JP2012171893A - Gene expression promoter for adiponectin receptor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロン等を含む、アディポネクチン受容体の遺伝子発現促進剤に関する。 The present invention relates to an adiponectin receptor gene expression promoter comprising resveratrol, fucoxanthin, guggulsterone and the like.
皮膚は、表皮、真皮、皮下組織等から構成されている。皮膚は体の内側を支える支持組織としても機能しており、その物性は外界からの物理的刺激に対する防御や、内部組織の定位などに重要である。この皮膚の物性、特に皮膚の弾性特性が低下することで、たるみの増悪に繋がることが示されている（非特許文献１）。この皮膚の弾性特性は、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリクス成分の減少によって低下する。 The skin is composed of epidermis, dermis, subcutaneous tissue and the like. The skin also functions as a supporting tissue that supports the inside of the body, and its physical properties are important for defense against physical stimulation from the outside world and localization of internal tissues. It has been shown that a decrease in the physical properties of the skin, particularly the elastic properties of the skin, leads to an increase in sagging (Non-patent Document 1). This elastic property of the skin is reduced by a decrease in extracellular matrix components such as collagen, elastin and hyaluronic acid.
従来、コラーゲン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリクス成分の外用や注射が、皮膚のはりを治す方法として用いられてきた。しかし、前記細胞外マトリクス成分は高分子であるため、外用によって皮膚深部まで到達させることは困難であり、日常的に繰り返し注射することも困難である。そこで、皮膚弾性特性の低下を予防及び改善することができる剤であって、日常的に使用でき、安定かつ安全な剤を開発する必要がある。 Conventionally, external application and injection of extracellular matrix components such as collagen and hyaluronic acid have been used as a method for curing skin acupuncture. However, since the extracellular matrix component is a polymer, it is difficult to reach deep skin by external use, and it is difficult to repeatedly inject daily. Therefore, it is necessary to develop an agent that can prevent and improve the decrease in skin elastic properties and can be used on a daily basis, and is stable and safe.
コラーゲン等の細胞外マトリクス成分は、アディポネクチン等に応答して皮膚の線維芽細胞で産生される（特開２０１０−７５６３９号公報）。皮膚の弾性特性は加齢とともに低下し、年齢と統計学的に有意に負の相関を示す（ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５６６１７号明細書）にもかかわらず、血中のアディポネクチン濃度は、年齢とともに高くなる（Ｉｓｏｂｅ，Ｔら、Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１５３：９１（２００５））。 Extracellular matrix components such as collagen are produced in skin fibroblasts in response to adiponectin and the like (Japanese Patent Laid-Open No. 2010-75639). Despite the fact that the elastic properties of the skin decrease with age and show a statistically significant negative correlation with age (PCT / JP2010 / 056617), the concentration of adiponectin in the blood increases with age (Isobe, T et al., Eur J Endocrinol, 153: 91 (2005)).
本発明者らは、アディポネクチン受容体の発現が、加齢にともなって減少することを新たに見出した。この発見は、加齢にともなう皮膚の弾性特性の低下の原因が、加齢にともなうアディポネクチン濃度の上昇を相殺するアディポネクチン受容体の発現減少であることを示唆する。加齢以外の要因でアディポネクチン受容体の発現が減少する場合でも、皮膚の弾性特性は低下するであろう。するとアディポネクチン受容体発現を促進することによって、皮膚弾性特性の低下を予防及び／又は改善できると考えられる。 The present inventors have newly found that the expression of adiponectin receptor decreases with aging. This finding suggests that the cause of the decrease in the elastic properties of the skin with aging is a decrease in adiponectin receptor expression that offsets the increase in adiponectin concentration with aging. Even if adiponectin receptor expression decreases due to factors other than aging, the elastic properties of the skin will decrease. Then, it is thought that the fall of skin elastic property can be prevented and / or improved by promoting adiponectin receptor expression.
また本発明者らは、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンが、アディポネクチン受容体の遺伝子発現を促進することも見出した。そこで、本発明者らは、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンを皮膚弾性特性低下の予防及び／又は改善の用途に用いる本発明を想到した。 The present inventors have also found that resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone promote adiponectin receptor gene expression. Therefore, the present inventors have conceived the present invention using resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone for the purpose of preventing and / or improving skin elastic properties.
本発明は、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンと、それらの誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、アディポネクチン受容体の遺伝子発現促進剤を提供する。本発明は、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンと、それらの誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、アディポネクチン受容体の遺伝子発現を促進する剤を提供する。 The present invention relates to an adiponectin receptor gene expression promoter comprising one or more compounds selected from the group consisting of resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone, and derivatives and / or salts thereof. provide. The present invention promotes adiponectin receptor gene expression comprising one or more compounds selected from the group consisting of resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone, and derivatives and / or salts thereof. Provide the agent.
本発明の剤において、前記グッグルステロンは、（Ｚ）−グッグルステロン及び／又は（Ｅ）−グッグルステロンの場合がある。本発明の組成物において、前記グッグルステロンは、（Ｚ）−グッグルステロン及び／又は（Ｅ）−グッグルステロンの場合がある。 In the agent of the present invention, the guggulsterone may be (Z) -guggulsterone and / or (E) -guggulsterone. In the composition of the present invention, the guggulsterone may be (Z) -guggulsterone and / or (E) -guggulsterone.
本発明の剤において、前記アディポネクチン受容体は、アディポネクチン受容体１及び／又は２の場合がある。本発明の組成物において、前記アディポネクチン受容体は、アディポネクチン受容体１及び／又は２の場合がある。 In the agent of the present invention, the adiponectin receptor may be adiponectin receptor 1 and / or 2. In the composition of the present invention, the adiponectin receptor may be adiponectin receptor 1 and / or 2.
本発明の剤は、皮膚弾性特性の低下を予防及び／又は改善するために用いられる場合がある。本発明の組成物は、皮膚弾性特性の低下を予防及び／又は改善するために用いられる場合がある。 The agent of this invention may be used in order to prevent and / or improve the fall of skin elastic property. The composition of the present invention may be used to prevent and / or improve the decrease in skin elastic properties.
本発明の剤又は組成物は、医薬品として用いられる場合がある。本発明の剤又は組成物は、食品として用いられる場合がある。 The agent or composition of the present invention may be used as a pharmaceutical product. The agent or composition of the present invention may be used as food.
本発明は、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンと、それらの誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、アディポネクチン受容体の遺伝子発現促進剤を投与するステップを含む、皮膚状態の悪化を予防及び／又は改善する方法を提供する。本発明は、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンと、それらの誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、アディポネクチン受容体の遺伝子発現を促進する組成物を投与するステップを含む、皮膚状態の悪化を予防及び／又は改善する方法を提供する。前記皮膚状態の悪化は皮膚弾性特性の低下の場合があるが、これに限定されない。前記グッグルステロンは、（Ｚ）−グッグルステロン及び／又は（Ｅ）−グッグルステロンの場合がある。前記アディポネクチン受容体は、アディポネクチン受容体１及び／又は２の場合がある。前記剤又は組成物は、医薬品及び／又は食品の場合がある。 The present invention relates to an adiponectin receptor gene expression promoter comprising one or more compounds selected from the group consisting of resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone, and derivatives and / or salts thereof. A method is provided for preventing and / or ameliorating deterioration of skin conditions comprising the step of administering. The present invention promotes adiponectin receptor gene expression comprising one or more compounds selected from the group consisting of resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone, and derivatives and / or salts thereof. A method is provided for preventing and / or ameliorating deterioration of skin conditions comprising administering a composition. The deterioration of the skin condition may be a decrease in skin elasticity, but is not limited thereto. The guggulsterone may be (Z) -guggulsterone and / or (E) -guggulsterone. The adiponectin receptor may be adiponectin receptor 1 and / or 2. The agent or composition may be a pharmaceutical and / or food.
本発明において、アディポネクチン受容体の遺伝子発現量は、線維芽細胞におけるアディポネクチン受容体のｍＲＮＡの量の他、線維芽細胞におけるアディポネクチン受容体の転写活性を含む。前記線維芽細胞におけるアディポネクチン受容体のｍＲＮＡの量は、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザンブロット法その他の固相雑種形成法を含むがこれらに限定されない方法によって測定される。前記線維芽細胞におけるアディポネクチン受容体の転写活性は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）その他のレポータータンパク質がアディポネクチン受容体の遺伝子発現制御領域によって駆動されるコンストラクトを線維芽細胞に一時的又は永続的に導入することによって測定されるのが典型的である。 In the present invention, the gene expression level of adiponectin receptor includes the transcriptional activity of adiponectin receptor in fibroblasts in addition to the amount of adiponectin receptor mRNA in fibroblasts. The amount of adiponectin receptor mRNA in the fibroblast is measured by methods including, but not limited to, RT-PCR, Northern blotting, and other solid-phase hybrid formation methods. The transcriptional activity of the adiponectin receptor in the fibroblasts is that chloramphenicol acetyltransferase (CAT), β-galactosidase (LacZ), luciferase (Luc), green fluorescent protein (GFP) and other reporter proteins are those of the adiponectin receptor. Typically, it is measured by temporarily or permanently introducing into the fibroblasts a construct driven by a gene expression control region.
本発明において、アディポネクチン受容体の遺伝子発現量は、測定するときの細胞の数又は全タンパク量によって標準化された絶対値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が、複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、被験処理条件における培養後の容器１つあたりのアディポネクチン受容体の遺伝子発現量は、被験処理前の前記線維芽細胞のアディポネクチン受容体の遺伝子発現量を基準とする相対値で表される場合がある。さらに、本発明において、アディポネクチン受容体の遺伝子発現量は、同じ数の細胞が、複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、同一条件で処理された容器１つあたりの対照遺伝子の発現量で標準化される場合がある。前記対照遺伝子は、いわゆるハウスキーピング遺伝子を含むが、これらに限らず、例えば遺伝子発現アレイチップ等の手段で見つけることができる。本発明において、ハウスキーピング遺伝子は、２８ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチン等を含むが、これらに限定されない。前記対照遺伝子がＧＡＰＤＨ又はβ−アクチンの場合には、「対照遺伝子のｍＲＮＡ量」という文言それぞれは、ＧＡＰＤＨ又はβ−アクチンのｍＲＮＡ量を意味するものとする。 In the present invention, the gene expression level of the adiponectin receptor may be determined as an absolute value normalized by the number of cells or the total protein amount when measured. Alternatively, when the same number of cells are seeded in a plurality of the same containers, for example, wells, dishes, flasks, etc., the gene expression level of adiponectin receptor per container after culturing under the test treatment conditions is It may be expressed as a relative value based on the gene expression level of the adiponectin receptor in the fibroblast before the test treatment. Furthermore, in the present invention, the gene expression level of the adiponectin receptor is such that when the same number of cells are seeded in a plurality of identical containers, for example, wells, dishes, flasks, etc., the container 1 treated under the same conditions It may be standardized by the expression level of the control gene per one. The control gene includes a so-called housekeeping gene, but is not limited thereto, and can be found by means such as a gene expression array chip. In the present invention, housekeeping genes include, but are not limited to, 28S rRNA, 18S rRNA, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), β-actin and the like. When the control gene is GAPDH or β-actin, the phrase “mRNA amount of control gene” means the amount of GAPDH or β-actin mRNA.
本発明において、線維芽細胞は、生体から採取された線維芽細胞と、継代された線維芽細胞株とを含む。 In the present invention, the fibroblast includes a fibroblast collected from a living body and a subcultured fibroblast cell line.
本発明において、固相雑種形成法は、いわゆるノザンブロット法の他、遺伝子発現アレイチップへの雑種形成法を含むが、これらに限定されない。 In the present invention, the solid-phase hybrid formation method includes, but is not limited to, the so-called Northern blot method and the hybrid formation method on the gene expression array chip.
本発明において、被験処理条件は、試験化合物を添加した培地中で前記線維芽細胞を培養することを含み、その他に、培養の際の温度、ガス組成、ガス分圧その他の物理的条件が操作される場合がある。 In the present invention, test treatment conditions include culturing the fibroblasts in a medium to which a test compound is added, and in addition, the temperature, gas composition, gas partial pressure and other physical conditions during the operation are manipulated. May be.
本発明において、試験化合物は、レスベラトロール、フコキサンチン、（Ｚ）−グッグルステロン、（Ｅ）−グッグルステロン等を含むが、これらに限定されない。 In the present invention, the test compound includes resveratrol, fucoxanthin, (Z) -guggulsterone, (E) -guggulsterone and the like, but is not limited thereto.
本発明において、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンは、藻類を含む植物の抽出物から精製された化合物か、あるいは化学的に合成され、精製された化合物の場合があるが、これらに限定されない。 In the present invention, resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone may be, but are not limited to, compounds purified from plant extracts containing algae or chemically synthesized and purified compounds. .
本発明において、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンの「塩」とは、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンのアディポネクチン受容体の遺伝子発現を促進する効果を損なわないことを条件として、金属塩、アミン塩等を含むいずれかの塩をいう。前記金属塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等を含む場合がある。前記アミン塩は、トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩等を含む場合がある。 In the present invention, “salt” of resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone is a metal salt provided that the effect of promoting gene expression of resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone adiponectin receptor is not impaired. And any salt including amine salts and the like. The metal salt may include an alkali metal salt, an alkaline earth metal salt, and the like. The amine salt may include a triethylamine salt, a benzylamine salt, or the like.
本発明において、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンの「誘導体」とは、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンのアディポネクチン受容体の遺伝子発現を促進する効果を損なわないことを条件として、いずれかの原子団と共有結合した、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンを指す。前記いずれかの原子団は、Ｎ−フェニルアセチル基、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基等のような保護基と、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、核酸等のような生体高分子と、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステル等のような合成高分子と、エステル基等のような官能基とを含むがこれらに限定されない。前記エステル基は、例えば、メチルエステル、エチルエステルその他の脂肪族エステルか、芳香族エステルかを含む場合がある。 In the present invention, the `` derivative '' of resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone is any one provided that it does not impair the effect of promoting the gene expression of resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone adiponectin receptor Refers to resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone covalently bonded to Any one of the above atomic groups includes a protecting group such as an N-phenylacetyl group, 4,4′-dimethoxytrityl (DMT) group, and a biopolymer such as a protein, peptide, sugar, lipid, nucleic acid, and the like. Synthetic polymers such as polystyrene, polyethylene, polyvinyl, and polyester, and functional groups such as ester groups, but are not limited thereto. The ester group may include, for example, methyl ester, ethyl ester, other aliphatic esters, or aromatic esters.
本発明の剤又は組成物を含む医薬品は、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンのアディポネクチン受容体の遺伝子発現を促進する効果を損なわないことを条件として、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンか、それらの塩、及び／又は、生体内で薬物代謝酵素その他によって、レスベラトロール、フコキサンチン及びグッグルステロンを放出できる誘導体に加えて、さらに１種類又は２種類以上の薬学的に許容される添加物を含む場合がある。前記添加物は、希釈剤及び膨張剤と、結合剤及び接着剤と、滑剤と、流動促進剤と、可塑剤と、崩壊剤と、担体溶媒と、緩衝剤と、着色料と、香料と、甘味料と、防腐剤及び安定化剤と、吸着剤と、当業者に知られたその他の医薬品添加剤とを含むが、これらに限られない。 The pharmaceutical comprising the agent or composition of the present invention is resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone, provided that the effect of promoting gene expression of resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone adiponectin receptor is not impaired. , Their salts, and / or derivatives that can release resveratrol, fucoxanthin and guggulsterone by drug metabolizing enzymes in vivo, and one or more pharmaceutically acceptable additions It may contain things. The additives include diluents and swelling agents, binders and adhesives, lubricants, glidants, plasticizers, disintegrants, carrier solvents, buffering agents, colorants, fragrances, Includes, but is not limited to, sweeteners, preservatives and stabilizers, adsorbents, and other pharmaceutical additives known to those skilled in the art.
本発明の剤又は組成物を含む食品は、例えば、キャンディー、クッキー、味噌、フレンチドレッシング、マヨネーズ、フランスパン、醤油、ヨーグルト、ふりかけ、調味料・納豆のたれ、納豆、もろみ黒酢等の従来食品に用いるものであればいずれでもよく、前記例示に限定されるものでない。 The food containing the agent or composition of the present invention is, for example, conventional foods such as candy, cookies, miso, French dressing, mayonnaise, French bread, soy sauce, yogurt, sprinkle, seasoning / natto sauce, natto, moromi black vinegar, etc. Any one may be used as long as it is used in the above, and the present invention is not limited to the above examples.
本発明において、皮膚弾性特性と、アディポネクチン産生と、アディポネクチン受容体の遺伝子発現との測定は当業者に周知のいかなる測定方法を使用して実施されてもかまわない。 In the present invention, the measurement of skin elastic properties, adiponectin production, and adiponectin receptor gene expression may be performed using any measurement method known to those skilled in the art.
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。 All documents mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。 The embodiments of the present invention described below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the technical scope of the present invention. The technical scope of the present invention is limited only by the appended claims. Modifications of the present invention, for example, addition, deletion, and replacement of the configuration requirements of the present invention can be made on the condition that the gist of the present invention is not deviated.
以下の実施例に説明される研究は、「ヘルシンキ宣言（２００２年１０月改定）」、「疫学研究に関する倫理指針（平成１４年６月１７日文部科学省、厚生労働省）」、「臨床研究に関する倫理指針（平成１５年７月３０日厚生労働省）」、「実験動物の適正な実施に向けたガイドライン（平成１８年６月１日日本学術会議）」、「研究機関における動物実験等の実施に関する基本指針（平成１８年６月１日文部科学省）」及び「厚生労働省における動物実験等の実施に関する基本指針（平成１８年６月１日厚生労働省）」の趣旨に則り資生堂リサーチセンターの倫理委員会によって承認された後に実施された。 The studies described in the following examples include the “Declaration of Helsinki (revised in October 2002)”, “Ethical Guidelines for Epidemiological Research” (June 17, 2002, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology, Ministry of Health, Labor and Welfare), “ "Ethical Guidelines (July 30, 2003, Ministry of Health, Labor and Welfare)", "Guidelines for Proper Implementation of Experimental Animals (June 1, 2006 Japan Science Council)", "Research on Animal Experiments at Research Organizations" Ethics committee members of the Shiseido Research Center in accordance with the basic guidelines (June 1, 2006, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology) and "Basic Guidelines for Implementation of Animal Experiments in the Ministry of Health, Labor and Welfare (June 1, 2006, Ministry of Health, Labor and Welfare)" It was implemented after it was approved by the association.
アディポネクチンと皮膚弾性特性との相関関係
１．材料及び方法
（１）被験者
３０歳ないし４０歳の健康な女性ボランティア３０名が、被験者として選定された。これらの女性被検者は、非喫煙者で、日光曝露が中程度である。試験内容等が、選定された被験者に文書に基づいて説明され、全ての被験者の同意が得られた。
Correlation between adiponectin and skin elastic properties Materials and Methods (1) Subjects Thirty healthy female volunteers 30 to 40 years old were selected as subjects. These female subjects are non-smokers with moderate sun exposure. The contents of the test were explained to the selected subjects based on the documents, and the consent of all subjects was obtained.
（２）高分子多量体アディポネクチン濃度の測定
血液が、前記被験者から一晩絶食後に採取され、血漿試料が当業者に周知の標準的な方法に従って調製された。その後、常法に従って、血漿試料中の高分子多量体アディポネクチン濃度が測定された。
(2) Measurement of high molecular weight multimeric adiponectin concentration Blood was collected from the subjects after an overnight fast and plasma samples were prepared according to standard methods well known to those skilled in the art. Thereafter, the polymer multimeric adiponectin concentration in the plasma sample was measured according to a conventional method.
（３）皮膚弾性特性の測定
被験者の皮膚弾性特性は、顔面を洗浄し、恒温恒湿室（室温：２１±２°Ｃ、湿度：４５±５％）で３０分間安静にした後、測定された。測定には、陰圧吸引による非侵襲的な生体皮膚粘弾性測定装置であるキュートメーター（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ）ＭＰＡ５８０（登録商標、ドイツ、ケルン市、Ｃｏｕｒａｇｅ ａｎｄ Ｋｈａｚａｋａ）が用いられた。被験者は、仰臥状態で首を４５度傾げて頬を水平にした状態にされ、口角から３ｃｍの頬の中心の皮膚が２ｍｍ径のプローブを用いて４００ｍｂａｒの陰圧で２秒間吸引された。その後、常圧に戻して２秒間の緩和時間で皮膚が戻る様子が、波形図で記録された。皮膚弾性特性のパラメーターは、Ｄｅｌｅｉｘｈｅ−Ｍａｕｈｉｎ、Ｆ．らが報告した論文（Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １９：１３０−１３３（１９９４））の記載に基づいて決定された。皮膚弾性特性回復率は、弾性回復成分（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ：Ｕｒ）を最大吸引値（ｆｉｎａｌ ｄｉｓｔｅｎｔｉｏｎ：Ｕｆ）で除算した商として算出された。
(3) Measurement of skin elasticity characteristics The skin elasticity characteristics of the subjects were measured after washing the face and resting in a constant temperature and humidity room (room temperature: 21 ± 2 ° C, humidity: 45 ± 5%) for 30 minutes. It was. For the measurement, a cutometer MPA580 (registered trademark, Curage and Khazaka, Germany), which is a noninvasive living skin viscoelasticity measuring apparatus by negative pressure suction, was used. In the supine state, the subject was placed in a state where his neck was tilted 45 degrees and the cheek was leveled, and the skin at the center of the cheek 3 cm from the corner of the mouth was aspirated for 2 seconds at a negative pressure of 400 mbar using a 2 mm diameter probe. Thereafter, the state of returning to normal pressure and the skin returning with a relaxation time of 2 seconds was recorded as a waveform diagram. Skin elastic property parameters are described in Delixhe-Mauhin, F.A. And the like (Clin. Exp. Dermatol. 19: 130-133 (1994)). The skin elastic property recovery rate was calculated as a quotient obtained by dividing an elastic recovery component (Ur) by a maximum suction value (final displacement: Uf).
（４）アディポネクチンと皮膚弾性特性との相関関係の評価
前記高分子多量体アディポネクチン濃度と、前記皮膚弾性特性回復率とのデータは、ピアソンの相関係数を算出して評価された。
(4) Evaluation of correlation between adiponectin and skin elastic property The data of the polymer multimeric adiponectin concentration and the skin elastic property recovery rate were evaluated by calculating Pearson's correlation coefficient.
２．結果
アディポネクチンとヒト皮膚弾性特性との相関関係
図１は、アディポネクチンとヒト皮膚弾性特性との相関関係を調べた実験結果を示すグラフである。グラフ中の「Ｎ」の記載は被験者数を、「ｐ」の記載は有意確率を、「ｒ」の記載は積率相関係数を示す。図１に示されるとおり、血漿試料中の高分子多量体アディポネクチン濃度（μｇ／ｍＬ）と、皮膚弾性特性回復率とは正の相関を示した。
2. Results Correlation between Adiponectin and Human Skin Elasticity Properties FIG. 1 is a graph showing the experimental results of examining the correlation between adiponectin and human skin elasticity properties. In the graph, “N” indicates the number of subjects, “p” indicates significance, and “r” indicates product moment correlation coefficient. As shown in FIG. 1, the polymer multimeric adiponectin concentration (μg / mL) in the plasma sample and the skin elastic property recovery rate showed a positive correlation.
本実施例の実験結果から、アディポネクチン濃度と皮膚弾性特性回復率とは、ヒトで正の相関を示すことが明らにされた。したがって、血中のアディポネクチン濃度を高くすることによって、皮膚弾性特性の低下を予防及び／又は改善できることが示唆された。 From the experimental results of this example, it has been clarified that the adiponectin concentration and the skin elastic property recovery rate show a positive correlation in humans. Therefore, it was suggested that a decrease in skin elastic properties can be prevented and / or improved by increasing the concentration of adiponectin in the blood.
３．考察
ここで、皮膚弾性特性と、年齢とが統計学的に有意に負の相関を示すことが以前に開示された（ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５６６１７号明細書）。この明細書を考慮すると、アディポネクチン濃度は、皮膚弾性特性と負の相関を示すことが予測された。しかし、実際には、血中のアディポネクチン濃度は、年齢と正の相関があり（磯部ら、糖尿病、４９：１１９（２００６））、年齢とともにアディポネクチン濃度が高くなる傾向がある（Ａｄａｍｃｚａｋ，Ｍら、Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６２：１１４（２００５）、及び、Ｉｓｏｂｅ，Ｔら、Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１５３：９１（２００５））ことが報告されている。そこで、加齢による皮膚弾性特性の低下は、アディポネクチンに対する応答経路の下流のシグナル伝達抑制が原因であると考えられた。
3. DISCUSSION Here, it was previously disclosed that skin elastic properties and age show a statistically significant negative correlation (PCT / JP2010 / 056617). In view of this specification, it was predicted that adiponectin concentration was negatively correlated with skin elastic properties. However, in reality, the concentration of adiponectin in blood has a positive correlation with age (Ashibe et al., Diabetes, 49: 119 (2006)), and the concentration of adiponectin tends to increase with age (Adamczak, M et al., Clin Endocrinol, 62: 114 (2005) and Isobe, T et al., Eur J Endocrinol, 153: 91 (2005)). Therefore, it was considered that the decrease in skin elastic properties due to aging was due to suppression of signal transduction downstream of the response pathway to adiponectin.
アディポネクチン受容体の免疫組織学的解析
１．材料及び方法
（１）組織切片の作製
組織切片の作製には、同意を得た患者から美容整形手術時に採取された腹部皮膚組織（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、株式会社ケー・エー・シー）が用いられた。前記皮膚組織は、アセトン・安息香酸メチル固定後、パラフィン包埋され、前記組織の薄切切片が作製された。
Immunohistochemical analysis of adiponectin receptor Materials and Methods (1) Preparation of Tissue Section For preparation of a tissue section, abdominal skin tissue (BIOPREDIC International, K.A. C. Co., Ltd.) collected from a patient who obtained consent at the time of cosmetic surgery was used. The skin tissue was fixed with acetone / methyl benzoate and then embedded in paraffin to prepare a sliced section of the tissue.
（２）免疫組織化学染色
前記組織切片の免疫組織化学染色は、当業者に周知の標準的な方法に従って行われた。簡潔には、組織切片は、キシレン及びエタノールで脱パラフィン処理された後、０．３％過酸化水素を含有するメタノールに浸漬され、内因性ペルオキシダーゼが失活された。ブロッキング処理が、ヤギ血清を用いて２０分間室温で行われた。ヒトアディポネクチン受容体１（ＡｄｉｐｏＲ１）抗体（ＡＬＸ−２１０−６４４Ｒ、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、ヒトアディポネクチン受容体２（ＡｄｉｐｏＲ２）抗体（ＡＬＸ−２１０−６４６Ｒ、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とが、ＰＢＳで１０００分の１に希釈され、１次抗体として用いられた。前記１次抗体は、室温３０分間の反応後、ＰＢＳで洗浄された。ビオチン標識ヤギ抗体が２次抗体として用いられた。前記２次抗体は、室温３０分間の反応後、ＰＢＳで洗浄された。染色がＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ（ＰＫ６１０５、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、フナコシ株式会社）を用いて、製造者の指示書に従って行われた。その後、核染色が、マイヤーヘマトキシリン溶液を用いて行われた。
(2) Immunohistochemical staining Immunohistochemical staining of the tissue sections was performed according to standard methods well known to those skilled in the art. Briefly, tissue sections were deparaffinized with xylene and ethanol and then immersed in methanol containing 0.3% hydrogen peroxide to inactivate endogenous peroxidase. Blocking was performed with goat serum for 20 minutes at room temperature. Human adiponectin receptor 1 (AdipoR1) antibody (ALX-210-644R, Enzo Life Sciences) and human adiponectin receptor 2 (AdipoR2) antibody (ALX-210-646R, Enzo Life Sciences) are 1000 parts by PBS. Diluted to 1 and used as primary antibody. The primary antibody was washed with PBS after a reaction at room temperature for 30 minutes. Biotin-labeled goat antibody was used as the secondary antibody. The secondary antibody was washed with PBS after a reaction at room temperature for 30 minutes. Staining was performed using a VECTASTAIN Elite ABC kit (PK6105, Vector Laboratories, Inc., Funakoshi Co., Ltd.) according to the manufacturer's instructions. Thereafter, nuclear staining was performed using Mayer's hematoxylin solution.
（３）染色された細胞数の計測
光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＰＲＯＶＩＳ ＡＸ８０）を用いて、強拡大（対物４０倍、接眼１０倍）で１標本あたり１６視野観察して、各視野毎にアディポネクチン受容体１及び２の陽性細胞数を計測し、全視野の平均値を各被験者のそれぞれの陽性細胞数とした。
(3) Counting the number of stained cells Using an optical microscope (OLYMPUS PROVIS AX80), observe 16 fields per specimen with strong magnification (40x objective, 10x eyepiece), and adiponectin receptor 1 for each field. And the number of positive cells of 2 was measured, and the average value of all visual fields was taken as the number of positive cells of each subject.
２．結果
（１）真皮の免疫組織化学染色
図２は、免疫組織化学染色した真皮切片の顕微鏡写真である。図２に示されるとおり、アディポネクチン受容体１（図２（Ａ）及び（Ｂ））と、アディポネクチン受容体２（図２（Ｃ）及び（Ｄ））との発現は、真皮の線維芽細胞で観察された。前記線維芽細胞は、２０歳代の試料と比較して６０歳代の試料ではほとんど観察されなかった。
2. Results (1) Immunohistochemical staining of dermis FIG. 2 is a photomicrograph of a dermis section that has been immunohistochemically stained. As shown in FIG. 2, the expression of adiponectin receptor 1 (FIGS. 2 (A) and (B)) and adiponectin receptor 2 (FIGS. 2 (C) and (D)) is expressed in dermal fibroblasts. Observed. The fibroblasts were hardly observed in the 60s sample compared to the 20s sample.
（２）染色された細胞数の計測
図３は、顕微鏡の視野１個あたりのアディポネクチン受容体１及び２の陽性細胞数を表すグラフである。各実験条件の誤差棒は、被験者の測定値の標準偏差を示す。図３に示されるとおり、アディポネクチン受容体１（図２（Ａ））と、アディポネクチン受容体２（図２（Ｃ））との陽性細胞は、３０歳代以降で顕著に低下した。
(2) Measurement of the number of stained cells FIG. 3 is a graph showing the number of positive cells of adiponectin receptors 1 and 2 per one visual field of a microscope. The error bar for each experimental condition indicates the standard deviation of the measured value of the subject. As shown in FIG. 3, the positive cells of adiponectin receptor 1 (FIG. 2 (A)) and adiponectin receptor 2 (FIG. 2 (C)) decreased significantly after the 30s.
本実施例の実験結果から、アディポネクチンに対する応答経路の下流である、アディポネクチン受容体１及び２は、加齢によって減少することが示された。したがって、加齢による皮膚弾性特性の低下は、アディポネクチン受容体１及び２の減少によって生じることが示唆された。 From the experimental results of this example, it was shown that adiponectin receptors 1 and 2, which are downstream of the response pathway to adiponectin, decrease with aging. Therefore, it was suggested that the decrease in skin elastic properties due to aging is caused by a decrease in adiponectin receptors 1 and 2.
アディポネクチン産生及びアディポネクチン受容体の遺伝子発現における紫外線照射の影響
１．材料及び方法
（１）実験動物
ＳＫＨ ＨＲ−１へアレスマウス（雄、５週齢、チャールズリバー）が用いられた。１週間の予備飼育後、前記ヘアレスマウスは、平均体重が等しくなるように、異なる実験群に配属された。
Effect of ultraviolet irradiation on adiponectin production and gene expression of adiponectin receptor Materials and Methods (1) Experimental animals SKH HR-1 hairless mice (male, 5 weeks old, Charles River) were used. After one week of pre-breeding, the hairless mice were assigned to different experimental groups so that their average body weights were equal.
（２）紫外線照射
１０８ｍＪ／ｃｍ２の紫外線（ＵＶＢ）が、紫外線照射機（デルマレイ２００、テルモ・クリニカルサプライ）を用いてヘアレスマウスの背部に照射された。紫外線照射量はＵＶＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ（ＵＶＲ−３０５／３６５Ｄ（ＩＩ）、トプコン）で測定された。紫外線未照射ヘアレスマウスが陰性対照として用いられた。
(2) Ultraviolet irradiation An ultraviolet ray (UVB) of 108 mJ / cm 2 was irradiated to the back of a hairless mouse using an ultraviolet irradiation machine (Dermalley 200, Terumo Clinical Supply). The amount of ultraviolet irradiation was measured with UVRADIOMETER (UVR-305 / 365D (II), Topcon). UV-irradiated hairless mice were used as negative controls.
（３）アディポネクチン濃度の測定
血清試料が、陰性対照のマウス（５匹）と、紫外線照射後２４時間のマウス（５匹）とから調製され、総アディポネクチン濃度が測定された。前記総アディポネクチン濃度は、アディポネクチンＥＬＩＳＡキット（４１０７１３、大塚製薬株式会社）を用いて測定された。
(3) Measurement of adiponectin concentration Serum samples were prepared from negative control mice (5 mice) and mice 24 hours after UV irradiation (5 mice), and the total adiponectin concentration was measured. The total adiponectin concentration was measured using an adiponectin ELISA kit (410713, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
（４）アディポネクチン受容体の遺伝子発現
陰性対照のマウス（５匹）と、紫外線照射４、８及び２４時間後のマウス（それぞれ５匹）とから皮膚組織が採取され、即座に液体窒素で凍結された。凍結皮膚組織は、凍結プレス破砕装置（クライオプレス、マイクロテック・ニチオン）で粉砕された。ＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製は、当業者に周知の標準的な方法に従って実施された。定量ＲＴ−ＰＣＲには、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ ｋｉｔ（０４５３５２８６００１、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）が用いられた。アディポネクチン受容体１、アディポネクチン受容体２及びβ−アクチンの遺伝子を増幅するために、配列番号１及び２と、配列番号３及び４と、配列番号５及び６との順方向及び逆方向プライマー対それぞれが用いられた。ＰＣＲは、９５°Ｃ、１０分間を１回と、９５°Ｃ、１０秒間、５５°Ｃ、２０秒間及び７２°Ｃ、１秒間を４５回との反応条件で行われた。アディポネクチン受容体１、アディポネクチン受容体２及びβ−アクチンの遺伝子発現率は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で解析され、β−アクチンの発現量で標準化して算出された。
(4) Gene expression of adiponectin receptor Skin tissue was collected from negative control mice (5 mice) and mice after UV irradiation 4, 8 and 24 hours (each 5 mice) and immediately frozen in liquid nitrogen It was. The frozen skin tissue was pulverized with a freeze press crusher (Cryopress, Microtech Nithion). RNA and cDNA preparation was performed according to standard methods well known to those skilled in the art. For the quantitative RT-PCR, LightCycler (registered trademark) TaqMan (registered trademark) Master kit (04535286001, Roche Diagnostics Inc.) was used. Forward and reverse primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, and SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively, for amplifying genes of adiponectin receptor 1, adiponectin receptor 2 and β-actin Was used. PCR was performed under the reaction conditions of 95 ° C, 10 minutes once, and 95 ° C, 10 seconds, 55 ° C, 20 seconds, 72 ° C, 45 seconds. The gene expression rates of adiponectin receptor 1, adiponectin receptor 2 and β-actin were measured using LightCycler Software Ver. It was analyzed by 3.5 (Roche Diagnostics Co., Ltd.) and standardized by the expression level of β-actin and calculated.
２．結果
（１）アディポネクチン濃度
図４は、マウスのアディポネクチン産生における紫外線照射の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、陰性対照群及び紫外線照射群のマウスそれぞれ５匹の血清試料中の総アディポネクチン濃度を測定した実験結果の各群の測定値の標準偏差を示す。図４に示されるとおり、血清試料中の総アディポネクチン濃度は、紫外線照射によって変化しなかった。
2. Results (1) Adiponectin Concentration FIG. 4 is a graph showing the experimental results of examining the influence of ultraviolet irradiation on adiponectin production in mice. The error bar for each experimental condition indicates the standard deviation of the measured value of each group of the experimental results of measuring the total adiponectin concentration in the serum samples of 5 mice each of the negative control group and the ultraviolet irradiation group. As shown in FIG. 4, the total adiponectin concentration in the serum sample was not changed by ultraviolet irradiation.
（２）アディポネクチン受容体の遺伝子発現
図５は、アディポネクチン受容体の遺伝子発現における紫外線照射の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、陰性対照群及び紫外線照射群のマウスそれぞれ５匹における、アディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現を測定した実験結果の測定値の標準偏差を示す。アステリスク（＊）は、ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｄｕｎｎｅｔ ｔｅｓｔで陰性対照と比較したｐ値が５％未満であることを示す。図５に示されるとおり、アディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現は、紫外線照射後、経時的に顕著に低下した。
(2) Gene Expression of Adiponectin Receptor FIG. 5 is a graph showing the experimental results of examining the influence of ultraviolet irradiation on the gene expression of the adiponectin receptor. The error bar for each experimental condition indicates the standard deviation of the measured values of the experimental results obtained by measuring the gene expression of adiponectin receptors 1 and 2 in 5 mice each of the negative control group and the ultraviolet irradiation group. An asterisk (*) indicates a p value of less than 5% compared to the negative control in the parametric Dunnet test. As shown in FIG. 5, the gene expression of adiponectin receptors 1 and 2 significantly decreased over time after UV irradiation.
本実施例の実験結果から、紫外線照射に対する応答調節が、アディポネクチンと、アディポネクチン受容体とで異なることが示された。このため、加齢に対する応答調節も、アディポネクチンと、アディポネクチン受容体とで異なることが示唆された。したがって、アディポネクチン受容体１及び２の発現促進が、加齢による皮膚弾性特性の低下を予防及び／又は改善するために有効であることが示唆された。 From the experimental results of this example, it was shown that the response control to ultraviolet irradiation was different between adiponectin and adiponectin receptor. Therefore, it was suggested that the regulation of the response to aging also differs between adiponectin and the adiponectin receptor. Therefore, it was suggested that promoting the expression of adiponectin receptors 1 and 2 is effective for preventing and / or improving the decrease in skin elastic properties due to aging.
アディポネクチン受容体の遺伝子発現を促進する化合物のスクリーニング
１．材料及び方法
（１）試験化合物の調製
アディポネクチン受容体の遺伝子発現を促進する効果を評価するために、レスベラトロール（Ｒ５０１０、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）と、フコキサンチン（０６７−０５５１１、和光純薬工業株式会社）と、（Ｚ）−グッグルステロン（Ｇ５１６８、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）と、（Ｅ）−グッグルステロン（Ｇ４９２３、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）とが試験化合物として用いられた。ウシ胎仔血清を２％添加したＦＧＭ−２（ＣＣ−３１３２、ＬＯＮＺＡ）（以下、「線維芽細胞培養用培地」という。）が前記化合物の調製に用いられた。ここで、レスベラトロールは、１５μＭ、３０μＭ及び６０μＭとなるように線維芽細胞培養用培地に添加された。フコキサンチンは、５μＭ、１０μＭ及び２０μＭとなるように線維芽細胞培養用培地に添加された。（Ｚ）−グッグルステロンは、２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭとなるように線維芽細胞培養用培地に添加された。（Ｅ）−グッグルステロンは、１２．５μＭ、２５μＭ及び５０μＭとなるように線維芽細胞培養用培地に添加された。（Ｚ）−グッグルステロン及び（Ｅ）−グッグルステロンの混合物では、（Ｚ）−グッグルステロン及び（Ｅ）−グッグルステロンそれぞれが、１２．５μＭとなるように線維芽細胞培養用培地に添加された。ＤＭＳＯを添加した線維芽細胞培養用培地が、陰性対照として用いられた。
Screening of compounds that promote gene expression of adiponectin receptor Materials and Methods (1) Preparation of Test Compound Resveratrol (R5010, Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) and fucoxanthin (067-105511, Wako Pure Chemical Industries) were used to evaluate the effect of promoting gene expression of adiponectin receptor. Kogyo Co., Ltd.), (Z) -Guggulsterone (G5168, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.), and (E) -Guggulsterone (G4923, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.) were used as test compounds. FGM-2 (CC-3132, LONZA) (hereinafter referred to as “fibroblast culture medium”) supplemented with 2% fetal calf serum was used for the preparation of the compound. Here, resveratrol was added to the culture medium for fibroblasts so that it might become 15 micromol, 30 micromol, and 60 micromol. Fucoxanthin was added to the fibroblast culture medium to 5 μM, 10 μM and 20 μM. (Z) -Guggulsterone was added to the fibroblast culture medium so as to be 25 μM, 50 μM and 100 μM. (E) -Guggulsterone was added to the fibroblast culture medium to 12.5 μM, 25 μM and 50 μM. In the mixture of (Z) -Guggulsterone and (E) -Guggulsterone, (Z) -Guggulsterone and (E) -Guggulsterone were each added to the fibroblast culture medium to 12.5 μM. . Fibroblast culture medium supplemented with DMSO was used as a negative control.
（２）細胞培養
細胞は、ヒト真皮線維芽細胞（ＣＣ−２５０９、ＬＯＮＺＡ）が用いられた。前記細胞は、ウェル１個あたり１５．２×１０４個となるように市販の６ウェル培養プレート（３０４６、ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種された。前記細胞は、線維芽細胞培養用培地を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で２４時間培養された。その後、培地は、前記試験化合物を添加した線維芽細胞培養用培地に切り換えられ、前記線維芽細胞は２４時間培養された。
(2) Cell culture Human dermal fibroblasts (CC-2509, LONZA) were used as the cells. The cells were seeded in a commercially available 6-well culture plate (3046, Falcon, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) so that there were 15.2 × 10 4 cells per well. The cells were cultured for 24 hours under a 37 ° C, 5% CO 2 and saturated water vapor atmosphere using a fibroblast culture medium. Thereafter, the medium was switched to a fibroblast culture medium supplemented with the test compound, and the fibroblasts were cultured for 24 hours.
（３）アディポネクチン受容体の遺伝子発現
アディポネクチン受容体の遺伝子発現は、実施例３で説明された方法に従って測定された。アディポネクチン受容体１、アディポネクチン受容体２及びグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の遺伝子を増幅するために、配列番号７及び８と、配列番号９及び１０と、配列番号１１及び１２との順方向及び逆方向プライマー対それぞれが用いられた。アディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現率は、ＧＡＰＤＨの発現量で標準化して算出された。
(3) Adiponectin receptor gene expression Adiponectin receptor gene expression was measured according to the method described in Example 3. In order to amplify the genes for adiponectin receptor 1, adiponectin receptor 2 and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, and SEQ ID NOs: 11 and 12 Each forward and reverse primer pair was used. The gene expression rates of adiponectin receptors 1 and 2 were calculated by standardizing with the expression level of GAPDH.
２．結果
アディポネクチン受容体の遺伝子発現
図６及び７は、アディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現におけるレスベラトロール、フコキサンチン、（Ｚ）−グッグルステロン及び（Ｅ）−グッグルステロンの影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、陰性対照群及び試験化合物添加群それぞれのウェル４個の線維芽細胞におけるアディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現を測定した実験結果の測定値の標準偏差を示す。アステリスク（＊）、（＊＊）及び（＊＊＊）それぞれは、ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｄｕｎｎｅｔ ｔｅｓｔ（ＡｄｉｐｏＲ１）又はＳｔｅｅｌ ｔｅｓｔ（ＡｄｉｐｏＲ２）で陰性対照と比較したｐ値が、５％未満、１％未満及び０．１％未満であることを示す。図６及び７に示されるとおり、レスベラトロール、フコキサンチン、（Ｚ）−グッグルステロン及び（Ｅ）−グッグルステロンを添加すると、アディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現は、統計学的に有意に増大した。（Ｅ）−グッグルステロンは、（Ｚ）−グッグルステロンと比較して、アディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現を促進する効果が高かった。
2. Results Gene Expression of Adiponectin Receptors FIGS. 6 and 7 show experimental results of examining the effects of resveratrol, fucoxanthin, (Z) -guggulsterone and (E) -guggulsterone on gene expression of adiponectin receptors 1 and 2. It is a graph which shows. The error bars for each experimental condition indicate the standard deviation of the measured values of the experimental results obtained by measuring the gene expression of adiponectin receptors 1 and 2 in 4 wells of each of the negative control group and the test compound addition group. The asterisks (*), (**) and (***) respectively have a p-value of less than 5%, less than 1% and less than 0.5% compared to the negative control in the parametric Dunnett test (AdipoR1) or Steel test (AdipoR2). Indicates less than 1%. As shown in FIGS. 6 and 7, when resveratrol, fucoxanthin, (Z) -guggulsterone and (E) -guggulsterone were added, the gene expression of adiponectin receptors 1 and 2 was statistically significant. Increased. (E) -Guggulsterone was more effective in promoting gene expression of adiponectin receptors 1 and 2 than (Z) -Guggulsterone.
図８は、アディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現における、（Ｚ）−グッグルステロン及び（Ｅ）−グッグルステロンの混合物の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、陰性対照群及び試験化合物添加群それぞれのウェル４個の線維芽細胞におけるアディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現を測定した実験結果の測定値の標準偏差を示す。アステリスク（＊＊）は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔで陰性対照と比較したｐ値が１％未満であることを示す。図８に示されるとおり、（Ｚ）−グッグルステロン及び（Ｅ）−グッグルステロンの混合物は、（Ｚ）−グッグルステロン単独及び（Ｅ）−グッグルステロン単独では作用がみとめられなかった用量でも混合させることでアディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現を著明に増加させた。 FIG. 8 is a graph showing experimental results of examining the influence of a mixture of (Z) -guggulsterone and (E) -guggulsterone on gene expression of adiponectin receptors 1 and 2. The error bars for each experimental condition indicate the standard deviation of the measured values of the experimental results obtained by measuring the gene expression of adiponectin receptors 1 and 2 in the four fibroblasts in each of the negative control group and the test compound addition group. An asterisk (**) indicates that the p-value compared to the negative control on Student t test is less than 1%. As shown in FIG. 8, the mixture of (Z) -Guggulsterone and (E) -Guggulsterone is mixed even at doses where (Z) -Guggulsterone alone and (E) -Guggulsterone alone did not work. This significantly increased the gene expression of adiponectin receptors 1 and 2.
本実施例の実験結果から、レスベラトロール、フコキサンチン、（Ｚ）−グッグルステロン及び（Ｅ）−グッグルステロンは、アディポネクチン受容体１及び２の遺伝子発現を促進することが示された。したがって、レスベラトロール、フコキサンチン、（Ｚ）−グッグルステロン及び（Ｅ）−グッグルステロンは、アディポネクチン受容体の発現減少をともなう皮膚弾性特性の低下を予防及び／又は改善できることが示唆された。 From the experimental results of this example, it was shown that resveratrol, fucoxanthin, (Z) -guggulsterone and (E) -guggulsterone promote the gene expression of adiponectin receptors 1 and 2. Therefore, it was suggested that resveratrol, fucoxanthin, (Z) -guggulsterone and (E) -guggulsterone can prevent and / or improve the decrease in skin elastic properties accompanied by decreased expression of adiponectin receptor.
アディポネクチン産生におけるグッグルステロンの影響
１．材料及び方法
（１）試験化合物の調製
（Ｚ）−グッグルステロン（Ｇ５１６８、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）と、（Ｅ）−グッグルステロン（Ｇ４９２３、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）と、トログリタゾン（Ｔ２５７３、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）とが、以下のとおり評価された。ウシ胎仔血清を１０％添加したブレットキットＰＧＭ−２（ＰＴ−８００２、ＬＯＮＺＡ）（以下、「脂肪細胞維持用培地」という。）と、該培地に分化因子（ＰＴ−９５０２、ＬＯＮＺＡ）を添加した培地（以下、「脂肪細胞分化用培地」という。）とが用意された。ここで、（Ｅ）−グッグルステロンは、１２．５μＭとなるように脂肪細胞分化用培地に添加された。（Ｚ）−グッグルステロンは、２５μＭとなるように脂肪細胞分化用培地に添加された。（Ｅ）−グッグルステロン及び（Ｚ）−グッグルステロンの混合物では、（Ｅ）−グッグルステロン及び（Ｚ）−グッグルステロンそれぞれが、１２．５μＭとなるように分化用培地に添加された。トログリタゾンが５μＭとなるように脂肪細胞分化用培地に添加された。ＤＭＳＯを添加した脂肪細胞分化用培地が、陰性対照として用いられた。
Effect of guggulsterone on adiponectin production Materials and Methods (1) Preparation of Test Compound (Z) -Guggulsterone (G5168, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.), (E) -Guggulsterone (G4923, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.), and troglitazone (T2573, Sigma-Aldrich) Japan Corporation) was evaluated as follows. Bullet kit PGM-2 (PT-8002, LONZA) supplemented with 10% fetal calf serum (hereinafter referred to as "adipocyte maintenance medium") and differentiation factor (PT-9502, LONZA) were added to the medium. A medium (hereinafter referred to as “adipocyte differentiation medium”) was prepared. Here, (E) -guggulsterone was added to the adipocyte differentiation medium to 12.5 μM. (Z) -Guggulsterone was added to the adipocyte differentiation medium to 25 μM. In the mixture of (E) -Guggulsterone and (Z) -Guggulsterone, (E) -Guggulsterone and (Z) -Guggulsterone were each added to the differentiation medium to 12.5 μM. Troglitazone was added to the adipocyte differentiation medium to 5 μM. Adipocyte differentiation medium supplemented with DMSO was used as a negative control.
（２）細胞培養
細胞は、ヒト脂肪細胞（ＰＴ−５００５、ＬＯＮＺＡ）が用いられた。前記細胞は、ウェル１個あたり１．２×１０４個となるように市販の９６ウェル培養プレート（３０４７、ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種された。前記細胞は、脂肪細胞維持用培地を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で２４時間培養された。その後、培地は、前記試験化合物を添加した脂肪細胞分化用培地に切り換えられ、前記脂肪細胞は７日間培養された。
(2) Cell culture Human adipocytes (PT-5005, LONZA) were used as cells. The cells were seeded in a commercially available 96-well culture plate (3047, Falcon, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) so that the number of cells was 1.2 × 10 4 per well. The cells were cultured for 24 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 and saturated water vapor atmosphere using a fat cell maintenance medium. Thereafter, the medium was switched to an adipocyte differentiation medium supplemented with the test compound, and the adipocytes were cultured for 7 days.
（３）アディポネクチン濃度の測定
総アディポネクチン濃度は、実施例３で説明された方法に従って測定された。
(3) Measurement of adiponectin concentration The total adiponectin concentration was measured according to the method described in Example 3.
２．結果
図９は、アディポネクチン産生におけるグッグルステロン及びトログリタゾンの影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、陰性対照群及び試験化合物添加群それぞれのウェル４個の脂肪細胞におけるアディポネクチン産生を測定した実験結果の測定値の標準偏差を示す。図９に示されるとおり、トログリタゾンはアディポネクチン産生を促進した一方、（Ｅ）−グッグルステロン単独と、（Ｚ）−グッグルステロン単独と、（Ｅ）−グッグルステロン及び（Ｚ）−グッグルステロンの混合物とはアディポネクチン産生を促進しなかった。
2. Results FIG. 9 is a graph showing the experimental results of examining the effects of guggulsterone and troglitazone on adiponectin production. The error bars for each experimental condition indicate the standard deviation of the measured values of the experimental results of measuring adiponectin production in the adipocytes of 4 wells in each of the negative control group and the test compound addition group. As shown in FIG. 9, troglitazone promoted adiponectin production, while (E) -Guggulsterone alone, (Z) -Guggulsterone alone, and a mixture of (E) -Guggulsterone and (Z) -Guggulsterone Did not promote adiponectin production.
結論
以上の実験結果から、アディポネクチン濃度と皮膚弾性特性回復率とは、ヒトで正の相関を示すことが明らかとなった。したがって、血中のアディポネクチン濃度を高くすることによって、皮膚状態の悪化、特に皮膚弾性特性の低下を予防及び／又は改善できることが示唆された。
Conclusion From the above experimental results, it has been clarified that the adiponectin concentration and the skin elastic property recovery rate show a positive correlation in humans. Therefore, it was suggested that an increase in the adiponectin concentration in the blood can prevent and / or improve the deterioration of the skin condition, particularly the decrease in skin elastic properties.
アディポネクチン受容体１及び２の発現は、加齢、及び、代表的な加齢モデル実験で用いられる紫外線照射において低下することが示された。これらを考慮すると、加齢による皮膚弾性特性の低下は、アディポネクチン受容体１及び２の発現低下によって生じることが示唆された。また、加齢以外のその他の要因によってもアディポネクチン受容体の発現が減少すると、皮膚弾性特性が低下すると考えられた。したがって、アディポネクチン受容体の発現を促進する、レスベラトロール、フコキサンチン、（Ｚ）−グッグルステロン及び（Ｅ）−グッグルステロンは、皮膚状態の悪化、特に皮膚弾性特性の低下を予防及び／又は改善できることが示唆された。 It has been shown that the expression of adiponectin receptors 1 and 2 decreases with age and with UV irradiation used in representative aging model experiments. Considering these, it was suggested that the decrease in skin elastic properties due to aging is caused by a decrease in the expression of adiponectin receptors 1 and 2. In addition, it was considered that the skin elastic properties were lowered when the expression of adiponectin receptor decreased due to other factors besides aging. Therefore, resveratrol, fucoxanthin, (Z) -guggulsterone and (E) -guggulsterone, which promote the expression of adiponectin receptor, prevent and / or improve the deterioration of skin condition, particularly the decrease in skin elastic properties It was suggested that it can be done.
Claims (4)
The agent according to any one of claims 1 to 3, which is used for preventing or improving a decrease in skin elastic properties.
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