JP2012198276A - Microscope device, observation method and sample loading mechanism - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an image of a sample at a high resolution through a simple optical adjustment and to carry out observation in which the degree of freedom in an optical axis direction is given.SOLUTION: A microscope 1 according to the present invention comprises: a laser light source 2 that oscillates a laser beam L with coherence for excitation of a sample S; a detection part 14 that detects fluorescent return light R when the laser beam L is emitted to the sample S; and a sample loading part 10 in which the sample S is loaded on a reflection surface 10a that reflects the laser beam L so as to generate a standing wave within the range of a focus F of the laser beam L. Causing the laser beam L directly bringing the focus F to the sample S and the laser beam L reflected by the reflection surface 10a to interfere with each other generates the standing wave. Interference is caused for the return light as well. Thus resolution power can be improved and an image with high resolution can be obtained.

Description

本発明は、試料に照明光を照射して、試料からの戻り光を検出して試料の画像を生成する顕微鏡装置、観察方法および試料搭載機構に関するものである。   The present invention relates to a microscope apparatus, an observation method, and a sample mounting mechanism that irradiates a sample with illumination light, detects return light from the sample, and generates an image of the sample.

蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対してレーザ光を照射して蛍光を発生させ、発生した蛍光に基づいて試料の観察を行う顕微鏡装置が従来から用いられている。この顕微鏡として、非特許文献１に開示される４Ｐｉ共焦点顕微鏡を用いることができる。４Ｐｉ共焦点顕微鏡は、高解像度の画像を得ることを目的とした顕微鏡装置になる。   2. Description of the Related Art Conventionally, a microscope apparatus has been used in which a sample into which a fluorescent dye or fluorescent protein is introduced is irradiated with laser light to generate fluorescence, and the sample is observed based on the generated fluorescence. As this microscope, the 4Pi confocal microscope disclosed in Non-Patent Document 1 can be used. The 4Pi confocal microscope becomes a microscope apparatus for the purpose of obtaining a high-resolution image.

４Ｐｉ共焦点顕微鏡は、試料を挟んで２つの対物レンズを対向配置している。レーザ光源から発振されたレーザ光は途中で分岐しており、分岐した２つのレーザ光は２つの対物レンズからそれぞれ試料に照射する。このときに、２つのレーザ光の焦点位置が試料において重なるようにする。これにより、励起光（レーザ光）を干渉させて、焦点の光軸方向（Ｚ軸方向）の領域を狭小にしており、Ｚ軸方向の分解能を高くしている。   In the 4Pi confocal microscope, two objective lenses are opposed to each other with a sample interposed therebetween. The laser light oscillated from the laser light source is branched in the middle, and the two branched laser lights are irradiated to the sample from the two objective lenses, respectively. At this time, the focal positions of the two laser beams are overlapped on the sample. As a result, the excitation light (laser light) is made to interfere to narrow the region of the focal point in the optical axis direction (Z-axis direction), and the resolution in the Z-axis direction is increased.

そして、対物レンズにより狭小な領域に焦点が結ばれたレーザ光によって試料に導入した蛍光色素や蛍光タンパクが蛍光する。この蛍光は戻り光となって、２つの対物レンズから回収される。このときに、戻り光を再び干渉させることで、Ｚ軸方向の分解能を向上させている。そして、干渉した戻り光が検出部により検出されることで、高解像度の試料の画像を生成している。   Then, the fluorescent dye or fluorescent protein introduced into the sample is fluorescent by the laser beam focused on a narrow area by the objective lens. This fluorescence becomes return light and is recovered from the two objective lenses. At this time, the resolution in the Z-axis direction is improved by making the return light interfere again. Then, the interference return light is detected by the detection unit, thereby generating a high-resolution sample image.

高解像度の画像を生成する顕微鏡としては、他に全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ顕微鏡）を用いることもできる。このＴＩＲＦ顕微鏡では、励起光としてエバネッセント光を用いて、エバネッセント場を利用した局所的な励起を行っている。これにより、極めて被写体の深度を浅くすることができ、Ｚ軸方向の分解能を高くしている。これにより、試料の画像を高解像度に生成している。   In addition, a total reflection illumination fluorescence microscope (TIRF microscope) can be used as a microscope for generating a high-resolution image. In the TIRF microscope, evanescent light is used as excitation light, and local excitation using an evanescent field is performed. As a result, the depth of the subject can be extremely reduced, and the resolution in the Z-axis direction is increased. Thereby, the image of the sample is generated with high resolution.

Journal of the Optical Society of America A 9: 2159-2166「Properties of a 4pi confocal fluorescence microscope by Stefan Hell and Ernest H. K. Stelzer」Journal of the Optical Society of America A 9: 2159-2166 `` Properties of a 4pi confocal fluorescence microscope by Stefan Hell and Ernest H. K. Stelzer ''

前述した４Ｐｉ顕微鏡は、２つのレーザ光を試料において干渉させることで、高解像度の画像を得るようにしている。このために、２つのレーザ光は試料において正確に焦点を一致させる必要がある。従って、２つの対物レンズの位置関係は高精度に調整しなければならない。また、２つの対物レンズからそれぞれ戻り光を回収させており、且つ２つの戻り光を干渉させている。このため、戻り光の光路も正確に重ね合わせる必要があることから、顕微鏡全体の光学調整を極めて厳格に行う必要がある。従って、過剰に高い光学調整の精度が要求される。   The 4Pi microscope described above obtains a high-resolution image by causing two laser beams to interfere with each other in a sample. For this reason, the two laser beams need to be accurately focused on the sample. Therefore, the positional relationship between the two objective lenses must be adjusted with high accuracy. Further, the return lights are collected from the two objective lenses, respectively, and the two return lights are made to interfere with each other. For this reason, since it is necessary to accurately superimpose the optical path of the return light, the optical adjustment of the entire microscope needs to be performed very strictly. Therefore, an excessively high accuracy of optical adjustment is required.

また、ＴＩＲＦ顕微鏡の場合には、エバネッセント場が発生する極めて限定された領域の画像が得られる。つまり、試料の厚さ数百ナノメートルでのみ励起光によって蛍光を発生するため、観察対象となる領域は深さ方向（Ｚ軸方向）において非常に限定された領域になる。これにより、深さ方向における観察の自由度が低下する。   In the case of a TIRF microscope, an image of a very limited region where an evanescent field is generated can be obtained. That is, since the fluorescence is generated by the excitation light only when the thickness of the sample is several hundred nanometers, the region to be observed is a very limited region in the depth direction (Z-axis direction). Thereby, the freedom degree of observation in a depth direction falls.

そこで、本発明は、簡単な光学調整で高解像度の試料の画像を得ると共に、光軸方向に自由度を持たせた観察を行うことを目的とする。   Accordingly, an object of the present invention is to obtain a high-resolution sample image by simple optical adjustment and to perform observation with a degree of freedom in the optical axis direction.

以上の課題を解決するため、干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源と、前記試料に前記照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させるように前記照明光を反射させる反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、を備えたことを特徴とする。   In order to solve the above problems, a light source that has coherency and oscillates illumination light that excites a sample, a detection unit that detects return light that is fluorescent when the sample is irradiated with the illumination light, and the illumination And a sample mounting portion in which the sample is mounted on a reflection surface that reflects the illumination light so as to generate a standing wave within a range of light focus.

この顕微鏡装置によれば、試料に直接的に入射する照明光と反射面で反射した反射光とを干渉させて定在波を発生させており、戻り光においても干渉を行う。これにより、光軸方向において分解能を高くすることができ、高解像度の画像生成を行うことができる。２つの対物レンズを用いて焦点を一致させなくてもよいことから、簡単に光学調整を行うことができ、エバネッセント光を用いていないため、光軸方向において任意の位置の観察を行うことができる。   According to this microscope apparatus, the standing light is generated by causing interference between the illumination light directly incident on the sample and the reflected light reflected by the reflecting surface, and interference is also performed in the return light. Thereby, the resolution can be increased in the optical axis direction, and high-resolution image generation can be performed. Since it is not necessary to make the focal points coincide with each other using two objective lenses, optical adjustment can be easily performed, and since no evanescent light is used, observation at an arbitrary position in the optical axis direction can be performed. .

また、前記焦点の範囲内の前記戻り光のみを前記検出部に通過させるピンホールを備えたことを特徴とする。これにより、焦点の合った部分だけの画像を生成する共焦点顕微鏡とすることができることから、高解像度の画像を生成することができる。   In addition, a pinhole is provided that allows only the return light within the focal range to pass through the detection unit. Thereby, since it can be set as the confocal microscope which produces | generates the image of only the focused part, a high-resolution image can be produced | generated.

また、前記試料に前記照明光の焦点を結ばせる対物レンズと、前記照明光の光軸方向に直交する平面に前記照明光を走査する走査部と、を備えたことを特徴とする。対物レンズにより照明光に焦点を結ばせて、光軸方向に直交する平面を走査手段が走査することで、所定領域の３次元の試料の画像を生成することができる。   In addition, an objective lens that focuses the illumination light on the sample, and a scanning unit that scans the illumination light on a plane orthogonal to the optical axis direction of the illumination light are provided. By focusing the illumination light with the objective lens and scanning the plane perpendicular to the optical axis direction, the scanning unit can generate a three-dimensional sample image of a predetermined region.

また、前記光源は、近赤外光のパルスレーザを前記照明光として発振することを特徴とする。光源が近赤外光のパルスレーザを発振することで、２光子励起を生じさせることができ、光軸方向の分解能を高くできる。これにより、高解像度の画像生成を行うことができる。   Further, the light source oscillates a near-infrared pulse laser as the illumination light. When the light source oscillates a near-infrared pulse laser, two-photon excitation can be generated, and the resolution in the optical axis direction can be increased. Thereby, high-resolution image generation can be performed.

また、複数のマイクロレンズを配列した第１の回転ディスクと、この第１の回転ディスクと離間した位置に設けられ、前記マイクロレンズと同じパターンで複数のピンホールを配列した第２の回転ディスクと、前記第１の回転ディスクと前記第２の回転ディスクとを一体的に回転させる回転ドラムと、を備えたことを特徴とする。ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡として用いることで、画像生成の速度を高速化できる。   A first rotating disk in which a plurality of microlenses are arranged; and a second rotating disk that is provided at a position spaced from the first rotating disk and in which a plurality of pinholes are arranged in the same pattern as the microlens. And a rotating drum for integrally rotating the first rotating disk and the second rotating disk. By using it as a Nipo Disc confocal microscope, the image generation speed can be increased.

また、前記反射面に対して前記焦点の位置を異ならせたときの戻り光を前記検出部が検出して、これらの戻り光を比較して強度が高くなっている１つの領域以外の領域を除去するデコンボルーション処理を行う演算部を備えたことを特徴とする。焦点位置を異ならせたときの戻り光を検出して、特定の領域の強度を検出するデコンボルーション処理を行うことで、光軸方向に優れた分解能の画像を得ることができる。   In addition, the detection unit detects return light when the focus position is changed with respect to the reflection surface, and compares the return light to areas other than one area where the intensity is high. An arithmetic unit that performs a deconvolution process to be removed is provided. An image with excellent resolution in the optical axis direction can be obtained by detecting the return light when the focal position is changed and performing deconvolution processing for detecting the intensity of a specific region.

また、前記照明光を第１の照明光と第２の照明光とに分岐して、この第２の照明光を拡散光にして前記反射面で反射させ、前記第１の照明光と反射した前記第２の照明光との焦点を一致させる光分岐部を備えたことを特徴とする。これにより、焦点の中心を反射面から離間した位置に且つ自由な位置に設定することができ、光軸方向における任意の位置の画像を得ることができる。   Further, the illumination light is branched into first illumination light and second illumination light, the second illumination light is converted into diffused light and reflected by the reflection surface, and reflected from the first illumination light. An optical branching unit that matches the focal point with the second illumination light is provided. Thereby, the center of the focal point can be set at a position separated from the reflecting surface and at a free position, and an image at an arbitrary position in the optical axis direction can be obtained.

また、前記光源は、前記試料の蛍光が飽和する強度であり且つ一定の周波数で変調したレーザ光を発振することを特徴とする。これにより、飽和励起顕微鏡として用いることができる。飽和励起顕微鏡として用いることで、光軸方向の限定された領域のみが飽和をするため、分解能を向上させることができ、高解像度の画像生成を行うことができる。   Further, the light source oscillates a laser beam having an intensity at which the fluorescence of the sample is saturated and modulated at a constant frequency. Thereby, it can be used as a saturation excitation microscope. By using as a saturation excitation microscope, only a limited region in the optical axis direction is saturated, so that the resolution can be improved and high-resolution image generation can be performed.

また、前記光源は、蛍光可能な状態と不可能な状態とを切り替え可能な蛍光分子が導入された前記試料に対してスイッチング用のレーザ光を発振することを特徴とする。これにより、顕微鏡装置をＰＡＬＭに適用することができる。ＰＡＬＭでは個々の蛍光分子が蛍光するため、ＸＹ方向の分解能が高くなることから、ＸＹ方向およびＺ方向の３次元に分解能の高い画像生成を行うことができる。   Further, the light source oscillates a switching laser beam for the sample into which a fluorescent molecule capable of switching between a fluorescent state and an impossible state is introduced. Thereby, a microscope apparatus can be applied to PALM. In PALM, since individual fluorescent molecules fluoresce, the resolution in the XY directions is increased, so that it is possible to generate images with high resolution in three dimensions in the XY and Z directions.

また、前記光源は、前記照明光を励起用レーザ光として発振する励起用レーザ光源と、前記励起用レーザ光の焦点の外周にリング状の焦点を結ばせるＳＴＥＤレーザを発振するＳＴＥＤレーザ光源と、前記励起用レーザ光と前記ＳＴＥＤレーザとの光路を一致させるダイクロイックミラーと、を備えたことを特徴とする。これにより、ＳＴＥＤ顕微鏡として適用することができ、ＸＹ方向に高い分解能を得ることができる。このため、ＸＹ方向およびＺ方向の３次元に分解能の高い画像生成を行うことができる。   The light source includes an excitation laser light source that oscillates the illumination light as excitation laser light, a STED laser light source that oscillates a STED laser that forms a ring-shaped focal point on the outer periphery of the focal point of the excitation laser light, And a dichroic mirror for matching the optical paths of the excitation laser beam and the STED laser. Thereby, it can apply as a STED microscope and can obtain high resolution in an XY direction. For this reason, it is possible to generate an image with high resolution in three dimensions in the XY direction and the Z direction.

また、本発明の観察方法は、干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源から、前記照明光の焦点の範囲内に定在波が発生するように前記照明光を反射させる反射面を形成した試料搭載部に搭載した前記試料に前記照明光を照射して、蛍光した戻り光を検出することを特徴とする。   In addition, the observation method of the present invention reflects the illumination light from a light source that has coherence and oscillates illumination light that excites the sample so that a standing wave is generated within the focus range of the illumination light. The fluorescent light is detected by irradiating the illumination light to the sample mounted on the sample mounting portion on which the reflecting surface is formed.

また、本発明の試料搭載機構は、干渉性を有し、試料を励起させる照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察を行うときの前記試料を搭載する試料搭載機構であって、この試料搭載機構の前記照明光が入射する側の面に前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させる反射面を形成したことを特徴とする。   Further, the sample mounting mechanism of the present invention is a sample mounting mechanism that mounts the sample when the observation is performed by detecting return light that is fluorescent when irradiated with illumination light that excites the sample. In addition, a reflection surface that generates a standing wave within the focal range of the illumination light is formed on the surface on which the illumination light is incident on the sample mounting mechanism.

本発明は、試料搭載部の試料を搭載する面を反射面として、試料に直接的に照射される照明光と反射面で反射した照明光とを干渉させて定在波を発生させており、戻り光においても干渉をさせている。これにより、焦点の範囲内の狭小な領域を蛍光させて分解能を高くでき、高解像度の画像を得ることができる。２つの対物レンズを使用して焦点を一致させなくてもよいことから、簡単な光学調整で顕微鏡装置を構成でき、エバネッセント光を使用していないため、光軸方向に自由度を持たせた観察を行うことができる。   In the present invention, the surface on which the sample of the sample mounting portion is mounted is used as a reflection surface, and the standing light is generated by causing interference between the illumination light directly irradiated on the sample and the illumination light reflected by the reflection surface, Interference is also caused in the return light. As a result, a narrow area within the focal range can be made fluorescent to increase the resolution, and a high-resolution image can be obtained. Since it is not necessary to use two objective lenses to adjust the focus, a microscope device can be configured with simple optical adjustment, and since evanescent light is not used, observation with a degree of freedom in the optical axis direction is possible. It can be performed.

実施形態の顕微鏡装置の構成図である。It is a block diagram of the microscope apparatus of embodiment. 実施形態の焦点の状態を説明した図である。It is a figure explaining the state of the focus of an embodiment. 図２の焦点の強度分布を示すグラフである。It is a graph which shows the intensity distribution of the focus of FIG. 図２から焦点の中心をずらしたときの状態を説明した図である。It is a figure explaining the state when the center of a focus is shifted from FIG. 図４の焦点の強度分布を示すグラフである。It is a graph which shows the intensity distribution of the focus of FIG. 図２から焦点の中心をさらにずらしたときの状態を説明した図である。It is a figure explaining the state when the center of a focus is further shifted from FIG. 図６の焦点の強度分布を示すグラフである。It is a graph which shows the intensity distribution of the focus of FIG. 変形例１の顕微鏡装置の構成図である。It is a block diagram of the microscope apparatus of the modification 1. 変形例１の顕微鏡装置の概念図である。It is a conceptual diagram of the microscope apparatus of the modification 1. 変形例２の顕微鏡装置の構成図である。It is a block diagram of the microscope apparatus of the modification 2. 光分岐ユニットの構成を示す図である。It is a figure which shows the structure of an optical branching unit. 変形例２の焦点の状態を示す図である。It is a figure which shows the state of the focus of the modification 2. 図１２の焦点の強度分布を示すグラフである。It is a graph which shows the intensity distribution of the focus of FIG. 図１２から焦点の中心をずらしたときの状態を説明した図である。It is a figure explaining the state when the center of a focus is shifted from FIG. 変形例５のレーザ光源の構成図である。It is a block diagram of the laser light source of the modification 5. 変形例６の試料搭載部を説明する図である。It is a figure explaining the sample mounting part of the modification 6. FIG.

以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。図１は顕微鏡装置１を示している。顕微鏡装置１はレーザ光源２とシャッタ３とダイクロイックミラー４と光走査ユニット５と瞳リレーレンズ６とミラー７と結像レンズ８と対物レンズ９と試料搭載部１０と蛍光フィルタ１１と集束レンズ１２とピンホール１３と検出部１４とコントローラ１５とディスプレイ１６とを備えて構成している。試料搭載部１０には蛍光指示薬（蛍光色素）が導入された試料Ｓが載置されている。   Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. FIG. 1 shows a microscope apparatus 1. The microscope apparatus 1 includes a laser light source 2, a shutter 3, a dichroic mirror 4, an optical scanning unit 5, a pupil relay lens 6, a mirror 7, an imaging lens 8, an objective lens 9, a sample mounting unit 10, a fluorescent filter 11, and a focusing lens 12. A pinhole 13, a detection unit 14, a controller 15, and a display 16 are provided. A sample S into which a fluorescent indicator (fluorescent dye) has been introduced is placed on the sample mounting unit 10.

レーザ光源２は干渉性を有するレーザ光Ｌを照明光として発振する光源になる。また、レーザ光Ｌは励起光であり、試料Ｓに導入した蛍光色素を励起させる波長λを有する。レーザ光源２が発振したレーザ光Ｌは図示しないコリメートレンズにより平行光にされて、シャッタ３に導かれる。シャッタ３は所定のタイミングで開放制御することでレーザ光Ｌを通過させる。シャッタ３を通過したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー４に入射する。   The laser light source 2 becomes a light source that oscillates with the coherent laser light L as illumination light. The laser light L is excitation light and has a wavelength λ for exciting the fluorescent dye introduced into the sample S. The laser light L oscillated by the laser light source 2 is converted into parallel light by a collimator lens (not shown) and guided to the shutter 3. The shutter 3 allows the laser light L to pass through the opening control at a predetermined timing. The laser light L that has passed through the shutter 3 enters the dichroic mirror 4.

ダイクロイックミラー４はレーザ光源２からのレーザ光Ｌを反射し、試料Ｓからの戻り光（蛍光）Ｒを透過させる特性を持つ光学部品である。よって、レーザ光源２が発振したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー４で反射して、光走査ユニット５に導かれる。光走査ユニット５は第１の可変ミラー５ａと第２の可変ミラー５ｂとを有する走査部である。   The dichroic mirror 4 is an optical component that reflects the laser light L from the laser light source 2 and transmits the return light (fluorescence) R from the sample S. Therefore, the laser light L oscillated by the laser light source 2 is reflected by the dichroic mirror 4 and guided to the optical scanning unit 5. The optical scanning unit 5 is a scanning unit having a first variable mirror 5a and a second variable mirror 5b.

第１の可変ミラー５ａと第２の可変ミラー５ｂとは１本の軸の周りに回転可能に構成している。これにより、光走査ユニット５はレーザ光Ｌの反射角を制御して、レーザ光Ｌの焦点Ｆを試料搭載部１０に載置した試料ＳのＸＹ方向（水平面方向：光軸（Ｚ軸）方向と直交する面）に走査する。   The first variable mirror 5a and the second variable mirror 5b are configured to be rotatable around one axis. Thereby, the optical scanning unit 5 controls the reflection angle of the laser beam L, and the XY direction (horizontal plane direction: optical axis (Z axis) direction of the sample S on which the focal point F of the laser beam L is placed on the sample mounting unit 10. To the surface perpendicular to.

光走査ユニット５からのレーザ光Ｌは瞳リレーレンズ６に入射し、その後にミラー７で反射される。そして、レーザ光Ｌは対物レンズ９により試料搭載部１０に搭載された試料Ｓに焦点Ｆを結ぶ。対物レンズ９の瞳は瞳リレーレンズ６によって、光走査ユニット５の位置にリレーされるので、光走査ユニット５により走査される光は、対物レンズ９の瞳位置でレーザ光Ｌが走査される。   Laser light L from the optical scanning unit 5 enters the pupil relay lens 6 and is then reflected by the mirror 7. The laser light L is focused on the sample S mounted on the sample mounting unit 10 by the objective lens 9. Since the pupil of the objective lens 9 is relayed to the position of the optical scanning unit 5 by the pupil relay lens 6, the laser beam L is scanned at the pupil position of the objective lens 9 with respect to the light scanned by the optical scanning unit 5.

試料Ｓは試料搭載機構としての試料搭載部１０に搭載されており、対物レンズ９によってレーザ光Ｌが試料Ｓで焦点を結ぶ。また、光走査ユニット５により試料ＳのＸＹ方向にレーザ光Ｌが走査される。試料搭載部１０の試料Ｓを搭載する面はレーザ光Ｌを反射させる反射面１０ａとしている。これにより、対物レンズ９から入射したレーザ光Ｌと反射面１０ａで反射したレーザ光Ｌとが干渉して定在波を発生させる。   The sample S is mounted on a sample mounting portion 10 as a sample mounting mechanism, and the laser light L is focused on the sample S by the objective lens 9. Further, the laser beam L is scanned in the XY direction of the sample S by the optical scanning unit 5. The surface on which the sample S of the sample mounting portion 10 is mounted is a reflecting surface 10a that reflects the laser light L. As a result, the laser beam L incident from the objective lens 9 interferes with the laser beam L reflected by the reflecting surface 10a to generate a standing wave.

試料Ｓには蛍光色素が導入されており、レーザ光Ｌによって試料Ｓの蛍光色素が励起される。これにより、蛍光して戻り光（蛍光）Ｒが発生する。発生した戻り光Ｒは対物レンズ９に入射して、レーザ光Ｌとは逆方向に進行する。そして、対物レンズ９、結像レンズ８、ミラー７、瞳リレーレンズ６、光走査ユニット５を経て、ダイクロイックミラー４に入射する。   A fluorescent dye is introduced into the sample S, and the fluorescent dye of the sample S is excited by the laser light L. As a result, fluorescent light and return light (fluorescence) R are generated. The generated return light R enters the objective lens 9 and travels in the opposite direction to the laser light L. Then, the light enters the dichroic mirror 4 through the objective lens 9, the imaging lens 8, the mirror 7, the pupil relay lens 6, and the optical scanning unit 5.

ダイクロイックミラー４は試料Ｓの蛍光の波長を透過させる特性を有している。よって、戻り光Ｒはダイクロイックミラー４を透過して、蛍光フィルタ１１に入射する。蛍光フィルタ１１は特定の波長成分、つまり蛍光の波長の光を選択的に透過させるフィルタである。   The dichroic mirror 4 has a characteristic of transmitting the fluorescence wavelength of the sample S. Therefore, the return light R passes through the dichroic mirror 4 and enters the fluorescent filter 11. The fluorescent filter 11 is a filter that selectively transmits light having a specific wavelength component, that is, a fluorescent wavelength.

よって、戻り光Ｒは蛍光フィルタ１１により、蛍光の波長成分の光が選択的に透過されて、ピンホール１３を通過する。ピンホール１３は焦点面以外からの光を除去するために焦点と共役な位置関係に配置している。これにより、焦点面からの光だけを抜き出して通過させることができる。ピンホール１３を通過した戻り光Ｒは検出部１４に入射する。このピンホール１３を形成することで、顕微鏡装置１を共焦点顕微鏡として適用している。つまり、ピンホール１３を通過した戻り光Ｒは焦点Ｆの近傍のみの光であり、焦点範囲に合った画像を共焦点画像として得ている。   Therefore, the return light R passes through the pinhole 13 with the fluorescence filter 11 selectively transmitting the light of the wavelength component of the fluorescence. The pinhole 13 is arranged in a positional relationship conjugate with the focal point in order to remove light from other than the focal plane. Thereby, only the light from the focal plane can be extracted and passed. The return light R that has passed through the pinhole 13 enters the detection unit 14. By forming this pinhole 13, the microscope apparatus 1 is applied as a confocal microscope. That is, the return light R that has passed through the pinhole 13 is light only in the vicinity of the focal point F, and an image suitable for the focal range is obtained as a confocal image.

検出部１４は光検出部である。つまり、受光した戻り光Ｒの光量を電気信号に光電変換する。この変換した電気信号は戻り光Ｒの光量のデジタルデータ（光量データ）になる。検出部１４が変換した光量データはコントローラ１５に入力される。コントローラ１５は入力した光量データをレーザ光Ｌの走査位置と対応させて画像のデータを生成する演算を行う。これにより、試料Ｓの画像を生成する。生成した画像は焦点面近傍からの蛍光画像になり、つまり共焦点画像になる。この共焦点画像がディスプレイ１６に表示される。   The detection unit 14 is a light detection unit. That is, the light amount of the received return light R is photoelectrically converted into an electric signal. The converted electric signal becomes digital data (light amount data) of the light amount of the return light R. The light amount data converted by the detection unit 14 is input to the controller 15. The controller 15 performs an operation of generating image data by associating the input light quantity data with the scanning position of the laser beam L. Thereby, an image of the sample S is generated. The generated image is a fluorescent image from the vicinity of the focal plane, that is, a confocal image. This confocal image is displayed on the display 16.

次に、本実施形態の動作について説明する。試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌは対物レンズ９により焦点Ｆを結ぶ。この焦点Ｆを試料Ｓで結ばせることで、試料Ｓの蛍光色素を励起させている。このときの焦点ＦはＰＳＦ（点像分布関数）に基づく一定の広がりを有している。図２は焦点Ｆの状態を示しており、この焦点Ｆは楕円形の一定範囲に広がり有している。   Next, the operation of this embodiment will be described. The laser light L applied to the sample S is focused on the focus F by the objective lens 9. By connecting the focal point F with the sample S, the fluorescent dye of the sample S is excited. The focus F at this time has a certain spread based on PSF (point spread function). FIG. 2 shows the state of the focal point F, and this focal point F extends over a certain range of an elliptical shape.

試料Ｓは試料搭載部１０に搭載しており、試料搭載部１０の試料Ｓを搭載する面は反射面１０ａとして形成している。この反射面１０ａはレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒを反射させる面となっており、レーザ光Ｌが入射する側の面に形成している。反射面１０ａは、レーザ光Ｌの波長λおよび戻り光Ｒの波長（試料Ｓが蛍光した波長）を反射させる光学特性を有していればよい。   The sample S is mounted on the sample mounting portion 10, and the surface of the sample mounting portion 10 on which the sample S is mounted is formed as a reflecting surface 10a. The reflection surface 10a is a surface that reflects the laser light L and the return light R, and is formed on the surface on the side where the laser light L is incident. The reflection surface 10a only needs to have optical characteristics that reflect the wavelength λ of the laser light L and the wavelength of the return light R (the wavelength at which the sample S is fluorescent).

例えば、アルミニウムや金等の金属のミラーコーティングを反射面１０ａに形成してもよいし、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒを選択的に反射させる誘電体多層膜を反射面１０ａとして形成してもよい。要は、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒを反射（全反射）させるものであれば、それ以外の波長域の光は透過させるものであってもよい。なお、反射面１０ａを保護するための保護層を反射面１０ａに形成してもよい。   For example, a mirror coating of a metal such as aluminum or gold may be formed on the reflection surface 10a, or a dielectric multilayer film that selectively reflects the laser light L and the return light R may be formed as the reflection surface 10a. . In short, as long as the laser beam L and the return beam R are reflected (totally reflected), light in other wavelength ranges may be transmitted. In addition, you may form the protective layer for protecting the reflective surface 10a in the reflective surface 10a.

レーザ光Ｌの焦点Ｆは楕円形に所定範囲の領域となっている。よって、焦点Ｆの光軸方向の中心を反射面１０ａと一致させるように調整する。これは、対物レンズ９を調整することにより行う。焦点Ｆの中心が反射面１０ａと一致したときには、焦点Ｆの半分は反射面１０ａにより反射される。   The focal point F of the laser beam L is an elliptical region within a predetermined range. Therefore, the center of the focal point F in the optical axis direction is adjusted to coincide with the reflecting surface 10a. This is done by adjusting the objective lens 9. When the center of the focal point F coincides with the reflecting surface 10a, half of the focal point F is reflected by the reflecting surface 10a.

このとき、対物レンズ９から直接的に試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌを直接光とし、反射面１０ａにより反射されたレーザ光Ｌを反射光とする。反射光と直接光とは相互に向きが異なるため、反射光は直接光に対して位相が１８０度（λ／２相当）シフトする。これにより、直接光と反射光とが干渉して定在波（定常波）が発生する。   At this time, the laser light L directly applied to the sample S from the objective lens 9 is set as direct light, and the laser light L reflected by the reflecting surface 10a is set as reflected light. Since the directions of the reflected light and the direct light are different from each other, the phase of the reflected light is shifted by 180 degrees (equivalent to λ / 2) with respect to the direct light. Thereby, direct light and reflected light interfere and a standing wave (stationary wave) is generated.

定在波を発生させているため、反射面１０ａからＺ軸方向において「λ／４」の領域（図２の領域Ｆ１）では直接光と反射光とが強め合うように干渉する。領域Ｆ１は直接光と反射光との光路差が「λ／４＋λ／４＋λ／２＝λ」と１波長分になることから定在波の「腹」になり、レーザ光Ｌの強度が高くなる。   Since standing waves are generated, direct light and reflected light interfere with each other in the region of “λ / 4” (region F1 in FIG. 2) in the Z-axis direction from the reflecting surface 10a. In the region F1, since the optical path difference between the direct light and the reflected light is “λ / 4 + λ / 4 + λ / 2 = λ”, which corresponds to one wavelength, it becomes the “antinode” of the standing wave, and the intensity of the laser light L increases. .

一方、反射面１０ａから光軸方向において「λ／２」の領域（図示せず）では直接光と反射光とにより弱め合うような干渉が生じる。この領域は、直接光と反射光との光路差が「λ／４＋λ／４＋λ／２＝λ」と３／２波長分になることから、定在波の「節」になる。このために、レーザ光Ｌの強度が弱め合って、打ち消される。これにより、当該領域では蛍光（戻り光Ｒ）が発生しなくなる。   On the other hand, in a region (not shown) of “λ / 2” in the optical axis direction from the reflecting surface 10a, interference that weakens by direct light and reflected light occurs. This region becomes a “node” of the standing wave because the optical path difference between the direct light and the reflected light is “λ / 4 + λ / 4 + λ / 2 = λ” corresponding to 3/2 wavelengths. For this reason, the intensity of the laser beam L is weakened and canceled. Thereby, fluorescence (return light R) is not generated in the region.

また、反射面１０ａから光軸方向において「（３／４）×λ」の領域（図２の領域Ｆ２）では直接光と反射光とが干渉して強め合う。これは、領域Ｆ２では直接光と反射光との光路差が２波長分になるためである。ただし、この領域Ｆ２の部分は焦点Ｆの中心部分から離れた位置になっているため、領域Ｆ１に比べて強度が弱くなっている。従って、領域Ｆ２は領域Ｆ１よりも暗い領域となる。   Further, in the region “(3/4) × λ” (region F2 in FIG. 2) in the optical axis direction from the reflecting surface 10a, the direct light and the reflected light interfere and strengthen each other. This is because the optical path difference between the direct light and the reflected light is equivalent to two wavelengths in the region F2. However, since the portion of the region F2 is located away from the center portion of the focal point F, the intensity is weaker than that of the region F1. Accordingly, the region F2 is a darker region than the region F1.

さらに、反射面１０ａから光軸方向においてλの領域（図示せず）では直接光と反射光とが弱め合うような干渉が生じ、レーザ光Ｌが打ち消される。つまり、当該領域では直接光と反射光との光路差が（５／２）×λになるため、レーザ光Ｌが弱め合って打ち消される。このため、蛍光（戻り光Ｒ）が発生しなくなる。   Further, in the region λ (not shown) in the optical axis direction from the reflecting surface 10a, interference occurs such that the direct light and the reflected light are weakened, and the laser light L is canceled out. That is, in this region, the optical path difference between the direct light and the reflected light is (5/2) × λ, so that the laser beams L are weakened and canceled out. For this reason, fluorescence (return light R) is not generated.

従って、反射面１０ａをレーザ光Ｌが反射する反射面１０ａとすることで、Ｚ軸方向に励起する領域（蛍光する領域）を狭小にすることができる。図３（ａ）はＺ軸方向のレーザ光Ｌの強度分布を示しており、この図に示すように、領域Ｆ１およびＦ２で強度（光強度）が高くなっているが、他の領域では強度がほぼゼロになっている。   Therefore, by making the reflecting surface 10a a reflecting surface 10a that reflects the laser light L, a region excited in the Z-axis direction (fluorescent region) can be narrowed. FIG. 3A shows the intensity distribution of the laser beam L in the Z-axis direction. As shown in this figure, the intensity (light intensity) is high in the areas F1 and F2, but the intensity is in other areas. Is almost zero.

つまり、焦点Ｆの領域のうち一部の領域Ｆ１、Ｆ２のみの強度（レーザ光Ｌの強度）を高くすることができ、蛍光する領域を狭小な領域Ｆ１、Ｆ２に限定することができる。これにより、Ｚ軸方向の分解能が高くなる。以上は、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌに干渉による定在波を発生させた場合を説明したが、戻り光Ｒについても干渉させることで、分解能を高くしている。   That is, the intensity (intensity of the laser beam L) of only some of the areas F1 and F2 in the area of the focal point F can be increased, and the fluorescent areas can be limited to the narrow areas F1 and F2. This increases the resolution in the Z-axis direction. The above describes the case where a standing wave is generated by interference in the laser light L irradiated to the sample S, but the resolution is increased by causing the return light R to also interfere.

図１に示したように、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌと戻り光Ｒとはほぼ同じ光路を辿っている。つまり、同じ光路において、レーザ光Ｌと戻り光Ｒとは往復している関係になる。前述したものは往路について干渉による定在波を発生させているが、復路についても干渉を発生させている。これにより、戻り光Ｒについても分解能を高くすることができる。   As shown in FIG. 1, the laser beam L and the return beam R irradiated on the sample S follow substantially the same optical path. That is, in the same optical path, the laser beam L and the return beam R are reciprocated. In the above-described case, a standing wave due to interference is generated on the forward path, but interference is also generated on the return path. As a result, the resolution of the return light R can be increased.

レーザ光Ｌにより試料Ｓが励起して蛍光することにより、戻り光Ｒが発生する。蛍光が発生する点を極めて小さな光点とすると、この光点から発生する戻り光Ｒは直接的に対物レンズ９に入射する光（直接光）と反射面１０ａで反射してから対物レンズ９に入射する光（反射光）との２つの光が発生する。従って、戻り光Ｒの直接光と反射光とはその光路差に基づいて干渉が発生する。   When the sample S is excited by the laser light L and fluoresces, the return light R is generated. If the point where the fluorescence is generated is an extremely small light spot, the return light R generated from this light spot is directly reflected on the objective lens 9 (direct light) and reflected by the reflecting surface 10a, and then reflected on the objective lens 9. Two lights, incident light (reflected light), are generated. Therefore, interference occurs between the direct light and the reflected light of the return light R based on the optical path difference.

蛍光した光点が反射面１０ａから「λ／４」の位置（領域Ｆ１）にあるとすると、直接光と反射光との光路差は「λ／４＋λ／４＋λ／２＝λ」と１波長分に相当する。つまり、往路の場合と同様に復路の場合も戻り光Ｒが強め合う。同様に、励起された光点が反射面１０ａから「（３／４）×λ」の位置（領域Ｆ２）にあるときには光路差が２波長分になり、戻り光Ｒが強め合う。ただし、領域Ｆ２を光点としたときの戻り光Ｒの強度は領域Ｆ１を光点としたときの戻り光Ｒの強度よりも弱くなる。   Assuming that the fluorescent light spot is at a position (λ / 4) from the reflecting surface 10a (region F1), the optical path difference between the direct light and the reflected light is “λ / 4 + λ / 4 + λ / 2 = λ”, which corresponds to one wavelength. It corresponds to. That is, the return lights R are intensified in the return path as in the forward path. Similarly, when the excited light spot is at the position (region F2) of “(3/4) × λ” from the reflecting surface 10a, the optical path difference becomes two wavelengths, and the return light R is strengthened. However, the intensity of the return light R when the area F2 is the light spot is weaker than the intensity of the return light R when the area F1 is the light spot.

一方、蛍光した光点が反射面１０ａから「λ／２」或いは「（３／２）×λ」に位置している場合には、戻り光Ｒが弱め合うため、打ち消される。干渉による定在波が発生した戻り光Ｒはピンホール１３により通過される光が制限され、検出部１４で検出される。復路（戻り光Ｒ）のみを考えた場合には、その強度分布は図３（ａ）と同じになるが、往路のレーザ光Ｌ（励起系）と復路の戻り光Ｒ（検出系）との相乗効果により、検出部１４で検出される戻り光Ｒの強度分布は図３（ｂ）のようになる。   On the other hand, when the fluorescent light spot is located at “λ / 2” or “(3/2) × λ” from the reflecting surface 10a, the return light R is weakened and canceled. The return light R in which the standing wave due to the interference is generated is limited by the light passing through the pinhole 13 and is detected by the detection unit 14. When only the return path (return light R) is considered, the intensity distribution is the same as in FIG. 3A, but the forward laser beam L (excitation system) and the return path return light R (detection system) Due to the synergistic effect, the intensity distribution of the return light R detected by the detector 14 is as shown in FIG.

この図３（ｂ）の強度分布は図３（ａ）の強度分布を概ね２乗した分布になる。なお、図中の光強度は２乗になっているため、その値も２乗になっている。図３（ｂ）の強度分布では図３（ａ）の強度分布よりもガウシアン分布がシャープになっている。つまり、強度が高い領域をさらに狭小な領域とすることができる。これにより、分解能を高くすることができる。戻り光Ｒはピンホール１３を通過しており、これにより高い分解能の共焦点画像を得ることができる。   The intensity distribution in FIG. 3B is a distribution obtained by squaring the intensity distribution in FIG. Since the light intensity in the figure is squared, the value is also squared. In the intensity distribution of FIG. 3B, the Gaussian distribution is sharper than the intensity distribution of FIG. That is, a region with high strength can be made a narrower region. Thereby, the resolution can be increased. The return light R has passed through the pinhole 13, whereby a high resolution confocal image can be obtained.

このとき、検出部１４では領域Ｆ１とＦ２との強度が高くなっている戻り光Ｒを検出する。ここでは、狭小な領域Ｆ１の蛍光が観察対象となる。よって、領域Ｆ２の強度の影響をデコンボルーション処理により除去する。つまり、点像分布関数（ＰＳＦ）を用いて、領域Ｆ２については検出部１４が検出した戻り光Ｒから除去する計算を行う。或いは、戻り光Ｒを実測して領域Ｆ２を除去するように処理を行う。このデコンボルーション処理を行うことで、領域Ｆ１のみの蛍光を観察することができ、より狭小な領域の戻り光Ｒを検出できる。これにより、分解能をさらに高くすることができる。   At this time, the detection unit 14 detects the return light R in which the intensity of the regions F1 and F2 is high. Here, the fluorescence of the narrow area | region F1 becomes an observation object. Therefore, the influence of the intensity of the region F2 is removed by the deconvolution process. That is, using the point spread function (PSF), a calculation for removing the region F2 from the return light R detected by the detection unit 14 is performed. Alternatively, the process is performed so as to remove the region F2 by actually measuring the return light R. By performing this deconvolution process, the fluorescence of only the region F1 can be observed, and the return light R in a narrower region can be detected. Thereby, the resolution can be further increased.

図１に示すように、対物レンズ９は１つだけを用いており、４Ｐｉ顕微鏡のように２つの対物レンズを用いてレーザ光の焦点を重ねるようにしなくてもよい。これにより、顕微鏡装置１の光学調整を簡単に行うことができる。また、エバネッセント光を用いることなく、試料Ｓの画像生成を行っているため、光軸方向の観察に自由度を持たせることができる。   As shown in FIG. 1, only one objective lens 9 is used, and it is not necessary to focus the laser light by using two objective lenses as in the 4Pi microscope. Thereby, the optical adjustment of the microscope apparatus 1 can be easily performed. Further, since the image of the sample S is generated without using evanescent light, it is possible to give a degree of freedom in observation in the optical axis direction.

以上において、レーザ光源２は複数波長のレーザ光Ｌを選択的に発振可能なように構成してもよい。また、蛍光色素の色に応じた波長を持つレーザ光Ｌを発振するようにしてもよい。従って、蛍光色素の色を変えたときには、レーザ光源２のレーザ光Ｌは蛍光色素の色に応じた発振波長とする。これにより、複数の色の蛍光色素の画像取得を行うことができる。また、レーザ光源２に代替して、ＬＥＤやＳＬＤ（Super Luminescent Diode）等の可干渉距離の短い光を発振するようにしてもよい。   In the above, the laser light source 2 may be configured to be able to selectively oscillate laser beams L having a plurality of wavelengths. Further, the laser beam L having a wavelength corresponding to the color of the fluorescent dye may be oscillated. Therefore, when the color of the fluorescent dye is changed, the laser light L of the laser light source 2 has an oscillation wavelength corresponding to the color of the fluorescent dye. Thereby, the image acquisition of the fluorescent dye of a several color can be performed. Further, instead of the laser light source 2, light having a short coherence distance such as an LED or an SLD (Super Luminescent Diode) may be oscillated.

また、光走査ユニット５によりレーザ光Ｌは試料Ｓにおいて水平面方向（ＸＹ方向）に走査される。このときに、レーザ光Ｌの焦点Ｆは反射面１０ａに対してＺ軸方向において常に一定の位置（焦点Ｆの中心が反射面１０ａとなるような位置）にする必要がある。この位置関係を維持しながら光走査ユニット５がＸＹ方向にレーザ光Ｌを走査する。つまり、焦点Ｆを反射面１０ａに追従させる必要がある。   Further, the laser beam L is scanned in the horizontal plane direction (XY direction) on the sample S by the optical scanning unit 5. At this time, the focal point F of the laser light L needs to be always at a constant position in the Z-axis direction with respect to the reflecting surface 10a (a position where the center of the focal point F is the reflecting surface 10a). The optical scanning unit 5 scans the laser light L in the XY directions while maintaining this positional relationship. That is, it is necessary to make the focal point F follow the reflecting surface 10a.

このために、オートフォーカス機能を搭載して、自動的に焦点Ｆを調整するようにしてもよい。このオートフォーカス機能はレーザ光Ｌの反射光を用いてもよい。例えば、光ディスクで使用される非点収差法を用いて常に反射面１０ａに焦点Ｆを高速に追従させることができる。   For this purpose, an autofocus function may be installed to automatically adjust the focus F. The autofocus function may use reflected light of the laser light L. For example, the focal point F can always follow the reflecting surface 10a at high speed using the astigmatism method used in the optical disc.

また、反射面１０ａの複数点の高さを予め測定しておき、反射面１０ａの面の傾きを予測してレーザ光Ｌの焦点Ｆを自動的に追従させてもよい。また、レーザ光Ｌが走査されるＸＹ平面（水平面）に対して反射面１０ａが傾きを生じている場合には、反射面１０ａとＸＹ平面とが平行になるように傾き調整を行ってもよい。   Alternatively, the heights of a plurality of points on the reflecting surface 10a may be measured in advance, and the tilt of the reflecting surface 10a may be predicted to automatically follow the focal point F of the laser light L. Further, when the reflection surface 10a is inclined with respect to the XY plane (horizontal plane) scanned with the laser light L, the inclination may be adjusted so that the reflection surface 10a and the XY plane are parallel to each other. .

また、レーザ光源２から発振するレーザ光Ｌを近赤外光のパルスレーザを用いるようにしてもよい。レーザ光Ｌは近赤外光を用いるため、ダイクロイックミラー４等の光学系もそれに対応したものを用いる。また、２光子励起によって生じた蛍光に対応した蛍光フィルタ１１を用いる。これにより、顕微鏡装置１を２光子励起顕微鏡として用いることができる。   Further, the laser light L oscillated from the laser light source 2 may be a near-infrared pulse laser. Since near-infrared light is used as the laser light L, an optical system such as the dichroic mirror 4 is also used. Moreover, the fluorescence filter 11 corresponding to the fluorescence generated by the two-photon excitation is used. Thereby, the microscope apparatus 1 can be used as a two-photon excitation microscope.

２光子励起顕微鏡としているため、焦点近傍でのみ２光子励起が生じる。このため、深部観察等において光路の途中で発生する蛍光やそれによって生じる退色の影響を極めて少ないものとすることができ、分解能を高くすることができる。特に、２光子励起現象は光密度が高い領域において生じるため、図３（ａ）および（ｂ）の領域Ｆ１の頂点近傍でのみ２光子励起が生じるため、光軸方向の分解能がさらに向上する。   Since a two-photon excitation microscope is used, two-photon excitation occurs only near the focal point. For this reason, the influence of the fluorescence generated in the middle of the optical path and the fading caused thereby in the deep observation or the like can be made extremely small, and the resolution can be increased. In particular, since the two-photon excitation phenomenon occurs in a region where the light density is high, two-photon excitation occurs only in the vicinity of the apex of the region F1 in FIGS. 3A and 3B, thereby further improving the resolution in the optical axis direction.

なお、２光子励起の場合には、蛍光はレーザ光Ｌの波長λのおおよそ半分になるため、戻り光Ｒの検出時には干渉によって強め合う領域が、レーザ光Ｌの干渉によって強め合う領域以外にも生じる。ただし、往路および復路の相力の干渉の効果が乗じられるため、復路のみで生じる強め合う領域の影響は小さくなる。従って、２光子励起の場合も同様に分解能を高くすることができる。   In the case of two-photon excitation, since the fluorescence is approximately half the wavelength λ of the laser light L, the region strengthened by the interference when detecting the return light R is not limited to the region strengthened by the interference of the laser light L. Arise. However, since the effect of the interference between the outward and return paths is multiplied, the influence of the constructive area generated only on the return path is reduced. Therefore, the resolution can be increased similarly in the case of two-photon excitation.

また、レーザ光Ｌの焦点Ｆの中心を反射面１０ａに一致させなくてもよい。つまり、焦点Ｆの中心を反射面１０ａから任意の間隔だけ離間させてもよい。図４は、レーザ光Ｌの焦点Ｆの中心を反射面１０ａから「λ／４」の分だけ離間した位置となるようにした例になる。この場合には、図２のように領域Ｆ１、Ｆ２の２箇所だけではなく、図４に示すように領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３の３箇所が干渉による定在波により強度が高くなる。   Further, the center of the focal point F of the laser light L does not have to coincide with the reflecting surface 10a. That is, the center of the focal point F may be separated from the reflecting surface 10a by an arbitrary interval. FIG. 4 shows an example in which the center of the focal point F of the laser beam L is located at a position spaced apart from the reflecting surface 10a by “λ / 4”. In this case, not only the two areas F1 and F2 as shown in FIG. 2, but also the three areas F1, F2 and F3 as shown in FIG.

この場合には、焦点Ｆの中心が反射面１０ａからずれていることにより、焦点Ｆの中心が反射面１０ａと一致しているときと比較して若干の非対称性を持つ。このために、干渉により弱め合う領域についても僅かに強度を有する。図５(ａ)は、この場合のレーザ光Ｌの強度分布を示している。   In this case, since the center of the focal point F is deviated from the reflecting surface 10a, there is a slight asymmetry as compared with the case where the center of the focal point F coincides with the reflecting surface 10a. For this reason, the region weakened by interference has a slight strength. FIG. 5A shows the intensity distribution of the laser light L in this case.

ただし、戻り光Ｒについても光路差に基づく干渉を発生させている。これにより、検出部１４で検出される戻り光Ｒの強度分布は図５（ａ）の強度分布の概ね２乗になることから、図５（ｂ）のようなシャープな形になる。これにより、図３（ｂ）とほぼ同程度の強度分布を持つ戻り光Ｒを検出することができる。従って、分解能を高くすることができ、高解像度の試料Ｓの画像を得ることができる。   However, the return light R also causes interference based on the optical path difference. As a result, the intensity distribution of the return light R detected by the detection unit 14 is approximately the square of the intensity distribution of FIG. 5A, and thus has a sharp shape as shown in FIG. Thereby, it is possible to detect the return light R having an intensity distribution substantially the same as that in FIG. Therefore, the resolution can be increased and an image of the sample S with high resolution can be obtained.

また、焦点Ｆの中心を反射面１０ａから「（３／４）×λ」の位置にすることもできる。この場合には、図６に示すように、焦点Ｆは領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４の４つの領域が高い強度となる。この場合のレーザ光Ｌの強度分布は図７（ａ）のようになり、検出部１４で検出される戻り光Ｒの強度分布は同図（ｂ）のようになる。これにより、分解能を高くすることができ、高解像度の画像生成を行うことができる。   Further, the center of the focal point F can be set to a position “(3/4) × λ” from the reflecting surface 10a. In this case, as shown in FIG. 6, the focus F has high intensity in the four areas F1, F2, F3, and F4. In this case, the intensity distribution of the laser light L is as shown in FIG. 7A, and the intensity distribution of the return light R detected by the detection unit 14 is as shown in FIG. 7B. Thereby, the resolution can be increased and high-resolution image generation can be performed.

ここで、図３（ｂ）、図５（ｂ）および図７（ｂ）は、それぞれ焦点Ｆの中心を反射面１０ａに対して変化させたときの強度分布を示している。このため、Ｚ軸方向に強度が高くなる領域が異なるようになる。このうち、観察対象となるのは何れか１つの領域（例えば、領域Ｆ１）であり、それ以外の領域（例えば、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）を除去しなければならない。   Here, FIGS. 3B, 5B, and 7B show the intensity distributions when the center of the focal point F is changed with respect to the reflecting surface 10a. For this reason, the region where the strength increases in the Z-axis direction is different. Among these, any one region (for example, region F1) is to be observed, and other regions (for example, F2, F3, F4) must be removed.

領域Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４の強度はＰＳＦに基づいて所定の演算処理（デコンボルーション処理）を行うことで除去できる。この演算処理はコントローラ１５により行われる。ここで、図３（ｂ）の強度分布または図５（ｂ）の強度分布と図７（ｂ）の強度分布を用いてデコンボルーション処理を行う。   The intensities of the regions F2, F3, and F4 can be removed by performing a predetermined calculation process (deconvolution process) based on the PSF. This calculation process is performed by the controller 15. Here, the deconvolution process is performed using the intensity distribution of FIG. 3B or the intensity distribution of FIG. 5B and the intensity distribution of FIG. 7B.

つまり、反射面１０ａに対して焦点Ｆの中心を異ならせたときの戻り光Ｒを検出して、戻り光Ｒの強度分布を比較することにより対象となる領域Ｆ１のみを抽出する処理を行う。これにより、領域Ｆ１のみが抽出され、光軸方向の分解能が向上する。また、図７（ｂ）において、領域Ｆ１だけではなく、領域Ｆ２、Ｆ３またはＦ４のみを抽出するようにデコンボルーション処理を行うこともできる。この場合には、Ｚ軸方向に反射面１０ａから異なる距離の複数の断面画像を生成することができる。   That is, the return light R when the center of the focal point F is made different from the reflecting surface 10a is detected, and the intensity distribution of the return light R is compared to extract only the target region F1. Thereby, only the region F1 is extracted, and the resolution in the optical axis direction is improved. Further, in FIG. 7B, the deconvolution process can be performed so as to extract not only the region F1, but only the region F2, F3, or F4. In this case, a plurality of cross-sectional images having different distances from the reflecting surface 10a in the Z-axis direction can be generated.

次に、変形例１について説明する。図８および図９は変形例１の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１はニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置になり、レーザ光源２とスキャナユニット２０と顕微鏡３０とカメラ４０とを備えて構成している。   Next, Modification 1 will be described. 8 and 9 show a microscope apparatus 1 according to the first modification. This microscope apparatus 1 is a Nipkow disk type confocal microscope apparatus, and includes a laser light source 2, a scanner unit 20, a microscope 30, and a camera 40.

レーザ光源２が発振したレーザ光Ｌは光ファイバ２Ｆによってスキャナユニット２０にまで伝達される。スキャナユニット２０は、マイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２と回転ドラム２３とモータ２４とコリメートレンズ２５とダイクロイックミラー２６とリレーレンズ２７とを備えて構成している。   The laser light L oscillated from the laser light source 2 is transmitted to the scanner unit 20 through the optical fiber 2F. The scanner unit 20 includes a microlens disk 21, a pinhole disk 22, a rotating drum 23, a motor 24, a collimator lens 25, a dichroic mirror 26, and a relay lens 27.

マイクロレンズディスク２１は、図９に示すように４条の螺旋状パターンの複数のマイクロレンズ２１Ｍを配列した第１の回転ディスクである。ピンホールディスク２２は、マイクロレンズディスク２１のマイクロレンズ２１Ｍのパターンと同じパターンで複数のピンホール２２Ｐを配列した第２の回転ディスクである。   As shown in FIG. 9, the microlens disk 21 is a first rotating disk in which a plurality of microlenses 21M having a spiral pattern are arranged. The pinhole disk 22 is a second rotating disk in which a plurality of pinholes 22P are arranged in the same pattern as the pattern of the microlens 21M of the microlens disk 21.

マイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２との間には所定の間隔が設けられている。また、マイクロレンズディスク２１およびピンホールディスク２２の回転方向において、マイクロレンズ２１Ｍとピンホール２２Ｐとが同じ位置となるように形成している。   A predetermined gap is provided between the microlens disk 21 and the pinhole disk 22. Further, the microlens 21M and the pinhole 22P are formed at the same position in the rotation direction of the microlens disk 21 and the pinhole disk 22.

回転ドラム２３はマイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２とを一体的に回転させる。モータ２４は回転ドラム２３に回転力を付与する回転手段である。コリメートレンズ２５は光ファイバ２Ｆによって導かれたレーザ光Ｌを平行光に変換する。このレーザ光Ｌは複数のマイクロレンズ２１Ｍによって複数のピンホール２２Ｐで焦点を結ぶようになっている。   The rotating drum 23 rotates the microlens disk 21 and the pinhole disk 22 integrally. The motor 24 is a rotating unit that applies a rotational force to the rotary drum 23. The collimating lens 25 converts the laser light L guided by the optical fiber 2F into parallel light. The laser beam L is focused at a plurality of pinholes 22P by a plurality of microlenses 21M.

マイクロレンズ２１Ｍとピンホール２２Ｐとの間にはダイクロイックミラー２６が配置されている。ダイクロイックミラー２６はレーザ光源２が発振するレーザ光Ｌの波長の光を透過させ、試料Ｓの蛍光の波長の光を反射させる特性を持つ光学部品である。よって、マイクロレンズ２１Ｍからピンホール２２Ｐにレーザ光Ｌは透過する。   A dichroic mirror 26 is disposed between the microlens 21M and the pinhole 22P. The dichroic mirror 26 is an optical component that transmits light having the wavelength of the laser light L oscillated by the laser light source 2 and reflects light having the fluorescence wavelength of the sample S. Therefore, the laser light L is transmitted from the microlens 21M to the pinhole 22P.

各マイクロレンズ２１Ｍからピンホール２２Ｐに向けてレーザ光Ｌが入射する。ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌは顕微鏡３０に入射する。顕微鏡３０は結像レンズ３１と対物レンズ３２とを有して構成している。ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌは結像レンズ３１によって所定傾きの平行光に変換される。この平行光が対物レンズ３２に入射する。   Laser light L enters from each microlens 21M toward the pinhole 22P. The laser beam L that has passed through the pinhole 22P enters the microscope 30. The microscope 30 includes an imaging lens 31 and an objective lens 32. The laser light L that has passed through the pinhole 22P is converted into parallel light having a predetermined inclination by the imaging lens 31. This parallel light is incident on the objective lens 32.

対物レンズ３２に入射したレーザ光Ｌは試料搭載部１０の試料Ｓで焦点を結ぶ。そして、試料Ｓで蛍光色素が励起されて蛍光が発生する。この蛍光は戻り光Ｒとなって顕微鏡３０、そしてピンホール２２Ｐを通過してダイクロイックミラー２６で反射する。この反射した戻り光Ｒはリレーレンズ２７によってカメラ４０の撮像素子で結像をする。カメラ４０の前段には図示しない蛍光フィルタが設けられており、試料Ｓの蛍光だけが選択的にカメラ４０に結像される。   The laser beam L incident on the objective lens 32 is focused on the sample S of the sample mounting unit 10. Then, the fluorescent dye is excited by the sample S to generate fluorescence. This fluorescence becomes return light R, passes through the microscope 30 and the pinhole 22P, and is reflected by the dichroic mirror 26. The reflected return light R is imaged by the image sensor of the camera 40 by the relay lens 27. A fluorescence filter (not shown) is provided in front of the camera 40, and only the fluorescence of the sample S is selectively imaged on the camera 40.

なお、図８において、レーザ光Ｌの光路を２つ示しているが、このうち実線で示す光路と破線で示す光路とは異なるマイクロレンズ２１Ｍを通過する光であることを示している。つまり、レーザ光Ｌの光軸中心のレーザ光Ｌと光軸中心からずれたレーザ光Ｌを示している。また、図９において、顕微鏡３０は１枚のレンズとして模式的に表している。   In FIG. 8, two optical paths of the laser beam L are shown. Of these, the optical path indicated by the solid line and the optical path indicated by the broken line indicate that the light passes through the micro lens 21M. That is, the laser beam L at the center of the optical axis of the laser beam L and the laser beam L shifted from the center of the optical axis are shown. In FIG. 9, the microscope 30 is schematically represented as a single lens.

本変形例の動作について説明する。モータ２４は回転ドラム２３を回転させることにより、マイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２とが一体的に回転する。レーザ光源２からレーザ光Ｌを発振させることにより、レーザ光Ｌはマイクロレンズ２１Ｍからピンホール２２Ｐを通過する。マイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２とは一体的に回転している。これにより、レーザ光Ｌが試料搭載部１０の試料Ｓにて走査される。且つ、複数のマイクロレンズ２１Ｍおよび複数のピンホール２２Ｐを配置していることから、同時に複数の焦点Ｆが生じる。そして、試料Ｓにレーザ光Ｌの焦点が結ばれることにより、試料Ｓの蛍光色素が発光する。   The operation of this modification will be described. The motor 24 rotates the rotating drum 23 so that the microlens disk 21 and the pinhole disk 22 rotate integrally. By oscillating the laser light L from the laser light source 2, the laser light L passes through the pinhole 22P from the microlens 21M. The microlens disk 21 and the pinhole disk 22 rotate integrally. Thereby, the laser beam L is scanned by the sample S of the sample mounting unit 10. In addition, since a plurality of microlenses 21M and a plurality of pinholes 22P are arranged, a plurality of focal points F are generated simultaneously. Then, when the focus of the laser light L is focused on the sample S, the fluorescent dye of the sample S emits light.

この蛍光が戻り光Ｒとなって、カメラ４０に結像する。戻り光Ｒのうち焦点面以外の光はピンホール２２Ｐを殆ど通過できないため、カメラ４０に到達しない。これによって、カメラ４０は焦点面のみの共焦点画像を撮影することになる。レーザ光Ｌが試料Ｓにて走査されるため、カメラ４０の受光面にて戻り光Ｒが走査される。従って、焦点Ｆの情報がカメラ４０に投影されて、試料Ｓの観察を行うことができる。   This fluorescence becomes return light R and forms an image on the camera 40. Of the return light R, light other than the focal plane cannot pass through the pinhole 22P and therefore does not reach the camera 40. As a result, the camera 40 takes a confocal image of only the focal plane. Since the laser light L is scanned with the sample S, the return light R is scanned with the light receiving surface of the camera 40. Therefore, the information on the focal point F is projected on the camera 40, and the sample S can be observed.

試料搭載部１０には反射面１０ａが形成されており、前述した実施形態と同様にレーザ光Ｌを干渉させて定在波を発生させている。このために、レーザ光Ｌの焦点Ｆの領域を狭くすることができ、高い分解能を得ることができる。また、戻り光Ｒにおいても干渉を発生させているために、高い分解能を得ることができる。そして、変形例１ではニポウディスク方式の顕微鏡装置１を適用していることから、極めて高速に画像生成を行うことができるようになる。   A reflection surface 10a is formed on the sample mounting portion 10, and a standing wave is generated by causing the laser light L to interfere as in the above-described embodiment. For this reason, the area | region of the focus F of the laser beam L can be narrowed, and high resolution can be obtained. Further, since interference is generated in the return light R, a high resolution can be obtained. In the first modification, since the Niipou disc type microscope apparatus 1 is applied, image generation can be performed at a very high speed.

次に、変形例２について説明する。図１０は変形例２の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１は実施形態の顕微鏡装置１に対して新たに光分岐ユニット５０を光分岐部として追加している。この光分岐ユニット５０は光走査ユニット５とダイクロイックミラー４との間に設けている。   Next, Modification 2 will be described. FIG. 10 shows a microscope apparatus 1 according to the second modification. This microscope apparatus 1 newly adds an optical branching unit 50 as an optical branching unit to the microscope apparatus 1 of the embodiment. The optical branching unit 50 is provided between the optical scanning unit 5 and the dichroic mirror 4.

図１１は光分岐ユニット５０の構成を示している。光分岐ユニット５０はハーフミラー５１とデフォーマブルミラー５２と反射ミラー５３とハーフミラー５４とを有して構成している。レーザ光源２が発振したレーザ光Ｌはハーフミラー５１によりレーザ光Ｌ１とＬ２とに分離される。同図の実線は分離された一方のレーザ光Ｌ１（第１の照明光）を示しており、破線は他方のレーザ光Ｌ２（第２の照明光）を示している。   FIG. 11 shows the configuration of the optical branching unit 50. The optical branching unit 50 includes a half mirror 51, a deformable mirror 52, a reflection mirror 53, and a half mirror 54. The laser beam L oscillated by the laser light source 2 is separated into laser beams L1 and L2 by the half mirror 51. The solid line in the figure indicates one separated laser beam L1 (first illumination light), and the broken line indicates the other laser beam L2 (second illumination light).

ハーフミラー５１で分離されたレーザ光Ｌ２はデフォーマブルミラー５２により反射する。デフォーマブルミラー５２はそのミラー曲面が変形可能な光学部品であり、静電力、電磁力、圧電素子等で駆動される。このデフォーマブルミラー５２でレーザ光Ｌ２が反射することにより、レーザ光Ｌ２は微小な拡散光に変換される。そして、このレーザ光Ｌ２は反射ミラー５３で反射して、ハーフミラー５４に入射する。   The laser beam L2 separated by the half mirror 51 is reflected by the deformable mirror 52. The deformable mirror 52 is an optical component whose mirror curved surface can be deformed, and is driven by an electrostatic force, an electromagnetic force, a piezoelectric element, or the like. When the deformable mirror 52 reflects the laser beam L2, the laser beam L2 is converted into a minute diffused beam. The laser beam L2 is reflected by the reflection mirror 53 and enters the half mirror 54.

ハーフミラー５４において、ハーフミラー５１を透過したレーザ光Ｌ１と反射ミラー５３で反射したレーザ光Ｌ２とが光路を同じにする。なお、レーザ光Ｌ１とレーザ光Ｌ２との光路差はレーザ光Ｌの波長λの整数倍となるように光分岐ユニット５０を構成している。   In the half mirror 54, the laser light L1 transmitted through the half mirror 51 and the laser light L2 reflected by the reflection mirror 53 have the same optical path. The optical branching unit 50 is configured so that the optical path difference between the laser light L1 and the laser light L2 is an integral multiple of the wavelength λ of the laser light L.

このとき、レーザ光Ｌ１は平行光となっているが、レーザ光Ｌ２は拡散光となっている。そして、対物レンズ９により試料Ｓに焦点を結ぶ。このときに、レーザ光Ｌ１の焦点Ｆの中心が試料搭載部１０の反射面１０ａから「（７／４）×λ」となるように対物レンズ９を調整している。つまり、前述してきたものよりも、焦点Ｆの中心を反射面１０ａから離間した位置にしている。勿論、反射面１０ａに対する焦点Ｆの中心は「（７／４）×λ」には限定されない。   At this time, the laser light L1 is parallel light, but the laser light L2 is diffused light. Then, the object S is focused on the sample S. At this time, the objective lens 9 is adjusted so that the center of the focal point F of the laser beam L1 is “(7/4) × λ” from the reflecting surface 10a of the sample mounting portion 10. That is, the center of the focal point F is located farther from the reflecting surface 10a than that described above. Of course, the center of the focus F with respect to the reflective surface 10a is not limited to “(7/4) × λ”.

図１２はこの場合の焦点Ｆを示している。レーザ光Ｌ１（実線）の焦点Ｆの中心は反射面１０ａから「（７／４）×λ」の位置となっており、焦点Ｆの全体が反射面１０ａから離間している。このとき、拡散光となっているレーザ光Ｌ２はレーザ光Ｌ１の焦点Ｆよりも遠方で焦点を結ぶようになる。従って、レーザ光Ｌ２は反射面１０ａで反射した後に焦点を結ぶ。このときに、反射後のレーザ光Ｌ２の焦点がレーザ光Ｌ１の焦点Ｆと一致するように、デフォーマブルミラー５２をコントロールする。   FIG. 12 shows the focal point F in this case. The center of the focal point F of the laser beam L1 (solid line) is a position “(7/4) × λ” from the reflecting surface 10a, and the entire focal point F is separated from the reflecting surface 10a. At this time, the laser light L2 that is the diffused light is focused farther than the focal point F of the laser light L1. Accordingly, the laser beam L2 is focused after being reflected by the reflecting surface 10a. At this time, the deformable mirror 52 is controlled so that the focal point of the reflected laser beam L2 coincides with the focal point F of the laser beam L1.

従って、レーザ光Ｌ１およびＬ２の焦点Ｆは図１２に示すようになる。同図に示すように、焦点ＦではＺ軸方向に強度が高くなる領域を複数発生する（領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５）。このときの焦点Ｆにおけるレーザ光Ｌ１およびＬ２の強度分布は図１３のようになる。   Accordingly, the focal points F of the laser beams L1 and L2 are as shown in FIG. As shown in the figure, at the focal point F, a plurality of regions whose strength increases in the Z-axis direction are generated (regions F1, F2, F3, F4, and F5). The intensity distribution of the laser beams L1 and L2 at the focal point F at this time is as shown in FIG.

レーザ光Ｌが焦点Ｆを結ぶことにより、試料Ｓが蛍光して戻り光Ｒが発生する。この戻り光Ｒについても、対物レンズ９に直接的に入射する光（戻り光Ｒ１：実線の光）と反射面１０ａで反射した後に対物レンズ９に入射する光（戻り光Ｒ２：破線の光）とが発生する。そして、戻り光Ｒ１とＲ２とは光路差により干渉する。干渉した戻り光Ｒ１とＲ２とが戻り光Ｒとして、ピンホール１３を通過して検出部１４に入射して検出される。   When the laser beam L has a focal point F, the sample S fluoresces and a return beam R is generated. As for the return light R, light directly incident on the objective lens 9 (return light R1: solid line light) and light incident on the objective lens 9 after being reflected by the reflecting surface 10a (return light R2: broken line light). Occurs. The return lights R1 and R2 interfere with each other due to the optical path difference. The interfering return lights R1 and R2 are detected as the return light R after passing through the pinhole 13 and entering the detection unit 14.

このときの検出部１４で検出される戻り光Ｒの強度分布は図１３（ｂ）のようになる。つまり、図１３（ａ）の強度分布を２乗したシャープな形になる。コントローラ１５は検出部１４が検出した戻り光Ｒの光量データに対してデコンボルーション処理を行う。これにより、特定の領域の強度だけが検出される。そして、図１３に示すように、Ｚ軸方向に複数の戻り光Ｒの強度が検出される。従って、所望の領域の強度のみを抽出するデコンボルーション処理を行うことで、試料ＳにおけるＺ軸方向の複数の断面画像を得ることができる。   The intensity distribution of the return light R detected by the detection unit 14 at this time is as shown in FIG. That is, a sharp shape is obtained by squaring the intensity distribution of FIG. The controller 15 performs a deconvolution process on the light amount data of the return light R detected by the detection unit 14. Thereby, only the intensity | strength of a specific area | region is detected. Then, as shown in FIG. 13, the intensities of the plurality of return lights R are detected in the Z-axis direction. Therefore, a plurality of cross-sectional images in the Z-axis direction of the sample S can be obtained by performing a deconvolution process that extracts only the intensity of a desired region.

ここでは、焦点Ｆの中心が反射面１０ａから「（７／４）×λ」の位置となるようにしたが、焦点Ｆの中心は反射面１０ａから任意の位置に設定してもよい。焦点Ｆの中心を光軸方向にずらすことで、強度が高くなる領域の位置を変化させることができる。図１４（ａ）および図１４（ｂ）は、反射面１０ａから（７／４）×λの位置を焦点Ｆの中心としたときから、焦点Ｆの中心をＺ軸方向に変化させた場合を示している。   Here, the center of the focal point F is set to a position “(7/4) × λ” from the reflecting surface 10a, but the center of the focal point F may be set to an arbitrary position from the reflecting surface 10a. By shifting the center of the focal point F in the optical axis direction, the position of the region where the intensity becomes high can be changed. 14A and 14B show the case where the center of the focus F is changed in the Z-axis direction from the position of (7/4) × λ from the reflection surface 10a as the center of the focus F. FIG. Show.

このように、焦点Ｆの中心をＺ軸方向に変化させることで、Ｚ軸方向の複数の領域の強度が得られる。そして、検出した戻り光Ｒに基づいて、より正確なデコンボルーション処理を行うことで、試料ＳのＺ軸方向における任意の位置における断面の画像生成を行うことができる。   In this way, by changing the center of the focal point F in the Z-axis direction, the intensity of a plurality of regions in the Z-axis direction can be obtained. Then, by performing more accurate deconvolution processing based on the detected return light R, it is possible to generate a cross-sectional image at an arbitrary position in the Z-axis direction of the sample S.

このときに、光分岐ユニット５０のレーザ光Ｌ１またはＬ２の何れかの光路に位相変調素子を挿入して、一方の位相をコントロールすることができる。これにより、焦点Ｆの状態を常に図１２のようにすることができる。このときには、デコンボルーション処理を行うときのＰＳＦが一定になるため、演算処理が容易になる。なお、位相変調素子ではなく、レーザ光Ｌ１またはＬ２の何れかの光路長をコントロールすることによっても、同様の効果を得ることができる。   At this time, one phase can be controlled by inserting a phase modulation element in the optical path of either the laser beam L1 or L2 of the optical branching unit 50. Thereby, the state of the focus F can always be as shown in FIG. At this time, since the PSF when performing the deconvolution process is constant, the calculation process becomes easy. The same effect can be obtained by controlling the optical path length of either the laser light L1 or L2 instead of the phase modulation element.

従って、本変形例２では、反射面１０ａから離間した位置（「（７／４）×λ」の位置）の試料Ｓの断面画像を得ることができる。また、反射面１０ａに対して焦点Ｆの中心をＺ軸方向にすらすことで、試料ＳのＺ軸方向の任意の位置の断面画像を得ることができる。   Therefore, in the second modification, it is possible to obtain a cross-sectional image of the sample S at a position separated from the reflecting surface 10a (a position of “(7/4) × λ”). In addition, a cross-sectional image of an arbitrary position in the Z-axis direction of the sample S can be obtained by sliding the center of the focal point F in the Z-axis direction with respect to the reflecting surface 10a.

次に、変形例３について説明する。変形例３では、顕微鏡装置１を飽和励起顕微鏡として用いている。顕微鏡装置１の構成としては図１と同じである。ただし、レーザ光源２が発振するレーザ光Ｌの強度を高くすると共に、レーザ光Ｌを一定の周波数ｆで変調する。これにより、レーザ光Ｌの焦点Ｆの中心部分（頂上付近）において蛍光信号の飽和が発生する。   Next, Modification 3 will be described. In the modification 3, the microscope apparatus 1 is used as a saturation excitation microscope. The configuration of the microscope apparatus 1 is the same as that in FIG. However, the intensity of the laser light L oscillated by the laser light source 2 is increased and the laser light L is modulated at a constant frequency f. Thereby, saturation of the fluorescence signal occurs in the central portion (near the top) of the focal point F of the laser light L.

これにより、この頂上付近の領域の蛍光信号の時間変化には歪みを生じ、周波数２ｆ、３ｆの高調波を含むようになる。このような高調波を含む信号成分を検出することにより、Ｚ軸方向およびこれに直交するＸＹ方向の限定された狭小な領域でのみ蛍光の飽和を生じさせる。従って、狭小な領域でのみ蛍光を飽和させて、これを検出することで、分解能を高くすることができる。そして、反射面１０ａによりレーザ光Ｌを反射させて干渉させているため、より高解像度の画像を得ることができる。   As a result, the time change of the fluorescent signal in the region near the top is distorted and includes harmonics of frequencies 2f and 3f. By detecting a signal component including such harmonics, fluorescence saturation occurs only in a limited narrow region in the Z-axis direction and the XY direction orthogonal to the Z-axis direction. Therefore, it is possible to increase the resolution by saturating fluorescence only in a narrow region and detecting this. Since the laser beam L is reflected and interfered by the reflecting surface 10a, a higher resolution image can be obtained.

次に、変形例４について説明する。変形例４はＰＡＬＭ（Photoactivated localization microscope）という手法に顕微鏡装置１を適用している。ここでは、レーザ光源２は２色のレーザ光Ｌを発振するものを用いる。このうち、１つはスイッチング用のレーザ光Ｌであり、もう１つは蛍光取得用のレーザ光Ｌである。   Next, Modification 4 will be described. In the fourth modification, the microscope apparatus 1 is applied to a technique called PALM (Photoactivated localization microscope). Here, a laser light source 2 that oscillates laser light L of two colors is used. Among these, one is the laser beam L for switching, and the other is the laser beam L for acquiring fluorescence.

また、蛍光分子を個別に発光させるために、蛍光のＯＮ（蛍光可能な状態）とＯＦＦ（蛍光不可能な状態）とを切り替えることが可能な蛍光タンパク質（蛍光プローブ）を用いる。この蛍光プローブを蛍光がＯＦＦの状態で試料Ｓに導入する。この状態で非常に微弱なスイッチング用のレーザ光Ｌで蛍光プローブのスイッチングを行う。このときに、試料Ｓの各蛍光分子の距離が充分に離れた少数の蛍光分子だけがＯＮにされる条件下でスイッチングを行う。   Further, in order to individually emit the fluorescent molecules, a fluorescent protein (fluorescent probe) capable of switching the fluorescence ON (fluorescent state) and OFF (non-fluorescent state) is used. This fluorescent probe is introduced into the sample S with the fluorescence off. In this state, the fluorescent probe is switched with a very weak switching laser beam L. At this time, switching is performed under the condition that only a small number of fluorescent molecules whose sample S are sufficiently separated from each other are turned on.

その後に、蛍光取得用のレーザ光Ｌで計測された蛍光分子の点像分布にガウス関数によるフィッティングを行う。そして、その中心位置を分子の位置として記録する。続けて、このＯＮの状態の蛍光分子を退色させた後に、別の蛍光分子のスイッチングを行い、この方法を繰り返す。これにより、ＸＹ方向の分解能が極めて優れた画像を取得することができる。   Thereafter, fitting with a Gaussian function is performed on the point image distribution of the fluorescent molecules measured with the laser beam L for fluorescence acquisition. Then, the center position is recorded as the molecular position. Subsequently, after this fluorescent molecule in the ON state is faded, another fluorescent molecule is switched and this method is repeated. As a result, an image with extremely excellent resolution in the XY directions can be acquired.

このときに、反射面１０ａにより反射したレーザ光Ｌと対物レンズ９から直接的に入射するレーザ光Ｌとの干渉により定在波を発生させることで、Ｚ方向に高い分解能を得ている。従って、ＸＹ方向およびＺ方向において分解能を高くすることができ、３次元に高解像度の画像を得ることができる。   At this time, a high resolution in the Z direction is obtained by generating a standing wave by the interference between the laser light L reflected by the reflecting surface 10a and the laser light L directly incident from the objective lens 9. Therefore, the resolution can be increased in the XY direction and the Z direction, and a three-dimensional high resolution image can be obtained.

次に、変形例５について説明する。変形例５は顕微鏡装置１を誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡に適用している。このＳＴＥＤ顕微鏡におけるレーザ光源２は、図１５に示すように、励起用レーザ光源６０とＳＴＥＤレーザ光源６１と位相制御板６２と反射ミラー６３とダイクロイックミラー６４とを備えている。   Next, Modification 5 will be described. In Modification 5, the microscope apparatus 1 is applied to a stimulated emission suppression (STED) microscope. As shown in FIG. 15, the laser light source 2 in this STED microscope includes an excitation laser light source 60, a STED laser light source 61, a phase control plate 62, a reflection mirror 63, and a dichroic mirror 64.

励起用レーザ光源６０が発振するレーザ光Ｌは前述したものであり、試料Ｓに照射させて蛍光色素を励起させる。ＳＴＥＤレーザ光源６１が発振するＳＴＥＤレーザＬＳは、励起用レーザ光源６０が発振したレーザ光Ｌの焦点Ｆに対してリング状の強度分布を持つ誘導放出用のレーザ光になる。   The laser light L oscillated by the excitation laser light source 60 is as described above, and the sample S is irradiated to excite the fluorescent dye. The STED laser LS oscillated by the STED laser light source 61 becomes stimulated emission laser light having a ring-shaped intensity distribution with respect to the focal point F of the laser light L oscillated by the excitation laser light source 60.

ＳＴＥＤレーザＬＳは反射ミラー６３により反射して、ダイクロイックミラー６４に入射する。このダイクロイックミラー６４にはレーザ光Ｌも入射している。ダイクロイックミラー６４はレーザ光Ｌを透過して、ＳＴＥＤレーザＬＳを反射する特性を有している。これにより、レーザ光ＬとＳＴＥＤレーザＬＳとが同軸になり、同じ光路を辿る。   The STED laser LS is reflected by the reflecting mirror 63 and enters the dichroic mirror 64. Laser light L is also incident on the dichroic mirror 64. The dichroic mirror 64 has a characteristic of transmitting the laser light L and reflecting the STED laser LS. As a result, the laser beam L and the STED laser LS are coaxial and follow the same optical path.

これにより、試料Ｓにおいて、レーザ光Ｌの焦点Ｆの外周にリング状にＳＴＥＤレーザＬＳの焦点が重なる。ＳＴＥＤレーザＬＳは誘導放出の作用を発生させる。レーザ光Ｌの焦点Ｆとなる中心部分は蛍光を発生し、リング状のＳＴＥＤレーザＬＳの焦点は蛍光を発しなくなる。これにより、中心部分の領域が蛍光し、その周辺が蛍光しなくなることから、蛍光する領域を狭小にすることができる。   Thereby, in the sample S, the focus of the STED laser LS overlaps with the outer periphery of the focus F of the laser light L in a ring shape. The STED laser LS generates a stimulated emission effect. The central portion that becomes the focal point F of the laser light L generates fluorescence, and the focal point of the ring-shaped STED laser LS does not emit fluorescence. Thereby, since the area | region of the center part fluoresces and the periphery does not fluoresce, the area | region to fluoresce can be made narrow.

従って、ＸＹ方向に高い分解能を得ることができ、高解像度の画像取得を行うことができる。そして、前述したように、反射面１０ａを用いて干渉による定在波を発生させることで、Ｚ方向の分解能も高くすることができる。これにより、ＸＹ方向およびＺ方向の分解能を高くすることができ、３次元の高解像度の画像生成を行うことができる。   Therefore, high resolution can be obtained in the XY directions, and high-resolution image acquisition can be performed. As described above, the resolution in the Z direction can be increased by generating a standing wave due to interference using the reflecting surface 10a. Accordingly, the resolution in the XY direction and the Z direction can be increased, and a three-dimensional high-resolution image can be generated.

次に、変形例６について説明する。図１６に示すように、変形例６は顕微鏡装置１を倒立顕微鏡として構成したものである。試料搭載部１０は台７１と反射蓋７２とを有して構成している。台７１は内部に試料Ｓを搭載可能な皿状に構成している。また、反射蓋７２は試料Ｓの側に反射面７２ａを形成している。台７１と反射蓋７２との間には細胞１層分程度（１０μｍ程度）の間隙を設けるようにする。   Next, Modification 6 will be described. As shown in FIG. 16, in the sixth modification, the microscope apparatus 1 is configured as an inverted microscope. The sample mounting unit 10 includes a base 71 and a reflective lid 72. The base 71 is configured in a dish shape on which the sample S can be mounted. Further, the reflection lid 72 has a reflection surface 72a on the sample S side. A gap of about one cell layer (about 10 μm) is provided between the base 71 and the reflective lid 72.

顕微鏡装置１は倒立顕微鏡であり、図１の顕微鏡装置１とは試料搭載部１０の構成が重力方向において逆方向になっている。倒立顕微鏡としたときでも、反射蓋７２に反射面７２ａを形成することで、干渉による定在波を発生させることができ、高い分解能を得ることができる。これにより、高解像度の画像生成を行うことができる。   The microscope apparatus 1 is an inverted microscope, and the configuration of the sample mounting portion 10 is opposite to that of the microscope apparatus 1 of FIG. Even when an inverted microscope is used, by forming the reflection surface 72a on the reflection lid 72, a standing wave due to interference can be generated, and high resolution can be obtained. Thereby, high-resolution image generation can be performed.

１ 顕微鏡装置
２ レーザ光源
５ 光走査ユニット
９ 対物レンズ
１０ 試料搭載部
１０ 試料搭載部
１０ａ 反射面
１４ 検出部
１５ コントローラ
２０ スキャナユニット
２１ マイクロレンズディスク
２２ ピンホールディスク
２３ 回転ドラム
２４ モータ
３０ 顕微鏡
３１ 結像レンズ
３２ 対物レンズ
４０ カメラ
５０ 光分岐ユニット
５１ ハーフミラー
５２ デフォーマブルミラー
５３ 反射ミラー
５４ ハーフミラー
６０ 励起用レーザ光源
６１ レーザ光源
６２ 位相制御板
６３ 反射ミラー
６４ ダイクロイックミラー DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Microscope apparatus 2 Laser light source 5 Optical scanning unit 9 Objective lens 10 Sample mounting part 10 Sample mounting part 10a Reflecting surface 14 Detection part 15 Controller 20 Scanner unit 21 Micro lens disk 22 Pinhole disk 23 Rotary drum 24 Motor 30 Microscope 31 Imaging Lens 32 Objective lens 40 Camera 50 Optical branching unit 51 Half mirror 52 Deformable mirror 53 Reflecting mirror 54 Half mirror 60 Excitation laser light source 61 Laser light source 62 Phase control plate 63 Reflecting mirror 64 Dichroic mirror

Claims (12)

干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源と、
前記試料に前記照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、
前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させるように前記照明光を反射させる反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、
を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。 A light source that has coherence and oscillates illumination light that excites the sample;
A detection unit for detecting return light that is fluorescent when the sample is irradiated with the illumination light;
A sample mounting portion on which the sample is mounted on a reflection surface that reflects the illumination light so as to generate a standing wave within the focal range of the illumination light;
A microscope apparatus comprising: 前記焦点の範囲内の前記戻り光のみを前記検出部に通過させるピンホールを備えたこと
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。 The microscope apparatus according to claim 1, further comprising a pinhole that allows only the return light within the focal range to pass through the detection unit. 前記試料に前記照明光の焦点を結ばせる対物レンズと、
前記照明光の光軸方向に直交する平面に前記照明光を走査する走査部と、
を備えたことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。 An objective lens that focuses the illumination light on the sample;
A scanning unit that scans the illumination light in a plane perpendicular to the optical axis direction of the illumination light;
The microscope apparatus according to claim 2, further comprising: 前記光源は、近赤外光のパルスレーザを前記照明光として発振すること
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。 The microscope apparatus according to claim 3, wherein the light source oscillates a pulse laser of near infrared light as the illumination light. 複数のマイクロレンズを配列した第１の回転ディスクと、
この第１の回転ディスクと離間した位置に設けられ、前記マイクロレンズと同じパターンで複数のピンホールを配列した第２の回転ディスクと、
前記第１の回転ディスクと前記第２の回転ディスクとを一体的に回転させる回転ドラムと、
を備えたことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。 A first rotating disk in which a plurality of microlenses are arranged;
A second rotating disk provided at a position spaced from the first rotating disk and having a plurality of pinholes arranged in the same pattern as the microlens;
A rotating drum that integrally rotates the first rotating disk and the second rotating disk;
The microscope apparatus according to claim 3, further comprising: 前記反射面に対して前記焦点の位置を異ならせたときの戻り光を前記検出部が検出して、これらの戻り光を比較して強度が高くなっている１つの領域以外の領域を除去するデコンボルーション処理を行う演算部を備えたこと
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。 The detection unit detects return light when the focal position is changed with respect to the reflection surface, and compares these return lights to remove regions other than one region where the intensity is high. The microscope apparatus according to claim 3, further comprising a calculation unit that performs a deconvolution process. 前記照明光を第１の照明光と第２の照明光とに分岐して、この第２の照明光を拡散光にして前記反射面で反射させ、前記第１の照明光と反射した前記第２の照明光との焦点を一致させる光分岐部を備えたこと
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。 The illumination light is split into first illumination light and second illumination light, the second illumination light is diffused and reflected by the reflecting surface, and the first illumination light reflected by the first illumination light is reflected. The microscope apparatus according to claim 3, further comprising a light branching unit that matches a focal point with the illumination light of 2. 前記光源は、前記試料の蛍光が飽和する強度であり且つ一定の周波数で変調したレーザ光を発振すること
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。 4. The microscope apparatus according to claim 3, wherein the light source oscillates a laser beam having an intensity at which the fluorescence of the sample is saturated and modulated at a constant frequency. 前記光源は、蛍光可能な状態と不可能な状態とを切り替え可能な蛍光分子が導入された前記試料に対してスイッチング用のレーザ光を発振すること
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。 The microscope apparatus according to claim 3, wherein the light source oscillates a laser beam for switching with respect to the sample into which a fluorescent molecule capable of switching between a fluorescent state and an impossible state is introduced. 前記光源は、
前記照明光を励起用レーザ光として発振する励起用レーザ光源と、
前記励起用レーザ光の焦点の外周にリング状の焦点を結ばせるＳＴＥＤレーザを発振するＳＴＥＤレーザ光源と、
前記励起用レーザ光と前記ＳＴＥＤレーザとの光路を一致させるダイクロイックミラーと、
を備えたことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。 The light source is
An excitation laser light source that oscillates the illumination light as excitation laser light;
A STED laser light source that oscillates a STED laser that forms a ring-shaped focal point on the outer periphery of the focal point of the excitation laser beam;
A dichroic mirror that matches the optical paths of the excitation laser beam and the STED laser;
The microscope apparatus according to claim 3, further comprising: 干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源から、前記照明光の焦点の範囲内に定在波が発生するように前記照明光を反射させる反射面を形成した試料搭載部に搭載した前記試料に前記照明光を照射して、蛍光した戻り光を検出すること
を特徴とする観察方法。 A sample mounting portion having a reflection surface that reflects the illumination light so that a standing wave is generated within a focal range of the illumination light from a light source that has coherence and oscillates illumination light that excites the sample. An observation method, wherein the mounted sample is irradiated with the illumination light to detect fluorescent return light. 干渉性を有し、試料を励起させる照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察を行うときの前記試料を搭載する試料搭載機構であって、
この試料搭載機構の前記照明光が入射する側の面に前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させる反射面を形成したこと
を特徴とする試料搭載機構。 A sample mounting mechanism that mounts the sample when the observation is performed by detecting the return light that has a coherence and fluoresces when the illumination light that excites the sample is irradiated,
A sample mounting mechanism characterized in that a reflecting surface for generating a standing wave in a range of a focus of the illumination light is formed on a surface of the sample mounting mechanism on which the illumination light enters.

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