JP2012213346A - Method of manufacturing 3-hydroxypropionic acid solution - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の製造方法、ならびに当該方法で得られた３−ヒドロキシプロピオン酸溶液からアクリル酸および吸水性樹脂を製造する方法に関する。特に、本発明は、培養により得られる３−ヒドロキシプロピオン酸を含む培養液に含まれうる副生成物を低減する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a 3-hydroxypropionic acid solution, and a method for producing acrylic acid and a water-absorbing resin from the 3-hydroxypropionic acid solution obtained by the method. In particular, the present invention relates to a method for reducing by-products that can be contained in a culture solution containing 3-hydroxypropionic acid obtained by culturing.
地球温暖化防止および環境保護の観点から、炭素源としてリサイクル可能な生物由来資源を従来の化石原料の代替として用いることが注目されている。例えば、汎用化成品、プラスチックおよび燃料生産の原料として、トウモロコシや小麦等の澱粉系バイオマス、サトウキビなどの糖質系バイオマス、および菜種の絞りかすや稲わら等のセルロース系バイオマス等のバイオマス資源を原料として利用する方法の開発が試みられている。また、バイオマス由来の糖類の利用以外にも、木質系バイオマスをガス化して得られる一酸化炭素と水素とを原料として利用する方法や、木質系バイオマスをガス化してメタノールを合成する方法についても検討・報告されている。このように、バイオマスから得られる糖類以外にも、様々な原料から汎用化成品を合成する技術が望まれている。 From the viewpoint of global warming prevention and environmental protection, attention has been focused on the use of biological resources that can be recycled as carbon sources as an alternative to conventional fossil raw materials. For example, as raw materials for general-purpose chemical products, plastics and fuel production, raw materials such as starch-based biomass such as corn and wheat, sugar-based biomass such as sugar cane, and cellulose-based biomass such as rapeseed pomace and rice straw Attempts have been made to develop methods for use as In addition to the use of biomass-derived saccharides, a method of using carbon monoxide and hydrogen obtained by gasifying woody biomass as raw materials and a method of synthesizing methanol by gasifying woody biomass are also studied. ·It has been reported. Thus, in addition to sugars obtained from biomass, a technique for synthesizing general-purpose chemical products from various raw materials is desired.
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ：３ＨＰ）およびそのエステルは、脂肪族ポリエステルの原料として有用な化合物であり、また、これから合成されるポリエステルは生分解性の地球にやさしいポリエステルとして注目されている。３ＨＰは、通常、アクリル酸に対する水の付加により、またはエチレンクロロヒドリンとシアン化ナトリウムとの反応により製造される。アクリル酸を水和する反応は平衡反応であるため、反応率が制御されるという問題がある。また、エチレンクロロヒドリンの場合は、毒性の強い物質の使用が必要であり、さらに加水分解工程を追加しなくてはならない。この場合、塩化ナトリウムおよびアンモニウム塩が大量に生じるという問題もある。 3-Hydroxypropionic acid (3HP) and its esters are useful compounds as raw materials for aliphatic polyesters, and polyesters synthesized from them are attracting attention as biodegradable earth-friendly polyesters. Yes. 3HP is usually produced by the addition of water to acrylic acid or by the reaction of ethylene chlorohydrin and sodium cyanide. Since the reaction of hydrating acrylic acid is an equilibrium reaction, there is a problem that the reaction rate is controlled. In the case of ethylene chlorohydrin, it is necessary to use a highly toxic substance, and an additional hydrolysis step must be added. In this case, there is also a problem that sodium chloride and ammonium salt are produced in large quantities.
３ＨＰは、脱水することによりアクリル酸を製造することができる。アクリル酸は、主にアクリル酸エステル製造の中間体として使用されており、アクリル酸エステルはコーティング剤、仕上げ剤、ペイント、接着剤の製造に使用され、吸着剤や洗浄剤用添加剤の製造にも使用されている。また、アクリル酸を部分中和させ、架橋性モノマーと共重合させることで吸水性樹脂を製造することもできる。アクリル酸の代替製造法としては、アクリロニトリルの硫酸による加水分解が知られている。しかし、この方法では、硫酸アンモニウム廃棄物が大量に生成し、それに伴うコストのために商業的には実施されていない。 3HP can produce acrylic acid by dehydration. Acrylic acid is mainly used as an intermediate in the manufacture of acrylic esters, and acrylic esters are used in the manufacture of coating agents, finishes, paints, and adhesives, and in the manufacture of adsorbents and detergent additives. Has also been used. Moreover, a water absorbing resin can also be manufactured by partially neutralizing acrylic acid and copolymerizing with a crosslinkable monomer. As an alternative method for producing acrylic acid, hydrolysis of acrylonitrile with sulfuric acid is known. However, this process produces a large amount of ammonium sulfate waste and is not commercially implemented due to the associated costs.
３ＨＰは微生物の培養により生産可能なことが報告されている。例えば、特許文献１では、３ＨＰ生成能を有さない大腸菌に遺伝子組換えにより３ＨＰ生成能を付与し、得られた組換え微生物を３ＨＰの発酵生産に用いる方法が開示されている。 It has been reported that 3HP can be produced by culturing microorganisms. For example, Patent Document 1 discloses a method in which E. coli having no 3HP production ability is imparted with 3HP production ability by genetic recombination, and the resulting recombinant microorganism is used for 3HP fermentation production.
一方、非特許文献１および２では、３ＨＰ生成能を元来保有する微生物を３ＨＰの発酵生産に用いる方法が開示されている。具体的に、非特許文献１では、Ｄｅｕｓｕｌｆｏｒｉｂｒｉｏ属細菌を用いて、非特許文献２では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌を用いて、３ＨＰの発酵生産が行われている。 On the other hand, Non-Patent Documents 1 and 2 disclose a method of using a microorganism originally having 3HP-producing ability for 3HP fermentation production. Specifically, in Non-Patent Document 1, fermentation of 3HP is carried out using Deusforibrio bacteria, and in Non-Patent Document 2, Lactobacillus bacteria are used.
このような微生物の培養による３ＨＰの生産方法では、３ＨＰ以外に発酵副生成物が生成しうる。例えば、乳酸、エタノール、酢酸、１，３−プロパンジオール、プロパノール、プロピオン酸等が３ＨＰ以外の副生成物として生成するとの報告がある。 In such a method for producing 3HP by culturing microorganisms, fermentation by-products can be produced in addition to 3HP. For example, there is a report that lactic acid, ethanol, acetic acid, 1,3-propanediol, propanol, propionic acid and the like are produced as by-products other than 3HP.
上述のように、微生物の培養により得られる未精製の３ＨＰ溶液は発酵副生成物を含みうるが、３ＨＰを脱水処理してアクリル酸を製造する場合、これらの副生成物の存在が問題となる場合がある。 As described above, the unpurified 3HP solution obtained by culturing microorganisms may contain fermentation byproducts, but when 3HP is dehydrated to produce acrylic acid, the presence of these byproducts becomes a problem. There is a case.
特に、発酵副生成物のうち、３ＨＰの異性体である乳酸は、触媒存在下で加熱すると脱水反応によりアクリル酸を生成することが知られているが、一方で、乳酸は３ＨＰに比べて加熱したときに副反応が進行しやすいため、反応器や流路の閉塞や、触媒のコーキングの原因となり、安定的に反応を継続できないという問題を引き起こす。また、乳酸は加熱すると、容易に環化反応を起こし、二量体であるラクチドを形成しうる。ラクチドは重合しやすいため、反応器や流路の閉塞の原因となる。また、反応ガスと共に捕集されて反応液に混入すると、加水分解を起こして乳酸や乳酸ダイマーを生成し、製品のアクリル酸の純度を低下させる要因ともなる。加えて、乳酸は副反応によってプロピオン酸やアセトアルデヒドを副生しうる。プロピオン酸はアクリル酸との分離が困難で、アクリル酸の純度低下の原因となる。またアセトアルデヒドは、反応器内で重質化することにより閉塞の原因となるだけでなく、アクリル酸中に混入すると安定性を損ない、着色や純度低下しやすくなるため、保管が困難になる虞がある。 In particular, lactic acid, which is an isomer of 3HP, is known to produce acrylic acid by a dehydration reaction when heated in the presence of a catalyst, while lactic acid is heated compared to 3HP. Then, the side reaction tends to proceed, causing the reactor and the flow path to be clogged and the caulking of the catalyst, causing a problem that the reaction cannot be stably continued. In addition, when lactic acid is heated, it can easily undergo a cyclization reaction to form lactide, which is a dimer. Since lactide is easily polymerized, it causes blockage of the reactor and the flow path. Moreover, when it is collected together with the reaction gas and mixed in the reaction solution, it causes hydrolysis to produce lactic acid or lactic acid dimer, which also causes a decrease in the purity of the acrylic acid of the product. In addition, lactic acid can by-produce propionic acid and acetaldehyde by side reactions. Propionic acid is difficult to separate from acrylic acid and causes a decrease in the purity of acrylic acid. Acetaldehyde is not only a cause of clogging by becoming heavy in the reactor, but if mixed in acrylic acid, stability is impaired, and coloring and purity are liable to deteriorate, so storage may be difficult. is there.
また、発酵副生成物のうち、エタノールは、反応器内で脱水反応を起こし、エチレンを生成したり、それ以外にもブテン類やその他の重合性不飽和結合を有する炭化水素類を生成したりする。これらの重合性不飽和結合を有する生成物が重合すると、反応器や流路の閉塞を引き起したり、触媒のコーキングにより触媒活性の低下を引き起こす原因となる。 Of the fermentation by-products, ethanol causes a dehydration reaction in the reactor to produce ethylene, and other than that, butenes and other hydrocarbons having a polymerizable unsaturated bond are produced. To do. When these products having a polymerizable unsaturated bond are polymerized, the reactor and the flow path are clogged or the catalyst activity is reduced due to catalyst coking.
以上のように、微生物の培養により３ＨＰを製造する場合、培養の際に副生した乳酸やエタノールが、その後のアクリル酸製造工程における脱水反応に使用される反応管の閉塞や、触媒のコーキングの原因となったり、得られるアクリル酸の純度低下や着色の原因となることが課題であった。 As described above, when 3HP is produced by culturing microorganisms, lactic acid and ethanol by-produced during cultivation are blocked by a reaction tube used for the dehydration reaction in the subsequent acrylic acid production process, or by caulking of the catalyst. It has been a problem that it causes or causes a decrease in purity or coloring of the acrylic acid obtained.
そこで、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、微生物の培養により得られる３−ヒドロキシプロピオン酸溶液に含まれうる乳酸および／またはエタノールを低減する手段を提供することを目的とする。 Then, this invention is made | formed in view of the said situation, and it aims at providing the means to reduce the lactic acid and / or ethanol which can be contained in the 3-hydroxypropionic acid solution obtained by culture | cultivation of microorganisms. .
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、乳酸および／またはエタノールの生成能が負に制御されてなる微生物を用いて培養を行うことにより、３ＨＰ溶液中に含まれる乳酸および／またはエタノールを低減することができることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present invention are included in a 3HP solution by culturing using a microorganism in which the ability to produce lactic acid and / or ethanol is negatively controlled. The inventors have found that lactic acid and / or ethanol can be reduced, and have completed the present invention.
すなわち、上記目的は、有機化合物の存在下で、３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有し、かつ、乳酸および／またはエタノールの生成能が負に制御されてなる微生物を培養し、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を得ることを有し、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液において、３−ヒドロキシプロピオン酸の全質量に対し、乳酸の含有率は１．２質量％以下である、および／または、エタノールの含有率は１質量％以下であることを特徴とする、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の製造方法によって達成される。 That is, the object is to cultivate a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid and the ability to produce lactic acid and / or ethanol to be negatively controlled in the presence of an organic compound. In the 3-hydroxypropionic acid solution, the content of lactic acid is 1.2% by mass or less and / or the content of ethanol in the 3-hydroxypropionic acid solution Is achieved by a method for producing a 3-hydroxypropionic acid solution, characterized in that it is 1% by mass or less.
本発明の方法によると、微生物の培養により得られる３−ヒドロキシプロピオン酸溶液に含まれうる乳酸および／またはエタノールを低減することが可能である。 According to the method of the present invention, lactic acid and / or ethanol that can be contained in a 3-hydroxypropionic acid solution obtained by culturing microorganisms can be reduced.
本発明の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法は、乳酸および／またはエタノールの生成能が負に制御されてなる微生物を用いて培養を行うことを特徴とする。従来の３ＨＰの発酵生産では、微生物の培養により得られる未精製の３ＨＰ溶液中には、３ＨＰの全質量に対し、通常、乳酸は６質量倍以上、エタノールは７０質量％以上含まれていた。これは、有機化合物の存在下で３ＨＰ生成能を有する微生物を培養して３ＨＰを得る際に、当該微生物の３ＨＰ生成能が機能するのと同時に、当該微生物が元来有する乳酸生成能および／またはエタノール生成能も機能するために、乳酸および／またはエタノールが不可避的に副生してしまうことによる。このような３ＨＰ溶液中の乳酸および／またはエタノールは、上述のように３ＨＰからアクリル酸への脱水反応の際に反応するなどして、反応器や流路の閉塞や、触媒のコーキングの原因となったり、他の副生成物を生成してアクリル酸の純度低下や着色の要因ともなりうる。本発明によると、微生物の培養により得られる３ＨＰ溶液に含まれる、３ＨＰの全質量に対する乳酸および／またはエタノールの含有率を、それぞれ、１．２質量％以下、１質量％以下に低減することができる。このように乳酸および／またはエタノールの含有率がこのような範囲であると、３ＨＰ溶液を脱水反応に供してアクリル酸とする際にも、反応管の閉塞や、触媒のコーキング、アクリル酸の純度低下や着色が抑えられ、高効率で高品質のアクリル酸を製造することが可能となる。加えて、乳酸および／またはエタノールの発酵生産を抑制することで、乳酸および／またはエタノールで消費される炭素量を低減することが可能となり、これにより３ＨＰの収率を向上させることも可能となる。 The method for producing 3-hydroxypropionic acid of the present invention is characterized by culturing using a microorganism in which the ability to produce lactic acid and / or ethanol is negatively controlled. In conventional 3HP fermentation production, an unpurified 3HP solution obtained by culturing microorganisms usually contained lactic acid 6 times or more and ethanol 70% by mass or more with respect to the total mass of 3HP. This is because, when 3HP is obtained by culturing a microorganism having the ability to produce 3HP in the presence of an organic compound, the ability of the microorganism to produce 3HP functions simultaneously with the ability of the microorganism to produce lactic acid and / or Since ethanol production ability also functions, lactic acid and / or ethanol are inevitably by-produced. Such lactic acid and / or ethanol in the 3HP solution reacts during the dehydration reaction from 3HP to acrylic acid as described above, which may cause clogging of the reactor and the flow path, or cause caulking of the catalyst. Or other by-products may be produced, which may cause a decrease in the purity of acrylic acid or coloring. According to the present invention, the contents of lactic acid and / or ethanol with respect to the total mass of 3HP contained in the 3HP solution obtained by culturing microorganisms can be reduced to 1.2 mass% or less and 1 mass% or less, respectively. it can. Thus, when the content of lactic acid and / or ethanol is within such a range, even when the 3HP solution is subjected to a dehydration reaction to produce acrylic acid, the reaction tube is clogged, the catalyst is caulked, and the acrylic acid is pure. Reduction and coloring can be suppressed, and high-quality and high-quality acrylic acid can be produced. In addition, by suppressing the fermentation production of lactic acid and / or ethanol, it becomes possible to reduce the amount of carbon consumed by lactic acid and / or ethanol, thereby improving the yield of 3HP. .
以下、本発明の好ましい形態を説明する。なお、以下では、所望の反応を触媒する酵素名または酵素遺伝子名を記載しているが、所望の反応を触媒できる酵素または酵素遺伝子であれば、その酵素名、酵素遺伝子名に関わらず、本明細書記載の酵素または酵素遺伝子と同様に利用することが可能である。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. In the following, the name of the enzyme or enzyme gene that catalyzes the desired reaction is described. However, the name of the enzyme or enzyme gene that can catalyze the desired reaction is the same regardless of the enzyme name or enzyme gene name. It can be used in the same manner as the enzyme or enzyme gene described in the specification.
＜３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法＞
本発明の３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の製造方法は、有機化合物の存在下で、３−ヒドロキシプロピオン酸生成能を有し、かつ、乳酸および／またはエタノールの生成能が負に制御されてなる微生物を培養し、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液を得ることを有し、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液において、３−ヒドロキシプロピオン酸の全質量に対し、乳酸の含有率は１．２質量％以下である、および／または、エタノールの含有率は１質量％以下であることを特徴とする。本形態では、３ＨＰ生成能を有し、かつ、乳酸および／またはエタノールの生成能が負に制御されてなる微生物を用いることにより、有機化合物から３ＨＰへの変換の際に同時に起こる、乳酸および／またはエタノールの生成そのものを抑制する点に特徴を有する。
<Method for producing 3-hydroxypropionic acid>
The method for producing a 3-hydroxypropionic acid solution of the present invention comprises a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid and the ability to produce lactic acid and / or ethanol to be negatively controlled in the presence of an organic compound. The 3-hydroxypropionic acid solution, and in the 3-hydroxypropionic acid solution, the content of lactic acid is 1.2% by mass or less with respect to the total mass of 3-hydroxypropionic acid. And / or the content rate of ethanol is 1 mass% or less, It is characterized by the above-mentioned. In the present embodiment, by using a microorganism having 3HP production ability and negatively controlled production ability of lactic acid and / or ethanol, lactic acid and / or which occur simultaneously in the conversion from an organic compound to 3HP. Or, it is characterized by suppressing the production of ethanol itself.
本形態において３ＨＰの原料となる有機化合物（炭素源）は特に制限されない。例えば、糖、糖アルコール、アルコール、脂肪酸、カルボン酸、一酸化炭素、または二酸化炭素等が使用されうる。ここで、糖としては、特に制限されず、培養に使用される一般的な糖が使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース等の六炭糖類、キシロース等の五炭糖類、デンプンの加水分解等により得られた糖類、セルロース系バイオマスを糖化処理することにより得られる糖類などが使用できる。また、糖アルコールとしては、特に制限されず、培養に使用される一般的な糖アルコールが使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、グリセリン、エリスリトール、Ｄ，Ｌ−トレイトール、Ｄ，Ｌ−アラビニトール、キシリトール、リビトール（アドニトール）、Ｄ−イジトール、ガラクチトール（ダルシトール）、Ｄ−グルシトール（ソルビトール）、マンニトール、ボレミトール、ペルセイトール、Ｄ−エリトロ−Ｄ−ガラクト−オクチトールなどが挙げられる。アルコールとしては、特に制限されず、培養に使用される一般的なアルコールが使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、メタノール、エタノール、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。脂肪酸としては、特に制限されず、培養に使用される一般的な脂肪酸が使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、オクタン酸、ドデカン酸、酪酸、カプロン酸、デカン酸、などが挙げられる。カルボン酸としては、特に制限されず、培養に使用される一般的なカルボン酸が使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、乳酸、酢酸、グルコン酸、プロピオン酸、蟻酸などが挙げられる。これらの有機化合物は、１種のみが単独で使用されてもよいし、２種以上が組み合わされて使用されてもよい。 In this embodiment, the organic compound (carbon source) that is a 3HP raw material is not particularly limited. For example, sugar, sugar alcohol, alcohol, fatty acid, carboxylic acid, carbon monoxide, carbon dioxide or the like can be used. Here, the sugar is not particularly limited, and a general sugar used for culture can be used, and is appropriately selected depending on the biological species. For example, hexose saccharides such as glucose, lactose, galactose and fructose, pentose saccharides such as xylose, saccharides obtained by hydrolysis of starch, saccharides obtained by saccharifying cellulose-based biomass, and the like can be used. Moreover, it does not restrict | limit especially as sugar alcohol, The common sugar alcohol used for culture | cultivation can be used, and it selects suitably according to the biological species. For example, glycerin, erythritol, D, L-threitol, D, L-arabinitol, xylitol, ribitol (adonitol), D-iditol, galactitol (dulcitol), D-glucitol (sorbitol), mannitol, boleitol, persitol, D -Erythro-D-galacto-octitol and the like. The alcohol is not particularly limited, and general alcohol used for culture can be used, and is appropriately selected depending on the species. For example, methanol, ethanol, polyvinyl alcohol, etc. are mentioned. The fatty acid is not particularly limited, and a general fatty acid used for culture can be used, and is appropriately selected depending on the biological species. Examples include octanoic acid, dodecanoic acid, butyric acid, caproic acid, decanoic acid, and the like. The carboxylic acid is not particularly limited, and a general carboxylic acid used for culturing can be used, and is appropriately selected depending on the biological species. Examples thereof include lactic acid, acetic acid, gluconic acid, propionic acid, formic acid and the like. Only one kind of these organic compounds may be used alone, or two or more kinds thereof may be used in combination.
本形態において、３ＨＰ生成能を有する微生物として使用される微生物は、３ＨＰ生成能を元来有する微生物であってもよいし、３ＨＰ生成能を元来有しない微生物に遺伝子組換えにより３ＨＰ生成能を付与してなる組換え微生物であってもよい。また、３ＨＰ生成能を元来有する微生物の３ＨＰ生成能を、遺伝子組換えによりさらに強化してなる組換え微生物を用いても構わない。使用されうる微生物としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ属、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ属、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ属、Ｏｓｃｉｌｌｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｈｅｌｉｏｔｈｒｉｘ属、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ属、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｃｌａｔｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｐｒｏｓｔｈｅｃｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｈａｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｉｓｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｍａｒｉｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ属、Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃａ属、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｔｈａｌａｓｓｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｏｄｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｒｏｓｅｏｓｐｉｒａ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｃａｒｂｏｘｙｄｉｂｒａｃｈｉｕｍ属、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｃｅｌｌａ属、Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ属、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属に属する微生物が挙げられるが、上記以外の微生物も、勿論、利用可能である。これらの微生物は、１種のみが単独で使用されてもよいし、２種以上が組み合わされて使用されてもよい。 In this embodiment, the microorganism used as the microorganism having 3HP production ability may be a microorganism originally having 3HP production ability, or the microorganism having no 3HP production ability originally has 3HP production ability by genetic recombination. It may be a recombinant microorganism provided. Moreover, you may use the recombinant microorganism formed by further strengthening the 3HP production ability of the microorganism which originally has 3HP production ability by gene recombination. Examples of microorganisms that can be used include the genus Escherichia, Lactobacillus, Salmonella, Klebsiella, Propionibacterium, Agrobacterium, Banaphyra, , Geobacter genus, Gloeobacter genus, Leptospira genus, Mycobacterium genus, Mycobacterium genus, Photorhabdus genus, Porphyromonas genus, Prochlorococcus genus, Pseudomonas genus, R lstonia species, Rhodobacter sp., Rhodopseudomonas spp., Sinorhizobium spp., Streptomyces spp., Synechococcus sp., Thermosynechococcus spp., Treponema spp., Archaeoglobus spp., Halobacterium sp., Mesorhizobium genus, Methanobacterium genus, Methanococcus genus, Methanopyrus genus, Methanosarcina sp., Methanosarcina sp., Pyrobaculum spp. , Sulfolobus genus, Thermoplasma genus, Acetobacterium genus, Moorella genus, Oligotropha genus, Cupriavidus genus, C loroflexus genus, Roseiflexus genus, Erythrobacter genus, Metallosphaera genus, Sulfolobus genus, Acidianus genus, Sulfolobus genus, Acidianus genus, Stygiolobus genus, Pyrolobus spp., Alcaligenes sp., Synechococcus sp., Chloronema genus, Oscillochloris genus, Heliothrix genus, Herpetosiphon genus, Roseiflexus spp. , Thermomicrobium genus, Clastrochloris genus, Prosthecochloris genus, Allochromatium genus, Chromatium genus, Halochromatium genus, Isochromatium genus, M arichromatium genus, Rhodovulum genus, Thermochromatium genus, Thiocapsa genus, Thiorhodococcus genus, Thiocystis genus, Phaeospirillum genus, Rhodobaca genus, Rhodomicrobium genus, Rhodopila genus, Rhodopseudomonas genus, Rhodothalassium genus, Rhodospirillum genus, Rodovibrio genus, Roseospira genus, Hydrogenovibrio genus, Hydrogenophilus spp. , Hydrogenobacter genus, Oxobacter genus, Peptostreptococcus genus, Eubacterium genus, Butyribacterium genus, Rubrivi ax genus, Citrobacter spp., Carboxydothermus genus, Carboxydibrachium genus, Carboxydocella genus, Thermincola genus, Thermolithobacter genus, Thermosinus genus, Desulfotomaculum genus, Thermosyntrophicum genus, Methanothermobacter species, Thermococcus spp., Bacillus sp., Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Pichia sp., Kluyveromyces sp. And microorganisms belonging to the genus Torulaspora, Zygosaccharomyces, and Candida, but other microorganisms can of course be used.Only 1 type of these microorganisms may be used independently, and 2 or more types may be used in combination.
本発明の一形態によると、上記微生物のうち、操作性、遺伝子組換えの容易さ、遺伝子発現系の有無、微生物の増殖速度、培養における知見などの観点から、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を用いることが好ましい。 According to one aspect of the present invention, among the above microorganisms, microorganisms belonging to the genus Escherichia, particularly Escherichia coli, from the viewpoints of operability, ease of gene recombination, presence / absence of gene expression system, growth rate of microorganisms, knowledge in culture, etc. It is preferable to use (Escherichia coli).
また、本発明の他の一形態によると、上記微生物のうち、酸耐性能を有する微生物を用いることが好ましい。一例を挙げると、乳酸発酵において発酵中のｐＨ調整を行わなくとも乳酸生成が可能であることが報告されている、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅを宿主として利用することができる。これにより、３ＨＰ生成に伴って低下する培地中のｐＨを、ＮａＯＨやアンモニア等のアルカリ試薬を添加することで中性付近に調整しなくとも３ＨＰ発酵を継続することが可能となる。このような酸耐性能を有するＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等の微生物を利用した３ＨＰ発酵（３ＨＰ酸型発酵）を行う場合、発酵中のｐＨ調整は必要なく、つまりアルカリ試薬の添加が不要となる。 According to another embodiment of the present invention, among the above microorganisms, it is preferable to use a microorganism having acid resistance. As an example, Shizosaccharomyces pombe, which has been reported to be capable of producing lactic acid without adjusting pH during fermentation in lactic acid fermentation, can be used as a host. Thereby, it becomes possible to continue 3HP fermentation even if it does not adjust pH in the culture medium which falls with 3HP production | generation to neutral vicinity by adding alkaline reagents, such as NaOH and ammonia. When performing 3HP fermentation (3HP acid type fermentation) using microorganisms such as Shizosaccharomyces pombe having such acid resistance, pH adjustment during fermentation is not necessary, that is, addition of an alkaline reagent is not necessary.
従来から一般的に行われている３ＨＰ塩発酵は、アルカリ試薬を添加してｐＨを中性付近に保ちながら発酵を行うものであり、発酵工程終了後の発酵液中の３ＨＰは、塩の状態で存在する。３ＨＰ塩の状態で発酵液から３ＨＰを回収しようとすると、３ＨＰの回収率の低下や、続く３ＨＰのアクリル酸への脱水反応における収率の低下等が問題となりうる。当該問題を解決する方法として、３ＨＰ塩発酵後に、３ＨＰ塩を３ＨＰに変換してから３ＨＰを回収する方法が提案されている。例えば、国際公開第２００２／０９０３１２号パンフレットには、３ＨＰアンモニウム塩を含む溶液にアミン系溶媒の添加、加熱によって３ＨＰアンモニウム塩を３ＨＰに変換し、アミン系溶媒に３ＨＰを抽出する方法が開示されている。また、国際公開第２００５／０７３１６１号パンフレットには、３ＨＰカルシウム塩を含む溶液に第３級アミン溶媒を添加し、二酸化炭素を流加することによって３ＨＰカルシウム塩を３ＨＰに変換し、第３級アミン溶媒中に３ＨＰを抽出する方法が開示されている。 Conventionally, 3HP salt fermentation is generally performed by adding an alkaline reagent and maintaining the pH in the vicinity of neutrality, and 3HP in the fermentation broth after completion of the fermentation process is in a salt state. Exists. If 3HP is to be recovered from the fermentation broth in the state of 3HP salt, a decrease in the recovery rate of 3HP, a decrease in yield in the subsequent dehydration reaction of 3HP to acrylic acid, or the like may be a problem. As a method for solving the problem, a method of recovering 3HP after converting 3HP salt to 3HP after 3HP salt fermentation has been proposed. For example, International Publication No. 2002/09031 pamphlet discloses a method of adding an amine solvent to a solution containing a 3HP ammonium salt, converting the 3HP ammonium salt to 3HP by heating, and extracting 3HP into the amine solvent. Yes. In addition, International Publication No. 2005/073161 pamphlet converts a 3HP calcium salt to 3HP by adding a tertiary amine solvent to a solution containing 3HP calcium salt, and feeding carbon dioxide, thereby converting a tertiary amine. A method for extracting 3HP into a solvent is disclosed.
一方、上述の３ＨＰ酸型発酵は、発酵工程におけるｐＨを調整するためのアルカリ試薬が不要であり、また、アルカリ試薬の添加による発酵液の希釈化を行う必要もないため、発酵終了後の発酵液中の３ＨＰ濃度を高く保つことができる。さらに、３ＨＰ塩を３ＨＰに変換する工程、およびこれに必要な熱エネルギーや二酸化炭素、酸性試薬等も不要である。このように、３ＨＰ酸型発酵は、原材料の削減、発酵工程以降の工程の簡略化、およびユーテリィティーの向上が可能であるため、３ＨＰ塩発酵と比較して非常に有利な方法である。 On the other hand, the 3HP acid type fermentation described above does not require an alkaline reagent for adjusting the pH in the fermentation process, and it is not necessary to dilute the fermentation broth by adding an alkaline reagent. The 3HP concentration in the liquid can be kept high. Furthermore, the step of converting the 3HP salt into 3HP, and the heat energy, carbon dioxide, acidic reagent and the like necessary for this are unnecessary. Thus, 3HP acid type fermentation is a very advantageous method compared to 3HP salt fermentation because it can reduce raw materials, simplify the processes after the fermentation process, and improve the utility.
低ｐＨでも発酵が可能な、酸耐性能を有する微生物の一例として、上記ではＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅの利用を記載したが、低ｐＨでも発酵可能な能力を保有した微生物や、生成された３ＨＰによる生育阻害に対する耐性を保有する微生物であれば、どのような微生物でも利用可能である。また、低ｐＨでも発酵が継続するように改変した遺伝子組換え微生物、３ＨＰによる生育阻害を抑制するように改変した遺伝子組換え微生物、低ｐＨでも発酵が継続するように変異処理を施した変異株、または３ＨＰによる生育阻害に対する耐性を向上させた変異株のいずれも利用可能である。低ｐＨでも発酵が可能な微生物としてはＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ以外には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等の酵母、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓが例示できる。なお、当然のことながら、上述の３ＨＰ酸型発酵は、本発明の好ましい一形態に過ぎないため、本発明の製造方法として３ＨＰ塩型発酵を採用することも勿論可能である。 As an example of a microorganism capable of fermentation even at low pH and having acid resistance, the use of Shizosaccharomyces pombe has been described above. However, microorganisms possessing the ability to ferment even at low pH and the growth inhibition by 3HP produced Any microorganism can be used as long as it has resistance. In addition, a genetically modified microorganism modified to continue fermentation even at low pH, a genetically modified microorganism modified to suppress growth inhibition by 3HP, and a mutant strain subjected to mutation treatment to continue fermentation even at low pH Any of the mutants having improved resistance to growth inhibition by 3HP can be used. As the addition Shizosaccharomyces pombe is a microorganism capable of fermenting any low pH, Saccharomyces genus, Kluyveromyces genus, Pichia genus Torulaspora genus Zygosaccharomyces spp, yeasts Candida genus such as, specifically, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces thermotolerans Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Candida sonorensis. Of course, the 3HP acid type fermentation described above is only one preferred form of the present invention, and of course, 3HP salt type fermentation can be adopted as the production method of the present invention.
また、本形態における３ＨＰ生成能を有する微生物として、メタン生成菌、硫黄酸化細菌、水素細菌、アンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌、鉄酸化細菌、緑色植物、藻類、ラン藻類、緑色硫黄細菌、紅色硫黄細菌等のカルビンベンソン回路、還元的ＴＣＡ回路、アセチルＣｏＡ経路、３−ヒドロキシプロピオン酸経路等の炭素固定経路を有する生物を遺伝子組換えの宿主として利用することで、炭素源として、二酸化炭素および／または一酸化炭素を用いて３ＨＰを発酵生産することも可能である。特に、生育速度の速さ、有機酸の生産速度等から、水素を酸化してエネルギーを獲得する能力を有するＨｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ属細菌を宿主として利用することが好ましい。これらの微生物は、１種のみが単独で使用されてもよいし、２種以上が組み合わされて使用されてもよい。 In addition, as a microorganism having 3HP generating ability in this embodiment, methanogenic bacteria, sulfur oxidizing bacteria, hydrogen bacteria, ammonia oxidizing bacteria, nitrite oxidizing bacteria, iron oxidizing bacteria, green plants, algae, cyanobacteria, green sulfur bacteria, red By utilizing an organism having a carbon fixation pathway such as a Calvin Benson cycle such as a sulfur bacterium, a reductive TCA cycle, an acetyl CoA pathway, a 3-hydroxypropionic acid pathway as a genetic recombination host, carbon dioxide and It is also possible to produce 3HP by fermentation using carbon monoxide. In particular, it is preferable to use, as a host, a genus Hydrogenobacter, Acetobacterium, Moorella, or Oligotropha that has the ability to oxidize hydrogen and acquire energy from the speed of growth, organic acid production, and the like. Only 1 type of these microorganisms may be used independently, and 2 or more types may be used in combination.
さらに、本形態における３ＨＰ生成能を有する微生物として、乳酸等のカルボン酸を資化する微生物および／またはエタノール等のアルコールを資化する微生物を利用することも、また好ましい。このような微生物を用いると、培養において糖を炭素源として用いる場合、まずは糖が消費され、糖が枯渇した後、糖から発酵生産されたカルボン酸やアルコールが炭素源として利用されうる。よって、結果として培養液中に含まれるカルボン酸やアルコール含量を低下させることが可能となる。 Furthermore, it is also preferable to use a microorganism that assimilate a carboxylic acid such as lactic acid and / or a microorganism that assimilates an alcohol such as ethanol as the microorganism having the ability to produce 3HP in this embodiment. When such a microorganism is used, when sugar is used as a carbon source in culture, first, the sugar is consumed, and after the sugar is depleted, carboxylic acid or alcohol produced by fermentation from the sugar can be used as the carbon source. Therefore, as a result, it becomes possible to reduce the carboxylic acid and alcohol content contained in the culture solution.
本形態おいて、３ＨＰ生成能を有する微生物として使用される微生物は、３ＨＰ生成能を元来有しない微生物に遺伝子組換えにより３ＨＰ生成能を付与してなる組換え微生物であってもよい。３ＨＰ生成能を元来有しない微生物に遺伝子組換えにより３ＨＰ生成能を付与する方法としては、国際公開第２００１／０１６３４６号パンフレットに開示されている、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来グリセロールデヒドラターゼおよび大腸菌由来アルデヒドデヒドロゲナーゼを導入した遺伝子組換え大腸菌を用いたグルコースまたはグリセリンからの３−ヒドロキシプロピオン酸の発酵生成方法；国際公開第２００８／０２７７４２号パンフレットおよび国際公開第２００３／０６２１７３号パンフレットに開示されている、βアラニンを中間体としたグルコースからの３ＨＰ発酵生産方法；国際公開第２００２／０４２４１８号パンフレットに開示されている乳酸を中間体としたグルコースからの３ＨＰ発酵生産方法等がある。また、本形態において、３ＨＰ生成能を有する微生物として使用される微生物は、３ＨＰ生成能を元来有する微生物の３ＨＰ生成能を、遺伝子組換えによりさらに強化してなる組換え微生物であってもよい。３ＨＰ生成能を強化する方法としては、３ＨＰサイクルと呼ばれる炭素固定経路を保有するＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓにおいて３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅの活性を低下させる方法や、３ＨＰ生成に関与する酵素遺伝子の活性を向上させた微生物を利用する方法、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉやＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等のグリセリンから３ＨＰや１，３−プロパンジオールを発酵生産する能力を有する微生物において、３ＨＰ以外の代謝産物を生成する不要な代謝経路を遮断する方法や、３ＨＰ生成に必要なグリセリンの脱水反応を触媒可能な酵素や３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの酸化反応を触媒可能な酵素の活性を向上させる方法等がある。以上、３ＨＰ生成能を有する微生物の構築方法を列記したが、本形態はこれらの方法に限定されず、上記以外の方法で得られる組換え微生物を使用することも、勿論可能である。 In this embodiment, the microorganism used as the microorganism having 3HP production ability may be a recombinant microorganism obtained by imparting 3HP production ability by genetic recombination to a microorganism that originally does not have 3HP production ability. As a method for imparting 3HP generation ability by genetic recombination to a microorganism that does not originally have 3HP generation ability, Klebsiella pneumoniae-derived glycerol dehydratase and Escherichia coli-derived aldehyde dehydrogenase disclosed in WO2001 / 016346 are introduced. Method for Fermentation of 3-Hydroxypropionic Acid from Glucose or Glycerin Using Recombinant E. coli; β-Alanine Disclosed in WO2008 / 027742 and WO2003 / 062173 3HP fermentation production method from glucose as a body; 3HP fermentation production method from glucose using lactic acid as an intermediate disclosed in WO 2002/042418 pamphlet, etc. There is. Further, in this embodiment, the microorganism used as the microorganism having the ability to produce 3HP may be a recombinant microorganism obtained by further enhancing the 3HP production ability of the microorganism originally having the ability to produce 3HP by genetic recombination. . As a method of enhancing 3HP production ability, a method of reducing the activity of 3-hydroxypropionyl-CoA synthetase in Chloroflexus aurantiacus possessing a carbon fixation pathway called 3HP cycle, and an activity of an enzyme gene involved in 3HP production were improved. A method of using microorganisms, a method of blocking unnecessary metabolic pathways that produce metabolites other than 3HP in microorganisms having the ability to fermentatively produce 3HP and 1,3-propanediol from glycerin such as Lactobacillus reuteri and Klebsiella pneumoniae, Improves the activity of enzymes capable of catalyzing dehydration of glycerin required for 3HP production and enzymes capable of catalyzing oxidation of 3-hydroxypropionaldehyde There is a method to. As mentioned above, although the construction method of the microorganisms which have 3HP production ability was listed, this form is not limited to these methods, Of course, it is also possible to use the recombinant microorganism obtained by methods other than the above.
本形態において使用される微生物は、乳酸および／またはエタノールの生成能が負に制御されてなることを特徴とする。本形態において、微生物の有する乳酸および／またはエタノールの生成能を負に制御する方法は、特に制限されないが、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ活性および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を負に制御する方法が挙げられる。ここで、乳酸デヒドロゲナーゼは、乳酸とピルビン酸との相互変換を触媒する酵素であり、また、ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルビン酸を脱炭酸してアセトアルデヒドと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。なお、ここで生じるアセトアルデヒドは、アルコールデヒドロゲナーゼにより、エタノールに変換されうる。 The microorganism used in this embodiment is characterized in that the ability to produce lactic acid and / or ethanol is negatively controlled. In this embodiment, the method for negatively controlling the ability of microorganisms to produce lactic acid and / or ethanol is not particularly limited, and examples thereof include a method for negatively controlling lactate dehydrogenase activity and / or pyruvate decarboxylase activity. . Here, lactate dehydrogenase is an enzyme that catalyzes the interconversion between lactic acid and pyruvate, and pyruvate decarboxylase is an enzyme that catalyzes the reaction of decarboxylating pyruvate to produce acetaldehyde and carbon dioxide. is there. In addition, the acetaldehyde produced here can be converted into ethanol by alcohol dehydrogenase.
乳酸デヒドロゲナーゼ活性および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を負に制御する方法としては、具体的には、（１）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子に欠失、置換、付加、または挿入による改変を行うことにより負に制御する；（２）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現制御因子を負に制御する；（３）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現を制御するプロモーター領域に変異を加え、転写量を低くする改変を行う；（４）乳酸および／またはエタノールの生成量が低くなった変異株を宿主として利用する；などの方法が挙げられる。これらの方法のうち、（１）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子に欠失、置換、付加、または挿入により改変を行う方法であることが好ましく、このうち、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を欠失する方法であることがより好ましい。これらの方法は、当業者であれば、公知の手法を適宜使用することにより容易に行うことができる。 Specifically, as a method for negatively controlling lactate dehydrogenase activity and / or pyruvate decarboxylase activity, (1) deletion, substitution, addition, or insertion of lactate dehydrogenase gene and / or pyruvate decarboxylase gene Negatively controlled by making modifications; (2) negatively control the expression regulator of lactate dehydrogenase gene and / or pyruvate decarboxylase gene; (3) expression of lactate dehydrogenase gene and / or pyruvate decarboxylase gene And (4) using a mutant strain with a reduced production amount of lactic acid and / or ethanol as a host. Among these methods, (1) the lactate dehydrogenase gene and / or the pyruvate decarboxylase gene is preferably modified by deletion, substitution, addition, or insertion. Among these methods, the lactate dehydrogenase gene and / or More preferably, the method is to delete the pyruvate decarboxylase gene. Those skilled in the art can easily perform these methods by appropriately using known methods.
また、エタノールの生成能を負に制御する方法としては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の欠損の他に、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子の欠損でもエタノール生成能を負に制御することが可能である。 Moreover, as a method for negatively controlling ethanol production ability, ethanol production ability can be negatively controlled not only by deletion of pyruvate decarboxylase gene but also by deletion of acetaldehyde dehydrogenase gene, alcohol dehydrogenase gene, and hexokinase gene. It is.
例えば、遺伝子を欠失させる方法は公知の方法を使用できる。具体的には、標的遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（ターゲティングベクター）を用いて当該遺伝子を破壊する方法（ジーンターゲティング法）や、標的遺伝子の任意の位置にトラップベクター（プロモーターを持たないレポーター遺伝子）を挿入して当該遺伝子を破壊しその機能を失わせる方法（遺伝子トラップ法）、それらを組み合わせた方法等の当技術分野でノックアウト細胞、トランスジェニック動物（ノックアウト動物含む）等を作製する際に用いられる方法を用いることができる。また、欠失させたい遺伝子のアンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターを導入する方法や、欠失させたい遺伝子の２重鎖ＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入する方法も利用できる。当該ベクターとしては、ウイルスベクターやプラスミドベクター等が包含され、通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い作製することができる。また、市販されているベクターを任意の制限酵素で切断し所望の遺伝子等を組み込んで半合成することもできる。 For example, a known method can be used as a method for deleting a gene. Specifically, a method of destroying the gene using a vector (targeting vector) that causes homologous recombination at an arbitrary position of the target gene (gene targeting method), or a trap vector (promoter at an arbitrary position of the target gene). Knockout cells, transgenic animals (including knockout animals), etc. in this technical field, such as methods that insert a reporter gene that does not possess) and destroy the gene to lose its function (gene trap method), methods that combine them, etc. A method used for manufacturing can be used. In addition, a method of introducing a vector expressing an antisense cDNA of a gene desired to be deleted, or a method of introducing a vector expressing a double-stranded RNA of a gene desired to be deleted into a cell can be used. Such vectors include viral vectors, plasmid vectors, etc., and are based on conventional genetic engineering techniques, for example, Sambrook, J et al. , Molecular Cloning 2nd ed. , 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. It can be produced according to a basic book such as press (1989). In addition, a commercially available vector can be cleaved with an arbitrary restriction enzyme, and a desired gene or the like can be incorporated and semi-synthesized.
相同置換を起こす位置またはトラップベクターを挿入する位置は、欠失させたい標的遺伝子の発現を消失させる変異を生じる位置であれば特に限定されないが、好ましくは転写調節領域、より好ましくは第２エクソンを置換する。 The position where homologous substitution occurs or the position where the trap vector is inserted is not particularly limited as long as it causes a mutation that eliminates the expression of the target gene to be deleted, but preferably a transcriptional regulatory region, more preferably a second exon. Replace.
また、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅ社より販売されている、リコンビネーションタンパク質を利用した相同組換えによる遺伝子破壊系（Ｒｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）を利用すれば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の、欠失させたい遺伝子のみを選択的に破壊した遺伝子破壊株を構築することが可能である。さらに、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社から販売されているグループ２イントロンを利用した遺伝子破壊システムであるＴａｒｇｅＴｒｏｎ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｙｓｔｅｍを利用することで、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｔｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の遺伝子破壊も可能である。 Moreover, if a gene disruption system (Red system) using homologous recombination using a recombination protein, sold by Gene Bridge, is used, the lack of Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Serratia, or Citrobacter bacteria. It is possible to construct a gene-disrupted strain in which only the gene to be lost is selectively disrupted. Furthermore, using the TargetTron Gene Knockout System, a gene disruption system using a group 2 intron sold by Sigma-aldrich, Escherichia, Staphylococcus, Clostridium, Lactococcus, Shigcellis, Lactococcus, Gene disruption of Pseudomonas and Agrobacterium is also possible.
Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅを宿主として利用する場合は、ＹＥＡＳＴ，１９９８；１４（１０），９４３−９５１に記載されている方法やＮａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．，２００６；１（５），２４５７−６４に記載されている方法等の公知の方法が利用可能であり、これらの方法を利用することで任意の酵素遺伝子を破壊することができる。 When Shizosaccharomyces pombe is used as a host, the method described in YEAST, 1998; 14 (10), 943-951, Nat Protoc. , 2006; 1 (5), 2457-64, and other known methods can be used, and any enzyme gene can be destroyed by using these methods.
ベクターの宿主への導入方法は、使用する宿主によって選定すれば良く、特に制限されない。例えば大腸菌では、ベクター導入に一般的に利用されている電気パルス法、カルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等を利用することができる。 The method for introducing the vector into the host may be selected depending on the host used, and is not particularly limited. For example, in Escherichia coli, an electric pulse method, a method using calcium ions, a protoplast method, an electroporation method and the like generally used for vector introduction can be used.
本形態の３ＨＰ溶液の製造方法では、原料として利用する有機化合物の存在下で上記微生物を培養し、当該微生物が有機化合物を資化する過程で生成する３ＨＰを培養液中に蓄積させることにより実施できる。 In the method for producing a 3HP solution according to the present embodiment, the microorganism is cultured in the presence of an organic compound used as a raw material, and the 3HP produced in the process of assimilating the organic compound is accumulated in the culture solution. it can.
培養に用いる培地および培養条件は、微生物の生育条件により選定すればよく、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができ、特に限定されない。例えば、大腸菌においてはＬＢ培地が例示できる。培養は、微生物（宿主）の生育に好適な条件で行われればよく、特に限定されない。例えば、大腸菌を宿主として利用する場合は、培養温度１０℃〜４５℃で、１６〜９６時間実施する。培養を連続的に行う場合には、培養は１週間〜３ヶ月間実施する。 The culture medium and culture conditions used for the culture may be selected according to the growth conditions of the microorganism, and a normal culture medium containing a nitrogen source, inorganic ions and other organic micronutrients as necessary can be used, and is not particularly limited. For example, in E. coli, LB medium can be exemplified. The culture is not particularly limited as long as it is performed under conditions suitable for the growth of the microorganism (host). For example, when using Escherichia coli as a host, it is carried out at a culture temperature of 10 ° C. to 45 ° C. for 16 to 96 hours. When the culture is continuously performed, the culture is performed for 1 week to 3 months.
微生物の培養におけるｐＨは、３ＨＰが効率的に発酵生産可能なｐＨであれば特に限定されない。酸耐性能を有する微生物を用いて培養を行う場合（３ＨＰ酸型発酵）、低ｐＨでも発酵産物の生成が継続するため、アルカリ試薬を添加してｐＨを中性付近に調整することなく培養することが可能である。例として、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅを宿主として利用する場合、培養開始時は使用する培地のｐＨ（中性付近）から培養は開始するが、３ＨＰの生成に伴って次第に培地のｐＨは低下する。ｐＨ２．５付近まで培地のｐＨが低下すると宿主の生育は抑制されるが、ｐＨ２．５以下、例えばｐＨ１付近まで培地のｐＨが低下したとしても、培地中の炭素源は資化され、３ＨＰ生産は継続する。３ＨＰの培地中の濃度が１００ｇ／Ｌを超えた段階で培養を終了すると、培地のｐＨは４未満となる。このように、発酵工程においてアルカリ試薬を添加せずに培養を行い、ｐＨ４未満の３ＨＰ発酵液を得ることで、発酵工程以降の工程、例えば、発酵液からの３ＨＰ回収工程に用いる場合に、前述のように、原材料の削減、工程の簡略化、およびユーティリティーの向上が期待できる。なお、この場合であっても、例えば微生物の生育などを考慮して、ｐＨを適切な範囲に調整してもよい。 The pH in the culture of microorganisms is not particularly limited as long as 3HP can be efficiently produced by fermentation. When culturing using acid-resistant microorganisms (3HP acid type fermentation), since fermentation products continue to be produced even at low pH, culture is performed without adding an alkaline reagent and adjusting the pH to near neutrality. It is possible. As an example, when Shizosaccharomyces pombe is used as a host, the culture starts from the pH of the medium to be used (near neutral) at the start of the culture, but the pH of the medium gradually decreases as 3HP is produced. Although the growth of the host is suppressed when the pH of the medium is lowered to around pH 2.5, even if the pH of the medium is lowered to pH 2.5 or less, for example, around pH 1, the carbon source in the medium is assimilated and 3HP production Will continue. When the culture is terminated when the concentration of 3HP in the medium exceeds 100 g / L, the pH of the medium becomes less than 4. Thus, in the fermentation process, the culture is performed without adding an alkaline reagent to obtain a 3HP fermentation broth having a pH of less than 4, so that the above-described process can be used for a process subsequent to the fermentation process, for example, a 3HP recovery process from the fermentation broth. Thus, reduction of raw materials, simplification of processes, and improvement of utilities can be expected. Even in this case, the pH may be adjusted to an appropriate range in consideration of, for example, the growth of microorganisms.
一方、３ＨＰ塩型発酵を行う場合、使用する宿主の生育を妨害せず、３ＨＰが効率的に発酵生産可能なｐＨを発酵期間中は維持することが望ましく、ｐＨの維持には培養液から酸を分離するときの障害とならない試薬を用いて調整することが好ましい。例として、大腸菌を宿主として利用する場合、培養期間中ｐＨは、５．０以上、好ましくは５．５以上で、１０．０以下、好ましくは９．７以下に保持することが望ましい。ｐＨ調整には無機もしくは有機の、酸性またはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。炭酸ナトリウム、アンモニア、ナトリウムイオン供給源を添加してもよい。また、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化アンモニウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等の一般的なアルカリ試薬を用いてもよい。 On the other hand, when performing 3HP salt-type fermentation, it is desirable to maintain a pH at which 3HP can efficiently produce fermentation without interfering with the growth of the host to be used. It is preferable to adjust using a reagent that does not become an obstacle when separating the. For example, when Escherichia coli is used as a host, it is desirable to maintain the pH at 5.0 or higher, preferably 5.5 or higher and 10.0 or lower, preferably 9.7 or lower during the culture period. For adjusting the pH, inorganic or organic, acidic or alkaline substances, ammonia gas and the like can be used. Sodium carbonate, ammonia, or sodium ion source may be added. Moreover, you may use common alkali reagents, such as sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, ammonium hydroxide aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, potassium acetate aqueous solution.
窒素源は使用する微生物（宿主）の生育に適した窒素源を選定すればよく特に限定されない。例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等の利用が挙げられる。また、無機物も同様に微生物の生育に適した窒素源を選定すればよく特に限定されない。例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。 The nitrogen source is not particularly limited as long as a nitrogen source suitable for the growth of the microorganism (host) to be used is selected. For example, in addition to ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, use of peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor and the like can be mentioned. Similarly, the inorganic material is not particularly limited as long as a nitrogen source suitable for the growth of microorganisms is selected. For example, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like can be mentioned.
培養中は、カナマイシン、アンピシリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、アラビノース、ラクトース等を培地に添加することができる。 During the culture, antibiotics such as kanamycin, ampicillin, streptomycin, tetracycline, chloramphenicol, erythromycin may be added to the medium. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter, an inducer can be added to the medium. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), indole acetic acid (IAA), arabinose, lactose and the like can be added to the medium.
本形態においては、微生物の培養は、好気的条件下で行われることが好ましい。本明細書において、「好気的条件」とは、分子状酸素の存在下での培養をいう。酸素供給などのために、通気、攪拌、振盪などを行ってもよい。培養に使用する装置としては、微生物の培養に通常使用される各種装置を使用できる。好気的条件下で３ＨＰを製造することで、副生する有機酸やアルコールの生成を抑制することも可能となる。加えて、好気条件下で培養を行うことで嫌気条件下と比較して微生物の生育速度が速くなり、これにより３ＨＰの生成速度も速くすることができる。 In this embodiment, it is preferable that the microorganism is cultured under aerobic conditions. In the present specification, “aerobic condition” refers to culture in the presence of molecular oxygen. Aeration, stirring, shaking, etc. may be performed for supplying oxygen. As an apparatus used for culturing, various apparatuses usually used for culturing microorganisms can be used. By producing 3HP under aerobic conditions, it is also possible to suppress the production of by-product organic acids and alcohols. In addition, by culturing under aerobic conditions, the growth rate of microorganisms becomes faster than under anaerobic conditions, and thus the production rate of 3HP can also be increased.
本形態によると、微生物として乳酸および／またはエタノールの生成能が負に制御されてなる微生物を利用するため、得られる３ＨＰ溶液（培養液）に含まれる乳酸および／またはエタノールは、従来の培養により得られる培養液と比較して低減される。したがって、得られる３ＨＰ溶液は未精製のまま、アクリル酸の製造等に供することができる。 According to this embodiment, since a microorganism in which the ability to produce lactic acid and / or ethanol is negatively controlled is used as a microorganism, lactic acid and / or ethanol contained in the obtained 3HP solution (culture solution) is obtained by conventional culture. Reduced compared to the resulting culture. Therefore, the obtained 3HP solution can be used for the production of acrylic acid and the like without purification.
具体的には、培養により得られる未精製の３ＨＰ溶液における乳酸の含有率は、３ＨＰの全質量に対して、１．２質量％以下であることが好ましく、０．６質量％以下であることがより好ましく、０．１質量％以下であることがさらに好ましい。また、培養により得られる未精製の３ＨＰ溶液におけるエタノールの含有率は、３ＨＰの全質量に対して、１質量％以下であることが好ましく、０．５質量％以下であることがより好ましく、０．１質量％以下であることがさらに好ましい。本発明においては、３ＨＰ溶液中の乳酸の含有率が１．２質量％以下である、または、エタノールの含有率が１質量％以下であることを必須とするが、より好ましくは、乳酸の含有率が１．２質量％以下であり、かつエタノールの含有率が１質量％以下である形態である。このように、３ＨＰ溶液に中の乳酸および／またはエタノールを低減することにより、アクリル酸製造工程における脱水反応に使用される反応器や流路の閉塞や、触媒のコーキング、得られるアクリル酸の純度低下や着色を効果的に防ぐことができる。 Specifically, the content of lactic acid in the unpurified 3HP solution obtained by culturing is preferably 1.2% by mass or less, and 0.6% by mass or less with respect to the total mass of 3HP. Is more preferable, and it is further more preferable that it is 0.1 mass% or less. In addition, the ethanol content in the unpurified 3HP solution obtained by culturing is preferably 1% by mass or less, more preferably 0.5% by mass or less, based on the total mass of 3HP. More preferably, it is 1% by mass or less. In the present invention, it is essential that the content of lactic acid in the 3HP solution is 1.2% by mass or less, or the content of ethanol is 1% by mass or less, more preferably, the content of lactic acid. The rate is 1.2% by mass or less, and the ethanol content is 1% by mass or less. In this way, by reducing the lactic acid and / or ethanol in the 3HP solution, the reactor and flow path used for the dehydration reaction in the acrylic acid production process, the caulking of the catalyst, and the purity of the acrylic acid obtained Reduction and coloring can be effectively prevented.
本形態で得られる３ＨＰ溶液は、上述のように培養後に未精製のままアクリル酸の製造に供することも可能であるが、必要によりさらに精製を行ってもよい。３ＨＰの精製法は当該技術分野において周知である。例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留およびカラムクロマトグラフィーに反応混合物を供することにより、３ＨＰ溶液から３−ヒドロキシプロピオン酸を分離することができる（米国特許第５，３５６，８１２号）。また、限外濾過膜や水などの低分子のみが透過できるゼオライト分離膜などで３ＨＰ溶液の濃縮を行ってもよい。濃縮を行うことにより、水を蒸発させるためのエネルギーを低減することができる。さらに、３ＨＰ溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にかけることにより、３−ヒドロキシプロピオン酸を直接同定することもできる。 The 3HP solution obtained in this form can be used for the production of acrylic acid without being purified after culturing as described above, but may be further purified if necessary. Methods for purifying 3HP are well known in the art. For example, 3-hydroxypropionic acid can be separated from 3HP solution by subjecting the reaction mixture to extraction with organic solvent, distillation and column chromatography (US Pat. No. 5,356,812). Alternatively, the 3HP solution may be concentrated using an ultrafiltration membrane or a zeolite separation membrane that allows only low molecules such as water to pass through. By concentrating, the energy for evaporating water can be reduced. Furthermore, 3-hydroxypropionic acid can also be identified directly by subjecting the 3HP solution to high performance liquid chromatography (HPLC) analysis.
＜アクリル酸の製造方法＞
本発明は、また、上述の製造方法により得られる３−ヒドロキシプロピオン酸溶液中の３−ヒドロキシプロピオン酸を脱水処理することによる、アクリル酸の製造方法を提供する。本形態のアクリル酸の製造方法では、上述の製造方法により得られる３−ヒドロキシプロピオン酸を含む原料組成物を、触媒の存在下あるいは非存在下、加熱して脱水反応を起こし、アクリル酸を得る。脱水反応工程は特に限定されず、液相または気相での反応が可能である。また反応形式は回分式、半回分式、連続式のいずれも好適に使用できる。反応器としては、固定床反応器、流動床反応器、撹拌槽型反応器、膜反応器、押出流れ反応器、トリクルベッド反応器、反応蒸留塔等が例示できる。
<Method for producing acrylic acid>
The present invention also provides a method for producing acrylic acid by dehydrating 3-hydroxypropionic acid in a 3-hydroxypropionic acid solution obtained by the above-described production method. In the method for producing acrylic acid of this embodiment, the raw material composition containing 3-hydroxypropionic acid obtained by the above-described production method is heated in the presence or absence of a catalyst to cause a dehydration reaction to obtain acrylic acid. . The dehydration reaction step is not particularly limited, and a liquid phase or gas phase reaction is possible. Moreover, any of a batch type, a semibatch type, and a continuous type can be used suitably for the reaction format. Examples of the reactor include a fixed bed reactor, a fluidized bed reactor, a stirred tank reactor, a membrane reactor, an extrusion flow reactor, a trickle bed reactor, and a reactive distillation column.
脱水反応に供する３ＨＰを含む原料組成物は、３ＨＰを含んでいればよく、これ以外にも３ＨＰのエステルダイマーやエーテルダイマー等のオリゴマー成分を含んでいてもよい。さらに、微生物による培養により副生する、発酵副生成物が含まれていてもよい。 The raw material composition containing 3HP to be subjected to the dehydration reaction may contain 3HP, and may further contain oligomer components such as 3HP ester dimer and ether dimer. Furthermore, the fermentation by-product which byproduces by culture | cultivation by microorganisms may be contained.
また、３ＨＰを含む原料組成物は、溶媒を含んでもよい。溶媒としては、３−ヒドロキシプロピオン酸を溶解可能なものであれば特に制限されない。例えば、水；メタノール、エタノール、ドデカノールなどのアルコール系溶媒；トルエンなどの炭化水素系溶媒；ジエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル系溶媒；アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒；酢酸エチルなどのエステル系溶媒；トリカプリルアミン、トリデシルアミンなどのアミン系溶媒；ジメチルホルムアミド、Ｎ―メチルピロリドンなどのアミド系溶媒；などが挙げられる。これらの溶媒のうち、好ましくは水が使用される。これらの溶媒は、１種のみが単独で使用されてもよいし、２種以上が組み合わされて使用されてもよい。 Moreover, the raw material composition containing 3HP may contain a solvent. The solvent is not particularly limited as long as it can dissolve 3-hydroxypropionic acid. For example, water; alcohol solvents such as methanol, ethanol, dodecanol; hydrocarbon solvents such as toluene; ether solvents such as diethyl ether and ethylene glycol dimethyl ether; ketone solvents such as acetone and methyl isobutyl ketone; Ester solvents; amine solvents such as tricaprylamine and tridecylamine; amide solvents such as dimethylformamide and N-methylpyrrolidone; and the like. Of these solvents, water is preferably used. Only one of these solvents may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
３ＨＰを含む原料組成物における３ＨＰの濃度は、当該組成物の全質量（溶媒を含む）に対し、５〜９５質量％であることが好ましく、１０〜９０質量％であることがより好ましく、２０〜９０質量％であることがさらに好ましい。３ＨＰの濃度を９５質量％以下とすることにより、粘度の低下により原料組成物の取り扱いが容易になる。一方、３ＨＰの濃度が５質量％以上とすることで、アクリル酸の生産効率を上げることができ、用役費の低減にも寄与できる。 The concentration of 3HP in the raw material composition containing 3HP is preferably 5 to 95% by mass, more preferably 10 to 90% by mass with respect to the total mass (including the solvent) of the composition, 20 More preferably, it is -90 mass%. By setting the concentration of 3HP to 95% by mass or less, handling of the raw material composition becomes easy due to a decrease in viscosity. On the other hand, when the concentration of 3HP is 5% by mass or more, the production efficiency of acrylic acid can be increased, which can contribute to a reduction in utility costs.
３ＨＰの脱水反応は、触媒の存在下で実施してもよいし、触媒の非存在下で実施することも可能であるが、触媒の存在下で実施した方が、反応速度の向上や選択率の上昇が期待できるため、好ましい。脱水反応に用いられる触媒としては、３ＨＰを脱水してアクリル酸とする反応を触媒する作用を有するものであれば特に限定されず、公知の触媒を適宜採用することができる。触媒としては、（１）塩類；具体的には、リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、および３−ヒドロキシプロピオン酸カルシウム等；（２）酸触媒；具体的には、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸類、ケイタングステン酸、リンタングステン酸等のヘテロポリ酸類、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ヒドロキシプロピオン酸等のカルボン酸類、塩酸、硫酸、リン酸またはヘテロポリ酸等の酸性化合物をシリカ等の担体に接触して得た触媒、リン酸水素ナトリウムやリン酸水素カリウム等のリン酸塩を担体に担持した触媒、酸性イオン交換樹脂、シリカ、アルミナ、シリカ／アルミナ、チタニア、ジルコニア、ゼオライト、およびその他のルイス酸またはブレンステッド酸等の固体酸触媒などの酸触媒；（３）塩基触媒；具体的には、酸化カルシウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の酸化物、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、トリカプリルアミン、トリデシルアミン、およびトリドデシルアミン等のアミン類、塩基性イオン交換樹脂等が挙げられる。これらの触媒のうち、アルミナ、シリカ、シリカ／アルミナ、チタニア、ジルコニア、ゼオライト、リン酸やリン酸塩を担体に担持した触媒が好適に用いられる。 The dehydration reaction of 3HP may be carried out in the presence of a catalyst or in the absence of a catalyst, but the reaction rate is improved or selectivity is improved in the presence of a catalyst. Can be expected, so it is preferable. The catalyst used in the dehydration reaction is not particularly limited as long as it has an action of catalyzing the reaction of dehydrating 3HP to form acrylic acid, and a known catalyst can be appropriately employed. Examples of the catalyst include (1) salts; specifically, calcium phosphate, calcium lactate, calcium 3-hydroxypropionate, etc .; (2) acid catalyst; specifically, minerals such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid Contact acid, heteropolyacids such as silicotungstic acid and phosphotungstic acid, carboxylic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid and hydroxypropionic acid, acidic compounds such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid or heteropolyacid with a carrier such as silica. Catalysts obtained by supporting a phosphate such as sodium hydrogen phosphate or potassium hydrogen phosphate on a support, acidic ion exchange resins, silica, alumina, silica / alumina, titania, zirconia, zeolite, and other Lewis acids Or an acid catalyst such as a solid acid catalyst such as Bronsted acid; (3) a base catalyst; specifically, calcium oxide Alkali metal or alkaline earth metal oxides such as sodium hydroxide, alkaline earth metal hydroxides such as calcium hydroxide, amines such as tricaprylamine, tridecylamine, and tridodecylamine And basic ion exchange resins. Among these catalysts, a catalyst in which alumina, silica, silica / alumina, titania, zirconia, zeolite, phosphoric acid or phosphate is supported on a carrier is preferably used.
脱水反応の反応温度は特に制限はないが、通常１５０℃〜５００℃であり、好ましくは２００℃〜４５０℃である。反応温度がこのような範囲であると、反応速度が速く、副反応も生じにくいため、アクリル酸の収率を高めることができる。また、脱水反応の反応圧力も特に限定されず、反応形式や反応条件を勘案して当業者が適宜決定することができる。例えば、反応圧力は１０ｋＰａ〜１０００ｋＰａの範囲が好適であり、５０ｋＰａ〜３００ｋＰａの範囲がより好ましい。 The reaction temperature of the dehydration reaction is not particularly limited, but is usually 150 ° C to 500 ° C, preferably 200 ° C to 450 ° C. When the reaction temperature is in such a range, the reaction rate is fast and side reactions are unlikely to occur, so that the yield of acrylic acid can be increased. Further, the reaction pressure of the dehydration reaction is not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the reaction type and reaction conditions. For example, the reaction pressure is preferably in the range of 10 kPa to 1000 kPa, and more preferably in the range of 50 kPa to 300 kPa.
以下、本形態における脱水処理の具体的な方法について、例を挙げて説明する。本形態の脱水処理の一例としては、３ＨＰを含む原料組成物を加熱し、脱水反応を気相で行うことによりアクリル酸を得る方法が挙げられる。より具体的には、３ＨＰを含む原料組成物を蒸発させ、気化した原料組成物を触媒を充填した反応器へ導入して脱水反応を行うことで、アクリル酸を得る。 Hereinafter, a specific method of the dehydration process in the present embodiment will be described with an example. As an example of the dehydration treatment of this embodiment, there is a method of obtaining acrylic acid by heating a raw material composition containing 3HP and performing a dehydration reaction in a gas phase. More specifically, acrylic acid is obtained by evaporating a raw material composition containing 3HP, introducing the vaporized raw material composition into a reactor filled with a catalyst, and performing a dehydration reaction.
３ＨＰを含む原料組成物を蒸発させる際には、３ＨＰは沸点が高いため、また二量化等の副反応が進行しやすいため、効率よく蒸発させることが好ましい。蒸発に用いる蒸発器は、液体状態で供給される原料組成物に効率的に熱を伝えることができる構造を有するものであることが好ましい。このような蒸発器としては、例えば、水平管型や垂直管型の自然循環式蒸発器、強制循環式蒸発器等が挙げられる。また、蒸発器内の原料組成物の流路に、ラシヒリング、ベルルサドル、ディクソンパッキン等の単位充填容積当たりの表面積が大きな充填物を充填し、そこに原料組成物を供給することで、液体の表面積を大きくして蒸発させる方法も挙げられる。また、上昇液膜型、流下液膜型、撹拌液膜型等の薄膜式熱交換器を用いて液体の表面積を大きくして短時間で蒸発させる方法も挙げられる。さらに、スプレーやアトマイザー等を用いて当該組成物を細かい液滴にして分散させて蒸発させる方法も挙げられる。これ以外にも、加熱した原料組成物を蒸発室に供給し、気化させるフラッシュ蒸発器を使用する方法が挙げられる。フラッシュ蒸発器を用いた蒸発は、原料組成物を常圧または加圧下で加熱し、この加熱された液体状の原料組成物を減圧または常圧下の蒸発室に供給して、原料組成物を気化させることにより行われる。また、原料組成物を流動床式の蒸発器に供給して気化させてもよい。流動床式の蒸発器を用いた蒸発は、例えば、粒状の不活性固体を不活性ガスで流動化させ、加熱された流動床式蒸発器に原料組成物を供給し、気化させることによって行われる。さらに、上記の蒸発方法を適宜併用してもよい。例えば、スプレーで原料組成物を噴霧し、充填物を充填した蒸発器で原料組成物を気化させることもできる。 When evaporating a raw material composition containing 3HP, 3HP has a high boiling point, and side reactions such as dimerization are likely to proceed. Therefore, it is preferable to evaporate efficiently. The evaporator used for evaporation preferably has a structure capable of efficiently transferring heat to the raw material composition supplied in a liquid state. Examples of such an evaporator include a horizontal tube type or a vertical tube type natural circulation evaporator, a forced circulation evaporator, and the like. In addition, the flow of the raw material composition in the evaporator is filled with a packing having a large surface area per unit filling volume such as Raschig ring, Berle saddle, Dixon packing, etc. A method of evaporating by enlarging is also mentioned. Further, there is a method of evaporating in a short time by increasing the surface area of the liquid using a thin film heat exchanger such as a rising liquid film type, a falling liquid film type, and a stirring liquid film type. Further, there may be mentioned a method in which the composition is dispersed in fine droplets using a spray, an atomizer or the like and evaporated. In addition to this, there may be mentioned a method using a flash evaporator in which a heated raw material composition is supplied to the evaporation chamber and vaporized. In evaporation using a flash evaporator, the raw material composition is heated at normal pressure or under pressure, and the heated liquid raw material composition is supplied to an evaporation chamber under reduced pressure or normal pressure to vaporize the raw material composition. Is done. Alternatively, the raw material composition may be supplied to a fluidized bed evaporator and vaporized. Evaporation using a fluidized bed evaporator is performed, for example, by fluidizing a granular inert solid with an inert gas, supplying the raw material composition to a heated fluidized bed evaporator, and vaporizing it. . Furthermore, the above evaporation methods may be used in combination as appropriate. For example, the raw material composition can be sprayed with a spray, and the raw material composition can be vaporized with an evaporator filled with the filler.
蒸発を行う際の蒸発器の温度（蒸発器の設定温度）は１５０℃〜５００℃が好ましく、２００℃〜４５０℃がより好ましい。蒸発器の温度を１５０℃以上とすることにより、原料組成物が速やかに気化させることができる。また、蒸発器の温度を５００℃以下とすることにより、３ＨＰの副反応や加熱に必要なエネルギーの増大を抑えたり、当該組成物がコーキングを起こし炭素質の析出物が反応器内に付着して閉塞を起こすのを防ぐことができる。 The evaporator temperature (evaporator set temperature) during evaporation is preferably 150 ° C. to 500 ° C., more preferably 200 ° C. to 450 ° C. By setting the temperature of the evaporator to 150 ° C. or higher, the raw material composition can be quickly vaporized. In addition, by setting the temperature of the evaporator to 500 ° C. or less, an increase in energy required for side reaction and heating of 3HP is suppressed, or the composition causes coking and carbonaceous deposits adhere to the reactor. Can prevent blockage.
原料組成物を蒸発させる際の好ましい形態は、加熱する際にガスを導入しながら蒸発させる形態である。原料組成物と共に、水や不活性気体等のガスを導入すると、３ＨＰの蒸発が促進され、安定な反応を継続できるため好ましい。この際に使用されるガスとしては、窒素、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素、水蒸気またはそれらの混合物等を用いることができ、窒素または水蒸気が好適に使用される。なお、上記水蒸気には、原料組成物中に溶媒として含まれる水が気化した水蒸気も含まれうる。また、導入されるガスの量は、原料組成物中の３ＨＰの全モル数に対して、０．５〜１００倍のモル数のガスを使用することが好ましく、１〜５０倍のモル数のガスを使用することがより好ましい。 A preferred form for evaporating the raw material composition is a form for evaporating while introducing a gas during heating. It is preferable to introduce a gas such as water or an inert gas together with the raw material composition because evaporation of 3HP is promoted and a stable reaction can be continued. As the gas used at this time, nitrogen, helium, argon, carbon dioxide, water vapor or a mixture thereof can be used, and nitrogen or water vapor is preferably used. The water vapor may include water vapor obtained by vaporizing water contained as a solvent in the raw material composition. Further, the amount of gas introduced is preferably 0.5 to 100 times the number of moles of gas relative to the total number of moles of 3HP in the raw material composition, and 1 to 50 times the number of moles. More preferably, a gas is used.
脱水反応が気相で行われる場合、原料組成物が蒸発した後に脱水反応が行われるが、原料組成物の蒸発後、脱水反応が行われる前に、上記を所定の温度に加熱または冷却する温度調整工程を経てもよい。また、蒸発器で気化させた原料組成物の蒸気を導管を通して連結した脱水反応器へと供給してもよい。あるいは、蒸発器と反応器を一体化されてなる装置を用いて蒸発および脱水反応を連続して行ってもよい。例えば、反応管に触媒を充填し、その上に表面積の大きい充填物を充填することにより、蒸発を充填物層で行った後、脱水反応を触媒層で行うことができ、蒸発および脱水反応を連続して行う形態も好ましい。さらに、１または複数の充填物層と、触媒を充填した多管式の反応器とを連結して、蒸発および脱水反応を連続して行うこともまた好ましい。 When the dehydration reaction is performed in the gas phase, the dehydration reaction is performed after the raw material composition has evaporated, but the temperature at which the above is heated or cooled to a predetermined temperature after the raw material composition is evaporated and before the dehydration reaction is performed. You may pass through an adjustment process. Moreover, you may supply the vapor | steam of the raw material composition vaporized with the evaporator to the dehydration reactor connected through the conduit | pipe. Or you may perform evaporation and a dehydration reaction continuously using the apparatus formed by integrating an evaporator and a reactor. For example, by filling a reaction tube with a catalyst and filling a packing with a large surface area on the reaction tube, evaporation can be performed in the packing layer, and then dehydration can be performed in the catalyst layer. A continuous form is also preferable. Further, it is also preferable to continuously perform the evaporation and dehydration reaction by connecting one or a plurality of packed beds and a multi-tubular reactor filled with a catalyst.
３ＨＰの脱水工程で使用する反応器は、反応器内に固体触媒を保持し、加熱することができるものであれば特に制限はなく、固定床式流通反応器や流動床式流通反応器等を当業者が適宜選択することができる。固定床式反応器は、反応器内に触媒を充填して加熱しておき、そこに原料組成物の蒸気を供給して反応を行うものである。原料組成物の蒸気は、上昇流、下降流、水平流いずれであってもよい。固定床式流通反応器のうち、特に熱交換の容易さから、多管式固定床反応器が好適に使用されうる。流動床式反応器は、反応器の中に粒状の触媒を入れ、原料組成物の蒸気や、別途供給する不活性ガス等で触媒を流動させながら反応を行うものである。触媒が流動しているため、重質分による閉塞が起こりにくいという利点を有する。また、触媒の一部を連続的に抜き出して、新しい触媒や再生した触媒を連続的に供給することもできる。 The reactor used in the 3HP dehydration step is not particularly limited as long as it can hold and heat a solid catalyst in the reactor. A fixed bed flow reactor, a fluidized bed flow reactor, or the like can be used. Those skilled in the art can select as appropriate. The fixed bed reactor is a reactor in which a catalyst is charged and heated, and a reaction is performed by supplying steam of a raw material composition thereto. The vapor of the raw material composition may be any of an upward flow, a downward flow, and a horizontal flow. Among the fixed bed flow reactors, a multi-tube fixed bed reactor can be suitably used, particularly because of easy heat exchange. The fluidized bed type reactor is one in which a granular catalyst is placed in a reactor, and the reaction is carried out while fluidizing the catalyst with a vapor of a raw material composition or an inert gas supplied separately. Since the catalyst is flowing, there is an advantage that clogging due to heavy components hardly occurs. It is also possible to continuously extract a part of the catalyst and continuously supply a new catalyst or a regenerated catalyst.
脱水反応により得られる反応生成物は、液体として回収されうる。反応生成物を回収する方法は、特に制限されないが、例えば、反応生成ガスを熱交換器に導入し、反応生成ガスの露点以下の温度で凝縮する方法や、反応生成ガスを溶剤等に接触させて捕集する方法等により、アクリル酸を含む組成物として回収される。得られる当該組成物中のアクリル酸濃度は、その回収方法によっても異なるが、通常、組成物の全質量に対して５質量％〜９０質量％である。 The reaction product obtained by the dehydration reaction can be recovered as a liquid. The method for recovering the reaction product is not particularly limited. For example, the reaction product gas is introduced into a heat exchanger and condensed at a temperature below the dew point of the reaction product gas, or the reaction product gas is contacted with a solvent or the like. And collected as a composition containing acrylic acid. The acrylic acid concentration in the obtained composition varies depending on the recovery method, but is usually 5% by mass to 90% by mass with respect to the total mass of the composition.
また、本形態の脱水処理の他の一例としては、脱水反応を液相で行う方法が挙げられる。具体的には、反応器内の加熱された溶媒および／または触媒からなる液相に、液体状態の原料組成物を導入して、当該原料組成物を加熱することにより脱水反応を行う。液相での脱水反応を行う際の原料組成物には、溶媒が含まれていてもよい。このような溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、ドデカノールなどのアルコール系溶媒；トルエンなどの炭化水素系溶媒；エチレングリコールジメチルエーテル、トリエチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル系溶媒；アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒；酢酸エチルなどのエステル系溶媒；トリカプリルアミン、トリデシルアミンなどのアミン系溶媒；ジメチルホルムアミド、Ｎ―メチルピロリドンなどのアミド系溶媒；などが挙げられる。これらの溶媒のうち、好ましくは、水、エーテル系溶媒、ケトン系溶媒が使用される。これらの溶媒は、１種のみが単独で使用されてもよいし、２種以上が組み合わされて使用されてもよい。 Another example of the dehydration treatment of this embodiment is a method of performing a dehydration reaction in a liquid phase. Specifically, a dehydration reaction is performed by introducing a raw material composition in a liquid state into a liquid phase composed of a heated solvent and / or catalyst in the reactor and heating the raw material composition. A solvent may be contained in the raw material composition when performing the dehydration reaction in the liquid phase. Examples of such solvents include water; alcohol solvents such as methanol, ethanol, and dodecanol; hydrocarbon solvents such as toluene; ether solvents such as ethylene glycol dimethyl ether and triethylene glycol dimethyl ether; acetone, methyl isobutyl ketone, and the like. Ketone solvents; ester solvents such as ethyl acetate; amine solvents such as tricaprylamine and tridecylamine; amide solvents such as dimethylformamide and N-methylpyrrolidone; Of these solvents, water, ether solvents, and ketone solvents are preferably used. Only one of these solvents may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
脱水反応において使用される触媒は、液相反応が可能な触媒であれば特に制限はなく、液体状の触媒または固体状の触媒のいずれも使用可能である。また、反応時に、溶媒に触媒が溶解されていてもよいし、溶媒中に触媒が分散している状態であっても構わない。この際に使用される溶媒としては、上述の原料組成物に含まれてもよい溶媒が例示される。 The catalyst used in the dehydration reaction is not particularly limited as long as it is a catalyst capable of liquid phase reaction, and either a liquid catalyst or a solid catalyst can be used. In the reaction, the catalyst may be dissolved in the solvent, or the catalyst may be dispersed in the solvent. Examples of the solvent used at this time include solvents that may be contained in the above-described raw material composition.
脱水反応は、液相において原料組成物を触媒と接触させることで行われる。液相での反応の場合、原料組成物中の３ＨＰの濃度が低下するので、３ＨＰのオリゴマー化等の副反応を抑制することができ、アクリル酸収率を向上させることが可能である。また、液相の場合、液相から供給される熱により、反応で生成したアクリル酸や水が速やかに気化し、液相より除去される。これにより反応の平衡が移動するため、３ＨＰからアクリル酸への変換率を高めることもできる。 The dehydration reaction is performed by bringing the raw material composition into contact with a catalyst in the liquid phase. In the case of the reaction in the liquid phase, the concentration of 3HP in the raw material composition decreases, so that side reactions such as oligomerization of 3HP can be suppressed, and the acrylic acid yield can be improved. In the case of the liquid phase, acrylic acid and water generated by the reaction are quickly vaporized and removed from the liquid phase by heat supplied from the liquid phase. This shifts the equilibrium of the reaction, so that the conversion rate from 3HP to acrylic acid can be increased.
液相反応において、原料組成物を反応器へ導入する速度は、使用する触媒や反応温度により異なるが、反応液中のアクリル酸濃度が、反応液の全質量に対して、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．５質量％以下となる状態を維持できるように調整することが好ましい。反応液中のアクリル酸濃度が１質量％以下であると、平衡反応である脱水反応の反応速度が高く維持され、３ＨＰからアクリル酸への変換を効率よく進めることができる。また、このように反応液中のアクリル酸濃度を低く保つことにより、生成したアクリル酸が副反応により消費されて、アクリル酸の収率が低下するのを防ぐこともできる。 In the liquid phase reaction, the rate at which the raw material composition is introduced into the reactor varies depending on the catalyst used and the reaction temperature, but the acrylic acid concentration in the reaction solution is preferably 1% by mass relative to the total mass of the reaction solution. Hereinafter, it is preferable to adjust so that the state which becomes 0.5 mass% or less more preferably can be maintained. When the acrylic acid concentration in the reaction solution is 1% by mass or less, the reaction rate of the dehydration reaction, which is an equilibrium reaction, is maintained high, and the conversion from 3HP to acrylic acid can proceed efficiently. In addition, by keeping the acrylic acid concentration in the reaction solution low in this way, it is possible to prevent the generated acrylic acid from being consumed by side reactions and reducing the yield of acrylic acid.
液相反応における好ましい形態の一つは、脱水反応後の反応生成物を気化させる際に、ガスを導入する形態である。ガスとしては、特に限定されないが、窒素、二酸化炭素（炭酸ガス）や空気等の非凝縮性のガス、水蒸気、過熱水蒸気等の凝縮性のガスを適宜用いることができる。これらのガスのうち、窒素、水蒸気、または過熱水蒸気を用いることが好ましい。これらのガスは、１種のみが単独で使用されてもよいし、２種以上が組み合わされて使用されてもよい。 One of the preferred forms in the liquid phase reaction is a form in which gas is introduced when the reaction product after the dehydration reaction is vaporized. Although it does not specifically limit as gas, Non-condensable gas, such as nitrogen, a carbon dioxide (carbon dioxide gas), and air, Condensable gas, such as water vapor | steam and superheated water vapor | steam, can be used suitably. Of these gases, nitrogen, water vapor, or superheated water vapor is preferably used. Only one kind of these gases may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
導入されるガスの温度は、非凝縮性のガスの場合、通常２０℃〜３５０℃であり、反応温度の維持および生成ガスの凝縮の観点から、好ましくは５０℃〜３３０℃、より好ましくは１００℃〜３００℃である。一方、凝縮性のガスの場合、導入されるガスの温度は、通常反応圧力における沸点〜３５０℃の範囲であり、反応温度の維持および生成ガスの凝縮の観点から、好ましくは反応圧力における沸点＋２０℃〜３３０℃の範囲である。 In the case of a non-condensable gas, the temperature of the introduced gas is usually 20 ° C. to 350 ° C., and preferably 50 ° C. to 330 ° C., more preferably 100 ° C. from the viewpoint of maintaining the reaction temperature and condensing the product gas. ° C to 300 ° C. On the other hand, in the case of a condensable gas, the temperature of the introduced gas is usually in the range of the boiling point to 350 ° C. at the reaction pressure. From the viewpoint of maintaining the reaction temperature and condensing the product gas, the boiling point at the reaction pressure is preferably +20. It is the range of ° C to 330 ° C.
導入されるガスの量は、原料組成物の全質量に対して、０．１〜１００質量倍の範囲であればよく、好ましくは、０．５〜５０質量倍の範囲である。導入されるガスの量が０．１質量倍以上であると、反応生成物からのアクリル酸の気化による除去効率を高め、反応収率を向上させることができる。一方、導入されるガスの量が１００質量倍以下であると、反応器から流出するガスを冷却するのに用いるエネルギーを抑えることができる。 The amount of the introduced gas may be in the range of 0.1 to 100 times by mass with respect to the total mass of the raw material composition, and is preferably in the range of 0.5 to 50 times by mass. When the amount of the introduced gas is 0.1 mass times or more, the removal efficiency by vaporization of acrylic acid from the reaction product can be increased, and the reaction yield can be improved. On the other hand, when the amount of the introduced gas is 100 mass times or less, the energy used for cooling the gas flowing out from the reactor can be suppressed.
本形態における脱水反応に用いられる反応器または反応装置は、反応生成物である水やアクリル酸を速やかに気化して除去することができるように、反応系に効率的に熱を与えることができるものであることが好ましい。例えば、反応器の壁面からの加熱に加えて、外部熱交換器に反応液を循環させてもよい。この際に使用できる熱交換器としては、例えば、液膜式の熱交換器が挙げられ、より具体的には、上昇液膜型、流下液膜型、撹拌液膜型等の公知の熱交換器が挙げられる。また、熱交換器そのものを反応器と使用してもよい。さらにまた、反応系内にガスを供給する場合には、加熱したガスにより熱を供給してもよい。 The reactor or reaction apparatus used for the dehydration reaction in this embodiment can efficiently heat the reaction system so that water and acrylic acid as reaction products can be quickly vaporized and removed. It is preferable. For example, in addition to heating from the wall surface of the reactor, the reaction solution may be circulated through the external heat exchanger. Examples of the heat exchanger that can be used in this case include a liquid film type heat exchanger, and more specifically, known heat exchanges such as a rising liquid film type, a falling liquid film type, and a stirring liquid film type. Vessel. Further, the heat exchanger itself may be used as a reactor. Furthermore, when supplying gas into the reaction system, heat may be supplied by a heated gas.
脱水反応により得られる反応生成物は、冷却して液体として回収されうる。反応生成物を回収する方法は、特に制限されないが、例えば、反応生成ガスを熱交換器に導入し反応生成ガスの露点以下の温度で凝縮して得る方法や、または反応生成ガスを溶剤等の捕集剤に接触させて吸収する方法等により冷却して、アクリル酸を含む組成物を得ることができる。当該組成物中のアクリル酸濃度は５質量％〜９０質量％である。 The reaction product obtained by the dehydration reaction can be cooled and recovered as a liquid. The method for recovering the reaction product is not particularly limited. For example, the reaction product gas may be introduced into a heat exchanger and condensed at a temperature below the dew point of the reaction product gas, or the reaction product gas may be a solvent or the like. The composition containing acrylic acid can be obtained by cooling with a method of absorbing it by contacting with a collecting agent. The acrylic acid concentration in the composition is 5% by mass to 90% by mass.
また、本発明の方法で得られるアクリル酸を含む組成物は精製してもよく、精製を行う場合は、好ましくは、晶析工程を用いる。 Moreover, the composition containing acrylic acid obtained by the method of the present invention may be purified. When purification is performed, a crystallization step is preferably used.
晶析工程は、アクリル酸を含む組成物を晶析装置に供給して結晶化させることにより、精製アクリル酸を得る工程である。なお、結晶化の方法としては、従来公知の結晶化方法を採用すればよく、特に限定されるものではないが、結晶化は、例えば、連続式または回分式の晶析装置を用いて、１段または２段以上で実施することができる。得られたアクリル酸の結晶は、必要に応じて、さらに洗浄や発汗などの精製を行うことにより、さらに純度の高い精製アクリル酸を得ることができる。 The crystallization step is a step of obtaining purified acrylic acid by supplying a composition containing acrylic acid to a crystallization apparatus to cause crystallization. The crystallization method may be a conventionally known crystallization method and is not particularly limited. For example, the crystallization may be performed using a continuous or batch crystallization apparatus. It can be carried out in stages or in two or more stages. The obtained acrylic acid crystals can be further purified by washing, sweating, or the like, if necessary, to obtain purified acrylic acid with higher purity.
連続式の晶析装置としては、例えば、結晶化部、固液分離部および結晶精製部が一体になった晶析装置（例えば、新日鐵化学社製のＢＭＣ（Ｂａｃｋｍｉｘｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｒ）装置、月島機械社製の連続溶融精製システム）や、結晶化部（例えば、ＧＭＦ ＧＯＵＤＡ社製のＣＤＣ（Ｃｏｏｌｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｒ）装置）、固液分離部（例えば、遠心分離器、ベルトフィルター）および結晶精製部（例えば、呉羽テクノエンジ社製のＫＣＰ（Ｋｕｒｅｈａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ）精製装置）を組み合わせた晶析装置などを使用することができる。 Examples of the continuous crystallizer include a crystallizer in which a crystallization part, a solid-liquid separation part, and a crystal purification part are integrated (for example, a BMC (Backmixing Column Crystallizer) apparatus manufactured by Nippon Steel Chemical Co., Ltd., Tsukishima Continuous melt purification system manufactured by Kikai Co., Ltd.), crystallization unit (for example, CDC (Cooling Disk Crystallizer) device manufactured by GMF GOUDA), solid-liquid separation unit (for example, centrifuge, belt filter) and crystal purification unit ( For example, a crystallizer combined with KCP (Kureha Crystal Purifier) manufactured by Kureha Techno Engineering Co., Ltd. can be used.
回分式の晶析装置としては、例えば、Ｓｕｌｚｅｒ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ社製の層結晶化装置（動的結晶化装置）、ＢＥＦＳ ＰＲＯＫＥＭ社製の静的結晶化装置などを使用することができる。 As a batch-type crystallizer, for example, a layer crystallizer (dynamic crystallizer) manufactured by Sulzer Chemtech, a static crystallizer manufactured by BEFS PROKEM, or the like can be used.
動的結晶化とは、例えば、結晶化、発汗、融解を行うための温度制御機構を備えた管状の結晶器と、発汗後の母液を回収するタンクと、結晶器に粗アクリル酸を供給する循環ポンプとを備え、結晶器の下部に設けた貯蔵器から循環ポンプにより粗アクリル酸を結晶器の管内上部に移送できる動的結晶化装置を使用して晶析を行う方法である。また、静的結晶化とは、例えば、結晶化、発汗、融解を行うための温度制御機構を備えた管状の結晶器であり、下部に抜き出し弁を有する結晶器と、発汗後の母液を回収するタンクとを備えた静的結晶化装置を使用して晶析を行う方法である。 Dynamic crystallization is, for example, a tubular crystallizer equipped with a temperature control mechanism for performing crystallization, sweating and melting, a tank for collecting the mother liquor after sweating, and supplying crude acrylic acid to the crystallizer. This is a method in which crystallization is performed using a dynamic crystallization apparatus that includes a circulation pump and can transfer crude acrylic acid from a reservoir provided at the lower part of the crystallizer to the upper part of the crystallizer tube. Static crystallization is, for example, a tubular crystallizer equipped with a temperature control mechanism for crystallization, sweating, and melting, and a crystallizer having an extraction valve at the bottom and a mother liquor after sweating are collected. The crystallization is carried out using a static crystallization apparatus equipped with a tank to be used.
具体的には、粗アクリル酸を液相として結晶器に導入し、液相中のアクリル酸を冷却面（管壁面）に凝固・生成させる。冷却面に生成した固相の質量が、結晶器に導入した粗アクリル酸に対して、好ましくは１０〜９０質量％、より好ましくは２０〜８０質量％になったら、直ちに、液相を結晶器から排出し、固相と液相とを分離する。液相の排出は、ポンプで汲み出す方式（動的結晶化）、結晶器から流出させる方式（静的結晶化）のいずれであってもよい。他方、固相は、結晶器から取り出した後、さらに純度を向上させるために、洗浄や発汗などの精製を行ってもよい。 Specifically, crude acrylic acid is introduced into the crystallizer as a liquid phase, and acrylic acid in the liquid phase is solidified and generated on the cooling surface (tube wall surface). As soon as the mass of the solid phase generated on the cooling surface becomes 10 to 90% by mass, more preferably 20 to 80% by mass, based on the crude acrylic acid introduced into the crystallizer, the liquid phase is immediately converted into the crystallizer. The solid phase and the liquid phase are separated. The liquid phase may be discharged by either a pumping method (dynamic crystallization) or a discharging method from a crystallizer (static crystallization). On the other hand, after the solid phase is taken out from the crystallizer, purification such as washing and sweating may be performed in order to further improve the purity.
動的結晶化や静的結晶化を多段で行う場合、向流の原理を採用すれば、有利に実施することができる。このとき、各段階で結晶化されたアクリル酸は、残留母液から分離され、より高い純度を有するアクリル酸が生成する段階に供給される。他方、残留母液は、より低い純度を有するアクリル酸が生成する段階に供給される。 When dynamic crystallization or static crystallization is performed in multiple stages, it can be advantageously carried out by adopting the countercurrent principle. At this time, the acrylic acid crystallized in each stage is separated from the residual mother liquor and supplied to the stage where acrylic acid having higher purity is generated. On the other hand, the residual mother liquor is fed to the stage where acrylic acid with lower purity is produced.
なお、動的結晶化では、アクリル酸の純度が低くなると、結晶化が困難になるが、静的結晶化では、動的結晶化に比べて、残留母液が冷却面に接触する時間が長く、また、温度の影響が伝わり易いので、アクリル酸の純度が低下しても、結晶化が容易である。それゆえ、アクリル酸の回収率を向上させるために、動的結晶化における最終的な残留母液を静的結晶化に付して、さらに結晶化を行ってもよい。 In dynamic crystallization, if the purity of acrylic acid is low, crystallization becomes difficult, but in static crystallization, the time for the residual mother liquor to contact the cooling surface is longer than in dynamic crystallization, In addition, since the influence of temperature is easily transmitted, crystallization is easy even if the purity of acrylic acid is lowered. Therefore, in order to improve the recovery rate of acrylic acid, the final residual mother liquor in dynamic crystallization may be subjected to static crystallization and further crystallization may be performed.
必要となる結晶化段数は、どの程度の純度が要求されるかに依存するが、高純度のアクリル酸を得るために必要な段数は、精製段階（動的結晶化）が通常１〜６回、好ましくは２〜５回、より好ましくは２〜４回であり、ストリッピング段階（動的結晶化および／または静的結晶化）が通常０〜５回、好ましくは０〜３回である。通常、供給される粗アクリル酸より高い純度を有するアクリル酸が得られる段階は、全て精製段階であり、それ以外の段階は、全てストリッピング段階である。ストリッピング段階は、精製段階から残留母液に含まれるアクリル酸を回収するために実施される。なお、ストリッピング段階は、必ずしも設ける必要はなく、例えば、蒸留塔を用いて、晶析装置の残留母液から低沸点成分を分離する場合には、ストリッピング段階は省略してもよい。 The number of crystallization stages required depends on the degree of purity required, but the number of stages required to obtain high purity acrylic acid is usually 1 to 6 purification steps (dynamic crystallization). The stripping step (dynamic crystallization and / or static crystallization) is usually 0 to 5 times, preferably 0 to 3 times, preferably 2 to 5 times, more preferably 2 to 4 times. In general, all stages where acrylic acid having a higher purity than the crude acrylic acid supplied is obtained are purification stages, and all other stages are stripping stages. The stripping step is performed to recover acrylic acid contained in the residual mother liquor from the purification step. Note that the stripping step is not necessarily provided. For example, when the low boiling point component is separated from the residual mother liquor of the crystallizer using a distillation column, the stripping step may be omitted.
動的結晶化および静的結晶化のいずれを採用する場合であっても、晶析工程で得られるアクリル酸の結晶は、そのまま製品としてもよいし、必要に応じて、さらに洗浄や発汗などの精製を行ってから製品としてもよい。他方、晶析工程で排出される残留母液は、系外に取り出してもよい。 Whether using dynamic crystallization or static crystallization, the acrylic acid crystals obtained in the crystallization process may be used directly as products, or if necessary, such as washing and sweating. It may be a product after purification. On the other hand, the residual mother liquor discharged in the crystallization step may be taken out of the system.
上記方法で製造されるアクリル酸は、アクリル酸エステル、ポリアクリル酸等のアクリル酸誘導体の原料として使用可能であることは公知となっていることから、上記アクリル酸の製造方法を、アクリル酸誘導体の製造方法におけるアクリル酸製造工程にすることも可能である。すなわち、一実施形態においては、上記方法によって得られたアクリル酸を部分中和して部分中和アクリル酸を製造し、これを必要であれば他のモノマーと（共）重合することにより、吸水性樹脂を製造することができる。したがって、本発明は、本発明の方法により製造されるアクリル酸を部分中和して部分中和アクリル酸を製造し、前記部分中和アクリル酸を架橋性モノマーと共重合することを有する、吸水性樹脂の製造方法をも提供する。ここで、上記部分中和および（共）重合は、公知の反応によって実施することができ、例えば、本発明の製造方法により得られたアクリル酸および／またはその塩を単量体成分の主成分（好ましくは７０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上）とし、さらに０．００１〜５モル％（アクリル酸に対する値）程度の架橋剤、０．００１〜２モル％（単量体成分に対する値）程度のラジカル重合開始剤を用いて、架橋重合させた後、乾燥・粉砕することにより、吸水性樹脂が得られる。 Since it is known that acrylic acid produced by the above method can be used as a raw material for acrylic acid derivatives such as acrylic acid ester and polyacrylic acid, the above acrylic acid production method is referred to as acrylic acid derivative. It is also possible to use an acrylic acid production process in the production method. That is, in one embodiment, partially neutralized acrylic acid obtained by the above method to produce partially neutralized acrylic acid, and if necessary, (co) polymerize with other monomers to absorb water. Resin can be produced. Accordingly, the present invention provides a water absorption, comprising partially neutralizing acrylic acid produced by the method of the present invention to produce partially neutralized acrylic acid, and copolymerizing the partially neutralized acrylic acid with a crosslinkable monomer. A method for producing a conductive resin is also provided. Here, the partial neutralization and (co) polymerization can be carried out by a known reaction. For example, acrylic acid and / or a salt thereof obtained by the production method of the present invention is used as the main component of the monomer component. (Preferably 70 mol% or more, more preferably 90 mol% or more), and further a crosslinking agent of about 0.001 to 5 mol% (value with respect to acrylic acid), 0.001 to 2 mol% (based on the monomer component) A water-absorbent resin can be obtained by carrying out cross-linking polymerization using a radical polymerization initiator of value) and then drying and pulverizing.
ここで、吸水性樹脂とは、架橋構造を有する水膨潤性水不溶性のポリアクリル酸であって、自重の３倍以上、好ましくは１０〜１，０００倍の純水または生理食塩水を吸水し、また、水溶性成分（水可溶分）が好ましくは２５質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である水不溶性ヒドロゲルを生成するポリアクリル酸を意味する。このような吸水性樹脂の具体例や物性測定法は、例えば、米国特許第６，１０７，３５８号、米国特許第６，１７４，９７８号、米国特許第６，２４１，９２８号などに記載されている。 Here, the water-absorbing resin is a water-swellable, water-insoluble polyacrylic acid having a cross-linked structure, and absorbs pure water or physiological saline 3 times or more, preferably 10 to 1,000 times its own weight. In addition, it means polyacrylic acid that forms a water-insoluble hydrogel having a water-soluble component (water-soluble component) of preferably 25% by mass or less, more preferably 10% by mass or less. Specific examples of such water-absorbing resins and methods for measuring physical properties are described in, for example, US Pat. No. 6,107,358, US Pat. No. 6,174,978, US Pat. No. 6,241,928, and the like. ing.
また、生産性向上の観点から好ましい製造方法は、例えば、米国特許第６，８６７，２６９号、米国特許第６，９０６，１５９号、米国特許第７，０９１，２５３号、国際公開第０１／０３８４０２号パンフレット、国際公開第２００６／０３４８０６号パンフレットなどに記載されている。 Further, from the viewpoint of improving productivity, preferred production methods include, for example, US Pat. No. 6,867,269, US Pat. No. 6,906,159, US Pat. No. 7,091,253, International Publication No. 01/253, No. 038402 pamphlet, International Publication No. 2006/034806 pamphlet and the like.
アクリル酸を出発原料として、中和、重合、乾燥などにより、吸水性樹脂を製造する一連の工程は、例えば、以下の通りである。 A series of steps for producing a water-absorbing resin by neutralization, polymerization, drying, etc. using acrylic acid as a starting material is as follows, for example.
本発明の製造方法により得られるアクリル酸の一部は、ラインを介して、吸水性樹脂の製造プロセスに供給される。吸水性樹脂の製造プロセスにおいては、アクリル酸を中和工程，重合工程，乾燥工程に導入して、所望の処理を施すことにより、吸水性樹脂を製造する。各種物性の改善を目的として所望の処理を施してもよく、例えば、重合中または重合後に架橋工程を介在させてもよい。 A part of acrylic acid obtained by the production method of the present invention is supplied to the production process of the water-absorbent resin via a line. In the production process of the water absorbent resin, acrylic acid is introduced into the neutralization step, the polymerization step, and the drying step, and a desired treatment is performed to produce the water absorbent resin. For the purpose of improving various physical properties, a desired treatment may be performed. For example, a crosslinking step may be interposed during or after the polymerization.
中和工程は、任意の工程であり、例えば、所定量の塩基性物質の粉末または水溶液と、アクリル酸やポリアクリル酸（塩）とを混合する方法が例示されるが、従来公知の方法を採用すればよく、特に限定されるものではない。なお、中和工程は、重合前または重合後のいずれで行ってもよく、また、重合前後の両方で行ってもよい。アクリル酸やポリアクリル酸（塩）の中和に用いられる塩基性物質としては、例えば、炭酸（水素）塩、アルカリ金属の水酸化物、アンモニア、有機アミンなど、従来公知の塩基性物質を適宜用いればよい。また、ポリアクリル酸の中和率は、特に限定されるものではなく、任意の中和率（例えば、３０〜１００モル％の範囲内における任意の値）となるように調整すればよい。 The neutralization step is an optional step. For example, a method of mixing a predetermined amount of a basic substance powder or aqueous solution with acrylic acid or polyacrylic acid (salt) is exemplified. It may be employed and is not particularly limited. The neutralization step may be performed either before or after the polymerization, or may be performed both before and after the polymerization. As a basic substance used for neutralization of acrylic acid or polyacrylic acid (salt), for example, a conventionally known basic substance such as a carbonic acid (hydrogen) salt, an alkali metal hydroxide, ammonia, an organic amine or the like is appropriately used. Use it. Moreover, the neutralization rate of polyacrylic acid is not specifically limited, What is necessary is just to adjust so that it may become arbitrary neutralization rates (for example, arbitrary values in the range of 30-100 mol%).
重合工程における重合方法は、特に限定されるものではなく、ラジカル重合開始剤による重合、放射線重合、電子線や活性エネルギー線の照射による重合、光増感剤による紫外線重合など、従来公知の重合方法を用いればよい。また、重合開始剤、重合条件など各種条件については、任意に選択することができる。勿論、必要に応じて、架橋剤や他の単量体、さらには水溶性連鎖移動剤や親水性高分子など、従来公知の添加剤を添加してもよい。 The polymerization method in the polymerization step is not particularly limited, and a conventionally known polymerization method such as polymerization with a radical polymerization initiator, radiation polymerization, polymerization by irradiation with an electron beam or active energy ray, ultraviolet polymerization with a photosensitizer, etc. May be used. Various conditions such as a polymerization initiator and polymerization conditions can be arbitrarily selected. Of course, if necessary, conventionally known additives such as a crosslinking agent and other monomers, and further a water-soluble chain transfer agent and a hydrophilic polymer may be added.
重合後のアクリル酸塩系ポリマー（すなわち、吸水性樹脂）は、乾燥工程に付される。乾燥方法としては、特に限定されるものではなく、熱風乾燥機，流動層乾燥機，ナウター式乾燥機など、従来公知の乾燥手段を用いて、所望の乾燥温度、好ましくは７０〜２３０℃で、適宜乾燥させればよい。 The acrylate polymer after polymerization (namely, water-absorbing resin) is subjected to a drying step. The drying method is not particularly limited, and using a conventionally known drying means such as a hot air dryer, a fluidized bed dryer, a nauter dryer, etc., a desired drying temperature, preferably 70 to 230 ° C., What is necessary is just to dry suitably.
乾燥工程を経て得られた吸水性樹脂は、そのまま用いてもよく、さらに所望の形状に造粒・粉砕、表面架橋をしてから用いてもよく、還元剤、香料、バインダーなど、従来公知の添加剤を添加するなど、用途に応じた後処理を施してから用いてもよい。 The water-absorbent resin obtained through the drying step may be used as it is, or may be used after granulation / pulverization and surface cross-linking into a desired shape, and conventionally known reducing agents, perfumes, binders, etc. You may use it, after giving post-processing according to a use, such as adding an additive.
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。 The effects of the present invention will be described using the following examples and comparative examples. However, the technical scope of the present invention is not limited only to the following examples.
［比較例１−１］Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来マロニルＣｏＡレダクターゼ導入大腸菌の構築および３ＨＰ発酵
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ ＯＫ−７０−ｆｌ（ＡＴＣＣ２９３６５）株のマロニルＣｏＡレダクターゼ（ｍｃｒ）遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｏｉｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＹ５３００１９）を元に、下記のマロニルＣｏＡレダクターゼの構造遺伝子領域を増幅するプライマーを設計した。
[Comparative Example 1-1] Construction of Chloroflexus aurantiacus-derived malonyl-CoA reductase-introduced Escherichia coli and 3HP fermentation The nucleotide sequence of the malonyl-CoA reductase (mcr) gene of Chloroflexus aurantiacus OK-70-fl (ATCC29365) strain Originally, primers that amplify the structural gene region of malonyl-CoA reductase described below were designed.
上記プライマーを用いて、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ ＡＴＣＣ２９３６５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ ＡＴＣＣ２９３６５のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を取得した。取得したマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を、ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＴａｃプロモーター下流にクローニングし、ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１を構築した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｕｓｉｏｎ ｂｌｕｅ（Ｔａｋａｒａ社）のプロトコールに従って、構築したｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１をヒートショック法により導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１）を取得した。 Using the above primers, PCR amplification was performed using the genomic DNA of Chloroflexus aurantiacus ATCC29365 as a template to obtain the malonyl CoA reductase gene of Chloroflexus aurantiacus ATCC29365. The obtained malonyl CoA reductase gene was cloned downstream of the Tac promoter of the PinPoint Xa-1 vector (Promega) to construct mcr / PinPoint Xa-1. According to the protocol of Escherichia coli fusion blue (Takara), the constructed mcr / PinPoint Xa-1 was introduced by the heat shock method. E. coli (mcr / PinPoint Xa-1) was obtained.
Ｅ．ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１）をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃、１２０ｒｐｍで４８時間好気培養を行った。培養上清１００μＬに２．５ｍＭ ２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌ−ｎ−ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ溶液 ２００μＬ（内部標準液）を加えた。ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ａ液 ２００μＬ、試薬Ｂ液 ２００μＬを加え、よく混合した後、６０℃、２０分間処理した。ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ｃ液 ２００μＬを添加し、よく混合した。６０℃、１５分間処理後、室温まで冷えたら０．４５ｍｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとして供した。 E. E. coli (mcr / PinPoint Xa-1) was inoculated into IPTG-added (final concentration 1 mM) 2 wt / vol% glucose-added M9 medium (Difco), and aerobic culture was performed at 37 ° C. and 120 rpm for 48 hours using a Sakaguchi flask. Went. To 100 μL of the culture supernatant, 200 μL (internal standard solution) of 2.5 mM 2-hydroxy-2-methyl-n-butyric acid solution was added. 200 μL of reagent A solution and 200 μL of reagent B solution of a hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) were added and mixed well, followed by treatment at 60 ° C. for 20 minutes. 200 μL of reagent C solution of a hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) was added and mixed well. After being treated at 60 ° C. for 15 minutes and then cooled to room temperature, it was passed through a 0.45 mm filter and used as an LC analysis sample.
得られたＬＣ分析サンプルを以下の記載の条件で高速液体クロマトグラフィーでの分析に供し、３ＨＰと乳酸の定量分析を行ったところ、３ＨＰ＝０．１５ｇ／Ｌ、乳酸＝０．３４ｇ／Ｌの生成が確認された。なお、エタノールの生成は確認されなかった。 The obtained LC analysis sample was subjected to analysis by high performance liquid chromatography under the conditions described below, and quantitative analysis of 3HP and lactic acid was performed. As a result, 3HP = 0.15 g / L and lactic acid = 0.34 g / L. Generation was confirmed. In addition, the production | generation of ethanol was not confirmed.
［実施例１−１］乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊大腸菌の構築、ｍｃｒ遺伝子導入乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊大腸菌の構築および３ＨＰ発酵
ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１（Ｔａｋａｒａ社）のカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ遺伝子）を増幅するために以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。なお、各プライマーの５’末端には大腸菌の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ遺伝子）（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｏｉｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿４１５８９８）の相同配列８０ｂｐが付加してある。
[Example 1-1] Construction of lactate dehydrogenase gene-disrupted E. coli, construction of mcr gene-introduced lactate dehydrogenase gene-disrupted Escherichia coli and 3HP fermentation PCR amplification was performed using primers. In addition, a homologous sequence 80 bp of E. coli lactate dehydrogenase gene (ldhA gene) (NCBI Accession Number: NP — 415898) is added to the 5 ′ end of each primer.
ＰＣＲ増幅により得られたＫｍＲ遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物（１６１０ｂｐ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｕｓｉｏｎ ｂｌｕｅ（Ｔａｋａｒａ社）のプロトコールに従ってヒートショック法により導入し、Ｋｍ１５ｐｐｍ添加ＬＢ培地に塗扶した。得られたＫｍ耐性大腸菌のコロニーＰＣＲを以下のプライマーを用いて実施し、ｌｄｈＡ遺伝子が破壊された大腸菌を選抜した。ｌｄｈＡ遺伝子が破壊された大腸菌をｌｄｈＡ遺伝子破壊Ｅ．ｃｏｌｉとして以降の実験に用いた。 A PCR amplification product (1610 bp) containing the KmR gene obtained by PCR amplification was introduced by the heat shock method according to the protocol of Escherichia coli fusion blue (Takara) and applied to an LB medium supplemented with Km15 ppm. The obtained Km-resistant Escherichia coli colony PCR was performed using the following primers, and Escherichia coli in which the ldhA gene was disrupted was selected. E. coli in which the ldhA gene has been disrupted is used for the ldhA gene disruption. This was used in the subsequent experiments as E. coli.
比較例１−１記載のｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１を、ｌｄｈＡ遺伝子破壊Ｅ．ｃｏｌｉに導入し、ｌｄｈＡ遺伝子破壊Ｅ．ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１）を構築した。ｌｄｈＡ遺伝子破壊Ｅ．ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１）をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃、１２０ｒｐｍで４８時間好気培養を行った。得られた培養液を比較例１−１記載のヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）を用いた分析に供し、３ＨＰおよび乳酸の定量分析を行ったところ、０．２ｇ／Ｌの３ＨＰの生成を確認したが、乳酸の生成は確認されなかった。また、ヒドロキシカルボン酸ラベル化に供したものと同じ培養液を、Ｅ−キット Ｄ−乳酸／Ｌ−乳酸（株式会社Ｊ．Ｋ．インターナショナル）およびＥ−液状キット エタノール（株式会社Ｊ．Ｋ．インターナショナル）に供したところ、乳酸およびエタノールは検出されなかった（なお、Ｅ−キット Ｄ−乳酸／Ｌ−乳酸の乳酸の検出限界は０．３ｍｇ／Ｌ、またＥ−液状キット エタノールのエタノールの検出限界は１．８ｍｇ／Ｌである）。すなわち、得られた３ＨＰ溶液において、３ＨＰの全質量に対して、乳酸の含有率は、多く見積もっても０．１５質量％以下であり、エタノールの含有率は多く見積もっても０．９質量％であることが確認された。 Mcr / PinPoint Xa-1 described in Comparative Example 1-1 was used as the ldhA gene disruption E. coli. E. coli, and ldhA gene disruption E. coli (mcr / PinPoint Xa-1) was constructed. ldhA gene disruption E. coli (mcr / PinPoint Xa-1) was inoculated into IPTG-added (final concentration 1 mM) 2 wt / vol% glucose-added M9 medium (Difco), and aerobic culture was performed at 37 ° C. and 120 rpm for 48 hours using a Sakaguchi flask. Went. The obtained culture broth was subjected to analysis using the hydroxycarboxylic acid labeling reagent (YMC) described in Comparative Example 1-1, and quantitative analysis of 3HP and lactic acid was performed. As a result, 0.2 g / L of 3HP was produced. However, the production of lactic acid was not confirmed. In addition, the same culture solution as that used for labeling with hydroxycarboxylic acid was prepared by using E-kit D-lactic acid / L-lactic acid (JK International Co., Ltd.) and E-liquid kit ethanol (JK International Co., Ltd.). ) And lactic acid and ethanol were not detected (note that the detection limit of lactic acid in E-kit D-lactic acid / L-lactic acid was 0.3 mg / L, and the detection limit of ethanol in E-liquid kit ethanol) Is 1.8 mg / L). That is, in the obtained 3HP solution, the content of lactic acid is 0.15% by mass or less at most, and the content of ethanol is 0.9% by mass at most, based on the total mass of 3HP. It was confirmed that.
［実施例１−２］３ＨＰを含む水溶液を用いた３ＨＰ脱水処理
実施例１−１で得た３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を含む培養液をＷＯ２００２／０９０３１２記載の方法で、３ＨＰの濃度が１２質量％である水溶液を調整し、メトキノンを１００質量ｐｐｍになるように添加した。
[Example 1-2] 3HP dehydration treatment using an aqueous solution containing 3HP The culture solution containing 3-hydroxypropionic acid (3HP) obtained in Example 1-1 was prepared according to the method described in WO2002 / 090312. An aqueous solution of 12% by mass was prepared, and methoquinone was added to 100 ppm by mass.
内径１０ｍｍのステンレス製反応管に、高さ５ｃｍで固体触媒としてγ−アルミナを充填し、その上にステンレス製の１．５ｍｍのディクソンパッキンを蒸発層として積層した。反応管を電気炉にて３００℃に加熱し、上記原料を毎時８．３ｇの速度で反応管の上部に供給した。同時に、毎時１．５Ｌの速度で窒素ガスを流した。 A stainless steel reaction tube having an inner diameter of 10 mm was filled with γ-alumina as a solid catalyst at a height of 5 cm, and a stainless steel 1.5 mm Dickson packing was laminated thereon as an evaporation layer. The reaction tube was heated to 300 ° C. in an electric furnace, and the raw material was supplied to the upper portion of the reaction tube at a rate of 8.3 g / hour. At the same time, nitrogen gas was allowed to flow at a rate of 1.5 L / hour.
反応管の下部から抜き出した反応ガスを、冷却捕集し反応液を得た。得られた反応液を液体クロマトグラフィーで分析したところ、３ＨＰの転化率は９９％、アクリル酸の収率は９８モル％であった。また１０日間保管しても着色は見られなかった。 The reaction gas extracted from the lower part of the reaction tube was cooled and collected to obtain a reaction solution. When the obtained reaction liquid was analyzed by liquid chromatography, the conversion rate of 3HP was 99%, and the yield of acrylic acid was 98 mol%. Moreover, coloring was not seen even if it stored for 10 days.
［比較例１−２］３ＨＰおよび乳酸を含む水溶液を用いた３ＨＰ脱水処理
比較例１−１で得た３−ヒドロキシプロピオン酸および乳酸含む培養液をＷＯ２００２／０９０３１２記載の方法に供し、３ＨＰを１２質量％、乳酸を２７重量％含む水溶液を得た。この水溶液を用いて、実施例１−２と同じように固体触媒を充填した反応管の上部に、毎時８．３ｇの速度で供給した。同時に、毎時１．５Ｌの速度で窒素ガスを流した。しかし供給の途中で反応管が閉塞し、アクリル酸の製造が困難となったため、水溶液の供給を停止した。なお、水溶液の供給を開始した初期に反応管から抜き出した反応ガスを冷却し、捕集した反応液を液体クロマトグラフィー分析したところ、アクリル酸の他に実施例１−２では検出されなかった未知の不純物が多数確認された。また捕集液は黄色く着色していた。
[Comparative Example 1-2] 3HP Dehydration Treatment Using Aqueous Solution Containing 3HP and Lactic Acid The culture solution containing 3-hydroxypropionic acid and lactic acid obtained in Comparative Example 1-1 was subjected to the method described in WO2002 / 090313, and 3HP was added to 12 An aqueous solution containing 27% by weight of mass% and lactic acid was obtained. Using this aqueous solution, it was supplied to the upper part of the reaction tube filled with the solid catalyst in the same manner as in Example 1-2 at a rate of 8.3 g per hour. At the same time, nitrogen gas was allowed to flow at a rate of 1.5 L / hour. However, since the reaction tube was clogged during the supply and it became difficult to produce acrylic acid, the supply of the aqueous solution was stopped. In addition, when the reaction gas extracted from the reaction tube at the beginning of the supply of the aqueous solution was cooled and the collected reaction liquid was subjected to liquid chromatography analysis, it was unknown that it was not detected in Example 1-2 in addition to acrylic acid. Many impurities were confirmed. The collected liquid was colored yellow.
Claims (7)
前記３−ヒドロキシプロピオン酸溶液において、３−ヒドロキシプロピオン酸の全質量に対し、乳酸の含有率は１．２質量％以下である、および／または、エタノールの含有率は１質量％以下であることを特徴とする、３−ヒドロキシプロピオン酸溶液の製造方法。 Culturing a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid and the ability to produce lactic acid and / or ethanol negatively in the presence of an organic compound to obtain a 3-hydroxypropionic acid solution Have
In the 3-hydroxypropionic acid solution, the content of lactic acid is 1.2% by mass or less and / or the content of ethanol is 1% by mass or less with respect to the total mass of 3-hydroxypropionic acid. A method for producing a 3-hydroxypropionic acid solution.
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