JP2012135249A - Method for producing chemical by continuous fermentation - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for operating continuous fermentation in a continuous fermentation device for producing chemicals continuously by the fermentation using a separation membrane, efficiently performing the cross flow filtration of fermentation liquid having a high suspended matter concentration, also stabilizing the fermentation and widely reducing operation cost.SOLUTION: This method for operating the continuous fermentation device is characterized by changing the pressure of the fermentation liquid supplied to the upstream side of the separation membrane 2.

Description

本発明は、分離膜を用いて発酵により連続的に化学品を製造する連続発酵装置の製造方法に関するものである。   The present invention relates to a method for producing a continuous fermentation apparatus that continuously produces chemicals by fermentation using a separation membrane.

微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ発酵法）と、（２）連続発酵法とに分類することができる。   Fermentation methods, which are substance production methods involving the cultivation of microorganisms and cultured cells, are largely (1) batch fermentation methods (Batch fermentation methods) and fed-batch fermentation methods (Fed-Batch fermentation methods), and (2) continuous fermentation methods. Can be classified.

上記（１）の回分発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過と共に発酵培養液中の化学品濃度が高くなり、浸透圧あるいは化学品阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。   The batch fermentation method and fed-batch fermentation method of the above (1) are simple in terms of equipment, and have the advantage that the culture is completed in a short time and damage caused by contamination with bacteria is small. However, the chemical concentration in the fermentation broth increases with the passage of time, and productivity and yield decrease due to osmotic pressure or chemical inhibition. Therefore, it is difficult to stably maintain a high yield and high productivity over a long period of time.

また、上記（２）の連続発酵法は、発酵槽内で目的化学品が高濃度に蓄積することを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。この連続発酵法については、Ｌ−グルタミン酸やＬ−リジンの発酵についての連続培養法が開示されている（非特許文献１参照）。しかしながら、この例では、発酵培養液に原料の連続的な供給を行うと共に、微生物や培養細胞を含んだ発酵培養液を抜き出すために、発酵培養液中の微生物や培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。   In addition, the continuous fermentation method (2) is characterized in that high yield and high productivity can be maintained over a long period of time by avoiding accumulation of the target chemical product at a high concentration in the fermenter. About this continuous fermentation method, the continuous culture method about fermentation of L-glutamic acid or L-lysine is disclosed (refer nonpatent literature 1). However, in this example, since the raw material is continuously supplied to the fermentation broth and the fermentation broth containing microorganisms and cultured cells is extracted, the microorganisms and cultured cells in the fermentation broth are diluted. The improvement in production efficiency was limited.

そこで、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から化学品を回収すると同時に濃縮液中の微生物や培養細胞を発酵培養液に保持または還流させることにより、発酵培養液中の微生物や培養細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。例えば、分離膜として有機高分子からなる平膜を用いた連続発酵装置において、連続発酵する技術が提案されている。（特許文献１参照）。   Therefore, in the continuous fermentation method, microorganisms and cultured cells are filtered through a separation membrane, and chemicals are collected from the filtrate. At the same time, the microorganisms and cultured cells in the concentrated liquid are retained or refluxed in the fermentation broth. A method for maintaining a high concentration of microorganisms and cultured cells has been proposed. For example, in a continuous fermentation apparatus using a flat membrane made of an organic polymer as a separation membrane, a technique for continuous fermentation has been proposed. (See Patent Document 1).

一方、分離膜については、上述したよう発酵分野への適用を含め、飲料水製造、浄水処理、排水処理などの水処理分野、食品工業分野等様々な方面で利用されている。飲料水製造、浄水処理、排水処理などの水処理分野においては、分離膜が従来の砂ろ過、凝集沈殿過程の代替として水中の不純物を除去するために用いられている。浄水処理や排水処理などの水処理分野においては、処理水量が大きいため、透水性能の向上が求められており、透水性能が優れている分離膜で膜面積を減らし、膜面積あたりの設置面積が小さい中空糸膜モジュールやスパイラル式モジュールを使用することで、装置のコンパクト化、設備費および膜交換費の低減を試みている。   On the other hand, separation membranes are used in various fields such as drinking water production, water treatment, water treatment such as wastewater treatment, food industry, etc., including application to the fermentation field as described above. In water treatment fields such as drinking water production, water purification treatment, and wastewater treatment, separation membranes are used to remove impurities in water as an alternative to conventional sand filtration and coagulation sedimentation processes. In the water treatment field such as water purification treatment and wastewater treatment, the amount of treated water is large, so improvement in water permeability performance is required.The separation membrane with excellent water permeability performance reduces the membrane area, and the installation area per membrane area is reduced. By using small hollow fiber membrane modules and spiral type modules, we are trying to make the device compact and reduce equipment costs and membrane replacement costs.

これより、より効率的な連続発酵による生産を行うために、膜面積あたりの設置面積が小さく、膜モジュールの交換費用が少ない中空糸膜モジュールなどを用いた技術が開示されている（特許文献２）。この技術では、微生物や培養細胞を、分離膜に中空糸膜モジュール分離膜を用いて、濾液から化学品を回収すると同時に濃縮液中の微生物や培養細胞を発酵培養液に保持または還流させることにより、発酵培養液中の微生物や培養細胞濃度を高く維持することが可能となっており、ここで、発酵培養液を中空糸膜モジュールに送液し、一部は濾過をして、大部分は発酵槽に還流させるクロスフロー濾過を採用しており、このクロスフロー濾過の流れの剪断力により、膜表面の汚れを除去し、効率的な濾過を長期間継続することも可能であった。   From this, in order to perform production by more efficient continuous fermentation, a technique using a hollow fiber membrane module or the like having a small installation area per membrane area and low replacement cost of the membrane module is disclosed (Patent Document 2). ). In this technology, microorganisms and cultured cells are collected from the filtrate using a hollow fiber membrane module separation membrane, and at the same time, the microorganisms and cultured cells in the concentrate are retained or refluxed in the fermentation broth. It is possible to maintain a high concentration of microorganisms and cultured cells in the fermentation broth. Here, the fermentation broth is fed to the hollow fiber membrane module, partly filtered, and mostly Cross flow filtration that refluxed to the fermenter was employed, and it was possible to remove dirt on the membrane surface by the shearing force of the flow of the cross flow filtration and to continue efficient filtration for a long period of time.

しかし、分離膜１次側に通液するクロスフローの流束については、例えば外圧式中空糸膜モジュールでは０．１〜１ｍ／ｓ、内圧式中空糸膜モジュールでは０．５〜３ｍ／ｓと、高い流束で運転を行うのが一般的である。これは前述したクロスフローの流れの剪断力により、膜表面の汚れを除去することや、内圧式中空糸膜の場合は、発酵液が中空糸膜内部の流路が狭い部分を通液されるため詰まり防止の目的も含まれる。   However, with regard to the cross flow flux that passes through the primary side of the separation membrane, for example, 0.1 to 1 m / s for the external pressure hollow fiber membrane module and 0.5 to 3 m / s for the internal pressure hollow fiber membrane module. It is common to operate at high flux. This is due to the removal of dirt on the membrane surface due to the shearing force of the flow of the cross flow described above, and in the case of the internal pressure type hollow fiber membrane, the fermentation liquid is passed through the narrow channel in the hollow fiber membrane. Therefore, the purpose of preventing clogging is included.

以上を前提として、工業化における設備対応を考えると、大きいものでは数百ｍ^３の発酵槽にて連続発酵を行うことも想定されるが、各モジュールに供給するクロスフロー流量の総量は、数百〜数千m³／時間にもなる。この場合、この流量に対応できるように、発酵槽から各モジュールへ送液する配管、バルブおよび送液ポンプなどの機器、設備を大型化する必要があり、そのため、送液配管等の容量が増加する。これより、発酵槽においては、原料の供給、また好気発酵では酸素供給が行われ、発酵培養の環境が適正に整えられているが、この発酵槽の容量に対し、発酵槽以外の送液配管等の容量が相対的に大きくなり、発酵効率が低下する懸念がある。さらに、機器、設備が大型化することによる設備費が増加、またクロスフロー流量の増加により送液ポンプ電力が増加し、コストアップの大きな問題がある。そのため、できるだけクロスフロー流量を抑えつつ、クロスフローで除去できる分離膜表面への微生物等の堆積を抑制するための手段が必要である。 Based on the above assumptions, considering the facility support in industrialization, it is assumed that continuous fermentation is performed in a fermenter of several hundred m ^{3 in} large ones, but the total amount of cross flow flow supplied to each module is several hundred. ~ also several thousand m ³ / time. In this case, it is necessary to enlarge the equipment and equipment such as piping, valves, and pumps for feeding liquid from the fermenter to each module so that this flow rate can be accommodated. To do. As a result, in the fermenter, the supply of raw materials and oxygen supply in aerobic fermentation are performed, and the environment for fermentation culture is properly adjusted. There is a concern that the capacity of piping and the like becomes relatively large, and the fermentation efficiency decreases. Furthermore, the equipment cost increases due to the increase in the size of the equipment and equipment, and the liquid pump power increases due to the increase in the cross flow flow rate. Therefore, there is a need for means for suppressing accumulation of microorganisms or the like on the separation membrane surface that can be removed by crossflow while suppressing the crossflow flow rate as much as possible.

分離膜に超音波振動子を付設して振動させることで、分離膜表面への堆積防止を図る技術（特許文献３）や、発酵液の濾過で、クロスフローろ過で使用する分離膜を振動させることにより、濾過性が向上する技術（非特許文献２）が開示されている。しかし、共に振動させるための設備が複雑で、設備費が増大する問題があり、また分離膜を振動させるため装置の耐久性が劣る可能性、さらに駆動部からの雑菌混入によるコンタミネーションの懸念もあり、工業用に使用する大型の発酵槽では適用は難しい。   By attaching an ultrasonic vibrator to the separation membrane and vibrating it, the separation membrane used in cross-flow filtration is vibrated by a technique for preventing deposition on the surface of the separation membrane (Patent Document 3) or by filtration of the fermentation broth. Thus, a technique for improving filterability (Non-patent Document 2) is disclosed. However, there is a problem that the equipment for vibrating together is complicated and the equipment cost increases, there is a possibility that the durability of the apparatus is inferior because the separation membrane is vibrated, and there is also a concern about contamination due to contamination with bacteria from the drive unit. Yes, it is difficult to apply to large fermenters used for industrial purposes.

この様に従来の膜分離連続発酵法では、分離膜モジュールの使用方法について、産業的応用が難く、効率的な連続発酵における化学品の製造は困難であった。   As described above, in the conventional membrane separation continuous fermentation method, it is difficult to industrially apply the method of using the separation membrane module, and it is difficult to efficiently produce chemical products in continuous fermentation.

特開２００７−２５２３６７号公報JP 2007-252367 A 特開２０１０−５７３８９号公報JP 2010-57389 A 特開昭６３−１８８３８７号公報JP-A-63-188387

Toshihiko Hirao et al.（ヒラノ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）Toshihiko Hirao et al. (Applied Microbiol. Biotechnol.), 32, 269-273 (1989) Soren Prip Beier,Maria Guerra,Arvid Garde,Gunnar Jonsson, Dynamic microfiltration with a vibrating hollow fiber membrane module:Filtration of yeast suspensions,Journal of Membrane Science 281 (2006) 281-287Soren Prip Beier, Maria Guerra, Arvid Garde, Gunnar Jonsson, Dynamic microfiltration with a vibrating hollow fiber membrane module: Filtration of yeast suspensions, Journal of Membrane Science 281 (2006) 281-287

本発明の目的は、濁質濃度の高い発酵液について、クロスフロー濾過を効率的に行い、かつ発酵の安定化、運転コストを大幅に低減する化学品の製造方法に関するものである。   An object of the present invention relates to a method for producing a chemical product that efficiently performs cross-flow filtration on a fermentation solution having a high turbidity concentration, and that significantly reduces the stabilization and operation costs of fermentation.

本発明は、前記目標を達成するために、次のような構成をとる。   The present invention has the following configuration in order to achieve the above-mentioned goal.

（１）発酵原料を微生物の発酵培養により化学品を含有する発酵液へと変換する発酵工程と、該発酵液から分離膜により濾過液として化学品を回収する膜分離工程を含む連続発酵による化学品の製造方法であって、分離膜の一次側に供給する発酵液の圧力を変動させることを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。   (1) Chemistry by continuous fermentation including a fermentation process in which fermentation raw materials are converted into a fermentation broth containing chemical products by fermentation of microorganisms, and a membrane separation process in which chemical products are recovered from the fermentation liquid as a filtrate through a separation membrane A method for producing a chemical by continuous fermentation, characterized in that the pressure of the fermentation liquor supplied to the primary side of the separation membrane is varied.

（２）分離膜の一次側に発酵液を供給する際に、同時に気体を供給する（１）に記載の連続発酵による化学品の製造方法。   (2) The method for producing a chemical product by continuous fermentation according to (1), wherein gas is simultaneously supplied when supplying the fermentation broth to the primary side of the separation membrane.

本発明によれば、上述の連続発酵による化学品の製造方法により、濁質濃度の高い発酵液について、クロスフロー濾過を効率的に行うことができ、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。   According to the present invention, the above-described method for producing a chemical product by continuous fermentation enables cross-flow filtration to be efficiently performed on a fermentation liquid having a high turbidity concentration. Products can be produced stably at low cost.

本発明で用いられる膜分離型連続発酵装置の例を説明するための概略図である。It is the schematic for demonstrating the example of the membrane-separation type continuous fermentation apparatus used by this invention.

本発明を用いた連続発酵による化学品の製造で使用する、微生物または培養細胞について述べる。   The microorganisms or cultured cells used in the production of chemicals by continuous fermentation using the present invention will be described.

本発明の連続発酵による化学品の製造において使用される微生物や培養細胞については特に制限はなく、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。また、使用する微生物や培養細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。   There are no particular limitations on microorganisms and cultured cells used in the production of chemicals by continuous fermentation of the present invention, for example, yeasts such as baker's yeast often used in the fermentation industry, bacteria such as Escherichia coli and coryneform bacteria, and filaments Examples include fungi, actinomycetes, animal cells, and insect cells. Moreover, the microorganisms and cultured cells used may be those isolated from the natural environment, or may be those whose properties have been partially modified by mutation or genetic recombination.

本発明の製造方法で得られる化学品すなわち変換後物質は、上記の微生物や培養細胞が発酵液中に生産する物質である。化学品としては、例えば、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質および組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−ブタンジオール、１,４−ブタンジオールおよびグリセロール等が挙げられる。また、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸およびクエン酸等を挙げることができ、核酸であればイノシン、グアノシンおよびシチジン等を挙げることができる。   A chemical product obtained by the production method of the present invention, that is, a post-conversion substance, is a substance produced in the fermentation broth by the above-described microorganism or cultured cell. Examples of the chemicals include substances that are mass-produced in the fermentation industry, such as alcohols, organic acids, amino acids, and nucleic acids. The present invention can also be applied to the production of substances such as enzymes, antibiotics and recombinant proteins. For example, examples of alcohol include ethanol, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol, and glycerol. Examples of organic acids include acetic acid, lactic acid, pyruvic acid, succinic acid, malic acid, itaconic acid, and citric acid, and examples of nucleic acids include inosine, guanosine, and cytidine.

また、本発明の製造方法で得られる化学品は、化成品、乳製品、医薬品、食品または醸造品のうち、少なくとも１種を含む流体物、または排水であることが好ましい。ここで化成品としては、例えば、有機酸、アミノ酸および核酸のように、膜分離濾過後の工程により化学製品を作ることに適用可能な物質、乳製品としては、例えば、低脂肪牛乳など、膜分離濾過後の工程により乳製品として適用可能な物質、医薬品としては、例えば、酵素、抗生物質、組み換えタンパク質のように、膜分離濾過後の工程により医薬品を作ることに適用可能な物質、食品としては、例えば、乳酸飲料など、膜分離濾過後の工程により食品として適用可能な物質、醸造品としては、例えば、ビール、焼酎など、膜分離濾過後の工程によりアルコールを含む飲料として適用可能な物質、排水としては、例えば、食品洗浄排水、乳製品洗浄排水などの生産品洗浄後の排水や、有機物を豊富に含む家庭排水などが挙げられる。   Moreover, it is preferable that the chemical product obtained by the manufacturing method of the present invention is a fluid containing at least one of chemical products, dairy products, pharmaceuticals, foods or brewed products, or waste water. Here, as chemical products, for example, substances that can be applied to make chemical products by the process after membrane separation filtration, such as organic acids, amino acids and nucleic acids, and as dairy products, for example, membranes such as low-fat milk As substances and pharmaceuticals that can be applied as dairy products by the process after separation and filtration, for example, as substances and foods that can be applied to make pharmaceuticals by the process after membrane separation and filtration, such as enzymes, antibiotics, and recombinant proteins. Is a substance that can be applied as a food by a process after membrane separation filtration, such as a lactic acid beverage, and as a brewed product, for example, a substance that can be applied as a beverage containing alcohol by a process after membrane separation filtration, such as beer or shochu Examples of the wastewater include wastewater after washing of product such as food washing wastewater and dairy product washing wastewater, and domestic wastewater containing abundant organic substances.

本発明で乳酸を製造する場合、真核細胞であれば酵母、原核細胞であれば乳酸菌を用いることが好ましい。このうち酵母は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を細胞に導入した酵母が好ましい。このうち乳酸菌は、消費したグルコースに対して対糖収率として５０％以上の乳酸を産生する乳酸菌を用いることが好ましく、更に好ましくは対糖収率として８０％以上の乳酸菌であることが好適である。   In the case of producing lactic acid according to the present invention, it is preferable to use yeast for eukaryotic cells and lactic acid bacteria for prokaryotic cells. Among these, yeast in which a gene encoding lactate dehydrogenase is introduced into cells is preferable. Of these, lactic acid bacteria are preferably lactic acid bacteria that produce 50% or more lactic acid as a yield to sugar relative to glucose consumed, and more preferably 80% or more as a yield against sugar. is there.

本発明で乳酸を製造する場合に好ましく用いられる乳酸菌としては、例えば、野生型株では、乳酸を合成する能力を有するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびスポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。   Examples of lactic acid bacteria that are preferably used in producing lactic acid in the present invention include, for example, in the wild type strain, Lactobacillus, Bacillus, Pediococcus having the ability to synthesize lactic acid, Genus Carnobacterium, Genus Carnobacterium, Genus Carnobacterium, Genus Carnobacterium, Genus Carnobacterium, Genus Carnobacteria ), Genus Leuconostoc Genus Oenococcus, Genus Atopobium, Streptococcus, Genus Enterococcus, Genus Lactococcus, Genus Lactococcus Can be mentioned.

また、乳酸の対糖収率や光学純度が高い乳酸菌を選択して用いることができ、例えば、Ｄ−乳酸を選択して生産する能力を有する乳酸菌としてはスポロラクトバチルス属に属するＤ−乳酸生産菌が挙げられ、好ましい具体例として、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）またはスポロラクトバチルス・イヌリナス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）が使用できる。さらに好ましくは、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ ２３４９２、ＡＴＣＣ ２３４９３、ＡＴＣＣ ２３４９４、ＡＴＣＣ ２３４９５、ＡＴＣＣ ２３４９６、ＡＴＣＣ ２２３５４９、ＩＡＭ１２３２６、ＩＡＭ １２３２７、ＩＡＭ １２３２８、ＩＡＭ １２３２９、ＩＡＭ １２３３０、ＩＡＭ １２３３１、ＩＡＭ １２３７９、ＤＳＭ ２３１５、ＤＳＭ ６４７７、ＤＳＭ ６５１０、ＤＳＭ ６５１１、ＤＳＭ ６７６３、ＤＳＭ ６７６４、ＤＳＭ ６７７１などとスポロラクトバチルス・イヌリナスＪＣＭ ６０１４などが挙げられる。   In addition, lactic acid bacteria having high yield and optical purity of lactic acid can be selected and used. For example, as lactic acid bacteria having the ability to select and produce D-lactic acid, D-lactic acid belonging to the genus Sporolactocillus Production microorganisms can be mentioned, and preferred specific examples include Sporolactobacillus laevolacticus or Sporolactobacillus inulinus. More preferably, Sporolactobacillus laevolacticus ATCC 23492, ATCC 23493, ATCC 23494, ATCC 23495, ATCC 23396, ATCC 223549, IAM 12326, IAM 12327, IAM 12328, IAM 12329, IAM 12330, IAM 12331, IAM 12379 , DSM 2315, DSM 6477, DSM 6510, DSM 6511, DSM 6763, DSM 6764, DSM 6771, and Sporolactocillus inulinas JCM 6014.

Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバシラス・アジリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・アビアリエス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｅｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・サリバリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・シャーピイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈａｒｐｅａｅ）、ラクトバシラス・デクストリニクス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。   Examples of lactic acid bacteria having a high yield of L-lactic acid to saccharide include, for example, Lactobacillus yamanasiensis, Lactobacillus animalis, Lactobacillus bilis Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Casei (Lactobacillus casei), Lactobacillus delbruecki, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus rhactobaslus Lactobacillus ruminis, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus sharvarie, Lactobacillus sharvarie It can be selected and used for the production of L-lactic acid.

本発明の連続発酵による化学品の製造は、発酵原料を使用する。使用される発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得るものであればよい。   The production of chemicals by continuous fermentation of the present invention uses fermentation raw materials. Any fermentation raw material may be used as long as it promotes the growth of the microorganisms to be cultured and can satisfactorily produce a chemical product that is the target fermentation product.

使用される発酵原料は、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなどが使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。   The fermentation raw material used is preferably a normal liquid medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins. As a carbon source, sugars such as glucose, sucrose, fructose, galactose and lactose, starch saccharified solution containing these sugars, sweet potato molasses, sugar beet molasses, high test molasses, organic acids such as acetic acid, alcohols such as ethanol, And glycerin and the like are used. Nitrogen sources include ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other supplementary organic nitrogen sources such as oil cakes, soybean hydrolysates, casein degradation products, other amino acids, vitamins, Corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented cells and hydrolysates thereof are used. As inorganic salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, and the like can be appropriately added.

連続発酵による化学品の製造に使用する微生物または培養細胞が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤を必要に応じて使用することができる。連続発酵による化学品の製造において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。   When microorganisms or cultured cells used for the production of chemicals by continuous fermentation require specific nutrients for growth, the nutrients are added as preparations or natural products containing them. Moreover, an antifoamer can be used as needed. In the production of chemical products by continuous fermentation, the culture solution refers to a solution obtained as a result of growth of microorganisms or cultured cells as fermentation raw materials. You may change suitably the composition of the fermentation raw material to add from the fermentation raw material composition at the time of a culture | cultivation start so that productivity of the target chemical product may become high.

また、適当な時期から原料培養液の供給および培養物、また必要に応じて発酵槽内から微生物または培養細胞の引き抜きを行うことが可能である。   In addition, it is possible to supply the raw material culture solution and culture from an appropriate time, and if necessary, extract microorganisms or cultured cells from the fermenter.

本発明において、発酵・膜分離工程において用いられる分離膜について説明する。   In the present invention, the separation membrane used in the fermentation / membrane separation step will be described.

本発明に用いられる分離膜は、有機膜、無機膜を問わず、耐薬品性を持つ分離膜であれば良い。分離性能及び透水性能、さらには耐汚れ性の観点から、有機高分子化合物を好適に使用することができる。例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられ、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。   The separation membrane used in the present invention may be any separation membrane having chemical resistance regardless of whether it is an organic membrane or an inorganic membrane. From the viewpoints of separation performance and water permeability, and stain resistance, organic polymer compounds can be preferably used. Examples include polyethylene resins, polypropylene resins, polyvinyl chloride resins, polyvinylidene fluoride resins, polysulfone resins, polyethersulfone resins, polyacrylonitrile resins, cellulose resins, and cellulose triacetate resins. A mixture of these resins as the main component may be used.

本発明においては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が、化学的強度（特に耐薬品性）と物理的強度を併せ有する特徴をもつため最も好ましく用いられる。   In the present invention, a polyvinyl chloride resin, a polyvinylidene fluoride resin, a polysulfone resin, a polyethersulfone resin, and a polyacrylonitrile resin that are easily formed into a film by a solution and excellent in physical durability and chemical resistance. A resin is preferable, and a polyvinylidene fluoride resin or a resin containing the same as a main component is most preferably used because it has a characteristic of having both chemical strength (particularly chemical resistance) and physical strength.

ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体を用いても構わない。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。   Here, as the polyvinylidene fluoride resin, a homopolymer of vinylidene fluoride is preferably used. Furthermore, the polyvinylidene fluoride resin may be a copolymer of a vinyl monomer copolymerizable with vinylidene fluoride. Examples of vinyl monomers copolymerizable with vinylidene fluoride include tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, and ethylene trichloride fluoride.

さらに好ましくは、フッ素樹脂系高分子を含む中空糸膜であり、三次元網目構造と球状構造の両方を有し、親水性を持たせるために、三次元網目構造中に脂肪酸ビニルエステル、ビニルピロリドン、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイドから選ばれる少なくとも１種を有する親水性高分子、またはセルロースエステルを含有する中空糸膜である。   More preferably, it is a hollow fiber membrane containing a fluororesin polymer and has both a three-dimensional network structure and a spherical structure, and in order to impart hydrophilicity, a fatty acid vinyl ester, vinyl pyrrolidone in the three-dimensional network structure. , A hydrophilic polymer having at least one selected from ethylene oxide and propylene oxide, or a hollow fiber membrane containing a cellulose ester.

ここで、三次元網目構造とは、固形分が三次元的に網目状に広がっている構造をいう。三次元網目構造は、網を形成する固形分に仕切られた細孔およびボイドを有する。   Here, the three-dimensional network structure refers to a structure in which solid content is three-dimensionally spread in a network. The three-dimensional network structure has pores and voids partitioned by solid contents forming a network.

また、球状構造とは、多数の球状もしくは略球状の固形分が、直接もしくは筋状の固形分を介して連結している構造のことをいう。   The spherical structure refers to a structure in which a large number of spherical or substantially spherical solids are connected directly or via streak-like solids.

さらに、球状構造層と三次元網目構造層の両方を有していれば特に限定されないが、球状構造層と三次元網目構造層とが積層されたものであることが好ましい。一般に層を多段に重ねると、各層の界面では層同士が互いに入り込むために緻密になり、透過性能が低下する。層同士が互いに入り込まない場合は、透過性能は低下しないが、界面の剥離強度が低下する。従って、各層の界面の剥離強度と透過性能を考慮すると、球状構造層と三次元網目構造層の積層数は少ない方が好ましく、球状構造層１層と三次元網目構造層１層の合計２層からなるようにすることが特に好ましい。また、球状構造層と三次元網目構造層以外の層、例えば多孔質基材などの支持体層を含んでいても良い。多孔質基材としては、有機材料、無機材料等、特に限定されないが、軽量化しやすい点から有機繊維が好ましい。さらに好ましくは、セルロース系繊維、酢酸セルロース系繊維、ポリエステル系繊維、ポリプロピレン系繊維、ポリエチレン系繊維などの有機繊維からなる織布や不織布である。   Furthermore, there is no particular limitation as long as both the spherical structure layer and the three-dimensional network structure layer are provided, but it is preferable that the spherical structure layer and the three-dimensional network structure layer are laminated. In general, when layers are stacked in multiple stages, the layers enter each other at the interface of each layer and become dense, resulting in a decrease in transmission performance. When the layers do not enter each other, the permeation performance does not decrease, but the peel strength at the interface decreases. Therefore, in consideration of the peel strength and the transmission performance at the interface of each layer, it is preferable that the number of the spherical structure layer and the three-dimensional network structure layer is smaller. A total of two layers, one spherical structure layer and one three-dimensional network structure layer. It is particularly preferable to consist of Further, a layer other than the spherical structure layer and the three-dimensional network structure layer, for example, a support layer such as a porous substrate may be included. The porous substrate is not particularly limited, such as an organic material or an inorganic material, but an organic fiber is preferable from the viewpoint of easy weight reduction. More preferred are woven fabrics and nonwoven fabrics made of organic fibers such as cellulose fibers, cellulose acetate fibers, polyester fibers, polypropylene fibers, and polyethylene fibers.

三次元網目構造層と球状構造層の上下や内外の配置は、濾過方式によって変えることができるが、三次元網目構造層が分離機能を担い、球状構造層が物理的強度を担うため、三次元網目構造層を分離対象側に配置することが好ましい。特に、汚れ物質の付着による透過性能の低下を抑制するためには、分離機能を担う三次元網目構造層を分離対象側の最表層に配置することが好ましい。   The top / bottom and inside / outside arrangement of the three-dimensional network structure layer and the spherical structure layer can be changed depending on the filtration method, but the three-dimensional network structure layer is responsible for the separation function and the spherical structure layer is responsible for the physical strength. It is preferable to arrange the network structure layer on the separation target side. In particular, in order to suppress a decrease in permeation performance due to adhesion of dirt substances, it is preferable to dispose a three-dimensional network structure layer having a separation function on the outermost layer on the separation target side.

また平均細孔径は、透水性能が上述の範囲にあれば使用する目的や状況に応じて適宜決定することができるが、ある程度小さい方が好ましく、通常は０.０１μｍ以上１μｍ以下であることが良い。中空糸膜の平均細孔径が０.０１μｍ未満であると、糖や蛋白質などの成分やその凝集体などの膜汚れ成分が細孔を閉塞して、安定運転ができなくなる。透水性能とのバランスを考慮した場合、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０３μｍ以上である。また、１μｍを超える場合、膜表面の平滑性と膜面の流れによる剪断力や、逆洗やエアースクラビングなどの物理洗浄による細孔からの汚れの成分の剥離が不十分となり、安定運転ができなくなる。さらに中空糸膜の平均細孔径が微生物もしくは培養細胞の大きさに近づくと、これらが直接孔を塞いでしまう場合がある。また発酵培養液中の微生物もしくは培養細胞の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これらの破砕物によって中空糸膜の閉塞することから回避するために、平均細孔径は０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ以下であれば、より好適に実施することができる。   The average pore diameter can be appropriately determined according to the purpose and situation of use if the water permeation performance is in the above-mentioned range, but it is preferable that the average pore diameter is small to some extent, and it is usually 0.01 μm or more and 1 μm or less. . When the average pore diameter of the hollow fiber membrane is less than 0.01 μm, components such as sugar and protein and membrane dirt components such as aggregates block the pores, and stable operation cannot be performed. In consideration of the balance with water permeability, it is preferably 0.02 μm or more, and more preferably 0.03 μm or more. In addition, when it exceeds 1 μm, the film surface smoothness and the shearing force due to the flow of the film surface, and the peeling of dirt components from the pores by physical cleaning such as backwashing and air scrubbing are insufficient, and stable operation is possible. Disappear. Further, when the average pore diameter of the hollow fiber membrane approaches the size of the microorganism or cultured cell, these may directly block the pore. In addition, in order to avoid the disruption of the hollow fiber membrane due to the destruction of the hollow fiber membrane due to the death of microorganisms or a part of the cultured cells in the fermentation broth, the average pore diameter Is preferably 0.4 μm or less, and more preferably 0.2 μm or less.

ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍以上の走査型電子顕微鏡観察で観察される複数の細孔の直径を測定し、平均することにより求めることができる。１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることが好ましい。細孔が円状でない場合などは画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円、すなわち等価円を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求めることも好ましく採用できる。   Here, the average pore diameter can be obtained by measuring and averaging the diameters of a plurality of pores observed by scanning electron microscope observation at a magnification of 10,000 times or more. Preferably, 10 or more, preferably 20 or more pores are randomly selected, the diameters of these pores are measured, and the number average is obtained. When the pores are not circular, it is also preferable to use an image processing device or the like to obtain a circle having an area equal to the area of the pores, that is, an equivalent circle, and obtain the equivalent circle diameter as the pore diameter. it can.

本発明で用いられる分離膜モジュールの形態としては、中空糸膜、スパイラル式などいずれの形状のものも採用することができ、中空糸膜モジュールであれば、外圧式、内圧式のいずれの形状のものも採用することができる。   As a form of the separation membrane module used in the present invention, any shape such as a hollow fiber membrane and a spiral type can be adopted. If the hollow fiber membrane module is used, any shape of an external pressure type and an internal pressure type can be used. Things can also be adopted.

本発明において、微生物や培養細胞の発酵液を膜モジュール中の分離膜で濾過処理する際の膜間差圧は、微生物や培養細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが重要である。膜間差圧は、好ましくは０．１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０．１ｋＰａ以上５ｋＰａの範囲である。上記膜間差圧の範囲を外れた場合、原核微生物および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、連続発酵運転に不具合を生じることがある。   In the present invention, the transmembrane pressure difference when the fermentation solution of microorganisms and cultured cells is filtered through the separation membrane in the membrane module may be any condition as long as the microorganisms, cultured cells and medium components are not easily clogged. It is important that the transmembrane pressure is within a range of 0.1 kPa to 20 kPa for filtration. The transmembrane pressure difference is preferably in the range of 0.1 kPa to 10 kPa, more preferably in the range of 0.1 kPa to 5 kPa. When the range of the transmembrane pressure difference is exceeded, clogging of prokaryotic microorganisms and medium components occurs rapidly, leading to a decrease in the amount of permeated water, and may cause problems in continuous fermentation operation.

濾過の駆動力としては、発酵液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホン、またはクロスフロー循環ポンプにより分離膜に膜間差圧を発生させることができる。また、濾過の駆動力として分離膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよい。また、クロスフロー循環ポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができる。更に、発酵液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。   As the driving force for the filtration, a transmembrane differential pressure can be generated in the separation membrane by a siphon utilizing a liquid level difference (water head difference) of the fermentation liquid and the porous membrane treated water or a cross flow circulation pump. A suction pump may be installed on the separation membrane treated water side as a driving force for filtration. In addition, when a cross flow circulation pump is used, the transmembrane pressure difference can be controlled by the suction pressure. Furthermore, the transmembrane pressure difference can be controlled also by the pressure of the gas or liquid that introduces the pressure on the fermentation broth side. When these pressure controls are performed, the pressure difference between the fermented liquid side and the pressure on the porous membrane treated water side can be used as the transmembrane pressure difference, and can be used to control the transmembrane pressure difference.

連続発酵による化学品の製造において、発酵培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持されることが好ましい。発酵培養液中の糖類濃度を５ｇ／ｌ以下に保持することが好ましい理由は、発酵培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。   In the production of chemical products by continuous fermentation, the saccharide concentration in the fermentation broth is preferably maintained at 5 g / l or less. The reason why it is preferable to keep the saccharide concentration in the fermentation broth at 5 g / l or less is to minimize the loss of saccharide due to withdrawal of the fermentation broth.

微生物もしくは培養細胞の培養は、通常、ｐＨ３以上８以下、温度２０℃以上６０℃以下の範囲で行われる。発酵培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ３以上８以下範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、発酵培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。   The culture of microorganisms or cultured cells is usually carried out at a pH of 3 to 8 and a temperature of 20 ° C to 60 ° C. The pH of the fermentation broth is usually adjusted to a predetermined value within the range of 3 to 8 with an inorganic acid or an organic acid, an alkaline substance, urea, calcium carbonate, ammonia gas, and the like. If it is necessary to increase the oxygen supply rate, means such as adding oxygen to the air to maintain the oxygen concentration at 21% or higher, pressurizing the fermentation broth, increasing the stirring rate, or increasing the aeration rate may be used. it can.

また連続発酵における化学品の製造において、分離膜の洗浄に逆圧洗浄や薬液浸漬による洗浄などを行うため、これらに対する耐久性を有することが要求される。例えば逆圧洗浄液には、水や濾過液を用いる他、発酵に大きく阻害しない範囲で、アルカリ、酸または酸化剤を使用することができる。ここで、アルカリは、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などを挙げることができる。酸は、シュウ酸、クエン酸、塩酸、硝酸などを挙げることができる。また酸化剤は、次亜塩素酸塩水溶液、過酸化水素水などを挙げることができる。この逆圧洗浄液は１００℃未満の高温で使用することもできる。ここで、逆圧洗浄とは、分離膜の２次側である濾過液側から、１次側である発酵液側へ液体を送ることにより、膜面の汚れ物質を除去する方法である。   Further, in the production of chemical products in continuous fermentation, the separation membrane is washed by back pressure washing or chemical immersion so as to have durability against these. For example, in addition to using water or a filtrate, an alkali, an acid, or an oxidizing agent can be used as the back pressure washing liquid as long as the fermentation is not significantly inhibited. Here, examples of the alkali include a sodium hydroxide aqueous solution and a calcium hydroxide aqueous solution. Examples of the acid include oxalic acid, citric acid, hydrochloric acid, nitric acid and the like. Examples of the oxidizing agent include hypochlorite aqueous solution and hydrogen peroxide solution. This back pressure washing liquid can also be used at a high temperature of less than 100 ° C. Here, the back pressure cleaning is a method of removing dirt substances on the membrane surface by sending a liquid from the filtrate side which is the secondary side of the separation membrane to the fermentation liquid side which is the primary side.

なお、逆圧洗浄液の逆圧洗浄速度は、膜濾過速度の０．５倍以上５倍以下の範囲であり、より好ましくは１倍以上３倍以下の範囲である。逆圧洗浄速度がこの範囲より高いと、分離膜に損傷を与える可能性があり、またこの範囲より低いと洗浄効果が充分に得られないことがある。   The back pressure washing rate of the back pressure washing liquid is in the range of 0.5 to 5 times the membrane filtration rate, and more preferably in the range of 1 to 3 times. If the back pressure cleaning rate is higher than this range, the separation membrane may be damaged, and if it is lower than this range, the cleaning effect may not be sufficiently obtained.

逆圧洗浄液の逆圧洗浄周期は、膜差圧および膜差圧の変化により決定することができる。逆圧洗浄周期は、時間あたり０．５回以上１２回以下の範囲であり、より好ましくは時間あたり１回以上６回以下の範囲である。逆圧洗浄周期がこの範囲より多いと、分離膜に損傷を与える可能性があり、またこの範囲より少ないと、洗浄効果が充分に得られないことがある。   The counter pressure cleaning cycle of the counter pressure cleaning liquid can be determined based on the membrane differential pressure and the change in the membrane differential pressure. The counter pressure washing cycle is in the range of 0.5 to 12 times per hour, more preferably in the range of 1 to 6 times per hour. If the counter pressure cleaning cycle is greater than this range, the separation membrane may be damaged, and if it is less than this range, the cleaning effect may not be sufficiently obtained.

逆圧洗浄液の逆圧洗浄時間は、逆圧洗浄周期、膜差圧および膜差圧の変化により決定することができる。逆圧洗浄時間は、１回あたり５秒以上３００秒以下の範囲であり、より好ましくは１回あたり３０秒以上１２０秒以下の範囲である。逆圧洗浄時間がこの範囲より長いと、分離膜に損傷を与える可能性があり、またこの範囲より短いと、洗浄効果が充分に得られないことがある。   The back pressure cleaning time of the back pressure cleaning liquid can be determined by the back pressure cleaning cycle, the membrane differential pressure, and the changes in the membrane differential pressure. The back pressure washing time is in the range of 5 seconds to 300 seconds per time, and more preferably in the range of 30 seconds to 120 seconds per time. If the back pressure cleaning time is longer than this range, the separation membrane may be damaged, and if it is shorter than this range, the cleaning effect may not be sufficiently obtained.

また逆圧洗浄をする際に、一旦濾過を停止し、逆圧洗浄液で分離膜を浸漬することができる。浸漬時間は、浸漬洗浄周期、膜差圧および膜差圧の変化により決定することができる。浸漬時間は、好ましくは１回あたり１分以上２４時間以下、より好ましくは１回あたり１０分以上１２時間以下の範囲である。   Further, when the back pressure cleaning is performed, the filtration is temporarily stopped, and the separation membrane can be immersed in the back pressure cleaning liquid. The immersion time can be determined by the immersion cleaning cycle, the film differential pressure, and the change in the film differential pressure. The immersion time is preferably in the range of 1 minute to 24 hours per time, more preferably 10 minutes to 12 hours per time.

分離膜を複数系列とし、分離膜を逆圧洗浄液で浸漬洗浄する際に、系列を切り替えて、濾過が全停止しないようにすることも好ましく採用できる。   It is also possible to preferably employ a plurality of separation membranes, and when immersing and cleaning the separation membranes with a counter pressure washing liquid, switching the series so that the filtration is not completely stopped.

洗浄液保管タンク、洗浄液供給ポンプ、洗浄液保管タンクからモジュールまでの配管およびバルブは、耐薬品性に優れるものを使用すれば良い。逆圧洗浄液の注入は手動でも可能だが、ろ過・逆洗制御装置を設け、ろ過ポンプおよびろ過側バルブ、洗浄液供給ポンプおよび洗浄液供給バルブを、タイマーなどにより自動的に制御して注入することが望ましい。   The cleaning liquid storage tank, the cleaning liquid supply pump, and the piping and valves from the cleaning liquid storage tank to the module should be excellent in chemical resistance. Back pressure washing liquid can be injected manually, but it is desirable to install a filtration / back washing control device and automatically inject the filtration pump, filtration side valve, washing liquid supply pump and washing liquid supply valve with a timer. .

連続発酵による化学品の製造では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って、微生物濃度を高くした後に、連続発酵（引き抜き）を開始しても良い。または、微生物濃度を高くした後に、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続発酵を行っても良い。連続発酵による化学品の製造では、適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。   In the production of chemicals by continuous fermentation, continuous fermentation (drawing) may be started after performing batch culture or fed-batch culture at the initial stage of culture to increase the microorganism concentration. Alternatively, after increasing the microorganism concentration, a high concentration of cells may be seeded and continuous fermentation may be performed at the start of the culture. In the production of chemicals by continuous fermentation, it is possible to supply a raw material culture solution and extract a culture from an appropriate time. The starting times of the supply of the raw material culture solution and the withdrawal of the culture are not necessarily the same. Further, the supply of the raw material culture solution and the withdrawal of the culture may be continuous or intermittent.

原料培養液には菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。発酵培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、発酵培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、効率よい生産性を得る上で好ましい態様である。発酵培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、一例として、ＳＬ乳酸菌を用いたＤ−乳酸発酵では、乾燥重量として、微生物濃度を５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。   Nutrients necessary for cell growth may be added to the raw material culture solution so that the cell growth is continuously performed. It is efficient to maintain the concentration of microorganisms or cultured cells in the fermentation broth at a high level as long as the environment of the fermentation broth is not appropriate for the growth of the microorganisms or cultured cells and does not increase the rate of death. This is a preferred embodiment for obtaining productivity. For example, in the D-lactic acid fermentation using SL lactic acid bacteria, the concentration of microorganisms or cultured cells in the fermentation broth provides good production efficiency by maintaining the microorganism concentration at 5 g / L or more as the dry weight. .

連続発酵の運転においては、微生物発酵槽の微生物濃度をモニタリングすることが望ましい。微生物濃度の測定はサンプルを採取し、測定することでも可能だが、微生物発酵槽に、ＭＬＳＳ測定器など、微生物濃度センサーを設置し、微生物濃度の変化状況を連続的にモニタリングすることが望ましい。   In continuous fermentation operation, it is desirable to monitor the microbial concentration in the microbial fermenter. Microbial concentration can be measured by taking a sample and measuring it. However, it is desirable to install a microbial concentration sensor such as an MLSS measuring device in the microbial fermenter and continuously monitor the change of the microbial concentration.

連続発酵による化学品の製造では、必要に応じて発酵槽内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、発酵槽内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、引き抜くことで、閉塞から回避することができる。また、発酵槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。   In the production of chemicals by continuous fermentation, microorganisms or cultured cells can be extracted from the fermenter as necessary. For example, if the concentration of microorganisms or cultured cells in the fermenter becomes too high, the separation membrane is likely to be clogged. In addition, the production performance of a chemical may change depending on the concentration of microorganisms or cultured cells in the fermenter, and the production performance can be maintained by extracting the microorganisms or cultured cells using the production performance as an index.

連続発酵による化学品の製造では、発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、菌体を増殖させつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。連続発酵による化学品の製造では、連続培養操作は、通常、培養管理上単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることも可能である。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。   In the production of chemicals by continuous fermentation, the continuous culture operation performed while growing fresh bacterial cells capable of fermentation production is a continuous culture method that produces products while growing bacterial cells. Any number. In the production of chemicals by continuous fermentation, it is preferable that the continuous culture operation is usually performed in a single fermentation reaction tank in terms of culture management. It is also possible to use a plurality of fermentation reaction tanks because the capacity of the fermentation reaction tank is small. In this case, high productivity of the fermentation product can be obtained even if continuous fermentation is performed by connecting a plurality of fermentation reaction tanks in parallel or in series by piping.

本発明で用いられる連続発酵装置について、図を用いて説明する。   The continuous fermentation apparatus used in the present invention will be described with reference to the drawings.

図１は、本発明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置を例示説明するための概略側面図である。図１は、分離膜モジュール２が、発酵槽１の外部に設置された代表的な連続発酵装置の例である。図１において、連続発酵装置は、発酵槽１と分離膜モジュール２と洗浄液供給部で基本的に構成されている。ここで、分離膜モジュール２には、多数の中空糸膜が組み込まれている。また、洗浄液供給部は、濾過バルブ１３と洗浄液供給ポンプ１２と洗浄液バルブ１４で構成される。また、分離膜モジュール２は、循環ポンプ８を介して発酵槽１に接続されている。   FIG. 1 is a schematic side view for illustrating the continuous fermentation apparatus used in the method for producing a chemical product by continuous fermentation according to the present invention. FIG. 1 is an example of a typical continuous fermentation apparatus in which the separation membrane module 2 is installed outside the fermenter 1. In FIG. 1, the continuous fermentation apparatus is basically composed of a fermenter 1, a separation membrane module 2, and a cleaning liquid supply unit. Here, a large number of hollow fiber membranes are incorporated in the separation membrane module 2. The cleaning liquid supply unit includes a filtration valve 13, a cleaning liquid supply pump 12, and a cleaning liquid valve 14. The separation membrane module 2 is connected to the fermenter 1 via a circulation pump 8.

図１において、培地供給ポンプ９によって培地を発酵槽１に投入し、必要に応じて、撹拌装置４で発酵槽１内の発酵液を撹拌し、また、必要に応じて、気体供給装置１５によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置１５で供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサー・制御装置５および中和剤供給ポンプ１０によって発酵液のｐＨを調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。   In FIG. 1, the medium is introduced into the fermenter 1 by the medium supply pump 9, the fermented liquid in the fermenter 1 is stirred by the stirring device 4 as necessary, and the gas supply device 15 is used as necessary. Necessary gas can be supplied. At this time, the supplied gas can be recovered and recycled and supplied again by the gas supply device 15. Moreover, highly productive fermentation production can be performed by adjusting the pH of a fermented liquor with the pH sensor and control apparatus 5 and the neutralizing agent supply pump 10 as needed.

さらに、装置内の発酵液は、循環ポンプ８によって発酵槽１と分離膜モジュール２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵液は、分離膜モジュール２によって微生物と発酵生産物にろ過・分離され、装置系から取り出すことができる。また、濾過・分離された微生物は、装置系内にとどまることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜モジュール２による濾過・分離には、循環ポンプ８による圧力によって、特別な動力を使用することなく実施可能であるが、必要に応じて濾過ポンプ１１を設け、差圧センサー・制御装置７によって発酵液量を適当に調整することができる。必要に応じて、温度制御装置３によって、発酵槽１の温度を一定に維持することができ、微生物濃度を高く維持することができる。   Further, the fermentation liquid in the apparatus is circulated between the fermenter 1 and the separation membrane module 2 by a circulation pump 8. The fermentation liquor containing the fermentation product is filtered and separated into microorganisms and fermentation product by the separation membrane module 2, and can be taken out from the apparatus system. Moreover, the microorganisms filtered and separated remain in the apparatus system, so that the microorganism concentration in the apparatus system can be maintained high, and fermentation production with high productivity is possible. Here, the filtration / separation by the separation membrane module 2 can be carried out by using the pressure of the circulation pump 8 without using any special power. However, if necessary, a filtration pump 11 is provided to provide a differential pressure sensor / control. The amount of the fermented liquid can be appropriately adjusted by the device 7. If necessary, the temperature of the fermenter 1 can be kept constant by the temperature control device 3, and the microorganism concentration can be kept high.

この循環ポンプ８には、ダイヤフラムやプランジャーの往復運動により液体の吸い込み、吐き出し作用を行う容積型の往復ポンプを用いることが望ましい。例えばダイヤフラムポンプは、ダイヤフラムと二つの弁で構成されるポンプで、ダイヤフラムを上下または左右に運動させて、ダイヤフラムの容積を変化させ、吸い込み、吐き出し作用を行うことができる。この容積を変化させる際にポンプの吐出圧力に圧力変動が生じる。一つのポンプでダイヤフラムを複数並列して送液するポンプや、ダイヤフラムポンプを複数並列して送液する場合、ダイヤフラムのストローク数、ストローク長、ダイヤフラム径を変更することで、送液時のポンプ吐出圧力の圧力変動幅、周期を変更することができる。   As the circulation pump 8, it is preferable to use a positive displacement pump that sucks and discharges liquid by a reciprocating motion of a diaphragm or a plunger. For example, a diaphragm pump is a pump composed of a diaphragm and two valves, and can move the diaphragm up and down or left and right to change the volume of the diaphragm to perform suction and discharge operations. When this volume is changed, pressure fluctuation occurs in the discharge pressure of the pump. When pumps that pump multiple diaphragms in parallel with a single pump or pump multiple diaphragm pumps in parallel, change the number of strokes, stroke length, and diameter of the diaphragm to change the pump discharge during pumping. The pressure fluctuation range and cycle of the pressure can be changed.

例えば、ダイヤフラムポンプを３台並列運転する場合、一般的なダイヤフラムポンプの吐出圧力はサインカーブの様に時間変化し増減するが、３台のダイヤフラムポンプのサインカーブの周期をずらすことで、１台ずつではサインカーブの様に変動する吐出圧力も、３台並列では平均化されて吐出圧力の変動は小さくなる。また、３台のダイヤフラムポンプのサインカーブの周期を同じにすると、サインカーブが増幅される形となり、吐出圧力の変動は大きくなる。   For example, when three diaphragm pumps are operated in parallel, the discharge pressure of a general diaphragm pump varies with time as a sine curve, but increases or decreases by shifting the period of the sine curves of the three diaphragm pumps. The discharge pressure that fluctuates like a sine curve with each other is averaged when the three units are arranged in parallel, and the fluctuation of the discharge pressure becomes small. Further, if the periods of the sine curves of the three diaphragm pumps are the same, the sine curves are amplified and the fluctuation of the discharge pressure increases.

またポンプ吐出側に制御バルブを設けることにより、圧力を制御することもできる。例えば、ダイヤフラムポンプ以外の遠心ポンプなどのポンプでも、吐出側に制御バルブを設け、はじめは全開としていたバルブの開度を徐々に小さくし、制御バルブでの圧力損失を増大させ、制御バルブ出の圧力を低下させる。その後、バルブ開度を徐々に大きくし、制御バルブでの圧力損失を減少させ、制御バルブでの圧力を増加させ、これを繰り返すことで周期的な変動を発生させることもできる。制御バルブの開度の調整幅により、圧力の変動幅を変更することもできる。   The pressure can also be controlled by providing a control valve on the pump discharge side. For example, a pump such as a centrifugal pump other than a diaphragm pump is provided with a control valve on the discharge side, and the opening degree of the valve, which was initially fully open, is gradually reduced to increase the pressure loss at the control valve. Reduce pressure. Thereafter, the valve opening is gradually increased, the pressure loss at the control valve is decreased, the pressure at the control valve is increased, and this is repeated to generate periodic fluctuations. The fluctuation range of the pressure can be changed by adjusting the opening of the control valve.

本発明では、この循環ポンプ８で発酵液を循環する際に、分離膜モジュール２の一次側に供給する発酵液の圧力を変動させることが特徴である。循環ポンプ８の吐出圧力の圧力変動により局所的に乱流領域をつくることができ、クロスフローの発酵液の剪断力が増大し、分離膜表面に堆積した微生物等の堆積物を除くことができ、分離膜の濾過性能を良好に維持することができる。   The present invention is characterized in that the pressure of the fermentation liquid supplied to the primary side of the separation membrane module 2 is varied when the fermentation liquid is circulated by the circulation pump 8. A turbulent flow region can be created locally by the pressure fluctuation of the discharge pressure of the circulation pump 8, the shearing force of the cross-flow fermentation liquid is increased, and sediments such as microorganisms deposited on the separation membrane surface can be removed. The filtration performance of the separation membrane can be maintained well.

この供給する発酵液の圧力の変動については、連続的に変動させることもできるし、通常はほぼ一定のポンプ吐出圧力で運転しているが、設定の時間のみ、制御バルブを操作することなどにより、設定した時間のみ変動させ断続的に変動させることもできる。   The fluctuation of the pressure of the fermented liquid to be supplied can be continuously changed. Usually, the pump is operated at a substantially constant pump discharge pressure. However, by operating the control valve only for a set time, etc. , And can be changed intermittently by changing only the set time.

循環ポンプ８の吐出圧力の変動により、循環ポンプ８の吐出圧力の圧力変動により分離膜表面に堆積した微生物等の堆積物を除くことができるが、この圧力変動が小さすぎると、除去効果も小さく、また圧力変動が大きすぎると、送液配管のハンチングによる接続部からの漏れが発生する懸念もある。そのため、循環ポンプ８の圧力変動の大きさは、吐出圧力に対して、３％以上２０％以下であることが望ましい。   Due to fluctuations in the discharge pressure of the circulation pump 8, deposits such as microorganisms deposited on the surface of the separation membrane due to fluctuations in the discharge pressure of the circulation pump 8 can be removed, but if this pressure fluctuation is too small, the removal effect is small. In addition, if the pressure fluctuation is too large, there is a concern that leakage from the connection portion due to hunting of the liquid feeding pipe may occur. Therefore, the magnitude of the pressure fluctuation of the circulation pump 8 is desirably 3% or more and 20% or less with respect to the discharge pressure.

好気発酵においては、発酵槽に気体を供給し、発酵液に酸素を溶解させて発酵を行うが、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過する際、濾液から化学品を回収すると同時に濃縮液中の微生物や培養細胞を発酵培養液に保持または還流させるため、分離膜モジュールに発酵液をクロスフロー循環させる。この循環を行う送液ラインや分離膜モジュールに気体を供給することで、発酵槽とは別の場所で、発酵液に酸素を溶解させることもでき、かつ気体の剪断力により分離膜表面へ堆積した微生物等を除去することができる。   In aerobic fermentation, gas is supplied to the fermentor and oxygen is dissolved in the fermentation broth to perform fermentation. In continuous fermentation, when microorganisms and cultured cells are filtered through a separation membrane, chemicals are collected from the filtrate. At the same time, in order to retain or reflux microorganisms and cultured cells in the concentrated liquid in the fermentation culture liquid, the fermentation liquid is cross-flow-circulated through the separation membrane module. By supplying gas to the liquid feed line and separation membrane module that perform this circulation, oxygen can be dissolved in the fermentation liquid at a place different from the fermenter, and it is deposited on the surface of the separation membrane by the shearing force of the gas. The removed microorganisms can be removed.

ここで、気体については、好気性発酵の場合は、酸素が含まれた気体が好ましく、純酸素で供給しても良く、発酵に悪影響のない気体、例えば、空気、窒素、二酸化炭素、メタン、または前記気体らの混合気体などを混合して酸素の濃度を調整した気体でも良い。一方で嫌気性発酵の場合において、酸素の供給速度を下げる必要があれば、二酸化炭素、窒素、メタンおよびアルゴンなど、酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。   Here, as for the gas, in the case of aerobic fermentation, a gas containing oxygen is preferable, and it may be supplied with pure oxygen, for example, air, nitrogen, carbon dioxide, methane, Or the gas which mixed the gas etc. of the said gas etc. and adjusted the density | concentration of oxygen may be sufficient. On the other hand, in the case of anaerobic fermentation, if it is necessary to reduce the supply rate of oxygen, it is possible to supply a gas containing no oxygen, such as carbon dioxide, nitrogen, methane and argon, mixed with air.

気体供給源は、気体を圧縮した後、一定な圧力で気体を供給することが可能な装置、または、気体が圧縮されていて、一定な圧力で気体を供給することが可能なタンクで良い。ガスボンベ、ブロアー、コンプレッサー、あるいは配管によって供給される圧縮ガスなどを使用することができる。   The gas supply source may be a device capable of supplying gas at a constant pressure after compressing the gas, or a tank capable of supplying gas at a constant pressure when the gas is compressed. A gas cylinder, a blower, a compressor, a compressed gas supplied by piping, or the like can be used.

また、気体供給源から気体供給口までの配管には流量計などを設置し、気体供給量の測定ができるようにし、前記配管にバルブなどを設置し、供給流量を制御する。バルブは気体の流量を調整することができるもので、自動バルブを設け、気体供給を間欠的に行うことができる。気体供給は、バルブを用いて手動で行うことも可能だが、気体供給量を制御する装置を設け、ろ過ポンプおよびろ過側バルブ、気体供給バルブおよび流量計を、タイマーなどにより自動的に制御して供給することが望ましい。前記流量計、バルブ、制御装置を設置しなくても、供給する気体の流量が確認でき、その流量を制御することができるものであれば、特に限定されない。   In addition, a flow meter or the like is installed in the pipe from the gas supply source to the gas supply port so that the gas supply amount can be measured, and a valve or the like is installed in the pipe to control the supply flow rate. The valve can adjust the flow rate of gas, and an automatic valve can be provided to supply gas intermittently. Gas supply can be performed manually using a valve, but a device for controlling the gas supply amount is provided, and the filtration pump, filtration side valve, gas supply valve and flow meter are automatically controlled by a timer, etc. It is desirable to supply. There is no particular limitation as long as the flow rate of the gas to be supplied can be confirmed and the flow rate can be controlled without installing the flow meter, the valve, and the control device.

気体供給源から気体供給口までの配管には、発酵系の中に雑菌が入らないように、滅菌用装置や滅菌用フィルタなどを設置することが好ましい。   It is preferable to install a sterilization device, a sterilization filter, or the like on the pipe from the gas supply source to the gas supply port so that various bacteria do not enter the fermentation system.

気体供給口は、気体供給源から分離膜モジュールの１次側に気体を供給することができれば良い。気体供給口は、分離膜モジュールの下部に設けることも良く、さらには、発酵槽と分離膜モジュールとを連通する配管に設けることもできる。ポンプを用いて発酵槽から分離膜モジュールまで発酵液を送液する際には、発酵液とポンプの間、またはポンプと分離膜モジュールの間に気体供給口を設けることができる。   The gas supply port only needs to be able to supply gas from the gas supply source to the primary side of the separation membrane module. The gas supply port may be provided in the lower part of the separation membrane module, and further may be provided in a pipe that communicates the fermenter and the separation membrane module. When the fermentation liquid is fed from the fermenter to the separation membrane module using a pump, a gas supply port can be provided between the fermentation liquid and the pump or between the pump and the separation membrane module.

気体供給口の大きさは、気体供給量が供給可能で、かつ、発酵液により詰まりが発生しないような大きさであれば良い。発酵系の中に雑菌が入らないように、滅菌用フィルタなどを設置することもできる。   The magnitude | size of a gas supply port should just be a magnitude | size which can supply a gas supply amount and is not clogged with fermentation liquid. A sterilization filter or the like can be installed so that various bacteria do not enter the fermentation system.

本発明では、分離膜モジュール２の一次側に供給する発酵液の圧力を変動させる際に、クロスフロー循環の送液ライン、または分離膜モジュールに同時に気体を供給し、圧力変動を伴い供給する発酵液中に気体を混入させることで、気体の剪断力を増加させることができ、分離膜表面へ堆積した微生物等の除去効果をさらに増大させることができる。   In the present invention, when the pressure of the fermentation liquid supplied to the primary side of the separation membrane module 2 is changed, the gas is supplied simultaneously to the liquid feed line of the cross flow circulation or the separation membrane module, and the fermentation is supplied with pressure fluctuation. By mixing the gas into the liquid, the shearing force of the gas can be increased, and the effect of removing microorganisms and the like deposited on the separation membrane surface can be further increased.

嫌気発酵では発酵液中の溶存酸素濃度を低くする必要があることから、空気や酸素によるスクラビングを適用できず、前記の様に酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能であるが、コストが高くなる懸念がある。そのため、代わりに分離膜モジュール２の一次側に供給する発酵液の圧力を変動させる本発明のクロスフロー圧変動を適用することで、分離膜表面に堆積した微生物等の堆積物を除去し、良好な分離膜濾過性を維持することができる。好気発酵でも嫌気発酵と同様に、発酵液中の溶存酸素濃度が制限される場合があるため、発酵槽、または発酵槽に循環する送液ラインや分離膜モジュールなどの付帯設備に供給する空気量の制限があるが、代わりに分離膜モジュール２の一次側に供給する発酵液の圧力を変動させる本発明のクロスフロー圧変動を適用することで、分離膜表面に堆積した微生物等の堆積物を除去し、良好な分離膜濾過性を維持することができる。   In anaerobic fermentation, it is necessary to lower the dissolved oxygen concentration in the fermentation broth, so it is not possible to apply scrubbing with air or oxygen, and it is also possible to supply oxygen-free gas mixed with air as described above. There is a concern that the cost will be high. Therefore, by applying the cross flow pressure fluctuation of the present invention that changes the pressure of the fermentation liquid supplied to the primary side of the separation membrane module 2 instead, the deposits such as microorganisms deposited on the surface of the separation membrane are removed, and good The separation filterability can be maintained. As with anaerobic fermentation, the aerobic fermentation may limit the dissolved oxygen concentration in the fermented liquid, so the air supplied to the fermenter, or other equipment such as a liquid feed line or separation membrane module that circulates in the fermenter Although the amount is limited, deposits such as microorganisms deposited on the surface of the separation membrane by applying the cross flow pressure fluctuation of the present invention that changes the pressure of the fermentation solution supplied to the primary side of the separation membrane module 2 instead. Can be removed, and good separation membrane filterability can be maintained.

洗浄液の供給方法で用いられる洗浄液供給部は、濾過バルブ１３と洗浄液供給ポンプ１２と洗浄液バルブ１４で構成される。   The cleaning liquid supply unit used in the cleaning liquid supply method includes a filtration valve 13, a cleaning liquid supply pump 12, and a cleaning liquid valve 14.

また発酵槽１には直接、水を添加することができ、水供給部は、水供給ポンプ１６で構成される。連続発酵装置に添加される物質は、コンタミによる汚染を防止し、発酵を効率よく行うため、滅菌されていることが必要である。例えば、培地原料については、培地原料を調製後に加熱して滅菌しても良い。また、培地原料、ｐＨ調製液および発酵槽に添加する水は、必要に応じて、滅菌用フィルターを通すなどして無菌化したものを用いる。   Further, water can be directly added to the fermenter 1, and the water supply unit is constituted by a water supply pump 16. The substance added to the continuous fermentation apparatus needs to be sterilized in order to prevent contamination by contamination and perform fermentation efficiently. For example, the medium raw material may be sterilized by heating after preparing the medium raw material. In addition, the medium raw material, the pH adjusting solution, and the water added to the fermenter are sterilized by passing through a sterilizing filter, if necessary.

以下、本発明の効果をさらに詳細に、上記化学品としてＤ−乳酸を選定し、実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, the effects of the present invention will be described in more detail by selecting D-lactic acid as the chemical product and referring to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

（参考例１）中空糸膜の作製
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ−ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解した。この高分子溶液をγ−ブチロラクトンを中空部形成液体として随伴させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ−ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して球状構造からなる中空糸膜を作製した。次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社製、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ−メチル−２−ピロリドンを７７重量％、Ｔ−２０Ｃを５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して高分子溶液を調製した。この製膜原液を、球状構造からなる中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させて球状構造層の上に三次元編目構造を形成させた中空糸膜を作製した。得られた中空糸膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０４μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０^-9ｍ³／ｍ²／ｓ／Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。 Reference Example 1 Production of Hollow Fiber Membrane A vinylidene fluoride homopolymer having a weight average molecular weight of 417,000 and γ-butyrolactone were dissolved at a temperature of 170 ° C. at a ratio of 38% by weight and 62% by weight, respectively. A hollow fiber membrane having a spherical structure is obtained by discharging this polymer solution from a die while accompanying γ-butyrolactone as a hollow portion forming liquid and solidifying it in a cooling bath composed of an 80 wt% aqueous solution of γ-butyrolactone at a temperature of 20 ° C. Produced. Next, 14% by weight of vinylidene fluoride homopolymer having a weight average molecular weight of 284,000, 1% by weight of cellulose acetate propionate (manufactured by Eastman Chemical Co., CAP482-0.5), N-methyl-2-pyrrolidone Was dissolved at a temperature of 95 ° C. at a ratio of 77 wt%, T-20C 5 wt%, and water 3 wt% to prepare a polymer solution. This membrane-forming stock solution was uniformly applied to the surface of a hollow fiber membrane having a spherical structure, and immediately solidified in a water bath to produce a hollow fiber membrane having a three-dimensional stitch structure formed on the spherical structure layer. The average pore diameter of the treated water side surface of the obtained hollow fiber membrane was 0.04 μm. Next, when the pure water permeation rate was evaluated for the hollow fiber porous membrane as the separation membrane, it was 5.5 × 10 ⁻⁹ m ³ / m ² / s / Pa. The amount of water permeation was measured using purified water at a temperature of 25 ° C. by a reverse osmosis membrane at a head height of 1 m.

（実施例１）
参考例１の中空糸膜を用いて分離膜モジュールを製作した。分離膜モジュールケースにはポリスルホン樹脂製筒状容器である成型品を用いて中空糸膜モジュールを作製した。製作した多孔性中空糸膜および膜ろ過モジュールを用いて、実施例１を行った。実施例１における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
発酵槽容量:2(L)
発酵槽有効容積:1.5(L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン中空糸膜104本（有効長8cm、総有効膜面積 0.036(m²）)
中空糸膜モジュール本数：1本
温度調整:37(℃)
発酵槽通気量:窒素ガス0.2(L/min)
発酵槽攪拌速度:600(rpm)
pH調整:3N Ｃａ(ＯＨ)₂によりpH6に調整
乳酸発酵培地供給:発酵槽液量が約1.5Lで一定になる様に制御して添加
発酵液循環装置によるクロスフロー流束:0.3(m/s)
膜濾過流量制御:吸引ポンプによる流量制御
間欠的な濾過処理：濾過処理(9分間)〜濾過停止処理(1分間)の周期運転
膜濾過流束：0.01(m/day)以上0.3（m/day）以下の範囲で膜間差圧が20kPa以下となる様に可変。膜間差圧が範囲を超えて上昇し続けた場合は、連続発酵を終了した。 Example 1
A separation membrane module was manufactured using the hollow fiber membrane of Reference Example 1. For the separation membrane module case, a hollow fiber membrane module was produced using a molded product which was a cylindrical container made of polysulfone resin. Example 1 was performed using the produced porous hollow fiber membrane and membrane filtration module. The operating conditions in Example 1 are as follows unless otherwise specified.
Fermenter capacity: 2 (L)
Fermenter effective volume: 1.5 (L)
Separation membrane used: 104 polyvinylidene fluoride hollow fiber membranes (effective length 8 cm, total effective membrane area 0.036 (m ² ))
Number of hollow fiber membrane modules: 1 Temperature adjustment: 37 (℃)
Fermenter aeration rate: Nitrogen gas 0.2 (L / min)
Fermenter stirring speed: 600 (rpm)
pH adjustment: adjusted to pH 6 with 3N Ca (OH) ₂ Supply of lactic acid fermentation medium: Controlled so that the amount of fermenter liquid becomes constant at about 1.5 L, cross flow flux by added fermenter circulation device: 0.3 (m / m s)
Membrane filtration flow control: Flow control by suction pump Intermittent filtration treatment: Periodic operation of filtration treatment (9 minutes) to filtration stop treatment (1 minute) Membrane filtration flux: 0.01 (m / day) or more 0.3 (m / day) ) Variable so that the transmembrane pressure difference is 20 kPa or less in the following range. When the transmembrane pressure difference continued to rise beyond the range, continuous fermentation was terminated.

培地は121℃、20分での飽和水蒸気下の蒸気滅菌をして用いた。微生物としてSporolactobacillus laevolacticus JCM2513（SL株）を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、下記に示したHPLCを用いて以下の条件下で行った。   The medium was used after steam sterilization under saturated steam at 121 ° C. for 20 minutes. Sporolactobacillus laevolacticus JCM2513 (SL strain) is used as the microorganism, the lactic acid fermentation medium having the composition shown in Table 1 is used as the medium, and the concentration of the product lactic acid is evaluated under the following conditions using the HPLC shown below. I went there.

カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：5 mM p-トルエンスルホン酸（0.8 mL/min）
反応相：5 mM p-トルエンスルホン酸、20 mM ビストリス、0.1 mM EDTA・2Na（0.8 mL/min）
検出方法：電気伝導度
カラム温度：45℃
なお、乳酸の光学純度の分析は、以下の条件下で行った。
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
移動相 ：1 mM 硫酸銅水溶液
流束：1.0 mL/分
検出方法 ：UV 254 nm
温度 ：30℃
L-乳酸の光学純度は、次式（５）で計算される。
光学純度（％）＝100×（L-D）／（D＋L） ・・・（５）
また、D-乳酸の光学純度は、次式（６）で計算される。
光学純度（％）＝100×（D-L）／（D＋L） ・・・（６）
ここで、LはL-乳酸の濃度を表し、DはD-乳酸の濃度を表す。 Column: Shim-Pack SPR-H (manufactured by Shimadzu Corporation)
Mobile phase: 5 mM p-toluenesulfonic acid (0.8 mL / min)
Reaction phase: 5 mM p-toluenesulfonic acid, 20 mM Bistris, 0.1 mM EDTA · 2Na (0.8 mL / min)
Detection method: Electrical conductivity Column temperature: 45 ° C
The optical purity of lactic acid was analyzed under the following conditions.
Column: TSK-gel Enantio L1 (manufactured by Tosoh Corporation)
Mobile phase: 1 mM aqueous copper sulfate flux: 1.0 mL / min Detection method: UV 254 nm
Temperature: 30 ° C
The optical purity of L-lactic acid is calculated by the following formula (5).
Optical purity (%) = 100 × (LD) / (D + L) (5)
The optical purity of D-lactic acid is calculated by the following formula (6).
Optical purity (%) = 100 × (DL) / (D + L) (6)
Here, L represents the concentration of L-lactic acid, and D represents the concentration of D-lactic acid.

培養は、まずSL株を試験管で5mLの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した(前々々培養)。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地100mLに植菌し、500mL容坂口フラスコで24時間、30℃で振とう培養した(前々培養)。前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の1.5Lの発酵槽に培地を入れて植菌し、発酵槽１を付属の攪拌機４によって攪拌し、発酵槽１の通気量の調整、温度調整、pH調整を行い、発酵培養液循環ポンプ８を稼働させることなく、24時間培養を行った(前培養)。前培養完了後直ちに、発酵培養液循環ポンプ８を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を1.5Lとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、定量濾過ポンプ１１により濾過量が発酵培地供給流量と同一となるように制御した。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。   For the culture, the SL strain was first cultured overnight in a test tube with 5 mL of lactic acid fermentation medium (pre-culture). The obtained culture solution was inoculated into 100 mL of a fresh lactic acid fermentation medium, and cultured with shaking in a 500 mL Sakaguchi flask at 30 ° C. for 24 hours (pre-culture). The culture medium is inoculated in a 1.5 L fermenter of the continuous fermentation apparatus shown in FIG. 1 before inoculation, the fermenter 1 is stirred with the attached stirrer 4, the aeration rate of the fermenter 1 is adjusted, the temperature Adjustment and pH adjustment were performed, and the culture was performed for 24 hours without operating the fermentation broth circulation pump 8 (pre-culture). Immediately after completion of the pre-culture, the fermentation broth circulating pump 8 is operated, the lactic acid fermentation medium is continuously supplied in addition to the operating conditions at the time of pre-culture, and the amount of permeate through the membrane so that the fermentation broth volume of the continuous fermentation apparatus becomes 1.5L. Continuous control was carried out while controlling the above, and D-lactic acid was produced by continuous fermentation. Control of the amount of permeated water through the continuous fermentation test was controlled by the quantitative filtration pump 11 so that the filtration amount was the same as the fermentation medium supply flow rate. The produced D-lactic acid concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured appropriately.

循環ポンプ８の吐出側に循環ポンプ出制御バルブ１７を設け、循環ポンプの吐出圧力の変動幅が１０％で、変動周期は２秒となるように発酵液を送液した。連続発酵試験を行った結果を表２に示す。図１に示す連続発酵装置において、連続発酵を４００時間行うことができ、Ｄ−乳酸生産速度は最大５．０ｇ／Ｌ／ｈｒであった。   A circulation pump discharge control valve 17 was provided on the discharge side of the circulation pump 8, and the fermentation broth was fed so that the fluctuation range of the discharge pressure of the circulation pump was 10% and the fluctuation period was 2 seconds. Table 2 shows the results of the continuous fermentation test. In the continuous fermentation apparatus shown in FIG. 1, continuous fermentation could be performed for 400 hours, and the D-lactic acid production rate was 5.0 g / L / hr at the maximum.

（比較例１）
循環ポンプ８により発酵液を送液する際、発酵液供給圧力について、圧力変動幅が３％未満で、その他は実施例１と同様として連続発酵試験を行った結果を表２に示す。連続発酵時間は３３０時間で、Ｄ−乳酸生産速度は最大３．１ｇ／Ｌ／ｈｒであった。 (Comparative Example 1)
Table 2 shows the results of performing a continuous fermentation test in the same manner as in Example 1 except that the pressure fluctuation width is less than 3% with respect to the fermented liquid supply pressure when the fermented liquid is fed by the circulation pump 8. The continuous fermentation time was 330 hours, and the maximum production rate of D-lactic acid was 3.1 g / L / hr.

本発明の方法によれば、簡便な運転条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持した連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。   According to the method of the present invention, it is possible to perform continuous fermentation with stable and high productivity over a long period of time under simple operating conditions, and in a wide range of fermentation industries, chemical products that are fermentation products can be stably produced at low cost. It becomes possible to produce.

１：発酵槽
２：分離膜モジュール
３：温度制御装置
４：撹拌装置
５：ｐＨセンサー・制御装置
６：レベルセンサー・制御装置
７：差圧センサー・制御装置
８：循環ポンプ
９：培地供給ポンプ
１０：中和剤供給ポンプ
１１：濾過ポンプ
１２：洗浄液供給ポンプ
１３：濾過バルブ
１４：洗浄液バルブ
１５：気体供給装置
１６：水供給ポンプ
１７：循環ポンプ出制御バルブ 1: Fermenter 2: Separation membrane module 3: Temperature control device 4: Stirring device 5: pH sensor / control device 6: Level sensor / control device 7: Differential pressure sensor / control device 8: Circulation pump 9: Medium supply pump 10 : Neutralizer supply pump 11: Filtration pump 12: Cleaning liquid supply pump 13: Filtration valve 14: Cleaning liquid valve 15: Gas supply device 16: Water supply pump 17: Circulation pump discharge control valve

Claims (2)

発酵原料を微生物の発酵培養により化学品を含有する発酵液へと変換する発酵工程と、該発酵液から分離膜により濾過液として化学品を回収する膜分離工程を含む連続発酵による化学品の製造方法であって、分離膜の一次側に供給する発酵液の圧力を変動させることを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。 Manufacture of chemical products by continuous fermentation, which includes a fermentation process in which fermentation raw materials are converted into a fermentation broth containing chemical products by fermentation fermentation of microorganisms, and a membrane separation process in which chemical products are recovered from the fermentation liquid as a filtrate through a separation membrane A method for producing a chemical product by continuous fermentation, characterized in that the pressure of the fermentation liquid supplied to the primary side of the separation membrane is varied. 分離膜の一次側に発酵液を供給する際に、同時に気体を供給する請求項１に記載の連続発酵による化学品の製造方法。 The method for producing a chemical product by continuous fermentation according to claim 1, wherein when supplying the fermentation liquid to the primary side of the separation membrane, gas is simultaneously supplied.

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