ＧＰＴ導入遺伝子をコードする核酸分子を含む１個以上の核酸コンストラクトまたは発現カセットを植物細胞に導入することにより形質転換された植物細胞を生産する工程と、ＧＰＴおよびＧＳ導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物を取得する工程とを含む。ＧＰＴおよびＧＳ導入遺伝子は、この導入遺伝子の発現を促進することが可能な１個以上の適切なプロモーター（および、任意に、他の制御エレメント）の制御下にある。 The present invention also provides a method for producing transgenic plants with improved growth and other agronomic properties. In one embodiment, a method of generating a transgenic plant with improved growth and other agronomical properties is obtained by introducing a plant transformed with an expression cassette comprising a nucleic acid molecule encoding a GPT transgene. Producing a cell and obtaining a transgenic plant expressing the encoded GPT. The GPT transgene is under the control of a suitable promoter capable of promoting the expression of this transgene. In other embodiments, a method of generating a transgenic plant with improved growth and other agronomic properties introduces one or more nucleic acid constructs or expression cassettes comprising nucleic acid molecules encoding a GPT transgene into plant cells. Producing a transformed plant cell, and obtaining a transgenic plant that expresses the GPT and GS transgenes. The GPT and GS transgenes are under the control of one or more suitable promoters (and optionally other control elements) capable of promoting the expression of the transgene.

本明細書に開示される結果に基づけば、任意の数のＧＰＴおよびＧＳポリヌクレオチドが、本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために使用され得ることは明白である。ＧＳ１およびＧＰＴタンパク質は、ともに種々の植物種の間で高く保存されており、密接に関連している非植物のＧＰＴ（例えばゼブラフィッシュのＧＰＴ）もまた使用され得ることは、本明細書に記載の実験データから明らかである。ＧＰＴに関して、異なる種由来の多数のＧＰＴポリヌクレオチドが活性を有しかつＧＰＴ導入遺伝子として有用であることが示されている。同様に、様々なＧＳポリヌクレオチドが用いられ得る。様々なＧＳポリヌクレオチドとしては、限定されないが、表現できるＧＳ１コンストラクトによって形質転換された宿主細胞内でＧＳ活性を産生するポリヌクレオチドをコードする任意の植物のＧＳ１が挙げられる。 Based on the results disclosed herein, it is clear that any number of GPT and GS polynucleotides can be used to produce a transgenic plant according to the present invention. It is described herein that GS1 and GPT proteins are both highly conserved among various plant species, and closely related non-plant GPTs (eg, zebrafish GPT) can also be used. It is clear from the experimental data. With respect to GPT, a number of GPT polynucleotides from different species have been shown to be active and useful as GPT transgenes. Similarly, various GS polynucleotides can be used. Various GS polynucleotides include, but are not limited to, GS1 from any plant that encodes a polynucleotide that produces GS activity in a host cell transformed with a expressible GS1 construct.

特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、シロイヌナズナ由来のＧＰＴ（例えば配列番号２、配列番号２１および配列番号３０に示すＧＰＴ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドであり、ＧＳ導入遺伝子は、アルファルファ由来のＧＳ１（すなわち、配列番号４）またはシロイヌナズナ由来のＧＳ１（配列番号７）をコードするＧＳポリヌクレオチドである。ＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列；配列番号１と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号２に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列；ならびにアミノ末端の３０〜５６アミノ酸残基がトランケートされている、配列番号２に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。ＧＳ１導入遺伝子は、配列番号３もしくは配列番号６に示すポリヌクレオチドによってコードされ得るか、または配列番号３もしくは配列番号６と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリヌクレオチドをコードする塩基配列；ならびに配列番号４もしくは７に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともに、ＧＳ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。 In certain embodiments, the GPT transgene is a GPT polynucleotide encoding a GPT from Arabidopsis thaliana (eg, GPT shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 30), and the GS transgene is GS1 from alfalfa. (Ie, SEQ ID NO: 4) or GS polynucleotide encoding GS1 (SEQ ID NO: 7) derived from Arabidopsis thaliana. The GPT transgene is a base sequence shown in SEQ ID NO: 1, a base sequence having at least 75% and more preferably at least 80% identity with SEQ ID NO: 1, and a base sequence encoding a polypeptide having GPT activity; A base sequence encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2, or a polypeptide having at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity and GPT activity; and amino terminal 30-56 amino acid residues Encoded by a base sequence encoding the polypeptide shown in SEQ ID NO: 2, or a polypeptide having at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity and having GPT activity, wherein the group is truncated. obtain. The GS1 transgene may be encoded by the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6, or may be a base sequence having at least 75% and more preferably at least 80% identity with SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6. A nucleotide sequence encoding a polynucleotide having GPT activity; and a polypeptide shown in SEQ ID NO: 4 or 7, or at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity with this and having GS activity It can be encoded by a base sequence encoding a polypeptide.

他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、ブドウ由来のＧＰＴ（例えば配列番号９および配列番号３１に示すブドウＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドであり、ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１ポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号８に示す塩基配列；配列番号８と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号９もしくは配列番号３１に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。 In another specific embodiment, the GPT transgene is a GPT polynucleotide encoding a grape-derived GPT (eg, grape GPTs shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 31), and the GS transgene is a GS1 polynucleotide. This GPT transgene is a base sequence shown in SEQ ID NO: 8; a base sequence having at least 75% and more preferably at least 80% identity with SEQ ID NO: 8, and a base sequence encoding a polypeptide having GPT activity It may be encoded by a base sequence that encodes a polypeptide set forth in SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 31, or a polypeptide having at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity and GPT activity therewith.

さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、イネ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１１および配列番号３２に示すイネＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドであり、ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１ポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列；配列番号１０と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１１もしくは配列番号３２に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。 In yet another specific embodiment, the GPT transgene is a GPT polynucleotide encoding a rice-derived GPT (eg, rice GPTs shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 32), and the GS transgene is a GS1 polynucleotide. . This GPT transgene is a base sequence shown in SEQ ID NO: 10; a base sequence having at least 75% and more preferably at least 80% identity with SEQ ID NO: 10, and a base sequence encoding a polypeptide having GPT activity It may be encoded by a base sequence encoding a polypeptide set forth in SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 32, or a polypeptide having at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity and GPT activity therewith.

さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、ダイズ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１３、配列番号３３または配列番号３３のＮ末端にイソロイシンがさらに付加された配列に示すダイズＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドであり、ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１ポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１２に示す塩基配列；配列番号１２と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１３もしくは配列番号３３もしくは配列番号３３のＮ末端にイソロイシンがさらに付加された配列に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。 In yet another specific embodiment, the GPT transgene encodes a soybean-derived GPT (eg, soybean GPTs shown in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 33, or a sequence in which isoleucine is further added to the N-terminus of SEQ ID NO: 33). It is a GPT polynucleotide and the GS transgene is a GS1 polynucleotide. This GPT transgene is a base sequence shown in SEQ ID NO: 12; a base sequence having at least 75% and more preferably at least 80% identity with SEQ ID NO: 12, and a base sequence encoding a polypeptide having GPT activity A polypeptide shown in the sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 33 with further addition of isoleucine at the N-terminus, or at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity and GPT activity It can be encoded by a base sequence encoding a polypeptide having

さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、オオムギ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１５および配列番号３４に示すオオムギＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドであり、ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１ポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１４に示す塩基配列；配列番号１０と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１５もしくは配列番号３４に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。 In yet another specific embodiment, the GPT transgene is a GPT polynucleotide encoding a barley-derived GPT (eg, barley GPTs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 34), and the GS transgene is a GS1 polynucleotide. . This GPT transgene is a base sequence shown in SEQ ID NO: 14; a base sequence having at least 75% identity and more preferably at least 80% identity to SEQ ID NO: 10, and a base sequence encoding a polypeptide having GPT activity It may be encoded by a base sequence encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 34, or a polypeptide having at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity and GPT activity therewith.

さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、ゼブラフィッシュ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１７および配列番号３５に示すゼブラフィッシュＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドであり、ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１ポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１６に示す塩基配列；配列番号１６と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１７もしくは配列番号３５に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。 In yet another specific embodiment, the GPT transgene is a GPT polynucleotide encoding a zebrafish-derived GPT (eg, zebrafish GPTs shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 35), and the GS transgene is a GS1 polynucleotide. It is. This GPT transgene is a base sequence shown in SEQ ID NO: 16; a base sequence having at least 75% and more preferably at least 80% identity with SEQ ID NO: 16, and a base sequence encoding a polypeptide having GPT activity It may be encoded by a base sequence encoding a polypeptide set forth in SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 35, or a polypeptide having at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity and GPT activity with them.

さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、バンブー由来のＧＰＴ（例えば配列番号３６に示すバンブーＧＰＴ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドであり、ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１ポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号３６に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。 In yet another specific embodiment, the GPT transgene is a GPT polynucleotide encoding a GPT derived from bamboo (eg, the bamboo GPT shown in SEQ ID NO: 36), and the GS transgene is a GS1 polynucleotide. This GPT transgene may be encoded by a base sequence encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 36, or a polypeptide having at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity and GPT activity therewith. .

本発明の実施におけるＧＰＴ導入遺伝子としての使用に適した他のＧＰＴポリヌクレオチドは、種々の方法により取得され得る。種々の方法とは、当業者によって理解され得るように、組換え発現システム（すなわち、大腸菌（E. coli）（実施例２０〜２３を参照）、植物体における一過性の発現システム（実施例１９を参照）、または遺伝子導入植物における（実施例１〜１８を参照））において、ＧＰＴの発現を導く能力についてＧＰＴ活性を用いて試験する方法である。 Other GPT polynucleotides suitable for use as GPT transgenes in the practice of the present invention can be obtained by various methods. Various methods refer to recombinant expression systems (ie, E. coli (see Examples 20-23), transient expression systems in plants (Examples) as can be understood by those skilled in the art. 19), or in transgenic plants (see Examples 1-18)) for testing the ability to induce GPT expression using GPT activity.

（導入遺伝子コンストラクト／発現ベクター）
本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために、所望の導入遺伝子に関する遺伝子コード配列は、形質転換された植物細胞内で導入遺伝子配列の発現を導くことができる核酸コンストラクト（本明細書中において、（導入遺伝子）発現ベクター、発現カセット、発現コンストラクトまたは遺伝的コンストラクトとしても交換可能に引用される）中に組み込まれなければならない。所定の導入遺伝子を保有する核酸コンストラクトは、多数の公知の方法を用いて、植物細胞または種々の細胞内に導入され得る。公知の方法は、限定されないが、エレクトロポレーション、ＤＮＡボンバードメントまたは遺伝子銃、マイクロインジェクション、ならびに種々のＤＮＡベースのベクター（例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のベクター）の使用を介する方法を含む。形質転換植物細胞中にいったん導入されると、核酸コンストラクトは、一過的に、あるいは安定的に、組み込まれた導入遺伝子（すなわちＧＰＴ）の発現を導くであろう。安定的に発現させることが好ましく、安定的な発現は、核酸コンストラクトをクロモソームに組み込ませることができる植物の形質転換ベクターを利用することにより達成される。一度植物細胞への形質転換が成功すれば、これを栽培することによりトランスジェニック植物を再生し得る。 (Transgene construct / expression vector)
In order to generate a transgenic plant according to the present invention, the gene coding sequence for the desired transgene is a nucleic acid construct (herein referred to herein) that can direct the expression of the transgene sequence in transformed plant cells. (Transgene) must be incorporated into an expression vector, expression cassette, expression construct or genetic construct, also referred to interchangeably). Nucleic acid constructs carrying a given transgene can be introduced into plant cells or various cells using a number of known methods. Known methods include, but are not limited to, electroporation, DNA bombardment or gene gun, microinjection, and various DNA-based vectors such as Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes ) Vector)). Once introduced into the transformed plant cell, the nucleic acid construct will lead to the expression of the integrated transgene (ie, GPT) either transiently or stably. Stable expression is preferred, and stable expression is achieved by utilizing a plant transformation vector that allows the nucleic acid construct to be incorporated into the chromosome. Once the transformation into plant cells is successful, transgenic plants can be regenerated by cultivating them.

形質転換植物における挿入遺伝子の本質的な発現または発現誘導の促進に適した、多数の発現ベクターが知られている。さらに、種々の一過性の発現ベクターおよびシステムが知られている。大体において、遺伝子の形質転換における特定の方法に使用するために、適切な発現ベクターが選択される（以下を参照）。概して、トランスジェニック植物を生成するための典型的な植物発現ベクターは、プロモーターの発現制御コントロール下にある所定の導入遺伝子、形質転換体の選択を助けるための選択マーカー、および転写終結配列を含み得る。 Numerous expression vectors are known that are suitable for promoting the intrinsic expression or induction of inserted genes in transformed plants. In addition, various transient expression vectors and systems are known. In general, an appropriate expression vector is selected for use in a particular method in gene transformation (see below). In general, a typical plant expression vector for generating a transgenic plant can include a given transgene under expression control control of a promoter, a selectable marker to assist in the selection of transformants, and a transcription termination sequence. .

より具体的には、本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用するための核酸コンストラクトの基本要素は、以下である：形質転換植物細胞において（１つもしくは複数の）導入遺伝子の機能的な発現を促進することができる適切なプロモーター、このプロモーターに実施可能に連結された（１つもしくは複数の）導入遺伝子（すなわちＧＰＴコード配列）、好ましくは、この導入遺伝子に実施可能に連結された適切な転写終結配列（すなわちノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター）、および典型的にこの導入遺伝子の発現を制御するために有用な他の要素、ならびに所望のトランスジェニック産物を選択するために適した１つ以上の選択マーカー遺伝子（すなわち抗生物質耐性遺伝子）。 More specifically, the basic elements of a nucleic acid construct for use in generating a transgenic plant according to the present invention are as follows: Functional expression of the transgene (s) in transformed plant cells A suitable promoter (s) operably linked to the promoter (or GPT coding sequence), preferably a suitable promoter operably linked to the transgene One or more transcription termination sequences (ie, terminators of the nopaline synthase gene) and other elements typically useful for controlling the expression of this transgene, as well as one or more suitable for selecting the desired transgenic product Selectable marker gene (ie antibiotic resistance gene).

アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、トランスジェニック植物を生成するために使用する初期の形質転換システムであるため、アグロバクテリウム形質転換用に設計された多数のベクターが存在する。安定な形質転換のため、アグロバクテリウムのシステムは、大腸菌およびアグロバクテリウムの両方で操作可能なプラスミドである「バイナリー」ベクターを利用する。このベクターは、典型的に、形質転換された植物を回収するための１つ以上の選択マーカーを含有する（Hellens et al., 2000, Technical focus: A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci 5:446-451）。アグロバクテリウム形質転換システムに使用するバイナリーベクターは、典型的に、Ｔ−ＤＮＡのボーダー領域、マルチクローニングサイト、大腸菌およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスのための複製機能、ならびに選択マーカーおよびレポーター遺伝子を含む。 Since Agrobacterium tumefaciens is an early transformation system used to generate transgenic plants, there are numerous vectors designed for Agrobacterium transformation. For stable transformation, Agrobacterium systems utilize “binary” vectors, which are plasmids that can be manipulated in both E. coli and Agrobacterium. This vector typically contains one or more selectable markers to recover transformed plants (Hellens et al., 2000, Technical focus: A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci 5 : 446-451). Binary vectors used in Agrobacterium transformation systems typically include T-DNA border regions, multiple cloning sites, replication functions for E. coli and Agrobacterium tumefaciens, and selectable markers and reporter genes.

いわゆる「スーパー−バイナリー」ベクターは、高い形質転換効率を提供し、一般的にＴｉ由来の別の病原性遺伝子を含む（Komari et al., 2006, Methods Mol. Biol. 343: 15-41）。スーパーバイナリーベクターは、一般的に、低い形質転換効率を示す植物（例えば穀類）に用いられる。別の病原性遺伝子は、限定されないが、ｖｉｒＢ，ｖｉｒＥ，およびｖｉｒＧを含む（Vain et al., 2004, The effect of additional virulence genes on transformation efficiency, transgene integration and expression in rice plants using the pGreen/pSoup dual binary vector system. Transgenic Res. 13: 593-603; Srivatanakul et al., 2000, Additional virulence genes influence transgene expression: transgene copy number, integration pattern and expression. J. Plant Physiol. 157, 685-690; Park et al., 2000, Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobacterium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020; Jin et al., 1987, Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281. J. Bacteriol. 169: 4417-4425）。 So-called “super-binary” vectors provide high transformation efficiency and generally contain another virulence gene from Ti (Komari et al., 2006, Methods Mol. Biol. 343: 15-41). Super binary vectors are generally used for plants that exhibit low transformation efficiency (eg, cereals). Other virulence genes include, but are not limited to virB, virE, and virG (Vain et al., 2004, The effect of additional virulence genes on transformation efficiency, transgene integration and expression in rice plants using the pGreen / pSoup dual Transgenic Res. 13: 593-603; Srivatanakul et al., 2000, Additional virulence genes influence transgene expression: transgene copy number, integration pattern and expression.J. Plant Physiol. 157, 685-690; Park et al ., 2000, Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobacterium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020; Jin et al., 1987, Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281. Bacteriol. 169: 4417-4425).

本明細書において実証された実施形態（後述する実施例を参照）では、挿入される導入遺伝子をＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下に配置する発現ベクターが使用される。ＣａＭＶ３５ＳおよびＲｕＢｉｓＣｏプロモーターを利用する多数の発現ベクターが知られており、および／または市販されており、および／または通常の当業者によって導出できる。 In the embodiments demonstrated herein (see the examples below), an expression vector is used in which the inserted transgene is placed under the control of the CaMV 35S promoter and the RuBisCo promoter. Numerous expression vectors utilizing the CaMV 35S and RuBisCo promoters are known and / or commercially available and / or can be derived by one of ordinary skill in the art.

（植物プロモーター）
用語「プロモーター」は、ゲノム配列において、遺伝子の転写開始部位（transcription start site：ＴＳＳ）の上流にある領域に対し名づけられた。しかし、ＴＳＳの下流の配列もまた同様に転写開始に影響を与え得る。プロモーター要素は、転写開始点、転写の特異性および割合を選択する。ＴＳＳからの距離に基づいて、用語「近位プロモーター」（ＴＳＳの周りの数百塩基）および「遠位プロモーター」（ＴＳＳの千塩基以上上流）もまた使用される。近位プロモーターおよび遠位プロモーターは、細胞−、組織−、臓器−、発生段階および環境ファクター−特異的な転写制御における複雑なプロセスに関与する種々の要素の組を含む。ＴＳＳの選択を制御する多くのプロモーター要素は、近位プロモーター内に位置する。 (Plant promoter)
The term “promoter” was named for the region in the genomic sequence that is upstream of the transcription start site (TSS) of the gene. However, sequences downstream of TSS can also affect transcription initiation as well. The promoter element selects the transcription start point, the specificity and rate of transcription. Based on the distance from the TSS, the terms “proximal promoter” (hundreds of bases around the TSS) and “distal promoter” (more than a thousand bases upstream of the TSS) are also used. Proximal and distal promoters include a set of different elements involved in complex processes in cell-, tissue-, organ-, developmental and environmental factor-specific transcriptional control. Many promoter elements that control the selection of TSS are located within the proximal promoter.

植物内で機能する多数のプロモーターが公知である。ＧＰＴおよびＧＳ導入遺伝子コンストラクトを構築する際、選択されるプロモーターは、恒常的な非特異的プロモーターであってもよく、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓリボソーマルプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）であってもよい。このプロモーターは、植物内における導入遺伝子の発現のために広く使用されている。他の強力な恒常的プロモーターの具体例は、限定されないが、イネのアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、Ｔｉプラスミドのノパリン合成酵素プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターおよびスクロース合成酵素プロモーターを含む。 A number of promoters that function in plants are known. In constructing GPT and GS transgene constructs, the promoter selected may be a constitutive non-specific promoter, for example, the cauliflower mosaic virus 35S ribosomal promoter (CaMV 35S promoter). This promoter is widely used for transgene expression in plants. Examples of other strong constitutive promoters include, but are not limited to, rice actin 1 promoter, CaMV 19S promoter, Ti plasmid nopaline synthase promoter, alcohol dehydrogenase promoter and sucrose synthase promoter.

あるいは、ある実施形態において、導入遺伝子コンストラクトにより形質転換させたい植物細胞、導入遺伝子の所望の発現量、導入遺伝子を発現させたい組織または細胞内コンパートメント、目標とする発生段階などに基づいてプロモーターを選択することが望ましい。 Alternatively, in some embodiments, a promoter is selected based on the plant cell that is to be transformed by the transgene construct, the desired expression level of the transgene, the tissue or intracellular compartment in which the transgene is to be expressed, the target developmental stage, etc. It is desirable to do.

例えば、光合成組織およびコンパートメントにおいて発現させたいときには、リブロース２リン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）遺伝子のプロモーターが使用され得る。後述する実施例では、トマトＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にＧＰＴおよびＧＳ１導入遺伝子を含む発現可能な核酸コンストラクトが調製され、トランスジェニック植物の生成に用いられるか、または植物内もしくは大腸菌におけるＧＰＴ活性に関してアッセイするために用いられる。 For example, the ribulose diphosphate carboxylase (RuBisCo) gene promoter can be used when it is desired to be expressed in photosynthetic tissues and compartments. In the examples described below, expressible nucleic acid constructs containing GPT and GS1 transgenes under the control of the tomato RuBisCo promoter are prepared and used for the generation of transgenic plants or assayed for GPT activity in plants or in E. coli. Used for.

種子で発現させたいときには、種々の貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーターが使用され得る。果実内で発現させるためには、果実特異的なプロモーター（例えばトマトの２Ａ１１）が使用され得る。他の組織特異的プロモーターの具体例は、レクチンをコードするプロモーター（Vodkin et al., 1983, Cell 34:1023-31; Lindstrom et al., 1990, Developmental Genetics 11:160-167）、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１（Vogel et al, 1989, J. Cell. Biochem. (Suppl. 0) 13:Part D; Dennis et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12(9): 3983-4000）、トウモロコシの集光性複合体（Simpson, 1986, Science, 233: 34-38; Bansal et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3654-3658）、トウモロコシの熱ショックタンパク質（Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812; Rochester et al., 1986, EMBO J., 5: 451-458）、エンドウマメのスモールサブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ（Poulsen et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 205(2): 193-200; Cashmore et al., 1983, Gen. Eng. Plants, Plenum Press, New York, pp 29-38）、Ｔｉプラスミドのマンノピン合成酵素およびＴｉプラスミドのノパリン合成酵素（Langridge et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3219-3223）、ペチュニアのカルコンイソメラーゼ（Van Tunen et al., 1988, EMBO J. 7(5): 1257-1263）、マメのグリシンリッチタンパク質１（Keller et al., 1989, EMBO J. 8(5): 1309-1314）、トランケートされたＣａＭＶ３５ｓ（Odell et al., 1985, supra）、ポテトのパタチン（Wenzler et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 41-50）、根細胞（Conkling et al., 1990, Plant Physiol. 93: 1203-1211）、トウモロコシのゼイン（Reina et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(21): 6426; Kriz et al., 1987, Mol. Gen. Genet. 207(1): 90-98; Wandelt and Feix, 1989, Nuc. Acids Res. 17(6): 2354; Langridge and Feix, 1983, Cell 34: 1015-1022; Reina et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(21): 6426）、グロブリン−１（Belanger and Kriz, 1991, Genetics 129: 863-872）、α−チューブリン（Carpenter et al., 1992, Plant Cell 4(5): 557-571; Uribe et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37(6): 1069-1078）、ｃａｂ（Sullivan, et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 215(3): 431-440）、ＰＥＰＣａｓｅ（Hudspeth and Grula, 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589）、Ｒ遺伝子複合体（Chandler et al., 1989, The Plant Cell 1: 1175-1183）、カルコン合成酵素（Franken et al., 1991, EMBO J. 10(9): 2605-2612）およびグルタミン合成酵素プロモーター（U.S. Pat. No. 5,391,725; Edwards et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3459-3463; Brears et al., 1991, Plant J. 1(2): 235-244）を含む。 When it is desired to express in seed, promoters of various storage protein genes can be used. For expression in fruits, a fruit-specific promoter (eg tomato 2A11) can be used. Specific examples of other tissue-specific promoters include lectin-encoding promoters (Vodkin et al., 1983, Cell 34: 1023-31; Lindstrom et al., 1990, Developmental Genetics 11: 160-167), corn alcohol Dehydrogenase 1 (Vogel et al, 1989, J. Cell. Biochem. (Suppl. 0) 13: Part D; Dennis et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12 (9): 3983-4000), Light-harvesting complex (Simpson, 1986, Science, 233: 34-38; Bansal et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3654-3658), maize heat shock protein (Odell et al. al., 1985, Nature, 313: 810-812; Rochester et al., 1986, EMBO J., 5: 451-458), pea small subunit RuBP carboxylase (Poulsen et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 205 (2): 193-200; Cashmore et al., 1983, Gen. Eng. Plants, Plenum Press, New York, pp 29-38), Ti plasmid mannopine synthase and Ti plasmid Phosphorus synthase (Langridge et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3219-3223), petunia chalcone isomerase (Van Tunen et al., 1988, EMBO J. 7 (5): 1257 -1263), bean glycine rich protein 1 (Keller et al., 1989, EMBO J. 8 (5): 1309-1314), truncated CaMV 35s (Odell et al., 1985, supra), potato patatin (Wenzler et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 41-50), root cells (Conkling et al., 1990, Plant Physiol. 93: 1203-1211), corn zein (Reina et al., 1990) , Nucl. Acids Res. 18 (21): 6426; Kriz et al., 1987, Mol. Gen. Genet. 207 (1): 90-98; Wandelt and Feix, 1989, Nuc. Acids Res. 17 (6) : 2354; Langridge and Feix, 1983, Cell 34: 1015-1022; Reina et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18 (21): 6426), globulin-1 (Belanger and Kriz, 1991, Genetics 129: 863) -872), α-tubulin (Carpenter et al., 1992, Plant Cell 4 (5): 557-571; Uribe et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37 (6): 1069-1078), cab (Sullivan, et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 215 (3): 431-440), PEPCase (Hudspeth and Grula, 1989, Plant Mol Biol. 12: 579-589), R gene complex (Chandler et al., 1989, The Plant Cell 1: 1175-1183), chalcone synthase (Franken et al., 1991, EMBO J. 10 (9) : 2605-2612) and glutamine synthase promoter (US Pat. No. 5,391,725; Edwards et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3459-3463; Brears et al., 1991, Plant J. 1 (2): 235-244).

恒常的プロモーターに加えて、トランスジェニック植物が再生し、成熟し、開花するなどに従って導入遺伝子の発現を制御したい場合には、種々の誘導性プロモーター配列が使用され得る。このような誘導性プロモーターの具体例は、熱ショック遺伝子、防御応答遺伝子（すなわち、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；例えばBevan et al., 1989, EMBO J. 8(7): 899-906を参照）、創傷応答遺伝子（すなわち、細胞壁タンパク質の遺伝子）、化学的誘導性遺伝子（すなわち、硝酸還元酵素、キチナーゼ）および暗誘導性遺伝子（すなわち、アスパラギン合成酵素；例えば、米国特許第５，２５６，５５８号を参照）のプロモーターを含む。また、主要なクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ｃａｂ）をコードする遺伝子ファミリー、およびリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ（ｒｂｃＳ）のスモールサブユニットをコードする遺伝子ファミリーを含む多くの植物の核内遺伝子は、光によって活性化される（例えば、Tobin and Silverthorne, 1985, Annu. Rev. Plant Physiol. 36: 569-593; Dean et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. 40: 415-439.を参照）。 In addition to the constitutive promoter, various inducible promoter sequences can be used if it is desired to control the expression of the transgene as the transgenic plant regenerates, matures, blooms, etc. Examples of such inducible promoters are heat shock genes, defense response genes (ie phenylalanine ammonia lyase; see eg Bevan et al., 1989, EMBO J. 8 (7): 899-906), wound response Genes (ie, cell wall protein genes), chemically inducible genes (ie, nitrate reductase, chitinase) and dark inducible genes (ie, asparagine synthase; see, eg, US Pat. No. 5,256,558) Including promoters. Also, in the nucleus of many plants, including the gene family that encodes the major chlorophyll a / b binding protein (cab) and the gene family that encodes the small subunit of ribulose-1,5-2 phosphate carboxylase (rbcS) Genes are activated by light (eg Tobin and Silverthorne, 1985, Annu. Rev. Plant Physiol. 36: 569-593; Dean et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. 40: 415-439 See.)

他の誘導性プロモーターは、ＡＢＡ誘導性プロモーターおよび膨圧誘導性プロモーター、オーキシン結合タンパク質遺伝子プロモーター（Schwob et al., 1993, Plant J. 4(3): 423-432）、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Ralston et al., 1988, Genetics 119(1): 185-197）；ＭＰＩプロテイナーゼインヒビタープロモーター（Cordero et al., 1994, Plant J. 6(2): 141-150）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Kohler et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29(6): 1293-1298; Quigley et al., 1989, J. Mol. Evol. 29(5): 412-421; Martinez et al.,1989, J. Mol. Biol. 208(4): 551-565）、およびエンドウマメ由来の光誘導性プラスチドグルタミン合成酵素遺伝子（米国特許第５，３９１，７２５号；Edwards et al., 1990, supra）を含む。 Other inducible promoters include ABA inducible promoter and turgor inducible promoter, auxin binding protein gene promoter (Schwob et al., 1993, Plant J. 4 (3): 423-432), UDP glucose flavonoid glycosyltransferase gene Promoter (Ralston et al., 1988, Genetics 119 (1): 185-197); MPI proteinase inhibitor promoter (Cordero et al., 1994, Plant J. 6 (2): 141-150), glyceraldehyde-3 -Phosphate dehydrogenase gene promoter (Kohler et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29 (6): 1293-1298; Quigley et al., 1989, J. Mol. Evol. 29 (5): 412-421; Martinez et al., 1989, J. Mol. Biol. 208 (4): 551-565), and the light-induced plastid glutamine synthase gene from peas (US Pat. No. 5,391,725; Edwards et al. ., 1990, supra).

トランスジェニック植物技術において使用される植物プロモーターのレビューについては、Potenza et al., 2004, In Vitro Cell. Devel. Biol - Plant, 40(1): 1-22を参照されたい。植物の合成プロモーター工学のレビューについては、例えば、Venter, M., 2007, Trends Plant Sci., 12(3): 118-124を参照されたい。 For a review of plant promoters used in transgenic plant technology, see Potenza et al., 2004, In Vitro Cell. Devel. Biol-Plant, 40 (1): 1-22. For a review of plant synthetic promoter engineering, see, for example, Venter, M., 2007, Trends Plant Sci., 12 (3): 118-124.

（グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）導入遺伝子）
本発明は、シグナル代謝産物である２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成に直接的に機能する、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）酵素を含む植物を最初に開示する。これまで、機能が明らかになった植物のトランスアミナーゼは全く記載されていない。出願人は、いくつかの植物種および動物種由来のＧＰＴポリヌクレオチドコード配列を同定し、試験した。そして、この遺伝子を宿主植物に組み込み、生育がより速く、葉のタンパク質量が向上され、葉組織内におけるグルタミンシンテターゼ活性が増加され、そしてＣＯ₂固定速度がより速い、生育特性が顕著に向上されている異種性のトランスジェニック植物とすることに成功した。 (Glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) transgene)
The present invention first discloses a plant comprising a glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) enzyme that functions directly in the synthesis of the signal metabolite 2-hydroxy-5-oxoproline. So far, no transaminases of plants whose functions have been clarified have been described. Applicants have identified and tested GPT polynucleotide coding sequences from several plant and animal species. And this gene is incorporated into the host plant, the growth is faster, the amount of leaf protein is improved, the glutamine synthetase activity in the leaf tissue is increased, the CO ₂ fixation rate is faster, and the growth characteristics are remarkably improved. We succeeded in creating a heterogeneous transgenic plant.

本発明の実施において、ＧＰＴ遺伝子は、本発明のトランスジェニック植物に取り込まれた少なくとも２つの導入遺伝子のうちの一方として機能し、他方はグルタミンシンテターゼ遺伝子である（下記を参照）
シグナル代謝産物２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの生合成を包含する同様の代謝経路で機能するＧＰＴは、全ての植物種に含まれていることが期待される。したがって、本発明の実施において、ＧＰＴホモログまたはその機能的な変異体をコードするあらゆる植物の遺伝子は、本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために有用であり得る。さらに、種々の植物ＧＰＴタンパク質構造と、ゼブラフィッシュ（Danio rerio（Zebra fish））由来の推定上の（および生物学的に活性な）ＧＰＴホモログとの間の構造的な同一性、を考慮すれば（実施例２２を参照）、他の非植物ＧＰＴホモログは、本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用するためのＧＰＴ導入遺伝子の調製に使用され得る。 In the practice of the present invention, the GPT gene functions as one of at least two transgenes incorporated into the transgenic plant of the present invention and the other is a glutamine synthetase gene (see below).
GPTs that function in similar metabolic pathways including the biosynthesis of the signal metabolite 2-hydroxy-5-oxoproline are expected to be included in all plant species. Thus, in the practice of the present invention, any plant gene encoding a GPT homolog or a functional variant thereof may be useful for generating a transgenic plant according to the present invention. Furthermore, considering the structural identity between various plant GPT protein structures and putative (and biologically active) GPT homologues from zebrafish (Danio rerio (Zebra fish)) (See Example 22), other non-plant GPT homologues can be used in the preparation of GPT transgenes for use in generating transgenic plants according to the present invention.

配列番号３０に示すシロイヌナズナの成熟タンパク質配列と（ＢＬＡＳＴアラインメントにより）個々に比較された際、以下の成熟ＧＰＴタンパク質配列について、以下の配列同一性および相同性（ＢＬＡＳＴ「陽性」、類似アミノ酸を含む）が得られた。 When compared individually with the mature Arabidopsis protein sequence shown in SEQ ID NO: 30 (by BLAST alignment), the following mature GPT protein sequences have the following sequence identity and homology (BLAST “positive”, including similar amino acids) was gotten.

ＧＰＴタンパク質構造では多くの植物種を超えて特徴が保存されていることを強調するように、この保存は、上述した植物種内だけでなく、ゼブラフィッシュおよびクラミドモナス由来の推定上の非ヒトＧＰＴｓにまで及んで見られる。ゼブラフィッシュの場合、同一性の範囲は非常に高い（配列番号３０で示すシロイヌナズナの成熟ＧＰＴとアミノ酸配列で８３％の同一性、かつ類似アミノ酸残基を計算に加えれば９２％の相同性）。ゼブラフィッシュの成熟ＧＰＴは、大腸菌においてこれを発現させ、かつ生物学的活性（２−オキソグルタラメート合成）を証明することにより確認された。 To emphasize that the GPT protein structure preserves features across many plant species, this conservation is not only within the plant species mentioned above, but also on putative non-human GPTs from zebrafish and Chlamydomonas. Can be seen. In the case of zebrafish, the range of identity is very high (83% identity in amino acid sequence with mature Arabidopsis GPT shown in SEQ ID NO: 30, and 92% homology if similar amino acid residues are added to the calculation). Zebrafish mature GPT was confirmed by expressing it in E. coli and demonstrating biological activity (2-oxoglutaramate synthesis).

推定上のＧＰＴホモログが、本発明における生育が向上されたトランスジェニック植物を生成するために適しているかどうかを調べるために、まずそのコード配列を大腸菌あるいは他の適した宿主内で発現させ、そして合成される２−オキソグルタラメートシグナル代謝産物の量が増加するかどうかを調べる必要がある（実施例１９〜２３を参照）。このような増加が示される場合には、次にそのコード配列を、同種の植物宿主および異種の植物宿主の両方に導入させた後に生育特性を評価してもよい。この目的のために、２−オキソグルタラメートを特異的に検出することができるあらゆるアッセイを使用することができる。あらゆるアッセイは、限定されないが、後述する実施例２に記載のＮＭＲおよびＨＰＬＣアッセイを含む。また、成熟ＧＰＴ活性を直接測定するためのアッセイ（例えば、実施例７で説明するＧＰＴ活性アッセイ）を用いてもよい。 In order to determine whether a putative GPT homolog is suitable for generating transgenic plants with improved growth in the present invention, its coding sequence is first expressed in E. coli or other suitable host, and It is necessary to investigate whether the amount of 2-oxoglutaramate signal metabolite synthesized increases (see Examples 19-23). If such an increase is shown, then the growth characteristics may be assessed after the coding sequence is introduced into both homologous and heterologous plant hosts. For this purpose, any assay that can specifically detect 2-oxoglutaramate can be used. All assays include, but are not limited to, the NMR and HPLC assays described in Example 2 below. Alternatively, an assay for directly measuring mature GPT activity (for example, the GPT activity assay described in Example 7) may be used.

本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために、２−オキソグルタラメート合成活性を有するあらゆる植物ＧＰＴが、植物細胞を形質転換するために使用され得る。植物種間における構造的な相同性のレベルは高いと考えられ、種々の植物ＧＰＴタンパク質と、ゼブラフィッシュの推定上のＧＰＴホモログとの間の密接な相同性によって証明されるように、この高いレベルは、植物を超えて及ぶと考えられる。したがって、種々の植物ＧＰＴ遺伝子が、種々の異種の植物種において生育が向上されたトランスジェニック植物を生成するために使用され得る。さらに、同種植物においてＧＰＴ導入遺伝子を発現させた場合には、異種細胞においては起こりえないであろう何らかの方法で、同種細胞内の制御が、導入遺伝子の発現を減じ得る可能性もある。しかし、たいていは生育特性が所望に向上される結果になることが期待されるであろう（すなわち、イネのグルタミントランスアミナーゼを、トランスジェニックイネ植物内で過剰発現させる）。 Any plant GPT having 2-oxoglutaramate synthesis activity can be used to transform plant cells to produce transgenic plants according to the present invention. The level of structural homology between plant species is thought to be high, as evidenced by the close homology between the various plant GPT proteins and the zebrafish putative GPT homolog. Is considered to extend beyond plants. Accordingly, various plant GPT genes can be used to generate transgenic plants with enhanced growth in various heterologous plant species. Furthermore, if a GPT transgene is expressed in a homologous plant, control within the homologous cell may reduce the expression of the transgene in some way that would not occur in a heterologous cell. However, most would be expected to result in the desired improvement in growth characteristics (ie, over-expressing rice glutamine transaminase in transgenic rice plants).

（グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）導入遺伝子）
本発明の実施において、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子は、本発明に係るトランスジェニック植物に組み込まれた少なくとも２つの導入遺伝子のうちの１つとして機能する（ＧＰＴが２つのうちのもう一方である）。 (Glutamine synthetase (GS) transgene)
In the practice of the present invention, the glutamine synthetase (GS) gene functions as one of at least two transgenes integrated in the transgenic plant according to the present invention (GPT is the other of the two). .

グルタミンシンテターゼは、動物および真正細菌と同様に、植物の窒素代謝に重要な役割を果たす。ＧＳ酵素は、グルタミンを合成するために、ＡＴＰ依存反応において、グルタミン酸へのアンモニウムの付加を触媒する。分類された種に由来するＧＳ酵素は、活性部位の機能に重要であるとみられる、高度に保存されたアミノ酸残基を示し、ＧＳ酵素が類似の機能を果たすことを示す（for review, see Eisenberg et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1477:122 145, 2000）。 Glutamine synthetase, like animals and eubacteria, plays an important role in plant nitrogen metabolism. The GS enzyme catalyzes the addition of ammonium to glutamic acid in an ATP-dependent reaction to synthesize glutamine. GS enzymes from classified species show highly conserved amino acid residues that appear to be important for active site function, indicating that GS enzymes perform similar functions (for review, see Eisenberg et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1477: 122 145, 2000).

ＧＳは、細胞小器官の異なる場所（葉緑体および細胞質）に分布し、葉、根、苗芽、種子および果実などの様々な植物組織にみられる。植物ＧＳの主な２つのアイソフォーム：細胞質のアイソフォーム（ＧＳ１）および色素体（葉緑体）のアイソフォーム（ＧＳ２）がある。ＧＳ２は、原則として葉の組織にみられ、光呼吸または硝酸還元により生成されたアンモニアの同化において機能する。ＧＳ１は、主に葉および根の組織にみられ（典型的に、高等植物の多数の異なるアイソフォームに存在する）、他の全ての生理学的過程により生成されたアンモニアを同化する機能がある（Coruzzi, 1991, Plant Science 74: 145-155; McGrath and Coruzzi, 1991, Plant J. 1(3): 275-280; Lam et al., 1996, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 569-593; Stitt, 1999, Curr. Op. Plant Biol. 2: 178-186; Oliveira et al., 2001, Brazilian J. Med. Biol. Res. 34: 567-575）。複合ＧＳ遺伝子は、器官および組織に特有の方法、ならびに環境要因に依存した方法でＧＳの発現を可能にする、複合プロモーターのレパートリーに付随する。 GS is distributed in different organelles (chloroplast and cytoplasm) and is found in various plant tissues such as leaves, roots, seedlings, seeds and fruits. There are two main isoforms of plant GS: cytoplasmic isoform (GS1) and plastid (chloroplast) isoform (GS2). GS2 is found in principle in leaf tissue and functions in the assimilation of ammonia produced by photorespiration or nitrate reduction. GS1 is found primarily in leaf and root tissues (typically present in many different isoforms of higher plants) and has the function of assimilating ammonia produced by all other physiological processes ( Coruzzi, 1991, Plant Science 74: 145-155; McGrath and Coruzzi, 1991, Plant J. 1 (3): 275-280; Lam et al., 1996, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47 Stitt, 1999, Curr. Op. Plant Biol. 2: 178-186; Oliveira et al., 2001, Brazilian J. Med. Biol. Res. 34: 567-575). The complex GS gene is associated with a repertoire of complex promoters that allow the expression of GS in a way that is specific to organs and tissues, and that depends on environmental factors.

植物のグルタミンシンテターゼは、８つのサブユニットから成り、植物のネイティブ酵素は、３２０から３８０ｋＤの範囲の分子量を有し、それぞれのサブユニットは、３８から４５ｋＤの分子量を有している。いくつかの植物、特にマメ科植物のＧＳ１遺伝子は、クローニングされて配列が読まれている（Tischer et al., 1986, Mol Gen Genet. 203: 221-229; Gebhardt et al., 1986, EMBO J. 5: 1429-1435; Tingey et al., 1987, EMBO J. 6: 1-9; Tingey et al., 1988, J Biol Chem. 263: 9651-9657; Bennett et al., 1989, Plant Mol Biol. 12: 553-565; Boron and Legocki, 1993, Gene 136: 95-102; Roche et al., 1993, Plant Mol Biol. 22: 971-983; Marsolier et al., 1995, Plant Mol Biol. 27: 1-15; Temple et al., 1995, Mol Plant-Microbe Interact. 8: 218-227). All have been found to be encoded by nuclear genes (for review, see, Morey et al., 2002, Plant Physiol. 128(1): 182-193）。 Plant glutamine synthetase consists of eight subunits, the native plant enzyme has a molecular weight ranging from 320 to 380 kD, each subunit having a molecular weight of 38 to 45 kD. The GS1 gene of some plants, particularly legumes, has been cloned and sequenced (Tischer et al., 1986, Mol Gen Genet. 203: 221-229; Gebhardt et al., 1986, EMBO J 5: 1429-1435; Tingey et al., 1987, EMBO J. 6: 1-9; Tingey et al., 1988, J Biol Chem. 263: 9651-9657; Bennett et al., 1989, Plant Mol Biol 12: 553-565; Boron and Legocki, 1993, Gene 136: 95-102; Roche et al., 1993, Plant Mol Biol. 22: 971-983; Marsolier et al., 1995, Plant Mol Biol. 27: 1-15; Temple et al., 1995, Mol Plant-Microbe Interact. 8: 218-227) .All have been found to be encoded by nuclear genes (for review, see, Morey et al., 2002, Plant Physiol. 128 (1): 182-193).

葉緑体ＧＳ２は、単一の遺伝子としてコードされるとみられ、一方、様々な細胞質ＧＳ１のアイソフォームは、多重遺伝子ファミリーにコードされる（上述のTingey et al., 1987; 上述のSakamoto et al., 1989, Plant Mol. Biol. 13: 611-614; Brears et al, 1991; Li et al., 1993, Plant Mol. Biol., 23:401-407; 上述のDubois et al., 1996, Plant Mol. Biol., 31:803-817; Lam et al., 1996）。ＧＳ１多重遺伝子ファミリーは、ホモまたはヘテロ八量体を形成するように結合し得る異なるサブユニットをコードするとみられる。また、異なる構成要素は、遺伝子の構成要素が、異なる制御がなされることを示唆する独特な発現パターンを示すが、それは、窒素代謝全体において果たすグルタミンシンテターゼの様々な機能的な役割に関係し得る（上述のGebhardt et al., 1986; 上述のTingey et al., 1987, ; 上述のBennett et al., 1989; 上述のWalker and Coruzzi, 1989; Peterman and Goodman, 1991, Mol Gen Genet. 1991;330:145-154.; 上述のMarsolier et al., 1995; 上述のTemple et al., 1995; 上述のDubois et al., 1996）。 Chloroplast GS2 appears to be encoded as a single gene, while various cytoplasmic GS1 isoforms are encoded in a multigene family (Tingey et al., 1987, supra; Sakamoto et al, supra). ., 1989, Plant Mol. Biol. 13: 611-614; Brears et al, 1991; Li et al., 1993, Plant Mol. Biol., 23: 401-407; Dubois et al., 1996, Plant above. Mol. Biol., 31: 803-817; Lam et al., 1996). The GS1 multigene family appears to encode different subunits that can bind to form homo- or hetero-octamers. Different components also display a unique expression pattern that suggests that the genetic components are differentially controlled, which may be related to the various functional roles of glutamine synthetase that play in overall nitrogen metabolism. (Gebhardt et al., 1986, above; Tingey et al., 1987, above; Bennett et al., 1989, above; Walker and Coruzzi, 1989, Peterman and Goodman, 1991, Mol Gen Genet. 1991; 330, above. : 145-154 .; the above-mentioned Marsolier et al., 1995; the above-mentioned Temple et al., 1995; the above-mentioned Dubois et al., 1996).

一実施形態では、ＧＳ１遺伝子コード配列を用いてＧＳ導入遺伝子コンストラクトを生成する。特定の実施形態では、後述の実施例でさらに説明するアルファルファまたはシロイヌナズナのＧＳ１遺伝子コード配列を用いて、ＧＳ１導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物を生成するために使用し得る導入遺伝子コンストラクトを生成する。一実施例として、当該コンストラクトは、アグロバクテリウムを形質転換するために使用し得る。その後、形質転換したアグロバクテリウムは、Ｔ₀トランスジェニック植物を生成するために用いられる。実施例５では、この方法によってＴ_oのＧＳ１トランスジェニックタバコ植物の生成を実証する。同様に、実施例６および１７ではＴ_oＧＳ１トランスジェニックトマト植物の生成を実証し、実施例８ではＴ_oＧＳ１トランスジェニックトウガラシ（ｐｅｐｐｅｒ）植物の生成を実証し、実施例９および１０ではＴ_oのＧＳ１トランスジェニックマメ植物の生成を実証し、実施例１１および１２ではＴ_oのＧＳ１トランスジェニックササゲ植物生成を実証し、実施例１３ではＴ_oのＧＳ１トランスジェニックアルファルファ植物の生成を実証し、実施例１４ではＴ_oのＧＳ１トランスジェニックカンタロープ植物の生成を実証し、実施例１５ではＴ_oのＧＳ１トランスジェニックカボチャ植物の生成を実証し、実施例１６ではＴ_oのＧＳ１トランスジェニックシロイヌナズナ植物の生成を実証し、実施例１８ではＴ_oのＧＳ１トランスジェニックアマナズナ植物の生成を実証する。 In one embodiment, the GS1 gene coding sequence is used to generate a GS transgene construct. In certain embodiments, alfalfa or Arabidopsis GS1 gene coding sequences, further described in the examples below, are used to generate transgene constructs that can be used to generate transgenic plants that express the GS1 transgene. As one example, the construct can be used to transform Agrobacterium. Thereafter, Agrobacterium transformed is used to generate the T ₀ transgenic plants. Example 5 demonstrates the production of GS1 transgenic tobacco plants T _o by this method. Similarly, Examples in 6 and 17 T _o GS1 demonstrate generation of transgenic tomato plants to demonstrate the formation of Example in 8 T _o GS1 transgenic pepper (pepper) plants, Example 9 and the 10 T _o of GS1 demonstrates the generation of transgenic bean plants, demonstrate GS1 transgenic cowpea plants produced in examples 11 and 12, T _o, and demonstrate the formation of a GS1 transgenic alfalfa plants of example 13, T _o, performed to demonstrate the formation of a GS1 transgenic cantaloupe plants example 14 in T _o, the generation of GS1 transgenic Arabidopsis plants GS1 demonstrate the production of transgenic squash plants, example 16 in T _o example 15 in T _o demonstrated, GS1 transgenic of the T _o example 18 To demonstrate the formation of a false flax plant.

（転写終結）
好ましい実施形態において、転写終結を導き、ｍＲＮＡ転写産物のポリアデニル化を正常にさせるために、３’転写終結配列が導入遺伝子の下流に組み込まれる。好適な転写終結因子は、植物において機能することが知られている転写終結因子であり、限定されないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリン合成酵素（nopaline synthase：ＮＯＳ）およびオクトピン合成酵素（octopine synthase：ＯＣＳ）遺伝子、オクトピン合成酵素遺伝子由来のＴ７転写産物、ジャガイモまたはトマト由来のプロテアーゼインヒビターＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーターおよびエンドウマメのｒｂｃＳＥ９ターミネーターを含む。さらに、天然の遺伝子における転写終結因子が使用され得る。ある実施形態では、実施例として後述するが、ノパリン合成酵素の転写終結因子が使用される。 (End of transcription)
In a preferred embodiment, a 3 ′ transcription termination sequence is incorporated downstream of the transgene to direct transcription termination and normalize polyadenylation of the mRNA transcript. Suitable transcription terminators are those known to function in plants, including but not limited to Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase (NOS) and octopine synthase: OCS) gene, T7 transcript from octopine synthase gene, 3 ′ end of protease inhibitor I or II gene from potato or tomato, CaMV 35S terminator, tml terminator and pea rbcS E9 terminator. In addition, transcription termination factors in natural genes can be used. In one embodiment, a transcription terminator of nopaline synthase is used, which is described below as an example.

（選択マーカー）
選択マーカーは、形質転換体を選抜する手段を可能にするために、導入遺伝子の発現ベクターに通常含まれる。種々のタイプのマーカーが使用可能であるが、種々のネガティブセレクションマーカーが通常利用される。ネガティブセレクションマーカーは、形質転換されていない細胞を阻害し、または殺す選択剤に対する耐性を付与するマーカーを含み、例えば、抗生物質（例えばカナマイシン、ゲンタマイシン、アナマイシン（anamycin）、ハイグロマイシンおよびハイグロマイシンＢ）に対する耐性、または除草剤（例えばスルホニル尿素、グルホシネート（gulfosinate）、ホスフィノトリシンおよびグリフォセート）に対する耐性を付与する遺伝子を含む。スクリーニング可能なマーカーは、例えば、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep 5: 387-405）、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ow et al., 1986, Science 234: 856-859）およびアントシアニン色素の生産もしくは制御に関わるタンパク質をコードする種々の遺伝子（例えば米国特許第６，５７３，４３２号を参照）を含む。大腸菌のグルクロニダーゼ遺伝子（ｇｕｓ，ｇｕｓＡまたはｕｉｄＡ）は、植物の遺伝子導入において広く使用されてきた選択マーカーである。この大きな理由は、グルクロニダーゼ酵素の安定性、高い感受性および検出の容易性（例えば、蛍光定量的方法、分光光度的方法、種々の組織化学的方法）にある。さらに、最も高等な植物種には、検出可能なグルクロニダーゼが基本的に存在しない。 (Selection marker)
A selectable marker is usually included in the transgene expression vector to allow a means of selecting transformants. Various types of markers can be used, but various negative selection markers are usually utilized. Negative selection markers include markers that confer resistance to selective agents that inhibit or kill untransformed cells, such as antibiotics (eg, kanamycin, gentamicin, anamycin, hygromycin and hygromycin B). ), Or genes that confer resistance to herbicides (eg, sulfonylureas, gulfosinate, phosphinotricin and glyphosate). Screenable markers include, for example, a gene encoding β-glucuronidase (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep 5: 387-405), a gene encoding luciferase (Ow et al., 1986, Science 234: 856). -859) and various genes encoding proteins involved in the production or control of anthocyanin pigments (see, eg, US Pat. No. 6,573,432). The E. coli glucuronidase gene (gus, gusA or uidA) is a selectable marker that has been widely used in plant gene transfer. The main reason for this is the stability, high sensitivity and ease of detection of the glucuronidase enzyme (eg, fluorometric methods, spectrophotometric methods, various histochemical methods). Furthermore, there is essentially no detectable glucuronidase in the highest plant species.

（形質転換の手法およびシステム）
本発明における導入遺伝子の発現ベクターコンストラクトを、植物または植物細胞に導入するための種々の方法は、当業者によく知られており、あらゆる形質転換可能な植物または植物細胞が標的として利用され得る。 (Transformation methods and systems)
Various methods for introducing the transgene expression vector construct of the present invention into plants or plant cells are well known to those skilled in the art, and any transformable plant or plant cell can be used as a target.

アグロバクテリウムによって媒介される形質転換は、おそらく植物の遺伝子導入に利用される最も一般的な方法である。そして、アグロバクテリウムに媒介される、多数の植物における形質転換プロトコルは、広く文献に記載されている（例えば、Agrobacterium Protocols, Wan, ed., Humana Press, 2nd edition, 2006を参照）。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、腫瘤を誘導するＤＮＡ（「Ｔ−ＤＮＡ」、「トランスファーＤＮＡ」）の小断片の植物細胞への挿入を介して、非常に多数の双子葉植物種において腫瘤（クラウンゴール疾患）を引き起こすグラム陰性土壌細菌である。Ｔ−ＤＮＡは、植物ゲノム中の半ランダムな位置に組み込まれ、そして最終的にそこに安定的に組み込まれ得る。Ｔ−ＤＮＡボーダーとよばれる直接繰り返しＤＮＡ配列が、Ｔ−ＤＮＡの左端および右端を規定している。Ｔ−ＤＮＡは、「バイナリーベクター」システムを作り出すために、Ｔｉプラスミドの残りの部分から物理的に分離されることができる。 Agrobacterium-mediated transformation is perhaps the most common method utilized for plant gene transfer. And Agrobacterium-mediated transformation protocols in many plants have been extensively described in the literature (see, for example, Agrobacterium Protocols, Wan, ed., Humana Press, 2nd edition, 2006). Agrobacterium tumefaciens is found in a large number of dicotyledonous species through the insertion of a small fragment of DNA that induces the mass (“T-DNA”, “transfer DNA”) into plant cells. Gram-negative soil bacteria that cause disease). T-DNA is integrated at semi-random locations in the plant genome and can eventually be stably integrated there. Directly repetitive DNA sequences called T-DNA borders define the left and right ends of T-DNA. T-DNA can be physically separated from the rest of the Ti plasmid to create a “binary vector” system.

アグロバクテリウム形質転換は、双子葉植物、単子葉植物、およびこれらの細胞を安定的に形質転換するために使用され得る（Rogers et al., 1986, Methods Enzymol., 118: 627-641; Hernalsteen et al., 1984, EMBO J., 3: 3039-3041; Hoykass-Van Slogteren et al., 1984, Nature, 311: 763-764; Grimsley et al., 1987, Nature 325: 167-1679; Boulton et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 31-40; Gould et al., 1991, Plant Physiol. 95: 426-434）。アグロバクテリアにＤＮＡを導入する種々の方法が知られており、エレクトロポレーション、凍結融解法、および三親接合（triparental mating）を含む。外部ＤＮＡをアグロバクテリウム内に配置する最も効率的な方法は、エレクトロポレーションを介する方法である（Wise et al., 2006, Three Methods for the Introduction of Foreign DNA into Agrobacterium, Methods in Molecular Biology, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 43-53）。さらに、Ｔ−ＤＮＡの大部分は組み込まれないことを考慮すれば、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換を使用することにより、組み込まれていない導入遺伝子コンストラクト分子の転写能力を介した導入遺伝子の一過的な発現を得ることができる（Helens et al., 2005, Plant Methods 1:13）。 Agrobacterium transformation can be used to stably transform dicotyledonous, monocotyledonous plants, and their cells (Rogers et al., 1986, Methods Enzymol., 118: 627-641; Hernalsteen et al., 1984, EMBO J., 3: 3039-3041; Hoykass-Van Slogteren et al., 1984, Nature, 311: 763-764; Grimsley et al., 1987, Nature 325: 167-1679; Boulton et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 31-40; Gould et al., 1991, Plant Physiol. 95: 426-434). Various methods of introducing DNA into Agrobacterium are known, including electroporation, freeze-thaw methods, and triparental mating. The most efficient way to place external DNA in Agrobacterium is via electroporation (Wise et al., 2006, Three Methods for the Introduction of Foreign DNA into Agrobacterium, Methods in Molecular Biology, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2 / e, volume 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 43-53). Furthermore, given that most of the T-DNA is not integrated, the use of Agrobacterium-mediated transformation allows the transgene to be mediated through the transcriptional ability of the non-integrated transgene construct molecule. Transient expression can be obtained (Helens et al., 2005, Plant Methods 1:13).

多数のアグロバクテリウム形質転換ベクターおよび方法が記載されてきた（Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci. 7(5): 193-5）。そして、これらの多くのベクターは商業的に手に入れることができる（例えばインビトロジェン）。さらに、より多くの「オープンソース」のアグロバクテリウム形質転換ベクターが使用可能である（例えばｐＣａｍｂｉａベクター；Ｃａｍｂｉａ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。また、本明細書中に上述した「導入遺伝子コンストラクト」の項を参照されたい。さらに実施例に記載した特定の実施形態において、生育が向上したタバコおよびトマトのトランスジェニック植物を生成するために、Ｈｏｒｓｃｈらのリーフディスク形質転換システム（Horsch et al.,1995, Science 227:1229-1231）において、ｐＭＯＮ３１６由来のベクターが使用された。 A number of Agrobacterium transformation vectors and methods have been described (Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci. 7 (5): 193-5). Many of these vectors are then commercially available (eg, Invitrogen). In addition, more “open source” Agrobacterium transformation vectors are available (eg, pCambia vectors; Cambia, Canberra, Australia). See also the section “Transgene Constructs” described hereinabove. In particular embodiments described in the Examples, the Horsch et al. Leaf disc transformation system (Horsch et al., 1995, Science 227: 1229-) is used to produce transgenic tobacco and tomato plants with improved growth. 1231), a vector derived from pMON316 was used.

本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用され得る、他に一般に使用される形質転換法は、限定されないが、微粒子銃（microprojectile bombardmentもしくはbiolistic）形質転換法、カルシウムによるネイキッドＤＮＡのプロトプラスト形質転換、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション（Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2727-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; Shimamoto et al., 1989, Nature, 338: 274-276）を含む。 Other commonly used transformation methods that can be used to generate transgenic plants according to the present invention include, but are not limited to, microprojectile bombardment or biolistic transformation methods, protoplast transformation of naked DNA with calcium, Polyethylene glycol (PEG) or electroporation (Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2727-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; Shimamoto et al., 1989, Nature, 338: 274-276).

微粒子銃形質転換は、ＤＮＡによってコートされた数百万個の金属粒子を、微粒子銃装置（もしくは「遺伝子銃」）を用いて標的の細胞または組織に注入する。様々な種類の微粒子銃が商業的に入手可能である。いったん細胞中に入れば、ＤＮＡが粒子から溶出され、一部が安定的に細胞の１つ以上のクロモソーム中に組み込まれ得る（レビューのために、Kikkert et al., 2005, Stable Transformation of Plant Cells by Particle Bombardment/Biolistics, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJを参照）。 Microparticle gun transformation involves injecting millions of metal particles coated with DNA into target cells or tissues using a microparticle gun apparatus (or “gene gun”). Various types of particle guns are commercially available. Once in the cell, the DNA is eluted from the particle and a portion can be stably incorporated into one or more chromosomes of the cell (for review, Kikkert et al., 2005, Stable Transformation of Plant Cells by Particle Bombardment / Biolistics, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJ).

エレクトロポレーションは、短い、高強度の電場を利用して、細胞膜の脂質二重層を可逆的に透過可能にする技術である（例えば、Fisk and Dandekar, 2005, Introduction and Expression of Transgenes in Plant Protoplasts, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 79-90; Fromm et al.,1987, Electroporation of DNA and RNA into plant protoplasts, in Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press, London, UK, pp. 351-366; Joersbo and Brunstedt, 1991, Electroporation: mechanism and transient expression, stable transformation and biological effects in plant protoplasts. Physiol. Plant. 81, 256-264; Bates, 1994, Genetic transformation of plants by protoplast electroporation. Mol. Biotech. 2: 135-145; Dillen et al., 1998, Electroporation-mediated DNA transfer to plant protoplasts and intact plant tissues for transient gene expression assays, in Cell Biology, Vol. 4, ed., Celis, Academic Press, London, UK, pp. 92-99を参照）。この技術は、細菌の膜に水溶性の細孔を作り出すことにより行なう。細孔は、ＤＮＡ分子（および他の高分子）が細胞に入るのに充分な大きさのサイズである。そして、導入遺伝子発現コンストラクト（Ｔ−ＤＮＡ等）は、植物ゲノムＤＮＡ中に安定的に組み込まれることができ、形質転換細胞の生成が導かれ、その後に形質転換細胞はトランスジェニック植物に再生され得る。 Electroporation is a technique that reversibly permeates the lipid bilayer of cell membranes using a short, high-intensity electric field (eg, Fisk and Dandekar, 2005, Introduction and Expression of Transgenes in Plant Protoplasts, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 79-90; Fromm et al., 1987, Electroporation of DNA and RNA into plant protoplasts, in Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press, London, UK, pp. 351-366; Joersbo and Brunstedt, 1991, Electroporation: mechanism and transient expression, stable transformation and Physiol.Plant 81, 256-264; Bates, 1994, Genetic transformation of plants by protoplast electroporation. Mol. Biotech. 2: 135-145; Dillen et al., 1998, Electroporation-mediated DNA transfer to plant protoplasts and intact plant tissues for transient gene expression as says, in Cell Biology, Vol. 4, ed., Celis, Academic Press, London, UK, pp. 92-99). This technique is performed by creating water-soluble pores in the bacterial membrane. The pores are large enough to allow DNA molecules (and other macromolecules) to enter the cell. A transgene expression construct (such as T-DNA) can then be stably integrated into plant genomic DNA, leading to the generation of transformed cells, which can then be regenerated into transgenic plants. .

より新しい形質転換法は、いわゆる「フローラルディップ（floral dip）」法を含む。フローラルディップ法は、他の一般に使用される全ての形質転換方法のように植物組織培養が要求されず、単純性が期待される（Bent et al., 2006, Arabidopsis thaliana Floral Dip Transformation Method, Methods Mol Biol, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 87-103; Clough and Bent, 1998, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735-743）。しかしながら、シロイヌナズナを除いて、これらの方法は、広範囲の種類の植物種にわたって広く使用されていない。簡単にいえば、フローラルディップによる形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの適切な菌株を用いて、開花している植物を浸漬し、もしくは開花している植物に噴霧することにより成し遂げられる。その後、３つのＴ₀植物から回収した種子を発芽させ、トランスジェニックＴ₁個体を同定して選択した。実施例１６は、花の浸漬によりシロイヌナズナを接種し、トランスジェニックシロイヌナズナ植物を生成したことを示す。 Newer transformation methods include the so-called “floral dip” method. The floral dip method, like all other commonly used transformation methods, does not require plant tissue culture and is expected to be simple (Bent et al., 2006, Arabidopsis thaliana Floral Dip Transformation Method, Methods Mol Biol, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2 / e, volume 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 87-103; Clough and Bent, 1998, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium -mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735-743). However, except for Arabidopsis, these methods are not widely used across a wide variety of plant species. Briefly, transformation by floral dip is accomplished by dipping a flowering plant or spraying the flowering plant with a suitable strain of Agrobacterium tumefaciens. Thereafter, seeds collected from the three T ₀ plants were germinated, and transgenic T ₁ individuals were identified and selected. Example 16 shows that Arabidopsis plants were inoculated by dipping flowers to produce transgenic Arabidopsis plants.

他の形質転換法は、アグロバクテリウムベクター等を用いて、生育中の植物の種子または苗を形質転換させる方法を含む。例えば、実施例８で説明されるように、このようなベクターは、ベクター（すなわちアグロバクテリア）の懸濁液または混合物を、生育中の種子のさや（すなわち、トウガラシのさや、マメのさや、およびエンドウマメのさやなど）における空洞中に直接的に注入することによって、生育中の種子を形質転換するために使用し得る。苗は、実施例１３のアルファルファに関する記載のように形質転換され得る。発芽した種子は、実施例１８のカメリアに関する記載のように形質転換され得る。実施例１４のカンタロープメロンおよび実施例１５のカボチャに関する記載のように、ベクターが果実または生育中の果実内に注入される果実内部法もまた使用し得る。 Other transformation methods include a method of transforming seeds or seedlings of a growing plant using an Agrobacterium vector or the like. For example, as described in Example 8, such vectors can be used to produce suspensions or mixtures of vectors (ie, Agrobacterium), growing seed pods (ie, pepper pods, legume pods, and Can be used to transform growing seeds by direct injection into cavities in pea pods). Seedlings can be transformed as described for alfalfa in Example 13. Germinated seeds can be transformed as described for Camellia in Example 18. As described with respect to the cantaloupe melon of Example 14 and the pumpkin of Example 15, a fruit internal method where the vector is injected into the fruit or growing fruit may also be used.

他の形質転換法は、花器官をベクター接種のための標的とする方法、例えば実施例９および１０のマメ、実施例１１および１２のエンドウマメ、ならびに実施例１７のトマトに関して説明される花接種法などをも含む。 Other transformation methods are methods that target floral organs for vector inoculation, such as flower inoculation described with respect to legumes of Examples 9 and 10, peas of Examples 11 and 12, and tomatoes of Example 17. Including law.

上述した植物形質転換法は、導入遺伝子を多くの種類の植物細胞および組織に導入するために使用され得る。植物細胞および組織は、限定されないが、植物全体、葉緑体を含む組織および器官の移植片、葉緑体を含む組織および器官の移植片、開花組織および細胞、プロトプラスト、***組織細胞、カルス、小胞子などの未成熟の胚および配偶子細胞、花粉、***および卵細胞、上述した組織の培養細胞、再生された繁殖性のトランスジェニック植物が生成され得る他のあらゆる細胞を含む。カルスは、組織源から生じる。組織源は、限定されないが、未成熟の胚、苗の頂端***組織、小胞子などを含む。カルスとして増殖可能な細胞もまた、遺伝的形質転換を受ける細胞である。 The plant transformation methods described above can be used to introduce transgenes into many types of plant cells and tissues. Plant cells and tissues include, but are not limited to, whole plants, transplants of tissues and organs including chloroplasts, transplants of tissues and organs including chloroplasts, flowering tissues and cells, protoplasts, meristem cells, callus, This includes immature embryos and gametes, such as microspores, pollen, sperm and egg cells, cultured cells of the tissues described above, and any other cells from which regenerated, reproductive transgenic plants can be generated. Callus arises from tissue sources. Tissue sources include, but are not limited to, immature embryos, apical meristems of seedlings, microspores, and the like. Cells that can grow as callus are also cells that undergo genetic transformation.

形質転換された植物細胞、組織および器官から個々の植物を再生する方法は、多くの植物種について知られており、かつ記載されている。 Methods for regenerating individual plants from transformed plant cells, tissues and organs are known and described for many plant species.

例として、形質転換された小植物（形質転換細胞または組織由来）を、形質転換法に使用する選択剤（つまり、およびカナマイシンなどの抗生物質）が添加された植え付け可能な生育培地において培養する。この形質転換された小植物を、根を下ろした後に土壌に移し、十分に成長させる。開花した後、成熟植物に好ましくは自家受粉させる。そして、その結果生じた種子を回収し、次の世代を生育させるために使用する。実施例３〜６は、トランスジェニックタバコ植物およびトランスジェニックトマト植物の再生について記載する。 By way of example, transformed plantlets (derived from transformed cells or tissues) are cultured in an implantable growth medium supplemented with a selective agent (ie, an antibiotic such as kanamycin) used in the transformation method. This transformed plantlet is transferred to soil after rooting and allowed to grow fully. After flowering, mature plants are preferably self-pollinated. The resulting seed is then collected and used to grow the next generation. Examples 3-6 describe the regeneration of transgenic tobacco plants and transgenic tomato plants.

Ｔ₀トランスジェニック植物は、第１の形質転換体もしくは第２の形質転換体の自家受粉によって、または他の植物（形質転換植物もしくは非形質転換植物）の第１もしくは第２の形質転換体の雌雄交雑によって、次の世代（例えば、Ｔ₁、Ｔ₂など）を生成するために使用され得る。例えば、後述の実施例７において説明するように、アルファルファＧＳ１遺伝子を過剰に発現し、野生型植物よりも優れている特定の植物と、シロイヌナズナのＧＰＴ遺伝子を過剰に発現し、野生型植物よりも優れている特定の植物とを、手作業で花粉を移すという簡単な雌雄交雑によって交雑した。相反交雑は、各植物が一つ目の組の交雑において雄として提供され、各植物が２つ目の組の交雑において雌として提供されるようにした。成熟した植物の成長段階中に、当該植物を、主として成長表現型、ＣＯ₂固定速度などについて試験した（下記のサブセクションを参照）。 The T ₀ transgenic plant can be produced by self-pollination of the first or second transformant or of the first or second transformant of another plant (transformed or non-transformed plant). It can be used to generate the next generation (eg, T ₁ , T _2, etc.) by sexing. For example, as described in Example 7 below, a specific plant that overexpresses an alfalfa GS1 gene and is superior to a wild type plant, an overexpressed GPT gene of Arabidopsis thaliana, and more than a wild type plant Specific plants that were superior were crossed by a simple male-female cross by transferring pollen by hand. Reciprocal crosses were such that each plant was provided as a male in the first set of crosses and each plant was provided as a female in the second set of crosses. During the growth phase of mature plants, the plants were tested primarily for growth phenotype, CO ₂ fixation rate, etc. (see subsection below).

（生育が向上されたトランスジェニック植物の選抜）
トランスジェニック植物は、標準的な方法を用いて選抜され、スクリーニングされ、そして同定され得る。本発明の好ましいトランスジェニック植物は、向上された生育および／または他の所望の農学的性質を示す１つ以上の表現型の特徴を提示し得る。トランスジェニック植物は、通常、形質転換体を選抜するために、選択圧下で再生され、その後にトランスジェニック植物生成が行なわれる。さらに、使用される選択圧は、所望の導入遺伝子発現コンストラクトまたはカセットの存在を確認するために、Ｔ₀世代を超えて使用され得る。 (Selection of transgenic plants with improved growth)
Transgenic plants can be selected, screened and identified using standard methods. Preferred transgenic plants of the present invention may exhibit one or more phenotypic characteristics that exhibit improved growth and / or other desired agronomic properties. Transgenic plants are usually regenerated under selective pressure to select for transformants, followed by transgenic plant production. Further, the selection pressure used in order to confirm the presence of desired transgene expression construct or cassette may be used in excess of T ₀ generation.

Ｔ₀形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、形質転換に用いる導入遺伝子発現コンストラクトに含まれるマーカー遺伝子の遺伝的組成物、および／またはマーカー遺伝子によりコードされる表現型の特徴を選抜し、またはスクリーニングすることにより、同定され、かつ単離され得る。例えば、遺伝的コンストラクトによって耐性を付与することができる抗生物質または除草剤の抑圧的な量を含む生育培地において、形質転換されている可能性のある植物、組織または細胞を生育させることによって、選抜が行なわれ得る。さらに、形質転換された植物細胞、組織および植物は、導入遺伝子発現コンストラクト内に存在し得るマーカー遺伝子（β−グルクロニダーゼ等）の活性をスクリーニングすることによっても同定され得る。 A T ₀ transformed plant cell, callus, tissue or plant selects for the genetic composition of the marker gene contained in the transgene expression construct used for transformation and / or the phenotypic characteristics encoded by the marker gene Or can be identified and isolated by screening. For example, selection by growing a potentially transformed plant, tissue or cell in a growth medium containing a repressive amount of an antibiotic or herbicide that can confer resistance through a genetic construct. Can be performed. In addition, transformed plant cells, tissues and plants can also be identified by screening for the activity of marker genes (such as β-glucuronidase) that may be present in the transgene expression construct.

周知のとおり、所望の導入遺伝子発現コンストラクトを含む植物を同定するために、種々の物理的方法および生化学的方法が使用され得る。これらの方法の具体例は、例えば以下を含む：導入遺伝子、導入遺伝子発現コンストラクトまたはその要素を同定するためのサザンブロット解析または種々の核酸増幅法（いわゆるＰＣＲ）；ＲＮＡ転写産物を検出しかつ決定するためのノザンブロッティング、Ｓ１ＲＮａｓｅ保護法、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅法；導入遺伝子によってコードされかつ発現されるタンパク質を同定するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、酵素免疫測定。 As is well known, various physical and biochemical methods can be used to identify plants containing the desired transgene expression construct. Specific examples of these methods include, for example: the following: Southern blot analysis or various nucleic acid amplification methods (so-called PCR) to identify transgenes, transgene expression constructs or elements thereof; detecting and determining RNA transcripts Northern blotting, S1 RNase protection method, reverse transcriptase PCR (RT-PCR) amplification method; protein gel electrophoresis, Western blotting, immunoprecipitation, enzyme to identify proteins encoded and expressed by the transgene Immunoassay.

他の手段では、形質転換体を同定するために、標的植物における導入遺伝子の発現により改変されることが知られている遺伝子、タンパク質および／または代謝化合物の発現量が使用され得る。本発明に係る一実施形態において、シグナル代謝産物２−オキソグルタラメートの量の増加は、実施例で説明するように、所望の形質転換体をスクリーニングするために使用され得る。同様に、実施例に説明するように、増加されたレベルのＧＰＴおよび／またはＧＳ活性が分析され得る。 In other means, the expression levels of genes, proteins and / or metabolic compounds known to be modified by transgene expression in the target plant can be used to identify transformants. In one embodiment according to the invention, an increase in the amount of signal metabolite 2-oxoglutaramate can be used to screen for the desired transformants, as illustrated in the examples. Similarly, increased levels of GPT and / or GS activity can be analyzed as described in the Examples.

最後に、本発明の形質転換植物は、向上された生育および／または他の所望の農学的性質を用いてスクリーニングされ得る。実際、特にその後の自家受粉、異種交配および戻し交配による植物を同定する際には、最も速い生育速度、最も高い種子の収量などを有する形質転換ラインを同定するために、ある一定の表現型のスクリーニングが通常望ましい。この目的のために、種々のパラメータが使用できる。パラメータは、限定されないが、生育速度、全生体重、乾燥重量、種子および果実の収量（数、重量）、種子および／または種子のさやのサイズ、種子のさやの収量（例えば数、重量）、葉のサイズ、植物のサイズ、開花の向上、開花の時期、全体のタンパク質量（種子、果実、植物組織内）、特定のタンパク質量（すなわちＧＳ）、窒素量、遊離アミノ酸、および特定の代謝化合物量（すなわち２−オキソグルタラメート）を含む。一般的に、これらの表現型の測定値は、親と同一もしくは類似の植物ライン、形質転換されていない植物と同一もしくは類似の植物、または野生型植物と同一もしくは類似の植物（すなわち、標準の植物もしくは親植物）から得られた測定値と比較される。好ましくは、そして少なくとも最初に、標的トランスジェニック植物における選択された表現型の特徴の測定は、標準の植物もしくは親植物における同じ特徴の測定と並行に行なわれる。通常、特定の表現型の特徴について、トランスジェニック植物における表現型の好ましさおよび／または優位性を確立するために、複数の植物が使用される。 Finally, the transformed plants of the present invention can be screened using improved growth and / or other desired agronomic properties. In fact, especially when identifying plants by subsequent self-pollination, cross-breeding and backcrossing, to identify transformation lines with the fastest growth rate, highest seed yield, etc. Screening is usually desirable. Various parameters can be used for this purpose. Parameters include, but are not limited to, growth rate, total body weight, dry weight, seed and fruit yield (number, weight), seed and / or seed pod size, seed pod yield (eg, number, weight), Leaf size, plant size, flowering improvement, timing of flowering, overall protein content (seed, fruit, in plant tissue), specific protein content (ie GS), nitrogen content, free amino acids, and specific metabolic compounds Amount (ie 2-oxoglutarate). In general, these phenotypic measurements are taken from the same or similar plant line as the parent, the same or similar plant as the non-transformed plant, or the same or similar plant as the wild type plant (ie, standard Compared to measurements obtained from plants or parent plants). Preferably, and at least initially, the measurement of the selected phenotypic characteristic in the target transgenic plant is performed in parallel with the measurement of the same characteristic in the standard or parent plant. Typically, multiple plants are used to establish phenotypic preferences and / or dominance in transgenic plants for specific phenotypic characteristics.

好ましくは、最初の形質転換体は、導入遺伝子の遺伝子型が先祖の形質を維持する（すなわち、植物が、導入遺伝子について同型となる）まで、選択された後にＴ₁およびこれに続く世代を自家受粉により生成するために使用される。実際には、これは、３または４世代について自家受粉させ、各世代において所望の形質についてスクリーニングし、そしてそれら個々を自家受粉させることにより成し遂げられる。本明細書において説明するように、少なくとも１つの雌雄世代を介して繁殖させたトランスジェニック植物の系統（タバコ、シロイヌナズナ、トマト）は、有性生殖の利点、および付随する導入遺伝子のコピー数の増加を有さない系統と比較して、より高度な導入遺伝子産生活性を示す。 Preferably, the first transformant will autologize T ₁ and subsequent generations after selection until the transgene genotype maintains the ancestral trait (ie, the plant is homozygous for the transgene). Used to produce by pollination. In practice, this is accomplished by self-pollination for 3 or 4 generations, screening for the desired trait in each generation, and self-pollinating them individually. As described herein, transgenic plant lines (tobacco, Arabidopsis, tomato) propagated through at least one male and female generation have the advantage of sexual reproduction and the accompanying increase in copy number of the transgene. Compared with a line not having, higher transgene production activity is exhibited.

安定なトランスジェニックラインは、いくつもの所望の形質を有する変種を作り出すために交雑され、かつ戻し交配されてもよい。変種は、積み重ねられた導入遺伝子を有する変種、導入遺伝子のマルチコピーを有する変種などを含む。さらに、安定なトランスジェニック植物は、これらの植物に導入遺伝子もしくは親の導入遺伝子のさらなるコピーをさらに形質転換することによって、遺伝的にさらに改変されてもよい。また、所定の導入遺伝子もしくは複数の導入遺伝子のマルチコピーを導入する形質転換を１回行なうことによって、トランスジェニック植物を作り出すことが検討される。種々の一般的な育種方法は、当業者によく知られている（例えばBreeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)を参照）。 Stable transgenic lines may be crossed and backcrossed to produce variants with any number of desired traits. Variants include variants with stacked transgenes, variants with multiple copies of the transgene, and the like. In addition, stable transgenic plants may be further genetically modified by further transforming these plants with additional copies of the transgene or parental transgene. It is also contemplated to create a transgenic plant by performing a single transformation that introduces a given transgene or multiple copies of a plurality of transgenes. Various general breeding methods are well known to those skilled in the art (see, for example, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)).

別の態様において、本発明は、増加された窒素利用効率を特徴とするトランスジェニック植物を提供する。窒素利用効率は、規定量の窒素あたりの植物の収量として発現され得る。本明細書に提供される実施例では、導入遺伝子およびコントロール植物のすべてには同じ栄養溶液を同量で与えた。トランスジェニック植物は、一貫してより高い収量を特徴
としており、そのためより高い窒素効率を有する。 In another aspect, the present invention provides a transgenic plant characterized by increased nitrogen utilization efficiency. Nitrogen utilization efficiency can be expressed as the yield of plants per defined amount of nitrogen. In the examples provided herein, the transgene and control plants were all given the same nutrient solution in the same amount. Transgenic plants are consistently characterized by higher yields and therefore have higher nitrogen efficiency.

さらに別の態様では、本発明は、高い塩分の生育環境に対して向上された耐性を有するトランスジェニック植物およびそれらの種子を提供する。この本発明の態様は、非常に高い塩分環境（２００ｍＭＮａＣｌ）におけるトランスジェニックタバコ植物の種子の発芽を記載した、実施例２４で説明する。対応する野生型のタバコ植物の種子がわずか約１０％（平均で）の割合で発芽する一方、トランスジェニックタバコの種子は、トランスジェニックおよび野生型の種子の両方に関して非塩分環境下で得られる発芽率（すなわち、約９２％）とほとんど同じ発芽率を達成した。 In yet another aspect, the present invention provides transgenic plants and their seeds that have improved tolerance to a high salinity growing environment. This aspect of the invention is illustrated in Example 24, which describes the germination of transgenic tobacco plant seeds in a very high salt environment (200 mM NaCl). Corresponding wild-type tobacco plant seeds germinate at a rate of only about 10% (on average), while transgenic tobacco seeds germinate in a non-saline environment for both transgenic and wild-type seeds Nearly the same germination rate as the rate (ie about 92%) was achieved.

〔実施例〕
本発明の様々な態様を、いくつかの実施例によりさらに記載および説明するが、いずれも本発明の範囲を限定するものではない。〔Example〕
Various aspects of the invention are further described and illustrated by means of several examples, which are not intended to limit the scope of the invention.

＜実施例１：シロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）遺伝子の単離＞
シグナル代謝産物である２−オキソグルタラメートの合成に直接的に関与する植物酵素を見出す試みとして、出願人らは、推定される植物酵素が、２−オキソグルタラメートの合成に関与していると特徴づけられているヒトのタンパク質と、ある程度の構造上の関連性を有しているであろうとの仮説を立てた。ヒトのパンパク質であるグルタミントランスアミナーゼＫ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．６４）（文献では、システイン共役β―リアーゼ、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ、等ともいわれている）は、ハロゲン化した生体異物のシステイン共役の処理に関与していることがわかっている（Perry et al., 1995, FEBS Letters 360:277-280）。ヒトのシステイン共役β―リアーゼは、窒素代謝に関与する活性を有するよりも、むしろヒトおよび動物において解毒活性を有する。とはいえ、２−オキソグルタラメートの合成におけるこのタンパク質の潜在的な関与は重要であった。 <Example 1: Isolation of Arabidopsis glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) gene>
In an attempt to find a plant enzyme that is directly involved in the synthesis of the signal metabolite 2-oxoglutaramate, Applicants have found that the putative plant enzyme is involved in the synthesis of 2-oxoglutaramate. It was hypothesized that it might have some degree of structural association with the human protein that is characterized as Glutamine transaminase K (EC 2.6.1.64) which is a human protein (also referred to in the literature as cysteine-conjugated β-lyase, kynurenine aminotransferase, glutamine phenylpyruvate transaminase, etc.) It has been shown to be involved in the processing of cysteine conjugation of halogenated xenobiotics (Perry et al., 1995, FEBS Letters 360: 277-280). Human cysteine-conjugated β-lyase has detoxifying activity in humans and animals rather than having activity involved in nitrogen metabolism. Nevertheless, the potential involvement of this protein in the synthesis of 2-oxoglutaramate was important.

ヒトのシステイン共役β―リアーゼのタンパク質配列を用いて、ＴＩＧＲシロイヌナズナ植物のタンパク質配列のデータベースを検索して、関連する可能性がある１つの配列、すなわち、シロイヌナズナの遺伝子のＡｔ１ｑ７７６７０に位置する部分的な配列によりコードされるポリペプチドを同定した。このポリペプチドは、アライメントした領域で約３６％の配列相同性を共有する。 Using the protein sequence of human cysteine-coupled β-lyase, a database of protein sequences of TIGR Arabidopsis plants is searched to find one possible related sequence, a partial located at At1q77670 of the Arabidopsis gene. The polypeptide encoded by the sequence was identified. This polypeptide shares approximately 36% sequence homology in the aligned region.

全長の遺伝子コーディング領域は、下記のプライマーによりシロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーから増幅した。 The full-length gene coding region was amplified from an Arabidopsis thaliana cDNA library using the following primers.

5'- CCCATCGATGTACC TGGACATAAATGGTGTGATG-3'
5'- GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3'
これらのプライマーは、後述のトランスジェニック植物を作成するための発現ベクターでのサブクローニングを促進するため、ＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）およびＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）の制限酵素部位を含むように設計した。ＴａＫａＲａＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて、次の条件により高性能のＰＣＲを行なった：まず９４Ｃで４分間変性し、９４Ｃで３０秒間の変性、５５Ｃで３０秒間のアニーリング、および７２Ｃで９０秒の伸長反応を３０サイクル行ない、最後に７２Ｃで７分間伸長反応させる。増幅産物はＣｌａＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動法で単離して、カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus：ＣａＭＶ、同様にＣＭＶ）３５Ｓの構成的プロモーターおよびノパリンシンターゼ（nopaline synthase：ＮＯＳ）３'ターミネーターを含むベクターｐＭｏｎ３１６（Rogers, et. al. 1987 Methods in Enzymology 153:253-277）にライゲーションした。ライゲーションをＤＨ５α細胞に形質転換し、挿入されたことを確認するために形質転換体の配列を決定した。 5'- CCCATCGATGTACC TGGACATAAATGGTGTGATG-3 '
5'- GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3 '
These primers were designed to include ClaI (ATCGAT) and KpnI (GGTACC) restriction enzyme sites in order to facilitate subcloning with expression vectors to create the transgenic plants described below. High performance PCR was performed using TaKaRa ExTaq DNA polymerase enzyme under the following conditions: first denaturing at 94C for 4 minutes, denaturing at 94C for 30 seconds, annealing at 55C for 30 seconds, and extension at 72C for 90 seconds. The reaction is performed for 30 cycles, and finally an extension reaction is performed at 72C for 7 minutes. The amplified product was cleaved with ClaI and KpnI restriction enzymes, isolated by agarose gel electrophoresis, and constitutive promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV, also CMV) 35S and nopaline synthase (NOS). ) Ligated into the vector pMon316 (Rogers, et. Al. 1987 Methods in Enzymology 153: 253-277) containing the 3 ′ terminator. The ligation was transformed into DH5α cells and the transformant sequence was determined to confirm insertion.

１．３ｋｂのｃＤＮＡを単離して配列を決定したところ、推定される葉緑体のシグナル配列を含む、長さ４４０アミノ酸の全長タンパク質をコードすることを見出した。 A 1.3 kb cDNA was isolated and sequenced and found to encode a full length protein of 440 amino acids in length, including the putative chloroplast signal sequence.

＜実施例２：生物学的に活性な組み換えシロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）の産生＞
上述の実施例１に記載したように、単離したｃＤＮＡによりコードされたタンパク質が、２−オキソグルタラメートの合成を触媒することが可能か否かを調べるため、当該ｃＤＮＡを大腸菌で発現させて、２−オキソグルタラメートの合成能を標準的な方法で検定した。 <Example 2: Production of biologically active recombinant Arabidopsis glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT)>
As described in Example 1 above, to determine whether the protein encoded by the isolated cDNA can catalyze the synthesis of 2-oxoglutaramate, the cDNA is expressed in E. coli. Thus, the ability to synthesize 2-oxoglutaramate was assayed by standard methods.

（２−オキソグルタラメートのＮＭＲアッセイ）
簡潔にいえば、精製したタンパク質の産物を、１５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、２００ｍＭグルタミン、１００ｍＭグリオキシル酸および２００マイクロＭピリドキサル５'−リン酸を含む反応液に加えた。試験するタンパク質を加えていない反応液をコントロールとして用いた。試験反応液およびコントロール反応液を３７℃で２０時間インキュベートし、遠心分離によって浄化して沈殿物を取り除いた。化学的に合成した標準の２−オキソグルタラメートを参照として、¹³ＣＮＭＲを用いて、２−オキソグルタラメートの存在と量を分析するために上清を試験した。反応産物は２−オキソグルタラメートおよびグリシンであり、一方、基質（グルタミンおよびグリオキシル酸）は存在比が減少した。サイクリック２−オキソグルタラメートは、オープンチェーンのグルタミン前駆体から容易に区別できる、まったく異なるシグナルを生じさせた。 (NMR assay of 2-oxoglutaramate)
Briefly, the purified protein product is added to a reaction solution containing 150 mM Tris-HCl (pH 8.5), 1 mM β-mercaptoethanol, 200 mM glutamine, 100 mM glyoxylic acid and 200 microM pyridoxal 5′-phosphate. It was. A reaction solution to which the protein to be tested was not added was used as a control. The test reaction solution and the control reaction solution were incubated at 37 ° C. for 20 hours and purified by centrifugation to remove precipitates. The supernatant was tested to analyze the presence and amount of 2-oxoglutaramate using ¹³ C NMR, with reference to chemically synthesized standard 2-oxoglutaramate. The reaction products were 2-oxoglutaramate and glycine, while the substrate (glutamine and glyoxylic acid) decreased in abundance. Cyclic 2-oxoglutaramate produced an entirely different signal that was easily distinguishable from the open chain glutamine precursor.

（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
ＧＰＴ活性に関する代替的なアッセイは、Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809の変性に続いて、ＨＰＬＣを用いて２−オキソグルタラメート産物を測定した。簡潔にいえば、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、２０μＭＦＡＤ、１０ｍＭシステインおよび〜１．５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールを含む、変性抽出バッファーを用いた。検査物質からの組織サンプル（すなわち、植物組織）を約１／３の比率（ｗ／ｖ）で抽出バッファーに加え、３７℃で３０分間インキュベートし、２００μＭの２０％ＴＣＡによって停止させた。約５分後、アッセイ溶液を遠心分離し、その上清を用いてＨＰＬＣ（０．０１Ｎｈ２ＳＯ４の移動相、約０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速、４０℃、でのＩＯＮ−３００７．８ｍｍＩＤＸ３０ｃｍＬｃｏｌｕｍｎを用いる）によって２−オキソグルタラメートを定量した。注入量は約２０μｌであり、保持時間はおよそ３８分から３９分である。検出は２１０ｎｍのＵＶ光で行なう。 (HPLC assay of 2-oxoglutaramate)
An alternative assay for GPT activity measured 2-oxoglutaramate product using HPLC following denaturation of Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161 (2): 807-809. Briefly, a denaturing extraction buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 20 μM FAD, 10 mM cysteine and ˜1.5% (v / v) mercaptoethanol was used. Tissue samples from the test substances (ie plant tissues) were added to the extraction buffer at a ratio of about 1/3 (w / v), incubated for 30 minutes at 37 ° C. and stopped with 200 μM 20% TCA. After approximately 5 minutes, the assay solution is centrifuged and the supernatant is used to HPLC (ION-300 7.8 mm ID X at 0.01 N h2SO4 mobile phase, flow rate of approximately 0.2 ml / min, 40 ° C). 2-oxoglutaramate was quantified by using 30 cm L column). The injection volume is about 20 μl and the retention time is approximately 38 to 39 minutes. Detection is performed with 210 nm UV light.

（ＮＭＲアッセイの結果）
本実験は、試験タンパク質が２−オキソグルタラメートの合成を触媒することができるということを証明した。ゆえに、これらのデータは、単離したｃＤＮＡが、植物において２−オキソグルタラメートの合成に直接的に関与するグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼをコードするということを示す。よって、試験タンパク質はシロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ、すなわちＧＰＴといえる。 (Result of NMR assay)
This experiment demonstrated that the test protein can catalyze the synthesis of 2-oxoglutaramate. Thus, these data indicate that the isolated cDNA encodes a glutamine phenylpyruvate transaminase that is directly involved in the synthesis of 2-oxoglutaramate in plants. Therefore, the test protein can be said to be Arabidopsis glutamine phenylpyruvate transaminase, that is, GPT.

シロイヌナズナＧＰＴのコード配列のヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ＧＰＴパンパク質の翻訳されたアミノ酸配列を、配列番号２に示す。 The nucleotide sequence of the coding sequence of Arabidopsis GPT is shown in SEQ ID NO: 1. The translated amino acid sequence of GPT protein is shown in SEQ ID NO: 2.

＜実施例３：シロイヌナズナのＧＰＴを過剰発現するトランスジェニックタバコ植物の作成＞
（植物の発現ベクターｐＭＯＮ−ＰＪＵの生成）
簡潔に、植物の発現ベクターｐＭｏｎ３１６−ＰＪＵを以下のように作製した。単離したシロイヌナズナのＧＰＴをコードするｃＤＮＡ（実験例１）をｐＭｏｎ３１６ベクターのＣｌａＩ−ＫｐｎＩポリリンカー部位に入れて、クローニングした。これにより、ＧＰＴ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターおよびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）転写ターミネーターの制御下におかれる。選択マーカーを提供するためにカナマイシン耐性遺伝子を加えた。 <Example 3: Production of transgenic tobacco plants overexpressing Arabidopsis GPT>
(Generation of plant expression vector pMON-PJU)
Briefly, a plant expression vector pMon316-PJU was prepared as follows. The isolated cDNA encoding GPT of Arabidopsis thaliana (Experimental Example 1) was inserted into the ClaI-KpnI polylinker site of the pMon316 vector and cloned. This places the GPT gene under the control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase (NOS) transcription terminator. A kanamycin resistance gene was added to provide a selectable marker.

（アグロバクテリウムを介した植物の形質転換）
ｐＭＯＮ−ＰＪＵおよびコントロールベクターｐＭｏｎ３１６（挿入したＤＮＡなし）は標準的なエレクトロポレーション法（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス株のｐＴｉＴＴ３７ＡＳＥに形質転換し、続いて抗生物質スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢプレートに塗り広げた。アグロバクテリウムの抗生物質耐性コロニーをＰＣＲによって試験し、プラスミドを含むことを確認した。 (Plant transformation via Agrobacterium)
pMON-PJU and control vector pMon316 (without inserted DNA) were transformed into pTiTT37ASE of the Agrobacterium tumefaciens strain using standard electroporation methods (McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9: 155-159). Conversion was followed by spreading on LB plates containing the antibiotics spectinomycin (100 μg / ml) and kanamycin (50 μg / ml). Antibiotic resistant colonies of Agrobacterium were tested by PCR and confirmed to contain the plasmid.

ニコチアナ・タバカムｃｖクサンチ（Nicotiana tabacum cv Xanthi）植物を、Horschらのリーフディスク形質転換法（Horsch et al.,1995, Science 227:1229-1231）を用いて、アグロバクテリウムを形質転換したｐＭＯＮ−ＰＪＵにより形質転換させた。つまり、無菌のリーフディスクに接種し、２日間培養して、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび５００μｇ／ｍｌのクラファラン（clafaran）を含んでいる選択ＭＳ培地に移植した。選択培地中で根を形成する能力により形質転換体を確認した。 Nicotiana tabacum cv Xanthi plants were transformed into Agrobacterium using Horsch et al., 1995, Science 227: 1229-1231 using the leaf disc transformation method of Horsch et al. Transformation was performed with PJU. Briefly, a sterile leaf disc was inoculated, cultured for 2 days, and transferred to selective MS medium containing 100 μg / ml kanamycin and 500 μg / ml clafaran. Transformants were confirmed by their ability to form roots in selective media.

（ＧＰＴトランスジェニックタバコ植物の生成）
無菌の葉の切片を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ（Ｍ＆Ｓ）培地上でカルスに発達させ、そこから形質転換小植物体が出現した。そして、これらの小植物体を発根可能な選択培地（選択試薬としてカナマイシンを含むＭ＆Ｓ培地）に移植した。その後、正常で、発根した、形質転換したタバコの小植物体を土壌に移植し、成熟期まで生育させて、花が咲いた植物を自家受精させて、得られた種子を収穫した。成長期の間、植物の成長表現型を調べ、多くの若いトランスジェニック植物でＣＯ₂固定速度を測定した。 (Generation of GPT transgenic tobacco plants)
Sterile leaf sections were developed into callus on Murashige & Skog (M & S) medium from which transformed plantlets emerged. Then, these plantlets were transplanted to a selective medium capable of rooting (M & S medium containing kanamycin as a selective reagent). Thereafter, normal, rooted, transformed tobacco plantlets were transplanted to soil, grown to maturity, and flowered plants were self-fertilized and the resulting seeds were harvested. During growth, the growth phenotype of the plants was examined and the CO ₂ fixation rate was measured in many young transgenic plants.

（Ｔ₁およびＴ₂世代のＧＰＴトランスジェニック植物の生成）
トランスジェニックタバコ植物のＴ₀世代から収穫した種子を、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＭ＆Ｓ培地で発芽させて、導入遺伝子の質を高めた。種子のうち少なくとも１／４がこの培地で発芽せず（カナマイシンは、通常の遺伝子分離の結果もたらされ得る、耐性のない種子の発芽を阻害すると期待される）、残りの種子のうち半分以上がカナマイシンに対して感受性（ごく弱い）を示したため取り去られた。 (Generation of T ₁ and T ₂ generation GPT transgenic plants)
The seeds harvested from the T ₀ generation of transgenic tobacco plants, germinated in the M & S medium containing kanamycin (100mg / L), enhanced the quality of the transgene. At least 1/4 of the seeds do not germinate in this medium (kanamycin is expected to inhibit germination of non-tolerant seeds that can result from normal gene segregation) and more than half of the remaining seeds Was removed because it was sensitive (very weak) to kanamycin.

生き残った植物（Ｔ₁世代）を成長させ、これらの植物をＴ₂世代の種子を生産するために自家受精させた。Ｔ₁世代からの種子は、形質転換体の系統のためにカナマイシン（１０ｍｇ／Ｌ）が追加されたＭＳ培地で発芽させた。１４日後、種子を砂地に移し、２５ｍＭの硝酸カリウムが追加された４分の１の濃度のホーグランド栄養液を与えた。これを９００マイクロモル／ｍ²／秒の光の強さで１６時間の明期および８時間の暗期という光周期にして、２４℃で成長させた。それらを砂地培養に移植した１４日後に収穫した。 Grown surviving plants (T ₁ generation), these plants were self fertilized to produce T ₂ generation seeds. Seeds from T ₁ generation are the kanamycin (10 mg / L) were germinated added MS medium for strains of transformants. After 14 days, the seeds were transferred to sand and given a quarter concentration of Hogland nutrient solution supplemented with 25 mM potassium nitrate. This was grown at 24 ° C. with a light period of 16 hours light period and 8 hours dark period with a light intensity of 900 μmol / m ² / sec. They were harvested 14 days after transplanting into a sand culture.

（ＧＰＴトランスジェニック植物のキャラクタリゼーション）
収穫されたトランスジェニック植物（ＧＰＴ形質転換体およびベクターコントロール形質転換体の両方）を根および葉のグルタミンシンテターゼ活性、乾燥させていない植物の総量、根および葉の総タンパク質ならびにＣＯ₂固定速度（Knight et al., 1988, Plant Physiol. 88: 333）を分析した。形質転換していない野生型Ａ．ツメファシエンス植物もベースラインコントロールを設けるため、同じパラメータで分析した。生育特性の結果は、下記の表Ｉに示す。さらに、野生型のコントロール植物と比較したＧＰＴトランスジェニック植物の写真を図２に示す（ＧＳ１トランスジェニックタバコ植物と一緒に示す、実施例５を参照）。評価した全パラメータにわたって、ＧＰＴトランスジェニックタバコ植物は促進された生育特性を示す。特に、ＧＰＴトランスジェニック植物は、野生型のコントロール植物と比較して、ＣＯ₂固定速度において５０％増を示し、葉の組織におけるグルタミンシンテターゼ活性は２倍を示した。さらに、葉と根とのＧＳ比は、トランスアミナーゼのトランスジェニック植物では野生型のコントロールと比較してほぼ３倍に増加した。生体重および全タンパク質量も、トランスジェニック植物では野生型のコントロールと比較して、それぞれ約５０％および８０％（葉）増加した。これらのデータは、シロイヌナズナＧＰＴ導入遺伝子が過剰発現したタバコ植物が、有意に促進された成長とＣＯ₂固定速度を獲得することを実証する。 (Characterization of GPT transgenic plants)
Harvested transgenic plants (both GPT transformants and vector control transformants) are treated with root and leaf glutamine synthetase activity, total amount of undried plants, root and leaf total protein and CO ₂ fixation rate (Knight et al., 1988, Plant Physiol. 88: 333). Untransformed wild type A. Tumefaciens plants were also analyzed with the same parameters to provide a baseline control. The growth characteristics results are shown in Table I below. In addition, a photograph of a GPT transgenic plant compared to a wild type control plant is shown in FIG. 2 (shown with GS1 transgenic tobacco plant, see Example 5). Over all the parameters evaluated, GPT transgenic tobacco plants show accelerated growth characteristics. In particular, GPT transgenic plants showed a 50% increase in CO ₂ fixation rate and glutamine synthetase activity in leaf tissue was doubled compared to wild type control plants. Furthermore, the GS ratio between leaves and roots increased almost 3-fold in transgenic plants of transaminase compared to wild-type controls. Raw body weight and total protein were also increased by about 50% and 80% (leaves) in transgenic plants compared to wild type controls, respectively. These data demonstrate that tobacco plants that overexpress the Arabidopsis GPT transgene acquire significantly enhanced growth and CO ₂ fixation rates.

データ＝３個体の平均値である。 Data = average value of 3 individuals.

野生型−コントロール植物；再生または形質転換されていない。 Wild-type control plant; not regenerated or transformed.

ＰＮ１系統は導入遺伝子を有していないコンストラクトで形質転換した後、再生により生成した。 The PN1 line was generated by regeneration after transformation with a construct having no transgene.

再生および形質転換の処理に対するコントロール。ＰＮ９系統はシロイヌナズナＧＰＴ遺伝子を有するコンストラクトで形質転換した後、再生により生成した。 Control over regeneration and transformation processes. The PN9 line was generated by regeneration after transformation with a construct having the Arabidopsis GPT gene.

＜実施例４：シロイヌナズナＧＰＴ遺伝子を持つトランスジェニックトマト植物の生成＞
シロイヌナズナＧＰＴ遺伝子を持つトランスジェニックトマト（Lycopersicon esculentum）（マイクロトムトマト）植物を、実施例３で記載したベクターおよび方法を用いて作成した。Ｔ₀トランスジェニックトマト植物を作成し、成熟期まで生育させた。トランスジェニックトマト植物の初期生育特性のデータを表ＩＩに示す。トランスジェニック植物は野生型のコントロール植物と比較して、成長速度、開花および種子の収穫量の有意な促進を示した。さらに、トランスジェニック植物は複数の主茎を発達させた、一方、野生型の植物は単数の主茎を発達させた。野生型の植物と比較したＧＰＴトランスジェニックトマト植物の写真を図３に示す（ＧＳ１トランスジェニックトマト植物とともに、実施例６を参照）。 <Example 4: Production of transgenic tomato plant having Arabidopsis GPT gene>
A transgenic tomato (Lycopersicon esculentum) (microtom tomato) plant carrying the Arabidopsis GPT gene was generated using the vectors and methods described in Example 3. T ₀ transgenic tomato plants were created and grown to maturity. Data on the initial growth characteristics of the transgenic tomato plants are shown in Table II. Transgenic plants showed significant enhancement of growth rate, flowering and seed yield compared to wild type control plants. In addition, transgenic plants developed multiple main stems, while wild type plants developed a single main stem. A photograph of a GPT transgenic tomato plant compared to a wild type plant is shown in FIG. 3 (see Example 6 along with the GS1 transgenic tomato plant).

＜実施例５：アルファルファＧＳ１を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物の生成＞
（植物発現ベクターｐＧＳ１１１の生成）
アルファルファＧＳ１遺伝子を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物は、以前に記載されたように生成した（Temple et al., 1993, Mol. Gen. Genetics 236: 315-325）。簡単にいえば、アルファルファＧＳ１遺伝子における５'非翻訳領域及び３'非翻訳領域の両方の広範囲な領域を含むアルファルファＧＳ１遺伝子の完全なコード配列（配列番号３）（DasSarma at al., 1986, Science, Vol 232, Issue 4755, 1242-1244）を、ｐＭＯＮ３１６（Rogers et al., 1987, supra）の中に挿入することにより、植物発現ベクターｐＧＳ１１１を構築した。これにより、恒常的なカリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターと、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）の転写終結因子との制御下に、導入遺伝子を置いた。選択マーカーを付与するため、カナマイシン耐性遺伝子が含有された。 <Example 5: Production of transgenic tobacco plant overexpressing alfalfa GS1>
(Generation of plant expression vector pGS111)
Transgenic tobacco plants overexpressing the alfalfa GS1 gene were generated as previously described (Temple et al., 1993, Mol. Gen. Genetics 236: 315-325). Briefly, the complete coding sequence of the alfalfa GS1 gene (SEQ ID NO: 3), which includes a wide range of both the 5 ′ and 3 ′ untranslated regions in the alfalfa GS1 gene (DasSarma at al., 1986, Science , Vol 232, Issue 4755, 1242-1244) was inserted into pMON316 (Rogers et al., 1987, supra) to construct a plant expression vector pGS111. This placed the transgene under the control of the constant cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase (NOS) transcription terminator. A kanamycin resistance gene was included to confer a selectable marker.

（ＧＳ１転写産物の生成）
ｐＧＳ１１１は、三親接合（triparental mating）（上述したRogers et al., 1987；Unkefer et al.,米国特許第６，５５５，５００号）を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）菌株ｐＴｉＴＴ３７ＡＳＥに形質転換される。タバコ（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）植物は、ｐＧＳ１１１が形質転換されたアグロバクテリアにより、Ｈｏｒｓｃｈらのリーフディスク形質転換システム（Horsch et al.,1995, Science 227:1229-1231）を用いて形質転換された。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＭＳ培地上で選択され、かつ再生された。シュートは、同じ培地（カナマイシンを含み、ホルモンがない）上に植え付けた後に鉢植え用土：パーライト：バーミキュライト（３：１：１）に移し、成熟期まで生育させた後に自家受粉させた。Ｔ₀世代と、自家受粉し、かつカナマイシンによる選抜を続けることによって生成された次の世代とから、種子を回収した。最もよく生育するものが、実施例３に記載のような最も多くＧＰＴを過剰発現することが同定された系統と交雑させ、Ｔ₃を生成するために使用された。野生型コントロール植物と比較したＧＳ１トランスジェニック植物の写真を図２に示す（ＧＰＴトランスジェニックタバコ植物とともに，実施例３を参照）。 (Generation of GS1 transcript)
pGS111 is transformed into Agrobacterium tumefaciens strain pTiTT37ASE using triparental mating (Rogers et al., 1987, described above; Unkefer et al., US Pat. No. 6,555,500). Transformed into Tobacco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) plants were transformed with Agrobacterium transformed with pGS111 using the Horsch et al. Leaf disk transformation system (Horsch et al., 1995, Science 227: 1229-1231). It was. Transformants were selected and regenerated on MS medium containing 100 μg / ml kanamycin. The shoots were planted on the same medium (containing kanamycin and without hormones), then transferred to potting soil: perlite: vermiculite (3: 1: 1), grown to maturity and self-pollinated. And T ₀ generation, selfed, and the next generation generated by continuing selection by kanamycin, seeds were collected. Which grow best found by most to overexpress GPT were identified lines crossed as described in Example 3, it was used to generate the T _3. A photograph of the GS1 transgenic plant compared to the wild type control plant is shown in FIG. 2 (see Example 3 along with the GPT transgenic tobacco plant).

＜実施例６：アルファルファＧＳ１導入遺伝子を保有するトランスジェニックトマト植物の生成＞
アルファルファＧＳ１導入遺伝子を保有するトランスジェニックトマト（Lycopersicon esculentum）（マイクロトム（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ）トマト）植物は、実施例５に記載のベクター及び基本的に（Sun et al., 2006. Plant Cell Physiol. 46(3) 426-31）に記載された形質転換プロトコルを用いて生成された。Ｔ₀トランスジェニックトマト植物を生成し、かつ成熟期まで生育させた。ＧＰＴトランスジェニックトマト植物の初期の生育特性データを表ＩＩＩに示す。このトランスジェニック植物は、野生型コントロール植物に対して、生育速度、開花期及び種子収量の顕著な向上を示した。さらに、野生型植物は１つの主茎しか展開させない一方で、このトランスジェニック植物は、複数の主茎を展開させた。野生型植物と比較したＧＳ１トランスジェニックトマト植物の写真を図３に示す（ＧＰＴトランスジェニックトマト植物とともに，実施例４を参照）。 <Example 6: Production of transgenic tomato plant carrying alfalfa GS1 transgene>
The transgenic tomato (Micro-Tom tomato) plant carrying the alfalfa GS1 transgene is the vector described in Example 5 and basically (Sun et al., 2006. Plant Cell Physiol. 46 (3) 426-31). T ₀ transgenic tomato plants were generated and grown to maturity. Initial growth characteristics data for GPT transgenic tomato plants are shown in Table III. This transgenic plant showed a marked improvement in growth rate, flowering time and seed yield over the wild type control plant. Furthermore, the wild type plant developed only one main stem, while this transgenic plant developed multiple main stems. A photograph of the GS1 transgenic tomato plant compared to the wild type plant is shown in FIG. 3 (see Example 4 along with the GPT transgenic tomato plant).

＜実施例７：ＧＳ１導入遺伝子及びＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックタバコ植物の生成＞
１個のトランスジェニック植物におけるＧＳ１導入遺伝子とＧＰＴ導入遺伝子との組合せが、生育及び他の農学的な特性が向上され得る範囲を改善するかどうかを確認するための試験において、単一の導入遺伝子（ＧＳ１又はＧＰＴ）を有するトランスジェニック植物のうちの高生産性系統の間で多くの有***雑を行なった。得られた結果は著しく、これらの交雑は、生育速度、バイオマス収量及び種子生産が、驚くほど、そしてこれまで見たこともないほど増加している子孫の植物を反復して生成した。 <Example 7: Generation of a double transgenic tobacco plant carrying a GS1 transgene and a GPT transgene>
In a test to confirm whether the combination of GS1 and GPT transgenes in a single transgenic plant improves the extent to which growth and other agronomic characteristics can be improved, a single transgene Many sexual crossings were performed between high-productivity lines of transgenic plants with (GS1 or GPT). The results obtained were striking and these crosses produced repeated progeny plants with surprisingly and unprecedented increases in growth rate, biomass yield and seed production.

（材料及び方法）
単一の導入遺伝子を有する、ＧＰＴ又はＧＳ１を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物を、それぞれ実施例３及び４に記載のように生成した。いくつかの最も速く生育するＴ₂世代のＧＰＴトランスジェニック植物系統を、最も速く生育するＴ₃世代のＧＳ１トランスジェニック植物系統と、相反交雑を用いて交雑した。その後、実施例３に記載のようなカナマイシンを含むＭ＆Ｓ培地上で子孫を選抜し、そしてそれらの生育、開花期および種子収量を調べた。 (Materials and methods)
Transgenic tobacco plants overexpressing GPT or GS1 with a single transgene were generated as described in Examples 3 and 4, respectively. Some of the most rapidly growing to T ₂ generation GPT transgenic plant lines, and T ₃ generation GS1 transgenic plant lines grown fastest, were crossed with reciprocal crosses. Thereafter, offspring were selected on M & S medium containing kanamycin as described in Example 3 and their growth, flowering period and seed yield were examined.

ＧＰＴ及びＧＳ活性のための組織抽出：ＧＰＴ活性は、１ｍｍエチレンジアミン四酢酸、２００ｍＭピリドキサールリン酸及び６ｍＭメルカプトエタノールを組織１グラム当たり３ｍｌの割合で含む冷却した１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６中ですりつぶした後の新鮮な植物組織から抽出した。この抽出物を遠心により透明にし、アッセイに用いた。ＧＳ活性は、１０ｍＭＭｇＣｌ２及び１２．５ｍＭメルカプトエタノールを組織１グラムあたり３ｍｌの割合で含む冷却した５０ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．５中ですりつぶした後の新鮮な植物組織から抽出した。この抽出物を遠心により透明にし、アッセイに用いた。ＧＰＴ活性は、Calderon and Mora, 1985, Journal Bacteriology 161:807-809に記載のようにアッセイした。ＧＳ活性は、Shapiro and Stadtmann, 1970, Methods in Enzymology 17A: 910-922に記載のように測定した。両方のアッセイは、適切なｐＨで基質およびコファクターと共にインキュベートすることを含む。検出はＨＰＬＣにより行なった。 Tissue extraction for GPT and GS activity: GPT activity is ground in chilled 100 mM Tris-HCl, pH 7.6 containing 1 mm ethylenediaminetetraacetic acid, 200 mM pyridoxal phosphate and 6 mM mercaptoethanol at a rate of 3 ml per gram of tissue. And then extracted from fresh plant tissue. This extract was clarified by centrifugation and used in the assay. GS activity was extracted from fresh plant tissue after grinding in chilled 50 mM imidazole, pH 7.5 containing 10 mM MgCl 2 and 12.5 mM mercaptoethanol at a rate of 3 ml per gram of tissue. This extract was clarified by centrifugation and used in the assay. GPT activity was assayed as described in Calderon and Mora, 1985, Journal Bacteriology 161: 807-809. GS activity was measured as described in Shapiro and Stadtmann, 1970, Methods in Enzymology 17A: 910-922. Both assays involve incubating with substrate and cofactor at the appropriate pH. Detection was performed by HPLC.

（結果）
結果を２つの方法で示す。まず、特異的な生育特性を、表ＩＶ．Ａ及び表ＩＶ．Ｂに示す（バイオマス、種子収量、生育速度、ＧＳ活性、ＧＰＴ活性、２−オキソグルタメート活性など）。次に、子孫植物及びそれらの葉の写真を、単一の導入遺伝子を持つ植物及び野生型植物ならびに葉と比較して示し、図５及び図６に表す。図５及び図６は、単一導入遺伝子を持つ親植物及び野生型コントロール植物と比較して、特により大きい植物全体、より大きい葉、ならびにより早く、及び／又はより十分な開花を示す。 (result)
Results are shown in two ways. First, specific growth characteristics are shown in Table IV. A and Table IV. Shown in B (biomass, seed yield, growth rate, GS activity, GPT activity, 2-oxoglutamate activity, etc.). Next, photographs of the progeny plants and their leaves are shown in comparison to plants with a single transgene and wild type plants and leaves, and are shown in FIGS. Figures 5 and 6 show particularly larger whole plants, larger leaves, and earlier and / or better flowering compared to parental plants and wild type control plants with a single transgene.

表ＩＶ．Ａを参照すれば、これらの交雑由来の二重導入遺伝子を持つ子孫植物の全バイオマス（生体重）は、個々の野生型植物あたり１９〜２４グラムの範囲と比べて、個々の子孫植物あたり４５〜８９グラムの範囲の生体重であり、甚だしい増加を示した。バイオマスにおいて、平均で言えば野生型植物に対して約２倍〜３倍の増加であり、そして最大値で言えば野生型植物に対して驚くべき４倍の増加である。二重導入遺伝子を持つ２４個の個々の子孫植物を評価したところ、個々の植物のバイオマスの平均は、野生型コントロール植物の平均の約２．７５倍であった。子孫の系統のうち４つは、野生型植物と比較して、植物の新鮮重あたりおよそ２．５倍大きい平均を示した。一方、２つの系統は、野生型植物と比較して３倍以上大きい生体重を示した。 Table IV. Referring to A, the total biomass (live weight) of progeny plants with double transgenes derived from these crosses is 45 per individual progeny, compared to a range of 19-24 grams per individual wild-type plant. Live weight in the range of ~ 89 grams, showing a significant increase. In biomass, on average, it is about a 2 to 3 fold increase over wild type plants, and maximum is a surprising 4 fold increase over wild type plants. When 24 individual progeny plants with double transgenes were evaluated, the average biomass of each individual plant was approximately 2.75 times that of the wild type control plant. Four of the progeny lines showed an average of about 2.5 times greater per plant fresh weight compared to wild type plants. On the other hand, the two strains showed a living weight that was more than 3 times greater than that of the wild type plant.

シングルトランスジーンを持つ親の系統と比較して、二重導入遺伝子を持つ子孫植物は、さらなる顕著な生育の向上をも示した。ＧＰＴ単一導入遺伝子系統が野生型のバイオマスに対して約５０％ほどの増加を示し、ＧＳ１単一導入遺伝子系統が６６％ほどの増加を示したのに対し、子孫植物は、野生型植物に対して平均してほとんど２００％の増加を示した。 Compared to the parental line with a single transgene, progeny plants with double transgenes also showed a further significant growth improvement. While the GPT single transgene line showed an increase of about 50% relative to the wild type biomass and the GS1 single transgene line showed an increase of about 66%, the progeny plant became a wild type plant. On average, it showed almost a 200% increase.

同様に、二重導入遺伝子を持つ子孫植物は、野生型又は単一の導入遺伝子を持つ親の系統のいずれよりも、早く開花し、かつより多産性であった。そして、この子孫植物が生産した植物あたりの種子の総数だけでなく、植物あたりの種子のさやの数も、はるかに多かった。表ＩＶ．Ａを再度参照すれば、平均的に、二重導入遺伝子を持つ子孫は、野生型植物によって生産される数の２倍以上の数の種子のさやを生産し、高生産性の植物のうち２つは、野生型と比べて３倍以上の数の種子のさやを生成した。子孫植物における全種子収量は、植物重量を基準として測定され、野生型植物において生産された数の約２倍から４倍近い数の範囲であった。 Similarly, progeny plants with double transgenes flowered earlier and were more productive than either wild-type or parental lines with a single transgene. And not only the total number of seeds per plant produced by this progeny plant, but also the number of seed pods per plant was much higher. Table IV. Referring back to A, on average, a progeny with a double transgene produces more than twice as many seed pods as produced by a wild-type plant, and 2 of the highly productive plants One produced more than three times the number of seed pods compared to the wild type. Total seed yield in progeny plants was measured on the basis of plant weight and ranged from about 2 to nearly 4 times the number produced in wild type plants.

表ＩＶ．Ｂは、ＧＳ１を発現する単一の導入遺伝子系統及び野生型コントロールタバコと比較した、系統ＸＸ（系統３がさらに自家受粉した）における生育速度、バイオマス及び収量、ならびに生化学的性質を示す。二重トランスジェニック植物（系統ＸＸ）では、全てのパラメータが顕著に増加している。特に、系統ＸＸ植物では、コントロール植物に対して、２−オキソグルタラメート活性がほぼ１７倍高くなっており、種子収量及び葉のバイオマスが３倍高くなっている。 Table IV. B shows growth rate, biomass and yield, and biochemical properties in line XX (line 3 further self-pollinated) compared to a single transgene line expressing GS1 and wild type control tobacco. In double transgenic plants (line XX), all parameters are significantly increased. In particular, in the line XX plant, the 2-oxoglutaramate activity is almost 17 times higher than the control plant, and the seed yield and leaf biomass are 3 times higher.

＜実施例８：ＧＳ１導入遺伝子及びＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックコショウ植物＞
本実施例では、ＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナのＧＰＴ全長のコード配列（配列番号１）、及びＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナのＧＳ１コード配列（配列番号６）を、アグロバクテリウム媒介によって種子のさやに導入することにより、ＢｉｇＪｉｍｃｈｉｌｉコショウ植物（ＮｅｗＭｅｘｉｃｏの変種）を形質転換した。３日後、種子を回収し、Ｔ０植物を生成するために使用し、形質転換体をスクリーニングした。得られた二重トランスジェニック植物は、コントロール植物と比較して、より高いさやの収率、より速い生育速度、及びより多いバイオマス収量を示した。 <Example 8: Double transgenic pepper plant carrying GS1 transgene and GPT transgene>
In this example, the coding sequence of the full length GPT of Arabidopsis thaliana under the control of the CMV 35S promoter (SEQ ID NO: 1) and the GS1 coding sequence of Arabidopsis thaliana under the control of the RuBisCo promoter (SEQ ID NO: 6) were mediated by Agrobacterium-mediated The Big Jim chili pepper plant (New Mexico varieties) was transformed by introducing into the seed pod. Three days later, seeds were collected and used to generate T0 plants and transformants were screened. The resulting double transgenic plants showed higher pod yield, faster growth rate, and higher biomass yield compared to control plants.

（材料及び方法）
発現ベクターｐＭＯＮ（実施例３を参照）内のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナのＧＰＴ全長のコード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（トマトのrubisco rbcS3C プロモーター：Kyozulka et al., 1993, Plant Physiol. 103: 991-1000；配列番号２２；ベクターコンストラクト（配列番号６））内のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター制御下にあるシロイヌナズナのＧＳ１コード配列（配列番号６）とを用いて、アグロバクテリウム媒介による種子のさやへの導入によって、コショウ植物であるソラナセアエ・カピシカム（Solanaceae Capisicum）（「ＢｉｇＪｉｍ」の変種）を形質転換した。 (Materials and methods)
The coding sequence of the full length GPT of Arabidopsis thaliana under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON (see Example 3) (SEQ ID NO: 1) and the expression vector pCambia1201 (tomato rubisco rbcS3C promoter: Kyozulka et al., 1993 , Plant Physiol. 103: 991-1000; SEQ ID NO: 22; Agrobacterium-mediated using the Arabidopsis GS1 coding sequence (SEQ ID NO: 6) under the control of the RuBisCo promoter in the vector construct (SEQ ID NO: 6)) By introduction into the seed pod, the pepper plant Solanaceae Capisicum (a variant of “Big Jim”) was transformed.

本実施例及びその後の全ての実施例において、Ｃａｍｂｉａ１２０１又は１３０５．１ベクターは、標準的なクローニング方法（上述したSambrook et al., 1989, Saiki et al., 1988, Science 239: 487-491）によって構築された。３５ＳＣａＭＶプロモーターが付与されたベクター；このプロモーターは、標的遺伝子の発現を制御するためのトマト由来のＲｃｂＳ−３Ｃプロモーターと交換された。Ｃａｍｂｉａ１２０１ベクターは、細菌のクロロフェニコール耐性選択マーカー遺伝子と植物のハイグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子とを含む。Ｃａｍｂｉａ１３０５．１ベクターは、細菌のクロロフェニコール耐性選択マーカー遺伝子とハイグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子とを含む。 In this example and in all subsequent examples, the Cambia 1201 or 1305.1 vector is obtained by standard cloning methods (Sambrook et al., 1989, Saiki et al., 1988, Science 239: 487-491, supra). It was constructed. A vector provided with a 35S CaMV promoter; this promoter was exchanged for a tomato-derived RcbS-3C promoter to control the expression of the target gene. The Cambia 1201 vector contains a bacterial chlorophenicol resistance selectable marker gene and a plant hygromycin resistance selectable marker gene. The Cambia 1305.1 vector contains a bacterial chlorophenicol resistance selectable marker gene and a hygromycin resistance selectable marker gene.

標準的なエレクトロポレーション法（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）を用いて、導入遺伝子発現ベクターｐＭＯＮ（ＧＰＴ導入遺伝子）及びｐＣａｍｂｉａ１２０１（ＧＳ導入遺伝子）を、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌株に導入した。コンストラクトのためのストレプトマイシン、又はＣａｍｂｉａコンストラクトのためのクロラムフェニコールのいずれかを５０μｇ／ｍｌ含む培地上で、形質転換したアグロバクテリウムを選抜した。形質転換されたアグロバクテリウム細胞を、抗生物質を２５μｇ／ｍｌ含むＬＢ培地中で３６時間生育させた。３６時間の生育期間の後に、遠心によって細胞を回収し、各形質転換より得られた細胞を、抗生物質を含まない１００ｍｌのＬＢ培養液中に懸濁した。 Using standard electroporation methods (McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9: 155-159), the transgene expression vectors pMON (GPT transgene) and pCambia1201 (GS transgene), respectively, were Agrobacterium -It was introduced into Tumefaciens LBA4404 strain. The transformed Agrobacterium was selected on a medium containing 50 μg / ml of either streptomycin for the construct or chloramphenicol for the Cambia construct. Transformed Agrobacterium cells were grown for 36 hours in LB medium containing 25 μg / ml antibiotics. After a growth period of 36 hours, the cells were collected by centrifugation, and the cells obtained from each transformation were suspended in 100 ml of LB medium containing no antibiotics.

その後、得られたアグロバクテリウム細胞の懸濁液の混合物により、アグロバクテリウムを直接的に種子における成長中のさやの穴の中に注入する形質転換プロトコルを用いて、コショウ植物を形質転換した。簡単に言えば、未成熟の種子にアグロバクテリアを接種するために、基本的に（Wang and Waterhouse, 1997, Plant Mol. Biol. Reporter 15: 209-215）に記載のように、成長中のさやに２００ｍｌの混合物を注入した。アグロバクテリアの病原性を導入し、かつ形質転換効率を改善するために、さや接種に先立って、１０μｇ／ｍｌのアセトシリンゴノンをアグロバクテリア培養液に加えた（Sheikholeslam and Weeks, 1986, Plant Mol. Biol. 8: 291-298を参照）。 The resulting mixture of Agrobacterium cells was then used to transform pepper plants using a transformation protocol in which Agrobacterium was injected directly into the growing pod hole in the seed. . Briefly, in order to inoculate immature seeds with Agrobacterium, the growing pods are basically as described in (Wang and Waterhouse, 1997, Plant Mol. Biol. Reporter 15: 209-215). 200 ml of the mixture was injected. To introduce the pathogenicity of Agrobacterium and improve transformation efficiency, 10 μg / ml acetosyringone was added to the Agrobacterium culture prior to pod inoculation (Sheikholeslam and Weeks, 1986, Plant Mol Biol. 8: 291-298).

シリンジを用いて、さやに充分な量のアグロバクテリウムベクター混合物を注入し、約３日間インキュベートした。その後、種子を回収して発芽させ、植物を成長させて生育及び抗生物質耐性を含む表現型特性を観察した。導入遺伝子を保有する植物は緑であるが、形質転換されていない植物は葉頂が萎黄病の徴候を示した。活発に生育する形質転換体を生育させ、同一の条件下で生育させた野生型のコショウ植物と比較した。 A sufficient amount of Agrobacterium vector mixture was injected using a syringe and incubated for about 3 days. Thereafter, seeds were collected and germinated, plants were grown and observed for phenotypic characteristics including growth and antibiotic resistance. Plants carrying the transgene are green, but non-transformed plants showed signs of yellowing at the leaf tips. Active transformants were grown and compared to wild-type pepper plants grown under the same conditions.

（結果）
結果を図７及び表Ｖに示す。図７は、同一の条件下で同時に生育させたコントロール植物と比較した、ＧＰＴ＋ＧＳ二重トランスジェニックコショウ植物の写真を示す。この写真は、コントロール植物と比較して、トランスジェニック系統のコショウ収量が甚だしいことを示す。 (result)
The results are shown in FIG. FIG. 7 shows a photograph of a GPT + GS double transgenic pepper plant compared to a control plant grown simultaneously under the same conditions. This photo shows that the pepper yield of the transgenic line is greater compared to the control plant.

表Ｖは、野生型コントロールと比較した、トランスジェニック系統におけるバイオマス収量及びＧＳ活性、ならびに導入遺伝子の遺伝子型を示す。表Ｖを参照すれば、二重−導入遺伝子の子孫植物は、全バイオマス（生体重）の甚だしい増加を示した。野生型植物あたりの平均３２８グラムと比較して、個々のトランスジェニック植物あたりの生体重は、３９３〜６６２グラムの範囲であった。トランスジェニック系統Ａ５は、コントロールの２倍以上の全バイオマスを生産した。さらに、トランスジェニック系統のコショウ収量は、野生型植物に対して著しく改善され、コントロール植物よりも５０％多かった（平均で）。特に、導入遺伝子系統の１つは、コントロール植物の平均よりも２倍多いコショウを生産した。 Table V shows the biomass yield and GS activity in the transgenic lines and the genotype of the transgene compared to the wild type control. Referring to Table V, double-transgene progeny plants showed a significant increase in total biomass (live weight). Live weight per individual transgenic plant ranged from 393 to 662 grams compared to an average of 328 grams per wild type plant. Transgenic line A5 produced more than twice as much total biomass as the control. Furthermore, the pepper yield of the transgenic line was markedly improved over the wild type plant, 50% higher (on average) than the control plant. In particular, one of the transgene lines produced twice as much pepper as the average of the control plants.

＜実施例９：シロイヌナズナのＧＳ１導入遺伝子とＧＰＴ導入遺伝子とを保有する二重トランスジェニックマメ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＰＴ全長コード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６）とを、アグロバクテリウム媒介により花へ導入することによって、黄色ワックスマメ植物（インゲンマメ（Phaseolus vulgaris））を形質転換した。 <Example 9: Generation of a double transgenic bean plant carrying an Arabidopsis GS1 transgene and a GPT transgene>
In this example, the Arabidopsis GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pCambia 1201, and the Arabidopsis GS1 coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201. 6) and Agrobacterium-mediated introduction into flowers to transform a yellow wax bean plant (Phaseolus vulgaris).

（材料及び方法）
導入遺伝子発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１−ＧＰＴ（配列番号２７のベクターコンストラクト）と、ｐＣａｍｂｉａ１２０１−ＧＳ（配列番号６のベクターコンストラクト）とを、標準的なエレクトロポレーション法を用いて、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌株に導入した（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）。５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む培地上で、形質転換したアグロバクテリウムを選択した。形質転換したアグロバクテリウム細胞を、２５μｇ／ｍｌの抗生物質を含むＬＢ培地中で３６時間生育させた。３６時間の生育期間の最後に、遠心により細胞を回収し、それぞれの形質転換由来の細胞を、抗生物質を含まない１００ｍｌＬＢ培養液中に懸濁した。 (Materials and methods)
The transgene expression vectors pCambia 1201-GPT (vector construct of SEQ ID NO: 27) and pCambia 1201-GS (vector construct of SEQ ID NO: 6) were respectively converted into Agrobacterium tumefaciens using standard electroporation methods. It was introduced into the LBA4404 strain (McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9: 155-159). Transformed Agrobacterium was selected on a medium containing 50 μg / ml chloramphenicol. Transformed Agrobacterium cells were grown for 36 hours in LB medium containing 25 μg / ml antibiotics. At the end of the 36 hour growth period, cells were harvested by centrifugation and cells from each transformation were suspended in 100 ml LB medium without antibiotics.

その後、結果として生じたアグロバクテリウム細胞懸濁液の混合物により、アグロバクテリアを花器官に直接的に注入する形質転換プロトコルを用いて、マメ植物に形質転換した（Yasseem, 2009, Plant Mol. Biol. Reporter 27: 20-28）。アグロバクテリア病原性を誘導し、形質転換効率を改善するために、花に接種する前のアグロバクテリア培養液に１０μｇ／ｍｌアセトシリンゴノンを添加した。簡単に言えば、花の開花後すぐに、アグロバクテリア混合物を導入できるように、外部構造が被包している生殖器官をピンセットで優しく開き、葯を浸すために十分な程度、花器官にアグロバクテリア混合物を加えた。 The resulting mixture of Agrobacterium cell suspensions was then transformed into legume plants using a transformation protocol in which Agrobacterium was injected directly into the flower organ (Yasseem, 2009, Plant Mol. Biol Reporter 27: 20-28). In order to induce Agrobacterium pathogenicity and improve transformation efficiency, 10 μg / ml acetosyringone was added to the Agrobacterium culture before inoculating the flowers. Simply put, the reproductive organs encapsulated by the external structure are gently opened with tweezers, and the agrobacterium is introduced into the agglomerates enough to soak the buds, so that the agrobacterial mixture can be introduced immediately after flowering. The bacterial mixture was added.

マメの鞘が成長するまで植物を生育させ、種子を回収して、トランスジェニック植物を生成するために使用した。その後、トランスジェニック植物をコントロールのマメ植物とともに同一条件下で生育させ、撮影するとともに表現型を同定した。トランスジェニック植物とコントロール植物との両方の生育速度を測定した。本実施例及び全ての実施例において、Shapiro and Stadtmann, 1970, Methods in Enzymology 17A: 910-922中の方法により、グルタミン合成酵素（ＧＳ）活性をアッセイした；そして、Calderon et al., 1985, J. Bacteriol. 161: 807-809中の方法により、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）活性をアッセイした。上述した実施例７の方法の項にて詳細を参照されたい。 Plants were grown until the bean pods grew and seeds were collected and used to generate transgenic plants. Thereafter, the transgenic plants were grown together with the control legume plants under the same conditions, photographed and the phenotype identified. The growth rates of both transgenic and control plants were measured. In this and all examples, glutamine synthase (GS) activity was assayed by the method in Shapiro and Stadtmann, 1970, Methods in Enzymology 17A: 910-922; and Calderon et al., 1985, J Bacteriol. 161: Glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) activity was assayed by the method in 807-809. See details in the method section of Example 7 above.

（結果）
結果を図８、図９及び表ＶＩに示す。 (result)
The results are shown in FIGS. 8 and 9 and Table VI.

図８は、コントロール植物に対するＧＰＴ＋ＧＳトランスジェニックマメ系統Ａの生育速度データを示す。生育速度データは、栽培中における様々な日の植物の高さ、ならびに花のつぼみ、花、及びマメの鞘の数を含む。これらのデータは、ＧＰＴ＋ＧＳ二重トランスジェニックマメ植物が、これらの対応するコントロール植物よりも大きくなることを示す。トランスジェニック植物は、野生型コントロール植物に対し、より高く育ち、より早く開花し、より多くの花のつぼみ及び花を作り、そしてマメの鞘を成熟させてより多くのマメの鞘を作った。 FIG. 8 shows the growth rate data of GPT + GS transgenic bean line A against control plants. Growth rate data includes the height of the plants on various days during cultivation, as well as the number of flower buds, flowers, and legumes. These data indicate that GPT + GS double transgenic bean plants are larger than their corresponding control plants. The transgenic plants grew higher, wilder, made more flower buds and flowers, and matured the bean pods to make more bean pods, compared to wild type control plants.

表ＶＩは、野生型コントロール（いくつかの健全なコントロール植物の平均；良好に生育しなかったコントロール植物は解析から除外した）と比較した、トランスジェニック系統におけるマメの鞘の収量、ＧＰＴ活性及びＧＳ活性、ならびに抗生物質耐性の状態を示す。表ＶＩを参照すれば、二重−導入遺伝子を持つ子孫植物は、コントロール植物と比較して、マメの鞘のバイオマスの十分な増加（未乾燥の鞘の重量）を示した。マメの鞘のバイオマス収量は、野生型植物あたり平均１２７グラムであるのと比較して、個々のトランスジェニック植物あたり常に２００グラム以上であった。これは、二重導入遺伝子系統では、コントロール植物に対して鞘の収量が６０％以上増加していることを示す。 Table VI shows legume pod yield, GPT activity and GS in transgenic lines compared to wild type controls (average of several healthy control plants; control plants that did not grow well were excluded from the analysis). Activity, as well as antibiotic resistance status. Referring to Table VI, the progeny plant with the double-transgene showed a sufficient increase in bean pod biomass (undried pod weight) compared to the control plant. The biomass yield of bean pods was always over 200 grams per individual transgenic plant compared to an average of 127 grams per wild type plant. This indicates that in the double transgene line, the yield of pods increased by 60% or more relative to the control plant.

最後に、図９は、同一条件下で同時に生育させたコントロール植物と比較したＧＰＴ＋ＧＳ二重トランスジェニックマメ植物の写真を示す。図９は、トランスジェニック植物において生育が増加したことを示す。 Finally, FIG. 9 shows a photograph of a GPT + GS double transgenic bean plant compared to a control plant grown simultaneously under the same conditions. FIG. 9 shows increased growth in the transgenic plants.

＜実施例１０：シロイヌナズナＧＳ１導入遺伝子及びブドウＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックマメ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１３０５．１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるブドウＧＰＴ全長コード配列（配列番号８）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６）とを、アグロバクテリウムで媒介して成長中の鞘に導入することにより、黄色ワックスマメ植物（インゲンマメ）を形質転換した。 <Example 10: Generation of a double transgenic bean plant carrying an Arabidopsis GS1 transgene and a grape GPT transgene>
In this example, the grape GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 8) under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia1305.1 and the Arabidopsis GS1 coding sequence (SEQ ID NO: 8) under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia1201. 6) was introduced into a growing pod mediated by Agrobacterium to transform a yellow wax bean plant (green beans).

（材料及び方法）
導入遺伝子発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１−ＧＰＴ（ブドウ）（配列番号８のベクターコンストラクト）と、ｐＣａｍｂｉａ１２０１−ＧＳ（配列番号６のベクターコンストラクト）とを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌株に、標準的なエレクトロポレーション法を用いて形質転換した（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）。５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む培地上で、形質転換したアグロバクテリウムを選択した。形質転換したアグロバクテリウム細胞を、２５μｇ／ｍｌの抗生物質を含むＬＢ培地中で３６時間生育させた。３６時間の生育期間の最後に、遠心により細胞を回収し、それぞれの形質転換由来の細胞を、抗生物質を含まない１００ｍｌＬＢ培養液中に懸濁した。 (Materials and methods)
The transgene expression vector pCambia1201-GPT (grape) (vector construct of SEQ ID NO: 8) and pCambia1201-GS (vector construct of SEQ ID NO: 6) were respectively transferred to Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain by standard electroporation. The method was used to transform (McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9: 155-159). Transformed Agrobacterium was selected on a medium containing 50 μg / ml chloramphenicol. Transformed Agrobacterium cells were grown for 36 hours in LB medium containing 25 μg / ml antibiotics. At the end of the 36 hour growth period, cells were harvested by centrifugation and cells from each transformation were suspended in 100 ml LB medium without antibiotics.

その後、結果として生じたアグロバクテリウム細胞懸濁液の混合物により、アグロバクテリアを花器官に直接的に注入する形質転換プロトコルを用いて、マメ植物に形質転換した。アグロバクテリア病原性を誘導し、形質転換効率を改善するために、花に接種する前のアグロバクテリア培養液に１０μｇ／ｍｌアセトシリンゴノンを添加した。簡単に言えば、花の開花後すぐに、アグロバクテリア混合物を導入できるように、外部構造が被包している生殖器官をピンセットで優しく開き、葯を浸すために十分な程度、花器官にアグロバクテリア混合物を加えた。 The resulting mixture of Agrobacterium cell suspensions was then transformed into legume plants using a transformation protocol in which Agrobacterium was injected directly into the flower organ. In order to induce Agrobacterium pathogenicity and improve transformation efficiency, 10 μg / ml acetosyringone was added to the Agrobacterium culture before inoculating the flowers. Simply put, the reproductive organs encapsulated by the external structure are gently opened with tweezers, and the agrobacterium is introduced into the agglomerates enough to soak the buds, so that the agrobacterial mixture can be introduced immediately after flowering. The bacterial mixture was added.

マメの鞘が成長するまで植物を生育させ、種子を回収して、トランスジェニック植物を生成するために使用した。その後、トランスジェニック植物をコントロールのマメ植物とともに同一条件下で生育させ、撮影するとともに表現型を同定した。トランスジェニック植物とコントロール植物との両方の生育速度を測定した。トランスジェニック植物及びコントロール植物の両方について、生育速度を測定した。 Plants were grown until the bean pods grew and seeds were collected and used to generate transgenic plants. Thereafter, the transgenic plants were grown together with the control legume plants under the same conditions, photographed and the phenotype identified. The growth rates of both transgenic and control plants were measured. Growth rates were measured for both transgenic plants and control plants.

（結果）
結果を図１０、図１１及び表ＶＩＩに示す。 (result)
The results are shown in FIGS. 10 and 11 and Table VII.

図１０は、コントロール植物に対するＧＰＴ＋ＧＳトランスジェニックマメ系統Ｇの生育速度データを示す。生育速度データは、特に、花のつぼみ、花、及びマメの鞘の数を含む。これらのデータは、ＧＰＴ＋ＧＳ二重トランスジェニックマメ植物が、これらの対応するコントロール植物よりも大きくなることを示す。特に、トランスジェニック植物は、野生型コントロール植物よりも十分に多くのマメの鞘を作った。 FIG. 10 shows the growth rate data of GPT + GS transgenic bean line G relative to the control plant. The growth rate data includes in particular the number of flower buds, flowers, and legumes. These data indicate that GPT + GS double transgenic bean plants are larger than their corresponding control plants. In particular, the transgenic plants produced sufficiently more bean pods than the wild type control plants.

表ＶＩＩは、野生型コントロール（いくつかの健全なコントロール植物の平均；良好に生育しなかったコントロール植物は解析から除外した）と比較した、トランスジェニック系統におけるマメの鞘の収量及び抗生物質耐性の状態を示す。表ＶＩＩを参照すれば、二重−導入遺伝子を持つ子孫植物は、コントロール植物と比較して、十分なマメの鞘のバイオマスの増加（未乾燥の鞘の重量）を示した。マメの鞘のバイオマス収量は、野生型植物あたり平均１５８グラムであるのと比較して、個々のトランスジェニック植物あたり２００．５グラム（系統Ｇ１）及び１７８グラム（系統Ｇ２）であった。これは、二重導入遺伝子系統では、コントロール植物に対して鞘の収量が２７％以上増加していることを示す。 Table VII shows the yield of bean pods and antibiotic resistance in transgenic lines compared to wild type controls (average of several healthy control plants; control plants that did not grow well were excluded from the analysis). Indicates the state. Referring to Table VII, the progeny plants with the double-transgene showed a sufficient increase in bean pod biomass (undried pod weight) compared to the control plants. The biomass yield of bean pods was 200.5 grams (line G1) and 178 grams (line G2) per individual transgenic plant compared to an average of 158 grams per wild type plant. This indicates that in double transgene lines, the yield of pods increased by 27% or more relative to the control plant.

最後に、図１１は、同一条件下で同時に生育させたコントロール植物と比較したＧＰＴ＋ＧＳ二重トランスジェニックマメ植物の写真を示す。トランスジェニック植物は、コントロール植物と比較して、サイズ及びバイオマスが十分に増加し、葉がより大きく、花がより成熟していることが示された。 Finally, FIG. 11 shows a photograph of a GPT + GS double transgenic bean plant compared to a control plant grown simultaneously under the same conditions. Transgenic plants were shown to be sufficiently increased in size and biomass, larger leaves, and more mature flowers compared to control plants.

＜実施例１１：シロイヌナズナのＧＳ１及びＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックササゲ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＭＯＮ中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＰＴ全長コード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６）とを、アグロバクテリウムで媒介して花に導入することにより、一般的なササゲ植物を形質転換した。材料及び方法は、上述した実施例９と同様である。 <Example 11: Generation of double transgenic cowpea plants carrying Arabidopsis GS1 and GPT transgenes>
In this example, the Arabidopsis GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON and the Arabidopsis GS1 coding sequence (SEQ ID NO: 6) under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia1201. ) Were introduced into flowers via Agrobacterium to transform common cowpea plants. The material and method are the same as in Example 9 described above.

（結果）
結果を図１２及び図１３、ならびに表ＶＩに示す。図１２は、栽培中の数区間で、ＧＰＴ＋ＧＳトランスジェニックササゲ系統Ａ及び野生型コントロールササゲにおける相対的な生育速度を示す。図１２は、高さ及びもっとも長い葉の長さ（図１２Ａ）、三出葉及び花のつぼみ（図１２Ｂ）、ならびに花、花のつぼみ及びマメの鞘（図１２Ｃ）を含む。これらのデータは、ＧＰＴ＋ＧＳ二重トランスジェニックササゲ植物が、その対応するコントロール植物よりも大きく生育することを示す。トランスジェニック植物は、野生型コントロール植物に対し、より早くかつより高く生育し、より長い葉を持ち、そしてより早く花及び鞘を作った。 (result)
The results are shown in FIGS. 12 and 13 and Table VI. FIG. 12 shows the relative growth rate in GPT + GS transgenic cowpea line A and wild type control cowpea in several sections during cultivation. FIG. 12 includes the height and length of the longest leaf (FIG. 12A), three leaves and flower buds (FIG. 12B), and flowers, flower buds and bean pods (FIG. 12C). These data indicate that the GPT + GS double transgenic cowpea plant grows larger than its corresponding control plant. Transgenic plants grew faster and higher than wild type control plants, had longer leaves, and made flowers and pods earlier.

表ＶＩＩＩは、野生型コントロール（いくつかの健全なコントロール植物の平均；良好に生育しなかったコントロール植物は解析から除外した）と比較した、トランスジェニック系統におけるエンドウマメ鞘の収量、ＧＰＴ活性及びＧＳ活性、ならびに抗生物質耐性の状態を示す。表ＶＩＩＩを参照すれば、二重−導入遺伝子を持つ子孫植物は、コントロール植物と比較して、エンドウマメの鞘のバイオマスの十分な増加（新鮮な鞘の重量）を示した。トランスジェニック植物におけるエンドウマメ鞘のバイオマス収量の平均は、コントロール植物で測定された収量よりも５２％近く多かった。 Table VIII shows pea pod yield, GPT activity and GS in transgenic lines compared to wild type controls (average of several healthy control plants; control plants that did not grow well were excluded from the analysis). Activity, as well as antibiotic resistance status. Referring to Table VIII, progeny plants with double-transgenes showed a sufficient increase in pea pod biomass (fresh pod weight) compared to control plants. The average pea pod biomass yield in the transgenic plants was nearly 52% higher than the yield measured in the control plants.

最後に、図１３は、同一条件下で同時に生育させたコントロール植物と比較したＧＰＴ＋ＧＳ二重トランスジェニックマメ植物の写真を示す。図１３は、トランスジェニック植物のバイオマス及び鞘収量が、野生型コントロール植物に対して増加したことを示す。 Finally, FIG. 13 shows a photograph of a GPT + GS double transgenic bean plant compared to a control plant grown simultaneously under the same conditions. FIG. 13 shows that the biomass and pod yield of the transgenic plants increased relative to the wild type control plants.

＜実施例１２：シロイヌナズナＧＳ１及びブドウＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックササゲ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１３０５．１（配列番号８のベクターコンストラクト）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるブドウＧＰＴ全長コード配列（配列番号８）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のベクターコンストラクト）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６）とを、アグロバクテリウムで媒介して花に導入することにより、一般的なササゲ植物を形質転換した。材料及び方法は、上述した実施例１１と同様である。 <Example 12: Generation of a double transgenic cowpea plant carrying Arabidopsis GS1 and grape GPT transgene>
In this example, the grape GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 8) under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia1305.1 (vector construct of SEQ ID NO: 8) and the expression vector pCambia1201 (vector construct of SEQ ID NO: 6) A common cowpea plant was transformed by introducing an Arabidopsis GS1 coding sequence (SEQ ID NO: 6) under the control of the RuBisCo promoter into a flower mediated by Agrobacterium. The material and method are the same as in Example 11 described above.

（結果）
結果を図１４及び図１５、ならびに表ＩＸに示す。 (result)
The results are shown in FIGS. 14 and 15 and Table IX.

図１４は、ＧＰＴ＋ＧＳトランスジェニックササゲ系統Ｇ及び野生型コントロールササゲにおける相対的な生育速度を示す。これらのデータは、トランスジェニック植物が、常により高く（図１４Ａ）、より十分に多くの花、花のつぼみ及びエンドウマメの鞘を作り（図１４Ｂ）、そして三出葉及びつぼみをより早く展開させる（図１４Ｃ）ことを示す。 FIG. 14 shows the relative growth rate in GPT + GS transgenic cowpea line G and wild type control cowpea. These data show that transgenic plants are always higher (FIG. 14A), make more flowers, flower buds and pea pods (FIG. 14B), and develop three leaves and buds faster. (FIG. 14C).

表ＩＸは、野生型コントロール（いくつかの健全なコントロール植物の平均；良好に生育しなかったコントロール植物は解析から除外した）と比較した、トランスジェニック系統におけるエンドウマメ鞘の収量、ＧＰＴ活性及びＧＳ活性、ならびに抗生物質耐性の状態を示す。表ＩＸを参照すれば、二重−導入遺伝子を持つ子孫植物は、コントロール植物と比較して、エンドウマメの鞘のバイオマスの十分な増加（新鮮な鞘の重量）を示した。トランスジェニック植物におけるエンドウマメ鞘のバイオマス収量の平均は、コントロール植物と比較して７０％多かった。 Table IX shows pea pod yield, GPT activity and GS in transgenic lines compared to wild type controls (average of several healthy control plants; control plants that did not grow well were excluded from the analysis). Activity, as well as antibiotic resistance status. Referring to Table IX, progeny plants with double-transgenes showed a sufficient increase in pea pod biomass (fresh pod weight) compared to control plants. The average pea pod biomass yield in the transgenic plants was 70% higher compared to the control plants.

最後に、図１５は、同一条件下で同時に生育させたコントロール植物と比較したＧＰＴ＋ＧＳ二重トランスジェニックエンドウマメ植物の写真を示す。図１５は、トランスジェニック植物の高さ、バイオマス及び葉のサイズが、野生型コントロール植物に対して増加したことを示す。 Finally, FIG. 15 shows a photograph of a GPT + GS double transgenic pea plant compared to a control plant grown simultaneously under the same conditions. FIG. 15 shows that the height, biomass and leaf size of the transgenic plants were increased relative to the wild type control plants.

＜実施例１３：シロイヌナズナのＧＳ１及びＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックアルファルファ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上述した実施例３を参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＰＴ全長コード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のベクターコンストラクト）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６）とを、アグロバクテリウム媒介により苗植物中に導入することによって、アルファルファ植物（Medicago sativa, var Ladak）を形質転換した。アグロバクテリウムベクター及び混合物は、苗接種するために、上述した実施例１１にて記載したように調製した。 Example 13: Generation of a double transgenic alfalfa plant carrying Arabidopsis GS1 and GPT transgenes
In this example, the Arabidopsis GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above) and the expression vector pCambia1201 (vector construct of SEQ ID NO: 6) An alfalfa plant (Medicago sativa, var Ladak) was transformed by introducing an Arabidopsis GS1 coding sequence (SEQ ID NO: 6) under the control of the RuBisCo promoter into the seedling plant via Agrobacterium. Agrobacterium vectors and mixtures were prepared as described in Example 11 above for seedling inoculation.

（苗接種）
アルファルファの苗がまだ約１／２インチ以下の高さのときに、両方の導入遺伝子コンストラクトを含むアグロバクテリア混合液に浸したペーパータオル中に浸した。苗をこのペーパータオル中に２〜３日間置き、取り除いた後に鉢植え用の土に植えた。その結果生じたＴ０及びコントロール植物は、グロースチャンバー内で最初の３０日間を生育させ、次いで温室内で栽培し、そして発芽後４２日で回収した。この時点で、野生型植物は未成熟の花のつぼみを作っているのみであるのに対し、トランスジェニックアルファルファ系統のみが開花していた。これらの植物の開花の状態及び全バイオマスを同定した。 (Seedling inoculation)
When the alfalfa seedlings were still about 1/2 inch or less in height, they were soaked in a paper towel soaked in an Agrobacterium mixture containing both transgene constructs. The seedlings were placed in this paper towel for 2-3 days, removed and then planted in potting soil. The resulting T0 and control plants were grown in the growth chamber for the first 30 days, then cultivated in a greenhouse and harvested 42 days after germination. At this point, wild-type plants only made immature flower buds, whereas only transgenic alfalfa lines were in bloom. The flowering status and total biomass of these plants were identified.

（結果）
結果を表Ｘに示す。このデータは、トランスジェニックアルファルファ植物が、コントロール植物に対して、より速く生育し、より早く開花し、そしてバイオマス収量の平均が約６２％増加したことを示す。 (result)
The results are shown in Table X. This data shows that the transgenic alfalfa plants grew faster and flowered faster than the control plants, and the average biomass yield increased by about 62%.

＜実施例１４：シロイヌナズナＧＳ１及びＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックカンタロープ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上述した実施例３を参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＰＴ全長コード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のベクターコンストラクト）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６）とを、アグロバクテリウムで媒介して成長中のメロン中に注入して導入することにより、カンタロープ植物（Cucumis melo var common）を形質転換した。上述した実施例８に記載のように、メロン内接種のために、アグロバクテリウムベクター及び混合物を調製した。成長中のメロン内への接種は、基本的に実施例８に記載のように行なった。植物は、同一条件下で生育させたコントロールメロン植物に対する開花の状態及び全バイオマスについて、特徴づけされた。 <Example 14: Generation of double transgenic cantaloupe plant carrying Arabidopsis GS1 and GPT transgene>
In this example, the Arabidopsis GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above) and the expression vector pCambia 1201 (vector construct of SEQ ID NO: 6). The Arabidopsis thaliana GS1 coding sequence (SEQ ID NO: 6) under the control of the RuBisCo promoter is introduced by injecting into a growing melon mediated by Agrobacterium, and the cantaloupe plant (Cucumis melo var common) was transformed. As described in Example 8 above, Agrobacterium vectors and mixtures were prepared for intramelon inoculation. Inoculation into growing melons was basically performed as described in Example 8. Plants were characterized for flowering status and total biomass relative to control melon plants grown under identical conditions.

結果を図１６及び表ＸＩに示す。表ＸＩを参照すれば、トランスジェニック植物は、コントロール植物と比較して、葉の植物のバイオマスがかなりの量増加し、バイオマスの平均が６３％増加したことを示す。さらに、５つ全てのトランスジェニック系統において、花及び花のつぼみの収量の甚だしい増加が観察された。コントロール植物は、平均して、犠牲において花を全く作らずかつつぼみを５個のみ表した。より著しい対照において、トランスジェニック植物は、植物あたり２〜５個の花を作り、また植物あたり２１〜３０個の花のつぼみを作った。これは、基本的に生育速度と花の収量とが高いことを示す。トランスジェニック植物において花の収量が増加することは、相応して言い換えれば、メロンの収量が増加することが期待されるであろう。図１６（コントロールカンタロープ植物と比較したトランスジェニックカンタロープ植物の写真）を参照すれば、トランスジェニックカンタロープ植物は、コントロール植物と比較して高さ、全体のバイオマス、及び開花状態が劇的に増加していることが示される。 The results are shown in FIG. 16 and Table XI. Referring to Table XI, the transgenic plants show a significant increase in leaf plant biomass and a 63% average biomass increase compared to the control plants. In addition, a significant increase in flower and flower bud yields was observed in all five transgenic lines. Control plants, on average, produced no more flowers at the sacrifice and represented only 5 buds. In a more striking control, the transgenic plants made 2-5 flowers per plant and 21-30 flower buds per plant. This basically indicates that the growth rate and flower yield are high. An increase in flower yield in transgenic plants would be expected to increase accordingly, in other words, in melon yield. Referring to FIG. 16 (a photograph of a transgenic cantaloupe plant compared to a control cantaloupe plant), the transgenic cantaloupe plant is dramatically higher in height, overall biomass, and flowering state than the control plant. It is shown that it is increasing.

＜実施例１５：シロイヌナズナＧＳ１およびＧＰＴ導入遺伝子を持つ二重トランスジェニックカボチャ植物の作成＞
本実施例では、一般的なカボチャ植物（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍａｘｉｍａ）を、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上記実施例３参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で、配列番号１に示すシロイヌナズナＧＰＴの全長コード配列によって形質転換した。また、当該カボチャ植物を、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のベクターコンストラクト）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号６に示すシロイヌナズナＧＳ１のコード配列によって形質転換した。この形質転換には、基本的には上述した実施例１４に示されるように、生育中のカボチャへの、接種によるアグロバクテリウムを介在した転移を用いた。トランスジェニックのカボチャ植物とコントロールのカボチャ植物とは、コントロール植物に花芽が現れるまで同一の条件下で生育し、その後、開花状況およびバイオマスの総量に関して、すべての植物を特徴づけた。 <Example 15: Production of a double transgenic pumpkin plant having Arabidopsis GS1 and GPT transgenes>
In this example, a general pumpkin plant (Cucurbita maxima) was transformed with the full-length coding sequence of Arabidopsis GPT shown in SEQ ID NO: 1 under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above). did. Further, the pumpkin plant was transformed with the coding sequence of Arabidopsis GS1 shown in SEQ ID NO: 6 under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201 (vector construct of SEQ ID NO: 6). For this transformation, basically Agrobacterium-mediated transfer by inoculation to a growing pumpkin was used as shown in Example 14 above. Transgenic and control pumpkin plants were grown under identical conditions until flower buds appeared in the control plants, and then all plants were characterized with respect to flowering status and total biomass.

その結果を図１７および表ＸＩＩに示す。表ＸＩＩに関して、トランスジェニック植物は、コントロール植物と比較して葉の植物バイオマスが実質的に増加を示し、平均して６７％バイオマス量が増加した。さらに、コントロールと比較して花芽の収量の増加は、５つのトランスジェニック系統のうち４つのトランスジェニック系統でみられた。コントロール植物は、サクリファイスでわずか４つの芽を示した（平均）。これに対し、４つのトランスジェニック植物の系統では、１つの植物あたり、８から１５個の芽を示し、２から約４倍の増加を示した。 The results are shown in FIG. 17 and Table XII. With respect to Table XII, transgenic plants showed a substantial increase in leaf plant biomass compared to control plants, with an average 67% increase in biomass. In addition, an increase in flower bud yield was seen in 4 of the 5 transgenic lines compared to the control. Control plants showed only 4 buds on sacrificial (average). In contrast, the four transgenic plant lines showed 8 to 15 shoots per plant, showing an increase of 2 to about 4-fold.

図１７（トランスジェニックカボチャ植物をコントロール植物と比較した写真）に関して、トランスジェニックカボチャ植物は、コントロール植物と比較して、植物の大きさ、バイオマスならびに葉の大きさおよび数の十分な増加を示す。 With respect to FIG. 17 (a photograph comparing a transgenic pumpkin plant with a control plant), the transgenic pumpkin plant shows a sufficient increase in plant size, biomass and leaf size and number compared to the control plant.

＜実施例１６：シロイヌナズナＧＳ１およびＧＰＴ導入遺伝子を持つダブルトランスジェニックシロイヌナズナ植物の作成＞
本実施例では、シロイヌナズナ植物（Arabidopsis thaliana）を、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上記実施例３参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で配列番号１８に示すトランケートされたシロイヌナズナＧＰＴのコード配列によって形質転換し、その後、トランスジェニック植物を発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のベクターコンストラクト）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号６のシロイヌナズナＧＳ１コード配列によって形質転換した。この形質転換には、（Harrison et al., 2006, Plant Methods 2:19-23; Clough and Bent, 1998, Plant J. 16:735-743）に記載のアグロバクテリウムを介在した「フローラルディップ法」を用いた。ＧＰＴを有するアグロバクテリウムのベクターｐＭＯＮ３１６、およびＧＳ１を有するｐＣａｍｂｉａ１２０１はそれぞれ、実施例３および１１に記載したとおりに準備した。 <Example 16: Production of double transgenic Arabidopsis plants having Arabidopsis GS1 and GPT transgenes>
In this example, an Arabidopsis thaliana plant was transformed with the truncated Arabidopsis GPT coding sequence shown in SEQ ID NO: 18 under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above), The transgenic plants were then transformed with the Arabidopsis GS1 coding sequence of SEQ ID NO: 6 under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201 (vector construct of SEQ ID NO: 6). This transformation involves Agrobacterium-mediated “floral dip method” described in (Harrison et al., 2006, Plant Methods 2: 19-23; Clough and Bent, 1998, Plant J. 16: 735-743). Was used. Agrobacterium vector pMON316 with GPT and pCambia 1201 with GS1 were prepared as described in Examples 3 and 11, respectively.

ｐＭｏｎ３１６＋シロイヌナズナＧＰＴコンストラクトまたはＣａｍｂｉａ１２０１＋シロイヌナズナＧＳコンストラクトのいずれかによる２つの異なるアグロバクテリウム培地の形質転換は、ウェイゲルアンドグレイズブルック２００２の方法を用いたエレクトロポレーションにより行なった。そして、形質転換したアグロバクテリウムを、抗生物質による選択下で生育させ、抗生物質を含むＬＢ培養液中で再懸濁された遠心分離により集菌し、シロイヌナズナの花部のフローラルディップ法に用いた。フローラルディップされたシロイヌナズナ植物を、成熟期まで生育させ、自家受粉させて種子を回収した。２度浸漬した植物からの種子を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む培地にまず播種し、次いで生存している苗を通常の選抜方法で、２０μｇのハイグロマイシンを含んだ培地に移した。両方の抗生物質における選抜工程を生き残った植物（３）を自家受粉させて、種子を回収した。Ｔ₁世代からの種子を２０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＭＳ培地で発芽させて、生き残った苗を成熟期まで生育して自家受精させて、種子を回収した。この種子団のＴ₂世代を、その後の生育調査に用いた。 Transformation of two different Agrobacterium media with either pMon316 + Arabidopsis GPT construct or Cambia 1201+ Arabidopsis GS construct was performed by electroporation using the method of Wegel and Glazebrook 2002. The transformed Agrobacterium is grown under selection with antibiotics, collected by centrifugation resuspended in an LB medium containing antibiotics, and used for the floral dip method of Arabidopsis flower parts. It was. Floral-dipped Arabidopsis plants were grown to maturity and self-pollinated to recover seeds. Seeds from twice soaked plants were first sown in a medium containing 20 μg / ml kanamycin, and then the surviving seedlings were transferred to a medium containing 20 μg hygromycin by a normal selection method. Plants (3) that survived the selection process for both antibiotics were self-pollinated and seeds were collected. Seeds from the T ₁ generation were germinated in MS medium containing 20 μg / ml hygromycin, and the surviving seedlings were grown to maturity and allowed to self-fertilize, and the seeds were collected. The T ₂ generation of the seed group, was used for the subsequent growth survey.

その結果を、図１８および表ＸＩＩＩに示す。表ＸＩＩＩ（６つの野生型および６つのトランスジェニックシロイヌナズナ植物のデータ（平均）を示す）に関して、トランスジェニック植物はともに増加したレベルのＧＰＴ活性およびＧＳ活性を示した。ＧＰＴ活性はコントロール植物より２０倍以上高かった。さらに、トランスジェニック植物の葉の生体重の平均値は、野生型コントロール植物の平均値の４倍以上であった。同一の条件下で生育した野生型コントロールのシロイヌナズナ植物と比較した若い導入遺伝子シロイヌナズナ植物の写真を図１８に示す。トランスジェニック植物において、この若い導入遺伝子シロイヌナズナ植物はコントロール植物に対して一貫した非常に顕著な増加を示す。 The results are shown in FIG. 18 and Table XIII. With respect to Table XIII (representing data (average) for 6 wild-type and 6 transgenic Arabidopsis plants), both transgenic plants showed increased levels of GPT and GS activity. GPT activity was more than 20 times higher than control plants. Furthermore, the average value of the living weight of the leaves of the transgenic plant was 4 times or more the average value of the wild type control plant. A photograph of a young transgene Arabidopsis plant compared to a wild-type control Arabidopsis plant grown under the same conditions is shown in FIG. In transgenic plants, this young transgene Arabidopsis plant shows a consistent and very significant increase over control plants.

＜実施例１７：シロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳ１導入遺伝子を持つトランスジェニックトマト植物の作成＞
本実施例では、トマト植物（Solanum lycopersicon,品種「マネーメーカー（money maker）」）を、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上記実施例３参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で、配列番号１に示すシロイヌナズナＧＰＴの全長コード配列を形質転換し、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のベクターコンストラクト）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号６のシロイヌナズナＧＳ１コード配列を形質転換した。１種類の導入遺伝子（ＧＰＴ）のトランスジェニックトマト植物を作製し、基本的には実施例４に記載したように開花するまで生育した。そして、直接的な花への注入（実施例８で説明したように）によるアグロバクテリウムを介在した転移によって、シロイヌナズナＧＳ１導入遺伝子をシングルトランスジーンＴ0植物に導入した。トランスジェニックおよびコントロールのトマト植物を同一の条件下で生育し、生育表現型の特性について評価した。得られたＴ0二重導入遺伝子植物を成熟期まで成長させ、コントロールのトマト植物とともに撮影し、表現型の評価をした。 <Example 17: Production of transgenic tomato plant having Arabidopsis GPT and GS1 transgene>
In this example, a tomato plant (Solanum lycopersicon, variety “money maker”) is transformed into an Arabidopsis GPT shown in SEQ ID NO: 1 under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above). Was transformed into the Arabidopsis GS1 coding sequence of SEQ ID NO: 6 under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201 (vector construct of SEQ ID NO: 6). One kind of transgene (GPT) transgenic tomato plant was produced and basically grown until flowering as described in Example 4. The Arabidopsis GS1 transgene was then introduced into a single transgene T0 plant by Agrobacterium-mediated transfer by direct flower injection (as described in Example 8). Transgenic and control tomato plants were grown under identical conditions and evaluated for growth phenotypic characteristics. The resulting T0 double transgene plant was grown to maturity, photographed with a control tomato plant, and evaluated for phenotype.

その結果を、図１９および表ＩＸＸに示す。表ＩＸＸに関して、二重導入遺伝子トマト植物は、コントロール植物と比較して、葉の植物バイオマスの十分な増加を示し、平均して４５％のバイオマス量の増加を示した。さらに、コントロール植物と比較したトランスジェニック系統では、トマトの果実の収穫量において７０％の増加がみられた（例えば、系統４Ｃからは５１個のトマトが収穫されたが、対してコントロール植物からは平均約３０個のトマトが収穫された）。非常に高いレベルのＧＰＴ活性が、トランスジェニック植物においてみられた（例えば、系統４Ｃは、コントロール植物で測定したＧＰＴ活性の平均値と比較して、およそ３２倍高いＧＰＴ活性を示している）。また、ＧＳ活性は、コントロール植物と比較してトランスジェニック植物では高かった（系統４Ｃでは、ほぼ２倍）。 The results are shown in FIG. 19 and Table IXX. With respect to Table IXX, the double transgene tomato plants showed a sufficient increase in leaf plant biomass compared to the control plants, with an average increase in biomass content of 45%. In addition, the transgenic lines compared to the control plants showed a 70% increase in tomato fruit yield (eg, 51 tomatoes were harvested from line 4C, whereas the control plants did not. An average of about 30 tomatoes was harvested). A very high level of GPT activity was found in the transgenic plants (eg, line 4C shows approximately 32 times higher GPT activity compared to the mean value of GPT activity measured in control plants). In addition, the GS activity was higher in the transgenic plant than in the control plant (almost twice in the line 4C).

生育表現型、および図１９に関して、トランスジェニックトマト植物は、コントロール植物と比較して実質的により大きなレベルを示した（図１９Ａ）。さらに、トランスジェニックトマト植物は、実質的により大きく、高く、また、優れた総バイオマスであった（図１９Ｂ参照）。 With respect to the growth phenotype, and FIG. 19, transgenic tomato plants showed substantially greater levels compared to control plants (FIG. 19A). Furthermore, the transgenic tomato plants were substantially larger, taller, and excellent total biomass (see FIG. 19B).

＜実施例１８：シロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳ１導入遺伝子を持つトランスジェニックアマナズナ植物の作成＞
本実施例では、カメリナ植物（Ｃａｍｅｌｉｎａｓａｔｉｖａ，ＶａｒＭＴ３０３）を、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号１に示すシロイヌナズナＧＰＴの全長コード配列によって形質転換し、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号６のシロイヌナズナＧＳ１コード配列を形質転換した。この形質転換は、Chee et al., 1989, Plant Physiol. 91: 1212-1218に記載の方法に従って、アグロバクテリウムを介在した発芽種子への転移によって行なった。
アグロバクテリウムベクターおよび混合物を、上記の実施例１１に記載したように、種子播種のために準備した。 <Example 18: Production of transgenic Amanazuna plants having Arabidopsis GPT and GS1 transgenes>
In this example, a camelina plant (Camelina sativa, Var MT 303) was transformed with the full-length coding sequence of Arabidopsis GPT shown in SEQ ID NO: 1 under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201, and the expression vector pCambia 1201 The Arabidopsis GS1 coding sequence of SEQ ID NO: 6 was transformed under the control of the RuBisCo promoter. This transformation was performed by Agrobacterium-mediated transfer to germinated seeds according to the method described in Chee et al., 1989, Plant Physiol. 91: 1212-1218.
The Agrobacterium vector and mixture was prepared for seed sowing as described in Example 11 above.

トランスジェニックおよびコントロールのカメリナ植物を、同一の条件下（生育室で３０日間、その後温室栽培に移した）で３９日間生育させ、バイオマス、生育特性および開花状態について評価した。 Transgenic and control camelina plants were grown for 39 days under the same conditions (30 days in growth room then transferred to greenhouse) and evaluated for biomass, growth characteristics and flowering status.

その結果を、表ＸＸおよび図２０に示す。表ＸＸに関して、トランスジェニック植物の総バイオマスは、平均で、コントロール植物のバイオマスのほぼ２倍であったことがみてとれる。また、草冠の直径はトランスジェニック植物で顕著に向上した。図２０は、コントロールと比較したトランスジェニックアマナズナの写真を示す。トランスジェニック植物は、著しく大きく、より促進された開花状態を示す。 The results are shown in Table XX and FIG. With regard to Table XX, it can be seen that the total biomass of the transgenic plants on average was approximately twice that of the control plants. Moreover, the diameter of the canopy was significantly improved in the transgenic plants. FIG. 20 shows a photograph of the transgenic Amanazuna compared to the control. Transgenic plants are significantly larger and exhibit a more accelerated flowering state.

＜実施例１９：植物体におけるオオムギＧＰＴ導入遺伝子の活性＞
本実施例では、オオムギのＧＰＴの推定コード配列を、植物体への一過性発現アッセイによって導入遺伝子コンストラクトから単離し、発現させた。生物学的に活性な組換えオオムギＧＰＴが生成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。 <Example 19: Activity of barley GPT transgene in plants>
In this example, the predicted coding sequence of barley GPT was isolated and expressed from the transgene construct by a transient expression assay in plants. Biologically active recombinant barley GPT was generated and confirmed by HPLC to catalyze increased synthesis of 2-oxoglutaramate.

オオムギ（Hordeum vulgare）ＧＰＴのコード配列を決定し、合成した。この実施例で用いるオオムギＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１４に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。 The coding sequence of barley (Hordeum vulgare) GPT was determined and synthesized. The DNA sequence of the barley GPT coding sequence used in this example is shown in SEQ ID NO: 14, and the amino acid sequence of the encoded GPT protein is shown in SEQ ID NO: 15.

オオムギＧＰＴのコード配列を１３０５．１Ｃａｎｂｉａベクターに挿入し、標準的なエレクトロポレーション法（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株のＬＢＡ４０４に形質転換し、ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢプレートに塗り広げた。アグロバクテリウムの抗生物質耐性コロニーを解析のために選択した。 The barley GPT coding sequence was inserted into the 1305.1 Canbia vector and inserted into the Agrobacterium tumefaciens strain LBA404 using standard electroporation methods (McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9: 155-159). The cells were transformed and spread on LB plates containing hygromycin (50 μg / ml). Antibiotic resistant colonies of Agrobacterium were selected for analysis.

タバコ葉の一過性発現アッセイは、形質転換したアグロバクテリウム（１．５−２．０ＯＤ₆₅₀）の懸濁液を、急速に成長するタバコ葉へ注入することから成る。皮内注射は有意な量の葉の表面がアグロバクテリウムにさらされることを確実にするため、葉の表面にわたる格子内で行った。植物を３−５日間生育させて、組織を他の全ての組織抽出で説明したように抽出し、ＧＰＴ活性を測定した。 The tobacco leaf transient expression assay consists of injecting a suspension of transformed Agrobacterium (1.5-2.0 OD ₆₅₀ ) into rapidly growing tobacco leaves. Intradermal injection was performed in a lattice across the leaf surface to ensure that a significant amount of the leaf surface was exposed to Agrobacterium. Plants were grown for 3-5 days and tissues were extracted as described for all other tissue extractions and GPT activity was measured.

接種した葉の組織のＧＰＴ活性（１２１７ｎｍｏｌ／ｇＦＷｔ／ｈ）は、コントロール植物の葉の組織で測定した活性（４０７ｎｍｏｌ／ｇＦＷｔ／ｈ）の３倍であり、ダイズ（Hordeum）ＧＰＴコンストラクトはトランスジェニック植物において機能的なＧＰＴを直接発現することができることを示した。 The GPT activity (1217 nmol / g FWt / h) of the inoculated leaf tissue is 3 times the activity measured in the leaf tissue of the control plant (407 nmol / g FWt / h), and the soybean (Hordeum) GPT construct is a transgenic plant. It was shown that functional GPT can be expressed directly.

＜実施例２０：組換えイネＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、イネのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的に活性な組換えイネＧＰＴが作成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。 <Example 20: Isolation and expression of recombinant rice GPT gene coding sequence and analysis of biological activity>
In this example, a putative coding sequence for rice GPT was isolated and expressed in E. coli. Biologically active recombinant rice GPT was generated and confirmed by HPLC to catalyze increased synthesis of 2-oxoglutaramate.

〔材料と方法〕
（イネＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
イネ（Oryza sativia）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで成長させて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して集菌した。そして、合計２５×１０⁶個の細胞の生物学的活性に関して、以下のＮＭＲアッセイによって分析した。形質転換していない野生型の大腸菌細胞をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。 [Materials and methods]
(Rice GPT coding sequence and expression in E. coli)
The rice (Oryza sativia) GPT coding sequence was determined, synthesized, introduced into a PET28 vector, and expressed in E. coli. That is, Escherichia coli cells were transformed with an expression vector, a transformant cultured overnight in an LB medium was diluted, grown to OD0.4, and induced with isopropyl-β-D-thiogalactoside (0.4 μM). And then collected by culturing for 3 hours. The biological activity of a total of 25 × 10 ⁶ cells was then analyzed by the following NMR assay. Untransformed wild type E. coli cells were analyzed as controls. For additional controls, E. coli cells transformed with an empty vector were used.

本実施例で用いるイネＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１０に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。 The DNA sequence of the rice GPT coding sequence used in this example is shown in SEQ ID NO: 10, and the amino acid sequence of the encoded GPT protein is shown in SEQ ID NO: 11.

（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809の変性に続いて、ＨＰＬＣを用いてＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞における２−オキソグルタラメートの産生量を測定した。つまり、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、２０μＭピリドキサルリン酸、１０ｍＭシステインおよび〜１．５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールを含む変性抽出バッファーを用いた。サンプル（大腸菌細胞２５×１０⁶個の溶菌液）を抽出バッファーに約１／３比率（ｗ／ｖ）で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、２００μＭの２０％ＴＣＡで停止した。約５分後、アッセイ溶液を遠心分離し、上清を用いて、０．０１Ｎｈ２ＳＯ４の移動相、流速約０．２ｍｌ／分、４０℃においてＩＯＮ−３００７．８ｍｍＩＤＸ３０ｃｍＬｃｏｌｕｍｎを用いたＨＰＬＣにより、２−オキソグルタラメートを定量した。注入量は約２０μｌであり、保持時間はおよそ３８分から３９分である。検出は２１０ｎｍのＵＶ光で行なった。 (HPLC assay of 2-oxoglutaramate)
Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161 (2): Following denaturation of 807-809, the amount of 2-oxoglutaramate produced in E. coli cells overexpressing GPT was measured using HPLC. That is, a denatured extraction buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 20 μM pyridoxal phosphate, 10 mM cysteine and ˜1.5% (v / v) mercaptoethanol was used. Samples (25 × 10 ⁶ lysates of E. coli cells) were added to the extraction buffer at about 1/3 ratio (w / v), incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and stopped with 200 μM 20% TCA. After about 5 minutes, the assay solution is centrifuged and the supernatant is used with a mobile phase of 0.01N h2SO4, a flow rate of about 0.2 ml / min, and ION-300 7.8 mm ID X 30 cm L column at 40 ° C. 2-oxoglutaramate was quantified by HPLC. The injection volume is about 20 μl and the retention time is approximately 38 to 39 minutes. Detection was performed with 210 nm UV light.

標準の２−オキソグルタラメートとのＮＭＲアッセイの比較は、シロイヌナズナの全長配列が、２−オキソグルタラメート合成活性を持つＧＰＴを発現することを立証するために用いた。つまり、アッセイの産物（発現ＧＰＴに対する応答において合成された分子）および標準の２−オキソグルタラメートが同じ保持時間で溶出することを確認することによって、上記のＨＰＬＣアッセイを有効なものとするために、化学的合成により標準の２−オキソグルタラメート（ＮＭＲで確認した構造）を作製した。加えて、アッセイ産物および標準の化合物を共に混合すると単一のピークとして溶出した。さらに、ＨＰＬＣアッセイの有効化は、基質であるグルタミンの消失のモニタリングおよびグルタミンの消費と２−オキソグルタラメートの生成との間に１：１のモル比があることを示すことも含んでいた。分析の工程には常に２つのコントロールを含んでおり、１つは酵素の添加がなく、１つはグルタミンの添加がない。第一に、２−オキソグルタラメートの生成物は酵素の存在に依存することを示し、第二に２−オキソグルタラメートの生成は基質であるグルタミンに依存することを示す。 Comparison of NMR assay with standard 2-oxoglutaramate was used to demonstrate that the full-length Arabidopsis thaliana sequence expresses GPT with 2-oxoglutaramate synthesis activity. That is, to validate the above HPLC assay by confirming that the product of the assay (molecule synthesized in response to expressed GPT) and standard 2-oxoglutaramate elute with the same retention time. In addition, standard 2-oxoglutaramate (structure confirmed by NMR) was prepared by chemical synthesis. In addition, the assay product and standard compound were mixed together and eluted as a single peak. In addition, validation of the HPLC assay included monitoring the disappearance of the substrate glutamine and showing that there was a 1: 1 molar ratio between glutamine consumption and 2-oxoglutaramate production. . The analytical process always includes two controls, one with no enzyme added and one with no glutamine added. First, it shows that the product of 2-oxoglutaramate is dependent on the presence of the enzyme, and secondly, the production of 2-oxoglutaramate is dependent on the substrate glutamine.

（結果）
配列番号１０のイネＧＰＴコード配列の発現は、２−オキソグルタラメート合成触媒の生物学的活性を持つ組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、１．７２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が組換えイネＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、８６倍の活性レベルの増加がみられた。 (result)
Expression of the rice GPT coding sequence of SEQ ID NO: 10 resulted in overexpression of a recombinant GPT protein having the biological activity of 2-oxoglutaramate synthesis catalyst. In particular, 1.72 nmol of 2-oxoglutaramate activity was found in E. coli cells overexpressing recombinant rice GPT, and only 0.02 nmol of 2-oxoglutaramate activity in control E. coli cells. Compared to the above, an 86-fold increase in activity level was observed.

＜実施例２１：組換えダイズＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、ダイズのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的に活性な組換えダイズＧＰＴが生成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。 <Example 21: Isolation and expression of recombinant soybean GPT gene coding sequence and analysis of biological activity>
In this example, a putative coding sequence for soybean GPT was isolated and expressed in E. coli. Biologically active recombinant soybean GPT was produced and confirmed by HPLC to catalyze increased synthesis of 2-oxoglutaramate.

（材料と方法）
（ダイズＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
ダイズ（Glycine max）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０⁶個の細胞により、下記のＮＭＲアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターを形質転換した大腸菌細胞を用いた。 (Materials and methods)
(Soybean GPT coding sequence and expression in E. coli)
The GPT coding sequence of soybean (Glycine max) was determined, synthesized, introduced into the PET28 vector, and expressed in E. coli. That is, E. coli cells were transformed with an expression vector, a transformant cultured overnight in an LB medium was diluted, cultured to OD0.4, and induced with isopropyl-β-D-thiogalacside (0.4 μM). The cells were cultured for 3 hours and collected. A total of 25 × 10 ⁶ cells were analyzed for biological activity using the NMR assay described below. Untransformed wild type E. coli was analyzed as a control. For additional controls, E. coli cells transformed with an empty vector were used.

本実施例で用いるダイズＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１２に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。 The DNA sequence of the coding sequence of soybean GPT used in this example is shown in SEQ ID NO: 12, and the amino acid sequence of the encoded GPT protein is shown in SEQ ID NO: 13.

（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
上記の実施例２０に記載したように、ＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞における２−オキソグルタラメートの生成を判定するためにＨＰＬＣを用いた。 (HPLC assay of 2-oxoglutaramate)
As described in Example 20 above, HPLC was used to determine the production of 2-oxoglutaramate in E. coli cells overexpressing GPT.

（結果）
配列番号１２のダイズＧＰＴコード配列の発現は２−オキソグルタラメート合成触媒の生物学的に活性な組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、３１．９ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が組換えダイズＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、１６００倍近くの活性レベルの増加がみられた。 (result)
Expression of the soybean GPT coding sequence of SEQ ID NO: 12 resulted in overexpression of the biologically active recombinant GPT protein of the 2-oxoglutaramate synthesis catalyst. In particular, 31.9 nmol of 2-oxoglutaramate activity was found in E. coli cells overexpressing recombinant soybean GPT, and only 0.02 nmol of 2-oxoglutaramate activity in control E. coli cells. Compared to the above, an increase in activity level nearly 1600 times was observed.

＜実施例２２：組換えゼブラフィッシュＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、ゼブラフィッシュのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的活性のある組換えゼブラフィッシュＧＰＴが作成され、ＮＭＲで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。 <Example 22: Isolation and expression of recombinant zebrafish GPT gene coding sequence and analysis of biological activity>
In this example, the predicted coding sequence of zebrafish GPT was isolated and expressed in E. coli. Biologically active recombinant zebrafish GPT was generated and confirmed by NMR to catalyze increased synthesis of 2-oxoglutaramate.

（材料と方法）
（ゼブラフィッシュＧＰＴコード配列および大腸菌における発現）
ゼブラフィッシュ（Danio rerio）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０⁶個の細胞により、下記のＮＭＲアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。 (Materials and methods)
(Zebrafish GPT coding sequence and expression in E. coli)
The zebrafish (Danio rerio) GPT coding sequence was determined, synthesized, introduced into the PET28 vector and expressed in E. coli. That is, E. coli cells were transformed with an expression vector, a transformant cultured overnight in an LB medium was diluted, cultured to OD0.4, and induced with isopropyl-β-D-thiogalacside (0.4 μM). The cells were cultured for 3 hours and collected. A total of 25 × 10 ⁶ cells were analyzed for biological activity using the NMR assay described below. Untransformed wild type E. coli was analyzed as a control. For additional controls, E. coli cells transformed with an empty vector were used.

この実施例で用いるゼブラフィッシュＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１６に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。 The DNA sequence of the coding sequence of zebrafish GPT used in this example is shown in SEQ ID NO: 16, and the amino acid sequence of the encoded GPT protein is shown in SEQ ID NO: 17.

（結果）
配列番号１６のゼブラフィッシュＧＰＴコード配列の発現は２−オキソグルタラメート合成触媒の生物学的活性を持つ組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、２８．６ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が組換えゼブラフィッシュＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、１４００倍以上の活性レベルの増加がみられた。 (result)
Expression of the zebrafish GPT coding sequence of SEQ ID NO: 16 resulted in overexpression of a recombinant GPT protein with the biological activity of 2-oxoglutaramate synthesis catalyst. In particular, 28.6 nmol of 2-oxoglutaramate activity was observed in E. coli cells overexpressing recombinant zebrafish GPT, and only 0.02 nmol of 2-oxoglutaramate in control E. coli cells. Compared to the activity, the activity level increased by 1400 times or more.

＜実施例２３：トランケートされた組換えシロイヌナズナＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
この実施例では、シロイヌナズナのＧＰＴの推定コード配列の異なる２つの断片を構築し、推定される葉緑体のシグナルペプチドが欠失しているまたはトランケートされたＧＰＴタンパク質の活性を評価するために、大腸菌で発現させた。最初の３０個のアミノ末端のアミノ酸残基または最初の４５個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失するようにトランケートされた、シロイヌナズナＧＰＴの全長アミノ酸配列の配列番号１に対応するトランケートされた組換えＧＰＴタンパク質は、無事に発現し、ＮＭＲで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒する生物学的活性を示した。 Example 23: Isolation and expression of truncated recombinant Arabidopsis GPT gene coding sequence and analysis of biological activity
In this example, to construct two different fragments of the predicted coding sequence of Arabidopsis GPT and to evaluate the activity of a truncated or truncated GPT protein lacking the putative chloroplast signal peptide, It was expressed in E. coli. A truncated set corresponding to SEQ ID NO: 1 of the full-length amino acid sequence of Arabidopsis GPT truncated to delete the first 30 amino-terminal amino acid residues or the first 45 amino-terminal amino acid residues The modified GPT protein was successfully expressed and confirmed by NMR to show biological activity catalyzing increased synthesis of 2-oxoglutaramate.

（材料と方法）
（トランケートされたシロイヌナズナＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
配列番号１のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のＧＰＴコード配列の断片のＤＮＡコード配列を構築し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。本実施例で用いたトランケートされたシロイヌナズナＧＰＴコード配列のＤＮＡ配列を配列番号２０（−４５ＡＡコンストラクト）に示し、対応するトランケートされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０⁶個の細胞により、実施例２０に記載したように、ＨＰＬＣアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。 (Materials and methods)
(Truncated Arabidopsis GPT coding sequence and expression in E. coli)
A DNA coding sequence of the Arabidopsis thaliana GPT coding sequence fragment of SEQ ID NO: 1 was constructed, synthesized, introduced into a PET28 vector and expressed in E. coli. The DNA sequence of the truncated Arabidopsis GPT coding sequence used in this example is shown in SEQ ID NO: 20 (-45AA construct), and the amino acid sequence of the corresponding truncated GPT protein is shown in SEQ ID NO: 21. That is, E. coli cells were transformed with an expression vector, a transformant cultured overnight in an LB medium was diluted, cultured to OD0.4, and induced with isopropyl-β-D-thiogalacside (0.4 μM). The cells were cultured for 3 hours and collected. A total of 25 × 10 ⁶ cells were analyzed for biological activity using an HPLC assay as described in Example 20. Untransformed wild type E. coli was analyzed as a control. For additional controls, E. coli cells transformed with an empty vector were used.

配列番号２０のトランケートされた−４５のシロイヌナズナＧＰＴコード配列の発現は、生物学的活性（２−オキソグルタラメートの合成を触媒する生物学的活性）を持つ、組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、１６．１ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性がトランケートされた−４５のＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、８００倍以上の活性レベルの増加がみられた。比較として、同じＥ．ｃｏｌｉで発現するシロイヌナズナ遺伝子の全長コード配列では、２．８ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が生じ、トランケートされた組換えＧＰＴタンパク質のおよそ１／５の活性がみられた。 Expression of the truncated -45 Arabidopsis GPT coding sequence of SEQ ID NO: 20 refers to overexpression of recombinant GPT protein with biological activity (biological activity catalyzing the synthesis of 2-oxoglutaramate). The result was. In particular, the activity of 16.1 nmol of 2-oxoglutaramate was found in E. coli cells overexpressing truncated -45 GPT, and only 0.02 nmol of 2-oxoglutaramate in control E. coli cells. Compared to the activity of the mate, the activity level increased by 800 times or more. For comparison, the same E.I. In the full-length coding sequence of the Arabidopsis gene expressed in E. coli, 2.8 nmol of 2-oxoglutaramate was generated, and approximately 1/5 of the activity of the truncated recombinant GPT protein was observed.

＜実施例２４：ＧＰＴ＋ＧＳトランスジェニックタバコの種子の高い塩濃度の発芽耐性＞
本実施例では、二重導入遺伝子タバコの系統ＸＸ−３（表４の交雑３、実施例７参照）を、高い塩濃度への耐性を評価するために設計した種子発芽アッセイにおいて試験した。 <Example 24: Germination tolerance of GPT + GS transgenic tobacco seeds with high salt concentration>
In this example, the double transgene tobacco line XX-3 (see cross 3 in Table 4, see Example 7) was tested in a seed germination assay designed to assess tolerance to high salt concentrations.

＜材料と方法＞
野生型およびＸＸ−３集団からのタバコ種子を表面殺菌し（５％漂白液に５分間、次いで１０％エタノールで３分間洗浄）、滅菌蒸留水で洗浄処理した。その後、表面殺菌した種子を、スクロースを含まず、０か、または２００ｍＭのＮａＣｌを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ培地（１０％アガロース）に拡散した。これらの種子を暗所で２日間、次いで１６：８の光周期で６日間置いて（２４Ｃで）発芽させた。８日目に、発芽速度を、発芽したコントロールまたはトランスジェニック植物からの種子の割合を測定して決定した。 <Materials and methods>
Tobacco seeds from wild type and XX-3 populations were surface sterilized (washed in 5% bleach for 5 minutes, then 10% ethanol for 3 minutes) and washed with sterile distilled water. The surface sterilized seeds were then diffused into Murashige and Skog medium (10% agarose) containing no sucrose and containing 0 or 200 mM NaCl. These seeds were allowed to germinate (at 24C) for 2 days in the dark and then 6 days with a 16: 8 photoperiod. On day 8, the germination rate was determined by measuring the percentage of seeds from the germinated control or transgenic plants.

＜結果＞
その結果を、下記の表ＸＸＩに示す。無塩条件におけるトランスジェニック植物の系統の種子の発芽速度は、コントロール植物の種子でみられるものと同じであった。著しく対照的に、高塩濃度条件におけるトランスジェニック植物系統の種子の発芽速度は、野生型のコントロールの種子でみられた速度をはるかに上回っていた。トランスジェニック植物の種子の８１％以上が高塩濃度下で発芽したが、野生型のコントロール植物の種子は同時点でわずか９％しか発芽しなかった。これらのデータは、トランスジェニックの種子が、高塩濃度下で非常によく発芽する能力があることを示しており、水および／または土壌の塩分が高さを増す地域における植物の生育のために重要な特性である。 <Result>
The results are shown in Table XXI below. Seed germination rates of transgenic plant lines under salt-free conditions were the same as those seen with control plant seeds. In striking contrast, the germination rate of the transgenic plant line seeds at high salt conditions was much higher than that seen with the wild type control seeds. More than 81% of the seeds of the transgenic plants germinated under high salt concentrations, while the seeds of the wild type control plants germinated only 9% at the same time. These data indicate that the transgenic seeds have the ability to germinate very well under high salt concentrations, for the growth of plants in areas where water and / or soil salinity increases. It is an important characteristic.

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この発明は本明細書で明らかにされた具体例によって範囲を限定されるものではなく、具体例は発明の個々の態様の一例とする意図であり、機能的に同等のものはいずれも発明の範囲内である。本明細書に記載されたもの加えて、発明のモデルおよび方法の様々な変更が前記の説明および手引きから、当業者にとって明白になるであろうし、同様に発明の範囲に含まれることを意図する。そのような変更または他の具体例は、発明の正当な範囲および趣旨から離れることなく実施され得る。 The scope of the present invention is not limited by the specific examples disclosed in this specification, and the specific examples are intended to be examples of individual aspects of the invention. Within range. Various modifications of the inventive model and method, in addition to those described herein, will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and guidance and are intended to be within the scope of the invention as well. . Such changes or other embodiments may be practiced without departing from the proper scope and spirit of the invention.

〔配列表〕 [Sequence Listing]

窒素吸収および２−オキソグルタラメートの生合成の概略的な代謝経路を示す図である。FIG. 2 shows a schematic metabolic pathway of nitrogen absorption and 2-oxoglutaramate biosynthesis. 野生型のタバコ植物に対して、ＧＳ１またはＧＰＴのいずれかが過剰に発現しているトランスジェニックタバコ植物の比較を示す写真である。It is a photograph which shows the comparison of the transgenic tobacco plant which overexpresses either GS1 or GPT with respect to a wild-type tobacco plant. 野生型のトマト植物に対してＧＳ１またはＧＰＴのいずれかを過剰に発現するトランスジェニックミクロトームトマト植物の比較を示す写真である。FIG. 6 is a photograph showing a comparison of transgenic microtome tomato plants that overexpress either GS1 or GPT relative to wild-type tomato plants. 野生型のタバコ植物とＧＳ１またはＧＰＴトランスジェニックタバコ植物との葉の大きさの比較を示す写真である。It is a photograph which shows the comparison of the leaf size of a wild-type tobacco plant and a GS1 or GPT transgenic tobacco plant. 野生型のタバコ植物とＧＳ１またはＧＰＴトランスジェニックタバコ植物との葉の大きさの比較を示す写真である。It is a photograph which shows the comparison of the leaf size of a wild-type tobacco plant and a GS1 or GPT transgenic tobacco plant. ＧＳ１トランスジェニックタバコ系統とＧＰＴトランスジェニックタバコ系統との多様な交雑から生成されたトランスジェニックタバコ植物と、野生型の植物と、１種類の導入遺伝子植物との比較を示す写真である。It is a photograph showing a comparison between a transgenic tobacco plant generated from various crosses between a GS1 transgenic tobacco line and a GPT transgenic tobacco line, a wild type plant, and one type of transgene plant. ＧＳ１トランスジェニックタバコ系統とＧＰＴトランスジェニックタバコ系統との多様な交雑から生成されたトランスジェニックタバコ植物と、野生型の植物と、１種類の導入遺伝子植物との比較を示す写真である。It is a photograph showing a comparison between a transgenic tobacco plant generated from various crosses between a GS1 transgenic tobacco line and a GPT transgenic tobacco line, a wild type plant, and one type of transgene plant. ＧＳ１トランスジェニックタバコ系統とＧＰＴトランスジェニックタバコ系統との多様な交雑から生成されたトランスジェニックタバコ植物と、野生型の植物と、１種類の導入遺伝子植物との比較を示す写真である。It is a photograph showing a comparison between a transgenic tobacco plant generated from various crosses between a GS1 transgenic tobacco line and a GPT transgenic tobacco line, a wild type plant, and one type of transgene plant. 野生型の植物と、ＧＳ１およびＧＰＴを交雑したトランスジェニックタバコ植物との葉の大きさの比較を示す写真である。It is a photograph showing a comparison of leaf size between a wild type plant and a transgenic tobacco plant hybridized with GS1 and GPT. 野生型の植物と、ＧＳ１およびＧＰＴを交雑したトランスジェニックタバコ植物との葉の大きさの比較を示す写真である。It is a photograph showing a comparison of leaf size between a wild type plant and a transgenic tobacco plant hybridized with GS1 and GPT. トランスジェニックペッパー植物（右）および野生型のコントロールペッパー植物（左）の写真である。It is a photograph of a transgenic pepper plant (right) and a wild type control pepper plant (left). トランスジェニックマメ植物を野生型のコントロールマメ植物と比較したグラフである。It is the graph which compared the transgenic bean plant with the wild-type control bean plant. トランスジェニックマメ植物（右）および野生型のコントロールマメ植物（左）の写真である。It is a photograph of a transgenic bean plant (right) and a wild-type control bean plant (left). トランスジェニックマメ植物のさや、花および花芽を、野生型のコントロールマメ植物と比較したグラフである。It is the graph which compared the pod, the flower, and the flower bud of the transgenic bean plant with the wild-type control bean plant. トランスジェニックマメ植物（右）および野生型のコントロールマメ植物（左）の写真である。It is a photograph of a transgenic bean plant (right) and a wild-type control bean plant (left). トランスジェニックササゲ（Cowpea）系統Ａ植物を野生型のコントロールササゲ植物と比較したグラフである。FIG. 5 is a graph comparing transgenic cowpea (Cowpea) line A plants with wild type control cowpea plants. トランスジェニックササゲ系統Ａ植物を野生型のコントロールササゲ植物と比較したTransgenic cowpea line A plants were compared to wild type control cowpea plants トランスジェニックササゲ系統Ａ植物を野生型のコントロールササゲ植物と比較したTransgenic cowpea line A plants were compared to wild type control cowpea plants トランスジェニックササゲ系統Ａ植物（右）および野生型のコントロールササゲ植物（左）の写真である。It is a photograph of a transgenic cowpea strain A plant (right) and a wild type control cowpea plant (left). トランスジェニックササゲ系統Ｇ植物を野生型のコントロールササゲ植物と比較したグラフである。It is the graph which compared the transgenic cowpea system | strain G plant with the wild type control cowpea plant. トランスジェニックササゲ系統Ｇ植物を野生型のコントロールササゲ植物と比較したグラフである。It is the graph which compared the transgenic cowpea system | strain G plant with the wild type control cowpea plant. トランスジェニックササゲ系統Ｇ植物を野生型のコントロールササゲ植物と比較したグラフである。It is the graph which compared the transgenic cowpea system | strain G plant with the wild type control cowpea plant. トランスジェニックササゲ系統Ｇ植物（右）および野生型のコントロールササゲ植物（左）の写真である。It is a photograph of a transgenic cowpea line G plant (right) and a wild type control cowpea plant (left). トランスジェニックカンタループ（Cantaloupe）植物（右）および野生型のコントロールカンタループ植物（左）の写真である。It is a photograph of a transgenic cantaloupe plant (right) and a wild-type control cantaloupe plant (left). トランスジェニックカボチャ植物（右）および野生型のコントロールカンタループ植物（左）の写真である。It is a photograph of a transgenic pumpkin plant (right) and a wild-type control cantaloupe plant (left). トランスジェニックシロイヌナズナ植物（右）および野生型のコントロールシロイヌナズナ植物（左）の写真である。It is a photograph of transgenic Arabidopsis plants (right) and wild-type control Arabidopsis plants (left). シロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現しているトランスジェニックトマト植物を野生型のコントロールトマト植物と比較した写真である。It is the photograph which compared the transgenic tomato plant which expressed the transgene of Arabidopsis GPT and GS with the wild-type control tomato plant. シロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳの導入遺伝子を発現しているトランスジェニックトマト植物を野生型のコントロールトマト植物と比較した写真である。It is the photograph which compared the transgenic tomato plant which expressed the transgene of Arabidopsis GPT and GS with the wild-type control tomato plant. トランスジェニックカメリナ（Camelina）植物（右）および野生型のコントロールカメリナ植物（左）の写真である。It is a photograph of transgenic Camelina plants (right) and wild-type control camelina plants (left).

発明の詳細な説明Detailed Description of the Invention

一実施形態において、本発明は、ＧＰＴ導入遺伝子およびＧＳ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物であって、上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子は、植物プロモーターに操作可能に結合される、トランスジェニック植物を提供する。特定の実施形態において、上記ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１導入遺伝子である。別の特定の実施形態において、上記ＧＰＴ導入遺伝子は、（ａ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に示すアミノ酸配列、ならびに（ｂ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のいずれか１つと少なくとも７５％の同一性を有し、かつ、ＧＰＴ活性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。さらに別の特定の実施形態において、上記ＧＳ導入遺伝子は、（ａ）残基１１からの配列番号４および配列番号７に示すアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号４または配列番号７と少なくとも７５％の同一性のあるアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子は、植物のゲノムに取り込まれている。本発明に係るトランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得る。 In one embodiment, the present invention provides a transgenic plant comprising a GPT transgene and a GS transgene, wherein the GPT transgene and the GS transgene are operably linked to a plant promoter. provide. In certain embodiments, the GS transgene is a GS1 transgene. In another specific embodiment, the GPT transgene comprises (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, sequence SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36, and (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24 An amino acid having at least 75% identity with any one of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, and SEQ ID NO: 36, and having GPT activity A polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: In yet another specific embodiment, the GS transgene comprises (a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7 from residue 11, and (b) SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 7 and at least 75% encoding a polypeptide having an identity of an amino acid sequence, amino acid sequence selected from the group consisting of. In some embodiments, the GPT transgene and the GS transgene are incorporated into the genome of the plant. The transgenic plant according to the present invention may be a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.

用語「プロモーター」は、核酸制御配列または操作可能に結合された核酸の転写を方向づける配列を指す。本明細書において用いられるとき、「植物プロモーター」とは植物の中で機能するプロモーターである。プロモーターは、転写の開始領域（ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ因子など）付近の核酸配列を必然的に含む。また、プロモーターは、任意により、末端部のエンハンサー因子またはレセプター因子を含む。当該エンハンサー因子またはレセプター因子は、転写の開始領域からほぼ数千塩基対に配置され得る。「恒常的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下および発生条件下において活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境または発生調節下において活性なプロモーターである。用語「操作可能に結合された」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイ）と、第２の核酸配列との機能的な結合を指す。ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を方向づける。 The term “promoter” refers to a nucleic acid control sequence or sequence that directs transcription of an operably linked nucleic acid. As used herein, a “plant promoter” is a promoter that functions in plants. A promoter necessarily includes a nucleic acid sequence near the initiation region of transcription (such as a TATA factor in the case of a polymerase type II promoter). The promoter also optionally includes a terminal enhancer factor or receptor factor. The enhancer factor or receptor factor can be located approximately several thousand base pairs from the start region of transcription. A “constitutive” promoter is a promoter that is active under most environmental and developmental conditions. An “inducible” promoter is a promoter that is active under environmental or developmental regulation. The term “operably linked” refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters or transcription factor binding sites) and a second nucleic acid sequence. Here, the expression control sequence directs transcription of the nucleic acid corresponding to the second sequence.

用語「植物」は、植物全体、植物組織（例えば、葉、幹、花、根、生殖器官、胚芽およびそれらの一部など）、苗、種子および植物細胞、ならびにそれらの子孫を含む。本発明の方法に用いられ得る植物の分類は、通常、形質転換技術に影響を受け易い高等植物の分類と同様である。当該高等植物としては、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）および裸子植物が挙げられる。これらは、多様な倍数性段階（多数体、二倍体、半数体および半接合が挙げられる）の植物を含む。 The term “plant” includes whole plants, plant tissues (such as leaves, stems, flowers, roots , reproductive organs, germs and parts thereof ), seedlings, seeds and plant cells, and their progeny. The classification of plants that can be used in the method of the present invention is usually similar to the classification of higher plants that are susceptible to transformation techniques. Such higher plants include angiosperms (monocotyledons and dicotyledons) and gymnosperms. These include plants at various ploidy stages, including multiploid, diploid, haploid and hemizygous.

「ＧＳ導入遺伝子」は核酸分子であり、当該核酸分子を有するトランスジェニック植物または植物の胚、器官もしくは種子に対して外来性であるか、またはＧＳポリヌクレオチドを有するトランスジェニック植物の、祖先の植物または植物の胚、器官もしくは種子に対して外来性である、ＧＳポリヌクレオチドを含んでいる。「ＧＳ１導入遺伝子」は核酸分子であり、当該核酸分子を有するトランスジェニック植物または植物の胚、器官もしくは種子に対して外来性であるか、またはＧＳ１ポリヌクレオチドを有するトランスジェニック植物の祖先の、植物または植物の胚、器官若しくは種子に対して外来性であるＧＳ１ポリヌクレオチドを含んでいる。 A “GS transgene” is a nucleic acid molecule that is foreign to the embryo, organ or seed of a transgenic plant or plant having the nucleic acid molecule, or an ancestral plant of a transgenic plant having a GS polynucleotide. Or a GS polynucleotide that is foreign to the embryo, organ or seed of the plant. A “GS1 transgene” is a nucleic acid molecule, a plant that is foreign to the embryo, organ or seed of a transgenic plant or plant having the nucleic acid molecule, or is an ancestor of a transgenic plant having a GS1 polynucleotide Or a GS1 polynucleotide that is foreign to the embryo, organ or seed of the plant.

さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、オオムギ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１５および配列番号３４に示すオオムギＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドであり、ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１ポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１４に示す塩基配列；配列番号１４と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１５もしくは配列番号３４に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。 In yet another specific embodiment, the GPT transgene is a GPT polynucleotide encoding a barley-derived GPT (eg, barley GPTs shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 34), and the GS transgene is a GS1 polynucleotide. . This GPT transgene is a base sequence shown in SEQ ID NO: 14 ; a base sequence having at least 75% and more preferably at least 80% identity with SEQ ID NO: 14, and a base sequence encoding a polypeptide having GPT activity It may be encoded by a base sequence encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 34, or a polypeptide having at least 75% and more preferably at least 80% sequence identity and GPT activity therewith.

より具体的には、本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用するための核酸コンストラクトの基本要素は、以下である：形質転換植物細胞において（１つもしくは複数の）導入遺伝子の機能的な発現を促進することができる適切なプロモーター、このプロモーターに実施可能に連結された（１つもしくは複数の）導入遺伝子（すなわちＧＰＴコード配列）、好ましくは、この導入遺伝子に実施可能に連結された適切な転写終結配列（すなわちノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター）、およびときにこの導入遺伝子の発現を制御するために有用な他の要素、ならびに所望のトランスジェニック産物を選択するために適した１つ以上の選択マーカー遺伝子（すなわち抗生物質耐性遺伝子）。 More specifically, the basic elements of a nucleic acid construct for use in generating a transgenic plant according to the present invention are as follows: Functional expression of the transgene (s) in transformed plant cells A suitable promoter (s) operably linked to the promoter (or GPT coding sequence), preferably a suitable promoter operably linked to the transgene A transcription termination sequence (ie, a terminator of the nopaline synthase gene), and sometimes other elements useful for controlling the expression of this transgene, as well as one or more selections suitable for selecting the desired transgenic product Marker gene (ie antibiotic resistance gene).

本明細書において実証された実施形態（後述する実施例を参照）では、挿入される導入遺伝子をＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下に配置する発現ベクターが使用される。ＣａＭＶ３５ＳおよびＲｕＢｉｓＣｏプロモーターを利用する多数の発現ベクターが知られており、および／または市販されており、および／または通常の当業者によって導出できる。さらに、導入遺伝子の発現を導くために適した多くのプロモーターが知られており、後ほどさらに説明するように、本発明の実施に用いられ得る。 In the embodiments demonstrated herein (see the examples below), an expression vector is used in which the inserted transgene is placed under the control of the CaMV 35S promoter and the RuBisCo promoter. Numerous expression vectors utilizing the CaMV 35S and RuBisCo promoters are known and / or commercially available and / or can be derived by one of ordinary skill in the art. In addition, many promoters suitable for directing transgene expression are known and can be used in the practice of the invention, as further described below.

（植物プロモーター）
植物内で機能する多数のプロモーターが公知である。ＧＰＴおよびＧＳ導入遺伝子コンストラクトを構築する際、選択されるプロモーターは、恒常的な非特異的プロモーターであってもよく、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓリボソーマルプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）であってもよい。このプロモーターは、植物内における導入遺伝子の発現のために広く使用されている。他の強力な恒常的プロモーターの具体例は、限定されないが、イネのアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、Ｔｉプラスミドのノパリン合成酵素プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターおよびスクロース合成酵素プロモーターを含む。 (Plant promoter )
A large number of promoters functional in plants are known. In constructing GPT and GS transgene constructs, the promoter selected may be a constitutive non-specific promoter, for example, the cauliflower mosaic virus 35S ribosomal promoter (CaMV 35S promoter). This promoter is widely used for transgene expression in plants. Examples of other strong constitutive promoters include, but are not limited to, rice actin 1 promoter, CaMV 19S promoter, Ti plasmid nopaline synthase promoter, alcohol dehydrogenase promoter and sucrose synthase promoter.

（グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）導入遺伝子）
本発明は、シグナル代謝産物である２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成に直接的に機能する、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）酵素を含む植物を最初に開示する。これまで、機能が明らかになった植物のグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼは全く記載されていない。出願人は、いくつかの植物種および動物種由来のＧＰＴポリヌクレオチドコード配列を同定し、試験した。そして、この遺伝子を宿主植物に組み込み、生育がより速く、葉のタンパク質量が向上され、葉組織内におけるグルタミンシンテターゼ活性が増加され、そしてＣＯ₂固定速度がより速い、生育特性が顕著に向上されている異種性のトランスジェニック植物とすることに成功した。 (Glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) transgene)
The present invention first discloses a plant comprising a glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) enzyme that functions directly in the synthesis of the signal metabolite 2-hydroxy-5-oxoproline. To date, no plant glutamine phenylpyruvate transaminase whose function has been clarified has been described. Applicants have identified and tested GPT polynucleotide coding sequences from several plant and animal species. And this gene is incorporated into the host plant, the growth is faster, the amount of leaf protein is improved, the glutamine synthetase activity in the leaf tissue is increased, the CO ₂ fixation rate is faster, and the growth characteristics are remarkably improved. We succeeded in creating a heterogeneous transgenic plant.

多数のアグロバクテリウム形質転換ベクターおよび方法が記載されてきた（Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci. 7(5): 193-5）。そして、これらの多くのベクターは商業的に手に入れることができる（例えばインビトロジェン、カールズバッド、ＣＡ）。さらに、より多くの「オープンソース」のアグロバクテリウム形質転換ベクターが使用可能である（例えばｐＣａｍｂｉａベクター；Ｃａｍｂｉａ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。また、本明細書中に上述した「導入遺伝子コンストラクト」の項を参照されたい。さらに実施例に記載した特定の実施形態において、生育が向上したタバコおよびトマトのトランスジェニック植物を生成するために、Ｈｏｒｓｃｈらのリーフディスク形質転換システム（Horsch et al.,1995, Science 227:1229-1231）において、ｐＭＯＮ３１６由来のベクターが使用された。 A number of Agrobacterium transformation vectors and methods have been described (Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci. 7 (5): 193-5). Many of these vectors are then commercially available (eg, Invitrogen , Carlsbad, CA ). In addition, more “open source” Agrobacterium transformation vectors are available (eg, pCambia vectors; Cambia, Canberra, Australia). See also the section “Transgene Constructs” described hereinabove. In particular embodiments described in the Examples, the Horsch et al. Leaf disc transformation system (Horsch et al., 1995, Science 227: 1229-) is used to produce transgenic tobacco and tomato plants with improved growth. 1231), a vector derived from pMON316 was used.

エレクトロポレーションは、短い、高強度の電場を利用して、細胞膜の脂質二重層を可逆的に透過可能にする技術である（例えば、Fisk and Dandekar, 2005, Introduction and Expression of Transgenes in Plant Protoplasts, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 79-90; Fromm et al.,1987, Electroporation of DNA and RNA into plant protoplasts, in Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press, London, UK, pp. 351-366; Joersbo and Brunstedt, 1991, Electroporation: mechanism and transient expression, stable transformation and biological effects in plant protoplasts. Physiol. Plant. 81, 256-264; Bates, 1994, Genetic transformation of plants by protoplast electroporation. Mol. Biotech. 2: 135-145; Dillen et al., 1998, Electroporation-mediated DNA transfer to plant protoplasts and intact plant tissues for transient gene expression assays, in Cell Biology, Vol. 4, ed., Celis, Academic Press, London, UK, pp. 92-99を参照）。この技術は、細胞膜に水溶性の細孔を作り出すことにより行なう。細孔は、ＤＮＡ分子（および他の高分子）が細胞に入るのに充分な大きさのサイズである。そして、導入遺伝子発現コンストラクト（Ｔ−ＤＮＡ等）は、植物ゲノムＤＮＡ中に安定的に組み込まれることができ、形質転換細胞の生成が導かれ、その後に形質転換細胞はトランスジェニック植物に再生され得る。 Electroporation is a technique that reversibly permeates the lipid bilayer of cell membranes using a short, high-intensity electric field (eg, Fisk and Dandekar, 2005, Introduction and Expression of Transgenes in Plant Protoplasts, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 79-90; Fromm et al., 1987, Electroporation of DNA and RNA into plant protoplasts, in Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press, London, UK, pp. 351-366; Joersbo and Brunstedt, 1991, Electroporation: mechanism and transient expression, stable transformation and Physiol.Plant 81, 256-264; Bates, 1994, Genetic transformation of plants by protoplast electroporation. Mol. Biotech. 2: 135-145; Dillen et al., 1998, Electroporation-mediated DNA transfer to plant protoplasts and intact plant tissues for transient gene expression ass ays, in Cell Biology, Vol. 4, ed., Celis, Academic Press, London, UK, pp. 92-99). This technique is performed by creating water-soluble pores in the cell membrane. The pores are large enough to allow DNA molecules (and other macromolecules) to enter the cell. A transgene expression construct (such as T-DNA) can then be stably integrated into plant genomic DNA, leading to the generation of transformed cells, which can then be regenerated into transgenic plants. .

Ｔ₀形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、形質転換に用いる導入遺伝子発現コンストラクトに含まれるマーカー遺伝子の遺伝的組成物、および／またはマーカー遺伝子によりコードされる表現型の特徴を選抜し、またはスクリーニングすることにより、同定され、かつ単離され得る。例えば、遺伝的コンストラクトによって耐性を付与することができる抗生物質または除草剤の抑圧的な量を含む生育培地において、形質転換されている可能性のある植物、組織または細胞を生育させることによって、選抜が行なわれ得る。さらに、形質転換された植物細胞、組織および植物は、導入遺伝子発現コンストラクト内に存在し得るマーカー遺伝子（すなわち、β−グルクロニダーゼ）の活性をスクリーニングすることによっても同定され得る。 A T ₀ transformed plant cell, callus, tissue or plant selects for the genetic composition of the marker gene contained in the transgene expression construct used for transformation and / or the phenotypic characteristics encoded by the marker gene Or can be identified and isolated by screening. For example, selection by growing a potentially transformed plant, tissue or cell in a growth medium containing a repressive amount of an antibiotic or herbicide that can confer resistance through a genetic construct. Can be performed. Further, the transformed plant cells, tissues and plants, the introduction marker gene which may be present in the gene expression in the construct (i.e., beta-Gurukuronida Ze) can also be identified by screening the activity of.

周知のとおり、所望の導入遺伝子発現コンストラクトを含む植物を同定するために、種々の物理的方法および生化学的方法が使用され得る。これらの方法の具体例は、例えば、導入遺伝子、導入遺伝子発現コンストラクトまたはその要素を同定するためのサザンブロット解析または種々の核酸増幅法（いわゆるＰＣＲ）、ＲＮＡ転写産物を検出しかつ決定するためのノザンブロッティング、Ｓ１ＲＮａｓｅ保護法、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅法、導入遺伝子によってコードされかつ発現されるタンパク質を同定するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、免疫沈降および酵素免疫測定などが用いられ得る。 As is well known, various physical and biochemical methods can be used to identify plants containing the desired transgene expression construct. Specific examples of these methods, For example, the transgene, the transgene expression construct or Southern blot analysis or various nucleic acid amplification methods for identifying that element (so-called PCR), to detect the R NA transcript and determining Northern blotting to, S1 RNase protection, reverse transcriptase PCR (RT-PCR) amplification method, protein gel electrophoresis to identify proteins that are encoded and expressed by the transgene, Western blotting, immunoprecipitation and Enzyme immunoassays and the like can be used .

好ましくは、最初の形質転換体は、導入遺伝子の遺伝子型が先祖の形質を維持する（すなわち、植物が、導入遺伝子について同型となる）まで、選択された後にＴ₁およびこれに続く世代を自家受粉により生成するために使用される。実際には、これは、各世代において所望の形質についてスクリーニングし、そしてそれら個々を自家受粉させること（たいてい繰り返し（すなわち、３または４世代））により成し遂げられる。本明細書において説明するように、少なくとも１つの雌雄世代を介して繁殖させたトランスジェニック植物の系統（タバコ、シロイヌナズナ、トマト）は、有性生殖の利点、および付随する導入遺伝子のコピー数の増加を有さない系統と比較して、より高度な導入遺伝子産生活性を示す。 Preferably, the first transformant will autologize T ₁ and subsequent generations after selection until the transgene genotype maintains the ancestral trait (ie, the plant is homozygous for the transgene). Used to produce by pollination. In practice, this is accomplished by screening for the desired traits in each generation and self-pollinating them (usually repeated (ie, 3 or 4 generations)) . As described herein, transgenic plant lines (tobacco, Arabidopsis, tomato) propagated through at least one male and female generation have the advantage of sexual reproduction and the accompanying increase in copy number of the transgene. Compared with a line not having, higher transgene production activity is exhibited.

安定なトランスジェニックラインは、いくつもの所望の形質を有する変種を作り出すために交雑され、かつ戻し交配されてもよい。変種は、積み重ねられた導入遺伝子を有する変種、導入遺伝子のマルチコピーを有する変種などを含む。種々の一般的な育種方法は、当業者によく知られている（例えば、Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987) を参照）。さらに、安定なトランスジェニック植物は、これらの植物に導入遺伝子もしくは親の導入遺伝子のさらなるコピーをさらに形質転換することによって、遺伝的にさらに改変されてもよい。また、所定の導入遺伝子もしくは複数の導入遺伝子のマルチコピーを導入する形質転換を１回行なうことによって、トランスジェニック植物を作り出すことが検討される。 Stable transgenic lines may be crossed and backcrossed to produce variants with any number of desired traits. Variants include variants with stacked transgenes, variants with multiple copies of the transgene, and the like. Various general breeding methods are well known to those skilled in the art (see, for example, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)). In addition, stable transgenic plants may be further genetically modified by further transforming these plants with additional copies of the transgene or parental transgene. It is also contemplated to create a transgenic plant by performing a single transformation that introduces a given transgene or multiple copies of a plurality of transgenes .

＜実施例１：シロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）遺伝子の単離＞
シグナル代謝産物である２−オキソグルタラメートの合成に直接的に関与する植物酵素を見出す試みとして、出願人らは、推定される植物酵素が、２−オキソグルタラメートの合成に関与していると特徴づけられているヒトのタンパク質と、ある程度の構造上の関連性を有しているであろうとの仮説を立てた。ヒトのパンパク質であるグルタミントランスアミナーゼＫ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．６４）（文献では、システイン共役β―リアーゼ、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ、等ともいわれている）は、ハロゲン化した生体異物のシステイン共役の処理に関与していることがわかっている（Perry et al., 1995, FEBS Letters 360:277-280）。ヒトのシステイン共役β―リアーゼは、窒素同化に関与する活性を有するよりも、むしろヒトおよび動物において解毒活性を有する（上述したCooper and Meister, 1997）。とはいえ、２−オキソグルタラメートの合成におけるこのタンパク質の潜在的な関与は重要であった。 <Example 1: Isolation of Arabidopsis glutamine phenylpyruvate transaminase (GPT) gene>
In an attempt to find a plant enzyme that is directly involved in the synthesis of the signal metabolite 2-oxoglutaramate, Applicants have found that the putative plant enzyme is involved in the synthesis of 2-oxoglutaramate. It was hypothesized that it might have some degree of structural association with the human protein that is characterized as Glutamine transaminase K (EC 2.6.1.64) which is a human protein (also referred to in the literature as cysteine-conjugated β-lyase, kynurenine aminotransferase, glutamine phenylpyruvate transaminase, etc.) It has been shown to be involved in the processing of cysteine conjugation of halogenated xenobiotics (Perry et al., 1995, FEBS Letters 360: 277-280). Human cysteine-conjugated β-lyase has detoxifying activity in humans and animals rather than having activity involved in nitrogen assimilation (Cooper and Meister, 1997, supra) . Nevertheless, the potential involvement of this protein in the synthesis of 2-oxoglutaramate was important.

5'- CCCATCGATGTACC TGGACATAAATGGTGTGATG-3' ［配列番号３７］
5'- GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3' ［配列番号３８］
これらのプライマーは、後述のトランスジェニック植物を作成するための発現ベクターでのサブクローニングを促進するため、ＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）およびＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）の制限酵素部位を含むように設計した。ＴａＫａＲａＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて、次の条件により高性能のＰＣＲを行なった：まず９４℃で４分間変性し、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒の伸長反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間伸長反応させる。増幅産物はＣｌａＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動法で単離して、カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus：ＣａＭＶ、同様にＣＭＶ）３５Ｓの構成的プロモーターおよびノパリンシンターゼ（nopaline synthase：ＮＯＳ）３'ターミネーターを含むベクターｐＭｏｎ３１６（Rogers, et. al. 1987 Methods in Enzymology 153:253-277）にライゲーションした。ライゲーション産物をＤＨ５α細胞に形質転換し、挿入されたことを確認するために形質転換体の配列を決定した。 5'- CCCATCGATGTACC TGGACATAAATGGTGTGATG-3 ' [SEQ ID NO: 37]
5'-GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3 ' [SEQ ID NO: 38]
These primers were designed to include ClaI (ATCGAT) and KpnI (GGTACC) restriction enzyme sites in order to facilitate subcloning with expression vectors to create the transgenic plants described below. High performance PCR was performed using TaKaRa ExTaq DNA polymerase enzyme under the following conditions: first denaturing at 94 ° C for 4 minutes, denaturing at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C. A 90 second extension reaction is performed for 30 cycles, and finally an extension reaction is performed at 72 ° C. for 7 minutes. The amplified product was cleaved with ClaI and KpnI restriction enzymes, isolated by agarose gel electrophoresis, and constitutive promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV, also CMV) 35S and nopaline synthase (NOS). ) Ligated into the vector pMon316 (Rogers, et. Al. 1987 Methods in Enzymology 153: 253-277) containing the 3 ′ terminator. The ligation product was transformed into DH5α cells and the transformant sequence was determined to confirm insertion.

（２−オキソグルタラメートのＮＭＲアッセイ）
簡潔にいえば、精製したタンパク質の産物を、１５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、２００ｍＭグルタミン、１００ｍＭグリオキシル酸および２００μＭピリドキサル５'−リン酸を含む反応液に加えた。試験するタンパク質を加えていない反応液をコントロールとして用いた。試験反応液およびコントロール反応液を３７℃で２０時間インキュベートし、遠心分離によって浄化して沈殿物を取り除いた。化学的に合成した標準の２−オキソグルタラメートを参照として、¹³ＣＮＭＲを用いて、２−オキソグルタラメートの存在と量を分析するために上清を試験した。反応産物は２−オキソグルタラメートおよびグリシンであり、一方、基質（グルタミンおよびグリオキシル酸）は存在比が減少した。サイクリック２−オキソグルタラメートは、オープンチェーンのグルタミン前駆体から容易に区別できる、まったく異なるシグナルを生じさせた。 (NMR assay of 2-oxoglutaramate)
Briefly, the purified protein product is added to a reaction containing 150 mM Tris-HCl (pH 8.5), 1 mM β-mercaptoethanol, 200 mM glutamine, 100 mM glyoxylic acid and 200 μM pyridoxal 5′-phosphate. It was. A reaction solution to which the protein to be tested was not added was used as a control. The test reaction solution and the control reaction solution were incubated at 37 ° C. for 20 hours and purified by centrifugation to remove precipitates. The supernatant was tested to analyze the presence and amount of 2-oxoglutaramate using ¹³ C NMR, with reference to chemically synthesized standard 2-oxoglutaramate. The reaction products were 2-oxoglutaramate and glycine, while the substrate (glutamine and glyoxylic acid) decreased in abundance. Cyclic 2-oxoglutaramate produced an entirely different signal that was easily distinguishable from the open chain glutamine precursor.

（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
ＧＰＴ活性に関する代替的なアッセイは、Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809の変性に続いて、ＨＰＬＣを用いて２−オキソグルタラメート産物を測定した。簡潔にいえば、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、２０μＭＦＡＤ、１０ｍＭシステインおよび〜１．５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールを含む、変性抽出バッファーを用いた。検査物質からの組織サンプル（すなわち、植物組織）を約１／３の比率（ｗ／ｖ）で抽出バッファーに加え、３７℃で３０分間インキュベートし、２００μＭの２０％ＴＣＡによって停止させた。約５分後、アッセイ溶液を遠心分離し、その上清を用いてＨＰＬＣ（０．０１ＮＨ ₂ ＳＯ ₄の移動相、約０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速、４０℃、でのＩＯＮ−３００７．８ｍｍＩＤＸ３０ｃｍＬｃｏｌｕｍｎを用いる）によって２−オキソグルタラメートを定量した。注入量は約２０μｌであり、保持時間はおよそ３８分から３９分である。検出は２１０ｎｍのＵＶ光で行なう。 (HPLC assay of 2-oxoglutaramate)
An alternative assay for GPT activity measured 2-oxoglutaramate product using HPLC following denaturation of Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161 (2): 807-809. Briefly, a denaturing extraction buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 20 μM FAD, 10 mM cysteine and ˜1.5% (v / v) mercaptoethanol was used. Tissue samples from the test substances (ie plant tissues) were added to the extraction buffer at a ratio of about 1/3 (w / v), incubated for 30 minutes at 37 ° C. and stopped with 200 μM 20% TCA. After about 5 minutes, the assay solution is centrifuged and the supernatant is used to HPLC (ION-300 at a mobile phase of 0.01 NH ₂ SO ₄ , flow rate of about 0.2 ml / min, 40 ° C.) 2-oxoglutaramate was quantified by using 8 mm ID X 30 cm L column). The injection volume is about 20 μl and the retention time is approximately 38 to 39 minutes. Detection is performed with 210 nm UV light.

（ＧＳ１転写産物の生成）
ｐＧＳ１１１は、三親接合（triparental mating）（上述したRogers et al., 1987；Unkefer et al.,米国特許第６，５５５，５００号）を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）菌株ｐＴｉＴＴ３７ＡＳＥに形質転換される。タバコ（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）植物は、ｐＧＳ１１１が形質転換されたアグロバクテリアにより、Ｈｏｒｓｃｈらのリーフディスク形質転換システム（Horsch et al.,1995, Science 227:1229-1231）を用いて形質転換された。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＭＳ培地上で選択され、かつ再生された。シュートは、同じ培地（カナマイシンを含み、ホルモンがない）上に植え付けた後に鉢植え用土：パーライト：バーミキュライト（３：１：１）に移し、成熟期まで生育させた後に自家受粉させた。Ｔ₀世代と、自家受粉し、かつカナマイシンによる選抜を続けることによって生成された次の世代とから、種子を回収した。最もよく生育するものが、実施例３に記載のような最も多くＧＰＴを過剰発現することが同定された系統と交雑させ、Ｔ₃ 子孫を生成するために使用された。野生型コントロール植物と比較したＧＳ１トランスジェニック植物の写真を図２に示す（ＧＰＴトランスジェニックタバコ植物とともに，実施例３を参照）。 (Generation of GS1 transcript)
pGS111 is transformed into Agrobacterium tumefaciens strain pTiTT37ASE using triparental mating (Rogers et al., 1987, described above; Unkefer et al., US Pat. No. 6,555,500). Transformed into Tobacco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) plants were transformed with Agrobacterium transformed with pGS111 using the Horsch et al. Leaf disk transformation system (Horsch et al., 1995, Science 227: 1229-1231). It was. Transformants were selected and regenerated on MS medium containing 100 μg / ml kanamycin. The shoots were planted on the same medium (containing kanamycin and without hormones), then transferred to potting soil: perlite: vermiculite (3: 1: 1), grown to maturity and self-pollinated. And T ₀ generation, selfed, and the next generation generated by continuing selection by kanamycin, seeds were collected. The best growing ones were crossed with the strains identified as most overexpressing GPT as described in Example 3 and used to generate T ₃ progeny . A photograph of the GS1 transgenic plant compared to the wild type control plant is shown in FIG. 2 (see Example 3 along with the GPT transgenic tobacco plant).

＜実施例８：ＧＳ１導入遺伝子及びＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックコショウ植物＞
本実施例では、ＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナのＧＰＴ全長のコード配列（配列番号１）、及びＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナのＧＳ１コード配列（配列番号６に含まれる）を、アグロバクテリウム媒介によって種子のさやに導入することにより、ＢｉｇＪｉｍｃｈｉｌｉコショウ植物（ＮｅｗＭｅｘｉｃｏの変種）を形質転換した。３日後、種子を回収し、Ｔ０植物を生成するために使用し、形質転換体をスクリーニングした。得られた二重トランスジェニック植物は、コントロール植物と比較して、より高いさやの収率、より速い生育速度、及びより多いバイオマス収量を示した。 <Example 8: Double transgenic pepper plant carrying GS1 transgene and GPT transgene>
In this example, the coding sequence of the full length GPT of Arabidopsis under the control of the CMV 35S promoter (SEQ ID NO: 1) and the GS1 coding sequence of Arabidopsis under the control of the RuBisCo promoter ( included in SEQ ID NO: 6) Big Jim chili pepper plants (New Mexico varieties) were transformed by introduction into the seed pods mediated by bacteria. Three days later, seeds were collected and used to generate T0 plants and transformants were screened. The resulting double transgenic plants showed higher pod yield, faster growth rate, and higher biomass yield compared to control plants.

（材料及び方法）
発現ベクターｐＭＯＮ（実施例３を参照）内のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナのＧＰＴ全長のコード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（トマトのrubisco rbcS3C プロモーター：Kyozulka et al., 1993, Plant Physiol. 103: 991-1000；配列番号２２；ベクターコンストラクト（配列番号６））内のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター制御下にあるシロイヌナズナのＧＳ１コード配列（配列番号６に含まれる）とを用いて、アグロバクテリウム媒介による種子のさやへの導入によって、コショウ植物であるソラナセアエ・カピシカム（Solanaceae Capisicum）（「ＢｉｇＪｉｍ」の変種）を形質転換した。 (Materials and methods)
The coding sequence of the full length GPT of Arabidopsis thaliana under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON (see Example 3) (SEQ ID NO: 1) and the expression vector pCambia1201 (tomato rubisco rbcS3C promoter: Kyozulka et al., 1993 103: 991-1000; SEQ ID NO: 22; Arabidopsis GS1 coding sequence ( contained in SEQ ID NO: 6) under the control of the RuBisCo promoter in the vector construct (SEQ ID NO: 6). Pepper plant Solanaceae Capisicum (variant of “Big Jim”) was transformed by introduction into the seed pods mediated by um.

シリンジを用いて、さやに充分な量のアグロバクテリウムベクター混合物を注入し、約３日間インキュベートした。その後、種子を回収して発芽させ、植物を成長させて生育及び抗生物質耐性を含む表現型特性を観察した。導入遺伝子を保有する植物は緑であるが、形質転換されていない植物は葉頂が萎黄病の徴候を示した。活発に生育する形質転換体をさらに生育させ、同一の条件下で生育させた野生型のコショウ植物と比較した。 A sufficient amount of Agrobacterium vector mixture was injected using a syringe and incubated for about 3 days. Thereafter, seeds were collected and germinated, plants were grown and observed for phenotypic characteristics including growth and antibiotic resistance. Plants carrying the transgene are green, but non-transformed plants showed signs of yellowing at the leaf tips. The actively growing transformants were further grown and compared to wild-type pepper plants grown under the same conditions.

＜実施例９：シロイヌナズナのＧＳ１導入遺伝子とＧＰＴ導入遺伝子とを保有する二重トランスジェニックマメ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＰＴ全長コード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６に含まれる）とを、アグロバクテリウム媒介により花へ導入することによって、黄色ワックスマメ植物（インゲンマメ（Phaseolus vulgaris））を形質転換した。 <Example 9: Generation of a double transgenic bean plant carrying an Arabidopsis GS1 transgene and a GPT transgene>
In this example, the Arabidopsis GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pCambia 1201, and the Arabidopsis GS1 coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201. the included) and 6, by introducing into the flowers by Agrobacterium-mediated, yellow wax bean plants (Phaseolus vulgaris (Phaseolus vulgaris)) was transformed.

（材料及び方法）
導入遺伝子発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１−ＧＰＴ（配列番号２７のコンストラクトを含む）と、ｐＣａｍｂｉａ１２０１−ＧＳ（配列番号６のコンストラクトを含む）とを、標準的なエレクトロポレーション法を用いて、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌株に導入した（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）。５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む培地上で、形質転換したアグロバクテリウムを選択した。形質転換したアグロバクテリウム細胞を、２５μｇ／ｍｌの抗生物質を含むＬＢ培地中で３６時間生育させた。３６時間の生育期間の最後に、遠心により細胞を回収し、それぞれの形質転換由来の細胞を、抗生物質を含まない１００ｍｌＬＢ培養液中に懸濁した。 (Materials and methods)
The transgene expression vectors pCambia 1201-GPT ( including the construct of SEQ ID NO: 27) and pCambia 1201-GS ( including the construct of SEQ ID NO: 6) were respectively agrobacterium using standard electroporation methods. -It was introduced into Tumefaciens LBA4404 strain (McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9: 155-159). Transformed Agrobacterium was selected on a medium containing 50 μg / ml chloramphenicol. Transformed Agrobacterium cells were grown for 36 hours in LB medium containing 25 μg / ml antibiotics. At the end of the 36 hour growth period, cells were harvested by centrifugation and cells from each transformation were suspended in 100 ml LB medium without antibiotics.

＜実施例１０：シロイヌナズナＧＳ１導入遺伝子及びブドウＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックマメ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１３０５．１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるブドウＧＰＴ全長コード配列（配列番号８に含まれる）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６に含まれる）とを、アグロバクテリウムで媒介して成長中の鞘に導入することにより、黄色ワックスマメ植物（インゲンマメ）を形質転換した。 <Example 10: Generation of a double transgenic bean plant carrying an Arabidopsis GS1 transgene and a grape GPT transgene>
In this example, the grape GPT full-length coding sequence ( included in SEQ ID NO: 8) under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia1305.1, and the Arabidopsis GS1 coding sequence under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia1201. A yellow wax bean plant (green kidney bean) was transformed by introducing Agrobacterium-mediated ( included in SEQ ID NO: 6) into the growing pod.

（材料及び方法）
導入遺伝子発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１−ＧＰＴ（ブドウ）（配列番号８のコンストラクトを含む）と、ｐＣａｍｂｉａ１２０１−ＧＳ（配列番号６のコンストラクトを含む）とを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌株に、標準的なエレクトロポレーション法を用いて形質転換した（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）。５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む培地上で、形質転換したアグロバクテリウムを選択した。形質転換したアグロバクテリウム細胞を、２５μｇ／ｍｌの抗生物質を含むＬＢ培地中で３６時間生育させた。３６時間の生育期間の最後に、遠心により細胞を回収し、それぞれの形質転換由来の細胞を、抗生物質を含まない１００ｍｌＬＢ培養液中に懸濁した。 (Materials and methods)
The transgene expression vectors pCambia1201-GPT (grape) ( including the construct of SEQ ID NO: 8) and pCambia1201-GS ( including the construct of SEQ ID NO: 6) were respectively transferred to the Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain with standard electro Transformation was performed using the poration method (McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9: 155-159). Transformed Agrobacterium was selected on a medium containing 50 μg / ml chloramphenicol. Transformed Agrobacterium cells were grown for 36 hours in LB medium containing 25 μg / ml antibiotics. At the end of the 36 hour growth period, cells were harvested by centrifugation and cells from each transformation were suspended in 100 ml LB medium without antibiotics.

＜実施例１１：シロイヌナズナのＧＳ１及びＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックササゲ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＭＯＮ中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＰＴ全長コード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６に含まれる）とを、アグロバクテリウムで媒介して花に導入することにより、一般的なササゲ植物を形質転換した。材料及び方法は、上述した実施例９と同様である。 <Example 11: Generation of double transgenic cowpea plants carrying Arabidopsis GS1 and GPT transgenes>
In this example, the Arabidopsis GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON and the Arabidopsis GS1 coding sequence (SEQ ID NO: 6) under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia1201. In general, cowpea plants were transformed by introducing Agrobacterium into the flowers. The material and method are the same as in Example 9 described above.

＜実施例１２：シロイヌナズナＧＳ１及びブドウＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックササゲ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１３０５．１（配列番号８のコンストラクトを含む）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるブドウＧＰＴ全長コード配列（配列番号８に含まれる）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のコンストラクトを含む）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６に含まれる）とを、アグロバクテリウムで媒介して花に導入することにより、一般的なササゲ植物を形質転換した。材料及び方法は、上述した実施例１１と同様である。 <Example 12: Generation of a double transgenic cowpea plant carrying Arabidopsis GS1 and grape GPT transgene>
In this example, the grape GPT full-length coding sequence ( included in SEQ ID NO: 8) under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia1305.1 ( including the construct of SEQ ID NO: 8) and the expression vector pCambia1201 (SEQ ID NO: 6 transformed Arabidopsis GS1 coding sequence under the control of RuBisCo promoter in including constructs) and (contained in SEQ ID NO: 6), by introducing the flowers mediating Agrobacterium, the general cowpea plants Converted. The material and method are the same as in Example 11 described above.

＜実施例１３：シロイヌナズナのＧＳ１及びＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックアルファルファ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上述した実施例３を参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＰＴ全長コード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のコンストラクトを含む）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６に含まれる）とを、アグロバクテリウム媒介により苗植物中に導入することによって、アルファルファ植物（Medicago sativa, var Ladak）を形質転換した。アグロバクテリウムベクター及び混合物は、苗接種するために、上述した実施例１１にて記載したように調製した。 Example 13: Generation of a double transgenic alfalfa plant carrying Arabidopsis GS1 and GPT transgenes
In this example, the Arabidopsis GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above) and the expression vector pCambia1201 ( including the construct of SEQ ID NO: 6). The alfalfa plant (Medicago sativa, var Ladak) is transformed by introducing the Arabidopsis thaliana GS1 coding sequence ( contained in SEQ ID NO: 6) under the control of the RuBisCo promoter into the seedling plant via Agrobacterium. Converted. Agrobacterium vectors and mixtures were prepared as described in Example 11 above for seedling inoculation.

＜実施例１４：シロイヌナズナＧＳ１及びＧＰＴ導入遺伝子を保有する二重トランスジェニックカンタロープ植物の生成＞
本実施例では、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上述した実施例３を参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＰＴ全長コード配列（配列番号１）と、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のコンストラクトを含む）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナＧＳ１コード配列（配列番号６に含まれる）とを、アグロバクテリウムで媒介して成長中のメロン中に注入して導入することにより、カンタロープ植物（Cucumis melo var common）を形質転換した。上述した実施例８に記載のように、メロン内接種のために、アグロバクテリウムベクター及び混合物を調製した。成長中のメロン内への接種は、基本的に実施例８に記載のように行なった。植物は、同一条件下で生育させたコントロールメロン植物に対する開花の状態及び全バイオマスについて、特徴づけされた。 <Example 14: Generation of double transgenic cantaloupe plant carrying Arabidopsis GS1 and GPT transgene>
In this example, the Arabidopsis GPT full-length coding sequence (SEQ ID NO: 1) under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above) and the expression vector pCambia 1201 (construct of SEQ ID NO: 6) By introducing the Arabidopsis thaliana GS1 coding sequence ( included in SEQ ID NO: 6) under the control of the RuBisCo promoter into the growing melon via Agrobacterium. (Cucumis melo var common) was transformed. As described in Example 8 above, Agrobacterium vectors and mixtures were prepared for intramelon inoculation. Inoculation into growing melons was basically performed as described in Example 8. Plants were characterized for flowering status and total biomass relative to control melon plants grown under identical conditions.

＜実施例１５：シロイヌナズナＧＳ１およびＧＰＴ導入遺伝子を持つ二重トランスジェニックカボチャ植物の作成＞
本実施例では、一般的なカボチャ植物（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍａｘｉｍａ）を、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上記実施例３参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で、配列番号１に示すシロイヌナズナＧＰＴの全長コード配列によって形質転換した。また、当該カボチャ植物を、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のコンストラクトを含む）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号６に含まれるシロイヌナズナＧＳ１のコード配列によって形質転換した。この形質転換には、基本的には上述した実施例１４に示されるように、生育中のカボチャへの、接種によるアグロバクテリウムを介在した転移を用いた。トランスジェニックのカボチャ植物とコントロールのカボチャ植物とは、コントロール植物に花芽が現れるまで同一の条件下で生育し、その後、開花状況およびバイオマスの総量に関して、すべての植物を特徴づけた。 <Example 15: Production of a double transgenic pumpkin plant having Arabidopsis GS1 and GPT transgenes>
In this example, a general pumpkin plant (Cucurbita maxima) was transformed with the full-length coding sequence of Arabidopsis GPT shown in SEQ ID NO: 1 under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above). did. In addition, the pumpkin plant was transformed with the coding sequence of Arabidopsis GS1 contained in SEQ ID NO: 6 under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201 ( including the construct of SEQ ID NO: 6). For this transformation, basically Agrobacterium-mediated transfer by inoculation to a growing pumpkin was used as shown in Example 14 above. Transgenic and control pumpkin plants were grown under identical conditions until flower buds appeared in the control plants, and then all plants were characterized with respect to flowering status and total biomass.

＜実施例１６：シロイヌナズナＧＳ１およびＧＰＴ導入遺伝子を持つダブルトランスジェニックシロイヌナズナ植物の作成＞
本実施例では、シロイヌナズナ植物（Arabidopsis thaliana）を、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上記実施例３参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で配列番号１８に示すトランケートされたシロイヌナズナＧＰＴのコード配列によって形質転換し、その後、トランスジェニック植物を発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のコンストラクトを含む）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号６に含まれるシロイヌナズナＧＳ１コード配列によって形質転換した。この形質転換には、（Harrison et al., 2006, Plant Methods 2:19-23; Clough and Bent, 1998, Plant J. 16:735-743）に記載のアグロバクテリウムを介在した「フローラルディップ法」を用いた。ＧＰＴを有するアグロバクテリウムのベクターｐＭＯＮ３１６、およびＧＳ１を有するｐＣａｍｂｉａ１２０１はそれぞれ、実施例３および１１に記載したとおりに準備した。 <Example 16: Production of double transgenic Arabidopsis plants having Arabidopsis GS1 and GPT transgenes>
In this example, an Arabidopsis thaliana plant was transformed with the truncated Arabidopsis GPT coding sequence shown in SEQ ID NO: 18 under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above), The transgenic plants were then transformed with the Arabidopsis GS1 coding sequence contained in SEQ ID NO: 6 under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201 ( including the construct of SEQ ID NO: 6). This transformation involves Agrobacterium-mediated “floral dip method” described in (Harrison et al., 2006, Plant Methods 2: 19-23; Clough and Bent, 1998, Plant J. 16: 735-743). Was used. Agrobacterium vector pMON316 with GPT and pCambia 1201 with GS1 were prepared as described in Examples 3 and 11, respectively.

その結果を、図１８および表ＸＩＩＩに示す。表ＸＩＩＩ（６つの野生型および６つのトランスジェニックシロイヌナズナ植物のデータ（平均）を示す）に関して、トランスジェニック植物はともに増加したレベルのＧＰＴ活性およびＧＳ活性を示した。ＧＰＴ活性はコントロール植物より２０倍以上高かった。さらに、トランスジェニック植物の葉の生体重の平均値は、野生型コントロール植物の平均値の４倍以上であった。同一の条件下で生育した野生型コントロールのシロイヌナズナ植物と比較した若い導入遺伝子シロイヌナズナ植物の写真を図１８に示す。トランスジェニック植物において、この若い導入遺伝子シロイヌナズナ植物はコントロール植物に対して一貫した非常に顕著な成長／バイオマス増加を示す。 The results are shown in FIG. 18 and Table XIII. With respect to Table XIII (representing data (average) for 6 wild-type and 6 transgenic Arabidopsis plants), both transgenic plants showed increased levels of GPT and GS activity. GPT activity was more than 20 times higher than control plants. Furthermore, the average value of the living weight of the leaves of the transgenic plant was 4 times or more the average value of the wild type control plant. A photograph of a young transgene Arabidopsis plant compared to a wild-type control Arabidopsis plant grown under the same conditions is shown in FIG. In transgenic plants, this young transgene Arabidopsis plant exhibits consistently very significant growth / biomass increase relative to control plants.

＜実施例１７：シロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳ１導入遺伝子を持つトランスジェニックトマト植物の作成＞
本実施例では、トマト植物（Solanum lycopersicon,品種「マネーメーカー（Money maker）」）を、発現ベクターｐＭＯＮ３１６（上記実施例３参照）中のＣＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で、配列番号１に示すシロイヌナズナＧＰＴの全長コード配列を形質転換し、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１（配列番号６のコンストラクトを含む）中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号６に含まれるシロイヌナズナＧＳ１コード配列を形質転換した。１種類の導入遺伝子（ＧＰＴ）のトランスジェニックトマト植物を作製し、基本的には実施例４に記載したように開花するまで生育した。そして、直接的な花への注入（実施例８で説明したように）によるアグロバクテリウムを介在した転移によって、シロイヌナズナＧＳ１導入遺伝子をシングルトランスジーンＴ0植物に導入した。トランスジェニックおよびコントロールのトマト植物を同一の条件下で生育し、生育表現型の特性について評価した。得られたＴ0二重導入遺伝子植物を成熟期まで成長させ、コントロールのトマト植物とともに撮影し、表現型の評価をした。 <Example 17: Production of transgenic tomato plant having Arabidopsis GPT and GS1 transgene>
In this example, a tomato plant (Solanum lycopersicon, variety “Money maker”) is transformed into an Arabidopsis GPT shown in SEQ ID NO: 1 under the control of the CMV 35S promoter in the expression vector pMON316 (see Example 3 above). The Arabidopsis GS1 coding sequence contained in SEQ ID NO: 6 was transformed under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201 ( including the construct of SEQ ID NO: 6). One kind of transgene (GPT) transgenic tomato plant was produced and basically grown until flowering as described in Example 4. The Arabidopsis GS1 transgene was then introduced into a single transgene T0 plant by Agrobacterium-mediated transfer by direct flower injection (as described in Example 8). Transgenic and control tomato plants were grown under identical conditions and evaluated for growth phenotypic characteristics. The resulting T0 double transgene plant was grown to maturity, photographed with a control tomato plant, and evaluated for phenotype.

その結果を、図１９および表Ｘに示す。表ＸＩＸに関して、二重導入遺伝子トマト植物は、コントロール植物と比較して、葉の植物バイオマスの十分な増加を示し、平均して４５％のバイオマス量の増加を示した。さらに、コントロール植物と比較したトランスジェニック系統では、トマトの果実の収穫量において７０％の増加がみられた（例えば、系統４Ｃからは５１個のトマトが収穫されたが、対してコントロール植物からは平均約３０個のトマトが収穫された）。非常に高いレベルのＧＰＴ活性が、トランスジェニック植物においてみられた（例えば、系統４Ｃは、コントロール植物で測定したＧＰＴ活性の平均値と比較して、およそ３２倍高いＧＰＴ活性を示している）。また、ＧＳ活性は、コントロール植物と比較してトランスジェニック植物では高かった（系統４Ｃでは、ほぼ２倍）。 The results, shown in Figure 19 and Table X. With respect to Table XIX , the double transgene tomato plants showed a sufficient increase in leaf plant biomass compared to the control plants, with an average increase in biomass content of 45%. In addition, the transgenic lines compared to the control plants showed a 70% increase in tomato fruit yield (eg, 51 tomatoes were harvested from line 4C, whereas the control plants did not. An average of about 30 tomatoes was harvested). A very high level of GPT activity was found in the transgenic plants (eg, line 4C shows approximately 32 times higher GPT activity compared to the mean value of GPT activity measured in control plants). In addition, the GS activity was higher in the transgenic plant than in the control plant (almost twice in the line 4C).

＜実施例１８：シロイヌナズナＧＰＴおよびＧＳ１導入遺伝子を持つトランスジェニックアマナズナ植物の作成＞
本実施例では、カメリナ植物（Ｃａｍｅｌｉｎａｓａｔｉｖａ，ＶａｒＭＴ３０３）を、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号１に示すシロイヌナズナＧＰＴの全長コード配列によって形質転換し、発現ベクターｐＣａｍｂｉａ１２０１中のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下で、配列番号６に含まれるシロイヌナズナＧＳ１コード配列を形質転換した。この形質転換は、Chee et al., 1989, Plant Physiol. 91: 1212-1218に記載の方法に従って、アグロバクテリウムを介在した発芽種子への転移によって行なった。
アグロバクテリウムベクターおよび混合物を、上記の実施例１１に記載したように、種子播種のために準備した。 <Example 18: Production of transgenic Amanazuna plants having Arabidopsis GPT and GS1 transgenes>
In this example, a camelina plant (Camelina sativa, Var MT 303) was transformed with the full-length coding sequence of Arabidopsis GPT shown in SEQ ID NO: 1 under the control of the RuBisCo promoter in the expression vector pCambia 1201, and the expression vector pCambia 1201 The Arabidopsis GS1 coding sequence contained in SEQ ID NO: 6 was transformed under the control of the RuBisCo promoter. This transformation was performed by Agrobacterium-mediated transfer to germinated seeds according to the method described in Chee et al., 1989, Plant Physiol. 91: 1212-1218.
The Agrobacterium vector and mixture was prepared for seed sowing as described in Example 11 above.

その結果を、表ＸＸおよび図２０に示す。表ＸＸに関して、トランスジェニック植物の総バイオマスは、平均で、コントロール植物のバイオマスのほぼ２倍であったことがみてとれる。また、草冠の直径はトランスジェニック植物で顕著に向上した。図２０は、コントロールと比較したトランスジェニックアマナズナの写真を示す。トランスジェニック植物は、著しく大きく、より促進された開花を示す。 The results are shown in Table XX and FIG. With regard to Table XX, it can be seen that the total biomass of the transgenic plants on average was approximately twice that of the control plants. Moreover, the diameter of the canopy was significantly improved in the transgenic plants. FIG. 20 shows a photograph of the transgenic Amanazuna compared to the control. Transgenic plant exhibits significantly larger, more accelerated open flowers.

接種した葉の組織のＧＰＴ活性（１２１７ｎｍｏｌ／ｇＦＷｔ／ｈ）は、コントロール植物の葉の組織で測定した活性（４０７ｎｍｏｌ／ｇＦＷｔ／ｈ）の３倍であり、ダイズ（Hordeum）ＧＰＴコンストラクトはトランスジェニック植物において生物学的に活性なＧＰＴの発現に導かれることを示した。 The GPT activity (1217 nmol / g FWt / h) of the inoculated leaf tissue is 3 times the activity measured in the leaf tissue of the control plant (407 nmol / g FWt / h), and the soybean (Hordeum) GPT construct is a transgenic plant. Have been shown to lead to the expression of biologically active GPT.

〔材料と方法〕
（イネＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
イネ（Oryza sativa）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで成長させて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して集菌した。そして、合計２５×１０⁶個の細胞の生物学的活性に関して、以下のＮＭＲアッセイによって分析した。形質転換していない野生型の大腸菌細胞をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。 [Materials and methods]
(Rice GPT coding sequence and expression in E. coli)
The rice (Oryza sat iva ) GPT coding sequence was determined, synthesized, introduced into a PET28 vector, and expressed in E. coli. That is, Escherichia coli cells were transformed with an expression vector, a transformant cultured overnight in an LB medium was diluted, grown to OD0.4, and induced with isopropyl-β-D-thiogalactoside (0.4 μM). And then collected by culturing for 3 hours. The biological activity of a total of 25 × 10 ⁶ cells was then analyzed by the following NMR assay. Untransformed wild type E. coli cells were analyzed as controls. For additional controls, E. coli cells transformed with an empty vector were used.

（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809の変性に続いて、ＨＰＬＣを用いてＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞における２−オキソグルタラメートの産生量を測定した。つまり、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、２０μＭピリドキサルリン酸、１０ｍＭシステインおよび〜１．５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールを含む変性抽出バッファーを用いた。サンプル（大腸菌細胞２５×１０⁶個の溶菌液）を抽出バッファーに約１／３比率（ｗ／ｖ）で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、２００μＭの２０％ＴＣＡで停止した。約５分後、アッセイ溶液を遠心分離し、上清を用いて、０．０１ＮＨ ₂ ＳＯ ₄の移動相、流速約０．２ｍｌ／分、４０℃においてＩＯＮ−３００７．８ｍｍＩＤＸ３０ｃｍＬｃｏｌｕｍｎを用いたＨＰＬＣにより、２−オキソグルタラメートを定量した。注入量は約２０μｌであり、保持時間はおよそ３８分から３９分である。検出は２１０ｎｍのＵＶ光で行なった。 (HPLC assay of 2-oxoglutaramate)
Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161 (2): Following denaturation of 807-809, the amount of 2-oxoglutaramate produced in E. coli cells overexpressing GPT was measured using HPLC. That is, a denatured extraction buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 20 μM pyridoxal phosphate, 10 mM cysteine and ˜1.5% (v / v) mercaptoethanol was used. Samples (25 × 10 ⁶ lysates of E. coli cells) were added to the extraction buffer at about 1/3 ratio (w / v), incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and stopped with 200 μM 20% TCA. After about 5 minutes, the assay solution is centrifuged and the supernatant is used to move the mobile phase of 0.01N H ₂ SO ₄ , flow rate of about 0.2 ml / min, ION-300 7.8 mm ID X 30 cm L at 40 ° C. 2-Oxoglutaramate was quantified by HPLC using column. The injection volume is about 20 μl and the retention time is approximately 38 to 39 minutes. Detection was performed with 210 nm UV light.

（材料と方法）
（ダイズＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
ダイズ（Glycine max）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０⁶個の細胞により、下記のＨＰＬＣアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターを形質転換した大腸菌細胞を用いた。 (Materials and methods)
(Soybean GPT coding sequence and expression in E. coli)
The GPT coding sequence of soybean (Glycine max) was determined, synthesized, introduced into the PET28 vector, and expressed in E. coli. That is, E. coli cells were transformed with an expression vector, a transformant cultured overnight in an LB medium was diluted, cultured to OD0.4, and induced with isopropyl-β-D-thiogalacside (0.4 μM). The cells were cultured for 3 hours and collected. Biological activity was analyzed using the following HPLC assay with a total of 25 × 10 ⁶ cells. Untransformed wild type E. coli was analyzed as a control. For additional controls, E. coli cells transformed with an empty vector were used.

＜実施例２２：組換えゼブラフィッシュＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、ゼブラフィッシュのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的活性のある組換えゼブラフィッシュＧＰＴが作成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。 <Example 22: Isolation and expression of recombinant zebrafish GPT gene coding sequence and analysis of biological activity>
In this example, the predicted coding sequence of zebrafish GPT was isolated and expressed in E. coli. Biologically active recombinant zebrafish GPT was generated and confirmed by HPLC to catalyze the increased synthesis of 2-oxoglutaramate.

（材料と方法）
（ゼブラフィッシュＧＰＴコード配列および大腸菌における発現）
ゼブラフィッシュ（Danio rerio）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０⁶個の細胞により、下記のＨＰＬＣアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。 (Materials and methods)
(Zebrafish GPT coding sequence and expression in E. coli)
The zebrafish (Danio rerio) GPT coding sequence was determined, synthesized, introduced into the PET28 vector and expressed in E. coli. That is, E. coli cells were transformed with an expression vector, a transformant cultured overnight in an LB medium was diluted, cultured to OD0.4, and induced with isopropyl-β-D-thiogalacside (0.4 μM). The cells were cultured for 3 hours and collected. Biological activity was analyzed using the following HPLC assay with a total of 25 × 10 ⁶ cells. Untransformed wild type E. coli was analyzed as a control. For additional controls, E. coli cells transformed with an empty vector were used.

＜実施例２３：トランケートされた組換えシロイヌナズナＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
この実施例では、シロイヌナズナのＧＰＴの推定コード配列の異なる２つの断片を構築し、推定される葉緑体のシグナルペプチドが欠失しているまたはトランケートされたＧＰＴタンパク質の活性を評価するために、大腸菌で発現させた。最初の３０個のアミノ末端のアミノ酸残基または最初の４５個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失するようにトランケートされた、シロイヌナズナＧＰＴの全長アミノ酸配列の配列番号２に対応するトランケートされた組換えＧＰＴタンパク質は、無事に発現し、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒する生物学的活性を示した。 Example 23: Isolation and expression of truncated recombinant Arabidopsis GPT gene coding sequence and analysis of biological activity
In this example, to construct two different fragments of the predicted coding sequence of Arabidopsis GPT and to evaluate the activity of a truncated or truncated GPT protein lacking the putative chloroplast signal peptide, It was expressed in E. coli. A truncated set corresponding to SEQ ID NO: 2 of the full-length amino acid sequence of Arabidopsis GPT truncated to delete the first 30 amino-terminal amino acid residues or the first 45 amino-terminal amino acid residues The modified GPT protein was successfully expressed and, as confirmed by HPLC , showed biological activity catalyzing increased synthesis of 2-oxoglutaramate.

＜材料と方法＞
野生型およびＸＸ−３集団からのタバコ種子を表面殺菌し（５％漂白液に５分間、次いで１０％エタノールで３分間洗浄）、滅菌蒸留水で洗浄処理した。その後、表面殺菌した種子を、スクロースを含まず、０か、または２００ｍＭのＮａＣｌを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ培地（１０％アガロース）に拡散した。これらの種子を暗所で２日間、次いで１６：８の光周期で６日間置いて（２４℃で）発芽させた。８日目に、発芽速度を、発芽したコントロールまたはトランスジェニック植物からの種子の割合を測定して決定した。 <Materials and methods>
Tobacco seeds from wild type and XX-3 populations were surface sterilized (washed in 5% bleach for 5 minutes, then 10% ethanol for 3 minutes) and washed with sterile distilled water. The surface sterilized seeds were then diffused into Murashige and Skog medium (10% agarose) containing no sucrose and containing 0 or 200 mM NaCl. These seeds were allowed to germinate (at 24 ° C. ) for 2 days in the dark and then 6 days with a 16: 8 photoperiod. On day 8, the germination rate was determined by measuring the percentage of seeds from the germinated control or transgenic plants.

〔配列表〕 [Sequence Listing]

Claims

ＧＰＴ導入遺伝子およびＧＳ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物であって、
上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子は、植物プロモーターに操作可能に結合されている、トランスジェニック植物。 A transgenic plant comprising a GPT transgene and a GS transgene,
A transgenic plant wherein the GPT transgene and the GS transgene are operably linked to a plant promoter.

上記ＧＳ導入遺伝子はＧＳ１導入遺伝子である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。 The transgenic plant according to claim 1, wherein the GS transgene is a GS1 transgene.

上記ＧＰＴ導入遺伝子は、
（ａ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に示すアミノ酸配列、ならびに、
（ｂ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のいずれか１つと少なくとも７５％の同一性を有し、かつ、ＧＰＴ活性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載のトランスジェニック植物。 The GPT transgene is
(A) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 And the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36, and
(B) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 And an amino acid sequence having at least 75% identity with any one of SEQ ID NO: 36 and having GPT activity,
The transgenic plant according to claim 1 or 2, which encodes a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of:

上記ＧＳ導入遺伝子は、
（ａ）残基１１からの配列番号４および配列番号７に示すアミノ酸配列、および、
（ｂ）配列番号４または配列番号７と少なくとも７５％の同一性のあるアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項３に記載のトランスジェニック植物。 The GS transgene is
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7 from residue 11, and
(B) an amino acid sequence that is at least 75% identical to SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 7;
The transgenic plant according to claim 3, which encodes a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of:

上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子は、植物のゲノムに取り込まれている、請求項１〜４に記載のトランスジェニック植物。 The transgenic plant according to claim 1, wherein the GPT transgene and the GS transgene are incorporated into a plant genome.

単子葉植物である、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 The transgenic plant according to claim 5, which is a monocotyledonous plant.

双子葉植物である、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 The transgenic plant according to claim 5, which is a dicotyledonous plant.

請求項５に記載のトランスジェニック植物の任意の世代の子孫であって、
上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子を含む、子孫。 Progeny of any generation of the transgenic plant of claim 5,
A progeny comprising the GPT transgene and the GS transgene.

請求項５に記載のトランスジェニック植物の任意の世代の種子であって、
上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子を含む、種子。 Seeds of any generation of the transgenic plant of claim 5,
A seed comprising the GPT transgene and the GS transgene.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増強された成長速度を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. The transgenic plant of claim 5, which exhibits an enhanced growth rate compared to a similar wild type plant or non-transformed plant.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大されたバイオマス収量を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. The transgenic plant of claim 5, which exhibits increased biomass yield compared to similar wild type or non-transformed plants.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された種子の収量を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. A transgenic plant according to claim 5, which exhibits increased seed yield compared to similar wild-type or non-transformed plants.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された花または花芽の収量を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. The transgenic plant of claim 5, which exhibits increased flower or flower bud yield compared to similar wild type or non-transformed plants.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された果実またはさやの収量を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. The transgenic plant of claim 5, which exhibits increased fruit or pod yield compared to similar wild-type or non-transformed plants.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して大型の葉を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. The transgenic plant of claim 5, which exhibits large leaves compared to a similar wild type plant or non-transformed plant.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大されたＧＰＴ活性を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. The transgenic plant of claim 5, which exhibits increased GPT activity compared to a similar wild type plant or non-transformed plant.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大されたＧＳ活性を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. The transgenic plant of claim 5, which exhibits increased GS activity compared to a similar wild type plant or non-transformed plant.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された２−オキソグルタラメートのレベルを示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. A transgenic plant according to claim 5, which exhibits increased levels of 2-oxoglutaramate compared to similar wild type plants or non-transformed plants.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して向上された窒素利用効率を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. The transgenic plant of claim 5, which exhibits improved nitrogen utilization efficiency compared to similar wild type or non-transformed plants.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して、塩または塩分を含んだ環境に対して増強された耐性を示す、請求項５に記載のトランスジェニック植物。 6. The transgenic plant of claim 5, which exhibits enhanced resistance to a salt or salt-containing environment as compared to a similar wild type plant or non-transformed plant.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して、増強された成長特性を有する植物を生成するための方法であって、
（ａ）ＧＰＴ導入遺伝子を植物に導入する工程と、
（ｂ）ＧＳ導入遺伝子を上記植物または当該植物の子孫に導入する工程と、
（ｃ）上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子を、上記植物または当該植物の子孫において発現させる工程と、
（ｄ）ＧＰＴ導入遺伝子またはＧＳ導入遺伝子を含まない同種の植物と比較して、増強された成長特性を有する植物を選抜する工程と、を含む方法。 A method for producing a plant having enhanced growth characteristics as compared to a similar wild type plant or non-transformed plant comprising:
(A) introducing a GPT transgene into a plant;
(B) introducing a GS transgene into the plant or a progeny of the plant;
(C) expressing the GPT transgene and the GS transgene in the plant or a progeny of the plant;
(D) selecting a plant having enhanced growth characteristics as compared to a homologous plant not containing a GPT transgene or a GS transgene.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して、増強された成長特性を有する植物を生成する方法であって、
（ａ）ＧＳ導入遺伝子を植物に導入する工程と、
（ｂ）ＧＰＴ導入遺伝子を上記植物または当該植物の子孫に導入する工程と、
（ｃ）上記ＧＳ導入遺伝子および上記ＧＰＴ導入遺伝子を、上記植物または当該植物の子孫において発現させる工程と、
（ｄ）ＧＳ導入遺伝子またはＧＰＴ導入遺伝子を含まない同種の植物と比較して、増強された成長特性を有する植物を選抜する工程と、を含む方法。 A method for producing a plant having enhanced growth characteristics compared to a similar wild-type plant or non-transformed plant comprising:
(A) introducing a GS transgene into a plant;
(B) introducing a GPT transgene into the plant or a progeny of the plant;
(C) expressing the GS transgene and the GPT transgene in the plant or a progeny of the plant;
(D) selecting a plant having enhanced growth characteristics as compared to a homologous plant that does not contain a GS or GPT transgene.

上記増強された成長特性は、増大されたバイオマス、促進された開花、促進された発芽、増大された草高、増大された開花、増大された発芽、大型の葉、増大された果実またはさやの収量、および増大された種子の収量からなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の方法。 The enhanced growth characteristics include increased biomass, accelerated flowering, accelerated germination, increased plant height, increased flowering, increased germination, large leaves, increased fruit or pods. 23. A method according to claim 21 or 22, wherein the method is selected from the group consisting of yield, and increased seed yield.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して、向上された窒素利用効率を有する植物を生成するための方法であって、
（ａ）ＧＰＴ導入遺伝子を植物に導入する工程と、
（ｂ）ＧＳ導入遺伝子を上記植物または当該植物の子孫に導入する工程と、
（ｃ）上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子を、上記植物または当該植物の子孫において発現させる工程と、
（ｄ）ＧＰＴ導入遺伝子またはＧＳ導入遺伝子を含まない同種の植物と比較して、向上された窒素理由効率を有する植物を選抜する工程と、を含む方法。 A method for producing plants with improved nitrogen utilization efficiency compared to similar wild-type or non-transformed plants comprising:
(A) introducing a GPT transgene into a plant;
(B) introducing a GS transgene into the plant or a progeny of the plant;
(C) expressing the GPT transgene and the GS transgene in the plant or a progeny of the plant;
(D) selecting a plant having improved nitrogen reasoning efficiency as compared to a homologous plant not containing a GPT transgene or a GS transgene.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して、向上された窒素利用効率を有する植物を生成する方法であって、
（ａ）ＧＳ導入遺伝子を植物に導入する工程と、
（ｂ）ＧＰＴ導入遺伝子を上記植物または当該植物の子孫に導入する工程と、
（ｃ）上記ＧＳ導入遺伝子および上記ＧＰＴ導入遺伝子を、上記植物または当該植物の子孫において発現させる工程と、
（ｄ）ＧＳ導入遺伝子またはＧＰＴ導入遺伝子を含まない同種の植物と比較して、向上された窒素理由効率を有する植物を選抜する工程と、を含む方法。 A method of producing a plant with improved nitrogen utilization efficiency compared to a similar wild type plant or non-transformed plant, comprising:
(A) introducing a GS transgene into a plant;
(B) introducing a GPT transgene into the plant or a progeny of the plant;
(C) expressing the GS transgene and the GPT transgene in the plant or a progeny of the plant;
(D) selecting a plant having improved nitrogen reasoning efficiency as compared to the same type of plant not containing the GS transgene or GPT transgene.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して、塩または塩分を含んだ環境における発芽または生育に増強された耐性を有する植物を生成するための方法であって、
（ａ）ＧＰＴ導入遺伝子を植物に導入する工程と、
（ｂ）ＧＳ導入遺伝子を上記植物または当該植物の子孫に導入する工程と、
（ｃ）上記ＧＰＴ導入遺伝子および上記ＧＳ導入遺伝子を、上記植物または当該植物の子孫において発現させる工程と、
（ｄ）ＧＰＴ導入遺伝子またはＧＳ導入遺伝子を含まない同種の植物と比較して、増強された成長特性を有する植物を選抜する工程と、
（ｅ）上記植物からの種子を収穫し、高い塩分環境において増大された発芽を示す種子を選抜する工程と、を含む方法。 A method for producing a plant having enhanced resistance to germination or growth in a salt or salt-containing environment as compared to a similar wild-type plant or non-transformed plant comprising:
(A) introducing a GPT transgene into a plant;
(B) introducing a GS transgene into the plant or a progeny of the plant;
(C) expressing the GPT transgene and the GS transgene in the plant or a progeny of the plant;
(D) selecting a plant having enhanced growth characteristics as compared to a homologous plant not containing a GPT transgene or a GS transgene;
(E) harvesting seeds from the plant and selecting seeds that show increased germination in a high salinity environment.

類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して、塩または塩分を含んだ環境における発芽または生育に増強された耐性を有する植物を生成する方法であって、
（ａ）ＧＳ導入遺伝子を植物に導入する工程と、
（ｂ）ＧＰＴ導入遺伝子を上記植物または当該植物の子孫に導入する工程と、
（ｃ）上記ＧＳ導入遺伝子および上記ＧＰＴ導入遺伝子を、上記植物または当該植物の子孫において発現させる工程と、
（ｄ）ＧＳ導入遺伝子またはＧＰＴ導入遺伝子を含まない同種の植物と比較して、増強された成長特性を有する植物を選抜する工程と、
（ｅ）上記植物からの種子を収穫し、高い塩分環境において増大された発芽を示す種子を選抜する工程と、を含む方法。 A method of producing a plant having enhanced resistance to germination or growth in a salt or salt-containing environment as compared to a similar wild type plant or non-transformed plant, comprising:
(A) introducing a GS transgene into a plant;
(B) introducing a GPT transgene into the plant or a progeny of the plant;
(C) expressing the GS transgene and the GPT transgene in the plant or a progeny of the plant;
(D) selecting a plant having enhanced growth characteristics compared to a homologous plant that does not contain a GS transgene or a GPT transgene;
(E) harvesting seeds from the plant and selecting seeds that show increased germination in a high salinity environment.

選抜された上記種子から植物を繁殖させて、当該植物から種子を収穫する工程をさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。 28. The method according to claim 26 or 27, further comprising the step of propagating a plant from the selected seed and harvesting the seed from the plant.