JP2012254061A - Nigerose phosphorylase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ホスホリラーゼ酵素及びその利用に関する。 The present invention relates to phosphorylase enzymes and uses thereof.
ホスホリラーゼは、グリコシド結合を加リン酸分解する酵素の総称である。ホスホリラーゼは、その可逆的な加水分解反応や厳密な反応位置特異性から、特定のオリゴ糖の調製に有用であることが知られている。ホスホリラーゼの反応の可逆性を利用して、様々なオリゴ糖が対応する糖１−リン酸から逆反応を用いて合成されている（非特許文献１〜３及び特許文献１）。単独のホスホリラーゼを用いて、又は２つのホスホリラーゼを組み合わせて用いて、より安価な原料からオリゴ糖を生成することも可能になっている。
Phosphorylase is a general term for enzymes that phosphorylate glycosidic bonds. Phosphorylase is known to be useful for the preparation of specific oligosaccharides because of its reversible hydrolysis reaction and strict reaction site specificity. Using the reversibility of phosphorylase reaction, various oligosaccharides have been synthesized from the corresponding sugar 1-phosphate using a reverse reaction (
従来クローニングされている反転型ホスホリラーゼは全て、ＣＡＺｙデータベース（http://www.cazy.org）中でグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー６５、９４又は１１２に分類されている。グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー６５は、α−Ｄ−グルコシル結合を加リン酸分解してβ−Ｄ−グルコース１−リン酸（β−グルコース１−リン酸；β-Ｇ１Ｐ）を生成するホスホリラーゼを含有するファミリーである。現在では、トレハロースホスホリラーゼ（EC 2.4.1.64）、コージビオースホスホリラーゼ（EC 2.4.1.230）、マルトースホスホリラーゼ（EC 2.4.1.8）及びトレハロース６−リン酸ホスホリラーゼ（EC 2.4.1.216）が、ＧＨ６５酵素のメンバーとして知られている。 All previously cloned inverted phosphorylases are classified in glycoside hydrolase (GH) family 65, 94 or 112 in the CAZy database (http://www.cazy.org). Glycoside hydrolase (GH) family 65 contains phosphorylases that phosphorylate α-D-glucosyl bonds to produce β-D-glucose 1-phosphate (β-glucose 1-phosphate; β-G1P). Family. Currently, trehalose phosphorylase (EC 2.4.1.64), cordobiose phosphorylase (EC 2.4.1.230), maltose phosphorylase (EC 2.4.1.8) and trehalose 6-phosphate phosphorylase (EC 2.4.1.216) are members of the GH65 enzyme. Known as.
しかしながら、既知のホスホリラーゼの基質特異性のバリエーションはまだ少ない。そのため、ホスホリラーゼを用いたオリゴ糖製造法を適用可能な範囲はなおも限定されている。このため新規な基質特異性を有するホスホリラーゼの取得がなおも望まれている。例えば、グルコース２分子がα−１，３結合したグルコシル二糖であるニゲロースを特異的に加リン酸分解するホスホリラーゼは、ホスホリラーゼを用いたニゲロースの製造に重要であると考えられるが、そのような酵素はこれまで報告されていない。 However, there are still few variations in the substrate specificity of known phosphorylases. Therefore, the range in which the oligosaccharide production method using phosphorylase can be applied is still limited. For this reason, acquisition of phosphorylase having a novel substrate specificity is still desired. For example, phosphorylase that specifically phosphorylates nigerose, which is a glucosyl disaccharide in which two glucose molecules are α-1,3 linked, is considered to be important for the production of nigerose using phosphorylase. Enzymes have not been reported so far.
本発明は、ニゲロースに対して特異的な加リン酸分解活性を有する酵素を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an enzyme having a phosphorolytic activity specific to nigerose.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、クロストリディウム・フィトファーメンタンス（Clostridium phytofermentans）から新規な活性、すなわち、ニゲロースを高い特異性で加リン酸分解してβ−グルコース１−リン酸を生成するニゲロースホスホリラーゼ酵素を取得し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have been able to phosphorylate nigerose with high specificity from Clostridium phytofermentans. Thus, a nigerose phosphorylase enzyme that produces β-glucose 1-phosphate was obtained, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］ ニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ−グルコース１リン酸を生成する活性を有する酵素。
本酵素は、基質濃度１０ｍＭのコージビオース、マルトース及びトレハロースに対する加リン酸分解活性が、基質濃度１０ｍＭのニゲロースに対する加リン酸分解活性と比較していずれも５％以下であることが好ましい。
本酵素はまた、
（ａ）３０℃の条件下で至適ｐＨが６．５〜７．５であり、ｐＨ５．５〜９．０で安定であり、
（ｂ）ｐＨ７．０の条件下で至適温度が４０℃であり、１５℃〜４０℃の範囲で安定であり、
（ｃ）ゲルろ過法で測定した分子量が２００ｋＤａであり、
（ｄ）二量体であり、
（ｅ）クロストリディウム・フィトファーメンタンス由来である
酵素であることが好ましい。
本酵素は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質から構成されることがさらに好ましい。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ−グルコース１リン酸を生成する活性を有するタンパク質
［２］ 上記［１］の酵素を、リン酸存在下でニゲロースと反応させることを含む、ニゲロースの分解方法。
［３］ 上記［１］の酵素を、β−グルコース１リン酸、及び単糖若しくはその誘導体と反応させてα−グルコシル結合を生成することを含む、α−グルコシル結合を有する二糖の製造方法。
この方法において用いる単糖又はその誘導体は、グルコース、ガラクトース、キシロース、１，５−アンヒドロ−グルシトール、グルクロン酸、及びα−メチルグルコシドからなる群から選択されることが好ましい。
この方法の特に好ましい態様では、用いる単糖又はその誘導体がグルコースであり、製造されるα−グルコシル結合を有する二糖がニゲロースであってよい。
That is, the present invention includes the following.
[1] An enzyme having an activity to specifically and reversibly phosphorylate nigerose to produce glucose and β-glucose monophosphate.
The enzyme preferably has a phosphorolytic activity for 10 mM substrate concentration of Codybiose, maltose and trehalose, all 5% or less compared to the phosphorolytic activity for nigerose having a substrate concentration of 10 mM.
The enzyme is also
(A) The optimum pH is 6.5 to 7.5 under the condition of 30 ° C., stable at pH 5.5 to 9.0,
(B) the optimum temperature is 40 ° C. under the condition of pH 7.0, stable in the range of 15 ° C. to 40 ° C.,
(C) The molecular weight measured by gel filtration is 200 kDa,
(D) is a dimer,
(E) It is preferably an enzyme derived from Clostridium phytofermentans.
The enzyme is more preferably composed of the following protein (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b) consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, And the protein [2] which has the activity which produces phosphorylation of nigerose specifically and reversibly and produces | generates glucose and (beta) -
[3] A method for producing a disaccharide having an α-glucosyl bond, which comprises reacting the enzyme of [1] with β-glucose monophosphate and a monosaccharide or a derivative thereof to generate an α-glucosyl bond. .
The monosaccharide or derivative thereof used in this method is preferably selected from the group consisting of glucose, galactose, xylose, 1,5-anhydro-glucitol, glucuronic acid, and α-methyl glucoside.
In a particularly preferred embodiment of this method, the monosaccharide or derivative thereof used may be glucose, and the produced disaccharide having an α-glucosyl bond may be nigerose.
本発明によれば、ニゲロースに対する特異的かつ可逆的な加リン酸分解活性を有する酵素ニゲロースホスホリラーゼを提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the enzyme nigerose phosphorylase which has the specific and reversible phosphorolysis activity with respect to nigerose can be provided.
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ニゲロースホスホリラーゼ酵素
本発明者らは、森林土壌に見出された嫌気性中温性セルロース分解性細菌であるクロストリディウム・フィトファーメンタンス（Clostridium phytofermentans）から、本発明に係る新規な活性を有する新規酵素を取得した。本発明はこの知見に基づく。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Nigerose Phosphorylase Enzyme The present inventors have developed a novel activity according to the present invention from Clostridium phytofermentans, an anaerobic mesophilic cellulolytic bacterium found in forest soil. A new enzyme was obtained. The present invention is based on this finding.
本発明に係る酵素ニゲロースホスホリラーゼは、α−グルコシル二糖（α−グルコシル結合を有する二糖；特に、α−１，３結合含有グルコシル二糖）、とりわけニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解して、グルコースとβ−グルコース１リン酸を生成するという新規な活性を有する。本酵素は、リン酸存在下で加リン酸分解活性を示し、リン酸非存在下では加リン酸分解活性を示さない。 The enzyme nigerose phosphorylase according to the present invention specifically and reversibly phosphorylates α-glucosyl disaccharide (a disaccharide having an α-glucosyl bond; in particular, an α-1,3-linked glucosyl disaccharide), particularly nigerose. It has a novel activity of acid decomposition to produce glucose and β-glucose monophosphate. This enzyme exhibits phosphorolytic activity in the presence of phosphate, and does not exhibit phosphorolytic activity in the absence of phosphate.
本酵素は、ニゲロースに対して高度な基質特異性を示し、一方、他のα−グルコシル二糖に対しては同一反応条件（例えば、反応液中の濃度１０ｍＭ）でのニゲロースに対する加リン酸分解活性と比較して、加リン酸分解活性をほとんど（例えば５％以下）示さない。具体的には、本酵素は、α−グルコシル二糖であるコージビオースに対して、同一反応条件（例えば、反応液中の濃度１０ｍＭ）でのニゲロースに対する加リン酸分解活性を１００％として比較した場合、５％以下、好ましくは２％以下の加リン酸分解活性しか有しない。本酵素は、α−グルコシル二糖であるマルトース及びトレハロースに対して、同一反応条件（例えば、反応液中の濃度１０ｍＭ）でのニゲロースに対する加リン酸分解活性を１００％として比較した場合、５％以下、好ましくは２％以下、さらに好ましくは検出限界以下（例えば、０．０１％以下）の加リン酸分解活性しか有しない。本酵素はさらに、イソマルトース及びスクロースに対して、同一反応条件（例えば、反応液中の濃度１０ｍＭ）でのニゲロースに対する加リン酸分解活性を１００％として比較した場合、５％以下、好ましくは２％以下、さらに好ましくは検出限界以下（例えば、０．０１％以下）の加リン酸分解活性しか有しない。本発明において、本発明に係る酵素の「ニゲロースに特異的な加リン酸分解活性」及び「ニゲロースを特異的に加リン酸分解する」との表現は、ニゲロースに対する加リン酸分解活性を１００％として比較した場合の相対活性で、ニゲロース以外のほとんどの（好ましくは全ての）α−グルコシル二糖に対しては１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下の加リン酸分解活性しか、本発明に係る酵素が示さないことを意味する。
This enzyme exhibits a high substrate specificity for nigerose, while phosphorylation for nigerose under the same reaction conditions (for example, 10 mM concentration in the reaction solution) for other α-glucosyl disaccharides. Compared with activity, it shows little (for example, 5% or less) phosphorolytic activity. Specifically, the present enzyme is compared with α-glucosyl disaccharide, cordobiose, where the phosphorolytic activity for nigerose under the same reaction conditions (for example, concentration of 10 mM in the reaction solution) is 100%. It has only 5% or less, preferably 2% or less of phosphorolysis activity. When the enzyme is compared with maltose and trehalose, which are α-glucosyl disaccharides, the phosphorolytic activity for nigerose under the same reaction conditions (for example, 10 mM in the reaction solution) is compared with 100%, 5% In the following, the phosphorolytic activity is preferably 2% or less, more preferably less than the detection limit (for example, 0.01% or less). The enzyme further compared to isomaltose and sucrose at 5% or less, preferably 2 when phosphorolytic activity against nigerose under the same reaction conditions (for example,
本発明に係る酵素の加リン酸分解活性は、例えば後述の実施例２に記載の手順に従って測定することができる。例えば、２５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中、１０ｍＭ ニゲロース等の被験糖類、及び１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、並びに実施例１で得た精製酵素を含む、反応液２００μＬを調製し、３０℃で３０分インキュベートする。反応時間後、反応液のサンプルを、等量のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に加え、酵素反応を停止させてサンプル液とする。サンプル液中の生成グルコースは、グルコースオキシダーゼ法により発色させ、５０５ｎｍでの吸光度を測定して定量すればよい。この条件下で毎分１μｍｏｌのグルコースを生成する活性（加リン酸分解活性）を１ユニットと定義することができる。 The phosphorolytic activity of the enzyme according to the present invention can be measured, for example, according to the procedure described in Example 2 described later. For example, in a 25 mM MOPS-NaOH buffer solution (pH 7.0), 200 μL of a reaction solution containing a test saccharide such as 10 mM nigerose, a 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), and the purified enzyme obtained in Example 1 was added. Prepare and incubate at 30 ° C. for 30 minutes. After the reaction time, a sample of the reaction solution is added to an equal amount of DMSO (dimethyl sulfoxide) to stop the enzyme reaction to obtain a sample solution. The produced glucose in the sample solution may be quantified by developing the color by the glucose oxidase method and measuring the absorbance at 505 nm. The activity (phosphorolysis activity) that produces 1 μmol of glucose per minute under these conditions can be defined as 1 unit.
本発明に係る酵素はまた、加リン酸分解の逆反応として、糖供与体としてのβ−グルコース１−リン酸（β−Ｄ−グルコース１−リン酸）と糖受容体としてのグルコースから、ニゲロースとリン酸を生成する合成活性も併せて有する。このような合成活性を併せ持つことから、本酵素のようなホスホリラーゼの加リン酸分解反応は「可逆的」であると称される。本発明に係るニゲロースホスホリラーゼの可逆的反応は図３に示されている。 The enzyme according to the present invention also contains nigerose from β-glucose 1-phosphate (β-D-glucose 1-phosphate) as a sugar donor and glucose as a sugar acceptor as a reverse reaction of phosphorolysis. And synthetic activity to produce phosphoric acid. Since it has such synthetic activity, the phosphorylation reaction of phosphorylase such as this enzyme is called “reversible”. The reversible reaction of nigerose phosphorylase according to the present invention is shown in FIG.
さらに、本発明に係る酵素は、糖供与体としてのβ−グルコース１−リン酸と、糖受容体としてのグルコース以外のいくつかの単糖又はその誘導体（好ましくは、グルコース、ガラクトース、キシロース、１，５−アンヒドログルシトール、グルクロン酸、及びα−メチルグルコシド）から、α−グルコシル結合を有する二糖とリン酸を生成する合成活性も有している。 Furthermore, the enzyme according to the present invention comprises β-glucose 1-phosphate as a sugar donor and some monosaccharides or derivatives thereof other than glucose as a sugar acceptor (preferably glucose, galactose, xylose, 1 , 5-anhydroglucitol, glucuronic acid, and α-methylglucoside), and also has a synthetic activity to produce a disaccharide having an α-glucosyl bond and phosphoric acid.
本発明に係る酵素は、グルコースとβ−グルコース１−リン酸からニゲロースを生成するが、グルコースとα−グルコース１−リン酸からは二糖を生成せず、α−グルコース１−リン酸を糖供与体とした合成反応を触媒しない。 The enzyme according to the present invention generates nigerose from glucose and β-glucose 1-phosphate, but does not generate disaccharide from glucose and α-glucose 1-phosphate, and converts α-glucose 1-phosphate to sugar. Does not catalyze the synthesis reaction as a donor.
本発明に係る酵素のそのような合成活性もまた、例えば後述の実施例２に記載の手順に従って測定することができる。例えば、２５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中、１０ｍＭ β−グルコース１−リン酸、及び１０ｍＭ 糖受容体候補単糖、並びに本発明の酵素を含む、反応液２００μＬを調製し、３０℃で３０分インキュベートする。反応時間後、反応液のサンプルを、０．２Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に加え、酵素反応を停止させてサンプル液とする。２５ｍＭ 硫酸塩を含有する１％ モリブデン酸アンモニウム１２．５μＬと０．０５％硫酸水素カリウムを含有する１％アスコルビン酸１２．５μＬを、上記サンプル液と混合した。混合液を３７℃で１時間インキュベートした後、７００ｎｍでの吸光度を測定すればよい。この条件下で毎分１μｍｏｌの無機リン酸を生成する活性（合成活性）を１ユニットと定義することができる。 Such synthetic activity of the enzyme according to the present invention can also be measured, for example, according to the procedure described in Example 2 below. For example, 200 μL of a reaction solution containing 10 mM β-glucose 1-phosphate, a 10 mM sugar receptor candidate monosaccharide, and the enzyme of the present invention in 25 mM MOPS-NaOH buffer (pH 7.0) is prepared at 30 ° C. Incubate for 30 minutes. After the reaction time, a sample of the reaction solution is added to 0.2 M sodium acetate buffer (pH 4.0) to stop the enzyme reaction to obtain a sample solution. 12.5 μL of 1% ammonium molybdate containing 25 mM sulfate and 12.5 μL of 1% ascorbic acid containing 0.05% potassium hydrogen sulfate were mixed with the sample solution. What is necessary is just to measure the light absorbency in 700 nm, after incubating a liquid mixture at 37 degreeC for 1 hour. The activity (synthetic activity) for producing 1 μmol of inorganic phosphoric acid per minute under these conditions can be defined as 1 unit.
本発明に係る酵素は、糖供与体としてβ−グルコース１−リン酸を用いる合成反応において、糖受容体として単糖を用いて二糖を特異的に生成する。その合成反応において、本酵素は、糖受容体として二糖を利用して三糖を合成しないことが好ましい。 The enzyme according to the present invention specifically produces a disaccharide using a monosaccharide as a sugar acceptor in a synthesis reaction using β-glucose 1-phosphate as a sugar donor. In the synthesis reaction, it is preferable that the enzyme does not synthesize a trisaccharide using a disaccharide as a sugar receptor.
本発明に係る酵素は、限定するものではないが、クロストリディウム属（Clostridium）細菌由来のものが好ましく、クロストリディウム・フィトファーメンタンス由来のものがさらに好ましい。 The enzyme according to the present invention is not limited, but is preferably derived from Clostridium bacteria, more preferably from Clostridium phytofermentans.
本発明に係る酵素は、３０℃の条件下での至適ｐＨが６．５〜７．５、好ましくは６．５〜７．０、例えば７．０付近である。また、本酵素は、ｐＨ５．５〜９．０で安定である。 The enzyme according to the present invention has an optimum pH under the condition of 30 ° C. of 6.5 to 7.5, preferably 6.5 to 7.0, for example, around 7.0. Moreover, this enzyme is stable at pH 5.5-9.0.
本酵素はまた、ｐＨ７．０の条件下での至適温度が４０℃であり、少なくとも４０℃以下、例えば１５℃〜４０℃の範囲で安定である。 The enzyme also has an optimum temperature of 40 ° C. under the condition of pH 7.0, and is stable at least at 40 ° C. or less, for example, in the range of 15 ° C. to 40 ° C.
本発明に係る酵素は、好ましくは、２個のサブユニットタンパク質（単量体）から構成される二量体の形態である。本発明に係る酵素は、通常はホモ二量体である。ここで「ホモ二量体」とは、同じサブユニットタンパク質２個から構成される二量体を意味する。 The enzyme according to the present invention is preferably in the form of a dimer composed of two subunit proteins (monomers). The enzyme according to the present invention is usually a homodimer. Here, “homodimer” means a dimer composed of two identical subunit proteins.
本発明に係る酵素の分子量は、限定するものではないが、典型例では、二量体の形態で、ゲルろ過法での分子量測定値が２００ｋＤａである。また本酵素の単量体の分子量は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定値で９０ｋＤａである。なお二量体と単量体の分子量が若干不整合であるのは測定法が異なることに起因しており実験誤差の範囲である。 The molecular weight of the enzyme according to the present invention is not limited, but in the typical example, the molecular weight measured by gel filtration is 200 kDa in the form of a dimer. Moreover, the molecular weight of the monomer of this enzyme is 90 kDa as measured by, for example, SDS-PAGE. Note that the slightly inconsistent molecular weights of the dimer and the monomer are due to different measurement methods and are within the range of experimental error.
本発明に係る酵素は、典型的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質から構成されるものでありうる。さらに本発明に係る酵素は、そのタンパク質が（典型的には二量体形態で）ニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ−グルコース１リン酸を生成する活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、例えば１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質から構成されるものであってもよい。例えば、本発明に係る酵素は、必要に応じて分泌シグナルペプチドや精製用のヒスチジンタグ、標識ペプチド等を含んでもよい。なお本明細書全体において、本発明の酵素タンパク質が、シグナルペプチドや標識ペプチド等を含む場合、それを除去すればニゲロースに対して特異的かつ可逆的に加リン酸分解活性を発揮する場合も、当該タンパク質が「ニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ−グルコース１リン酸を生成する活性を有する」範囲に含まれるものとするが、これは当業者には当然認識されることである。 The enzyme according to the present invention can typically be composed of a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Furthermore, the enzyme according to the present invention has an activity that the protein specifically and reversibly phosphorylates nigerose to produce glucose and β-glucose monophosphate (typically in a dimeric form). As long as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which 1 to several (1 to 10, preferably 1 to 5, for example, 1 to 3) amino acids have been deleted, substituted or added. It may be composed of proteins. For example, the enzyme according to the present invention may contain a secretory signal peptide, a histidine tag for purification, a labeled peptide, etc. as necessary. In addition, throughout the present specification, when the enzyme protein of the present invention contains a signal peptide, a labeled peptide, etc., if it is removed, the enzyme protein specifically and reversibly exhibits phosphorolytic activity, The protein is included in the range of “having an activity to specifically and reversibly phosphorylate nigerose to produce glucose and β-glucose monophosphate”, which is naturally recognized by those skilled in the art. It is to be done.
２．ニゲロースホスホリラーゼの調製
本発明に係る酵素ニゲロースホスホリラーゼは、クロストリディウム属（Clostridium）細菌、好ましくはクロストリディウム・フィトファーメンタンスを培養して得られる培養物から、常法に従って回収することができる。
2. Preparation of Nigerose Phosphorylase The enzyme nigerose phosphorylase according to the present invention is recovered from a culture obtained by culturing Clostridium bacteria, preferably Clostridium phytofermentans, according to a conventional method. can do.
本発明に係る酵素ニゲロースホスホリラーゼはまた、そのタンパク質をコードするニゲロースホスホリラーゼ遺伝子を用いて、遺伝子工学に基づく組換え法により常法に従って生産することができる。本発明は、ニゲロースホスホリラーゼ遺伝子も提供する。 The enzyme nigerose phosphorylase according to the present invention can also be produced according to a conventional method by a recombinant method based on genetic engineering using a nigerose phosphorylase gene encoding the protein. The present invention also provides a nigerose phosphorylase gene.
本発明に係る酵素タンパク質をコードするニゲロースホスホリラーゼ遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるものであり得る。あるいはこのニゲロースホスホリラーゼ遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの誘導体、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ−グルコース１リン酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるものであってもよい。 The nigerose phosphorylase gene encoding the enzyme protein according to the present invention may consist of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Alternatively, the nigerose phosphorylase gene is a derivative of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, for example, one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And a DNA encoding a protein having an activity of specifically and reversibly phosphorylating nigerose to produce glucose and β-glucose monophosphate.
あるいは本発明に係る酵素タンパク質をコードするニゲロースホスホリラーゼ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなるものであってもよい。あるいはその遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ−グルコース１リン酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるものであってもよい。ここでストリンジェントな条件とは、塩基配列相同性が高い核酸同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するＤＮＡ同士が、いわゆる特異的な核酸ハイブリッドを形成するが、それより相同性が低い核酸同士はハイブリダイズしない条件を指し、その具体的な例としては、ナトリウム塩濃度が好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、反応温度が好ましくは５０℃〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％でハイブリダイゼーション反応を行う条件を言う。さらにハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃での条件である場合も、本発明における「ストリンジェントな条件」に含めることができる。 Alternatively, the nigerose phosphorylase gene encoding the enzyme protein according to the present invention may be composed of DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Alternatively, the gene hybridizes with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and specifically and reversibly phosphorylates nigerose to produce glucose. And a DNA encoding a protein having an activity to produce β-glucose monophosphate. Here, the stringent condition means that nucleic acids having high base sequence homology, for example, DNAs having sequence homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more are so-called specific nucleic acids. A nucleic acid that forms a hybrid but does not hybridize with nucleic acids with lower homology than that. Specific examples thereof include a sodium salt concentration of preferably 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM, and a reaction temperature of The hybridization reaction is preferably performed at 50 ° C. to 70 ° C., more preferably 55 to 65 ° C., and the formamide concentration is preferably 20 to 50%, more preferably 35 to 45%. Furthermore, when the conditions for washing the filter after hybridization are such that the sodium salt concentration is preferably 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 mM, and the temperature is preferably 55 to 70 ° C., more preferably 60 to 65 ° C. Can also be included in “stringent conditions” in the present invention.
本発明においてＤＮＡは少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、修飾塩基を一部に含むＤＮＡ等を包含する。本発明において「遺伝子」は、開始コドン及び終止コドンを含まない塩基配列を有する核酸断片であってもよいが、開始コドン及び終止コドンを含むことが好ましい。本発明の「遺伝子」は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列などを含んでもよい。 In the present invention, DNA includes at least genomic DNA, cDNA, DNA partially containing a modified base, and the like. In the present invention, the “gene” may be a nucleic acid fragment having a base sequence not including a start codon and a stop codon, but preferably includes a start codon and a stop codon. The “gene” of the present invention may include an untranslated region (UTR) sequence and the like.
本発明に係るニゲロースホスホリラーゼ遺伝子は、クロストリディウム・フィトファーメンタンスから単離して用いてもよいが、他のクロストリディウム属細菌から単離してもよい。本発明に係るニゲロースホスホリラーゼ遺伝子は、複数部位に分けて化学合成したＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で連結することにより作製することもできる。 The nigerose phosphorylase gene according to the present invention may be isolated from Clostridium phytofermentans, or may be isolated from other Clostridium bacteria. The nigerose phosphorylase gene according to the present invention can also be prepared by linking DNA fragments chemically synthesized by dividing them into a plurality of sites by the PCR method or the like.
また本発明に係るニゲロースホスホリラーゼ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡに、部位特異的突然変異誘発法等の変異導入法を用いて塩基の欠失、置換、又は付加等の改変を導入することにより作製してもよい。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。これらの変異導入は、例えば市販の部位特異的突然変異誘発キット（例えばMutan(R)-K、Mutan(R)-Super Express Km、PrimeSTAR(R) Mutagenesis Basal Kit（いずれもTAKARA BIO INC.社製））などを用いて当業者であれば容易に行うことができる。 In addition, the nigerose phosphorylase gene according to the present invention is a base deletion, substitution, addition or the like using a mutation-introducing method such as site-directed mutagenesis to DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. It may be produced by introducing a modification of In order to introduce a mutation into a gene, a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method equivalent thereto can be employed. These mutagenesis can be performed by, for example, commercially available site-directed mutagenesis kits (for example, Mutan (R) -K, Mutan (R) -Super Express Km, PrimeSTAR (R) Mutagenesis Basal Kit (both manufactured by TAKARA BIO INC. ) )) And the like can be easily performed by those skilled in the art.
なお、得られたニゲロースホスホリラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列については、塩基配列決定によりその配列を確認することが好ましい。塩基配列決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＡＢＩ社製ＤＮＡシークエンサー）を用いて行えばよい。 In addition, about the DNA sequence of the obtained nigerose phosphorylase gene, it is preferable to confirm the sequence by base sequence determination. The nucleotide sequence can be determined by a known method such as a Maxam-Gilbert chemical modification method or a dideoxynucleotide chain termination method, but it may be usually performed using an automatic nucleotide sequencer (for example, a DNA sequencer manufactured by ABI).
得られたニゲロースホスホリラーゼ遺伝子は、ベクター中にクローニングして組換えベクターを作製することが好ましい。本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結することにより得ることができる。本発明のベクターは、宿主細胞中で当該遺伝子からニゲロースホスホリラーゼタンパク質を発現させるため、発現ベクターであることがさらに好ましい。ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。例えばプラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ−２４ａ、ｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴ１００／Ｄ−ＴＯＰＯ等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ、λＺＡＰＩＩ等）などが挙げられる。発現ベクターには、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必要な各種エレメントが含まれることが好ましい。発現ベクターには、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必要な各種エレメントが含まれることが好ましい。プロモーターは、その発現ベクターを導入すべき宿主細胞中でその制御下の遺伝子の発現を誘導できる任意のものであってよい。例えば細菌中で発現させるのであれば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等が使用できる。発現ベクターには、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子や、ポリリンカー、エンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、精製用のヒスチジンタグ配列等の有用な配列が必要に応じて含まれていてもよい。選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT遺伝子）等が挙げられる。 The obtained nigerose phosphorylase gene is preferably cloned into a vector to produce a recombinant vector. The recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating the gene of the present invention to an appropriate vector. The vector of the present invention is more preferably an expression vector in order to express the nigerose phosphorylase protein from the gene in the host cell. The vector is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA. For example, plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (eg, pET-24a, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, pET100 / D-TOPO, etc.). Λ phage (Charon 4A, Charon 21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, λZAPII, etc.). The expression vector preferably contains various elements necessary for expression in the host organism such as a promoter, terminator, and ribosome binding site. The expression vector preferably contains various elements necessary for expression in the host organism such as a promoter, terminator, and ribosome binding site. The promoter may be any that can induce the expression of the gene under its control in the host cell into which the expression vector is to be introduced. For example, if it is expressed in bacteria, a T7 promoter, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc. can be used. Expression vectors contain selectable marker genes, reporter genes, cis elements such as polylinkers and enhancers, splicing signals, poly A addition signals, and useful sequences such as histidine tag sequences for purification. Also good. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a chloramphenicol resistance gene (CAT gene), and the like.
本発明に係るニゲロースホスホリラーゼ遺伝子を宿主細胞に導入することにより形質転換体を作製することができる。具体的には、本発明に係るニゲロースホスホリラーゼ遺伝子を含む組換えベクター（好ましくは発現ベクター）を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換することができる。 A transformant can be prepared by introducing the nigerose phosphorylase gene according to the present invention into a host cell. Specifically, a host cell can be transformed by introducing a recombinant vector (preferably an expression vector) containing the nigerose phosphorylase gene according to the present invention into the host cell.
宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。より具体的には、宿主細胞には、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞（好ましくは培養細胞）が含まれる。本発明においては、例えば本発明のニゲロースホスホリラーゼを生産する目的では、大腸菌（E.coli）やバチルス・スブチルス（Bacillus subtillis）、特に大腸菌（例えば、DH5α株、Rosetta(DE3)LysS株など）を宿主細胞として好適に使用することができる。 The host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. More specifically, host cells include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (for example, mammalian cells), and any cells (preferably cultured cells) such as plant cells. It is. In the present invention, for example, for the purpose of producing the nigerose phosphorylase of the present invention, E. coli or Bacillus subtillis, particularly E. coli (for example, DH5α strain, Rosetta (DE3) LysS strain, etc.) is used. It can be suitably used as a host cell.
宿主細胞の形質転換には、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（PEG）法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。形質転換体の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用したベクターに組み込まれた選択マーカー遺伝子の機能を利用して行うことができる。 For transformation of host cells, commonly used gene transfer methods such as calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, particle gun method, polyethylene glycol (PEG) method, Agrobacterium method, protoplast fusion A law or the like may be used. Selection of transformants can be performed according to a conventional method, but can usually be performed utilizing the function of a selectable marker gene incorporated in the vector used.
得られた形質転換体を常法により培養し、遺伝子発現を誘導することにより、ニゲロースホスホリラーゼを製造することができる。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行えばよい。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換細胞は、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有する培地中に接種して培養すればよい。培地は、形質転換細胞の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を添加してもよい。 Nigerose phosphorylase can be produced by culturing the obtained transformant by a conventional method and inducing gene expression. The transformed cells may be cultured according to a usual method used for culturing host organisms. For example, transformed cells obtained by using microorganisms such as E. coli and yeast cells as host cells may be inoculated and cultured in a medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the host microorganism. The medium may be either a natural medium or a synthetic medium as long as it can efficiently culture transformed cells. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium.
誘導性プロモーターを含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主細胞に適した条件下で行われる。 When culturing host cells transformed with an expression vector containing an inducible promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when culturing a host cell transformed with an expression vector using the Lac promoter, a host cell transformed with isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG) or the like with an expression vector using the trp promoter is used. When culturing, indoleacrylic acid (IAA) or the like can be added to the medium. The culture conditions are not particularly limited, but are preferably performed under conditions suitable for the host cell used for transformation.
ニゲロースホスホリラーゼを取得するため、形質転換細胞の培養後、例えば、宿主細胞の菌体を破砕し、固液分離して得た上清を採取することが好ましい。固液分離した上清中の組換えタンパク質を常法により精製することにより、ニゲロースホスホリラーゼを単離精製することができる。 In order to obtain nigerose phosphorylase, after culturing the transformed cells, for example, it is preferable to collect the supernatant obtained by crushing the host cells and separating them into solid and liquid. Nigerose phosphorylase can be isolated and purified by purifying the recombinant protein in the solid-liquid separated supernatant by a conventional method.
あるいは、無細胞タンパク質翻訳合成系を使用して、ニゲロースホスホリラーゼ遺伝子を含む発現ベクターから、ニゲロースホスホリラーゼを生成させることもできる。 Alternatively, nigerose phosphorylase can be generated from an expression vector containing a nigerose phosphorylase gene using a cell-free protein translational synthesis system.
３．本発明に係るニゲロースホスホリラーゼを用いた糖類製造
本発明では、上記のとおり作製したニゲロースホスホリラーゼを、糖類の分解や製造に用いることができる。
3. Production of saccharides using the nigerose phosphorylase according to the present invention In the present invention, the nigerose phosphorylase produced as described above can be used for decomposition and production of saccharides.
本発明に係る酵素ニゲロースホスホリラーゼは、ニゲロースに特異的な加リン酸分解活性を示す（図３）。 The enzyme nigerose phosphorylase according to the present invention exhibits phosphorolytic activity specific to nigerose (FIG. 3).
この加リン酸分解活性を利用して、本発明では、ニゲロースを特異的に分解し、β−グルコース１−リン酸とグルコースを等モルずつ生成することができる。具体的には、本発明に係るニゲロースホスホリラーゼを、適切な水性媒体（水又は緩衝液など）中、リン酸存在下でニゲロースと共にインキュベートして反応させることで、ニゲロースを分解することができ、その結果、グルコース及びβ−グルコース１リン酸を生成させることができる。本発明は、このようなニゲロースの分解方法も提供する。 By utilizing this phosphorolytic activity, nigerose can be specifically decomposed to produce β-glucose 1-phosphate and glucose in equimolar amounts. Specifically, nigerose phosphorylase according to the present invention can be decomposed by incubating with nigerose in a suitable aqueous medium (such as water or a buffer) in the presence of phosphoric acid for reaction. As a result, glucose and β-glucose monophosphate can be generated. The present invention also provides such a method for degrading nigerose.
本発明に係るニゲロースホスホリラーゼは、限定するものではないが、基質となるニゲロース１モルに対して１００〜１００，０００ユニット、好適には１，０００〜５０，０００ユニットの量で反応系に含めることが好ましい。 The nigerose phosphorylase according to the present invention is not limited, but is included in the reaction system in an amount of 100 to 100,000 units, preferably 1,000 to 50,000 units, per 1 mol of nigerose as a substrate. It is preferable.
本発明に係るニゲロースホスホリラーゼは、反応系（反応液）中に分散していてもよいし、固相担体等に固定化されていてもよい。 The nigerose phosphorylase according to the present invention may be dispersed in a reaction system (reaction solution), or may be immobilized on a solid phase carrier or the like.
反応系に加えるリン酸は、無機リン酸が好ましい。リン酸は、好適な実施形態では、リン酸塩を用いて調製されるリン酸緩衝液の形態で反応系に加えることができる。リン酸塩は、限定するものではないが、例えばリン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウム等が挙げられる。限定するものではないが、ニゲロース１モルに対して０．１〜１０モル、好ましくは０．５〜１．５モルとなる量でリン酸が反応系に含まれるようにするのが適当である。 The phosphoric acid added to the reaction system is preferably inorganic phosphoric acid. Phosphoric acid, in a preferred embodiment, can be added to the reaction system in the form of a phosphate buffer prepared with phosphate. Examples of the phosphate include, but are not limited to, trisodium phosphate, tripotassium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium hydrogen phosphate, and the like. Although not limited, it is appropriate that phosphoric acid is contained in the reaction system in an amount of 0.1 to 10 mol, preferably 0.5 to 1.5 mol, relative to 1 mol of nigerose. .
反応系のｐＨ条件は、限定するものではないが、通常は５．５〜９．０、好ましくは６．５〜７．５、特に７．０が好適である。反応系の温度条件は、限定するものではないが、４０℃以下、例えば１５〜４０℃、例えば２０℃〜４０℃、より好ましくは３０℃が好適である。 The pH condition of the reaction system is not limited, but is usually 5.5 to 9.0, preferably 6.5 to 7.5, particularly 7.0. Although the temperature conditions of a reaction system are not limited, 40 degreeC or less, for example, 15-40 degreeC, for example, 20 degreeC-40 degreeC, More preferably, 30 degreeC is suitable.
反応時間は、限定するものではないが、例えば３０℃で１分〜１０日間、好ましくは１０分〜５日間、例えば２０分〜１時間が好適である。 Although reaction time is not limited, For example, 1 minute-10 days at 30 degreeC, Preferably 10 minutes-5 days, for example, 20 minutes-1 hour are suitable.
加リン酸分解反応が十分に進行した後、反応液の加熱、酸性溶液や有機溶媒の添加等により酵素反応を停止させることができる。加リン酸分解反応の反応後組成物中には、ニゲロースの分解により生成したグルコースとβ−グルコース１−リン酸が含まれる。 After the phosphorolysis reaction has sufficiently proceeded, the enzyme reaction can be stopped by heating the reaction solution, adding an acidic solution or an organic solvent, or the like. The post-reaction composition of the phosphorolysis reaction contains glucose produced by the decomposition of nigerose and β-glucose 1-phosphate.
また本発明では、本発明に係るニゲロースホスホリラーゼを、適切な水性媒体（水又は緩衝液など）中で、糖供与体として機能するβ−グルコース１リン酸、及び糖受容体として機能する単糖又はその誘導体（以下、「単糖等」とも呼ぶ）とインキュベートして反応させ、β−グルコース１リン酸と単糖等との間でα−グルコシル結合（α−グルコシド結合とも呼ばれる）を生成することにより、α−グルコシル結合を有する二糖を効率よく製造することができる。ここでα−グルコシル結合を有する二糖とは、１分子のグルコースに１分子の単糖又はその誘導体がα−グルコシル結合（例えばα−１，３グルコシル結合、α−１，２グルコシル結合）したものをいい、α−グルコシル二糖とも呼ばれる。本発明は、このようなα−グルコシル結合を有する二糖の製造方法も提供する。本方法は、ニゲロースホスホリラーゼの加リン酸分解の逆反応である合成反応に基づく。 In the present invention, the nigerose phosphorylase according to the present invention is converted into β-glucose monophosphate functioning as a sugar donor and a monosaccharide functioning as a sugar acceptor in an appropriate aqueous medium (water or buffer solution). Alternatively, it is incubated with a derivative (hereinafter also referred to as “monosaccharide etc.”) and reacted to form an α-glucosyl bond (also referred to as an α-glucoside bond) between β-glucose monophosphate and the monosaccharide. Thus, a disaccharide having an α-glucosyl bond can be produced efficiently. Here, the disaccharide having an α-glucosyl bond means that one molecule of monosaccharide or a derivative thereof is α-glucosyl bond (for example, α-1,3 glucosyl bond, α-1,2 glucosyl bond) to one molecule of glucose. It is also called α-glucosyl disaccharide. The present invention also provides a method for producing such a disaccharide having an α-glucosyl bond. This method is based on a synthetic reaction that is the reverse reaction of the phosphorolysis of nigerose phosphorylase.
本方法において、糖受容体として使用し得る単糖の誘導体としては、限定するものではないが、例えば糖アルコール（アルジトールなど）、糖エステル、アルドン酸、ウロン酸、アルダル酸等が挙げられる。糖受容体として使用するのに好適な単糖等の具体例としては、グルコース、ガラクトース、キシロース、１，５−アンヒドログルシトール、グルクロン酸、及びα−メチルグルコシド等が挙げられる。本方法において、グルコースは糖受容体として特に好適に使用できる。 Examples of monosaccharide derivatives that can be used as a sugar receptor in the present method include, but are not limited to, sugar alcohols (such as alditol), sugar esters, aldonic acid, uronic acid, aldaric acid, and the like. Specific examples of monosaccharides and the like suitable for use as a sugar receptor include glucose, galactose, xylose, 1,5-anhydroglucitol, glucuronic acid, α-methylglucoside, and the like. In this method, glucose can be particularly preferably used as a sugar receptor.
本方法において、糖受容体としての単糖等は、限定するものではないが、糖供与体となるβ−グルコース１リン酸１モルに対して１〜１０モル、好適には１〜２モルの量で反応系に含めることが好ましい。 In this method, monosaccharides and the like as sugar acceptors are not limited, but 1 to 10 moles, preferably 1 to 2 moles per mole of β-glucose monophosphate serving as a sugar donor. It is preferable to include it in the reaction system in an amount.
本発明に係るニゲロースホスホリラーゼは、限定するものではないが、基質となるβ−グルコース１リン酸１モルに対して０．１〜５０ユニット、好適には１〜１０ユニットの量で反応系に含めることが好ましい。 The nigerose phosphorylase according to the present invention is not limited, but is 0.1 to 50 units, preferably 1 to 10 units, per 1 mol of β-glucose monophosphate serving as a substrate. Preferably included.
本発明に係るニゲロースホスホリラーゼは、反応系（反応液）中に分散していてもよいし、固相担体等に固定化されていてもよい。 The nigerose phosphorylase according to the present invention may be dispersed in a reaction system (reaction solution), or may be immobilized on a solid phase carrier or the like.
反応系のｐＨ条件は、限定するものではないが、通常は５．５〜９．０、好ましくは６．５〜７．５、特に７．０が好適である。反応系の温度条件は、限定するものではないが、４０℃以下、例えば１５〜４０℃、例えば２０℃〜４０℃、より好ましくは３０℃が好適である。 The pH condition of the reaction system is not limited, but is usually 5.5 to 9.0, preferably 6.5 to 7.5, particularly 7.0. Although the temperature conditions of a reaction system are not limited, 40 degreeC or less, for example, 15-40 degreeC, for example, 20 degreeC-40 degreeC, More preferably, 30 degreeC is suitable.
反応時間は、限定するものではないが、例えば３０℃で１分〜１０日間、好ましくは１０分〜５日間、例えば１０時間〜４０時間が好適である。 Although reaction time is not limited, For example, 1 minute-10 days at 30 degreeC, Preferably it is 10 minutes-5 days, for example, 10 hours-40 hours are suitable.
反応時間及び使用酵素量は、限定するものではないが、酵素反応が平衡状態に達するまで増加させることが好ましい。 The reaction time and the amount of enzyme used are not limited, but are preferably increased until the enzyme reaction reaches an equilibrium state.
反応後、反応液の加熱、酸性溶液や有機溶媒の添加等により酵素反応を停止させることができる。本酵素による合成反応の反応後組成物中には、グルコース等の単糖とβ−グルコース１−リン酸から合成された二糖が含まれる。 After the reaction, the enzyme reaction can be stopped by heating the reaction solution or adding an acidic solution or an organic solvent. The post-reaction composition of the synthesis reaction by this enzyme contains a disaccharide synthesized from a monosaccharide such as glucose and β-glucose 1-phosphate.
例えば、等モルずつの単糖とβ−グルコース１−リン酸を基質とした合成反応の場合、反応液について平衡状態になるまで酵素反応（合成反応）を進めると、反応後組成物中には、出発物質として含めた単糖又はβ−グルコース１−リン酸のおよそ６０％がα−グルコシル結合を有する二糖に変換されて含まれることになる。すなわち平衡状態では基質のα−グルコシル結合を有する二糖への転換率はおよそ６０％である。ここで生成されるα−グルコシル結合を有する二糖は、主としてα−１，３グルコシル結合を有する二糖であることが好ましいが、副次的にα−１，２グルコシル結合を有する二糖が生成されてもよい。 For example, in the case of a synthesis reaction using equimolar monosaccharides and β-glucose 1-phosphate as substrates, if the enzyme reaction (synthesis reaction) is advanced until the reaction solution reaches an equilibrium state, Thus, approximately 60% of the monosaccharide or β-glucose 1-phosphate included as a starting material is converted into a disaccharide having an α-glucosyl bond. That is, in the equilibrium state, the conversion rate of the substrate to a disaccharide having an α-glucosyl bond is approximately 60%. The disaccharide having an α-glucosyl bond produced here is preferably a disaccharide mainly having an α-1,3 glucosyl bond, but the disaccharide having a secondary α-1,2 glucosyl bond is May be generated.
この本発明に係る方法の好ましい一実施形態では、本発明に係るニゲロースホスホリラーゼを、適切な水性媒体（水又は緩衝液など）中で、糖供与体として機能するβ−グルコース１リン酸、及び糖受容体として機能するグルコースとインキュベートして反応させてα−１，３グルコシル結合を生成することにより、ニゲロースを効率よく製造することができる。この場合の反応条件等は上記と同様である。 In a preferred embodiment of the method according to the invention, the nigerose phosphorylase according to the invention is β-glucose monophosphate functioning as a sugar donor in a suitable aqueous medium (such as water or buffer), and Nigerose can be efficiently produced by incubating and reacting with glucose functioning as a sugar receptor to produce an α-1,3 glucosyl bond. The reaction conditions in this case are the same as described above.
さらに、ニゲロースの製造は、本発明に係るニゲロースホスホリラーゼの反応系と、他のホスホリラーゼ反応系とを組み合わせることによって行うこともできる。すなわち本発明の方法では、ニゲロース以外の二糖を基質とするホスホリラーゼの加リン酸分解反応によりβ−グルコース１リン酸を生成して、それを、本発明に係るニゲロースホスホリラーゼが触媒する二糖合成反応に用いることにより、ニゲロースを製造することができる。本発明は、そのような２つ以上のホスホリラーゼ反応系を組み合わせたニゲロースの製造法も提供する。 Further, nigerose can be produced by combining the nigerose phosphorylase reaction system according to the present invention with another phosphorylase reaction system. That is, in the method of the present invention, β-glucose monophosphate is produced by phosphorolysis of phosphorylase using a disaccharide other than nigerose as a substrate, and this is catalyzed by the nigerose phosphorylase according to the present invention. Nigerose can be produced by using it in the synthesis reaction. The present invention also provides a method for producing nigerose in which two or more phosphorylase reaction systems are combined.
例えば文献Murao S., Nagano, H., Ogura, S., and Nishio T., (1985), Agric. Biol. Chem., 49, p. 2113-2118や特公昭６３−６０９９８には、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼを組み合わせて用いる、マルトースを原料としたトレハロースの製造方法が記載されている。この方法では２種類のホスホリラーゼ（マルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼ）をマルトースと反応させることにより、マルトースが加リン酸分解されて生成されるグルコースとβ−グルコース−１−リン酸からトレハロースが合成される。この方法により、より安価な原料（マルトース）からトレハロースを製造することができる。 For example, the documents Murao S., Nagano, H., Ogura, S., and Nishio T., (1985), Agric. Biol. Chem., 49, p. 2113-2118 and Japanese Patent Publication No. 63-60998 include maltose phosphorylase. And a method for producing trehalose using maltose as a raw material in combination with trehalose phosphorylase. In this method, two types of phosphorylases (maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase) are reacted with maltose to synthesize trehalose from glucose and β-glucose-1-phosphate produced by the phosphorolysis of maltose. By this method, trehalose can be produced from a less expensive raw material (maltose).
そこでこの方法と同様にして、リン酸の存在下でβ−グルコース１リン酸を生成する別の１種以上のホスホリラーゼ及びその基質とニゲロースホスホリラーゼ反応系を組み合わせることにより、ニゲロースを製造することが可能である。具体的には、そのような別のホスホリラーゼとその基質を含む水性媒体に、本発明に係るニゲロースホスホリラーゼを加えて反応させることにより、ニゲロースを合成できる。本発明の方法で使用する、リン酸の存在下でβ−グルコース１リン酸を生成する別のホスホリラーゼとしては、例えば、マルトースホスホリラーゼ（基質：マルトース）、トレハロースホスホリラーゼ（基質：トレハロース）、スクロースホスホリラーゼ（基質：スクロース）等が挙げられ、公知のものを使用することができる。このような別のホスホリラーゼとしては、本発明に係る酵素ニゲロースホスホリラーゼのｐＨ条件及び温度条件に適合するものが好ましい。例えばそのようなホスホリラーゼは、３０℃の条件下で至適ｐＨが６．５〜７．５、例えば７．０付近であり、ｐＨ５．５〜９．０で安定であり、またｐＨ７．０の条件下での至適温度が３０℃〜５０℃、例えば４０℃であり、少なくとも４０℃以下、例えば１５℃〜４０℃の範囲で安定であることが好ましい。 Thus, in the same manner as this method, nigerose can be produced by combining one or more phosphorylases that produce β-glucose monophosphate in the presence of phosphoric acid and a substrate thereof with a nigerose phosphorylase reaction system. Is possible. Specifically, nigerose can be synthesized by adding and reacting the nigerose phosphorylase according to the present invention to an aqueous medium containing such another phosphorylase and its substrate. As another phosphorylase used in the method of the present invention to produce β-glucose monophosphate in the presence of phosphate, for example, maltose phosphorylase (substrate: maltose), trehalose phosphorylase (substrate: trehalose), sucrose phosphorylase ( Substrate: sucrose) and the like, and known ones can be used. As such another phosphorylase, those suitable for the pH condition and temperature condition of the enzyme nigerose phosphorylase according to the present invention are preferable. For example, such phosphorylase has an optimum pH of 6.5 to 7.5, for example, around 7.0 at 30 ° C., is stable at pH 5.5 to 9.0, and has a pH of 7.0. The optimum temperature under the conditions is 30 ° C. to 50 ° C., for example 40 ° C., and is preferably stable at least in the range of 40 ° C. or less, for example 15 ° C. to 40 ° C.
本発明に係るニゲロースホスホリラーゼを含む２種以上のホスホリラーゼを用いた上記反応系のｐＨ条件は、限定するものではないが、通常は５．５〜９．０、好ましくは６．５〜７．５、特に７．０が好適である。反応系の温度条件は、限定するものではないが、４０℃以下、例えば１５〜４０℃、例えば２０℃〜４０℃、より好ましくは３０℃が好適である。反応時間は、特に限定するものではなく、１５分〜３０時間であってよいが、例えば１５〜２５時間であることも好ましい。 Although the pH conditions of the said reaction system using 2 or more types of phosphorylases containing the nigerose phosphorylase which concerns on this invention are not limited, Usually, it is 5.5-9.0, Preferably it is 6.5-7. 5, especially 7.0 is preferred. Although the temperature conditions of a reaction system are not limited, 40 degreeC or less, for example, 15-40 degreeC, for example, 20 degreeC-40 degreeC, More preferably, 30 degreeC is suitable. The reaction time is not particularly limited, and may be 15 minutes to 30 hours, but is preferably 15 to 25 hours, for example.
この２種以上のホスホリラーゼを用いて得られる反応後組成物中には、ホスホリラーゼ、残存量の基質（単糖等及びβ−グルコース１リン酸）に加えて、生成されたニゲロースが含まれる。 The post-reaction composition obtained using the two or more phosphorylases contains the produced nigerose in addition to the phosphorylase and the remaining amount of the substrate (monosaccharide and the like and β-glucose monophosphate).
ニゲロースを含む反応後組成物は、ニゲロース含有組成物としてそのまま使用してもよいし、そこからニゲロースを分離して使用してもよい。 The post-reaction composition containing nigerose may be used as it is as a nigerose-containing composition, or nigerose may be separated therefrom and used.
なお本発明において用いるｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡ塩基配列決定、プライマーの合成、突然変異誘発、タンパク質の抽出・精製などの分子生物学的・生化学的実験操作は、基本的には通常の実験書の記載に従って行うことができる。そのような実験書としては、例えば、SambrookらのMolecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを挙げることができる。 Preparation of mRNA used in the present invention, cDNA preparation (RT-PCR), PCR, library preparation, ligation into vector, cell transformation, DNA sequencing, primer synthesis, mutagenesis, protein The molecular biological and biochemical experimental procedures such as extraction and purification of can be basically carried out according to the description in a normal experiment document. Examples of such experiments include Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited by these.
（実施例１）
クロストリディウム・フィトファーメンタンス（Clostridium phytofermentans）ISDgTゲノムデータベースに登録されている機能未同定遺伝子ＣＰＨ１８７４の配列情報（配列表の配列番号１）に基づき、ＣＰＨ１８７４遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端及び３’末端に、フォワードプライマー（5'-gatatacatatgaattggacattaacaaat-3'；配列番号３；ＮｄｅＩ部位を含む）及びリバースプライマー（5'-ggtgctcgagcatttcaattttactaatag-3'；配列番号４；ＸｈｏＩ部位を含む）をそれぞれ設計した。インスタジーン（バイオラッド社製）を用いて調製したクロストリディウム・フィトファーメンタンスＩＳＤｇ株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（登録商標）からATCC番号700394にて入手可能）のゲノムＤＮＡを鋳型として、このプライマー対を用い、ＯＲＦ全長をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）により増幅した。得られた増幅産物を電気泳動したところ、予測断片長２２７８ｂｐと一致する明瞭なバンドが得られた。
Example 1
Based on the sequence information of the unidentified gene CPH1874 registered in the Clostridium phytofermentans ISDg T genome database (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), the open reading frame (ORF) of the CPH1874 gene Forward primer (5'-gatatacatatgaattggacattaacaaat-3 '; SEQ ID NO: 3 including NdeI site) and reverse primer (5'-ggtgctcgagcatttcaattttactaatag-3'; SEQ ID NO: 4; including XhoI site at 5 'and 3' ends of ) Designed each. Clostridial phytofermentans ISDg strain (available from American Type Culture Collection (ATCC) (registered trademark) as ATCC No. 700394) prepared using Instagene (Bio-Rad) Using this primer pair with DNA as a template, the entire ORF was amplified by polymerase chain reaction (PCR reaction). When the obtained amplification product was electrophoresed, a clear band corresponding to the expected fragment length of 2278 bp was obtained.
増幅したＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化した後、その断片を、同様にＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ−２４ａ（ノバジェン社製）に、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。 After the amplified PCR product was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI, the fragment was converted into a commercially available plasmid pET-24a for gene expression (manufactured by Novagen) similarly treated with NdeI and XhoI. The product was connected using
増幅産物については、自動ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決定した。増幅産物が、配列番号１に示す塩基配列を有する目的のＣＰＨ１８７４遺伝子（ＯＲＦ）を含むことが確認された。 The amplified product was sequenced using an automated DNA sequencer. It was confirmed that the amplified product contained the target CPH1874 gene (ORF) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
このようにしてＣＰＨ１８７４遺伝子をクローン化した遺伝子発現用プラスミドを用いて、Sambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌（E. coli BL21 (DE3)（ノバジェン社製））を形質転換した。 Using the gene expression plasmid obtained by cloning the CPH1874 gene in this way, Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. “Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition”, 1.74, Vo1.1 ( 1989) was transformed into E. coli BL21 (DE3) (Novagen).
得られた形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。具体的には、ＣＰＨ１８７４遺伝子含有発現プラスミドをE. coli BL21(DE3)に導入した形質転換体を、３３μｇ／ｍＬ カナマイシンを添加したルリア−ベルターニ培地（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ；ＬＢ培地）中、３７℃で、６６０ｎｍでの吸光度が０．６になるまで増殖させた。遺伝子発現は、０．１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導し、２５℃で６時間培養を続けた。４０００ ｘ ｇで５分間の遠心分離により培養物中の湿潤細胞を回収し、それを、５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）（バッファーＡ）中に懸濁した。細胞懸濁物を超音波処理し、さらに１０，０００ ｘ ｇで２０分間、遠心分離した。こうして得られた上清から、組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、精製酵素標品を得た。 Using the resulting transformant, the gene was expressed and recombinant protein was produced according to conventional methods. Specifically, a transformant obtained by introducing a CPH1874 gene-containing expression plasmid into E. coli BL21 (DE3) was added to a Luria-Bertani medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% added with 33 μg / mL kanamycin. % NaCl; LB medium) at 37 ° C. until the absorbance at 660 nm is 0.6. Gene expression was induced by the addition of 0.1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), and the culture was continued at 25 ° C. for 6 hours. Wet cells in the culture were recovered by centrifugation at 4000 × g for 5 minutes and were collected from 50 mM 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) -NaOH buffer (pH 7.5) containing 500 mM NaCl. Suspended in (Buffer A). The cell suspension was sonicated and further centrifuged at 10,000 xg for 20 minutes. From the supernatant thus obtained, the recombinant protein was purified by column chromatography using Ni-NTA agarose (Qiagen) to obtain a purified enzyme preparation.
（実施例２）
実施例１で得られた精製酵素標品を用い、以下に示す方法によって酵素活性を調べた。
(Example 2)
Using the purified enzyme preparation obtained in Example 1, the enzyme activity was examined by the following method.
なお本願の実施例で用いた、トレハロース（別名：α−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、コージビオース（別名：２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコース）、ニゲロース（別名：３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコース）、マルトース（別名：４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコース）一水和物、イソマルトース（別名：６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコース）、及び１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールは、Wako Pure Chemicals (Osaka, Japan)から購入して用いた。なお本願実施例で用いた糖は、特に記載しない限りＤ体である。またＭＯＰＳは、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸の略語である。 In addition, trehalose (alias: α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranosid), cordobiose (alias: 2-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose), nigerose (alias: 3) used in Examples of the present application. -O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose), maltose (alias: 4-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose) monohydrate, isomaltose (alias: 6-O-α-D- Glucopyranosyl-D-glucose) and 1,5-anhydro-D-glucitol were purchased from Wako Pure Chemicals (Osaka, Japan) and used. The sugar used in the examples of the present application is in the D form unless otherwise specified. MOPS is an abbreviation for 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid.
２５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中、１０ｍＭ α−グルコシル二糖（トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース又はスクロース）、及び１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、並びに実施例１で得た精製酵素２２μｇ／ｍＬを含む、反応液２００μＬを調製し、３０℃で３０分インキュベートした。反応時間後、反応液２５μＬを、２５μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に加え、酵素反応を停止させてサンプル液とした。サンプル液中で酵素反応により生成されたグルコース（より明確には、Ｄ−グルコース）を、グルコースオキシダーゼ法（グルコースＣ−ＩＩテストワコー、和光純薬株式会社製）により定量した。具体的には、１００μＬのグルコースＣ−ＩＩテストワコー液（但しリン酸緩衝液を２００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）に変更）をサンプル液に加えてインキュベートした後、５０５ｎｍでの吸光度を測定した。上記条件下に毎分１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素活性（分解活性）を１ユニットと定義した。 10 mM α-glucosyl disaccharide (trehalose, cordobiose, nigerose, maltose, isomaltose or sucrose) and 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) in 25 mM MOPS-NaOH buffer (pH 7.0), and Example 1 A reaction solution (200 μL) containing the purified enzyme (22 μg / mL) obtained in the above was prepared and incubated at 30 ° C. for 30 minutes. After the reaction time, 25 μL of the reaction solution was added to 25 μL of DMSO (dimethyl sulfoxide) to stop the enzyme reaction to obtain a sample solution. Glucose produced by the enzymatic reaction in the sample solution (more specifically, D-glucose) was quantified by the glucose oxidase method (glucose C-II test Wako, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Specifically, 100 μL of glucose C-II test Wako solution (however, phosphate buffer was changed to 200 mM MOPS-NaOH buffer (pH 7.0)) was added to the sample solution and incubated, and then the absorbance at 505 nm was measured. It was measured. The enzyme activity (decomposition activity) that produces 1 μmol of glucose per minute under the above conditions was defined as 1 unit.
その結果、本酵素はニゲロースに対する分解活性が３２ユニット／ｍｇであった。また、コージビオースをわずかに（０．５ユニット／ｍｇ）分解する活性を示したが、他の二糖に対する分解活性は示さなかった。また、リン酸の非存在下ではニゲロースを分解しなかった。この結果から、本酵素がニゲロース特異的に高い加リン酸分解活性を有することが示された。 As a result, this enzyme had a degradation activity against nigerose of 32 units / mg. Moreover, although the activity which decomposes | disassembles cordobiose slightly (0.5 unit / mg) was shown, it did not show the decomposition activity with respect to other disaccharides. In addition, nigerose was not degraded in the absence of phosphoric acid. From this result, it was shown that this enzyme has a high phosphorolytic activity specific to nigerose.
本酵素は、トレハロース、マルトース及びトレハロース６−リン酸のような、典型的なグリコシドヒドロラーゼファミリー（ＧＨ）６５酵素の基質に対して加リン酸分解活性を示さず、これまで報告のないニゲロースに対して強い加リン酸分解活性を示すことから、従来の他のＧＨ６５酵素とは全く異なる活性を有する酵素であることが判明した。 This enzyme does not exhibit phosphorolytic activity against substrates of typical glycoside hydrolase family (GH) 65 enzymes, such as trehalose, maltose and trehalose 6-phosphate, and has not been reported against nigerose to date. And a strong phosphorolytic activity, it was revealed that the enzyme has completely different activity from other conventional GH65 enzymes.
次いで本酵素について、β−グルコース１−リン酸（β−Ｇ１Ｐ）を糖供与体とし、各種糖を糖受容体（基質）候補とした合成活性を、反応液中のリン酸の増加をＬｏｗｒｙ−Ｌｏｐｅｚの方法（Lowry O.H. and Lopez J.A., (1946) J. Biol. Chem., 162, p. 421-428）により測定することにより決定した。２５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中、１０ｍＭ β−グルコース１−リン酸、及び１０ｍＭ 糖受容体候補糖、並びに実施例１で得た精製酵素２２μｇ／ｍＬを含む、反応液２００μＬを調製し、３０℃で３０分インキュベートした。反応時間後、反応液２５μＬを、１００μＬの０．２Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に加え、酵素反応を停止させてサンプル液とした。２５ｍＭ 硫酸塩を含有する１％ モリブデン酸アンモニウム１２．５μＬと０．０５％硫酸水素カリウムを含有する１％アスコルビン酸１２．５μＬを、上記サンプル液と混合した。混合液を３７℃で１時間インキュベートした後、７００ｎｍでの吸光度を測定した。上記条件下に毎分１μｍｏｌの無機リン酸を生成する酵素活性（合成活性）を１ユニットと定義した。 Next, for this enzyme, the synthesis activity using β-glucose 1-phosphate (β-G1P) as a sugar donor and various sugars as sugar acceptor (substrate) candidates, and the increase in phosphate in the reaction solution as Low- It was determined by measuring by the method of Lopez (Lowry OH and Lopez JA, (1946) J. Biol. Chem., 162, p. 421-428). Prepare a reaction solution of 200 μL containing 10 mM β-glucose 1-phosphate, 10 mM sugar receptor candidate sugar, and 22 μg / mL of the purified enzyme obtained in Example 1 in a 25 mM MOPS-NaOH buffer (pH 7.0). And incubated at 30 ° C. for 30 minutes. After the reaction time, 25 μL of the reaction solution was added to 100 μL of 0.2 M sodium acetate buffer (pH 4.0) to stop the enzyme reaction to obtain a sample solution. 12.5 μL of 1% ammonium molybdate containing 25 mM sulfate and 12.5 μL of 1% ascorbic acid containing 0.05% potassium hydrogen sulfate were mixed with the sample solution. After incubating the mixture at 37 ° C. for 1 hour, the absorbance at 700 nm was measured. Enzyme activity (synthetic activity) that produces 1 μmol of inorganic phosphate per minute under the above conditions was defined as 1 unit.
その結果、本酵素が、糖供与体としてのβ−グルコース１−リン酸の存在下で、グルコース、ガラクトース、キシロース、１，５−アンヒドログルシトール、グルクロン酸、又はα−メチルグルコシドを糖受容体として利用できることが示された。測定された合成活性を表１に示す。 As a result, in the presence of β-glucose 1-phosphate as a sugar donor, this enzyme converts glucose, galactose, xylose, 1,5-anhydroglucitol, glucuronic acid, or α-methylglucoside into sugars. It was shown that it can be used as a receptor. The measured synthetic activity is shown in Table 1.
本酵素は表１に示す基質のいずれからも、対応する二糖を生成した。 The enzyme produced the corresponding disaccharide from any of the substrates shown in Table 1.
一方、本酵素は、マンノース、アロース、Ｌ−アラビノース、リキソース、Ｌ−フコース、Ｌ−ラムノース、フルクトース、２−デオキシ−グルコース、グルカル、グルコサミン、α−グルコース１−リン酸、β−グルコース１−リン酸、グルコース６−リン酸、メチルβ−グルコース、３−メチル−グルコース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビース、ゲンチオビオース、キシロビオース、ラクトース及びスクロースを糖受容体とした活性は示さなかった。 On the other hand, this enzyme is mannose, allose, L-arabinose, lyxose, L-fucose, L-rhamnose, fructose, 2-deoxy-glucose, glucar, glucosamine, α-glucose 1-phosphate, β-glucose 1-phosphorus. Acid, glucose 6-phosphate, methyl β-glucose, 3-methyl-glucose, N-acetyl-glucosamine, N-acetyl-galactosamine, trehalose, cordobiose, nigerose, maltose, isomaltose, sophorose, laminaribiose, serobius, No activity was observed with gentiobiose, xylobiose, lactose and sucrose as sugar receptors.
このように本酵素は、表１に示すように、グルコースの誘導体のうち、２，３位に変異が入っておらず１位に大きな置換基が入っていない単糖又はその誘導体を基質として合成活性を生じた。本酵素は、二糖を合成反応における糖受容体として利用してさらに三糖を合成する活性は示さなかった。このことは、本酵素が、加リン酸分解反応の逆反応では二糖を特異的に合成することを示している。
Thus, as shown in Table 1, this enzyme synthesizes a monosaccharide or derivative thereof having no mutation at
なお本酵素は、同様の実験で、グルコースとα−グルコース１−リン酸からは二糖を合成しなかった。 In the same experiment, this enzyme did not synthesize disaccharides from glucose and α-glucose 1-phosphate.
したがって本酵素が、糖供与体としてのβ−グルコース１−リン酸と糖受容体としての所定の単糖又はその誘導体から二糖を合成する活性を有することが示された。この合成反応は、加リン酸分解反応の逆反応に当たる。 Therefore, it was shown that this enzyme has an activity of synthesizing a disaccharide from β-glucose 1-phosphate as a sugar donor and a predetermined monosaccharide or a derivative thereof as a sugar acceptor. This synthesis reaction corresponds to the reverse reaction of the phosphorolysis reaction.
これらの結果から、実施例１で得られた本酵素が、ニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ−グルコース１−リン酸を生成する新規活性を有することが示された。そこで本酵素をニゲロースホスホリラーゼと命名した。 These results indicate that the enzyme obtained in Example 1 has a novel activity to specifically and reversibly phosphorylate nigerose to produce glucose and β-glucose 1-phosphate. It was. Therefore, this enzyme was named nigerose phosphorylase.
（実施例３）
次に、β−グルコース１−リン酸を糖供与体とした本酵素の合成活性により得られる生成物の解析を行った。１００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中、５０ｍＭ β−グルコース１−リン酸、及び５０ｍＭ 糖受容体（グルコース、キシロース、１，５−アンヒドログルシトール、ガラクトース、又はα−メチルグルコシド）に、実施例１で得た、ニゲロースに対する特異的かつ可逆的な加リン酸分解活性を有する精製酵素（各糖受容体に対して、それぞれ、２２μｇ／ｍＬ、４４μｇ／ｍＬ、４４μｇ／ｍＬ、４４μｇ／ｍＬ、３５０μｇ／ｍＬの濃度）を含む、反応液５００μＬを、３０℃で２０時間インキュベートした。次いでこの反応液を、アンバーライトＭＢ−３（オルガノ社製）を用いて脱塩した後、蒸留水で平衡化したトヨパールＨＷ−４０Ｆカラム（径２．６ｃｍ、長さ３２ｃｍ；トーソー社製）上で、流速０．５ｍＬ／分の、水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィーにより分離することにより、二糖画分を単離した。生成物を含有する画分を回収し、アンバーライトＭＢ−３を用いて再度脱塩した後、凍結乾燥した。こうして得られた生成物の収量は、表２のとおりであった。
(Example 3)
Next, the product obtained by the synthetic activity of this enzyme using β-glucose 1-phosphate as a sugar donor was analyzed. 50 mM β-glucose 1-phosphate and 50 mM sugar receptor (glucose, xylose, 1,5-anhydroglucitol, galactose, or α-methyl glucoside) in 100 mM MOPS-NaOH buffer (pH 7.0) In addition, purified enzymes having specific and reversible phosphorolytic activity for nigerose obtained in Example 1 (22 μg / mL, 44 μg / mL, 44 μg / mL, 44 μg for each sugar receptor, respectively) / ML, 350 μg / mL concentration) was incubated at 30 ° C. for 20 hours. Next, the reaction solution was desalted with Amberlite MB-3 (manufactured by Organo) and then equilibrated with distilled water on a Toyopearl HW-40F column (diameter 2.6 cm, length 32 cm; manufactured by Tosoh Corp.). The disaccharide fraction was isolated by separation by gel filtration chromatography using water as a solvent at a flow rate of 0.5 mL / min. Fractions containing the product were collected, desalted again with Amberlite MB-3 and then lyophilized. The yield of the product thus obtained was as shown in Table 2.
さらに、それぞれの生成物をＮＭＲにより分析した。各生成物の、１Ｄ（１Ｈ及び１３Ｃ）及び２Ｄ［二重量子相関分光解析（ＤＱＦ−ＣＯＳＹ）、異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）、及び異核種多重結合相関（ＨＭＢＣ）］核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Bruker Avance 800又はAvance 500スペクトロメーター（Bruker Biospin社製）を使用し、内部標準として２−メチル−２−プロパノールを用いて、Ｄ２Ｏ中で取得した。プロトンシグナルはＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルに基づいて割り当てた。１３Ｃシグナルには、プロトンシグナルの割り当てに基づいて、ＨＳＱＣスペクトルを割り当てた。それぞれの二糖の結合位置は、各ＨＭＢＣスペクトル中の環内クロスピークを検出することによって決定した。
Furthermore, each product was analyzed by NMR. 1D (1H and 13C) and 2D [Double Quantum Correlation Spectroscopy (DQF-COSY), Heterogeneous Single Quantum Coherence (HSQC), and Heterogeneous Multiple Bond Correlation (HMBC)] nuclear magnetic resonance of each product ( NMR) spectra using Bruker Avance 800 or Avance 500 spectrometer (Bruker Biospin Co., Ltd.), using 2-methyl-2-propanol as internal standard, were obtained in
ＮＭＲ解析の結果、糖受容体としてグルコース、１，５−アンヒドログルシトール、及びガラクトースを用いて得られた生成物は、それぞれ、ニゲロース、３−Ｏ−α−グルコピラノシル−１，５−アンヒドログルシトール、及び３−Ｏ−α−グルコピラノシル−ガラクトースであることが判明した。このことは、グルコース１−リン酸を糖供与体とした本酵素の合成反応において、α−１，３−グルコシル結合が形成されることを示す。 As a result of NMR analysis, the products obtained by using glucose, 1,5-anhydroglucitol and galactose as sugar receptors were found to be nigerose, 3-O-α-glucopyranosyl-1,5-anne, respectively. It was found to be hydroglucitol and 3-O-α-glucopyranosyl-galactose. This indicates that an α-1,3-glucosyl bond is formed in the synthesis reaction of this enzyme using glucose 1-phosphate as a sugar donor.
例として、グルコースを糖受容体とした場合の生成物のＮＭＲ解析の結果を図１に示す。なお、グルコースを糖受容体として得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１のＡ及びＤ）には、ごくわずかな量のコージビオース（１．６％）（図１のＢ）が検出された。 As an example, FIG. 1 shows the result of NMR analysis of the product when glucose is used as a sugar acceptor. A very small amount of cordobiose (1.6%) (B in FIG. 1) was detected in the 1 H-NMR spectrum (A and D in FIG. 1) of the product obtained using glucose as a sugar acceptor. It was done.
また糖受容体としてキシロースを用いて得られた生成物は、３−Ｏ−α−グルコピラノシル−キシロース及び２−Ｏ−α−グルコピラノシル−キシロースを６３：３７の重量比で含有していた。同様に、α−メチルグルコシドを糖受容体として得られた生成物は、メチル−３−Ｏ−α−グルコピラノシル−α−グルコシド及びメチル−２−Ｏ−α−グルコピラノシル−α−グルコシドを７１：２９の重量比で含有していた。例として、メチル−α−Ｄ−グルコシドを糖受容体とした場合の生成物のＮＭＲ解析の結果を図２に示す。 The product obtained using xylose as a sugar acceptor contained 3-O-α-glucopyranosyl-xylose and 2-O-α-glucopyranosyl-xylose in a weight ratio of 63:37. Similarly, a product obtained using α-methylglucoside as a sugar acceptor is obtained by converting methyl-3-O-α-glucopyranosyl-α-glucoside and methyl-2-O-α-glucopyranosyl-α-glucoside into 71:29 In a weight ratio. As an example, FIG. 2 shows the results of NMR analysis of the product when methyl-α-D-glucoside is used as a sugar acceptor.
このように、本酵素によるβ−グルコース１−リン酸と単糖等からのα−グルコシル二糖の合成反応においては、α−１，３−グルコシル結合を有する二糖が主たる生成物であり、α−１，２−グルコシル結合を有する二糖は従たる（マイナーな）生成物であった。
実施例２〜４により示された、本酵素が触媒する可逆的反応を図３に示す。
Thus, in the synthesis reaction of α-glucosyl disaccharide from β-glucose 1-phosphate and monosaccharide by the present enzyme, a disaccharide having an α-1,3-glucosyl bond is the main product, Disaccharides with α-1,2-glucosyl bonds were secondary products (minor).
The reversible reaction catalyzed by the present enzyme as shown in Examples 2 to 4 is shown in FIG.
（実施例４）
本酵素のニゲロース加リン酸分解活性に対する温度の影響を、標準的反応条件で調べた。様々な反応温度で１０分間インキュベートした点以外は、実施例２に示す手順に従って反応を実施した。なお温度安定性は、各種温度で酵素（１７５μｇ／ｍＬ）を１０分間インキュベーションした後の残存活性（加リン酸分解活性）として定義した。
Example 4
The effect of temperature on the nigerose phosphorolytic activity of the enzyme was examined under standard reaction conditions. The reaction was carried out according to the procedure shown in Example 2, except that it was incubated at various reaction temperatures for 10 minutes. The temperature stability was defined as the residual activity (phosphorolysis activity) after incubation of the enzyme (175 μg / mL) for 10 minutes at various temperatures.
測定の結果、本酵素ニゲロースホスホリラーゼはｐＨ７．０において、至適温度は４０℃であり（図４Ａ）、１５℃から４０℃まで安定であった（図４Ｂ）。 As a result of the measurement, the enzyme nigerose phosphorylase was pH 7.0, the optimum temperature was 40 ° C. (FIG. 4A), and was stable from 15 ° C. to 40 ° C. (FIG. 4B).
また、本酵素のニゲロース加リン酸分解活性及びニゲロース合成活性に対するｐＨの影響を、標準的反応条件で調べた。 Moreover, the influence of pH on the nigerose phosphorolytic activity and nigerose synthesis activity of the enzyme was examined under standard reaction conditions.
まず２５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）を、各種ｐＨの１００ｍＭ 緩衝液（クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０−５．５）、４−モルホリン−エタンスルホン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ５．５−７．０）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０−８．５）、グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５−１０．５））に変更する点以外は、実施例２と同様の手順に従って、無機リン酸存在下でのニゲロースに対する加リン酸分解活性と、グルコースとβ−グルコース１−リン酸からのニゲロース合成活性とを測定した。なおｐＨ安定性は、各種ｐＨで３０℃にて３０分間、酵素（１７５μｇ／ｍＬ）をインキュベートした後の残存活性（加リン酸分解活性）として定義した。 First, 25 mM MOPS-NaOH buffer (pH 7.0) was added to 100 mM buffer (sodium citrate (pH 3.0-5.5), 4-morpholine-ethanesulfonic acid-NaOH (pH 5.5-7. 0), 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid-NaOH (pH 7.0-8.5), glycine-NaOH (pH 8.5-10.5)) According to the same procedure as in Example 2, the phosphorolytic activity against nigerose in the presence of inorganic phosphate and the nigerose synthesis activity from glucose and β-glucose 1-phosphate were measured. The pH stability was defined as the residual activity (phosphorolysis activity) after incubation of the enzyme (175 μg / mL) at 30 ° C. for 30 minutes at various pHs.
本酵素の３０℃における至適ｐＨは、加リン酸分解活性及び合成活性の両方についてｐＨ７．０付近（ｐＨ６．５〜７．５）であった（図５Ａ及び図５Ｂ）。さらに本酵素は、３０℃にて３０分の反応条件下で、ｐＨ５．５〜９．０の範囲で安定であった（図５Ｃ）。 The optimum pH of the enzyme at 30 ° C. was around pH 7.0 (pH 6.5 to 7.5) for both phosphorolytic activity and synthetic activity (FIGS. 5A and 5B). Furthermore, this enzyme was stable in the range of pH 5.5 to 9.0 under the reaction conditions at 30 ° C. for 30 minutes (FIG. 5C).
さらに実施例２及び３でニゲロース特異的かつ可逆的な加リン酸分解活性が確認された精製酵素標品について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及びSuperose 12 HR10/30カラム（GE Healthcare UK Ltd.）を用いたゲルろ過法により、分子量測定を行った。その結果、本酵素の分子量は、変性条件下にあるＳＤＳ−ＰＡＧＥでは９０ｋＤａ（キロダルトン）、ゲルろ過法で２００ｋＤａと測定された。この結果から、本酵素が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定値で９０ｋＤａのサブユニットタンパク質（単量体）２個から構成される二量体であること、その二量体の分子量はゲルろ過法による測定値で２００ｋＤａであることが示された。これらの測定値は、配列番号２のアミノ酸配列から計算される分子量８７．２ｋＤａとよく合致していた。 Furthermore, with respect to the purified enzyme preparation in which nigerose-specific and reversible phosphorolytic activity was confirmed in Examples 2 and 3, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Superose 12 HR10 / 30 column ( The molecular weight was measured by gel filtration using GE Healthcare UK Ltd.). As a result, the molecular weight of the enzyme was measured to be 90 kDa (kilodalton) by SDS-PAGE under denaturing conditions and 200 kDa by gel filtration. From this result, the enzyme is a dimer composed of two subunit proteins (monomers) of 90 kDa as measured by SDS-PAGE, and the molecular weight of the dimer is measured by gel filtration. The value was shown to be 200 kDa. These measured values were in good agreement with the molecular weight of 87.2 kDa calculated from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
ニゲロースは、食品用素材や医薬品用素材などへの利用が期待される有用なオリゴ糖である。本発明に係る酵素ニゲロースホスホリラーゼを用いることにより、ニゲロースを製造することが可能である。また本発明に係るニゲロースホスホリラーゼを用いれば、β−グルコース１−リン酸を高効率に製造することもできる。 Nigerose is a useful oligosaccharide that is expected to be used as a food material or a pharmaceutical material. By using the enzyme nigerose phosphorylase according to the present invention, nigerose can be produced. Moreover, if the nigerose phosphorylase which concerns on this invention is used, (beta) -glucose 1-phosphate can also be manufactured with high efficiency.
配列番号３〜４：プライマー SEQ ID NOs: 3-4: Primers
Claims (8)
（ｂ）ｐＨ７．０の条件下で至適温度が４０℃であり、１５℃〜４０℃の範囲で安定であり、
（ｃ）ゲルろ過法で測定した分子量が２００ｋＤａであり、
（ｄ）二量体であり、
（ｅ）クロストリディウム・フィトファーメンタンス由来である、
請求項１又は２に記載の酵素。 (A) The optimum pH is 6.5 to 7.5 under the condition of 30 ° C., stable at pH 5.5 to 9.0,
(B) the optimum temperature is 40 ° C. under the condition of pH 7.0, stable in the range of 15 ° C. to 40 ° C.,
(C) The molecular weight measured by gel filtration is 200 kDa,
(D) is a dimer,
(E) derived from Clostridium phytofermentans,
The enzyme according to claim 1 or 2.
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ−グルコース１リン酸を生成する活性を有するタンパク質 The enzyme of any one of Claims 1-3 comprised from the following protein of (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b) consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, And a protein having an activity to specifically and reversibly phosphorolyze nigerose to produce glucose and β-glucose monophosphate
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015019939A1 (en) * | 2013-08-07 | 2015-02-12 | 国立大学法人新潟大学 | Method for producing α-glucoside |
| CN112980762A (en) * | 2021-03-05 | 2021-06-18 | 江南大学 | Aspergillus niger disaccharide phosphorylase and application thereof in preparation of aspergillus niger disaccharide |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0746991A (en) * | 1993-08-05 | 1995-02-21 | Kikkoman Corp | Production of glucobiose |
| JPH0759559A (en) * | 1993-08-24 | 1995-03-07 | Kirin Brewery Co Ltd | Production of oligosaccharide |
| JPH09201194A (en) * | 1996-01-26 | 1997-08-05 | Kikkoman Corp | New alpha-glucosidase and its production |
| JP2003169665A (en) * | 2001-09-28 | 2003-06-17 | Honen Corp | New method for producing saccharide containing koji oligosaccharide and nigerooligosaccharide and fungal cell and enzyme used threfor and method for producing the same |
-
2011
- 2011-06-10 JP JP2011130340A patent/JP2012254061A/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0746991A (en) * | 1993-08-05 | 1995-02-21 | Kikkoman Corp | Production of glucobiose |
| JPH0759559A (en) * | 1993-08-24 | 1995-03-07 | Kirin Brewery Co Ltd | Production of oligosaccharide |
| JPH09201194A (en) * | 1996-01-26 | 1997-08-05 | Kikkoman Corp | New alpha-glucosidase and its production |
| JP2003169665A (en) * | 2001-09-28 | 2003-06-17 | Honen Corp | New method for producing saccharide containing koji oligosaccharide and nigerooligosaccharide and fungal cell and enzyme used threfor and method for producing the same |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6015027105; Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＹＰ００１５５８９８２ * |
| JPN6015027106; Ｎｉｐｐｏｎ Ｎｏｇｅｉｋａｇａｋｕ Ｋａｉｓｈｉ Ｖｏｌ．７０， Ｎｏ．７, 1996, ｐｐ．７７３-７８０ * |
| JPN6015027107; Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．３８１, 2008, ｐｐ．１１６-１２８ * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015019939A1 (en) * | 2013-08-07 | 2015-02-12 | 国立大学法人新潟大学 | Method for producing α-glucoside |
| CN112980762A (en) * | 2021-03-05 | 2021-06-18 | 江南大学 | Aspergillus niger disaccharide phosphorylase and application thereof in preparation of aspergillus niger disaccharide |
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