JP2012158545A - Purification method of isoflavone fermentation metabolite - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、セルロースエステルを用いたイソフラボン発酵代謝産物の精製方法に関する。 The present invention relates to a method for purifying isoflavone fermentation metabolites using cellulose esters.
大豆、葛などのマメ科の植物に多く含まれているイソフラボン類はポリフェノールの分類のひとつであり、イソフラボンを基本骨格とするフラボノイドである。近年の調査により、イソフラボン類は女性ホルモン作用（エストロゲン）や抗酸化作用を有し、イソフラボン類を摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害などに対して予防効果があることが明らかとなっている（非特許文献１〜６）。 Isoflavones, which are abundant in leguminous plants such as soybeans and kuzu, are a class of polyphenols and are flavonoids based on isoflavones. According to recent research, isoflavones have female hormonal action (estrogens) and antioxidant action, and by taking isoflavones, breast cancer, prostate cancer, osteoporosis, hypercholesterolemia, heart disease, climacteric disorder, etc. It has become clear that there is a preventive effect (Non-Patent Documents 1 to 6).
イソフラボン類は、たとえば大豆内では、糖と共有結合した配糖体の形、ダイジン(daidzin)、グリシチン（glycitn）、ゲニスチン(genistin)として存在しており、アグリコンの形ではごく少量存在しているのみである。これら配糖体はさらにマロニル化、アセチル化されているものも存在している。これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素であるβグルコシダーゼ等の働きにより、それぞれダイゼイン（daidzein）、グリシテイン（glycitein）、ゲニステイン（genistein）となる。さらに、ダイゼインは腸内細菌の働きにより、ジヒドロダイゼイン（dihydrodaidzein）を経て、O-デスメチルアンゴレンシン（O-desmethylangolensin：O-DMA） 又はエクオール（equol）へと酵素的に変換されることが知られている（図１）。 Isoflavones exist, for example, in soybeans in the form of glycosides covalently linked to sugars, daidzin, glycitn, genistin, and in very small amounts in the form of aglycone. Only. Some of these glycosides are further malonylated and acetylated. These glycosides enter the body of humans and animals by the action of digestive enzymes or β-glucosidase, which is an enzyme produced by intestinal bacteria, respectively, such as daidzein, glycitein, genistein and genistein. Become. Furthermore, it is known that daidzein is enzymatically converted to O-desmethylangolensin (O-DMA) or equol via dihydrodaidzein by the action of intestinal bacteria. (FIG. 1).
エクオールは、これらの代謝産物の中で最もエストロゲン活性が高いことが知られている（非特許文献７及び８）。しかしながら、人間の場合、イソフラボンの代謝には個人差があり、上記のようにダイゼインを発酵させてエクオールを産生する能力を有する腸内細菌を保有する人は少なく、その保有率は日本人で約５割、欧米人で約３割程度であることが明らかとなっている（非特許文献９及び１０）。そのため、エクオール産生菌を保有しない人は、大豆等のマメ科食物を摂取してもエクオールを体内で産生することができないという問題点が存在していた。
Equol is known to have the highest estrogenic activity among these metabolites (Non-patent Documents 7 and 8). However, in the case of humans, the metabolism of isoflavones varies from person to person, and few people have enteric bacteria that have the ability to ferment daidzein and produce equol as described above. It is clear that it is about 30% for Westerners and about 30% (
これらの課題を克服するために、近年、乳酸菌等の嫌気性微生物を用いて体外的にエクオールを産生させる試みがなされている（特許文献１〜５）。しかしながら、どのような精製方法により、より効果的・実用的にエクオールの回収ができるかについては、明らかとなっていなかった。微生物を用いてエクオールを産生させる場合、発酵液には培地成分、界面活性剤、グルコースなど不純物が多く含まれるため、濃縮時に発砲トラブルを引き起こす要因となっていた。また、エクオールについては、食品用途への応用が考えられるため、酢酸エチルやヘキサン等の有機溶媒を用いた精製プロセスを利用することは好ましくなく、さらに、単純に発酵液を乾燥させる場合には、製品におけるエクオール含量が低くなり、不必要な不純物が多く含まれるという問題点があった。製品中のイソフラボン発酵代謝産物（エクオール）含量を高くするために、培地成分などの不純物をより高率的に除去する精製方法の確立が求められていた。 In order to overcome these problems, in recent years, attempts have been made to produce equol ex vivo using anaerobic microorganisms such as lactic acid bacteria (Patent Documents 1 to 5). However, it has not been clarified as to what purification method can recover equol more effectively and practically. When equol is produced using microorganisms, the fermentation broth contains a large amount of impurities such as medium components, surfactants, glucose, etc., and this has been a factor causing firing troubles during concentration. As for equol, since it can be applied to food applications, it is not preferable to use a purification process using an organic solvent such as ethyl acetate or hexane. Furthermore, when simply drying the fermentation broth, There was a problem that the equol content in the product was low and many unnecessary impurities were contained. In order to increase the content of isoflavone fermentation metabolites (equol) in products, it has been required to establish a purification method that removes impurities such as medium components at a higher rate.
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、セルロースエステルを用いることにより、従来よりも効果的にイソフラボン発酵代謝産物を精製する方法を提供することにある。 This invention is made | formed in view of such a condition, The objective is to provide the method of refine | purifying an isoflavone fermentation metabolite more effectively than before by using a cellulose ester.
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。 In order to solve the above problems, the present inventors have conducted intensive research.
本発明者らは、嫌気性微生物の一例としてコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌を用い、イソフラボン発酵代謝産物の一例であるエクオールを産生し、イソフラボン発酵代謝産物の精製における好適な条件の検討を行った。 The present inventors use bacteria classified into the family of Coriobacteriaceae as an example of anaerobic microorganisms, produce equol, which is an example of an isoflavone fermentation metabolite, and are suitable for purification of an isoflavone fermentation metabolite. We examined various conditions.
具体的には、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株を、複数種類の混合ガスからなる気相存在下で培養し、ダイゼインをエクオールへ発酵させ、吸着精製法を用いたエクオールの好適な精製条件の検討を行った。 Specifically, Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain was cultured in the presence of a gas phase consisting of multiple types of mixed gas, fermented daidzein to equol, and equol using adsorption purification method. Appropriate purification conditions were investigated.
その結果、発酵液をセルロースエステル（例えば、酢酸セルロース）により処理することにより、エクオールがセルロースエステルに吸着することを見出し、本特性を用いて吸着精製を行うことにより、エクオールの精製効率が飛躍的に高まることが明らかとなった。 As a result, by treating the fermentation broth with cellulose ester (for example, cellulose acetate), we found that equol was adsorbed to cellulose ester, and by performing adsorption purification using this property, the purification efficiency of equol was dramatically increased. It became clear that it would increase.
即ち、本発明者らは、イソフラボン発酵代謝産物の好適な精製条件の確立に成功し、これにより本発明を完成するに至った。 That is, the present inventors have succeeded in establishing suitable purification conditions for isoflavone fermentation metabolites, thereby completing the present invention.
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１３〕を提供するものである。
〔１〕次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させる工程、及び
（２）セルロースエステルへ吸着したイソフラボン発酵代謝産物を回収する工程。
〔２〕次の工程を含むイソフラボン発酵代謝産物の精製方法；
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
（２）洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する工程、及び
（３）回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる工程。
〔３〕前記セルロースエステルが、少なくとも１種類以上の脂肪族有機酸エステルであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔４〕前記脂肪族有機酸エステルが、酢酸セルロースであることを特徴とする、〔３〕に記載の精製方法。
〔５〕前記酢酸セルロースの酢化度が、５０〜６２％であることを特徴とする、〔４〕に記載の精製方法。
〔６〕前記セルロースエステルの平均重合度が、１０〜１０００であることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔７〕前記セルロースエステルの形状が、粉末、粒状、チップ状、繊維状、平膜状、又は中空糸膜状のいずれかであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔８〕前記セルロースエステルが、多孔性構造であることを特徴とする、〔７〕に記載の精製方法。
〔９〕前記イソフラボン発酵代謝産物が、エクオール、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ジヒドロダイゼイン、又はO-デスメチルアンゴレンシンのいずれかであることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔１０〕前記イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液が、嫌気性微生物によるイソフラボン発酵生産物を含むこと特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法。
〔１１〕前記嫌気性微生物がコーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌又はこれらの類縁菌であることを特徴とする、〔１０〕に記載の精製方法。
〔１２〕前記嫌気性微生物が、コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属、アトポビウム（Atopobium）属、コリンゼラ（Collinsella）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属、エガセラ（Eggerthella）属、エンテロハブダス（Enterorhabdus）属、ゴードニバクター（Gordonibacter）属、オルセネラ（Olsenella）属、パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属、又はスラッキア（Slackia）属のいずれかに分類される菌であることを特徴とする、〔１０〕に記載の精製方法。
〔１３〕前記嫌気性微生物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株であることを特徴とする、〔１０〕に記載の精製方法。
More specifically, the present invention provides the following [1] to [13].
[1] A method for purifying isoflavone fermentation metabolites including the following steps;
(1) A step of bringing a sample solution containing an isoflavone fermentation metabolite into contact with a cellulose ester, and (2) a step of recovering the isoflavone fermentation metabolite adsorbed on the cellulose ester.
[2] A method for purifying isoflavone fermentation metabolites including the following steps;
(1) contacting a sample solution containing an isoflavone fermentation metabolite with a cellulose ester, and adsorbing the isoflavone fermentation metabolite to the cellulose ester;
(2) A step of washing the cellulose ester adsorbed with the isoflavone fermentation metabolite with a washing solution, and (3) a step of desorbing the isoflavone fermentation metabolite from the cellulose ester with a recovery solution.
[3] The purification method according to [1] or [2], wherein the cellulose ester is at least one aliphatic organic acid ester.
[4] The purification method according to [3], wherein the aliphatic organic acid ester is cellulose acetate.
[5] The purification method according to [4], wherein the acetylation degree of the cellulose acetate is 50 to 62%.
[6] The purification method according to [1] or [2], wherein the average degree of polymerization of the cellulose ester is 10 to 1000.
[7] The shape of the cellulose ester is any of powder, granule, chip, fiber, flat membrane, or hollow fiber membrane, [1] or [2] Purification method.
[8] The purification method according to [7], wherein the cellulose ester has a porous structure.
[9] The purification according to [1] or [2], wherein the isoflavone fermentation metabolite is any one of equol, daidzein, glycitein, genistein, dihydrodaidzein, or O-desmethylangolensin. Method.
[10] The purification method according to [1] or [2], wherein the sample solution containing the isoflavone fermentation metabolite includes an isoflavone fermentation product by an anaerobic microorganism.
[11] The purification method according to [10], wherein the anaerobic microorganism is a bacterium classified into the family Coriobacteriaceae or a related bacterium.
[12] The anaerobic microorganism is selected from the genus Coriobacterium, Adlercreutzia, Asaccharobacter, Atopobium, Collinsella, Cryptobacterium (Cryptobacterium), Denitrobacterium, Eggerthella, Enterorhabdus, Gordonibacter, Olsenella, Paraeggerthella, or Slackia The purification method according to [10], wherein the bacterium is classified into any of the genus (Slackia).
[13] The purification method according to [10], wherein the anaerobic microorganism is Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain.
嫌気性微生物の代謝によってイソフラボン発酵代謝産物が製造されることは、学術的にはかねてより知られていたものの、微生物により発酵生産されたイソフラボン発酵代謝産物のより効率的な精製条件については、これまで確立されていなかった。 Although the production of isoflavone fermented metabolites by the metabolism of anaerobic microorganisms has been known for some time in the academic world, this is not the case for more efficient purification conditions for fermented isoflavone fermented metabolites produced by microorganisms. Was not established until.
本発明によって、セルロースエステルを利用したイソフラボン発酵代謝産物（例えばエクオール）の効率的な精製方法が実現でき、イソフラボン発酵代謝産物の工業的な精製技術が提供された。本発明の方法により精製されたイソフラボン発酵代謝産物を、飲食品又は医薬品等としてそのまま摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等を予防できるものと考えられる。 According to the present invention, an efficient method for purifying an isoflavone fermentation metabolite (for example, equol) using cellulose ester can be realized, and an industrial purification technique for isoflavone fermentation metabolites has been provided. A product that can prevent breast cancer, prostate cancer, osteoporosis, hypercholesterolemia, heart disease, climacteric disorder, etc. by ingesting the isoflavone fermentation metabolite purified by the method of the present invention as it is as a food or drink or medicine. it is conceivable that.
本発明は、セルロースエステルを用いたイソフラボン発酵代謝産物の精製方法に関する。 The present invention relates to a method for purifying isoflavone fermentation metabolites using cellulose esters.
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させる工程、及び
（２）セルロースエステルへ吸着したイソフラボン発酵代謝産物を回収する工程
を少なくとも含むものである。
The purification method of the isoflavone fermentation metabolite of the present invention comprises:
(1) It includes at least a step of contacting a sample solution containing an isoflavone fermentation metabolite with a cellulose ester, and (2) a step of recovering the isoflavone fermentation metabolite adsorbed on the cellulose ester.
また、本発明の本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
（２）洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する工程、及び
（３）回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる工程
を含んでいてもよい。
Further, the method for purifying the isoflavone fermentation metabolite of the present invention of the present invention comprises:
(1) contacting a sample solution containing an isoflavone fermentation metabolite with a cellulose ester, and adsorbing the isoflavone fermentation metabolite to the cellulose ester;
(2) A step of washing the cellulose ester adsorbed with the isoflavone fermentation metabolite by a washing solution, and (3) a step of desorbing the isoflavone fermentation metabolite from the cellulose ester by a collection solution may be included.
本発明の精製方法において、従来分離精製が困難であったイソフラボン発酵代謝産物を精製回収することが可能となる。本発明において、イソフラボン発酵代謝産物は特に制限させるものではないが、好ましくはエクオール、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ジヒドロダイゼイン、又はO-デスメチルアンゴレンシンを、より好ましくはエクオールを例示することができる。 In the purification method of the present invention, it is possible to purify and recover isoflavone fermentation metabolites that have conventionally been difficult to separate and purify. In the present invention, the isoflavone fermented metabolite is not particularly limited, but preferably equol, daidzein, glycitein, genistein, dihydrodaidzein, or O-desmethylangolensin, more preferably equol.
本発明においては、セルロースエステルを収容したカートリッジ（又はカラム）を用いて精製を行うことができる。例えば、少なくとも二個の開口を有する容器内に該セルロースエステルを収容したカートリッジの一の開口に、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させる方法により精製を行うことができる。イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で該セルロースエステルに通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができる。加圧は、好ましくは10〜200 kpa、より好ましくは40〜100 kpaの程度で行われる。 In the present invention, purification can be performed using a cartridge (or column) containing a cellulose ester. For example, a sample solution, a washing solution, or a recovery solution containing an isoflavone fermentation metabolite is injected into one opening of a cartridge that contains the cellulose ester in a container having at least two openings, and is coupled to the one opening of the cartridge. Purification can be carried out by a method in which the inside of the cartridge is pressurized using the pressure difference generator thus prepared, the injected liquids are allowed to pass through, and discharged from other openings. By passing a sample solution, washing solution or recovered solution containing isoflavone fermentation metabolites through the cellulose ester under pressure, the apparatus can be automated in a compact manner. The pressurization is preferably performed at a rate of 10 to 200 kpa, more preferably 40 to 100 kpa.
前記のセルロースエステルを収容するカートリッジを用いる場合は、以下の工程でイソフラボン発酵代謝産物を分離精製することができる。
(ａ) イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内にセルロースエステルを収容したカートリッジの一の開口に注入する工程、
(ｂ)該カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジト内を加圧状態にし、注入したイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を、セルロースエステルに通過させ、該カートリッジの他の開口より排出することによって、セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
(ｃ)該カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(ｄ)該カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、セルロースエステルを通過させ、他の開口より排出することによって、セルロースエステルを、イソフラボン発酵代謝産物が吸着した状態で、洗浄する工程、
(ｅ)該カートリッジの前記一の開口に回収液を注入する工程、及び
(ｆ)該カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、セルロースエステルを通過させ、他の開口より排出することによって、セルロースエステル内からイソフラボン発酵代謝産物を脱離させ、該カートリッジ容器外に排出する工程。
When the cartridge containing the cellulose ester is used, the isoflavone fermentation metabolite can be separated and purified by the following steps.
(a) injecting a sample solution containing an isoflavone fermentation metabolite into one opening of a cartridge containing a cellulose ester in a container having at least two openings;
(b) The inside of the cartridge is pressurized using a pressure difference generator connected to the one opening of the cartridge, and the sample solution containing the injected isoflavone fermentation metabolite is passed through a cellulose ester, Adsorbing isoflavone fermentation metabolites on cellulose ester by discharging from the other opening of the cartridge;
(c) injecting a cleaning liquid into the one opening of the cartridge;
(d) The inside of the cartridge is pressurized using a pressure difference generator coupled to the one opening of the cartridge, and the injected cleaning liquid is allowed to pass through the cellulose ester and discharged from the other opening, A step of washing the cellulose ester with the isoflavone fermentation metabolite adsorbed thereon,
(e) injecting a recovered liquid into the one opening of the cartridge; and
(f) By making the inside of the cartridge into a pressurized state using a pressure difference generating device coupled to the one opening of the cartridge, and passing the injected recovery liquid through the cellulose ester and discharging it from the other opening Detaching the isoflavone fermentation metabolite from the cellulose ester and discharging it out of the cartridge container.
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の分離精製方法における各工程（吸着工程、洗浄工程、及び回収工程）について詳細に説明する。 Each step (adsorption step, washing step, and recovery step) in the method for separating and purifying isoflavone fermentation metabolites of the present invention will be described in detail.
吸着工程
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、前述の通りイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる。
Adsorption process As described above, the method for purifying an isoflavone fermentation metabolite of the present invention comprises contacting a sample solution containing an isoflavone fermentation metabolite with a cellulose ester, and adsorbing the isoflavone fermentation metabolite to the cellulose ester.
本発明においてセルロースエステルとしては、例えば、酢酸セルロース、セルロースプロピオネート、セルロースブチレートなどの脂肪族カルボン酸エステル、フタル酸半エステルなどの芳香族カルボン酸エステル；硝酸セルロース、硫酸セルロース、リン酸セルロースなどの無機酸エステル；セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、硝酸酢酸セルロースなどの混酸エステル；およびポリカプロラクトングラフト化酢酸セルロースなどのセルロースエステル誘導体などが例示される。これらのセルロースエステルは、単独でまたは二種以上混合して使用できる。 Examples of the cellulose ester in the present invention include aliphatic carboxylic acid esters such as cellulose acetate, cellulose propionate, and cellulose butyrate, and aromatic carboxylic acid esters such as phthalic acid half ester; cellulose nitrate, cellulose sulfate, and cellulose phosphate. Examples thereof include inorganic acid esters such as cellulose acetate propionate, cellulose acetate butyrate, cellulose acetate phthalate, and mixed acid esters such as cellulose nitrate acetate; and cellulose ester derivatives such as polycaprolactone-grafted cellulose acetate. These cellulose esters can be used alone or in admixture of two or more.
セルロースエステルの平均置換度は特に制限させるものではないが、好ましくは平均置換度１〜３、より好ましくは１．５〜３程度を例示することができる。 The average degree of substitution of the cellulose ester is not particularly limited, but an average degree of substitution of 1 to 3, more preferably about 1.5 to 3 can be exemplified.
本発明において、セルロースエステルは特に制限されるものではないが、好ましくは脂肪族有機酸エステル（例えば、炭素数２〜４程度の有機酸から選ばれた少なくとも一種の有機酸との単独エステル又は混酸エステル）、より好ましくは酢酸セルロースを例示することができる。 In the present invention, the cellulose ester is not particularly limited, but is preferably an aliphatic organic acid ester (for example, a single ester or mixed acid with at least one organic acid selected from organic acids having about 2 to 4 carbon atoms). Ester), more preferably cellulose acetate.
本発明において用いられる酢酸セルロースの酢化度は５０〜６２％程度の範囲で適当に選択でき、酢化度５３〜５８％程度の酢酸セルロースを用いることが好ましい。 The acetylation degree of the cellulose acetate used in the present invention can be appropriately selected in the range of about 50 to 62%, and it is preferable to use cellulose acetate having an acetylation degree of about 53 to 58%.
セルロースエステルの平均重合度は、例えば１０〜１０００、好ましくは５０〜９００、さらに好ましくは２００〜８００程度である。 The average degree of polymerization of the cellulose ester is, for example, about 10 to 1000, preferably about 50 to 900, and more preferably about 200 to 800.
本発明のセルロースエステルの形状は特に制限されるものではないが、好ましくは粉末、粒状、チップ状、繊維状、平膜状、又は中空糸膜状のいずれか、より好ましくは粒状を例示することができる。また、本発明のセルロースエステルは、多孔性構造であってもよい。 The shape of the cellulose ester of the present invention is not particularly limited, but preferably any one of powder, granules, chips, fibers, flat membranes, or hollow fiber membranes, and more preferably granular. Can do. The cellulose ester of the present invention may have a porous structure.
セルロースエステルに、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を接触させる場合、試料溶液をセルロースエステルに均一に接触させることが好ましい。セルロースエステルが、粉末、粒状、又はチップ状等である場合には、試料溶液にセルロースエステルを添加し、均一となるよう攪拌させることにより、試料溶液をセルロースエステルに均一に接触させることができる。また、セルロースエステルが繊維状、平膜状、又は中空糸膜状等である場合には、これら膜状のセルロースエステルに試料溶液を一方の面から他方の面へ通過させることにより、液を膜へ均一に接触させることができる。セルロースエステル膜中を、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液をセルロースエステル膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で、好ましい。 When the sample solution containing the isoflavone fermentation metabolite is brought into contact with the cellulose ester, the sample solution is preferably brought into contact with the cellulose ester uniformly. When the cellulose ester is in the form of powder, granules, chips, or the like, the sample solution can be uniformly contacted with the cellulose ester by adding the cellulose ester to the sample solution and stirring it uniformly. In addition, when the cellulose ester is in the form of a fiber, a flat membrane, or a hollow fiber membrane, the sample solution is passed through the membrane-like cellulose ester from one side to the other side to form a film. Can be uniformly contacted. When the sample solution containing the isoflavone fermentation metabolite is passed through the cellulose ester membrane, it is preferable that the sample solution is passed from the side having the larger pore diameter of the cellulose ester membrane to the side having a smaller pore size because clogging is difficult.
試料溶液にセルロースエステルを添加する場合の、セルロースエステルの添加量は特に制限されるものではないが、好ましくは試料溶液中に含まれるイソフラボン発酵代謝産物１ｇに対して、５０ｇ〜２００ｇのセルロースエステルを添加することが好ましい。 The amount of cellulose ester added when the cellulose ester is added to the sample solution is not particularly limited, but preferably 50 g to 200 g of cellulose ester is added to 1 g of isoflavone fermentation metabolite contained in the sample solution. It is preferable to add.
本発明において使用できる試料溶液は、イソフラボン発酵代謝産物を含むものであれば特に制限されるものではないが、好ましい例としては、嫌気性微生物によるイソフラボン発酵生産物を含む試料溶液を挙げることができる。本発明の試料溶液には、嫌気性微生物、又はそれらがホモジネートされたものが含まれていてもよい。 The sample solution that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it contains an isoflavone fermentation metabolite, and preferred examples include a sample solution containing an isoflavone fermentation product by an anaerobic microorganism. . The sample solution of the present invention may contain anaerobic microorganisms or those that are homogenized.
本発明において、イソフラボン発酵代謝産物の発酵生産に用いられる嫌気性微生物は、イソフラボン発酵代謝産物の生産能を有する嫌気性微生物であり、好ましい例として、コーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌又はこれらの類縁菌を例示することができる。 In the present invention, the anaerobic microorganisms used for the fermentative production of isoflavone fermented metabolites are anaerobic microorganisms having the ability to produce isoflavone fermented metabolites, and preferred examples are classified in the family Coriobacteriaceae. Can be exemplified.
また、以下の群から選択される属に分類される微生物を、嫌気性微生物として例示することができる。
コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属
アドレクラウチア（Adlercreutzia）属
アサッカロバクター（Asaccharobacter）属
アトポビウム（Atopobium）属
コリンゼラ（Collinsella）属
クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属
デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属
エガセラ（Eggerthella）属
エンテロハブダス（Enterorhabdus）属
ゴードニバクター（Gordonibacter）属
オルセネラ（Olsenella）属
パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属
スラッキア（Slackia）属
Moreover, the microorganisms classified into the genus selected from the following groups can be illustrated as anaerobic microorganisms.
Coriobacterium genus Adlercreutzia genus Asaccharobacter genus Atopobium genus Collinsella genus Cryptobacterium genus Denitrobacterium genus Egacea ( Eggerthella genus Enterorhabdus genus Gordonibacter genus Orsenella genus Paraeggerthella genus Slackia
したがって、これらの属に分類された微生物から選択され、嫌気発酵によってイソフラボン発酵代謝産物を生成する微生物は、本発明における好ましい嫌気性微生物である。中でも、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物は、本発明におけるイソフラボン発酵代謝産物産生能を有する微生物として好ましい。微生物がイソフラボン発酵代謝産物を生成することは、培養物中のダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオール等を定量することにより確認することができる。より具体的には、たとえば、以下の微生物を、本発明におけるイソフラボン発酵代謝産物産生能を有する微生物として利用することができる。
Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450
Enterorhabdus mucosicola DSM 19490
Slackia isoflavoniconvertens HE8 （DSM 22006）
Slackia sp. TM-30 FERM AP-20729号
Eggerthella sp. KCCM-10490
Asccharobacter celatus DSM 18785
Therefore, a microorganism selected from microorganisms classified into these genera and producing an isoflavone fermentation metabolite by anaerobic fermentation is a preferred anaerobic microorganism in the present invention. Among these, microorganisms belonging to the genus Asaccharobacter are preferable as microorganisms having the ability to produce isoflavone fermentation metabolites in the present invention. It can be confirmed that microorganisms produce isoflavone fermented metabolites by quantifying daidzein, dihydrodaidzein, equol and the like in the culture. More specifically, for example, the following microorganisms can be used as microorganisms having the ability to produce an isoflavone fermentation metabolite in the present invention.
Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450
Enterorhabdus mucosicola DSM 19490
Slackia isoflavoniconvertens HE8 (DSM 22006)
Slackia sp.TM-30 FERM AP-20729
Eggerthella sp.KCCM-10490
Asccharobacter celatus DSM 18785
特に以下に記載するアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株又はこれらの菌と同様の種としての性質を有する類縁の菌をより好ましい嫌気性微生物として挙げることができる。 In particular, Asaccharobacter celatus strain DSM 18785 described below or a related bacterium having the same species characteristics as these bacterium can be mentioned as a more preferable anaerobic microorganism.
上記嫌気性微生物は、その寄託番号に示された寄託機関から入手することができる。各受託番号は、当該嫌気性微生物が、それぞれ次の寄託機関に寄託されていることを示す。
FERM 特許生物寄託センター；International Patent Organism Depositary (IPOD)
http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
http://www.dsmz.de/
KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
The anaerobic microorganisms can be obtained from the depository indicated by the deposit number. Each deposit number indicates that the anaerobic microorganism is deposited at the next depository.
FERM Patent Organism Depositary; International Patent Organism Depositary (IPOD)
http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
http://www.dsmz.de/
KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
本発明において、嫌気性微生物、又はそれらがホモジネートされたものを含む試料溶液を用いる場合には、タンパク質分解酵素、カオトロピック塩、界面活性剤、又は、消泡剤により予め処理を行ってもよい。また、遠心分離によりイソフラボン発酵代謝産物のみを含む画分を単離することもできる。これらの処理により、不純物を取り除く効果が向上し、イソフラボン発酵代謝産物の回収率が向上するものと考えられる。 In the present invention, when using a sample solution containing anaerobic microorganisms or those homogenized, they may be pretreated with a proteolytic enzyme, a chaotropic salt, a surfactant, or an antifoaming agent. In addition, a fraction containing only isoflavone fermentation metabolites can be isolated by centrifugation. These treatments are thought to improve the effect of removing impurities and improve the recovery rate of isoflavone fermentation metabolites.
洗浄工程
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、次に、洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する。
Washing step In the method for purifying the isoflavone fermentation metabolite of the present invention, the cellulose ester adsorbed with the isoflavone fermentation metabolite is then washed with a washing solution.
洗浄を行うことにより、イソフラボン発酵代謝産物の回収量及び純度が向上させることができる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。 By performing washing, the recovered amount and purity of the isoflavone fermentation metabolite can be improved. The cleaning step may be completed by one cleaning for speeding up, and when the purity is more important, the cleaning is preferably repeated a plurality of times.
洗浄工程においてセルロースエステルを収容したカートリッジを用いる場合、洗浄液は、自動注入装置もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、該カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、該カートリッジの一の開口（イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にしてセルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。 When a cartridge containing a cellulose ester is used in the cleaning step, the cleaning liquid is supplied to the cartridge using an automatic injection device or a supply means having the same function as these. The supplied cleaning liquid is supplied from one opening of the cartridge (the opening into which the sample solution containing the isoflavone fermentation metabolite is injected), and the cartridge is pressurized using a pressure difference generating device coupled to the opening. Thus, the cellulose ester can be passed through and discharged from an opening different from the one opening.
また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、該カートリッジのイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、該カートリッジの一の開口から供給し、セルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法の方が、より洗浄効率が優れている。 Also, the cleaning liquid can be supplied from one opening and discharged from the same opening. Furthermore, it is possible to supply and discharge the cleaning liquid from an opening different from the one opening to which the sample solution containing the isoflavone fermentation metabolite of the cartridge is supplied. However, the method of supplying from one opening of the cartridge, allowing the cellulose ester to pass through, and discharging from the opening different from the one opening is more excellent in cleaning efficiency.
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃ であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。洗浄工程において、セルロースエステルを機械的な振動や超音波による攪拌を与えながら洗浄を行うことができる。また、遠心分離を行うことにより洗浄してもよい。 In the washing step, the temperature of the washing solution is preferably 4 to 70 ° C. Furthermore, it is more preferable that the temperature of the cleaning liquid is room temperature. In the washing step, the cellulose ester can be washed while applying mechanical vibration or ultrasonic stirring. Moreover, you may wash | clean by centrifuging.
本発明において、前述の試料溶液及び洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物は脱離させないが不純物は脱離させる組成であることが必要である。また、イソフラボン発酵代謝産物の吸着効果が高め、不純物及び不要成分の選択的除去作用が向上させるために、水溶性塩を添加してもよい。 In the present invention, the sample solution and the cleaning solution described above are preferably solutions containing a water-soluble organic solvent and / or a water-soluble salt. The washing liquid needs to have a function of washing out impurities in the sample solution adsorbed on the cellulose ester together with the isoflavone fermentation metabolite. For that purpose, it is necessary that the isoflavone fermentation metabolite is not desorbed from the cellulose ester but the impurities are desorbed. Further, a water-soluble salt may be added in order to enhance the adsorption effect of the isoflavone fermentation metabolite and improve the selective removal action of impurities and unnecessary components.
洗浄液に用いることができる水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、アルコール、アセトン等を用いることができ、アセトニトリル又はアルコールが好ましい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ − イソプロパノール、ブタノール等を挙げることができ、中でもエタノールを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、0〜40質量％ であることが好ましく、5〜20質量％であることがより好ましい。 As the water-soluble organic solvent that can be used for the cleaning liquid, acetonitrile, alcohol, acetone, or the like can be used, and acetonitrile or alcohol is preferable. Examples of the alcohol include methanol, ethanol, isopropanol, n-isopropanol, butanol and the like, and it is preferable to use ethanol among them. The amount of the water-soluble organic solvent contained in the cleaning liquid is preferably 0 to 40% by mass, and more preferably 5 to 20% by mass.
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩としては、ハロゲン化物の塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を例示することができる。 On the other hand, examples of water-soluble salts contained in the cleaning liquid include halide salts, alkali metal salts, and alkaline earth metal salts.
前述の試料溶液及び洗浄液のｐＨは、ｐＨ５〜９であることが好ましい。 The pH of the sample solution and the cleaning solution is preferably 5 to 9.
回収工程
本発明のイソフラボン発酵代謝産物の精製方法は、最後に、回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる。
Recovery Step In the method for purifying the isoflavone fermentation metabolite of the present invention, finally, the isoflavone fermentation metabolite is desorbed from the cellulose ester by the recovery solution.
洗浄工程においてセルロースエステルを収容したカートリッジを用いる場合、回収液は、自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、セルロースエステルを装着したカートリッジへ供給される。回収液は、該カートリッジの一の開口（イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて該カートリッジ内を加圧状態にしてセルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、該カートリッジのイソフラボン発酵代謝産物含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、該カートリッジの一の開口から供給し、セルロースエステルを通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収効率が優れ、より好ましい。 When a cartridge containing a cellulose ester is used in the washing step, the recovered liquid is supplied to the cartridge equipped with the cellulose ester using an automatic injection device or a supply means having the same function as these. The recovered liquid is supplied from one opening of the cartridge (the opening into which the sample solution containing the isoflavone fermentation metabolite is injected), and the inside of the cartridge is pressurized using a pressure difference generator coupled to the opening. The cellulose ester can be passed through and discharged from an opening different from the one opening. Further, the recovery liquid can be supplied from one opening and discharged from the same opening. Furthermore, it is also possible to supply and discharge the recovered liquid from an opening different from the one opening to which the sample solution containing the isoflavone fermentation metabolite of the cartridge is supplied. However, a method of supplying from one opening of the cartridge, allowing the cellulose ester to pass through, and discharging from the opening different from the one opening is more preferable because of excellent recovery efficiency.
回収液としては好ましくはアルコール（好ましくはエタノール）等が使用できる。 Preferably, alcohol (preferably ethanol) or the like can be used as the recovery liquid.
回収工程においては、イソフラボン発酵代謝産物の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。 In the recovery process, the isoflavone fermentation metabolite recovery liquid can be made into a composition that can be used in the subsequent subsequent processes.
回収液のｐＨは、ｐＨ６〜８であることが好ましい。 The pH of the recovered liquid is preferably pH 6-8.
回収液の体積を当初のイソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮されたイソフラボン発酵代謝産物を含む回収液を得ることができる。 By reducing the volume of the collected liquid compared to the volume of the sample solution containing the initial isoflavone fermentation metabolite, a collected liquid containing the concentrated isoflavone fermentation metabolite can be obtained.
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便にイソフラボン発酵代謝産物を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量のイソフラボン発酵代謝産物を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。 The number of injections of the recovery liquid is not limited and may be one time or multiple times. Usually, when isoflavone fermentation metabolites are separated and purified quickly and simply, the recovery is carried out once. However, the recovery solution may be injected several times, such as when collecting a large amount of isoflavone fermentation metabolites.
また、回収工程において、イソフラボン発酵代謝産物の回収液に回収したイソフラボン発酵代謝産物の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。 In the recovery step, a stabilizer for preventing the recovered isoflavone fermentation metabolite from being decomposed may be added to the isoflavone fermentation metabolite recovery liquid.
回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、280nmの吸収が無い素材で
作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収したイソフラボン発酵代謝産物溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。280nmに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
The collection container used in the collection process is not particularly limited, but a collection container made of a material that does not absorb at 280 nm can be used. In this case, the concentration of the recovered isoflavone fermentation metabolite solution can be measured without transferring to another container. Examples of the material that does not absorb at 280 nm include quartz glass, but are not limited thereto.
前記のセルロースエステルを収容したカートリッジと圧力発生装置を用いて、イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液からイソフラボン発酵代謝産物を分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置を用いることにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、イソフラボン発酵代謝産物を得ることが可能になる。 The step of separating and purifying the isoflavone fermentation metabolite from the sample solution containing the isoflavone fermentation metabolite using the cartridge containing the cellulose ester and the pressure generator can be performed using an automatic device that automatically performs the process. . The use of an automatic apparatus not only simplifies and speeds up the operation, but also makes it possible to obtain an isoflavone fermentation metabolite at a certain level regardless of the skill of the operator.
本発明の精製方法により得られたエクオールは、医薬品又は飲食物として提供することが可能である。 The equol obtained by the purification method of the present invention can be provided as a medicine or food and drink.
エクオールを医薬品として提供する場合、その製剤化には、一般的に製剤化に用いられる物質（たとえば、デンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類等）を用いることができる。医薬品として提供する場合の剤型としては、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤等を例示することができる。 When equol is provided as a pharmaceutical product, substances generally used for the formulation (eg, starch, dextrin, lactose, corn starch, inorganic salts, etc.) can be used for the formulation. Examples of dosage forms in the case of providing as pharmaceuticals include ampoules, tablets, capsules, granules, fine granules, powders, infusions, drinks and the like.
エクオールを飲食物として提供する場合、その形態としては、健康食品、清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。 When providing equol as food and drink, the forms include health food, soft drinks, milk, pudding, jelly, rice cake, gum, yogurt, chocolate, soup, cookies, snacks, ice cream, popsicles, bread, cakes, Examples include cream puffs, ham, meat sauce, curry, stew, cheese, butter, dressing and the like.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to this.
［参考例１］エクオールの生産
AglyMax-30(イソフラボンアグリコンの抽出物、ニチモウバイオティックス株式会社製)25 g/L、GAM培地(日水製薬株式会社製、日本)59 g/L、L-Arg 10 g/LからなるpH 7.5に調整したエクオール生産培地を、40 mLずつ10本の200 mL容バイヤルビンに分注した。気相を炭酸ガスで置換した後、ブチルゴム栓で密栓し、オートクレーブで115℃、15分間の殺菌処理を行った。ここに、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株の前培養液(0.4 mL)を接種した後、気相を水素/炭酸ガス=4/1の混合ガスで置換し、37℃で24時間、振とう培養した。得られた発酵液を混合し、105℃で1分間の加熱処理を行った後、遠心分離にて不溶物と菌体を除去した。遠心上清液には、2.3 g/Lのエクオールが含まれていた。なお、HPLCは以下の条件により行った。エクオールは、26分に溶出する。
カラム：WakosilII5C18 (4.6×250mm)
移動相A：アセトニトリル / 水 / 酢酸 = 15 / 85 / 0.1
移動相B：アセトニトリル / 水 / 酢酸 = 35 / 65 / 0.1
グラジェント条件：0 %B → 30 %B (15min) → 100 %B (15.1 → 30 min)
→ 30.1 min → 0 %B → 40 min 平衡化 → 次サンプル
カラム温度：35℃
検出：UV280nm
サンプル：70% エタノールで適宜希釈
[Reference Example 1] Production of equol
AglyMax-30 (Isoflavone aglycone extract, manufactured by Nichimo Biotics Co., Ltd.) 25 g / L, GAM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) 59 g / L, L-Arg 10 g / L pH 7.5 The equol production medium thus prepared was dispensed into 10 200 mL vials of 40 mL each. After replacing the gas phase with carbon dioxide, it was sealed with a butyl rubber stopper and sterilized at 115 ° C. for 15 minutes with an autoclave. After inoculating the pre-culture solution (0.4 mL) of Asaccharobacter celatus DSM 18785 strain here, the gas phase was replaced with a mixed gas of hydrogen / carbon dioxide = 4/1 at 37 ° C. Cultured with shaking for 24 hours. The obtained fermentation broth was mixed and subjected to a heat treatment at 105 ° C. for 1 minute, and then insoluble matters and bacterial cells were removed by centrifugation. The centrifugation supernatant contained 2.3 g / L equol. The HPLC was performed under the following conditions. Equol elutes at 26 minutes.
Column: WakosilII5C18 (4.6 × 250mm)
Mobile phase A: acetonitrile / water / acetic acid = 15/85 / 0.1
Mobile phase B: acetonitrile / water / acetic acid = 35/65 / 0.1
Gradient condition: 0% B → 30% B (15 min) → 100% B (15.1 → 30 min)
→ 30.1 min → 0% B → 40 min equilibration → Next sample Column temperature: 35 ° C
Detection: UV280nm
Sample: Dilute appropriately with 70% ethanol
［実施例１］酢酸セルロースへの吸着１
参考例１で得られた遠心上清液1mLにアセトニトリルと50 mgの酢酸セルロース(和光純薬製、日本)を加え、激しく撹拌した後、遠心上清中のエクオール濃度を分析して、酢酸セルロースへの吸着量を測定した（図２）。10% アセトニトリル濃度において最大となる40％の吸着率が得られた。
[Example 1] Adsorption to cellulose acetate 1
Acetonitrile and 50 mg of cellulose acetate (Wako Pure Chemicals, Japan) were added to 1 mL of the centrifuged supernatant obtained in Reference Example 1, and after vigorous stirring, the equol concentration in the centrifuged supernatant was analyzed, and cellulose acetate was obtained. The amount adsorbed on was measured (FIG. 2). A maximum adsorption rate of 40% was obtained at 10% acetonitrile concentration.
［実施例２］酢酸セルロースへの吸着２
参考例１で得られた遠心上清液1mLにアセトニトリルを加え10% アセトニトリル溶液としたところに、微細化した酢酸セルロースを18〜200 mgの範囲で加え、激しく撹拌した後、遠心上清中のエクオール濃度を分析して、酢酸セルロースへの吸着量を測定した（図３）。200 mgの微細化した酢酸セルロースにおいて最大となる84％の吸着率が得られた。なお、酢酸セルロースの微細化は、マルチビーズショッカー(安井器械製)にて行った。
[Example 2] Adsorption to
Acetonitrile was added to 1 mL of the centrifugal supernatant obtained in Reference Example 1 to make a 10% acetonitrile solution, and then refined cellulose acetate was added in the range of 18 to 200 mg and stirred vigorously. The equol concentration was analyzed and the amount adsorbed on cellulose acetate was measured (FIG. 3). A maximum adsorption rate of 84% was obtained with 200 mg of refined cellulose acetate. The cellulose acetate was refined with a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Kikai).
［実施例３］酢酸セルロースへの吸着３
参考例１で得られた遠心上清液1mLにエタノールを加え10% エタノール溶液としたところに、微細化した酢酸セルロースを100 mgあるいは200 mg加え、激しく撹拌した後、遠心上清中のエクオール濃度を分析して、酢酸セルロースへの吸着量を測定した。その結果、200 mgの微細化した酢酸セルロースにおいて最大となる87％の吸着率が得られた。
[Example 3] Adsorption to cellulose acetate 3
Ethanol was added to 1 mL of the centrifugal supernatant obtained in Reference Example 1 to make a 10% ethanol solution, and then 100 mg or 200 mg of refined cellulose acetate was added and stirred vigorously, and then the equol concentration in the centrifugal supernatant was The amount of adsorption onto cellulose acetate was measured. As a result, the maximum adsorption rate of 87% was obtained with 200 mg of refined cellulose acetate.
［実施例４］酢酸セルロースを用いたエクオールの精製
20 gの酢酸セルロースを微細化してカラムに詰め、10％エタノールを80 mL通液して平衡化した。平衡化したカラムに、参考例１で得られた遠心上清液の10％エタノール溶液100 mLを通過させ、次いで、10％ エタノールを120 mL通液して洗浄した。洗浄後、カラムにエタノールを120 mL通液してエクオールを含有する溶液を得た。これをエバポレーターにて濃縮乾燥して、509 mgの残渣を得た。 この残渣中におけるエクオール含量は45%であり、回収率は93％であった。
[Example 4] Purification of equol using cellulose acetate
20 g of cellulose acetate was refined and packed in a column, and 80 mL of 10% ethanol was passed through the column to equilibrate. The equilibrated column was passed through 100 mL of the 10% ethanol solution of the centrifugal supernatant obtained in Reference Example 1, and then washed by passing 120 mL of 10% ethanol. After washing, 120 mL of ethanol was passed through the column to obtain a solution containing equol. This was concentrated and dried with an evaporator to obtain 509 mg of a residue. The equol content in this residue was 45%, and the recovery rate was 93%.
本発明の方法によって、イソフラボン発酵代謝産物（例えば、嫌気性微生物により発酵生産したエクオール）を高効率で精製することができる。 By the method of the present invention, isoflavone fermentation metabolites (for example, equol fermented and produced by anaerobic microorganisms) can be purified with high efficiency.
本発明の方法により精製されたイソフラボン発酵代謝産物（例えばエクオール）は不純物が除去されていることから、飲食品又は医薬品等としてそのまま摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等を予防することができる。 Since the isoflavone fermented metabolite purified by the method of the present invention (for example, equol) has impurities removed, it can be taken as it is as a food or drink or as a pharmaceutical product to obtain breast cancer, prostate cancer, osteoporosis, hypercholesterolemia. Symptom, heart disease, menopause, etc. can be prevented.
Claims (13)
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させる工程、及び
（２）セルロースエステルへ吸着したイソフラボン発酵代謝産物を回収する工程。 A method for purifying isoflavone fermentation metabolites comprising the following steps;
(1) A step of bringing a sample solution containing an isoflavone fermentation metabolite into contact with a cellulose ester, and (2) a step of recovering the isoflavone fermentation metabolite adsorbed on the cellulose ester.
（１）イソフラボン発酵代謝産物を含む試料溶液をセルロースエステルに接触させ、該セルロースエステルにイソフラボン発酵代謝産物を吸着させる工程、
（２）洗浄液によりイソフラボン発酵代謝産物が吸着した該セルロースエステルを洗浄する工程、及び
（３）回収液により該セルロースエステルからイソフラボン発酵代謝産物を脱離させる工程。 A method for purifying isoflavone fermentation metabolites comprising the following steps;
(1) contacting a sample solution containing an isoflavone fermentation metabolite with a cellulose ester, and adsorbing the isoflavone fermentation metabolite to the cellulose ester;
(2) A step of washing the cellulose ester adsorbed with the isoflavone fermentation metabolite with a washing solution, and (3) a step of desorbing the isoflavone fermentation metabolite from the cellulose ester with a recovery solution.
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