JP2012175911A - Manganese peroxidase variant, and method for pretreating lignocellulosic biomass using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、マンガンペルオキシダーゼ変異体及びそれを用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理方法に関する。 The present invention relates to a manganese peroxidase mutant and a pretreatment method for lignocellulosic biomass using the same.
近年、自動車用燃料として、ガソリン−エタノール混合燃料を用いることが検討されている。前記エタノールとしては、植物性物質の発酵、蒸留により得たバイオエタノールを用いると、土壌管理を厳密に行うことにより所謂カーボンニュートラル効果を得ることができ、二酸化炭素の排出量を低減して地球温暖化の防止に寄与できるものと考えられている。 In recent years, it has been studied to use a gasoline-ethanol mixed fuel as a fuel for automobiles. When bioethanol obtained by fermentation and distillation of plant substances is used as the ethanol, a so-called carbon neutral effect can be obtained by strict soil management, reducing carbon dioxide emissions and reducing global warming. It is thought that it can contribute to the prevention of transformation.
しかし、前記植物性物質として、例えばサトウキビ、トウモロコシ等の農作物を用いると、該農作物がエタノールの原料として大量に消費されることにより、食料又は飼料としての供給量が減少するという問題がある。そこで、前記植物性物質として、食用または飼料用とならないリグノセルロース系バイオマスを用いてエタノールを製造する技術が検討されている。 However, when a crop such as sugar cane or corn is used as the plant substance, there is a problem that the supply amount as food or feed decreases because the crop is consumed in large quantities as a raw material for ethanol. Then, the technique which manufactures ethanol using the lignocellulosic biomass which does not become food or feed as said plant substance is examined.
前記リグノセルロース系バイオマスは、セルロースを含んでおり、該セルロースを酵素糖化によりグルコースに分解し、得られたグルコースを発酵させてバイオエタノールを得ることができる。ところが、前記リグノセルロースは、セルロースの他にヘミセルロース及びリグニンを主な構成成分としており、通常該セルロース及び該ヘミセルロースは、該リグニンと強固に結合することにより保護されている。従って、前記リグノセルロースはそのままでは前記酵素糖化反応が阻害されることとなり、予め前記リグニンを除去しておくことが望ましい。 The lignocellulosic biomass contains cellulose. The cellulose can be decomposed into glucose by enzymatic saccharification, and the obtained glucose can be fermented to obtain bioethanol. However, the lignocellulose contains hemicellulose and lignin as main components in addition to cellulose, and usually the cellulose and the hemicellulose are protected by being firmly bonded to the lignin. Accordingly, if the lignocellulose is used as it is, the enzymatic saccharification reaction is inhibited, and it is desirable to remove the lignin in advance.
前記リグニンを除去する方法として、微生物または微生物が産生する酵素を用いることが考えられる。前記リグニンを分解する微生物としては白色腐朽菌が知られており、白色腐朽菌はリグニン分解酵素であるマンガンペルオキシダーゼを産生することが知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。 As a method for removing the lignin, it is conceivable to use a microorganism or an enzyme produced by the microorganism. A white-rot fungus is known as a microorganism that degrades the lignin, and the white-rot fungus is known to produce manganese peroxidase, which is a lignin-degrading enzyme (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
前記マンガンペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下にＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化する。そして、Ｍｎ（III）と有機酸との反応により形成され錯体が、前記リグニンの分解に関与しているものと考えられている（例えば、特許文献４参照）。 The manganese peroxidase oxidizes Mn (II) to Mn (III) in the presence of hydrogen peroxide. And it is thought that the complex formed by reaction of Mn (III) and an organic acid is concerned in decomposition | disassembly of the said lignin (for example, refer patent document 4).
一般に、酵素を工業的に利用する場合には、室温以上の高温で作用させることが好ましい。しかしながら、前記マンガンペルオキシダーゼは、耐熱性が低く、例えば２０〜３０℃程度の温度で失活するという不都合がある。 In general, when an enzyme is used industrially, it is preferable to act at a high temperature of room temperature or higher. However, the manganese peroxidase has low heat resistance and has a disadvantage of being deactivated at a temperature of about 20 to 30 ° C., for example.
また、前記マンガンペルオキシダーゼは、過酸化水素存在下でＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化することにより前記リグニンを分解する酵素であるにも拘わらず、過酸化水素に対する耐性が低いという不都合がある。 In addition, the manganese peroxidase is an enzyme that degrades the lignin by oxidizing Mn (II) to Mn (III) in the presence of hydrogen peroxide, but has the disadvantage of low resistance to hydrogen peroxide. is there.
そこで、本発明は、かかる不都合を解消して、耐熱性及び耐過酸化水素性に優れたマンガンペルオキシダーゼ変異体を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a manganese peroxidase variant that is free from such inconvenience and is excellent in heat resistance and hydrogen peroxide resistance.
また、本発明の目的は、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体を用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理方法を提供することにもある。 Another object of the present invention is to provide a pretreatment method for lignocellulosic biomass using the manganese peroxidase mutant.
かかる目的を達成するために、本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、野生型マンガンペルオキシダーゼのアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸をより疎水性の大きなアミノ酸で置換したことを特徴とする。 In order to achieve this object, the manganese peroxidase mutant of the present invention is characterized in that amino acids 230 to 250 in the amino acid sequence of wild-type manganese peroxidase are substituted with amino acids having higher hydrophobicity.
本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、野生型マンガンペルオキシダーゼの立体構造において、その内方に位置しているアミノ酸であって、アミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸をより疎水性の大きなアミノ酸で置換している。この結果、本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、その立体構造の内方における疎水性相互作用が強化され、該立体構造が安定化するので、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を得ることができると考えられる。 The manganese peroxidase mutant of the present invention is an amino acid located inward in the three-dimensional structure of wild-type manganese peroxidase, and the 230th to 250th amino acids in the amino acid sequence are substituted with a more hydrophobic amino acid. ing. As a result, the manganese peroxidase variant of the present invention has an enhanced hydrophobic interaction in the interior of the three-dimensional structure, and the three-dimensional structure is stabilized, so that excellent heat resistance and hydrogen peroxide resistance can be obtained. It is considered possible.
本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、例えば、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなることが好ましい。 The manganese peroxidase variant of the present invention is, for example, the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the second amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the first amino acid sequence It preferably consists of a sequence.
前記第１のアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型のマンガンペルオキシダーゼにおいて、２３８番目のＭ（メチオニン）をＩ（イソロイシン）にアミノ酸置換したものである。この結果、前記第１のアミノ酸配列又は前記第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体は、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を得ることができる。 The first amino acid sequence is a wild-type manganese peroxidase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, in which 238th M (methionine) is amino acid substituted with I (isoleucine). As a result, the manganese peroxidase mutant consisting of the first amino acid sequence or the second amino acid sequence can obtain excellent heat resistance and hydrogen peroxide resistance.
本発明のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、前記第１のアミノ酸配列又は第２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質である。 The manganese peroxidase mutant of the present invention is a recombinant protein comprising the first amino acid sequence or the second amino acid sequence.
また、本発明は、前記組換えタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子にもある。本発明の遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子であることが好ましい。 The present invention also resides in a gene characterized by encoding the recombinant protein. The gene of the present invention is preferably a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
本発明のリグニンペルオキシダーゼ変異体は、前記遺伝子を含有する組換えベクターを形質転換体に導入することにより発現させることができる。 The lignin peroxidase mutant of the present invention can be expressed by introducing a recombinant vector containing the gene into a transformant.
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法は、リグノセルロース系バイオマスからリグニンを分解して除去するリグノセルロース系バイオマスの前処理方法であって、リグノセルロース系バイオマスに、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質と、リグニンペルオキシダーゼとを添加することを特徴とする。 The pretreatment method for lignocellulosic biomass of the present invention is a pretreatment method for lignocellulosic biomass that decomposes and removes lignin from lignocellulosic biomass, and is represented by SEQ ID NO: 1 in lignocellulosic biomass. A manganese peroxidase variant or recombinant protein comprising the first amino acid sequence or a second amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the first amino acid sequence, and lignin peroxidase are added It is characterized by doing.
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記リグノセルロース系バイオマスに、前記リグニンペルオキシダーゼを添加すると、該リグニンペルオキシダーゼが該リグノセルロース系バイオマスのリグニンを分解し、細胞壁を破壊する。 In the pretreatment method for lignocellulosic biomass of the present invention, when the lignin peroxidase is added to the lignocellulosic biomass, the lignin peroxidase decomposes the lignin of the lignocellulosic biomass and destroys the cell wall.
一方、前記リグノセルロース系バイオマスに、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体を添加すると、該マンガンペルオキシダーゼ変異体は、まず、過酸化水素の存在下にＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化する。生成したＭｎ（III）は、前記のように破壊された細胞壁から、前記リグノセルロース系バイオマスの内部に侵入し、該リグノセルロース系バイオマスの内部の不飽和脂肪酸と錯体を形成する。そして、前記錯体が前記リグノセルロース系バイオマスのリグニンをさらに分解する。 On the other hand, when the manganese peroxidase mutant is added to the lignocellulosic biomass, the manganese peroxidase mutant first oxidizes Mn (II) to Mn (III) in the presence of hydrogen peroxide. The produced Mn (III) enters the lignocellulosic biomass from the cell wall destroyed as described above, and forms a complex with the unsaturated fatty acid inside the lignocellulosic biomass. And the said complex further decomposes | disassembles the lignin of the said lignocellulosic biomass.
このとき、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体は優れた耐過酸化水素性を備えているので、過酸化水素の存在下においても失活することなく、Ｍｎ（II）をＭｎ（III）に酸化することができる。また、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体は優れた耐熱性を備えているので、室温よりも高い温度、例えば３７〜４２℃の範囲の温度で作用させることができ、前記リグニンの分解を促進させることができる。 At this time, since the manganese peroxidase mutant has excellent hydrogen peroxide resistance, Mn (II) can be oxidized to Mn (III) without being deactivated even in the presence of hydrogen peroxide. it can. Further, since the manganese peroxidase mutant has excellent heat resistance, it can be operated at a temperature higher than room temperature, for example, in the range of 37 to 42 ° C., and can promote the degradation of the lignin. .
また、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体によれば、それ自体が前記リグニンの分解を行うことはなく、該マンガンペルオキシダーゼ変異体により酸化されたＭｎ（III）が前記リグニンの分解に関与する。従って、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体自体から離間した部位で前記リグニンの分解を行うことができる。 Further, according to the manganese peroxidase mutant itself, the lignin is not decomposed, and Mn (III) oxidized by the manganese peroxidase mutant is involved in the decomposition of the lignin. Therefore, the lignin can be decomposed at a site separated from the manganese peroxidase mutant itself.
尚、本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体に代えて、前記組換えタンパク質を用いても、該マンガンペルオキシダーゼ変異体と同一の作用効果を奏することができる。 In the pretreatment method for lignocellulosic biomass of the present invention, even if the recombinant protein is used in place of the manganese peroxidase mutant, the same effects as the manganese peroxidase mutant can be achieved.
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記リグノセルロース系バイオマスに、前記リグニンペルオキシダーゼを添加した後、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質を添加することが好ましい。このようにすることにより、まず、前記リグニンペルオキシダーゼによりリグニンを分解して前記リグノセルロース系バイオマスの細胞壁を破壊することができ、次いで、破壊された細胞壁からＭｎ（III）が前記リグノセルロース系バイオマスの内部に侵入することができる。 In the pretreatment method of lignocellulosic biomass of the present invention, it is preferable to add the manganese peroxidase mutant or recombinant protein after adding the lignin peroxidase to the lignocellulosic biomass. In this way, first, the lignin can be decomposed by the lignin peroxidase to destroy the cell wall of the lignocellulosic biomass, and then Mn (III) from the broken cell wall becomes the lignocellulosic biomass. Can penetrate inside.
従って、前記リグニンペルオキシダーゼと、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質との連携を効率よく行うことができる。 Therefore, cooperation between the lignin peroxidase and the manganese peroxidase mutant or the recombinant protein can be efficiently performed.
本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法において、前記リグニンペルオキシダーゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型のリグニンペルオキシダーゼにおいて、２４０番目のＨ（ヒスチジン）をＦ（フェニルアラニン）に、２４１番目のＴ（トレオニン）をＬ（ロイシン）に、２４２番目のＩ（イソロイシン）をＬ（ロイシン）に、それぞれアミノ酸置換したリグニンペルオキシダーゼ変異体であることが好ましい。前記野生型のリグニンペルオキシダーゼは、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。 In the pretreatment method for lignocellulosic biomass of the present invention, the lignin peroxidase is a wild-type lignin peroxidase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, in which 240th H (histidine) is converted to F (phenylalanine) A lignin peroxidase mutant in which the 241st T (threonine) is replaced by L (leucine) and the 242nd I (isoleucine) is replaced by L (leucine), respectively, is amino acid-substituted. The wild-type lignin peroxidase is encoded by a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
前記リグニンペルオキシダーゼ変異体は、優れた耐熱性及び耐過酸化水素性を備えているので、前記マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質と同一条件下で作用することができ、該マンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質との連携をさらに効率よく行うことができる。 Since the lignin peroxidase mutant has excellent heat resistance and hydrogen peroxide resistance, it can act under the same conditions as the manganese peroxidase mutant or the recombinant protein. Cooperation with the replacement protein can be performed more efficiently.
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。 Next, embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.
本実施形態のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の野生型のマンガンペルオキシダーゼの変異体であり、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。前記野生型のマンガンペルオキシダーゼは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる。 The manganese peroxidase mutant of this embodiment is a wild-type manganese peroxidase mutant derived from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641, and consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The wild-type manganese peroxidase has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
本実施形態のマンガンペルオキシダーゼ変異体の前記配列番号１で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列において、２３８番目のＭ（メチオニン）をＩ（イソロイシン）にアミノ酸置換したものである。また、本実施形態のマンガンペルオキシダーゼ変異体は、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼは、配列番号６で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the manganese peroxidase variant of the present embodiment is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 in which 238th M (methionine) is amino acid substituted with I (isoleucine). is there. Further, the manganese peroxidase variant of the present embodiment is encoded by a gene consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the wild type manganese peroxidase is encoded by a gene consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 6. Is done.
前記野生型のマンガンペルオキシダーゼは、耐熱性及び耐過酸化水素性を備えていない。しかし、ウーズ（Woese）らによって示された１６ｓｒＲＮＡによる系統樹を見ると、８０℃以上で至適に生育する生物が該系統樹の根元に多いことが示されている。この事実から、真正細菌、真核生物、古細菌の共通の祖先は超好熱菌と推定され、先祖型のアミノ酸配列を有するか又はそれに近い配列を有するタンパク質は耐熱性を備えているものと考えられる。このような知見は、特開２００２−２４７９９１号公報に記載されている。 The wild-type manganese peroxidase does not have heat resistance and hydrogen peroxide resistance. However, looking at the phylogenetic tree of 16srRNA shown by Woese et al., It is shown that there are many organisms that grow optimally at 80 ° C. or more at the root of the phylogenetic tree. From this fact, the common ancestors of eubacteria, eukaryotes, and archaea are presumed to be hyperthermophilic bacteria, and proteins having an ancestral amino acid sequence or a sequence close thereto have heat resistance. Conceivable. Such knowledge is described in JP-A-2002-247991.
そこで、本実施形態では、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質に関する系統樹を作成し、該系統樹における先祖型のアミノ酸配列について検討した。 Therefore, in this embodiment, a phylogenetic tree relating to a protein containing an enzyme that degrades lignin and having an amino acid sequence homologous to the wild-type manganese peroxidase was created, and the ancestral amino acid sequence in the phylogenetic tree was examined.
前記系統樹の作成に当たって、まず、リグニンを分解する酵素を含み、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼと相同のアミノ酸配列を備えるタンパク質４８個をＤＤＢＪ内のアミノ酸配列データベースからソフトウェアＢＬＡＳＴＰを用いて抽出した。抽出したタンパク質は、リグニンを分解する酵素として、前記野生型のマンガンペルオキシダーゼの他、担子菌由来のマンガンペルオキシダーゼ、子のう菌由来のリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼとリグニンペルオキシダーゼとのハイブリッド型酵素であるヴァーサタイルペルオキシダーゼ、野生型のリグニンペルオキシダーゼを含んでいる。尚、本明細書では、マンガンペルオキシダーゼを「ＭｎＰ」、リグニンペルオキシダーゼを「ＬｉＰ」、ヴァ−サタイルペルオキシダーゼ「ＶＰ」と略記することがある。 In preparing the phylogenetic tree, 48 proteins including an enzyme that degrades lignin and having an amino acid sequence homologous to the wild-type manganese peroxidase were first extracted from the amino acid sequence database in DDBJ using software BLASTP. The extracted protein is an enzyme that degrades lignin. In addition to the wild-type manganese peroxidase, basidiomycete-derived manganese peroxidase, aspergillus oryzae-derived lignin peroxidase, or a hybrid enzyme of manganese peroxidase and lignin peroxidase. Contains tile peroxidase, wild-type lignin peroxidase. In the present specification, manganese peroxidase may be abbreviated as “MnP”, lignin peroxidase as “LiP”, and versatile peroxidase “VP”.
次に、前記野生型ＭｎＰと、抽出した４８個のタンパク質との合わせて４９個のタンパク質について、進化の系統を示す系統樹を作成した。前記系統樹は、ソフトウェアＴｒｅｅｆｉｎｄｅｒとＰｈｙＭＬとを用いて候補系統樹群を作成し、該候補系統樹群の各候補系統樹について、ソフトウェアＰＭＡＬのＣＯＤＥＭＬを用いて尤度を計算した。そして、最尤度を備える候補系統樹を前記４９個のタンパク質の進化の系統を示す系統樹として選択した。選択した系統樹を図１に示す。 Next, a phylogenetic tree showing the evolutionary lineage was created for 49 proteins, including the wild-type MnP and the extracted 48 proteins. The said phylogenetic tree created the candidate phylogenetic tree group using software Treefinder and PhyML, and calculated the likelihood about each candidate phylogenetic tree of this candidate phylogenetic tree group using CODEML of software PMAL. The candidate phylogenetic tree having the maximum likelihood was selected as a phylogenetic tree indicating the evolutionary lines of the 49 proteins. The selected phylogenetic tree is shown in FIG.
図１において、符号１は野生型ＭｎＰ、符号２は野生型ＬｉＰ、符号３は子のう菌由来ＬｉＰ、符号４はＶＰを示す。また、符号５はＭｎＰを示し、符号６はＬｉＰを示す。
In FIG. 1, reference numeral 1 represents wild-type MnP,
尚、図１において、野生型ＭｎＰ１及び野生型ＬｉＰ２を除く４７個のタンパク質は、ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓにより示している。野生型ＭｎＰ１及び野生型ＬｉＰ２を除く４７個のタンパク質は、いずれも論文等に発表されており、前記”ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ”により特定することができる。 In FIG. 1, 47 proteins excluding wild type MnP1 and wild type LiP2 are indicated by DDBJ accession numbers. All 47 proteins except for wild-type MnP1 and wild-type LiP2 have been published in papers and can be identified by the aforementioned “DDBJ accession numbers”.
また、前記野生型ＬｉＰ２は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。 The wild-type LiP2 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and is encoded by a gene having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
図１において、分岐点Ａに対応するタンパク質は耐熱性を備えており、そのアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸は、野生型ＭｎＰ１のアミノ酸配列の２３０〜２５０番目のアミノ酸よりも疎水性大きなアミノ酸であると考えられる。 In FIG. 1, the protein corresponding to the branch point A has heat resistance, and the amino acids 230 to 250 in the amino acid sequence are more hydrophobic than the amino acids 230 to 250 in the amino acid sequence of wild-type MnP1. It is thought that.
そこで、前記野生型ＭｎＰ１のアミノ酸配列（配列番号５）中、２３８番目のＭ（メチオニン）を、Ｍより疎水性の大きなアミノ酸であるＩ（イソロイシン）にアミノ酸置換したものを本実施形態の先祖型ＭｎＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１）とした。 Therefore, in the amino acid sequence of the wild type MnP1 (SEQ ID NO: 5), the ancestor type of this embodiment is obtained by substituting the 238th M (methionine) with I (isoleucine), which is an amino acid having a hydrophobicity greater than M. The amino acid sequence of the MnP variant (SEQ ID NO: 1) was used.
本実施形態のＭｎＰ変異体（先祖型ＭｎＰ変異体）は、前記のようにして決定した先祖型ＭｎＰ変異体のアミノ酸配列に基づいて、次のようにして作成することができる。 The MnP mutant (an ancestral MnP mutant) of the present embodiment can be prepared as follows based on the amino acid sequence of the ancestral MnP mutant determined as described above.
まず、野生型ＭｎＰ１の遺伝子がコードされたプラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）に、QuikChange（登録商標）Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE)を用いて、２３８番目のＭをＩにアミノ酸置換した祖先型変異を導入し、ベクターとする。目的の変異導入の成否はシークエンシングで確認することができる。 First, an ancestral mutation in which amino acid substitution of 238th M to I was performed on plasmid pET21a (+) encoding wild type MnP1 gene using QuikChange (registered trademark) Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE). Introduce into a vector. Successful mutagenesis can be confirmed by sequencing.
次に、前記祖先型変異が導入されたベクターを用いて大腸菌Escherichia coli BL21(DE3)株を形質転換し、ＴＢ培地を用い３７℃の温度で大量培養する。得られた菌体を超音波で破砕し、３００００ｒｐｍで２０分間遠心して、沈殿を分離する。 Next, Escherichia coli BL21 (DE3) strain is transformed with the vector into which the ancestral mutation has been introduced, and mass-cultured at 37 ° C. using TB medium. The obtained microbial cells are crushed with ultrasonic waves and centrifuged at 30000 rpm for 20 minutes to separate the precipitate.
次に、分離された沈殿を、２０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−ＤＴＴ、１％−非イオン性界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名））で３回洗浄し、８Ｍ−尿素、５０ｍＭ−Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ−ＤＴＴに再懸濁し、４℃の温度に一晩保持して封入体を可溶化する。 Next, the separated precipitate was washed 3 times with 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% non-ionic surfactant (Triton X-100 (trade name)). The suspension is resuspended in 8M-urea, 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 2 mM-EDTA, 1 mM-DTT, and kept at a temperature of 4 ° C. overnight to solubilize the inclusion bodies.
次に、前記封入体が可溶化された溶液を４倍に希釈することにより尿素の濃度を２Ｍとし、４℃の温度の暗所に一晩保持してリフォールディングして、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）を得る。このとき、５μＭ−ヘミン、０．７ｍＭ−酸化グルタチオン、１０ｍＭ−ＣａＣｌ２（濃度はそれぞれ終濃度である）を添加する。 Next, the solution in which the inclusion bodies are solubilized is diluted 4 times to make the concentration of urea 2M, and kept overnight in a dark place at a temperature of 4 ° C. for refolding. A mutant (M238I) is obtained. At this time, 5 μM hemin, 0.7 mM-oxidized glutathione, 10 mM-CaCl 2 (concentrations are final concentrations) are added.
次に、リフォールディングされた本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）を、陰イオン交換カラム（DEAE-Sepharose（商品名）、HiTrrapQ HP（商品名）、ResourceQ（商品名）)、で分離し、精製する。 Next, the refolded MnP mutant (M238I) of this embodiment is separated with an anion exchange column (DEAE-Sepharose (trade name), HiTrrapQ HP (trade name), ResourceQ (trade name)), Purify.
次に、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）の耐熱性及び耐過酸化水素性を評価した（実施例）。 Next, the heat resistance and hydrogen peroxide resistance of the MnP mutant (M238I) of this embodiment were evaluated (Example).
前記耐熱性の評価は、まず、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）４８ｎＭを、１０ｍＭ−酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び１ｍＭ−ＣａＣｌ２からなる溶液中、３７℃及び４２℃の温度でそれぞれインキュベートした。次に、インキュベート開始後、０分後、２分後、５分後、１０分後、１５分後に、インキュベートされた本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）８ｎＭを、５０ｍＭ−マロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）、１．２ｍＭ−ＭｎＳＯ４、０．１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２を含む溶液に加えて、測定液を調製した。 The evaluation of the heat resistance was carried out by first applying 48 nM of the MnP mutant (M238I) of the present embodiment at a temperature of 37 ° C. and 42 ° C. in a solution composed of 10 mM acetate buffer (pH 6.0) and 1 mM CaCl 2. Each was incubated. Next, after the start of incubation, 0 minutes, 2 minutes, 5 minutes, 10 minutes, and 15 minutes, 8 nM of the incubated MnP mutant (M238I) of this embodiment was added to 50 mM malonate buffer ( In addition to a solution containing pH 4.5), 1.2 mM MnSO 4 and 0.1 mM H 2 O 2 , a measurement solution was prepared.
前記測定液中で、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）はＭｎ(III)を生成し、Ｍｎ(III)がマロン酸と錯体を形成する。そこで、次に、２７０ｎｍの波長の光線を用いて、前記測定液の吸光度を測定した。測定中の失活を防ぐために、測定温度は２５℃とした。２７０ｎｍの波長によるモル吸光係数ε２７０は、ε２７０＝８５００である。 In the measurement solution, the MnP variant (M238I) of this embodiment generates Mn (III), and Mn (III) forms a complex with malonic acid. Then, next, the light absorbency of the said measuring liquid was measured using the light beam of a wavelength of 270 nm. In order to prevent deactivation during the measurement, the measurement temperature was set to 25 ° C. The molar extinction coefficient ε 270 at a wavelength of 270 nm is ε 270 = 8500.
各試料から得られた初速により、それぞれのインキュベート時間における比活性（μモル／ｍｇ分）を算出した。インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。 Based on the initial velocity obtained from each sample, the specific activity (μmol / mg min) in each incubation time was calculated. With respect to specific activities after 0 minutes and 15 minutes after the start of incubation, Table 1 shows values at an incubation temperature of 37 ° C, and Table 2 shows values at 42 ° C.
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフについて、インキュベート温度３７℃の場合を図２（ａ）に、４２℃の場合を図３（ａ）にそれぞれ示す。 Moreover, about the graph which made the common logarithm of initial velocity the vertical axis | shaft and time was the horizontal axis, the case of 37 degreeC of incubation temperature is shown to Fig.2 (a), and the case of 42 degreeC is shown to Fig.3 (a), respectively.
また、図２（ａ）及び図３（ａ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。 Moreover, the deactivation rate was calculated | required from the inclination of the graph of Fig.2 (a) and Fig.3 (a). Regarding the inactivation rate, Table 1 shows values at an incubation temperature of 37 ° C, and Table 2 shows values at 42 ° C.
また、前記耐過酸化水素性の評価は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）４８ｎＭを、ｐＨ６．０の０．１ｍＭ−Ｈ２Ｏ２溶液中、２５℃の温度でインキュベートした以外は、前記耐熱性の評価と全く同一にして、測定液の吸光度を測定することにより行った。 The hydrogen peroxide resistance was evaluated except that 48 nM of the MnP mutant (M238I) of this embodiment was incubated at a temperature of 25 ° C. in a 0.1 mM-H 2 O 2 solution having a pH of 6.0. It was carried out by measuring the absorbance of the measurement liquid in exactly the same way as the evaluation of heat resistance.
各試料から得られた初速により、それぞれのインキュベート時間における比活性（μモル／ｍｇ分）を算出した。インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性の値を表３に示す。 Based on the initial velocity obtained from each sample, the specific activity (μmol / mg min) in each incubation time was calculated. Table 3 shows specific activity values at 0 minutes and 15 minutes after the start of incubation.
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフを図４（ａ）に示す。また、図４（ａ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度を表３に示す。 Further, FIG. 4A shows a graph in which the common logarithm of the initial speed is the vertical axis and the time is the horizontal axis. Moreover, the deactivation rate was calculated | required from the inclination of the graph of Fig.4 (a). The deactivation rate is shown in Table 3.
次に、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）に代えて野生型のＭｎＰ１を用いた以外は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）の場合と全く同一にして野生型のＭｎＰ１の耐熱性及び耐過酸化水素性を評価した（比較例１）。 Next, except that wild type MnP1 was used instead of the MnP mutant (M238I) of this embodiment, the heat resistance of the wild type MnP1 was exactly the same as that of the MnP mutant (M238I) of this embodiment. And the hydrogen peroxide resistance was evaluated (Comparative Example 1).
前記耐熱性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。 Regarding the heat resistance, the specific activity at 0 minutes and 15 minutes after the start of incubation is shown in Table 1, and the values at 42 ° C. are shown in Table 1 and Table 2, respectively.
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフについて、インキュベート温度３７℃の場合を図２（ｂ）に、４２℃の場合を図３（ｂ）にそれぞれ示す。 Moreover, about the graph which made the common logarithm of initial velocity the vertical axis | shaft and time was the horizontal axis, the case of 37 degreeC of incubation temperature is shown in FIG.2 (b), and the case of 42 degreeC is shown in FIG.3 (b), respectively.
また、図２（ｂ）及び図３（ｂ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。 Moreover, the deactivation rate was calculated | required from the inclination of the graph of FIG.2 (b) and FIG.3 (b). Regarding the inactivation rate, Table 1 shows values at an incubation temperature of 37 ° C, and Table 2 shows values at 42 ° C.
また、前記耐過酸化水素性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性の値を表３に示す。 As for the hydrogen peroxide resistance, Table 3 shows specific activity values at 0 minutes and 15 minutes after the start of incubation.
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフを図４（ｂ）に示す。また、図４（ｂ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度を表３に示す。 Further, FIG. 4B shows a graph in which the common logarithm of the initial speed is the vertical axis and the time is the horizontal axis. Moreover, the deactivation rate was calculated | required from the inclination of the graph of FIG.4 (b). The deactivation rate is shown in Table 3.
次に、前記野生型ＭｎＰ１のアミノ酸配列（配列番号４）中、２３８番目のＭ（メチオニン）を、Ｆ（フェニルアラニン）にアミノ酸置換したアミノ酸配列（配列番号７）を備えるＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）を作成した。前記ＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）は、配列番号８で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。前記ＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）は、野生型ＭｎＰ１の遺伝子がコードされたプラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）に、２３８番目のＭをＦにアミノ酸置換した変異を導入してベクターとする以外は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）と全く同一にして作成することができる。 Next, an MnP mutant (M238F) having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) in which the 238th M (methionine) is substituted with F (phenylalanine) in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the wild type MnP1 is obtained. Created. The MnP mutant (M238F) is encoded by a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8. The MnP mutant (M238F) is the same as that of the present embodiment except that a plasmid pET21a (+) in which the gene of wild-type MnP1 is encoded has a mutation obtained by substituting the 238th M with F for amino acid substitution. It can be made exactly the same as the MnP variant (M238I).
次に、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）に代えて、ＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）を用いた以外は、本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ）の場合と全く同一にしてＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｆ）の耐熱性及び耐過酸化水素性を評価した（比較例２）。 Next, in place of the MnP mutant (M238I) of the present embodiment, the MnP mutant (M238I) was completely the same as the MnP mutant (M238I) except that the MnP mutant (M238F) was used. The heat resistance and hydrogen peroxide resistance of M238F) were evaluated (Comparative Example 2).
前記耐熱性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。 Regarding the heat resistance, the specific activity at 0 minutes and 15 minutes after the start of incubation is shown in Table 1, and the values at 42 ° C. are shown in Table 1 and Table 2, respectively.
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフについて、インキュベート温度３７℃の場合を図２（ｃ）に、４２℃の場合を図３（ｃ）にそれぞれ示す。 Moreover, about the graph which made the common logarithm of initial velocity the vertical axis | shaft and time was the horizontal axis, the case of 37 degreeC of incubation temperature is shown in FIG.2 (c), and the case of 42 degreeC is shown in FIG.3 (c), respectively.
また、図２（ｃ）及び図３（ｃ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度について、インキュベート温度３７℃のときの値を表１に、４２℃のときの値を表２にそれぞれ示す。 Moreover, the deactivation rate was calculated | required from the inclination of the graph of FIG.2 (c) and FIG.3 (c). Regarding the inactivation rate, Table 1 shows values at an incubation temperature of 37 ° C, and Table 2 shows values at 42 ° C.
前記過酸化水素性については、インキュベート開始後０分後及び１５分後の比活性の値を表３に示す。 As for the hydrogen peroxide property, specific activity values at 0 minutes and 15 minutes after the start of incubation are shown in Table 3.
また、初速の常用対数を縦軸とし、時間を横軸としたグラフを図４（ｃ）に示す。また、図４（ｃ）のグラフの傾きから失活速度を求めた。前記失活速度を表３に示す。 FIG. 4C shows a graph in which the common logarithm of the initial speed is the vertical axis and the time is the horizontal axis. Moreover, the deactivation rate was calculated | required from the inclination of the graph of FIG.4 (c). The deactivation rate is shown in Table 3.
表１〜２及び図２〜３に示すように、本実施例のＭｎＰ変異体は、野生型ＭｎＰ（比較例１）又は２３８番目のＭをＦにアミノ酸置換したＭｎＰ変異体（比較例２）よりも優れた耐熱性を備えていることが明らかである。 As shown in Tables 1 and 2 and FIGS. 2 to 3, the MnP mutant of this example is a wild-type MnP (Comparative Example 1) or a MnP mutant in which M at the 238th M is substituted with F (Comparative Example 2). It is clear that it has better heat resistance.
また、表３及び図４に示すように、本実施例のＭｎＰ変異体は、野生型ＭｎＰ（比較例１）又は２３８番目のＭをＦにアミノ酸置換したＭｎＰ変異体（比較例２）よりも優れた耐過酸化水素性を備えていることが明らかである。 In addition, as shown in Table 3 and FIG. 4, the MnP mutant of this example is more than the wild-type MnP (Comparative Example 1) or the MnP mutant (Comparative Example 2) in which the 238th M is substituted with F. It is clear that it has excellent hydrogen peroxide resistance.
次に、本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法について説明する。 Next, the pretreatment method of lignocellulosic biomass of this embodiment will be described.
本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法は、リグノセルロース系バイオマスを基質として、該基質を糖化酵素により糖化し、得られた糖化溶液を発酵させてバイオエタノールを製造する際に、前処理として該基質のリグニンを除去する方法である。前記リグノセルロース系バイオマスとしては、木材、稲藁、麦藁、バガス、竹、パルプ及びこれらから生じる廃棄物例えば古紙等を挙げることができ、例えば、稲藁を用いることができる。 The pretreatment method for lignocellulosic biomass of the present embodiment uses a lignocellulosic biomass as a substrate, saccharifies the substrate with a saccharifying enzyme, and ferments the obtained saccharified solution to produce bioethanol. As a method for removing lignin from the substrate. Examples of the lignocellulosic biomass include wood, rice straw, wheat straw, bagasse, bamboo, pulp, and wastes such as waste paper, and for example, rice straw can be used.
本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記リグノセルロース系バイオマスとして稲藁を用いる場合には、まず、カッターミル等により約３ｍｍの長さに粉砕された稲藁に水を添加して、例えば５質量％の濃度の混合液を調製する。 In the pretreatment method for lignocellulosic biomass of the present embodiment, when rice straw is used as the lignocellulosic biomass, water is first added to the rice straw crushed to a length of about 3 mm by a cutter mill or the like. For example, a liquid mixture having a concentration of 5% by mass is prepared.
次に、前記混合液に、その全量に対し０．１〜０．５μＭの範囲のリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）を添加する。前記ＬｉＰは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる野生型ＬｉＰにおいて、２４０番目のＨ（ヒスチジン）をＦ（フェニルアラニン）に、２４１番目のＴ（トレオニン）をＬ（ロイシン）に、２４２番目のＩ（イソロイシン）をＬ（ロイシン）に、それぞれアミノ酸置換したＬｉＰ変異体であることが好ましい。前記野生型ＬｉＰは、配列番号４で表される塩基配列からなる遺伝子によりコードされる。 Next, lignin peroxidase (LiP) in a range of 0.1 to 0.5 μM is added to the mixed solution with respect to the total amount. In the wild-type LiP consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, the LiP is the 240th H (histidine) in F (phenylalanine), the 241nd T (threonine) in L (leucine), and the 242nd It is preferable to be a LiP variant in which I (isoleucine) is replaced with L (leucine) by amino acid substitution. The wild-type LiP is encoded by a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
前記ＬｉＰ変異体は、耐熱性及び耐過酸化水素性を備えている。そこで、前記ＬｉＰ変異体が添加された混合液を、０．１〜０．５ｍＭの過酸化水素の存在下、２５〜３０℃の範囲の温度に、１〜１２０時間の範囲の時間保持することにより、前記稲藁のリグニンを分解し、細胞壁を破壊することができる。 The LiP mutant has heat resistance and hydrogen peroxide resistance. Therefore, the liquid mixture to which the LiP variant has been added is maintained at a temperature in the range of 25 to 30 ° C. for a period of 1 to 120 hours in the presence of 0.1 to 0.5 mM hydrogen peroxide. Thus, the lignin of the rice straw can be decomposed and the cell wall can be destroyed.
次に、前記混合液に、その全量に対し０．１〜０．５μＭの範囲の本実施形態のＭｎＰ変異体（Ｍ２３８Ｉ、先祖型ＭｎＰ変異体）を添加する。本実施形態のＭｎＰ変異体は、前述のように耐熱性及び耐過酸化水素性を備えている。 Next, the MnP variant (M238I, ancestral MnP variant) of this embodiment in the range of 0.1 to 0.5 μM is added to the total amount of the mixed solution. The MnP mutant of this embodiment has heat resistance and hydrogen peroxide resistance as described above.
そこで、本実施形態のＭｎＰ変異体が添加された混合液を、０．１〜０．５ｍＭの過酸化水素の存在下、３７〜４２℃の範囲の温度に、１〜１２０時間の範囲の時間保持することにより、前記稲藁に含まれるＭｎ（II）をＭｎ（III）に酸化することができる。生成したＭｎ（III）は、前記ＬｉＰ変異体により破壊された細胞壁から、前記稲藁の内部に侵入し、該稲藁に含まれる不飽和脂肪酸と錯体を形成する。そして、前記錯体が前記稲藁のリグニンをさらに分解する。 Therefore, the mixed solution to which the MnP variant of the present embodiment is added is subjected to a temperature in the range of 37 to 42 ° C. in the presence of 0.1 to 0.5 mM hydrogen peroxide for a time in the range of 1 to 120 hours. By holding, Mn (II) contained in the rice straw can be oxidized to Mn (III). The produced Mn (III) enters the rice straw from the cell wall destroyed by the LiP mutant, and forms a complex with the unsaturated fatty acid contained in the rice straw. The complex further degrades the rice lignin.
また、本実施形態のＭｎＰ変異体によれば、それ自体が前記リグニンの分解を行うことはなく、該ＭｎＰ変異体により酸化されたＭｎ（III）が前記リグニンの分解に関与する。従って、前記ＭｎＰ変異体自体から離間した部位で前記リグニンの分解を行うことができる。 Moreover, according to the MnP mutant of this embodiment, the lignin itself is not degraded, and Mn (III) oxidized by the MnP mutant is involved in the degradation of the lignin. Therefore, the lignin can be decomposed at a site separated from the MnP mutant itself.
本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法により処理された前記混合液は、前記リグニンの分解後、さらに糖化酵素を添加することにより、前記稲藁に含まれるセルロース及びヘムセルロースを糖化して、糖化溶液とすることができる。また、前記糖化溶液は、バイオエタノールの原料として用いることができる。 The mixed solution treated by the lignocellulosic biomass pretreatment method of the present embodiment, after decomposing the lignin, further saccharifies the cellulose and heme cellulose contained in the rice straw by adding a saccharifying enzyme. Saccharified solution. The saccharification solution can be used as a raw material for bioethanol.
尚、本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記ＭｎＰ変異体に代えて、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質を用いてもよく、前記ＭｎＰ変異体と同一の作用効果を奏することができる。 In the lignocellulosic biomass pretreatment method of the present invention, a recombinant protein consisting of the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be used instead of the MnP variant, and the MnP variant. The same effects can be achieved.
また、本発明のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記ＬｉＰ変異体に代えて、野生型ＬｉＰ等の他のリグニンペルオキシダーゼを用いてもよい。ただし、この場合には、前記ＬｉＰ変異体よりも耐熱性又は耐過酸化水素性が低く、本実施形態のＭｎＰ変異体と同一条件で用いることが難しくなることがある。 In the pretreatment method for lignocellulosic biomass of the present invention, other lignin peroxidase such as wild-type LiP may be used instead of the LiP mutant. However, in this case, heat resistance or hydrogen peroxide resistance is lower than that of the LiP variant, and it may be difficult to use the same conditions as the MnP variant of the present embodiment.
また、本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの前処理方法では、前記混合液に前記ＬｉＰ変異体を添加した後、本実施形態のＭｎＰ変異体を添加するようにしているが、前記ＬｉＰ変異体と本実施形態のＭｎＰ変異体とを同時に添加するようにしてもよい。 Moreover, in the pretreatment method of lignocellulosic biomass of the present embodiment, after adding the LiP variant to the mixed solution, the MnP variant of the present embodiment is added. You may make it add simultaneously with the MnP variant of this embodiment.
１…野生型ＭｎＰ、 ２…野生型ＬｉＰ、 ３…子のう菌由来ＬｉＰ、 ４…ＶＰ、 ５…ＭｎＰ、 ６…ＬｉＰ、 Ａ…分岐点。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Wild type MnP, 2 ... Wild type LiP, 3 ... Lipo derived LiP, 4 ... VP, 5 ... MnP, 6 ... LiP, A ... Branching point.
Claims (12)
リグノセルロース系バイオマスに、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質と、リグニンペルオキシダーゼとを添加することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの前処理方法。 A pretreatment method for lignocellulosic biomass that decomposes and removes lignin from lignocellulosic biomass,
Manganese peroxidase comprising a first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a second amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the first amino acid sequence in lignocellulosic biomass A method for pretreatment of lignocellulosic biomass, comprising adding a mutant or recombinant protein and lignin peroxidase.
前記リグノセルロース系バイオマスに、前記リグニンペルオキシダーゼを添加した後、前記配列番号１で表される第１のアミノ酸配列、又は第１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第２のアミノ酸配列からなるマンガンペルオキシダーゼ変異体または組換えタンパク質を添加することを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの前処理方法。 In the pretreatment method of lignocellulosic biomass according to claim 10,
After the lignin peroxidase is added to the lignocellulosic biomass, one or several amino acids in the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the first amino acid sequence are deleted, substituted or added. A method for pretreating lignocellulosic biomass, comprising adding a manganese peroxidase mutant or recombinant protein comprising the second amino acid sequence.
前記リグニンペルオキシダーゼは、配列番号３で表される第３のアミノ酸配列、又は第３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された第４のアミノ酸配列からなるリグニンペルオキシダーゼ変異体であることを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの前処理方法。 In the pretreatment method of lignocellulosic biomass according to claim 10 or claim 11,
The lignin peroxidase is a lignin peroxidase mutation consisting of a third amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a fourth amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the third amino acid sequence. A method for pretreatment of lignocellulosic biomass, characterized by being a body.
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