JP2012500637A - 終止コドンのリードスルーによるポリペプチドアイソフォームの細胞表面提示 - Google Patents
終止コドンのリードスルーによるポリペプチドアイソフォームの細胞表面提示 Download PDFInfo
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-
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Abstract
Description
a)対象とするポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(Pn−POI)、第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドン、および免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体をコードする、終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドを少なくとも含む少なくとも1つのカセット(Cas−POI)を含む異種核酸を含む複数の真核宿主細胞を提供するステップと、
b)対象とするポリペプチドの少なくとも一部が免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドとして発現されるように、真核宿主細胞を培養して対象とするポリペプチドを発現させるステップであって、前記融合ポリペプチドが前記宿主細胞の表面上に提示されているステップと、
c)細胞表面上に提示されている融合ポリペプチドの存在または量に基づいて少なくとも1つの真核宿主細胞を選択するステップと
を含む方法を提供することによって、この問題を解決する。
a)対象とするポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(Pn−POI)、第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドン、および免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体をコードする、終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのカセット(Cas−POI)を含む異種核酸を含む複数の真核宿主細胞を提供するステップと、
b)対象とするポリペプチドの少なくとも一部が免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドとして発現されるように、真核宿主細胞を培養して対象とするポリペプチドを発現させるステップであって、前記融合ポリペプチドが前記宿主細胞の表面上に提示されているステップと、
c)細胞表面上に提示されている融合ポリペプチドの存在または量に基づいて少なくとも1つの真核宿主細胞を選択するステップと、
d)対象とするポリペプチドの発現を許容する条件下で、培地中で選択された真核宿主細胞を培養するステップと
を含む方法も提供される。
その翻訳の結果対象とするポリペプチドが生じる第1のポリヌクレオチドと、
前記第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドンと、
その翻訳の結果免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体を生じる、前記終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドと
を少なくとも含む転写物が生じる。
TGACTA コード鎖、したがってDNAレベルにおける終止コーディングの配置のヌクレオチド配列;終止コドンは太字および下線で示されている
UGACUA RNAレベルにおける終止コドンの配置のヌクレオチド配列
W L 翻訳リードスルーが起こった場合の終止コドンおよび隣接コドンに対応する推定アミノ酸;したがって、示されているポリヌクレオチドの最も可能性の高いリードスルー産物が示されている
前記化合物が標識されていること、
前記化合物が蛍光標識されていること、
前記化合物が抗原であること、
前記化合物が免疫グロブリン分子またはその結合断片であること、
前記化合物がプロテインA、G、および/またはLであること
のうち少なくとも1つを有し得る。
第1のポリヌクレオチドの下流に位置する少なくとも1つの終止コドンの下流に位置するアフィニティータグをコードし、免疫グロブリン膜貫通アンカーもしくはその機能的変異体をコードする第2のポリヌクレオチドの上流に位置するポリヌクレオチド(Pn−TAG)、および/または
選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチド(Pn−MARKER)
をさらに含む。
アフィニティータグを標的とするアフィニティー精製により、分断された融合ポリペプチドの混入物を除去すること、および/または
アフィニティータグを標的とすることにより、分断された融合タンパク質の存在の有無を検出すること
によってさらに処理することができる。
対象とするポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(Pn−POI)、
哺乳動物の選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(Exp−MSM)、および/または
哺乳動物の増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(Exp−MASM)
を少なくとも含んでよい。
免疫グロブリン分子の重鎖および/もしくは軽鎖またはその機能的断片をコードする第1のポリヌクレオチドと、第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドンと、免疫グロブリン膜貫通アンカーもしくはその機能的断片を少なくともコードする、終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドとを含む発現カセット(Exp−POI)、ならびに/または
免疫グロブリン分子の重鎖および/もしくは軽鎖またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む追加の発現カセット(Exp−POI’)を含む。発現カセット(Exp−POI’)は、発現カセット(Exp−POI)の免疫グロブリン鎖に対応する免疫グロブリン鎖をコードする(すなわち、発現カセット(Exp−POI)が重鎖をコードする場合、発現カセット(Exp−POI’)は軽鎖をコードし、その逆も同様である)。したがって、ベクターから機能的な免疫グロブリン分子(またはその断片)を発現させることができる。
免疫グロブリン分子の重鎖またはその機能的断片をコードする第1のポリヌクレオチド、第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドン、および免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体をコードする、終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドを含む発現カセット(Exp−POI)と、
免疫グロブリン分子の対応する軽鎖またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む追加の発現カセット(Exp−POI’)と
を含む。
第1のポリヌクレオチドの下流に位置する少なくとも1つの終止コドンの下流に位置するアフィニティータグをコードし、免疫グロブリン膜貫通アンカーをコードする第2のポリヌクレオチドの上流に位置するポリヌクレオチド(Pn−TAG)、および/または
選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチド(Pn−MARKER)
をさらに含む。
哺乳動物の選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(Exp−MSM)、
哺乳動物の増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(Exp−MASM)
を構築するステップをさらに含んでよく、好ましくは、その結果発現カセット(Exp−MASM)が発現カセット(Exp−POI)の5’に位置し、発現カセット(Exp−MSM)が3’に位置し、発現カセット(Exp−MASM)、(Exp−POI)および(Exp−MSM)が同じ5’から3’の方向で配置される。
IgG1定常重鎖領域の一部+漏出終止コドンスタッファーならびにIg膜貫通および細胞質ドメインをコードする1113bpの合成DNA断片を、Age1およびAsc1を介してpBW201(IgG1重鎖およびκ軽鎖を含有する標準的なベクター)に挿入して、pNT11を得る(表1を参照)。使用されるIg膜貫通ドメインのヌクレオチド配列は配列番号1で示され、漏出終止コドンスタッファーが示されている。もちろん、本発明の原理に従って、同じ膜固着機能をもたらす、コードされたIg膜貫通ドメインの変異体を使用することもできる。前記変異体は、コードされたIg膜貫通ドメインの相同体であり、例えば、保存的アミノ酸置換によって得ることができる。これらは、好ましくは少なくとも80%、85%、90%の相同性を有する。それぞれの変異体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、厳密な条件下で、示された配列とハイブリダイズする。
CMVprom/enh=ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター/エンハンサー
RK−イントロン=CMVプロモーターのイントロンドナースプライス部位、およびマウスIgG重鎖可変領域のアクセプタースプライス部位を含む(例えば、Eatonら、1986、Biochemistry 25、8343〜8347、Neubergerら、1983、EMBO J.2(8)、1373〜1378を参照;それは、pRK−5ベクター(BD PharMingen)から得ることができる)
mAB−LC=モノクローナル抗体軽鎖
mAB−HC=モノクローナル抗体重鎖
SV40ポリA=SV40ポリA部位
SV40prom/enhan=SV40プロモーター/エンハンサー
Neo=ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
合成ポリA=合成ポリアデニル化部位
Amp=βラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子
DHFR=ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子。
専売の既知組成培地中でCHO細胞を増殖させている懸濁液を使用して、振盪フラスコで細胞培養、トランスフェクションおよびスクリーニングを実施する。製造業者の説明書に従って、リポフェクションまたはエレクトロポレーション(ヌクレオフェクション)により細胞をトランスフェクトする。GFP(緑色蛍光タンパク質)レポータープラスミドをトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞のフローサイトメトリー分析を行うことによってトランスフェクション効率を確認する。細胞生存率に応じて、G418含有選択培地を細胞に添加することにより、トランスフェクションの24〜48時間後に選択を開始する。細胞が80%を上回る生存率まで回復するとすぐに、G418を含まないMTX(メトトレキセート)含有培地に細胞を継代することによって第2の選択ステップを適用する。MTX選択から細胞が回復した後、FACS濃縮サイクル、FACSクローン化または限界希釈クローン化およびスクリーニングの全体にわたってMTX含有培地中で培養を続ける。
細胞の標識:トランスフェクトしたプール当たり2×10E7個の細胞を遠心分離し、冷やしたPBS(リン酸緩衝食塩水)5mLで洗浄し、冷PBS1mL中に再懸濁する。適切な量のFITC(フルオレセインイソチオシアネート)標識抗IgG抗体を細胞に添加し、氷上で30分間、暗所でインキュベートする。その後、細胞を室温で2回、PBS5mLで洗浄し、PBS1mL中に再懸濁し、それを濾過し、分析、選別およびクローン化用のFACSチューブ中に分注する。
クローンの産生能は、異なる形式を使用して、回分および流加実験で分析する。初回のクローンスクリーニングは、24ウェルプレート回分アッセイで、振盪した24ウェルプレートに細胞を播くことによって行う。培養の開始から10日後に、プロテインA HPLCによって細胞培養上清中の抗体濃度を決定する。最高の産生クローンも回分および流加式で振盪フラスコモデルにおいて分析する。使用容量が100mLである500mLの振盪フラスコ中に回分培養物を播き、振盪キャビネット(加湿しない)中で、150rpmおよび10%CO2で培養する。細胞の生存率は、アッセイの開始時に>90%であるべきである。播く細胞の密度は2×105c/mLである。産物濃度/細胞数/生存率の決定は3〜7、10および13日目に行う。同じ条件を使用して流加実験を行うが、開始細胞密度を4×105c/mLにし、定期的に栄養を添加する。振盪フラスコ回分モデルを使用して2週間ごとに産生能を測定しつつ14週間にわたって細胞を培養することにより、クローン安定性を評価する。
新たなFACSベクター(ここではpNT11またはpNT29)でのトランスフェクション後に膜結合翻訳産物が細胞表面上に存在するかどうかを試験するために、免疫染色およびフローサイトメトリーによって、一過性にトランスフェクトした細胞を分析する。トランスフェクションから48時間後、ヒトIgGに対するFITC標識抗体で細胞を染色する。GFP発現ベクターをトランスフェクトした細胞がトランスフェクション対照として使用され、トランスフェクション効率が約60%であると計算される。非トランスフェクト細胞および標準的なベクター(膜貫通ドメインを含まない)をトランスフェクトした細胞は、著しいレベルの表面結合抗体を示さないが、FACSベクターをトランスフェクトした細胞の16%がバックグラウンドレベルを超えて染色される。これは、細胞膜に固着した融合ペプチド、ここでは抗体分子を細胞表面上で検出できることを示す。
一過性にトランスフェクトした細胞上で膜結合抗体の存在が示された後、トランスフェクトした細胞の選択されたプールにおける表面発現レベルおよび分布を分析する。それによって、FACS選別により産生細胞を選択的に濃縮できることを示すことができる。したがって、トランスフェクション後の細胞をG418で、その後MTXで選択する。得られた耐性細胞のプールをFITC標識抗IgG抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析する。対照として、非トランスフェクト細胞を染色し分析する。FACSベクターをトランスフェクトした、選択されたプール中で、陽性細胞の部分集団を検出する。それによる陽性細胞の分布は、2つの分析されたプール間で異なっていた。高産生細胞をその蛍光シグナルに基づいて濃縮できるかどうか(したがって定量的選択が可能であるかどうか)を評価するために、2つのプールそれぞれから最も高い蛍光強度を有する細胞を選別し(上位5%)、継代培養して産生能を濃縮前のプールと比較する。
13日目に最終産物濃度を比較する、振盪フラスコ回分培養物におけるフローサイトメトリー濃縮前後の選択されたプールの産生能分析を行う。13日目に上清を回収し、プロテインA−HPLCによりIgG含量について分析する。本発明の教示によるFACS濃縮サイクルを1回行った後すでにどちらのプールも産生レベルの著しい増大を示す。プール1の産物濃度はおよそ2倍増大するが、プール2はほぼ10倍増大し、このことは高産生細胞が染色および選別の間に選択的に検出されることを示す。最初の濃縮サイクルですでにほぼ250mg/lの抗体濃度を得ることができる。
フローサイトメトリーを使用して、個々の染色細胞をその染色プロファイルに従って選別し播くことができる。そのような選択的クローン化の結果、限界希釈によるクローン化より高産生クローンの数が多くなるかどうかを分析するために、両方の方法を使用してクローンを得、24ウェルプレート回分培養物において産生能を分析する。24ウェルプレート中で回分培養を行い、10日目に上清を回収し、プロテインA−HPLCによりIgG含量について測定する。その結果は下記の通りである:
トランスフェクトした細胞のフローサイトメトリー濃縮の有益な効果を確認し、FACSベクター(pNT29)の使用を標準的なベクターと比較するために、細胞にトランスフェクトし、G418およびMTXで選択する。FACSベクターをトランスフェクトした3つの細胞プール(試料1、2および3)および標準的なベクターをトランスフェクトした3つの細胞プール(試料7、9および9)をフローサイトメトリーによって分析し、最も高い染色シグナルを有する5%を選別する。振盪フラスコ回分培養を行って、濃縮後の産物濃度の増大を比較する。トランスフェクトし選択したプールを染色しフローサイトメトリーにより選別して、蛍光強度に基づいて上位5%を濃縮する。濃縮の前後で振盪フラスコ回分培養を行い、13日後にプロテインA−HPLCによって上清を分析する。その結果は(およそ)下記の通りである:
a)ベクター構築
実施例1に記載のようにベクターpBW201、pNT11、pBW478およびpNT29を得る。
実施例2に記載のようにこれを行う。
実施例3に記載のようにこれを行う。
クローンおよびプールの産生能は、異なる形式を使用して、回分および流加実験で分析する。振盪フラスコ回分アッセイで、許容量250mLの振盪フラスコを使用して、使用容量50mL中に1mL当たり細胞1×105個(c/mL)を播くことによりFACS濃縮前後のプールを分析する。回分培養の13日目で採取された試料のプロテインA−HPLCによってIgG含量を分析する。クローンの初回のスクリーニングは、24ウェルプレート回分アッセイで、振盪した24ウェルプレートに細胞を播くことによって行う。培養の開始から10日後に、定量的プロテインA−HPLCによって細胞培養上清中の抗体濃度を決定する。最高の産生クローンを、回分および流加式で振盪フラスコモデルにおいて分析する。使用容量100mLの振盪フラスコ(許容量500mL)中に回分培養物を播き、振盪キャビネット(加湿しない)中で、150rpm、36.5℃および10%CO2で培養する。細胞の生存率は、アッセイの開始時に>90%である。播く細胞の密度は2×105c/mLである。抗体濃度、細胞数および生存率は3〜7、10および13日目に決定する。同じ条件を使用して流加実験を行うが、実行期間を17日とし、開始細胞密度を4×105c/mLにし、生存細胞密度が7×106c/mLを上回ってから定期的に栄養を添加する。振盪フラスコ回分モデルを使用して2週間ごとに産生能を測定しつつ12週間にわたって細胞を培養することにより、クローン安定性を評価する。
安定にトランスフェクトされた細胞集団における表面発現を分析して、FACS選別により産生細胞を選択的に濃縮できるかどうかを試験する。したがって、トランスフェクション後の細胞をG418で、その後MTXで選択する。得られた耐性細胞のプール(ベクター当たり10個)を上記に記載のように染色し、フローサイトメトリーによって分析する。使用した染色プロトコールで、pBW478とpNT29両方のトランスフェクト細胞プールにおいて細胞の陽性部分集団を検出することができる。予想されるように、FACSベクターで高い割合のFACS陽性細胞が認められる。
13日目に最終力価を比較する、振盪フラスコ回分培養物におけるフローサイトメトリー濃縮前後の選択されたプールの産生能分析を行う。濃縮前のプールの産生能は、使用した両方のベクターで非常に似た範囲にある。個々のプールに対する1回目の濃縮サイクルで、平均産生能の著しい向上が全ての手法で実現され、さらに、個々のプール間に実質的な変動が存在する(表6bを参照)。驚くべきことに、非常に高いレベルのFACS染色陽性細胞が前に認められたが、標準的なベクターをトランスフェクトしたプールの産生能は、FACSベクターをトランスフェクトしたものと比較して高くない。プールし選別した細胞集団から2回目に選別することによって、標準的なベクターでは産生能のさらなる向上は実現されない。対照的に、FACS染色結果からほぼ100%の細胞が抗体を産生しているはずであることが示唆されるが(表6aを参照)、低い産生能が得られる。FACSベクターをトランスフェクトしたプールの産生能は、2回目に選別することによって著しく向上させることができた。使用したFACS手順で、高産生細胞がより選択的に濃縮され、産生能が非選別集団と比較して少なくとも約8倍、1回選別した後のプールと比較して少なくとも2倍増大する。
フローサイトメトリーを使用して、個々の染色細胞をその染色プロファイルに従って選別し播くことができる。そのような選択的クローン化の結果、標準的なベクターと比較してFACSベクターを使用したときに高産生クローンの数が多くなるかどうかを分析するために、両方の方法を使用してクローンを得、24ウェルプレート回分培養物において産生能を分析する。
標準的なベクターに由来するLPクローンならびに10個の高産生FACSベクタークローンを振盪フラスコに増殖させ、それを一般的な振盪フラスコ回分および流加モデルで試験してその製造潜在性を評価する。
例えばウェーブ、ガラスまたはステンレス鋼バイオリアクター中で大規模なポリペプチドの産生を行うことができる。その目的で、通常は単一の冷凍バイアル、例えばマスターセルバンク(Master Cell Bank)のバイアルから開始して細胞を増殖させる。細胞を解凍し、いくつかのステップを介して増殖させる。様々な規模のバイオリアクターに適当な量の細胞を接種する。栄養溶液および添加物をバイオリアクターに添加することによって、細胞密度を増大させることができる。細胞は高い生存率で長い間維持される。1リットル当たり数百ミリグラムから最大で1リットル当たり数グラムにわたるリアクター中の産物濃度が大規模に実現される。アフィニティー、イオン交換、疎水性相互作用またはサイズ排除クロマトグラフィーステップを含み得る、標準的なクロマトグラフィー法によって精製を行うことができる。バイオリアクターのサイズは最終的な規模で最大数千リットルの容量となり得る(例えば、F.Wurm、Nature Biotechnology 22巻、11、2004、1393〜1398も参照されたい)。
Claims (15)
- 所望されるレベルの対象とするポリペプチドを発現する少なくとも1つの真核宿主細胞を選択する方法であって、
a)対象とするポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(Pn−POI)、第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドン、および免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体をコードする、終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドを少なくとも含む少なくとも1つのカセット(Cas−POI)を含む異種核酸を含む複数の真核宿主細胞を提供するステップと、
b)対象とするポリペプチドの少なくとも一部が免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドとして発現されるように、真核宿主細胞を培養して対象とするポリペプチドを発現させるステップであって、前記融合ポリペプチドが前記宿主細胞の表面上に提示されているステップと、
c)細胞表面上に提示されている融合ポリペプチドの存在または量に基づいて少なくとも1つの真核宿主細胞を選択するステップと
を含む方法。 - 高収量で対象とするポリペプチドを産生する方法であって、
a)対象とするポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(Pn−POI)、第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドン、および免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体をコードする、終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのカセット(Cas−POI)を含む異種核酸を含む複数の真核宿主細胞を提供するステップと、
b)対象とするポリペプチドの少なくとも一部が免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドとして発現されるように、真核宿主細胞を培養して対象とするポリペプチドを発現させるステップであって、前記融合ポリペプチドが前記宿主細胞の表面上に提示されているステップと、
c)細胞表面上に提示されている融合ポリペプチドの存在または量に基づいて少なくとも1つの真核宿主細胞を選択するステップと、
d)対象とするポリペプチドの発現を許容する条件下で、培地中で選択された真核宿主細胞を培養するステップと
を含む方法。 - カセット(Cas−POI)の発現の結果、
その翻訳の結果対象とするポリペプチドが生じる第1のポリヌクレオチドと、
前記第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドンと、
その翻訳の結果免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体が生じる、前記終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドと
を少なくとも含む転写物が生じ、転写物の少なくとも一部が、少なくとも1つの終止コドンの翻訳リードスルーにより、免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドに翻訳される、請求項1または2に記載の方法。 - 免疫グロブリン膜貫通アンカーが、
a)IgA、IgE、IgM、IgGおよび/またはIgDに由来する膜貫通アンカー、
b)細胞質ドメインを含む免疫グロブリン膜貫通アンカー、
c)配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および/または配列番号7で示される配列を含む免疫グロブリン膜貫通アンカー、ならびに
d)融合ポリペプチドと真核宿主細胞の表面の固着を可能にする、上記a)〜c)に記載の膜貫通アンカーの機能的変異体
からなる群から選択される、請求項1から3の少なくとも一項に記載の方法。 - ステップc)が 、融合ポリペプチドと結合する検出化合物と複数の真核宿主細胞を接触させるステップと、結合した検出化合物の存在または量に基づいて少なくとも1つの真核宿主細胞を選択するステップとを含む、請求項1から4の一項に記載の方法。
- 終止コドンのリードスルーの結果、およそ≦50%、≦25%、≦15%、≦10%、≦5%、≦2.5%、≦1.5%、≦1%のまたは≦0.5%より少ない融合ポリペプチドが生じる、請求項1から5の少なくとも一項に記載の方法。
- 2つ以上の選択サイクルを行い、各選択サイクルにおいて、細胞表面上に提示されている融合ポリペプチドの存在または量に基づいて少なくとも1つの真核宿主細胞が選択される、請求項1から6の少なくとも一項に記載の方法。
- 検出化合物と真核宿主細胞の表面との結合が、フローサイトメトリーによって検出される、請求項1から7の少なくとも一項に記載の方法。
- 真核宿主細胞中で少なくとも1つの対象とするポリペプチドを発現させるのに適したベクター核酸であって、
a)対象とするポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(Pn−POI)の挿入部位、および/または対象とするポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのカセット(Cas−POI)と、
b)前記挿入部位の下流および/または第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドンと、
c)免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体をコードする、終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドと
を含むベクター核酸。 - 下記の特徴:
カセット(Cas−POI)中にある、対象とするポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(Pn−POI)、
哺乳動物の選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(MSM)、および/または
哺乳動物の増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(MASM)
のうち少なくとも1つを含む、請求項9に記載のベクター核酸。 - 免疫グロブリン分子の重鎖またはその機能的断片をコードする第1のポリヌクレオチド、第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドン、および免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体をコードする、終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドを含む発現カセット(Exp−POI)と、
免疫グロブリン分子の対応する軽鎖またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む追加の発現カセット(Exp−POI’)と
を含む、少なくとも1つの免疫グロブリン分子またはその機能的変異体を発現させるための請求項9または10に記載のベクター核酸。 - 請求項9から11の少なくとも一項に記載のベクター核酸を作製する方法であって、カセット(Cas−POI)が、対象とするポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(Pn−POI)、第1のポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドン、および免疫グロブリン膜貫通アンカーまたはその機能的変異体をコードする、終止コドンの下流にある第2のポリヌクレオチドを含むように、ベクター中に少なくとも1つの前記カセット(Cas−POI)を構築するステップを含む方法。
- 下記の特徴:
a)請求項1から8の少なくとも一項に記載の方法によって得られること、
b)対象とするポリヌクレオチドをコードする異種ポリヌクレオチド、前記異種ポリヌクレオチドの下流にある少なくとも1つの終止コドン、および免疫グロブリン膜貫通アンカーもしくはその機能的変異体をコードする、終止コドンの下流にあるポリヌクレオチドを少なくとも含むカセット(Cas−POI)を含むこと、ならびに/または
c)請求項9から11の少なくとも一項に記載のベクター核酸を含むこと
のうち少なくとも1つを有する真核宿主細胞。 - 対象とするポリペプチドを産生する方法であって、請求項13に記載の真核宿主細胞を培養して対象とするポリペプチドを発現させる方法。
- 請求項2から8または14の一項に記載の対象とするポリペプチドを産生する方法であって、下記のステップ:
細胞培養物から前記ポリペプチドを得るステップ、
培地中に前記ポリペプチドを分泌させ培地から前記ポリペプチドを得るステップ、
真核宿主細胞を破砕して、発現した前記ポリペプチドを得るステップ、
発現した前記ポリペプチドを単離するステップ、
発現した前記ポリペプチドを精製するステップ、ならびに/または
発現した前記ポリペプチドをさらに処理および/もしくは修飾するステップ
のうち少なくとも1つを行う、方法。
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