JP2012191875A - Psyllium brought to have low viscosity and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、低粘化サイリウム及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a low viscosity psyllium and a method for producing the same.
サイリウムは、オオバコの一種であるPlantago ovata Forskal等の種子外皮から得られるアラビノキシランを主体とした多糖類である。サイリウムは、β−1,4及びβ−1,3結合のキシランを主鎖とし、側鎖の構成糖はβ−D−キシロース、α−D−アラビノース、α−L−ラムノース、α−D−ガラクツロン酸からなり、ゲル形成による吸水作用、膨潤作用等の物理化学的性質を有する。また、便通改善作用、コレステロール吸収抑制作用、血糖値上昇抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性の阻害による抗炎症作用等の生理活性を有することが報告されている(特許文献1)。 Psyllium is a polysaccharide mainly composed of arabinoxylan obtained from seed hulls such as Plantago ovata Forskal, which is a kind of plantain. Psyllium has β-1,4 and β-1,3 linked xylan as the main chain, and the constituent sugars of the side chain are β-D-xylose, α-D-arabinose, α-L-rhamnose, α-D- It consists of galacturonic acid and has physicochemical properties such as water absorption and swelling due to gel formation. In addition, it has been reported to have physiological activities such as a bowel movement improving action, a cholesterol absorption inhibitory action, a blood sugar level rise inhibitory action, and an anti-inflammatory action by inhibiting hyaluronidase activity (Patent Document 1).
サイリウムは、水に溶解すると粘凋性の高いゲルを形成して水飴状となってしまうため、そのままでは液体飲料用途に用いることは困難である。そこで、サイリウムを低粘化する種々の方法が検討されている。 Psyllium, when dissolved in water, forms a highly viscous gel and forms a starch syrup, so it is difficult to use psyllium as it is for liquid beverages. Thus, various methods for reducing the viscosity of psyllium have been studied.
サイリウムの低粘化方法としては、酸やアルカリ、加熱により低粘化する方法のほか、酵素を用いる方法もいくつか提案されている。例えば、特許文献2では、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼを使用し低粘化する方法が記載されている。特許文献3では、キシラナーゼ等により低粘化することが記載されている。また、特許文献4では、プロテアーゼを用いたサイリウムの低粘化方法が記載されている。
As a method for reducing the viscosity of psyllium, in addition to a method for reducing the viscosity by acid, alkali, or heating, several methods using an enzyme have been proposed. For example,
しかしながら、サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したまま低粘化することは容易ではない。 However, it is not easy to reduce the viscosity while maintaining the physiological activity inherent in psyllium, particularly hyaluronidase inhibitory activity.
酸やアルカリ、加熱による低粘化方法では、サイリウムが低pHや高pH、高温にさらされることになり、低粘化とともに生理活性も損なわれてしまう可能性が高い。また、工業的生産の観点からも、低pHや高pH、高温といった厳しい反応条件に耐えうる製造設備が必要となり、コストアップの要因となる。 In the method of reducing the viscosity by acid, alkali, or heating, psyllium is exposed to a low pH, a high pH, and a high temperature, and there is a high possibility that physiological activity is impaired along with the decrease in viscosity. In addition, from the viewpoint of industrial production, manufacturing equipment that can withstand severe reaction conditions such as low pH, high pH, and high temperature is required, which causes an increase in cost.
一方、酵素による低粘化方法は、常温、常圧に近い温和な反応条件で処理するため、設備負担も少なく、生理活性を保持したままサイリウムを低粘化できる可能性がある。 On the other hand, the enzyme-based low viscosity method is processed under mild reaction conditions close to normal temperature and normal pressure, so there is a possibility of reducing the viscosity of psyllium while maintaining the physiological activity with less equipment burden.
しかしながら、例えば、特許文献2や特許文献3記載のペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ等による低粘化方法では、生理活性として主に便通改善効果に着目しており、その他の多様な生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性が保持されているかどうかは不明である。また、特許文献4記載のプロテアーゼを用いたサイリウムの低粘化方法でも、その生理活性への影響については開示されていない。
However, for example, the methods for reducing viscosity using pectinase, hemicellulase, xylanase, etc. described in
従って、本発明の主な目的は、サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウム、及びヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したままサイリウムを低粘化する方法を提供することにある。 Therefore, the main object of the present invention is to provide a low-viscosity psyllium that retains physiological activity inherent in psyllium, in particular, hyaluronidase inhibitory activity, and a method for reducing psyllium while retaining hyaluronidase inhibitory activity. It is in.
本発明者は、従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定の微生物由来の培養物をサイリウムに接触させることにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies in view of the problems of the prior art, the present inventor has found that the above object can be achieved by bringing a culture derived from a specific microorganism into contact with psyllium, and has completed the present invention. .
すなわち、本発明は、セルロシミクロビウム属細菌由来の培養物をサイリウムと接触させることを含む、低粘化サイリウムの製造方法に関する。 That is, the present invention relates to a method for producing low-viscosity psyllium, which comprises bringing a culture derived from a cellulosimicrobium bacterium into contact with psyllium.
セルロシミクロビウム属細菌、特に、セルロシミクロビウムsp.SY502株由来の培養物をサイリウムと接触させることにより、生理活性、特に、ヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウムを製造することができる。 Cellulosimicrobium bacteria, especially cellulosimicrobium sp. By bringing the culture derived from the SY502 strain into contact with psyllium, low-viscosity psyllium that retains physiological activity, particularly hyaluronidase inhibitory activity, can be produced.
本発明によって得られる低粘化サイリウムは、水等の溶媒に溶解した際の溶液の粘度が低いため、液体飲料として容易に摂取することができ、サイリウムが有する生理活性を保持した機能性食品素材として、広く利用することができる。 The low-viscosity psyllium obtained by the present invention has a low viscosity when dissolved in a solvent such as water, so that it can be easily ingested as a liquid beverage, and a functional food material that retains the physiological activity of psyllium. Can be widely used.
本発明では、セルロシミクロビウム属細菌由来の培養物をサイリウムと接触させることによって、サイリウムを低粘化させる。 In the present invention, psyllium is reduced in viscosity by contacting a culture derived from the genus Cellulosimicrobium with psyllium.
(1)セルロシミクロビウム属細菌由来の培養物
(1−1)セルロシミクロビウム属細菌
本発明において、サイリウムの低粘化に用いられる細菌は、セルロシミクロビウム(Cellulosimicrobium)属に属する細菌である。セルロシミクロビウム属は、2001年にSchumannらによって提唱された新属である(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2001,50,993−996)。
(1) Cellulosimicrobium-derived culture
(1-1) Bacterium belonging to the genus Cellulosimicrobium In the present invention, the bacterium used for reducing the viscosity of psyllium is a bacterium belonging to the genus Cellulosimicrobium. The genus Cellulosimicrobium is a new genus proposed by Schumann et al. In 2001 (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 50, 993-996).
本発明において用いられる細菌は、セルロシミクロビウム属に分類される細菌であればいかなる細菌でもよいが、特に好適なものとして、セルロシミクロビウムsp.SY502株(Cellulosimicrobium sp.SY502)が挙げられる。セルロシミクロビウム sp. SY502株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託番号NITE P−1054として寄託されている。 The bacterium used in the present invention may be any bacterium classified into the genus Cellulosimicrobium, but particularly preferred is Cellulosimicrobium sp. Examples include SY502 strain (Cellulosimicrobium sp. SY502). Cellulosimicrobium sp. The SY502 strain has been deposited as Deposit Number NITE P-1054 with the Patent Microorganism Deposit Center, National Institute of Technology and Evaluation.
(1−2)細菌の培養
培養条件としては、セルロシミクロビウム属に属する細菌が好適に生育する条件であれば特段限定されるものではない。
(1-2) Bacterial culture The culture conditions are not particularly limited as long as bacteria belonging to the genus Cellulosimicrobium grow favorably.
培養温度は、例えば、20℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃、さらに好ましくは30℃〜37℃で行うことができ、また、必要に応じて、培養中に温度を変更してもよい。 The culture temperature can be, for example, 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C, more preferably 30 ° C to 37 ° C, and if necessary, the temperature can be changed during the culture. Good.
培養時間も特には限定されず、例えば、5〜100時間、好ましくは10〜90時間、さらに好ましくは20〜80時間程度行えばよい。 The culture time is not particularly limited, and may be, for example, 5 to 100 hours, preferably 10 to 90 hours, more preferably about 20 to 80 hours.
培養前又は培養中の培地のpHは、セルロシミクロビウム属に属する細菌の生育に適した値であればよく、例えば5〜9、好ましくは6〜8のpHで培養することができ、必要に応じてpHの調整を行いながら培養することができる。pH調整剤としては無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いることができる。 The pH of the medium before or during the culture may be a value suitable for the growth of bacteria belonging to the genus Cellulosimicrobium, for example, it can be cultured at a pH of 5 to 9, preferably 6 to 8, Culturing can be performed while adjusting the pH as necessary. As the pH adjuster, an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like can be used.
培養方法としては、固体培養、液体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養等が挙げられる。これらの中でも液体培養法によって培養するのが好ましく、特に振盪培養又は通気攪拌培養による培養が好ましい。 Examples of the culture method include solid culture, liquid culture, stationary culture, shaking culture, and aeration and agitation culture. Among these, culture by a liquid culture method is preferable, and culture by shaking culture or aeration stirring culture is particularly preferable.
培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の1種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸ナトリウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を添加し、さらに、糖質原料、ビタミン、抗生物質、誘導剤等を添加したものが用いられる。 Examples of the medium include one or more nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, polypeptone, corn steep liquor, soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, potassium chloride, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate. Add one or more inorganic salts such as magnesium sulfate, magnesium chloride, sodium nitrate, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate, and add carbohydrate raw materials, vitamins, antibiotics, inducers, etc. Used.
また、サイリウム低粘化酵素活性を誘導するために、培地にサイリウムを添加することが好ましい。添加するサイリウムの濃度は特段限定されず、例えば、0.001〜10質量%、好ましくは0.01〜5質量%とすることができる。 Moreover, in order to induce psyllium low-viscosity enzyme activity, it is preferable to add psyllium to the medium. The concentration of psyllium to be added is not particularly limited and can be, for example, 0.001 to 10% by mass, preferably 0.01 to 5% by mass.
(1−3)培養物
本発明において、培養物とは、培養液、培養液上清、菌体、菌体懸濁液、菌体破砕液、粗酵素液及びこれらの処理物など、セルロシミクロビウム属に属する細菌を培養することによって得られるもの及びそれらに起因するものいずれをも含む。本発明において特に好ましく用いられる培養物は、培養液及び培養液上清である。
(1-3) Culture In the present invention, the culture refers to a culture solution, a culture solution supernatant, a microbial cell, a microbial cell suspension, a microbial cell disruption solution, a crude enzyme solution, and a processed product thereof. Both those obtained by culturing bacteria belonging to the genus Microbium and those resulting therefrom are included. Cultures particularly preferably used in the present invention are a culture solution and a culture solution supernatant.
「培養液」とは、細菌を、生育に好適な成分を含有する培地中に接種し、適当な培養条件下で増殖させた後に得られる溶液である。「培養液上清」とは、培養後に遠心分離やろ過などの手段によって、培養液から菌体を除去して得られる画分である。「菌体」とは、細菌そのものを意味し、完全に乾燥されたもののみならず、少量の水、緩衝液、培養液、その他液体を含有しているものも含む。「菌体懸濁液」とは、菌体を水や緩衝液、その他液体に懸濁したもの溶液を言う。「菌体破砕液」とは、細菌の菌体を、超音波処理、高圧処理、磨砕処理、衝撃破砕処理、酵素処理、凍結融解処理、低張液処理等によって、破砕して得られる菌体破砕物を含有する溶液を言う。「粗酵素液」とは、遠心分離やろ過などの手段によって、菌体破砕液から不溶物を除去して得られる画分を言う。「処理物」とは、上記の培養液、培養液上清、菌体、菌体懸濁液、菌体破砕液、粗酵素液に対して、物理的・化学的処理を施したものを言う。例えば、菌体を担体に固定化して得られる固定化菌体や、培養液上清や粗酵素液から硫安沈殿や各種クロマトグラフィーなどの操作によって得られる画分なども含まれる。 The “culture solution” is a solution obtained after inoculating bacteria in a medium containing components suitable for growth and growing them under appropriate culture conditions. The “culture medium supernatant” is a fraction obtained by removing cells from the culture medium by means such as centrifugation or filtration after culturing. “Bacteria” means bacteria themselves, and includes not only those completely dried, but also those containing a small amount of water, buffer solution, culture solution, and other liquids. “Bacterial cell suspension” refers to a solution in which cells are suspended in water, buffer solution, or other liquid. “Bacteria cell disruption liquid” refers to bacteria obtained by crushing bacterial cells by ultrasonic treatment, high pressure treatment, grinding treatment, impact crush treatment, enzyme treatment, freeze-thaw treatment, hypotonic solution treatment, etc. A solution containing crushed material. The “crude enzyme solution” refers to a fraction obtained by removing insolubles from a cell disruption solution by means such as centrifugation or filtration. “Processed product” refers to a product obtained by subjecting the above-mentioned culture solution, culture solution supernatant, cells, cell suspension, cell disruption solution, or crude enzyme solution to physical / chemical treatment. . For example, an immobilized microbial cell obtained by immobilizing microbial cells on a carrier, and a fraction obtained by an operation such as ammonium sulfate precipitation or various chromatography from a culture supernatant or a crude enzyme solution are also included.
(2)サイリウム
サイリウムは、オオバコの一種Plantago ovataの種子から得られる天然多糖である。一般には、サイリウムハスク、サイリウムシードガムとして市販されている。
(2) Psyllium Psyllium is a natural polysaccharide obtained from seeds of the plant type Plantago ovata. Generally, it is marketed as psyllium husk and psyllium seed gum.
本発明においては、いかなる粒度、グレードのものを用いることができるが、ごみ等共雑物の少ないものが好ましい。本発明では、公知の方法(例えば、特開平01−197501号公報に記載の方法)により製造することもできるし、市販されているものを使用することもできる。市販されているサイリウムとしては、例えば、ソアリュームPG200、ソアリュームPG020MR(共にMRCポリサッカライド社製)などがある。 In the present invention, particles of any particle size and grade can be used, but those having less complications such as dust are preferred. In this invention, it can manufacture by a well-known method (For example, the method as described in Unexamined-Japanese-Patent No. 01-197501), and can also use what is marketed. Examples of commercially available psyllium include Soalum PG200 and Soalum PG020MR (both manufactured by MRC Polysaccharide).
(3)サイリウムの低粘化
本発明において、培養物をサイリウムと接触させるとは、サイリウム溶液とセルロシミクロビウム属細菌由来の培養物を混合し、一定時間反応させることをいう。本発明では、サイリウムを含むサイリウム溶液に微生物の培養物を添加しても良く、逆に微生物の培養物にサイリウム又はサイリウム溶液を添加しても良い。ここでは、代表して前者の方法について述べる。
(3) Reducing the viscosity of psyllium In the present invention, bringing the culture into contact with psyllium means mixing a psyllium solution and a culture derived from a bacterium belonging to the genus Cellulomicrobium and allowing them to react for a certain period of time. In the present invention, a culture of microorganisms may be added to the psyllium solution containing psyllium, and conversely, psyllium or a psyllium solution may be added to the cultures of microorganisms. Here, the former method will be described as a representative.
サイリウム溶液中のサイリウム濃度はサイリウムが低粘化されれば限定されず、例えば、0.001〜10質量%、好ましくは0.01〜5質量%、さらに好ましくは0.1〜1質量%とすることができる。 The concentration of psyllium in the psyllium solution is not limited as long as psyllium is reduced in viscosity. For example, 0.001 to 10% by mass, preferably 0.01 to 5% by mass, and more preferably 0.1 to 1% by mass. can do.
サイリウム溶液の溶媒としては水が例示できるが、低粘化が妨げられない限り、エタノール等の有機溶媒を加えたり、緩衝作用を有する無機・有機塩類等を添加したりすることも可能である。 Water can be exemplified as the solvent of the psyllium solution, but it is possible to add an organic solvent such as ethanol or an inorganic / organic salt having a buffering action as long as the reduction in viscosity is not hindered.
用いられる緩衝液は特段限定されるものではなく、例えば、緩衝液成分濃度5〜500mM、好ましくは5〜150mM程度、pHとしては5〜9程度のものが挙げられる。緩衝作用を有する無機・有機塩類等としては、例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)、リン酸ナトリウム又はカリウム塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。 The buffer solution to be used is not particularly limited, and examples thereof include buffer component concentrations of 5 to 500 mM, preferably about 5 to 150 mM, and pH of about 5 to 9. Examples of inorganic / organic salts having a buffering action include tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris), sodium or potassium phosphate, citrate, acetate, and the like.
反応条件は、サイリウムの低粘化を達成できる条件であれば如何なる条件でもよい。反応温度は、10〜60℃、好ましくは20〜50℃、より好ましくは30〜40℃とすることができる。pHは、4〜10、好ましくは5〜9、より好ましくは6〜8とすればよい。 The reaction conditions may be any conditions as long as the viscosity of the psyllium can be reduced. The reaction temperature can be 10-60 ° C, preferably 20-50 ° C, more preferably 30-40 ° C. The pH may be 4 to 10, preferably 5 to 9, and more preferably 6 to 8.
必要に応じて、反応液を撹拌することができる。反応を効率的に進行させることができるからである。回転速度は、例えば、5〜500rpm(回転/分)、好ましくは10〜200rpm、より好ましくは20〜100rpmとすることができる。 If necessary, the reaction solution can be stirred. This is because the reaction can proceed efficiently. The rotation speed can be, for example, 5 to 500 rpm (rotation / min), preferably 10 to 200 rpm, and more preferably 20 to 100 rpm.
接触させるセルロシミクロビウム属細菌由来の培養物の量は、低粘化が達成できる量であれば限定されず、培養物中に含まれる低粘化活性その他の反応条件を考慮して任意に設定できる。例えば、培養液の上清を直接用いる場合、サイリウム溶液の0.001倍〜10倍の質量、好ましくは0.01倍〜5倍の質量、より好ましくは0.1倍〜2倍の質量とすることができる。 The amount of the cellulosimicrobium-derived culture to be contacted is not limited as long as low viscosity can be achieved, and it is arbitrary considering the low viscosity activity and other reaction conditions contained in the culture. Can be set. For example, when the culture supernatant is used directly, the mass is 0.001 to 10 times that of the psyllium solution, preferably 0.01 to 5 times the mass, more preferably 0.1 to 2 times the mass. can do.
低粘化反応を行った後は、反応を停止するために培養物に含まれる低粘化活性を消失させるための失活処理を行うことができる。失活処理は、低粘化活性を消失することができ、且つ、サイリウムの過剰な低粘化や分解が生じない処理であれば如何なる処理でもよい。例えば、加熱処理などが挙げられる。加熱処理としては、例えば50〜100℃、好ましくは60〜100℃、より好ましくは70〜100℃とすることができる。 After performing the low viscosity reaction, inactivation treatment for eliminating the low viscosity activity contained in the culture can be performed to stop the reaction. The deactivation treatment may be any treatment as long as it can eliminate the low-viscosity activity and does not cause excessive thinning or decomposition of psyllium. For example, heat treatment can be given. As heat processing, it can be set as 50-100 degreeC, for example, Preferably it is 60-100 degreeC, More preferably, it can be set at 70-100 degreeC.
また、必要に応じて、低粘化反応により得られた低粘化サイリウムを精製することができる。精製方法としては、所望の低粘化サイリウム溶液を得ることができる方法であれば如何なる方法でもよい。例えば、遠心分離やろ過、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿などの方法が挙げられる。 Moreover, the low viscosity psyllium obtained by the low viscosity reaction can be refine | purified as needed. As a purification method, any method can be used as long as a desired low-viscosity psyllium solution can be obtained. For example, methods such as centrifugation, filtration, various types of chromatography, and alcohol precipitation can be used.
遠心分離の条件は、不要不純物などが沈殿し、低粘化サイリウム含む上清を回収できる条件であれば如何なる条件でもよいが、例えば、1,000〜50,000×g、好ましくは5,000〜20,000×gとすることができる。 The conditions for the centrifugation may be any conditions as long as unnecessary impurities or the like are precipitated and the supernatant containing low-viscosity psyllium can be recovered. For example, the conditions are 1,000 to 50,000 × g, preferably 5,000. ˜20,000 × g.
ろ過は、ろ紙やろ布、膜などを用いて行うことができる。ろ紙としては、精製した綿繊維(セルロース)を主体としたもの又はガラス繊維ろ紙等が挙げられ、例えば、JIS P3801の規定による定性分析用及び定量分析用等のろ紙を用いることができる。 Filtration can be performed using filter paper, filter cloth, membrane or the like. Examples of the filter paper include purified cotton fibers (cellulose) or glass fiber filter paper. For example, filter paper for qualitative analysis and quantitative analysis according to JIS P3801 can be used.
ろ布としては、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアミド(ナイロン)、塩化ビニリデン、ビニロン、綿等の材質のろ布を用いることができる。ろ布の糸の形態としては、例えば、スパン糸(短繊維糸)、マルチフィラメント糸(長繊維糸)、モノフィラメント糸(長単繊維糸)、分割型極細繊維糸等のものを用いることができる。ろ布の組織としては、平織、綾織、二重織、フェルト、朱子織等のものを用いることができる。 As the filter cloth, a filter cloth made of polypropylene, polyester, polyamide (nylon), vinylidene chloride, vinylon, cotton or the like can be used. As the form of the filter cloth, for example, a spun yarn (short fiber yarn), a multifilament yarn (long fiber yarn), a monofilament yarn (long single fiber yarn), a split ultrafine fiber yarn, or the like can be used. . As the structure of the filter cloth, plain weave, twill, double weave, felt, satin weave, or the like can be used.
ろ紙又はろ布によってろ過を行う際、ろ過助剤を併用して行うこともできる。ろ過助剤としては、例えば、珪藻土、パーライト(真珠岩)のほか、活性炭、セルロース系ろ過助剤等が挙げられる。 When filtering with a filter paper or a filter cloth, a filter aid can be used in combination. Examples of filter aids include diatomaceous earth and pearlite (pearlite), activated carbon, and cellulose filter aids.
膜としては、精密ろ過(MF)膜や限外ろ過(UF)膜を用いることができる。MF膜の材質としては、有機系の高分子膜とアルミナなどの無機系のセラミック膜があり、有機高分子膜としてはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルフォン、ポリフッ化ビニリデンなどが用いられる。MF膜の孔径としては、例えば0.1〜0.5μm程度の孔径のものを用いることができる。UF膜の材質としては、高分子材料を用いる有機膜とセラミック膜などの無機膜があり、高分子膜としては、酢酸セルロース系、ポリアクリロニトリル系、ポリスルフォン系などが挙げられる。UF膜は目的に応じた分画分子量の膜を選択して用いることができ、例えば、1,000〜300,000程度のUF膜を使用することができる。 As the membrane, a microfiltration (MF) membrane or an ultrafiltration (UF) membrane can be used. The material of the MF film includes an organic polymer film and an inorganic ceramic film such as alumina. As the organic polymer film, polyethylene, polypropylene, polysulfone, polyvinylidene fluoride, or the like is used. As the pore size of the MF membrane, for example, a pore size of about 0.1 to 0.5 μm can be used. The material of the UF film includes an organic film using a polymer material and an inorganic film such as a ceramic film. Examples of the polymer film include cellulose acetate, polyacrylonitrile, and polysulfone. As the UF membrane, a membrane having a fractional molecular weight according to the purpose can be selected and used. For example, a UF membrane of about 1,000 to 300,000 can be used.
クロマトグラフィーとしては、所望の低粘化サイリウム溶液を得ることができる方法であればよく、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー等が挙げられる。 As the chromatography, any method that can obtain a desired low-viscosity psyllium solution may be used. For example, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, anion chromatography, etc. Can be mentioned.
アルコール沈殿に用いるアルコールとしては、エタノールやイソプロパノール等を用いることができる。アルコールの濃度は、低粘化サイリウムの沈殿を取得することができる濃度であれば如何なる濃度でもよいが、例えば、50〜99%(V/V)、好ましくは60〜99%、より好ましくは70〜99%の濃度とすればよい。必要に応じて得られたサイリウムの沈殿を同様の濃度のアルコール水溶液でリンスすることができる。得られたサイリウムの沈殿は、真空乾燥、凍結乾燥などにより乾燥することができる。 As alcohol used for alcohol precipitation, ethanol, isopropanol, or the like can be used. The concentration of the alcohol may be any concentration as long as the precipitation of low-viscosity psyllium can be obtained. For example, the concentration is 50 to 99% (V / V), preferably 60 to 99%, more preferably 70. A concentration of ˜99% may be used. If necessary, the obtained psyllium precipitate can be rinsed with an aqueous alcohol solution having a similar concentration. The obtained psyllium precipitate can be dried by vacuum drying, freeze drying or the like.
(4)低粘化サイリウム
(4−1)低粘化
本発明において、低粘化とは、サイリウム溶液の粘度を低下させることを意味する。粘度の測定方法は特には限定されない。例えば、25℃で水溶液として測定した場合に、低粘化反応を行う前(原料)のサイリウム溶液の粘度と比較して、好ましくは50%以下、より好ましくは20%以下、さらに好ましくは10%以下に粘度を低下させることを意味する。
(4) Low viscosity psyllium
(4-1) Reducing viscosity In the present invention, reducing viscosity means reducing the viscosity of the psyllium solution. The method for measuring the viscosity is not particularly limited. For example, when measured as an aqueous solution at 25 ° C., it is preferably 50% or less, more preferably 20% or less, and even more preferably 10%, compared with the viscosity of the psyllium solution before the low viscosity reaction (raw material). The following means to reduce the viscosity.
サイリウム溶液の粘度は、種々の粘度計を用いて測定することができる。粘度計の種類としては、振動式粘度計、回転式粘度計、細管式粘度計、落体式粘度計、カップ式粘度計などがある。サイリウム溶液の粘度を適切に測定できる粘度計であれば如何なる粘度計を用いてもよいが、本発明においては、回転式粘度計を好適に用いることができる。回転式粘度計には、共軸二重円筒型、単一円筒型回転式粘度計(B型粘度計)、コーンプレート型(E型粘度計)等があり、本発明においては、B型粘度計を好適に用いることができる。 The viscosity of the psyllium solution can be measured using various viscometers. Examples of the viscometer include a vibration viscometer, a rotary viscometer, a capillary viscometer, a falling body viscometer, and a cup viscometer. Any viscometer may be used as long as it can appropriately measure the viscosity of the psyllium solution, but a rotary viscometer can be preferably used in the present invention. The rotary viscometer includes a coaxial double cylinder type, a single cylinder type rotary viscometer (B type viscometer), a cone plate type (E type viscometer), etc. In the present invention, the B type viscosity is used. A meter can be used suitably.
また、本発明において、サイリウムを低粘化させる能力の強さを低粘化活性と言う。本発明における低粘化活性は、被験試料とサイリウム溶液を混合して反応液とし、所定条件下で所定時間接触(反応)させた後の粘度によって測定及び比較することができるものとする。 In the present invention, the strength of the ability to reduce the viscosity of psyllium is referred to as the activity of reducing viscosity. The low-viscosity activity in the present invention can be measured and compared by the viscosity after mixing a test sample and a psyllium solution to make a reaction solution, and contacting (reacting) for a predetermined time under a predetermined condition.
(4−2)サイズ排除クロマトグラフィー
本発明の低粘化サイリウムは、サイズ排除クロマトグラムにおいて2つの分子量ピークを有する。そのうちの1つは高分子量側のピークのピークトップ分子量が100万以上であり、もう1つは低分子側のピークのピークトップ分子量が10万以下である。高分子量側のピークの好ましいピークトップ分子量は100万〜200万程度、より好ましくは120万〜150万程度である。また、低分子量側のピークの好ましいピークトップ分子量は1000〜10万程度、より好ましくは5000〜5万程度である。
(4-2) Size Exclusion Chromatography The low viscosity psyllium of the present invention has two molecular weight peaks in the size exclusion chromatogram. One of them has a peak top molecular weight of a peak on the high molecular weight side of 1 million or more, and the other has a peak top molecular weight of a peak on the low molecular weight side of 100,000 or less. A preferred peak top molecular weight of the high molecular weight peak is about 1,000,000 to 2,000,000, more preferably about 1,200,000 to 1,500,000. Moreover, the preferable peak top molecular weight of the low molecular weight side peak is about 1,000 to 100,000, more preferably about 5,000 to 50,000.
本発明において、サイズ排除クロマトグラムとは、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、横軸に保持時間又は溶出容量を、縦軸に溶質濃度を反映する光学的シグナル(吸光度、示唆屈折率、蛍光等)強度や電気化学的シグナル強度をとったものを言う。サイズ排除クロマトグラフィーとは、多孔質充填剤を詰めたカラム中において、充填剤表面の細孔とポリマー(高分子量体)とのサイズ排除機構により物質を分離することができるクロマトグラフィーを言う。 In the present invention, the size exclusion chromatogram means the optical signal (absorbance, suggested refractive index, fluorescence, etc.) intensity reflecting the retention time or elution volume on the horizontal axis and the solute concentration on the vertical axis in size exclusion chromatography. Refers to the electrochemical signal intensity. Size exclusion chromatography refers to chromatography in which substances can be separated by a size exclusion mechanism between pores on the surface of the filler and a polymer (high molecular weight body) in a column packed with a porous filler.
サイズ排除クロマトグラフィーでは、分子サイズの大きい(高分子量の)ポリマーは多孔質充填剤の深部へは到達できないために早く溶出され、分子サイズの小さい(低分子量の)ポリマーは深部へ到達できるために遅く溶出されるため、分子サイズ(分子量)の違いによりポリマーを分離することができる。 In size exclusion chromatography, polymers with large molecular weight (high molecular weight) are not able to reach the depth of the porous packing, so they are eluted quickly, while polymers with small molecular size (low molecular weight) can reach the depth. Since it is eluted slowly, the polymer can be separated by the difference in molecular size (molecular weight).
種々のサイズ排除クロマトグラフィー用充填剤(カラム)が市販されており、本発明においては、サイリウムの分子量を適切に測定できるカラムであれば如何なるカラムをも用いることができる。例えば、Shodex OHpak SB−806M HQ(昭和電工株式会社)などを好適に用いることができる。 Various packing materials (columns) for size exclusion chromatography are commercially available. In the present invention, any column can be used as long as it can appropriately measure the molecular weight of psyllium. For example, Shodex OHpak SB-806M HQ (Showa Denko KK) can be suitably used.
サイズ排除クロマトグラフィーにおいては、分子量既知のポリマー(標準ポリマー)を用い、保持時間又は溶出容量と分子量の較正曲線を予め求めておくことで、被験ポリマーであるサイリウムの分子量を求めることができる。標準ポリマーは、被験ポリマーであるサイリウムの分子量を適切に算出できるポリマーであれば特段限定されず、特にプルラン(例えば、STD P−82、STD P−250、昭和電工株式会社)を好適に用いることができる。 In size exclusion chromatography, the molecular weight of psyllium, which is the test polymer, can be determined by using a polymer having a known molecular weight (standard polymer) and obtaining in advance a calibration curve of retention time or elution volume and molecular weight. The standard polymer is not particularly limited as long as it can appropriately calculate the molecular weight of psyllium as a test polymer, and in particular, pullulan (eg, STD P-82, STD P-250, Showa Denko KK) is preferably used. Can do.
サイズ排除クロマトグラフィーによって、数平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、z平均分子量(Mz)、ピークトップ分子量(Mp)などの平均分子量を求めることができる。本発明における低粘化サイリウムは、ピークトップ分子量によって特定することができる。 The average molecular weight such as number average molecular weight (Mn), weight average molecular weight (Mw), z average molecular weight (Mz), peak top molecular weight (Mp) can be determined by size exclusion chromatography. The low viscosity psyllium in the present invention can be specified by the peak top molecular weight.
ピークトップ分子量は、サイズ排除クロマトグラムにおける分子量ピーク(以下、単にピークとも呼ぶ)の頂点(ピークトップ)に相当する分子量として求められる。ピークトップは、サイズ排除クロマトグラム上の「山」の頂点に相当する部分であり、ピーク領域内における出力値の1階微分値が0であり2階微分値がマイナスであるデータ点ということができる。クロマトグラムにおけるピークの検出方法は任意であるが、例えば、クロマトグラムの微分値を求め、該微分値が+、−の所定レベルを超えた時点をピークの始点、終点として、始点と終点の間の部分をピークとする方法が挙げられる。 The peak top molecular weight is determined as a molecular weight corresponding to the apex (peak top) of a molecular weight peak (hereinafter also simply referred to as a peak) in a size exclusion chromatogram. The peak top is a portion corresponding to the peak of the “mountain” on the size exclusion chromatogram, and is a data point in which the first-order differential value of the output value in the peak region is 0 and the second-order differential value is negative. it can. Any method can be used to detect the peak in the chromatogram. For example, the differential value of the chromatogram is obtained, and when the differential value exceeds a predetermined level of + and −, the peak start point and end point are used, and the interval between the start point and the end point is determined. The method of peaking this part is mentioned.
なお、本発明において低粘化サイリウムを特定するためのピーク及びピークトップ分子量は、本質的にサイリウムに由来するピーク及びそのピークトップ分子量が対象であり、クロマトグラム上に出現するサイリウム以外の不純物等に由来するピーク及びそのピークトップ分子量は対象ではない。ピークがサイリウムに由来するものであるか否かは、被験試料であるサイリウム溶液のクロマトグラムと、サイリウム以外の成分が被験試料と同じ溶液のクロマトグラムとを比較することによって容易に判断することができる。 In the present invention, the peak and peak top molecular weight for specifying low-viscosity psyllium are essentially the peak derived from psyllium and the peak top molecular weight, and impurities other than psyllium appearing on the chromatogram, etc. The peak derived from and its peak top molecular weight are not the object. Whether or not the peak is derived from psyllium can be easily determined by comparing the chromatogram of the psyllium solution, which is the test sample, with the chromatogram of the same solution in which the components other than psyllium are the same as the test sample. it can.
(4−3)ヒアルロニダーゼ阻害活性
本発明においてヒアルロニダーゼ阻害活性とは、ヒアルロン酸を分解する酵素であるヒアルロニダーゼの活性を阻害する活性を言う。ヒアルロン酸は、β−D−N−アセチルグルコサミンとβ−D−グルクロン酸が交互に結合してできた直鎖状の高分子多糖であり、哺乳動物の結合組織に多量に分布するほか、ニワトリの鶏冠や連鎖球菌の夾膜などにも存在する。
(4-3) Hyaluronidase Inhibitory Activity In the present invention, hyaluronidase inhibitory activity refers to an activity that inhibits the activity of hyaluronidase, an enzyme that degrades hyaluronic acid. Hyaluronic acid is a linear macromolecular polysaccharide formed by alternately binding β-DN-acetylglucosamine and β-D-glucuronic acid, and is distributed in a large amount in mammalian connective tissue. It is also present in chicken crowns and streptococcal capsules.
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を解重合する酵素の総称であり、高等動物の***や蛇毒・肺炎菌・連鎖球菌中などに存在する。哺乳動物においては、受精の際、卵細胞表面をおおうヒアルロン酸を含む粘性ゲルを取り除いて***の侵入を助けたり、病原菌の侵入を容易にしたりすると考えられている。また、炎症時に活性化され、結合組織のマトッリクスを破壊し、炎症系組織への浸潤や血管の透過性亢進、I型アレルギーにおける肥満細胞からのヒスタミン遊離過程に介在することが知られている。 Hyaluronidase is a general term for enzymes that depolymerize hyaluronic acid, and is present in higher animal semen, snake venom, pneumoniae, and streptococci. In mammals, it is considered that during fertilization, a viscous gel containing hyaluronic acid covering the surface of an egg cell is removed to assist invasion of sperm or to facilitate invasion of pathogenic bacteria. It is also known that it is activated during inflammation, destroys the matrix of connective tissue, and mediates infiltration into inflammatory tissues, increased vascular permeability, and histamine release from mast cells in type I allergy.
ヒアルロニダーゼ阻害活性を有する物質としては、クロモグリク酸ナトリウム、トラニラストのような抗アレルギー剤、アスピリン、インドメタシンのような抗炎症薬等が知られている。 Known substances having hyaluronidase inhibitory activity include anti-allergic agents such as sodium cromoglycate and tranilast, and anti-inflammatory agents such as aspirin and indomethacin.
ヒアルロニダーゼ阻害活性は、ヒアルロニダーゼ活性測定系に被験物質を共存させた場合に、被験物質を共存させない場合と比較してヒアルロニダーゼ活性がどの程度阻害されるかを調べることによって求めることができる。ヒアルロニダーゼ活性は、例えば、ヒアルロニダーゼによってヒアルロン酸から遊離したN−アセチルグルコサミン量を、Morgan−Elson法(J.Biol.Chem.,1955,217,959−966)によって定量することにより測定できる。 Hyaluronidase inhibitory activity can be determined by examining how much hyaluronidase activity is inhibited when a test substance is allowed to coexist in a hyaluronidase activity measurement system as compared to when the test substance is not allowed to coexist. Hyaluronidase activity can be measured, for example, by quantifying the amount of N-acetylglucosamine released from hyaluronic acid by hyaluronidase by the Morgan-Elson method (J. Biol. Chem., 1955, 217, 959-966).
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[実施例1:セルロシミクロビウム属細菌由来培養物の調製とサイリウム低粘化活性の確認]
セルロシミクロビウムsp.SY502株(Cellulosimicrobium sp.SY502;以下、「SY502株」という。)を次のように培養した。
[Example 1: Preparation of cellulosimicrobium-derived culture and confirmation of psyllium-thinning activity]
Cellulosimicrobium sp. The SY502 strain (Cellulosimicrobium sp. SY502; hereinafter referred to as “SY502 strain”) was cultured as follows.
−80℃で保存していたSY502株のグリセロールストック0.2mLを、500mL容三角フラスコ中に調製した100mLの前培養培地(培地1Lあたり、硝酸ナトリウム1g、リン酸水素二カリウム0.1g、硫酸マグネシウム七水和物0.5g、塩化カリウム0.5g、硫酸第二鉄七水和物0.01g、酵母エキス0.5g、ポリペプトン細粒2g、サイリウム(ソアリューム;MRCポリサッカライド株式会社製)0.5gを含み、水酸化ナトリウム水溶液でpH7に調製した後、オートクレーブ滅菌(121℃、20分間)したもの)に植菌し、温度30℃、回転数200rpmで72時間振とう培養を行った。 Glycerol stock 0.2 mL of SY502 strain stored at −80 ° C. was prepared in a 100 mL pre-culture medium prepared in a 500 mL Erlenmeyer flask (1 g of sodium nitrate, 0.1 g of dipotassium hydrogen phosphate per 1 L of medium, sulfuric acid Magnesium heptahydrate 0.5 g, potassium chloride 0.5 g, ferric sulfate heptahydrate 0.01 g, yeast extract 0.5 g, polypeptone fine granules 2 g, psyllium (Soarium; manufactured by MRC Polysaccharide Co., Ltd.) 0 0.5 g and adjusted to pH 7 with an aqueous sodium hydroxide solution, inoculated into autoclave sterilized (121 ° C., 20 minutes), and cultured with shaking at a temperature of 30 ° C. and a rotation speed of 200 rpm for 72 hours.
得られた前培養液25mLを、3L容ミニジャーファーメンター中に調製した3系列の2.5Lの本培養培地(培地1Lあたり、硝酸ナトリウム1g、リン酸水素二カリウム0.1g、硫酸マグネシウム七水和物0.5g、塩化カリウム0.5g、硫酸第二鉄七水和物0.01g、酵母エキス0.5g、ポリペプトン細粒2g、サイリウム15g、プルロニックL−61(株式会社ADEKA製)0.2gを含み、水酸化ナトリウム水溶液でpH6、7、8にそれぞれ調製した後、オートクレーブ滅菌(121℃、20分間)したもの)に植菌し、温度30℃、回転数200rpm、pH制御値6、7又は8(12.5質量%水酸化ナトリウム水溶液及び12質量%硫酸水溶液で制御)、通気量1.25L/分(26時間後0.6L/分に変更)、圧力は大気圧にて通気撹拌培養を行った。
25 mL of the obtained preculture solution was added to 3 L of 2.5 L main culture medium (1 g of sodium nitrate, 0.1 g of dipotassium hydrogen phosphate, 7 mg of magnesium sulfate per liter of the medium) prepared in a 3 L mini jar fermenter. Hydrate 0.5g, potassium chloride 0.5g, ferric sulfate heptahydrate 0.01g, yeast extract 0.5g, polypeptone fine granules 2g, psyllium 15g, Pluronic L-61 (manufactured by ADEKA Corporation) 0 .2g, prepared to pH 6, 7 and 8 with aqueous sodium hydroxide solution and then inoculated into autoclave sterilized (121 ° C, 20 minutes),
培養48時間後又は72時間後に、菌濃度を反映するOD660値(波長660nmにおける濁度)を測定した。また、培養液の一部(40mL)を遠心分離(7,500×g、20分間)に供し、得られた上清を「培養液上清」とした。 After culturing 48 hours or 72 hours, the OD660 value (turbidity at a wavelength of 660 nm) reflecting the bacterial concentration was measured. Moreover, a part (40 mL) of the culture solution was subjected to centrifugation (7,500 × g, 20 minutes), and the resulting supernatant was designated as “culture solution supernatant”.
得られた各培養液上清を用いて、次のように低粘化活性を測定した。サイリウム溶液(サイリウム1.2gを20mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液(pH8)に加え、オートクレーブ(121℃、20分間)により溶解したもの)30mLと、各培養液上清30mL又は対照として蒸留水30mLを混合し、温度37℃、回転数160rpmで24時間(蒸留水の場合は96時間)は反応した後、B型粘度計により粘度を測定した。粘度は、B型粘度計(東京計器株式会社)を用い、温度25℃において測定した。測定したOD660値及び反応液粘度を表1に示す。 Using each of the obtained culture supernatants, the low-viscosity activity was measured as follows. 30 mL of psyllium solution (1.2 g of psyllium dissolved in 20 mM KH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 buffer (pH 8) and dissolved by autoclave (121 ° C., 20 minutes)) and 30 mL of each culture supernatant or control Then, 30 mL of distilled water was mixed and reacted at a temperature of 37 ° C. and a rotation speed of 160 rpm for 24 hours (96 hours in the case of distilled water), and then the viscosity was measured with a B-type viscometer. The viscosity was measured at a temperature of 25 ° C. using a B-type viscometer (Tokyo Keiki Co., Ltd.). Table 1 shows the measured OD660 values and reaction liquid viscosity.
本培養時のpHがpH6、7及び8のいずれであってもSY502株は良好に生育した。また、いずれの培養液上清を用いた場合でも、対象である蒸留水を用いた場合と比較して、反応液の粘度は大きく低下した。従って、これらの培養液上清にサイリウム低粘化活性が含まれることが確認された。 The SY502 strain grew well even if the pH during the main culture was any of pH 6, 7, and 8. Moreover, even when any culture supernatant was used, the viscosity of the reaction solution was greatly reduced as compared with the case where the target distilled water was used. Therefore, it was confirmed that these culture supernatants contain psyllium-lowering activity.
実施例1で得られたSY502株培養液上清(本培養時pH7)をサイリウム溶液と接触させて低粘化反応を行った。
The SY502 strain culture supernatant obtained in Example 1 (pH 7 during main culture) was brought into contact with a psyllium solution to perform a low viscosity reaction.
サイリウム溶液(サイリウム10gを25mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液(pH7)500mLに加え、オートクレーブ(121℃、20分間)したもの)500mLと、SY502株培養液上清(本培養時pH7)500mLを混合し、温度37℃、pH制御値7(12.5質量%水酸化ナトリウム水溶液及び12質量%硫酸水溶液で制御)、回転数100rpmで2日間反応させ、反応液(=「SY502株培養液上清処理サイリウム」)の粘度を測定した。 500 mL of psyllium solution (10 g of psyllium added to 500 mL of 25 mM KH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 buffer (pH 7) and autoclaved (121 ° C., 20 minutes)) and SY502 strain culture supernatant (pH 7 during main culture) ) 500 mL was mixed, reacted at a temperature of 37 ° C., pH control value 7 (controlled with 12.5 mass% sodium hydroxide aqueous solution and 12 mass% sulfuric acid aqueous solution), rotation speed of 100 rpm for 2 days, and the reaction solution (= “SY502 strain” The viscosity of the culture supernatant treated psyllium ") was measured.
結果を表2に示す。粘度は40mPa・sであり、反応液の粘度が大きく低下していることが確認された。 The results are shown in Table 2. The viscosity was 40 mPa · s, and it was confirmed that the viscosity of the reaction solution was greatly reduced.
[比較例1:蒸留水による低粘化反応]
サイリウム溶液(サイリウム1gを蒸留水50mLに加え、オートクレーブ(121℃、20分間)したもの)50mLと、蒸留水50mLを混合し、温度37℃で4日間反応させ、反応液(=「蒸留水処理サイリウム」)の粘度を測定した。
[Comparative Example 1: Reducing viscosity with distilled water]
50 mL of psyllium solution (1 g of psyllium added to 50 mL of distilled water and autoclave (121 ° C., 20 minutes)) and 50 mL of distilled water are mixed and reacted at a temperature of 37 ° C. for 4 days. The viscosity of psyllium ") was measured.
結果を表2に併せて示す。蒸留水処理サイリウムの粘度は5700mPa・sであり、前述したSY502株培養液上清処理サイリウム反応液と比較すると、非常に高い粘度であることが確認された。 The results are also shown in Table 2. The viscosity of the distilled water-treated psyllium was 5700 mPa · s, which was confirmed to be very high compared to the SY502 strain culture supernatant-treated psyllium reaction solution described above.
[比較例2:塩酸による低粘化反応]
サイリウム溶液(サイリウム1g、を蒸留水100mLに加え、オートクレーブ(121℃、20分間)したもの)100mLに、2N塩酸0.25mLを添加し(添加後pH約2.7)、温度80℃で30分間反応させた後、反応液(=「塩酸処理サイリウム」)の粘度を測定した。
[Comparative Example 2: Reducing viscosity with hydrochloric acid]
To 100 mL of a psyllium solution (1 g of psyllium added to 100 mL of distilled water and autoclaved (121 ° C., 20 minutes)) is added 0.25 mL of 2N hydrochloric acid (pH about 2.7 after the addition), and the temperature is 30 ° C. After reacting for a minute, the viscosity of the reaction solution (= “hydrochloric acid-treated psyllium”) was measured.
結果を表2に併せて示す。塩酸処理サイリウムの粘度は8mPa・sであり、反応液の粘度が大きく低下していることが確認された。 The results are also shown in Table 2. The viscosity of the hydrochloric acid-treated psyllium was 8 mPa · s, and it was confirmed that the viscosity of the reaction solution was greatly reduced.
[比較例3:Novozyme188による低粘化反応]
サイリウム溶液(サイリウム10gを25mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液1000mLに加え、オートクレーブ(121℃、20分間)1000mLに、Novozyme188(ノボザイム社製)溶液5mLを添加し、温度40℃、pH制御値7(12.5質量%水酸化ナトリウム水溶液及び12質量%硫酸水溶液で制御)、回転数100rpmで7日間反応させ、反応液(=「Novozyme188処理サイリウム」)の粘度を測定した。
[Comparative Example 3: Low viscosity reaction by Novozyme 188]
Psyllium solution (10 g of psyllium is added to 1000 mL of 25 mM KH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 buffer, 5 mL of Novozyme 188 (manufactured by Novozyme) is added to 1000 mL of autoclave (121 ° C., 20 minutes), temperature 40 ° C., pH The reaction was carried out at a control value of 7 (controlled with a 12.5 mass% aqueous sodium hydroxide solution and a 12 mass% sulfuric acid aqueous solution) at a rotational speed of 100 rpm for 7 days, and the viscosity of the reaction solution (= “Novozyme 188 treated psyllium”) was measured.
結果を表2に併せて示す。Novozyme188処理サイリウムの粘度は11mPa・sであり、反応液の粘度が大きく低下していることが確認された。 The results are also shown in Table 2. The viscosity of Novozyme 188 treated psyllium was 11 mPa · s, and it was confirmed that the viscosity of the reaction solution was greatly reduced.
実施例2の反応液を80℃で40分加熱処理を行い、低粘化活性を消失させた。遠心分離(7,500×g、20分間)を行い、得られた上清の一部を用いて、SY502株培養液上清処理サイリウムの分子量をサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。プルラン(STD P−82及びSTD P−250;昭和電工株式会社製)を標準ポリマーに用いて較正曲線を作成した。分析条件を以下に示す。
The reaction solution of Example 2 was heat-treated at 80 ° C. for 40 minutes to eliminate the low-viscosity activity. Centrifugation (7,500 × g, 20 minutes) was performed, and the molecular weight of SY502 strain culture supernatant-treated psyllium was measured by size exclusion chromatography using a part of the obtained supernatant. A calibration curve was prepared using pullulan (STD P-82 and STD P-250; Showa Denko KK) as a standard polymer. The analysis conditions are shown below.
分析カラム :Shodex OHpak SB−806M HQ 8mm×300mm(昭和電工株式会社)
ガードカラム:Shodex OHpak SB−G 4.6mm×100mm(昭和電工株式会社)
流速 :1mL/分
移動相 :50mM硫酸ナトリウム水溶液
検出 :示唆屈折率
カラム温度 :40℃
サンプル濃度:約0.25mg/mL
注入量 :20μL。
Analytical column: Shodex OHpak SB-806M HQ 8 mm x 300 mm (Showa Denko KK)
Guard column: Shodex OHpak SB-G 4.6 mm × 100 mm (Showa Denko KK)
Flow rate: 1 mL / min Mobile phase: 50 mM aqueous sodium sulfate detection: Suggested refractive index Column temperature: 40 ° C.
Sample concentration: about 0.25 mg / mL
Injection volume: 20 μL.
SY502株培養液上清処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを図1に、算出されたピークトップ分子量を表3に示す。 The size exclusion chromatogram of the SY502 strain culture supernatant-treated psyllium is shown in FIG. 1, and the calculated peak top molecular weight is shown in Table 3.
後述する蒸留水処理サイリウム(比較例4;図2)及び塩酸処理(比較例5;図3)のクロマトグラムとは異なり、SY502株培養液上清処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムは、明確に分離された2つの分子量ピークを示した。高分子量側のピークのピークトップ分子量は約140万、低分子側のピークのピークトップ分子量は約7500であった。 Unlike the chromatogram of distilled water-treated psyllium (Comparative Example 4; FIG. 2) and hydrochloric acid treatment (Comparative Example 5; FIG. 3) described later, the size exclusion chromatogram of the SY502 strain culture supernatant treated psyllium is clearly separated. Two molecular weight peaks observed. The peak top molecular weight of the high molecular weight peak was about 1.4 million, and the peak top molecular weight of the low molecular side peak was about 7500.
比較例1で得られた反応液の一部を用いて、蒸留水処理サイリウムの分子量を実施例3と同様の分析条件により測定した。蒸留水処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを図2に、算出されたピークトップ分子量を表3に併せて示す。
Using a part of the reaction solution obtained in Comparative Example 1, the molecular weight of distilled water-treated psyllium was measured under the same analysis conditions as in Example 3. The size exclusion chromatogram of distilled water-treated psyllium is shown in FIG. 2, and the calculated peak top molecular weight is also shown in Table 3.
実施例3のSY502株培養液上清処理サイリウムのクロマトグラムとは異なり、蒸留水処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムは、近接した2つの分子量ピークを示した。高分子量側のピークのピークトップ分子量は約160万、低分子側のピークのピークトップ分子量は約20万であった。 Unlike the chromatogram of the SY502 strain culture supernatant-treated psyllium of Example 3, the size exclusion chromatogram of the distilled water-treated psyllium showed two adjacent molecular weight peaks. The peak top molecular weight of the peak on the high molecular weight side was about 1.6 million, and the peak top molecular weight of the peak on the low molecular weight side was about 200,000.
[比較例5: 塩酸処理サイリウムの分子量測定]
比較例2の反応液を水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH6に調整した後、その一部を用いて、塩酸処理サイリウムの分子量を実施例3と同様の分析条件により測定した。塩酸処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを図3に、算出されたピークトップ分子量を表3に併せて示す。
[Comparative Example 5: Molecular weight measurement of hydrochloric acid-treated psyllium]
After adjusting the reaction solution of Comparative Example 2 to pH 6 using an aqueous sodium hydroxide solution, the molecular weight of hydrochloric acid-treated psyllium was measured under the same analytical conditions as in Example 3 using a part of the reaction solution. FIG. 3 shows the size exclusion chromatogram of the hydrochloric acid-treated psyllium, and Table 3 shows the calculated peak top molecular weight.
実施例3のSY502株培養液上清処理サイリウムのクロマトグラムとは異なり、また、比較例4の蒸留水処理サイリウムのクロマトグラムと同様に、塩酸処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムも、近接した2つの分子量ピークを示した。高分子量側のピークのピークトップ分子量は約90万、低分子側のピークのピークトップ分子量は約13万であった。 Unlike the chromatogram of the SY502 strain culture supernatant treated psyllium of Example 3, and the chromatogram of the distilled water-treated psyllium of Comparative Example 4, the size-exclusion chromatogram of the psyllium treated with hydrochloric acid is also two adjacent chromatograms. A molecular weight peak was shown. The peak top molecular weight of the high molecular weight peak was about 900,000, and the peak top molecular weight of the low molecular weight peak was about 130,000.
[実施例4:SY502株培養液上清処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定]
実施例3の遠心上清をメンブレンフィルター(ADVANTEC、孔径0.45μm、材質セルロースアセテート)を用いて0.2MPaにて加圧ろ過を行った。得られたろ液を限外ろ過膜(MILLIPORE、分画分子量1万、材質再生セルロース)を用いて0.15MPaにて加圧ろ過を行い、限外ろ過膜上に濃縮された溶液を回収した。
[Example 4: Measurement of hyaluronidase inhibitory activity of SY502 strain culture supernatant treated psyllium]
The centrifugal supernatant of Example 3 was subjected to pressure filtration at 0.2 MPa using a membrane filter (ADVANTEC, pore diameter 0.45 μm, material cellulose acetate). The obtained filtrate was subjected to pressure filtration at 0.15 MPa using an ultrafiltration membrane (MILLIPORE, fractional molecular weight 10,000, material regenerated cellulose), and the solution concentrated on the ultrafiltration membrane was recovered.
回収した溶液10mLにイオン交換樹脂(AG501−8X、バイオラッド・ラボラトリーズ株式会社)0.5gを添加し、25℃で一晩振とうし、脱塩を行った。得られた溶液を凍結させた後、凍結乾燥を行った。 To 10 mL of the collected solution, 0.5 g of ion exchange resin (AG501-8X, Bio-Rad Laboratories, Inc.) was added, and the mixture was shaken overnight at 25 ° C. for desalting. The resulting solution was frozen and then lyophilized.
得られた乾燥品を用いて、SY502株培養液上清処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、以下のようにして測定した。凍結乾燥したSY502株培養液上清処理サイリウムを0.1M酢酸バッファー(pH3.5、以下、酢酸バッファーという)に終濃度0.08〜0.3g/Lとなるよう溶解し、サイリウム溶液とした。 Using the obtained dried product, the hyaluronidase inhibitory activity of SY502 strain culture supernatant-treated psyllium was measured as follows. Lyophilized SY502 strain culture supernatant treated psyllium was dissolved in 0.1 M acetic acid buffer (pH 3.5, hereinafter referred to as acetic acid buffer) to a final concentration of 0.08 to 0.3 g / L to prepare a psyllium solution. .
試験管中にサイリウム溶液を0.2mL取り、ヒアルロンニダーゼ溶液(酢酸バッファー中に0.7g/Lの濃度でヒアルロニダーゼ(from bovine testis;タイプIV−S、シグマ社製)を含有)0.1mLを添加して、37℃で20分間インキュベートした。Compound48/80溶液(酢酸バッファー中に0.1g/Lの濃度でCompound48/80(シグマ社製)を含有)0.2mLを添加し、さらに37℃で20分間インキュベートした。 0.2 mL of psyllium solution is taken in a test tube, and 0.1 mL of hyaluronidase solution (containing hyaluronidase (from bovine testis; type IV-S, Sigma) at a concentration of 0.7 g / L in an acetate buffer) And incubated at 37 ° C. for 20 minutes. Compound 48/80 solution (compound 48/80 (manufactured by Sigma) at a concentration of 0.1 g / L in acetate buffer) 0.2 mL was added, and further incubated at 37 ° C. for 20 minutes.
ヒアルロン酸カリウム溶液(ヒアルロン酸カリウム(和光純薬工業(株)製)を酢酸バッファーに溶解し、最終濃度を0.4mg/mLに調製したもの)0.5mLを添加し、37℃で40分間反応させた。0.4M水酸化ナトリウム水溶液を0.2mL添加して反応を停止させた後、氷冷し、ホウ酸溶液(ホウ酸4.95gに水50mLを加え、1N水酸化ナトリウム溶液でpH=9.1にし、水を加えて100mLに調製したもの)0.2mLを添加した。沸騰水中で3分間加熱した後、DMAB溶液(10N塩酸12.5mLと酢酸87.5mLの混液にp−ジメチルアミノベンズアルデヒド(和光純薬工業(株)製)を10g溶解し、使用直前に酢酸で10倍に希釈したもの)0.2mLを添加し、37℃で20分間インキュベートした後、波長585nmにおける吸光度(Abs585)を測定した。 0.5 mL of potassium hyaluronate solution (potassium hyaluronate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in acetic acid buffer and adjusted to a final concentration of 0.4 mg / mL) was added, and the mixture was added at 37 ° C. for 40 minutes. Reacted. The reaction was stopped by adding 0.2 mL of 0.4 M sodium hydroxide aqueous solution, and then ice-cooled, boric acid solution (50 mL of water was added to 4.95 g of boric acid, pH = 9. 1 with 1N sodium hydroxide solution). 1 and adjusted to 100 mL by adding water) 0.2 mL was added. After heating in boiling water for 3 minutes, dissolve 10 g of DMAB solution (p-dimethylaminobenzaldehyde (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a mixture of 12.5 mL of 10N hydrochloric acid and 87.5 mL of acetic acid with acetic acid immediately before use. After adding 0.2 mL) and incubating at 37 ° C. for 20 minutes, absorbance (Abs585) at a wavelength of 585 nm was measured.
被験試料を添加した系におけるAbs585をAbs585(T)、被験試料の変わりに酢酸バッファーを添加した系におけるAbs585値をAbs585(C)とし、次の式によりヒアルロニダーゼ活性阻害率IR(%)を算出した。
IR(%)={Abs585(C)−Abs585(T)/Abs585(C)}×100。
Abs585 in the system to which the test sample was added was Abs585 (T), Abs585 value in the system to which acetate buffer was added instead of the test sample was Abs585 (C), and the hyaluronidase activity inhibition rate IR (%) was calculated by the following formula: .
IR (%) = {Abs585 (C) −Abs585 (T) / Abs585 (C)} × 100.
反応系中の被験試料濃度(%)を横軸に、IR(%)を縦軸にとり、IR=50(%)となるような被験試料濃度をIC50(%)とし、ヒアルロニダーゼ阻害活性の指標とした。IC50(%)値を表4に示す。 The test sample concentration (%) in the reaction system is plotted on the horizontal axis, IR (%) is plotted on the vertical axis, and the test sample concentration such that IR = 50 (%) is IC50 (%), and an index of hyaluronidase inhibitory activity did. IC50 (%) values are shown in Table 4.
SY502株培養液上清処理サイリウムのIC50(%)値は0.00582であり、後述する蒸留水処理サイリウム、塩酸処理サイリウム、Novozyme188処理サイリウムと比較して、明らかに高いヒアルロニダーゼ阻害活性を有していることが確認された。 The SY502 strain culture supernatant-treated psyllium has an IC50 (%) value of 0.00582, which clearly has higher hyaluronidase inhibitory activity compared to distilled water-treated psyllium, hydrochloric acid-treated psyllium, and Novozyme 188-treated psyllium described below. It was confirmed that
比較例1の反応液を凍結乾燥し、得られた乾燥品を用いて、蒸留水処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、実施例4と同様の方法により測定した。IC50(%)値を表4に併せて示す。
The reaction solution of Comparative Example 1 was freeze-dried, and the hyaluronidase inhibitory activity of distilled water-treated psyllium was measured by the same method as in Example 4 using the obtained dried product. IC50 (%) values are also shown in Table 4.
蒸留水処理サイリウムのIC50(%)値は0.00920であり、SY502株培養液上清処理サイリウムと比較すると、ヒアルロニダーゼ阻害活性は低いことが確認された。 The IC50 (%) value of distilled water-treated psyllium was 0.00920, and it was confirmed that the hyaluronidase inhibitory activity was low as compared with SY502 strain culture supernatant-treated psyllium.
[比較例7:塩酸処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定]
比較例5で得られた中和反応液について、実施例4と同様に分画、精製及び乾燥を行った。得られた乾燥品を用いて、塩酸処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、実施例4と同様の方法により測定した。IC50(%)値を表4に併せて示す。
[Comparative Example 7: Measurement of hyaluronidase inhibitory activity of psyllium treated with hydrochloric acid]
The neutralization reaction solution obtained in Comparative Example 5 was fractionated, purified and dried in the same manner as in Example 4. Using the obtained dried product, the hyaluronidase inhibitory activity of hydrochloric acid-treated psyllium was measured by the same method as in Example 4. IC50 (%) values are also shown in Table 4.
塩酸処理サイリウムのIC50(%)値は0.00982であり、SY502株培養液上清処理サイリウムと比較すると、ヒアルロニダーゼ阻害活性は低いことが確認された。 The IC50 (%) value of psyllium treated with hydrochloric acid was 0.00982, and it was confirmed that the hyaluronidase inhibitory activity was low as compared with psyllium treated with SY502 strain culture supernatant.
[比較例8:Novozyme188処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定]
比較例3で得られた反応液について、実施例3と同様に、加熱処理及び遠心分離を行った後、実施例4と同様に分画、精製及び乾燥を行った。得られた乾燥品を用いて、Novozyme188処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、実施例4と同様の方法により測定した。IC50(%)値を表4に併せて示す。
[Comparative Example 8: Measurement of hyaluronidase inhibitory activity of Novozyme 188-treated psyllium]
The reaction solution obtained in Comparative Example 3 was subjected to heat treatment and centrifugation as in Example 3, followed by fractionation, purification and drying in the same manner as in Example 4. Using the resulting dried product, the hyaluronidase inhibitory activity of Novozyme 188-treated psyllium was measured by the same method as in Example 4. IC50 (%) values are also shown in Table 4.
Novozyme188処理サイリウムのIC50(%)値は0.00912であり、SY502株培養液上清処理サイリウムと比較すると、ヒアルロニダーゼ阻害活性は低いことが確認された。 The IC50 (%) value of Novozyme 188-treated psyllium was 0.00912, and it was confirmed that the hyaluronidase inhibitory activity was low as compared with SY502 strain culture supernatant-treated psyllium.
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