JP2012120451A - Substrate for cell test with auxiliary electrode - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、補助電極の付いた細胞試験用基板及び細胞試験用容器に関する。 The present invention relates to a cell test substrate with an auxiliary electrode and a cell test container.
現在、様々な動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。 Currently, various animal and plant cell cultures are being performed, and new cell culture methods have been developed. Cell culture techniques are used for the purpose of elucidating biochemical phenomena and properties of cells and producing useful substances. In addition, attempts have been made to examine the physiological activity and toxicity of artificially synthesized drugs using cultured cells.
一部の細胞（特に多くの動物細胞）は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にし、細胞の形態に影響を与えることが知られている。 Some cells (particularly many animal cells) have an adhesion dependency that grows by adhering to something, and cannot survive for a long time in a floating state in vitro. In order to culture such cells having adhesion dependency, a carrier for cell adhesion is required, and generally, a plastic culture in which cell adhesion proteins such as collagen and fibronectin are uniformly applied. A dish is used. These cell adhesion proteins are known to act on cultured cells, facilitate cell adhesion, and affect cell morphology.
生体内で接着した状態で生存している細胞の機能を評価するためには、細胞を接着させた状態で培養する必要がある。細胞間の相互作用を評価する場合も、接着した状態の細胞を共培養して相互作用を評価することが好ましい。しかし、担体上の特定の領域のみを細胞接着性をすることにより、その領域に細胞を接着させることはできても、２種以上の細胞をそれぞれ別の領域に接着させることは困難であった。したがって、特定の条件で細胞接着性を改変することができ、細胞ごとに接着させる領域と接着させない領域を制御できるような技術が求められていた。 In order to evaluate the function of cells surviving in a state of being adhered in a living body, it is necessary to culture in a state where the cells are adhered. Also when evaluating the interaction between cells, it is preferable to evaluate the interaction by co-culturing cells in an adherent state. However, it was difficult to attach two or more types of cells to different regions, even though cells can be adhered to a specific region on the carrier only by making it adhere to the cell. . Therefore, there has been a demand for a technique that can modify cell adhesion under specific conditions and can control a region to be adhered to each cell and a region not to be adhered.
一方、細胞の遊走は免疫応答や受精後の胚形態形成、組織修復及び再生などの様々な段階に関与している。また、癌やアテローム動脈硬化症、関節炎などの疾患の進行においても極めて重要な役割を持つ。具体的には、血管内皮を通しての細胞の遊走は、炎症、アテローム性動脈硬化症、癌の転移といった状態の病態生理における重要な現象である。そのため、インビトロでの細胞遊走を測定する方法は、長年に渡って開発されてきた。 On the other hand, cell migration is involved in various stages such as immune response, embryo morphogenesis after fertilization, tissue repair and regeneration. In addition, it plays an extremely important role in the progression of diseases such as cancer, atherosclerosis and arthritis. Specifically, cell migration through the vascular endothelium is an important phenomenon in the pathophysiology of conditions such as inflammation, atherosclerosis, and cancer metastasis. Therefore, methods for measuring cell migration in vitro have been developed for many years.
細胞遊走アッセイに関してすでに市販されている装置としては、古典的なボイデンチャンバ、細胞培養インサート、ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ＨｉｔＫｉｔ（登録商標）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）がある。しかし、こうした装置では、接着した細胞の遊走方向を制御して、定量的に細胞遊走をアッセイすることは困難である。したがって、接着した細胞を特定の領域に制御して遊走させることにより細胞遊走を試験するための技術も求められていた。 Devices already on the market for cell migration assays include the classic Boyden chamber, cell culture insert, FluoroBlock® (BD Biosciences), and Cell Mobility HitKit® (Cellomics). However, with such a device, it is difficult to quantitatively assay cell migration by controlling the migration direction of attached cells. Therefore, there is also a need for a technique for testing cell migration by allowing attached cells to migrate in a specific region.
本発明者らは既に、細胞接着阻害性領域と前記細胞接着阻害性領域に隣接する細胞接着性領域とを有する細胞試験用基板に電圧を印加することにより、細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変できることを見出しており、この技術を応用した異なる細胞の共培養や、細胞遊走試験について特許出願済みである（特願２００９−２３９５８８号、及び特願２００９−２３９７１１号）。 The present inventors have already applied a voltage to a cell test substrate having a cell adhesion inhibitory region and a cell adhesion region adjacent to the cell adhesion inhibitory region, thereby making the cell adhesion inhibitory region a cell adhesive property. It has been found that it can be modified into a region, and patent applications have been filed for co-culture of different cells and cell migration tests applying this technology (Japanese Patent Application Nos. 2009-239588 and 2009-239711).
本発明者らによる上記特許出願に係る発明によれば、異なる細胞の共培養、細胞間の相互作用の評価、細胞遊走試験などを簡便に実施することが可能となる。しかしながら、細胞試験用基板のサイズを大きくすると、電圧印加端子からの距離に応じて電圧降下が生じてしまう。そのため、基板全体に均一な電圧を印加する点において未だ改良の余地が残されている。 According to the invention relating to the above patent application by the present inventors, it becomes possible to easily carry out co-culture of different cells, evaluation of interaction between cells, cell migration test and the like. However, when the size of the cell test substrate is increased, a voltage drop occurs depending on the distance from the voltage application terminal. Therefore, there is still room for improvement in terms of applying a uniform voltage across the entire substrate.
したがって、本発明は基板全体に均一な電圧を印加することが可能な細胞試験用基板を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a cell test substrate capable of applying a uniform voltage to the entire substrate.
本発明者らが鋭意検討した結果、細胞試験用基板に補助電極を取り付けることにより、基板全体に均一な電圧を印加できることを見出した。なお、補助電極を使用する発明としては、例えば特許文献１に開示されているものが知られている。しかしながら、特許文献１は有機ＥＬ素子における電圧降下を問題としており、本発明とは技術分野が大きく異なる。また、本発明では細胞接着阻害性領域を均一に細胞接着性領域に改変させることを目的としているのに対して、特許文献１では輝度のムラを解消することを目的としており、その目的も大きく異なっている。 As a result of intensive studies by the present inventors, it was found that a uniform voltage can be applied to the entire substrate by attaching an auxiliary electrode to the cell test substrate. In addition, as invention which uses an auxiliary electrode, what is disclosed by patent document 1, for example is known. However, Patent Document 1 has a problem of a voltage drop in the organic EL element, and is technically different from the present invention. Further, in the present invention, the object is to uniformly change the cell adhesion-inhibiting region to the cell adhesion region, whereas in Patent Document 1, the object is to eliminate luminance unevenness, and the purpose is also large. Is different.
具体的には、本発明は以下を包含する。
（１）基材と、
前記基材上に配置された電極と
を備える細胞試験用基板であって、
前記電極は、主電極と、前記主電極に導電可能に接続された補助電極とを含み、
前記主電極上には、細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域とが配置されている
ことを特徴とする前記細胞試験用基板。
（２）補助電極の抵抗が主電極の抵抗よりも小さい、（１）に記載の細胞試験用基板。
Specifically, the present invention includes the following.
(1) a base material;
A substrate for cell testing comprising an electrode disposed on the substrate,
The electrode includes a main electrode and an auxiliary electrode conductively connected to the main electrode,
The cell test substrate, wherein a cell adhesive region and a cell adhesion inhibitory region adjacent to the cell adhesive region are disposed on the main electrode.
(2) The cell test substrate according to (1), wherein the resistance of the auxiliary electrode is smaller than the resistance of the main electrode.
（３）主電極が透明電極である、（１）又は（２）に記載の細胞試験用基板。
（４）基材上に配置された対向電極を更に備え、前記対向電極が前記電極と電気的に絶縁されて配置されている、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞試験用基板。
（５）補助電極と対向電極とが同一の物質である、（４）に記載の細胞試験用基板。
(3) The cell test substrate according to (1) or (2), wherein the main electrode is a transparent electrode.
(4) The cell test according to any one of (1) to (3), further comprising a counter electrode disposed on a substrate, wherein the counter electrode is disposed to be electrically insulated from the electrode. substrate.
(5) The cell test substrate according to (4), wherein the auxiliary electrode and the counter electrode are the same substance.
（６）（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞試験用基板と、
前記細胞試験用基板上の１又は複数の部分領域を底面とし上方に開放された１又は複数の凹部の側壁を形成する側壁部材と
を備える細胞試験用容器であって、
前記凹部の底面を構成する部分領域は、主電極上に配置された細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域とを含む前記細胞試験用容器。
（７）細胞試験用基板と側壁部材とが接触する位置に補助電極が配置されており、前記補助電極が接着材料を含み、前記細胞試験用基板と前記側壁部材とが前記補助電極を介して接合されている、（６）に記載の細胞試験用容器。
(6) The cell test substrate according to any one of (1) to (3),
A cell test container comprising a side wall member forming one or a plurality of recesses opened upward with the one or more partial regions on the cell test substrate as a bottom surface,
The partial area which comprises the bottom face of the said recessed part is the said cell test container containing the cell-adhesive area | region arrange | positioned on a main electrode, and the cell-adhesion inhibitory area adjacent to the said cell-adhesive area | region.
(7) An auxiliary electrode is disposed at a position where the cell test substrate and the side wall member are in contact with each other, the auxiliary electrode includes an adhesive material, and the cell test substrate and the side wall member are interposed via the auxiliary electrode. The cell test container according to (6), which is joined.
（８）（４）又は（５）に記載の細胞試験用基板と、
前記細胞試験用基板上の１又は複数の部分領域を底面とし上方に開放された１又は複数の凹部の側壁を形成する側壁部材と
を備える細胞試験用容器であって、
前記凹部の底面を構成する部分領域は、主電極上に配置された細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域と、対向電極と含む前記細胞試験用容器。
（９）補助電極が、凹部の底面を構成する部分領域の周縁の外に配置されている、（６）又は（８）に記載の細胞試験用容器。
（１０）側壁部材が、厚さ方向に延びる複数の貫通孔が形成された板状体である、（６）〜（９）のいずれかに記載の細胞試験用容器。
(8) The cell test substrate according to (4) or (5),
A cell test container comprising a side wall member forming one or a plurality of recesses opened upward with the one or more partial regions on the cell test substrate as a bottom surface,
The cell test container, wherein the partial region constituting the bottom surface of the recess includes a cell adhesive region disposed on the main electrode, a cell adhesion inhibitory region adjacent to the cell adhesive region, and a counter electrode.
(9) The cell test container according to (6) or (8), wherein the auxiliary electrode is disposed outside the peripheral edge of the partial region constituting the bottom surface of the recess.
(10) The cell test container according to any one of (6) to (9), wherein the side wall member is a plate-like body having a plurality of through holes extending in the thickness direction.
本発明によれば、基板全体に均一な電圧を印加することができ、それにより細胞接着阻害性領域を均一に細胞接着性領域に改変させることが可能な細胞試験用基板を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a cell test substrate capable of applying a uniform voltage to the entire substrate, thereby making it possible to uniformly change the cell adhesion-inhibiting region to the cell adhesion region. .
以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明者らが既に出願している細胞試験用基板を使用した細胞試験用容器を示す。主電極１１上の細胞接着性領域１６と細胞接着阻害性領域１７とを含むように側壁部材１４が配置され、凹部１５が形成される。対向電極１３は細胞試験用容器１０とは別個に設けられている。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
FIG. 1 shows a cell test container using a cell test substrate already filed by the present inventors. The
図２は、本発明の補助電極付き細胞試験用基板２９を使用した細胞試験用容器２０の一実施形態を示す。図２に示すように、細胞試験用基板２９は、基材上に配置された主電極２１と、主電極に導電可能に接続された補助電極２２とを含み、主電極上には、細胞接着性領域２６と、細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域２７とが配置されている。細胞試験用容器２０は、細胞試験用基板２９上の１又は複数の部分領域を底面とし上方に開放された１又は複数の凹部２５の側壁を形成する側壁部材２４を備えており、凹部２５の底面を構成する部分領域が、主電極２１上に配置された細胞接着性領域２６と、細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域２７とを含んでいる。
FIG. 2 shows an embodiment of a
側壁部材２４は、細胞試験用基板２９と一体となって、細胞や細胞培養液などを収容することができる１又は複数の凹部２５を細胞試験用基板上に作成することができる。凹部２５が複数作成される場合には、凹部の底面を構成する部分領域のそれぞれに、主電極上に配置された細胞接着性領域２６と、細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域２７とが含まれる。
The
凹部は細胞や細胞培養液などを収容することができるものであればどのような形状であってもよい。そのため、側壁部材は、例えば、両端が開口した中空の多角柱（三角柱、四角柱、五角柱、六角柱など）や円柱の形状であってもよく、また、複数の凹部を形成する場合にはこれらが連結した形状であってもよい。厚さ方向に延びる複数の貫通孔が形成された板状体を側壁部材として使用することも可能である。この場合、貫通孔の形状は、細胞の培養や観察などが容易であればどのような形状であってもよい。基板表面と側壁とが成す角度が９０度であることが好ましいが、９０度未満であってもよく、また９０度を超えていてもよい。 The recess may have any shape as long as it can accommodate cells, cell culture medium, and the like. Therefore, the side wall member may be, for example, a hollow polygonal column (triangular column, quadrangular column, pentagonal column, hexagonal column, etc.) or a cylindrical shape with both ends open, and when forming a plurality of recesses The shape which these connected may be sufficient. A plate-like body in which a plurality of through-holes extending in the thickness direction is formed can be used as the side wall member. In this case, the shape of the through hole may be any shape as long as cell culture and observation are easy. The angle formed by the substrate surface and the side wall is preferably 90 degrees, but may be less than 90 degrees or may exceed 90 degrees.
厚さ方向に延びる複数の貫通孔が形成された板状体として、例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルのマルチウェルプレートであって、各ウェルの底部が存在しないもの（つまり、底が抜けているマルチウェルプレート）を使用することもできる。複数の凹部を有することにより、異なる細胞や異なる条件を用いた試験を一度に実施することが可能となる。 As a plate-like body in which a plurality of through holes extending in the thickness direction are formed, for example, a 6-well, 12-well, 24-well, 48-well, 96-well, 384-well, and 1536-well multi-well plate, each well It is also possible to use a plate that does not have a bottom portion (that is, a multi-well plate with a hollow bottom). By having a plurality of recesses, it is possible to carry out tests using different cells and different conditions at the same time.
図３は、細胞試験用基板３０と側壁部材３４（両端が開口した９６ウェルのマルチウェルプレート）とを示す。細胞試験用基板３０上に側壁部材３４を接合することにより、細胞や細胞培養液などを収容することができる複数の凹部を有する細胞試験用容器とすることができる。
FIG. 3 shows the
形成可能な凹部の数は細胞試験用基板の大きさに依存するが、基板のサイズが大きくなっても補助電極を使用することにより、基板全体に均一な電圧を印加することができる。細胞試験用基板のサイズは特に制限されないが、長さ×幅が１０ｍｍ×１０ｍｍ〜１０００ｍｍ×１０００ｍｍであることが好ましく、２０ｍｍ×２０ｍｍ〜２００ｍｍ×２００ｍｍであることがより好ましい。例えば、マイクロプレートのANSI/SBS規格で定まっているサイズ、長さ×幅が１２７．７６ｍｍ×８５．４８ｍｍに合わせることが考えられる（規格については、例えば特開２００７−３１６０６４号公報を参照されたい）。 The number of recesses that can be formed depends on the size of the cell test substrate, but even when the size of the substrate is increased, a uniform voltage can be applied to the entire substrate by using the auxiliary electrode. The size of the cell test substrate is not particularly limited, but the length × width is preferably 10 mm × 10 mm to 1000 mm × 1000 mm, and more preferably 20 mm × 20 mm to 200 mm × 200 mm. For example, it can be considered that the size and length × width determined by the ANSI / SBS standard of the microplate are set to 127.76 mm × 85.48 mm (for the standards, see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-316064) ).
図４ａは細胞試験用容器４０を上方から見た図である。細胞試験用基板上に側壁部材４４が配置されることにより９６個の凹部４５が形成されている。補助電極４２は凹部の底面を構成する部分領域の周縁の外に配置されている。図４ｂは図４ａの一部を拡大した図である。側壁部材４４は細胞接着性領域４６と細胞接着阻害性領域４７とを含むように配置されており、細胞接着性領域上には細胞４９が接着している。図４ｃは図４ｂの断面図である。基材４８上に主電極４１が配置されており、補助電極４２が主電極上に配置されている。主電極上には細胞接着性領域４６と細胞接着阻害性領域４７とが存在しており、両領域を含むように側壁部材４４が配置され、凹部４５が形成されている。凹部の内部には細胞培養液が導入されており、細胞接着性領域上には細胞４９が接着している。
FIG. 4 a is a view of the
補助電極が接着材料を含む場合、例えば、補助電極が金属微粒子と接着材料を含む導電性ペーストである場合には、細胞試験用基板と側壁部材とが接触する位置に補助電極を配置することにより、補助電極を介して細胞試験用基板と側壁部材を接合することができる。補助電極が接着剤の機能を果たすことにより、細胞試験用基板と側壁部材とを接合する更なる工程を省略することができ、細胞試験用容器の作成プロセスを簡素化することができる。 When the auxiliary electrode includes an adhesive material, for example, when the auxiliary electrode is a conductive paste including metal fine particles and an adhesive material, the auxiliary electrode is disposed at a position where the cell test substrate and the side wall member are in contact with each other. The cell test substrate and the side wall member can be joined via the auxiliary electrode. Since the auxiliary electrode functions as an adhesive, a further step of joining the cell test substrate and the side wall member can be omitted, and the process of creating the cell test container can be simplified.
例えば、細胞試験用容器の断面を示す図５のように、細胞試験用基板５９と側壁部材５４とが接触する位置に補助電極５２が配置されており、前記基板と側壁部材とが補助電極を介して接合される。
For example, as shown in FIG. 5 showing a cross section of the cell test container, the
補助電極に包含させることができる接着材料としては特に制限されるものではないが、例えば、導電フィラーを樹脂バインダーに混合した接着剤や、低融点金属などが挙げられる。接着剤としては例えば、ドータイトやスリーボンド３３００シリーズ、低融点金属としては、例えばハンダなどが挙げられる。 Although it does not restrict | limit especially as an adhesive material which can be included in an auxiliary electrode, For example, the adhesive agent which mixed the conductive filler with the resin binder, a low melting metal, etc. are mentioned. Examples of the adhesive include dotite and three bond 3300 series, and examples of the low melting point metal include solder.
補助電極が透明電極ではない場合には、細胞を観察する観点から、凹部の底面を構成する細胞試験用基板上の一定の領域（部分領域）における細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣接する領域（観察領域）の外に補助電極が配置されていることが好ましい。更には、凹部の底面を構成する部分領域の周縁の外に補助電極が配置されていることが好ましい。前記周縁の外であって側壁部材の下部領域に補助電極が配置されていてもよい。 When the auxiliary electrode is not a transparent electrode, from the viewpoint of observing cells, the cell adhesion region and the cell adhesion inhibitory region in a certain region (partial region) on the cell test substrate constituting the bottom surface of the recess are It is preferable that the auxiliary electrode is disposed outside the adjacent region (observation region). Furthermore, it is preferable that the auxiliary electrode is disposed outside the peripheral edge of the partial region constituting the bottom surface of the recess. An auxiliary electrode may be disposed outside the peripheral edge and in a lower region of the side wall member.
補助電極は主電極と導電可能に接続されていればよいため、補助電極及び主電極が基材上にどのような順番で積層されていてもよい。また、補助電極は主電極に連続して接続している必要はなく、断続的に接続されていてもよい。そのため、図６に示す細胞試験用基板６０のように、複数の補助電極６２が間隔をあけて主電極６１に接続されていてもよい。
Since the auxiliary electrode is only required to be conductively connected to the main electrode, the auxiliary electrode and the main electrode may be laminated on the base material in any order. Moreover, the auxiliary electrode does not need to be connected continuously to the main electrode, and may be connected intermittently. Therefore, a plurality of
本発明の細胞試験用容器の別の実施形態では、細胞試験用基板が、電極と電気的に絶縁されて基材上に配置されている対向電極を更に備える。例えば、図７ａの細胞試験用容器の一部拡大図に示すように、側壁部材７４は細胞接着性領域と、細胞接着阻害性領域と、対向電極７３とを含むように配置されており、細胞接着性領域上には細胞が接着している。図７ｂは図７ａの断面図である。基材（ガラス板）７８上に補助電極７２と対向電極７３とが配置され、主電極７１が補助電極７２と導電可能に接続し、且つ対向電極７３と電気的に絶縁された位置に配置される。細胞接着性領域７６と、細胞接着阻害性領域７７と、対向電極７３とを含むように側壁部材７４が配置され、凹部が形成されている。凹部の内部には細胞培養液が導入されており、細胞接着性領域上には細胞が接着している。補助電極と対向電極とが同一の物質である場合には、基材上に補助電極と対向電極とを一度に形成することができるため、作成プロセスを簡素化することができる。
In another embodiment of the cell test container of the present invention, the cell test substrate further includes a counter electrode that is electrically insulated from the electrode and disposed on the substrate. For example, as shown in the partially enlarged view of the cell test container of FIG. 7a, the
細胞試験用容器が複数の凹部を有する場合には、図８に示すように、電極（主電極８１、及び前記主電極に導電可能に接続された補助電極８２）と、対向電極８３とが基材８８上に複数配置され、前記複数の電極と対向電極とがそれぞれ電気的に絶縁されて配置され、凹部の底面を構成する細胞試験用基板上の部分領域に主電極８１及び対向電極８３の一対が包含されるように側壁部材が配置されていてもよい。凹部ごとに異なる電極及び対向電極が配置されることで、凹部ごとに異なる電圧を印加することが可能となる。
When the cell test container has a plurality of recesses, as shown in FIG. 8, the electrode (the
本発明の細胞試験用基板及び細胞試験用容器を使用することで、細胞の培養、異なる細胞の共培養、細胞間の相互作用の評価、細胞遊走試験などの細胞を使用した様々な試験を実施することができる。 By using the cell test substrate and cell test container of the present invention, various tests using cells such as cell culture, co-culture of different cells, evaluation of interaction between cells, cell migration test, etc. are performed. can do.
（基材）
本発明の細胞試験用基板に用いられる基材としては、基材上に電極を配置可能なものであれば特に制限されない。例えば、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス、セラミック、シリコン、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される無機材料や有機材料などを挙げることができる。導電性の基材を電極として使用してもよい。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜などの平坦な形状、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路などの立体的な形状、ならびに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。
(Base material)
The base material used for the cell test substrate of the present invention is not particularly limited as long as an electrode can be disposed on the base material. For example, glass, quartz glass, borosilicate glass, alumina, sapphire, ceramics, forsterite, photosensitive glass, ceramic, silicon, elastomer, plastic (for example, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin) , Fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin), and the like. A conductive substrate may be used as the electrode. The shape is not limited. For example, a flat shape such as a flat plate, a flat membrane, a film, and a porous membrane, a three-dimensional shape such as a cylinder, a stamp, a multiwell plate, and a microchannel, and irregularities are formed on the surface. Shape. When using a film, the thickness in particular is not restrict | limited, However, Usually, it is 0.1-1000 micrometers, Preferably it is 1-500 micrometers, More preferably, it is 10-200 micrometers.
特に、細胞の大きさよりも小さい１ｎｍ〜１０μｍ程度の微細な凹凸が表面に付加された基材を用い、細胞接着性領域も同様の形状となる場合には、接着した細胞の形状や挙動を制御して、試験を効果的に行うことが可能である。微細な凹凸とは例えば、ラインパターンの場合、深さ１ｎｍ〜１０μｍ、ライン凸部の幅１ｎｍ〜１０μｍ、ライン凹部の幅１ｎｍ〜１０μｍのことを指す。 In particular, when a substrate with fine irregularities of 1 nm to 10 μm, which is smaller than the cell size, is added to the surface, and the cell adhesive region has the same shape, the shape and behavior of the adhered cells are controlled. Thus, the test can be performed effectively. For example, in the case of a line pattern, the fine unevenness means a depth of 1 nm to 10 μm, a line convex portion width of 1 nm to 10 μm, and a line concave portion width of 1 nm to 10 μm.
（主電極）
主電極としては導電性の物質であれば特に制限されない。例えば、金属（金、銀、銅など）、金属酸化物（酸化インジウム錫（ＩＴＯ）、酸化インジウム亜鉛(ＩＺＯ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）など）、導電性ナノファイバー（カーボンナノチューブなど)、導電性の有機材料（ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）など）が挙げられる。細胞を観察する観点から、電圧印加後も透明である透明電極を使用することが好ましい。透明電極としては、例えば、ＩＴＯ，ＩＺＯ、ＺｎＯなどの金属酸化物、ＰＥＤＯＴなどの導電性高分子、Ａｇナノワイヤーやカーボンナノチューブをバインダーに分散させた材料、Ａｇなどの金属材料を格子状に形成して開口部を持たせた膜などが挙げられる。主電極は電極材料を基材上に成膜して、その後パターニングすることにより形成することが好ましい。
(Main electrode)
The main electrode is not particularly limited as long as it is a conductive substance. For example, metal (gold, silver, copper, etc.), metal oxide (indium tin oxide (ITO), indium zinc oxide (IZO), zinc oxide (ZnO), etc.), conductive nanofiber (carbon nanotube, etc.), conductive Organic materials such as polyethylene dioxythiophene (PEDOT). From the viewpoint of observing cells, it is preferable to use a transparent electrode that is transparent even after voltage application. As transparent electrodes, for example, metal oxides such as ITO, IZO and ZnO, conductive polymers such as PEDOT, materials in which Ag nanowires and carbon nanotubes are dispersed in a binder, and metal materials such as Ag are formed in a lattice shape And a film having an opening. The main electrode is preferably formed by forming an electrode material on a substrate and then patterning the electrode material.
透明電極は一般的に金属電極と比べて抵抗が大きい。本発明の細胞試験用基板に用いられる透明電極の抵抗は、例えばＩＴＯの場合は、膜質・膜厚・透過率にもよるが、通常、シート抵抗が１〜１０００Ω／□であり、具体的には５〜５００Ω／□、より具体的には１０Ω／□程度である。膜厚１５０ｎｍでシート抵抗が１０Ω／□の場合、電気抵抗率は、１．５×１０−６ Ω・ｍとなる。シート抵抗や電気抵抗率は、例えば、三菱化学アナリテック（株）のロレスタを用いて測定することができる。金属酸化物膜、金属微粒子や金属ファイバーがバインダーに分散された膜、金属が絶縁体物に埋め込まれた膜、導電性の有機材料、イオン液体等のイオン導電性の材料等であることが好ましい。例えば、金属膜には金を用いてもよく、金属酸化物膜にはＩＴＯを用いてもよい。導電膜は透明であることが好ましい。 A transparent electrode generally has a higher resistance than a metal electrode. For example, in the case of ITO, the resistance of the transparent electrode used in the cell test substrate of the present invention depends on the film quality / film thickness / transmittance, but usually the sheet resistance is 1-1000Ω / □, specifically Is 5 to 500 Ω / □, more specifically about 10 Ω / □. When the sheet resistance is 10Ω / □ at a film thickness of 150 nm, the electrical resistivity is 1.5 × 10 −6 Ω · m. Sheet resistance and electrical resistivity can be measured using, for example, Loresta manufactured by Mitsubishi Chemical Analytech Co., Ltd. It is preferably a metal oxide film, a film in which metal fine particles or metal fibers are dispersed in a binder, a film in which a metal is embedded in an insulator, a conductive organic material, an ion conductive material such as an ionic liquid, or the like. . For example, gold may be used for the metal film, and ITO may be used for the metal oxide film. The conductive film is preferably transparent.
（補助電極）
補助電極としては導電性の物質であれば特に制限されない。例えば、主電極として使用可能な物質を使用することができる。補助電極の抵抗は主電極の抵抗よりも小さいことが好ましい。また、補助電極と主電極との抵抗の差が大きいほど好ましい。補助電極の抵抗がより小さく、また、抵抗の差が大きいほど主電極を単独で使用した場合に生じる電圧降下を改善することができる。具体的には、金、銀、銅などの導電率の高い金属を補助電極として使用することが好ましい。また、接着材料を含む導電性ペーストを使用してもよい。
(Auxiliary electrode)
The auxiliary electrode is not particularly limited as long as it is a conductive substance. For example, a substance that can be used as the main electrode can be used. The resistance of the auxiliary electrode is preferably smaller than the resistance of the main electrode. Moreover, it is preferable that the difference in resistance between the auxiliary electrode and the main electrode is larger. As the resistance of the auxiliary electrode is smaller and the difference in resistance is larger, the voltage drop that occurs when the main electrode is used alone can be improved. Specifically, it is preferable to use a metal having high conductivity such as gold, silver, or copper as the auxiliary electrode. Alternatively, a conductive paste containing an adhesive material may be used.
補助電極の抵抗は、１×１０−８〜１×１０−６ Ω・ｍであることが好ましく、１×１０−８〜５×１０−７ Ω・ｍであることがより好ましく、１×１０−８〜１×１０−７ Ω・ｍであることが特に好ましい。主電極と補助電極の抵抗率の比（主電極／補助電極）は、１〜１，０００であることが好ましく、５〜１，０００であることがより好ましく、１０〜１，０００であることが特に好ましい。シート抵抗や電気抵抗率は、例えば、三菱化学アナリテック（株）のロレスタを用いて測定することができる。 The resistance of the auxiliary electrode is preferably 1 × 10 −8 to 1 × 10 −6 Ω · m, more preferably 1 × 10 −8 to 5 × 10 −7 Ω · m, and more preferably 1 × 10 It is particularly preferably −8 to 1 × 10 −7 Ω · m. The resistivity ratio of the main electrode to the auxiliary electrode (main electrode / auxiliary electrode) is preferably 1 to 1,000, more preferably 5 to 1,000, and 10 to 1,000. Is particularly preferred. Sheet resistance and electrical resistivity can be measured using, for example, Loresta manufactured by Mitsubishi Chemical Analytech Co., Ltd.
（対向電極）
対向電極としては導電性の物質であれば特に制限されない。例えば、主電極及び補助電極として使用可能な物質を使用することができる。好ましくは、補助電極と同一の物質が使用される。この場合、基材上に補助電極と対向電極とを一度に形成することができるため、細胞試験用基板の作成プロセスを簡素化することができる。
(Counter electrode)
The counter electrode is not particularly limited as long as it is a conductive substance. For example, a material that can be used as a main electrode and an auxiliary electrode can be used. Preferably, the same material as the auxiliary electrode is used. In this case, since the auxiliary electrode and the counter electrode can be formed on the substrate at the same time, the process for creating the cell test substrate can be simplified.
（電極の形成）
基材上における主電極、補助電極及び対向電極の形成は、公知のパターニング技術を利用できる。公知のパターニング技術としては、例えば、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法、フレキソ印刷法およびコンタクトプリンティング法などの各種印刷法による方法、各種リソグラフィー法を用いる方法、ならびにインクジェット法による方法、他に微細な溝を彫刻などする立体整形の手法などが挙げられる。具体的には、絶縁性材料からなる基材、例えばガラス基材に、導電性材料、例えば金属膜または金属酸化物膜を成膜し、これをフォトリソグラフィー技術などの公知の技術を用いてパターニングすることにより、主電極、補助電極及び対向電極を形成することができる。
(Formation of electrodes)
A known patterning technique can be used to form the main electrode, the auxiliary electrode, and the counter electrode on the substrate. Known patterning techniques include, for example, gravure printing methods, screen printing methods, offset printing methods, flexographic printing methods, contact printing methods and other printing methods, various lithography methods, ink jet methods, and the like. 3D shaping techniques such as engraving fine grooves. Specifically, a conductive material such as a metal film or a metal oxide film is formed on a base material made of an insulating material, such as a glass base material, and is patterned using a known technique such as a photolithography technique. By doing so, a main electrode, an auxiliary electrode, and a counter electrode can be formed.
基材上への主電極、補助電極及び対向電極の成膜は、公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。成膜は、塗布により実施してもよい。スピンコートや各種の印刷方式も使用できる。 The main electrode, auxiliary electrode, and counter electrode can be formed on the substrate by a known method. For example, a microwave plasma CVD (Chemical vapor deposition) method, an ECRCVD (Electrical cyclotron resonance) method, an ICP (Inductive coupled plasma) method, a direct current sputtering method, an ICP (Inductive coupled plasma) method, a direct current sputtering method, an ECR method. Examples thereof include an arc type vapor deposition method, a laser vapor deposition method, an EB (Electron beam) vapor deposition method, and a resistance heating vapor deposition method. The film formation may be performed by coating. Spin coating and various printing methods can also be used.
主電極、補助電極及び対向電極の膜の厚さは、通常、単分子膜〜１００μｍ程度であり、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。 The film thicknesses of the main electrode, auxiliary electrode and counter electrode are usually about a monomolecular film to about 100 μm, preferably 2 nm to 1 μm, more preferably 5 nm to 500 nm.
上記のような主電極、補助電極及び対向電極のパターニングは、具体的には、成膜した金属膜または金属酸化物膜に、レジスト塗布、フォトマスクを介した露光、現像およびエッチングを行って実施することができる。 Specifically, the patterning of the main electrode, auxiliary electrode, and counter electrode as described above is performed by performing resist coating, exposure through a photomask, development, and etching on the formed metal film or metal oxide film. can do.
（細胞接着性領域及び細胞接着阻害性領域）
本発明において細胞接着性とは、細胞が接着すること、または細胞が接着しやすいことを意味する。細胞接着阻害性とは、細胞が接着しにくいこと、または細胞が接着しないことを意味する。従って、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化された細胞試験用基板上に細胞を播くと、細胞接着性領域には細胞が接着するが、細胞接着阻害性領域には細胞が接着しないため、基板表面には細胞がパターン状に配列されることになる。
(Cell adhesion region and cell adhesion inhibitory region)
In the present invention, cell adhesion means that cells adhere or cells adhere easily. The cell adhesion inhibitory means that cells are difficult to adhere or cells do not adhere. Therefore, when cells are seeded on a cell test substrate in which a cell adhesion region and a cell adhesion inhibition region are patterned, cells adhere to the cell adhesion region, but cells adhere to the cell adhesion inhibition region. Since it does not adhere, cells are arranged in a pattern on the substrate surface.
細胞接着性は、接着しようとする細胞によって異なる場合もあるため、細胞接着性とは、ある種の細胞に対して細胞接着性であることを意味する。従って、細胞試験用基板上には、複数種の細胞に対する複数の細胞接着性領域が存在する場合、すなわち細胞接着性が異なる細胞接着性領域が２水準以上存在する場合もある。 Since cell adhesion may vary depending on the cells to be adhered, cell adhesion means cell adhesion to certain types of cells. Therefore, there may be a case where a plurality of cell adhesion regions for a plurality of types of cells are present on the cell test substrate, that is, there are two or more cell adhesion regions having different cell adhesion properties.
本発明の細胞試験用基板における、細胞接着性領域および細胞接着阻害性領域の構造としては、例えば、以下の２つの形態が挙げられる。 Examples of the structure of the cell adhesion region and the cell adhesion inhibition region in the cell test substrate of the present invention include the following two forms.
第一の形態は、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした領域である形態である。この形態では、電極が形成された基材表面に炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成し、次いで、細胞の接着が望まれる領域に対して酸化処理および／または分解処理を施すことにより当該領域に細胞接着性を付与して細胞接着性領域に改変する。前記処理を施さない部分は細胞接着阻害性領域である。 The first form is a form in which the cell adhesion region is a cell adhesion region obtained by subjecting a cell adhesion-inhibiting hydrophilic membrane containing an organic compound having a carbon-oxygen bond to oxidation treatment and / or degradation treatment. is there. In this embodiment, a cell adhesion-inhibiting hydrophilic film containing an organic compound having a carbon-oxygen bond is formed on the surface of the substrate on which the electrode is formed, and then an oxidation treatment and / or a region where cell adhesion is desired. Alternatively, cell adhesion is imparted to the region by performing a decomposition treatment, and the cell adhesion region is modified. The part not subjected to the treatment is a cell adhesion-inhibiting region.
第二の形態は、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を低密度で含む親水性膜で形成されている形態である。この形態は、炭素酸素結合を有する有機化合物を高密度で含む親水性膜が細胞接着阻害性を有するのに対して、前記化合物を低密度で含む親水性膜は細胞接着性を有することを利用したものである。電極が形成された基材表面に前記化合物が結合しやすい第一領域と結合しにくい第二領域とを設け、該基材表面に前記化合物の膜を形成すると、第一領域は細胞接着阻害性領域となり、第二領域は細胞接着性領域となる。 In the second form, the cell adhesive region is formed of a hydrophilic film containing an organic compound having a carbon-oxygen bond at a low density. This form utilizes the fact that a hydrophilic film containing an organic compound having a carbon-oxygen bond at a high density has cell adhesion inhibitory properties, whereas a hydrophilic film containing the compound at a low density has a cell adhesion property. It is a thing. When the surface of the substrate on which the electrode is formed is provided with a first region where the compound is likely to bind and a second region where the compound is difficult to bind, and the film of the compound is formed on the surface of the substrate, the first region is cell adhesion inhibitory. The second region becomes a cell adhesion region.
さらに、本発明の細胞試験用基板においては、主電極上の細胞接着阻害性領域が、電極及び／又は補助電極への電圧印加、好ましくは正電圧の印加によって細胞接着性に改変可能である。電圧の印加によって細胞接着性に改変された領域は、上記のように炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して得られる細胞接着性領域とは、詳細な表面性状が異なる場合がある。 Furthermore, in the cell test substrate of the present invention, the cell adhesion-inhibiting region on the main electrode can be altered to cell adhesion by applying a voltage to the electrode and / or auxiliary electrode, preferably by applying a positive voltage. As described above, cell adhesion obtained by subjecting a cell adhesion-inhibiting hydrophilic membrane containing an organic compound having a carbon-oxygen bond to oxidation treatment and / or degradation treatment is applied to the region modified to cell adhesion by application of voltage. The surface area may be different from the property region.
細胞接着阻害性領域は、好ましくは、炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される親水性膜により形成される。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を有する有機化合物を主原料とする薄膜であり、酸化される前は細胞接着阻害性を有し、酸化および／または分解された後は細胞接着性を有しているものであれば特に限定されない。 The cell adhesion-inhibiting region is preferably formed by a hydrophilic film formed of an organic compound having a carbon-oxygen bond. The hydrophilic film is a thin film mainly composed of an organic compound having a carbon-oxygen bond, which has water solubility and water swellability, and has a cell adhesion inhibitory property before being oxidized and is oxidized and / or decomposed. There is no particular limitation as long as it has cell adhesion.
本発明において炭素酸素結合とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であってもよい。炭素酸素結合としてはＣ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合が挙げられる。 In the present invention, the carbon-oxygen bond means a bond formed between carbon and oxygen, and is not limited to a single bond but may be a double bond. Examples of the carbon-oxygen bond include a C—O bond, a C (═O) —O bond, and a C═O bond.
主原料としては、水溶性高分子、水溶性オリゴマー、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質などが挙げられ、これらが相互に物理的または化学的に架橋し、電極が形成された基材と物理的または化学的に結合することにより親水性薄膜となる。 Main raw materials include water-soluble polymers, water-soluble oligomers, water-soluble organic compounds, surfactants, amphiphiles, etc., and these were physically or chemically cross-linked to form an electrode. A hydrophilic thin film is obtained by physically or chemically bonding to the substrate.
具体的な水溶性高分子材料としては、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアクリル酸およびその誘導体、ポリメタクリル酸およびその誘導体、ポリアクリルアミドおよびその誘導体、ポリビニルアルコールおよびその誘導体、双性イオン型高分子、多糖類などを挙げることができる。分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマーなどを挙げることができる。より具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーの共重合体、デキストラン、およびヘパリンが挙げられるがこれらには限定されない。 Specific water-soluble polymer materials include polyalkylene glycol and derivatives thereof, polyacrylic acid and derivatives thereof, polymethacrylic acid and derivatives thereof, polyacrylamide and derivatives thereof, polyvinyl alcohol and derivatives thereof, and zwitterionic polymers. And polysaccharides. Examples of the molecular shape include a straight chain, a branched one, and a dendrimer. More specifically, polyethylene glycol, a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol, such as Pluronic F108, Pluronic F127, poly (N-isopropylacrylamide), poly (N-vinyl-2-pyrrolidone), poly (2- Hydroxyethyl methacrylate), poly (methacryloyloxyethylphosphorylcholine), copolymers of methacryloyloxyethylphosphorylcholine and acrylic monomers, dextran, and heparin, but are not limited thereto.
具体的な水溶性オリゴマー材料や水溶性低分子化合物としては、アルキレングリコールオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、メタクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、アクリルアミドオリゴマーおよびその誘導体、酢酸ビニルオリゴマーの鹸化物およびその誘導体、双性イオンモノマーからなるオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸およびその誘導体、メタクリル酸およびその誘導体、アクリルアミドおよびその誘導体、双性イオン化合物、水溶性シランカップリング剤、水溶性チオール化合物などを挙げることができる。より具体的には、エチレングリコールオリゴマー、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）オリゴマー、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンオリゴマー、低分子量デキストラン、低分子量ヘパリン、オリゴエチレングリコールチオール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、２−〔メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル〕トリメトキシシラン、およびトリエチレングリコール−ターミネーティッド−チオールが挙げられるがこれらには限定されない。 Specific water-soluble oligomer materials and water-soluble low molecular weight compounds include alkylene glycol oligomers and derivatives thereof, acrylic acid oligomers and derivatives thereof, methacrylic acid oligomers and derivatives thereof, acrylamide oligomers and derivatives thereof, saponified vinyl acetate oligomers and Derivatives thereof, oligomers composed of zwitterionic monomers and derivatives thereof, acrylic acid and derivatives thereof, methacrylic acid and derivatives thereof, acrylamide and derivatives thereof, zwitterionic compounds, water-soluble silane coupling agents, water-soluble thiol compounds, etc. be able to. More specifically, ethylene glycol oligomer, (N-isopropylacrylamide) oligomer, methacryloyloxyethylphosphorylcholine oligomer, low molecular weight dextran, low molecular weight heparin, oligoethylene glycol thiol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, tetraethylene Examples include, but are not limited to, glycol, 2- [methoxy (polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane, and triethylene glycol-terminated-thiol.
親水性膜は、処理前は高い細胞接着阻害性を有し、酸化処理および／または分解処理後は細胞接着性を示すものであることが望ましい。 It is desirable that the hydrophilic film has a high cell adhesion inhibitory property before treatment, and exhibits cell adhesion after oxidation treatment and / or degradation treatment.
親水性膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、基板表面の親水性薄膜で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。 The average thickness of the hydrophilic film is preferably 0.8 nm to 500 μm, more preferably 0.8 nm to 100 μm, more preferably 1 nm to 10 μm, and most preferably 1.5 nm to 1 μm. If the average thickness is 0.8 nm or more, it is preferable because protein adsorption and cell adhesion are not easily affected by the region not covered with the hydrophilic thin film on the substrate surface. Moreover, if the average thickness is 500 μm or less, coating is relatively easy.
電極が形成された基材表面への親水性膜の形成方法としては、基材へ親水性有機化合物を直接吸着させる方法、基材へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、基材へ親水性有機化合物をコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材への密着性を高めるために多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、基板表面に重合開始点を形成し、次いで親水性ポリマーブラシを重合する方法などを挙げることができる。 As a method for forming a hydrophilic film on the surface of a substrate on which an electrode is formed, a method of directly adsorbing a hydrophilic organic compound to a substrate, a method of directly coating a hydrophilic organic compound on a substrate, a hydrophilic property to a substrate A method of performing a crosslinking treatment after coating with an organic compound, a method of forming a hydrophilic thin film in a multistage manner in order to improve adhesion to the substrate, and an underlayer on the substrate to improve adhesion to the substrate And a method of coating a hydrophilic organic compound, a method of forming a polymerization initiation point on the substrate surface, and then polymerizing a hydrophilic polymer brush.
上記成膜方法のうち特に好ましい方法としては、多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、ならびに、電極が形成された基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法を挙げることができる。これらの方法を用いると、親水性有機化合物の基材への密着性を高めることが容易だからである。本明細書では「結合層」という用語を用いる。結合層とは、多段階式に親水性有機化合物の薄膜を形成する場合には最表面の親水性薄膜層と基材との間に存在する層を意味し、基材表面に下地層を設け当該下地層の上に親水性薄膜層を形成する場合には当該下地層を意味する。結合層は、結合部分（リンカー）を有する材料を含む層であることが好ましい。リンカーとリンカーに結合させる材料の末端の官能基の組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒドなどが挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれがリンカーであってもよい。これらの方法においては、親水性材料によるコーティングを行う前に、基材上にリンカーを有する材料により結合層を形成する。結合層における前記材料の密度は結合力を規定する重要な因子である。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。例えば、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）を例にとると、エポキシシランを付加した基材表面の水接触角が典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上であれば、次に酸触媒存在下エチレングリコール系材料等を付加することによって十分な細胞接着阻害性を有する基板を作ることができる。 Among the above film forming methods, particularly preferable methods include a method of forming a hydrophilic thin film in a multi-stage manner, and a base layer formed on the substrate in order to improve adhesion to the substrate on which the electrode is formed. Then, a method of coating a hydrophilic organic compound can be mentioned. This is because using these methods makes it easy to improve the adhesion of the hydrophilic organic compound to the substrate. In this specification, the term “bonding layer” is used. The bonding layer means a layer existing between the outermost hydrophilic thin film layer and the base material when a thin film of hydrophilic organic compound is formed in a multistage manner, and a base layer is provided on the surface of the base material. When forming a hydrophilic thin film layer on the said base layer, the said base layer is meant. The binding layer is preferably a layer containing a material having a binding portion (linker). Examples of the combination of the linker and the functional group at the end of the material to be bonded to the linker include epoxy group and hydroxyl group, phthalic anhydride and hydroxyl group, carboxyl group and N-hydroxysuccinimide, carboxyl group and carbodiimide, amino group and glutaraldehyde, etc. Is mentioned. In each combination, any may be a linker. In these methods, before coating with a hydrophilic material, a tie layer is formed from a material having a linker on a substrate. The density of the material in the bonding layer is an important factor that defines the bonding force. The density can be easily evaluated using the contact angle of water on the surface of the bonding layer as an index. For example, taking a silane coupling agent having an epoxy group at the end (epoxy silane) as an example, the water contact angle of the substrate surface to which epoxy silane has been added is typically 45 ° or more, preferably 47 ° or more. For example, a substrate having sufficient cell adhesion inhibitory property can be made by adding an ethylene glycol-based material or the like in the presence of an acid catalyst.
なお、本発明において水接触角とは、２３℃において測定される水接触角を指す。
細胞接着性領域は、例えば、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした領域により形成される。
In the present invention, the water contact angle refers to a water contact angle measured at 23 ° C.
The cell adhesion region is formed by, for example, a region that is made cell adhesive by subjecting a cell adhesion-inhibiting hydrophilic film containing an organic compound having a carbon-oxygen bond to oxidation treatment and / or degradation treatment.
本発明において「酸化」とは狭義の意味であり、有機化合物が酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を意味する。 In the present invention, “oxidation” has a narrow meaning, and means a reaction in which an organic compound reacts with oxygen and the content of oxygen is higher than before the reaction.
本発明において「分解」とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。「分解処理」としては典型的には、酸化処理による分解、紫外線照射による分解などが挙げられるがこれらには限定されない。「分解処理」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解処理」と「酸化処理」とは同一の処理を指す。 In the present invention, “decomposition” refers to a change in which a bond of an organic compound is broken to produce two or more organic compounds from one organic compound. “Decomposition treatment” typically includes, but is not limited to, decomposition by oxidation treatment and decomposition by ultraviolet irradiation. When the “decomposition process” is a decomposition accompanied by oxidation (that is, oxidative decomposition), the “decomposition process” and the “oxidation process” indicate the same process.
紫外線照射による分解とは、有機化合物が紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、有機化合物が、酸素を含む分子種（酸素、水など）とともに存在している系中に紫外線を照射すると、紫外線が化合物に吸収されて分解が起こる以外に、該分子種が活性化して有機化合物と反応する場合がある。後者の反応は「酸化」に分類できる。そして活性化された分子種による酸化により有機化合物が分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類できる。 Decomposition by ultraviolet irradiation means that an organic compound absorbs ultraviolet rays and decomposes through an excited state. In addition, when an organic compound is irradiated with ultraviolet rays in a system that contains molecular species containing oxygen (oxygen, water, etc.), the molecular species are activated in addition to being absorbed by the compound and causing decomposition. May react with organic compounds. The latter reaction can be classified as “oxidation”. A reaction in which an organic compound is decomposed by oxidation by an activated molecular species can be classified as “decomposition by oxidation” rather than “decomposition by ultraviolet irradiation”.
以上のように「酸化処理」と「分解処理」は操作としては重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない。そこで本明細書では「酸化処理および／または分解処理」という用語を使用する。 As described above, “oxidation treatment” and “decomposition treatment” may overlap as operations, and the two cannot be clearly distinguished. Therefore, in this specification, the term “oxidation treatment and / or decomposition treatment” is used.
酸化処理および／または分解処理の方法としては、親水性膜を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。本発明では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とをそれぞれ形成することから、親水性膜をパターン状に部分的に酸化処理および／または分解処理する。部分的に酸化処理および／または分解処理する場合は、フォトマスクやステンシルマスクなどのマスクを用いたり、スタンプを用いたりするとよい。また、紫外線レーザなどのレーザを用いた方式などの直描方式で酸化処理および／または分解処理を施してもよい。 Examples of the oxidation treatment and / or decomposition treatment include a method of subjecting the hydrophilic film to ultraviolet irradiation treatment, a method of photocatalytic treatment, and a method of treatment with an oxidizing agent. In the present invention, since the cell adhesion region and the cell adhesion inhibition region are respectively formed, the hydrophilic film is partially oxidized and / or decomposed in a pattern. In the case of partial oxidation treatment and / or decomposition treatment, a mask such as a photomask or a stencil mask or a stamp may be used. Further, the oxidation treatment and / or the decomposition treatment may be performed by a direct drawing method such as a method using a laser such as an ultraviolet laser.
紫外線照射処理の場合は、波長１８５ｎｍや２５４ｎｍの紫外線を出す水銀ランプや波長１７２ｎｍの紫外線を出すエキシマランプなどのＶＵＶ領域からＵＶ−Ｃ領域の紫外線を出すランプを光源として用いることが好ましい。光触媒処理する場合は、波長３６５ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることが好ましく、波長２５４ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることがより好ましい。光触媒としては、酸化チタン光触媒、金属イオンや金属コロイドで活性化された酸化チタン光触媒を用いるのが好ましい。酸化剤としては、有機酸や無機酸を特に制限なく用いることができるが、高濃度の酸は取り扱いが難しいので、１０％以下の濃度に希釈して用いるとよい。最適な紫外線処理時間、光触媒処理時間、酸化剤処理時間は、用いる光源の紫外線強度、光触媒の活性、酸化剤の酸化力や濃度などの諸条件に応じて適宜決定することができる。 In the case of the ultraviolet irradiation treatment, it is preferable to use a lamp that emits ultraviolet rays in the UV-C region from the VUV region, such as a mercury lamp that emits ultraviolet rays having a wavelength of 185 nm or 254 nm or an excimer lamp that emits ultraviolet rays having a wavelength of 172 nm. When the photocatalytic treatment is performed, it is preferable to use a light source that emits ultraviolet light having a wavelength of 365 nm or less, and it is more preferable to use a light source that emits ultraviolet light having a wavelength of 254 nm or less. As the photocatalyst, it is preferable to use a titanium oxide photocatalyst, a titanium oxide photocatalyst activated with a metal ion or a metal colloid. As the oxidizing agent, an organic acid or an inorganic acid can be used without any particular limitation. However, since a high-concentration acid is difficult to handle, it is preferable to dilute it to a concentration of 10% or less. The optimum ultraviolet treatment time, photocatalyst treatment time, and oxidant treatment time can be appropriately determined according to various conditions such as the ultraviolet light intensity of the light source used, the activity of the photocatalyst, the oxidizing power and concentration of the oxidant.
細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を低密度で含む親水性膜により形成されていてもよい。この態様では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とは、ともに炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されている。２つの領域は前記有機化合物の密度が相違する。同密度が高いほど細胞は接着しにくくなる傾向がある。細胞接着性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低い。一方、細胞接着阻害性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できない程度に高い。 The cell adhesion region may be formed by a hydrophilic film containing an organic compound having a carbon-oxygen bond at a low density. In this embodiment, both the cell adhesive region and the cell adhesion inhibitory region are formed of a hydrophilic film containing an organic compound having a carbon-oxygen bond. The two regions differ in the density of the organic compound. The higher the density, the more difficult the cells adhere. In the cell adhesion region, the density of the organic compound is low enough to allow cells to adhere. On the other hand, in the cell adhesion-inhibiting region, the density of the organic compound is so high that cells cannot adhere.
親水性有機化合物の密度を制御する方法としては、親水性有機化合物の薄膜と電極が形成された基材表面との間に結合層を設け、当該結合層の親水性有機化合物との結合力を調整する方法が挙げられる。ここで「結合層」とは上記で定義した通りであり、上記で説明した好ましい材料から構成され得る。結合層の結合力は、結合層におけるリンカーを有する材料の密度が高いほど強くなり、同密度が低いほど弱くなる。結合層におけるリンカーを有する材料の密度は、上述の通り、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。 As a method of controlling the density of the hydrophilic organic compound, a bonding layer is provided between the hydrophilic organic compound thin film and the substrate surface on which the electrode is formed, and the bonding strength of the bonding layer with the hydrophilic organic compound is increased. The method of adjusting is mentioned. Here, the “binding layer” is as defined above, and may be composed of the preferred materials described above. The bonding force of the bonding layer increases as the density of the material having the linker in the bonding layer increases, and decreases as the density decreases. As described above, the density of the material having a linker in the bonding layer can be easily evaluated using the water contact angle on the surface of the bonding layer as an index.
本発明のこの実施形態では、細胞接着性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は低い。細胞接着性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には、１０°〜４３°、望ましくは１５°〜４０°である。このような結合層を形成する方法としては、リンカーを有する材料の被膜（結合層）を電極が形成された基材表面に形成した後、当該結合層の表面を酸化処理および／または分解処理する方法が挙げられる。結合層表面を酸化処理および／または分解処理する方法としては、結合層表面を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。結合層表面の全面を酸化処理および／または分解処理してもよいし、部分的に処理してもよい。部分的な処理は、フォトマスクやステンシルマスクなどのマスクを用いたり、スタンプを用いることにより行うことができる。また、紫外線レーザなどのレーザを用いた方式などの直描方式で酸化処理および／または分解処理を施してもよい。諸条件などについても、親水性膜の酸化処理および／または分解処理により細胞接着性領域を形成する方法の場合と同様の条件を適用できる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着性領域が形成できる。 In this embodiment of the invention, the density of the material with the linker in the tie layer of the cell adhesion region is low. In the cell adhesion region, the water contact angle of the surface of the bonding layer before forming the hydrophilic organic compound thin film is taken as an example in the case of using a silane coupling agent having an epoxy group as a terminal as a material having a linker. And typically 10 ° to 43 °, desirably 15 ° to 40 °. As a method of forming such a bonding layer, after forming a coating (bonding layer) of a material having a linker on the surface of the substrate on which the electrode is formed, the surface of the bonding layer is oxidized and / or decomposed. A method is mentioned. Examples of the method for oxidizing and / or decomposing the bonding layer surface include a method of treating the bonding layer surface with ultraviolet irradiation, a method of treating with a photocatalyst, and a method of treating with an oxidizing agent. The entire surface of the bonding layer surface may be oxidized and / or decomposed or partially processed. The partial processing can be performed by using a mask such as a photomask or a stencil mask, or by using a stamp. Further, the oxidation treatment and / or the decomposition treatment may be performed by a direct drawing method such as a method using a laser such as an ultraviolet laser. As for various conditions, the same conditions as in the method of forming a cell adhesive region by oxidizing and / or decomposing a hydrophilic membrane can be applied. A cell adhesion region can be formed by forming a thin film of a hydrophilic organic compound on the binding layer thus formed.
本発明のこの実施形態では、細胞接着阻害性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は高い。細胞接着阻害性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、リンカーを有する材料の被膜を電極が形成された基材表面に形成することにより得られる。結合層表面を部分的に酸化処理および／または分解処理した場合には、処理を受けない残余の部分が前記水接触角を有する結合層となる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着阻害性領域が形成できる。 In this embodiment of the present invention, the density of the material having a linker in the binding layer of the cell adhesion-inhibiting region is high. The water contact angle on the surface of the bonding layer before forming a thin film of hydrophilic organic compound in the cell adhesion inhibitory region is an example of using a silane coupling agent having an epoxy group at the end as a material having a linker. When it is taken, it is typically 45 ° or more, desirably 47 ° or more. Such a bonding layer can be obtained by forming a coating of a material having a linker on the surface of the substrate on which the electrode is formed. When the bonding layer surface is partially oxidized and / or decomposed, the remaining portion not subjected to the treatment becomes the bonding layer having the water contact angle. A cell adhesion-inhibiting region can be formed by forming a hydrophilic organic compound thin film on the binding layer thus formed.
（細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域との比較）
細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して２０〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「炭素量（ａｔｏｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。
(Comparison between cell adhesion region and cell adhesion inhibitory region)
The amount of carbon in the cell adhesion region (including the bonding layer when a bonding layer is present) is lower than the amount of carbon in the cell adhesion inhibiting region (including the bonding layer when the bonding layer is present). It is preferable. Specifically, the amount of carbon in the cell adhesion region is preferably 20 to 99% with respect to the amount of carbon in the cell adhesion inhibition region. Corresponding to this range is particularly suitable when the thickness of the hydrophilic film (the total of the thickness of the bonding layer and the hydrophilic film when a bonding layer is present) is 10 μm or less. “Carbon content (atomic concentration,%)” is as defined below.
また、細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞接着阻害性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「酸素と結合している炭素の割合（ａｔｏｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。 In addition, the value of the ratio (%) of the carbon bonded to oxygen in the cell adhesive region (including the bonded layer when the bonded layer is present) is the cell adhesion inhibitory region (the bonded layer is It is preferable that the value be smaller than the value of the ratio (%) of carbon bonded to oxygen among the carbon in the carbon (including the bonded layer if present). Specifically, the value of the ratio (%) of carbon bonded to oxygen in the cell adhesion region is equal to the ratio of carbon bonded to oxygen among the carbon in the cell adhesion inhibitory region ( %) Is preferably 35 to 99%. Corresponding to this range is particularly suitable when the thickness of the hydrophilic film (the total of the thickness of the bonding layer and the hydrophilic film when a bonding layer is present) is 10 μm or less. “The proportion of carbon bonded to oxygen (atomic concentration,%)” is as defined below.
（親水性薄膜の評価方法）
本発明の親水性薄膜（結合層が存在する場合には結合層も含む）の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、Ｘ線光電子分光測定、各種質量分析法などを用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度（ａｔｏｍｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）で算出される。以下、本発明におけるＸ線光電子分光分析方法を詳細に説明する。
(Evaluation method of hydrophilic thin film)
Evaluation methods for the hydrophilic thin film of the present invention (including a bonding layer when a bonding layer is present) include contact angle measurement, ellipsometry, atomic force microscope observation, electron microscope observation, Auger electron spectroscopy measurement, X-ray measurement Photoelectron spectroscopy, various mass spectrometry, etc. can be used. Among these methods, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS / ESCA) is most excellent in quantification. What is obtained by this measurement method is a relative quantitative value, and is generally calculated by an elemental concentration (atomic concentration,%). Hereinafter, the X-ray photoelectron spectroscopic analysis method in the present invention will be described in detail.
本発明において親水性薄膜の「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義される。また、本発明において親水性薄膜の「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。具体的な測定は、特開２００７−３１２７３６に記載されるとおりに実施できる。 In the present invention, the “carbon amount” of the hydrophilic thin film is defined as “the carbon amount obtained from the analytical value of the C1s peak obtained using an X-ray photoelectron spectrometer”. In the present invention, the “ratio of carbon bonded to oxygen” of the hydrophilic thin film is “the ratio of carbon bonded to oxygen determined from the analytical value of the C1s peak obtained using an X-ray photoelectron spectrometer. Is defined. Specific measurement can be performed as described in JP-A-2007-312736.
（パターンの形状）
本発明の細胞試験用基板では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化されて配置されていることが好ましい。パターンの形状は、二次元のパターンであれば特に制限されず、細胞の種類、形成させる組織などによって選択することができる。例えば、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形および四角形などの図形の内部がすべて細胞接着性領域または細胞接着阻害性領域となっているパターンなどを形成することができる。
(Pattern shape)
In the cell test substrate of the present invention, it is preferable that the cell adhesion region and the cell adhesion inhibition region are arranged in a pattern. The shape of the pattern is not particularly limited as long as it is a two-dimensional pattern, and can be selected according to the type of cell, tissue to be formed, and the like. For example, a line shape, a tree shape (dendritic shape), a mesh shape, a lattice shape, a circular shape, a quadrangular pattern, a pattern in which the inside of a figure such as a circular shape and a quadrangular shape is a cell adhesion region or a cell adhesion inhibition region Can be formed.
細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域のパターンは、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣接しているように形成される。細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣接していることにより、まず細胞接着性領域に細胞を接着させて培養した後、電極への電圧の印加により細胞接着阻害性領域が細胞接着性領域に改変すると、改変された領域に細胞が遊走できるようになる。したがって、細胞接着性領域に改変される領域をパターンニングにより予め決定して、細胞遊走試験において細胞を遊走させる領域および方向を制御することができる。 The pattern of the cell adhesion region and the cell adhesion inhibition region is formed so that the cell adhesion region and the cell adhesion inhibition region are adjacent to each other. Since the cell adhesion region and the cell adhesion inhibitory region are adjacent to each other, cells are first adhered to the cell adhesion region and cultured, and then the cell adhesion inhibitory region becomes cell adhesive by applying voltage to the electrode. When modified to a region, cells can migrate to the modified region. Therefore, the region to be altered to the cell adhesion region can be determined in advance by patterning, and the region and direction in which the cells migrate in the cell migration test can be controlled.
本発明の細胞試験用基板は、上記のように製造することができ、一実施形態においては、電極が形成された基材の全面に、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成する工程、および該基材上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣接するように、親水膜をパターン状に酸化処理および／または分解処理して細胞接着性に改変させる工程を含む方法により製造できる。 The cell test substrate of the present invention can be produced as described above, and in one embodiment, the cell adhesion-inhibiting agent contains an organic compound having a carbon-oxygen bond on the entire surface of the substrate on which the electrode is formed. The hydrophilic film is oxidized and / or decomposed in a pattern to form cell adhesion so that the cell adhesion region and the cell adhesion inhibitory region are adjacent to each other on the substrate. It can be produced by a method including a step of modifying.
（細胞）
細胞試験用基板に播種する細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよいし接着性細胞でもよいが、本発明は、接着性を有する細胞に対して好適に使用される。また遊走する性質を有する細胞に対して好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝がん細胞、グリオーマ細胞、結腸癌細胞、腎がん細胞、膵がん細胞、前立腺がん細胞、大腸がん細胞、乳癌細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞などのがん細胞、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。
(cell)
The cells to be seeded on the cell test substrate may be floating cells such as blood cells and lymphoid cells, and may be adhesive cells, but the present invention is preferably used for cells having adhesiveness. It is also preferably used for cells having the property of migrating. Examples of such cells include liver cancer cells, glioma cells, colon cancer cells, kidney cancer cells, pancreatic cancer cells, prostate cancer cells, colon cancer cells, breast cancer cells, lung cancer cells, and ovarian cancer. Cancer cells such as cells, liver cells that are liver parenchymal cells, Kupffer cells, endothelial cells such as vascular endothelial cells and corneal endothelial cells, fibroblasts, osteoblasts, osteoclasts, periodontal ligament-derived cells, epidermis angle Epidermal cells such as keratinocytes, tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, epithelial cells such as corneal epithelial cells, mammary cells, pericytes, muscle cells such as smooth muscle cells and cardiomyocytes, kidney cells, Examples include pancreatic islets of Langerhans, nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells, chondrocytes, and bone cells. These cells may be primary cells collected directly from tissues or organs, or may be passaged from one generation to another. Furthermore, these cells are undifferentiated embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as pluripotent mesenchymal stem cells, unipotent stem cells such as vascular endothelial progenitor cells that have unipotency, and differentiation has ended. Any of cells may be sufficient. In addition, the cells may be cultivated as a single species, or two or more types of cells may be co-cultured.
目的の細胞を含む培養試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理などを行っておくことが好ましい。 The culture sample containing the target cells is preliminarily subjected to a dispersion process in which the biological tissue is finely dispersed in a liquid, a separation process in which impurities other than the target cells in the biological tissue and other cell debris are removed. It is preferable to go.
細胞試験用基板への細胞の播種に先だって、目的とする細胞を含む培養試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養などの通常の培養方法が採用できる。予備培養において、細胞を支持体表面に接着させて培養する方法の一つに、いわゆる単層培養法として既に知られている手段がある。具体的には、例えば、培養容器に培養試料と培養液を収容して一定の環境条件に維持しておくことにより、特定の生細胞のみが、培養容器などの支持体表面に接着した状態で増殖する。使用する装置や処理条件などは、通常の単層培養法などに準じて行う。細胞が接着して増殖する支持体表面の材料として、ポリリシン、ポリエチレンイミン、コラーゲンおよびゼラチンなどの細胞の接着や増殖が良好に行われる材料を選択したり、ガラスシャーレ、プラスチックシャーレ、スライドガラス、カバーガラス、プラスチックシートおよびプラスチックフィルムなどの支持体表面に、細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質、いわゆる細胞接着因子を塗布しておくことも行われる。 Prior to seeding of the cells on the cell test substrate, it is preferable to preliminarily culture a culture sample containing the target cells by various culture methods to increase the target cells. For the preliminary culture, a normal culture method such as monolayer culture, coat dish culture, or on-gel culture can be employed. In the preculture, one of the methods of culturing with cells attached to the surface of the support is already known as a so-called monolayer culture method. Specifically, for example, by storing a culture sample and a culture solution in a culture container and maintaining the environment at a certain level, only specific living cells are adhered to the surface of a support such as a culture container. Multiply. The apparatus to be used, the treatment conditions, etc. are performed according to the usual monolayer culture method. As materials for the surface of the support on which cells adhere and grow, materials such as polylysine, polyethyleneimine, collagen, and gelatin that can adhere and proliferate well can be selected, glass petri dishes, plastic petri dishes, glass slides, covers A so-called cell adhesion factor, which is a chemical substance that favors cell adhesion and proliferation, is also applied to the surface of a support such as glass, plastic sheet, and plastic film.
予備培養後に、培養容器中の培養液を除去することで、培養試料中の支持体表面に接着しない塊状や線維状の不純物等の不要成分が除去され、支持体表面に接着した生細胞のみを回収できる。支持体表面に接着した生細胞の回収には、ＥＤＴＡ−トリプシン処理などの手段が適用できる。 After preliminary culture, the culture solution in the culture vessel is removed, so that unnecessary components such as clumps and fibrous impurities that do not adhere to the support surface in the culture sample are removed, and only living cells that adhere to the support surface are removed. Can be recovered. Means such as EDTA-trypsin treatment can be applied to recovering living cells adhered to the support surface.
上記のように予備培養した細胞を、培養液中の細胞試験用基板上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。細胞を細胞試験用基板上で増殖させる必要がない程度に十分な量で、細胞が単層で接着するように播種することが好ましい。通常、培養液１ｍｌ当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましく、また、基板１ｃｍ２当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましい。具体的には、４００ｍｍ２あたり２×１０５個程度で播種する。 Cells pre-cultured as described above are seeded on a cell test substrate in a culture solution. The seeding method and the seeding amount of the cell are not particularly limited, and for example, the method described in “A tissue culture technique (1999)” published by Asakura Shoten, pages 266 to 270 can be used. It is preferable to seed the cells in a sufficient amount so that the cells do not need to be grown on the cell test substrate so that the cells adhere in a single layer. Usually, it is preferable to seed so that cells are contained in an order of 10 4 to 10 6 per ml of culture medium, and seeding so that cells are contained in an order of 10 4 to 10 6 per 1 cm 2 of the substrate. Is preferred. Specifically, seeding is performed at about 2 × 10 5 per 400 mm 2 .
細胞を播種した細胞試験用基板を培養液中で培養することにより、細胞を細胞接着性領域に接着させることが好ましい。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞試験用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地など、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）などの市販の無血清培地などを用いることができる。 It is preferable to adhere the cells to the cell adhesive region by culturing the cell test substrate seeded with the cells in a culture solution. Any culture medium can be used without particular limitation as long as it is a cell test medium usually used in the art. For example, depending on the type of cells used, MEM medium, BME medium, DME medium, αMEM medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI1640 medium, etc. A basal medium as described in "Tissue culture technology third edition" edited by the Japanese Society for Tissue Culture, page 581 can be used. Furthermore, serum (such as fetal bovine serum), various growth factors, antibiotics, amino acids and the like may be added to the basal medium. A commercially available serum-free medium such as Gibco serum-free medium (Invitrogen) can also be used.
細胞を培養する時間は、培養時の細胞操作の有無などに左右されるが、通常６〜９６時間、好ましくは１２〜７２時間である。培養する温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。培養した後、細胞試験用基板を洗浄することにより、接着していない細胞が洗い流され、細胞接着性領域にのみ細胞を接着させることができる。 Although the time which culture | cultivates a cell is influenced by the presence or absence of the cell operation at the time of culture | cultivation, it is 6 to 96 hours normally, Preferably it is 12 to 72 hours. The temperature for culturing is usually 37 ° C. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 5% using a CO 2 cell culture device or the like. After culturing, the cell test substrate is washed to wash away non-adherent cells and allow cells to adhere only to the cell adhesion region.
（細胞遊走試験）
上記のように、本発明の細胞試験用基板上に細胞を播種して培養し、細胞接着性領域に細胞を接着させた後、電極に電圧を印加して、主電極上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させ、その後の細胞の移動を観察することにより、細胞遊走を試験することができる。
(Cell migration test)
As described above, the cells are seeded and cultured on the cell test substrate of the present invention, and after the cells are adhered to the cell adhesion region, a voltage is applied to the electrode to inhibit cell adhesion on the main electrode. Cell migration can be tested by modifying the region to a cell adhesion region and observing subsequent cell migration.
図９は細胞試験用容器９０への電圧の印加と、その後の細胞の遊走を示している。図９ａは対向電極９３を用いて電圧を印加する前の状態を示す。図９ｂでは、電圧が印加されて細胞接着阻害性領域９７が細胞接着性領域９６に改変する。図９ｃでは細胞接着性領域９６に改変された領域へ細胞が遊走する。なお、図９ｂでは電圧を印加したことによる変化を明確に表現するために細胞接着阻害性領域９７（例えば、親水性膜）が消失したように表現してあるが、実際には親水性膜の分解物などが残存していると推定される。また、図９ａにおける接着性領域９５においても、親水性膜の酸化処理および／または分解処理などにより生じる分解物などが残存していると推定される。
FIG. 9 shows voltage application to the
換言すれば、細胞遊走試験法は、
（ｉ）本発明の細胞試験用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
（ｉｉ）電極に電圧を印加することによって主電極上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させる工程、
（ｉｉｉ）細胞接着性領域に接着していた細胞の、工程（ｉｉ）で細胞接着性領域に改変した領域への移動を観察する工程
を含む。
In other words, the cell migration test method is
(I) seeding the cells on the cell test substrate of the present invention, and attaching the cells to the cell adhesion region;
(Ii) changing the cell adhesion-inhibiting region on the main electrode to a cell-adhesive region by applying a voltage to the electrode;
(Iii) a step of observing the movement of the cells adhered to the cell adhesive region to the region modified to the cell adhesive region in step (ii).
（ｉ）の工程においては、細胞を播種した後、細胞培養を行い、細胞接着性領域に細胞を接着させることが好ましく、さらに細胞試験用基板を洗浄することにより、接着していない細胞を洗い流し、細胞接着性領域にのみ細胞を接着させることが好ましい。 In the step (i), it is preferable to perform cell culture after seeding the cells and adhere the cells to the cell adhesion region, and further wash away the cells that have not adhered by washing the cell test substrate. It is preferable to attach the cells only to the cell adhesive region.
（ｉｉ）の工程において、電極に印加する電圧は、正電圧であることが好ましい。正電圧を印加することにより、細胞接着阻害性領域を効果的に細胞接着性領域に改変できるとともに、特に透明電極（ＩＴＯ膜など）からなる主電極が黒変するのを防止でき、細胞遊走の観察を良好に実施できる。 In the step (ii), the voltage applied to the electrode is preferably a positive voltage. By applying a positive voltage, the cell adhesion-inhibiting region can be effectively changed to the cell adhesion region, and in particular, the main electrode made of a transparent electrode (ITO film, etc.) can be prevented from turning black, and cell migration can be prevented. Observation can be carried out satisfactorily.
印加する電圧は、当業者であれば適宜決定することができるが、通常１〜１０Ｖ、好ましくは１．５〜５Ｖであり、より好ましくは２〜２．３Ｖであり、印加する時間は、通常０．５〜６０分間、好ましくは１〜１０分間、より好ましくは１．５〜３分間である。 The voltage to be applied can be appropriately determined by those skilled in the art, but is usually 1 to 10 V, preferably 1.5 to 5 V, more preferably 2 to 2.3 V, and the application time is usually 0.5 to 60 minutes, preferably 1 to 10 minutes, more preferably 1.5 to 3 minutes.
印加する電圧は、電極が接している溶媒の種類や、電極の材質、電極の形状によって、適切な値が変わるが、通常、細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変可能な電圧以上で、細胞に悪影響を与えない程度に低い電圧を加えるのがよい。 The voltage to be applied varies depending on the type of solvent in contact with the electrode, the electrode material, and the electrode shape, but it is usually higher than the voltage at which the cell adhesion-inhibiting region can be changed to the cell adhesive region. It is better to apply a voltage that is low enough not to adversely affect the cells.
本発明の細胞試験用基板及び細胞試験用容器は細胞遊走試験以外にも、細胞の培養、異なる細胞の共培養、細胞間の相互作用の評価などの細胞を使用した様々な試験に利用することができる。 In addition to the cell migration test, the cell test substrate and cell test container of the present invention should be used for various tests using cells such as cell culture, co-culture of different cells, and evaluation of interaction between cells. Can do.
実施例
１．細胞試験用容器の作製
長さ×幅が１２５ｍｍ×８５ｍｍの無アルカリガラス基材上に補助電極（Ａｇ）を膜厚１００ｎｍでスパッタ成膜し、ウェル部を避けるようにグリッド状にフォトリソグラフィーによってパターニングした。次いで、透明電極（ＩＴＯ）を膜厚１５０ｎｍで全面にスパッタ成膜した。
Example
1. Preparation of cell test container A sputter film of an auxiliary electrode (Ag) with a film thickness of 100 nm on an alkali-free glass substrate with a length x width of 125 mm x 85 mm, and patterning by photolithography in a grid shape so as to avoid the well portion did. Next, a transparent electrode (ITO) was formed by sputtering on the entire surface with a film thickness of 150 nm.
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ及びエポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）７５０μｌの混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。ＵＶ洗浄したＩＴＯ基材を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、１９時間室温で振盪した。その後、下地処理された基材をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。
(First stage reaction)
While stirring a mixed solution of 39.0 g of toluene and 750 μl of epoxysilane TSL8350 (manufactured by GE Toshiba Silicone), a catalytic amount of triethylamine was added and further stirred at room temperature for several minutes. The UV-cleaned ITO substrate was immersed in the above epoxysilane solution and shaken at room temperature for 19 hours. Thereafter, the base material subjected to the ground treatment was washed with ethanol, then washed with water and dried.
（二段階目の反応）
ポリエチレングリコール１５ｇを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシシラン処理された基材を上記のポリエチレングリコールに浸漬し、８０℃で６０分間反応させた。反応後、基材をよく水洗いし、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成された基板が得られた。
(Second stage reaction)
While stirring 15 g of polyethylene glycol, a catalytic amount of concentrated sulfuric acid was slowly added and further stirred at room temperature for several minutes. The epoxysilane-treated substrate was immersed in the polyethylene glycol and reacted at 80 ° C. for 60 minutes. After the reaction, the substrate was washed thoroughly with water and then dried. As a result, a substrate on which a hydrophilic thin film was formed was obtained.
（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２５ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたＩＴＯ基板と上記触媒付き石英板を、親水性薄膜とフォトマスクの光触媒層が対向するように設置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。１２０秒間露光し、酸化処理を行った。
(Oxidation treatment)
A photomask having a titanium oxide photocatalyst applied to the entire surface was prepared. The illuminance of the exposure machine was measured in advance at a wavelength of 350 nm and used as a guide for setting the exposure time. The illuminance was 25 mW / cm 2 . Place the ITO substrate on which the hydrophilic thin film is formed and the above-mentioned quartz plate with a catalyst so that the hydrophilic thin film and the photocatalyst layer of the photomask face each other, and install in the exposure machine so that light is irradiated from the back side of the photomask. did. The film was exposed for 120 seconds to be oxidized.
得られた細胞試験用基板に９６ウェルプレート（縦８×横１２ウェル）の枠を接着剤で接合することにより細胞試験用容器を作成した。 A cell test container was prepared by joining a frame of a 96-well plate (vertical 8 × horizontal 12-well) to the obtained cell test substrate with an adhesive.
２．細胞培養
細胞試験用容器をエチレンオキサイドガスで滅菌した。各ウェルの中に５ｘ１０４個のウシ血管内皮細胞を播種した。１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で２４時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、細胞は酸化処理された部分にのみコンフルエントの状態で接着していた。
2. The cell culture cell test container was sterilized with ethylene oxide gas. 5 × 10 4 bovine vascular endothelial cells were seeded in each well. Using DMEM medium containing 10% serum, the cells were cultured for 24 hours in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration. When observed with a phase-contrast microscope, the cells adhered in a confluent state only to the oxidized part.
３．電圧印加
以下、９６ウェルプレート（縦８×横１２ウェル）の各ウェルの位置を（縦の位置，横の位置）で示す。縦方向には、上からＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈと文字で表し、横方向には、左から順番に１から１２番まで番号をつけて表す。例えば、縦方向の上から２番目で横方向の左から１１番目のウェルの位置を（Ｂ，１１）と表す。
3. Below voltage application , the position of each well of the 96-well plate (8 vertical × 12 horizontal) is indicated by (vertical position, horizontal position). In the vertical direction, the letters A, B, C, D, E, F, G, and H are shown from the top, and in the horizontal direction, numbers 1 to 12 are assigned in order from the left. For example, the position of the second well from the top in the vertical direction and the eleventh well from the left in the horizontal direction is represented as (B, 11).
電圧印加端子をウェル（Ａ，１２）の近傍に接続し、対向電極をウェルＡ（Ｅ，２）及びウェルＢ（Ｄ，１１）に差し入れた状態で２Ｖを２分間かけた。ウェルＡ及びウェルＢの両方において細胞遊走が観測された。これは、ウェルＡ及びウェルＢで均一に電圧がかかったため、細胞にダメージに与えるような高い電圧を加えることなく、均一にＰＥＧを脱離できたためと考えられる。 The voltage application terminal was connected in the vicinity of the well (A, 12), and 2 V was applied for 2 minutes with the counter electrode inserted into the well A (E, 2) and the well B (D, 11). Cell migration was observed in both well A and well B. This is presumably because the voltage was applied uniformly in well A and well B, so that PEG could be removed uniformly without applying a high voltage that would damage cells.
比較例
補助電極は設けずに、実施例と同様に細胞培養用容器を作製した。ウェルＡ及びウェルＢに対向電極を差し入れた状態で２．４Ｖを２分間かけた。ウェルＡでは細胞遊走が観測されたが、ウェルＢでは細胞遊走が観測されなかった。これは、ウェルＡ及びウェルＢで電圧のかかり方が不均一であったため、より電圧が高いウェルＢ内で細胞にダメージを与えてしまい、細胞が遊走しなかったと考えられる。
Comparative Example An auxiliary electrode was not provided, and a cell culture vessel was prepared in the same manner as in the example. 2.4 V was applied for 2 minutes with the counter electrode inserted in well A and well B. Cell migration was observed in well A, but no cell migration was observed in well B. This is probably because the voltage applied to the well A and the well B was not uniform, so that the cells were damaged in the well B having a higher voltage, and the cells did not migrate.
１０，２０，４０，５０，７０，８０，９０ 細胞試験用容器
３０，６０ 細胞試験用基板
１１，２１，３１，４１，５１，６１，７１，８１ 主電極（ＩＴＯ電極）
２２，３２，４２，５２，６２，７２，８２ 補助電極
１３，４３，７３，８３，９３ 対向電極
１４，２４，３４，４４，５４，７４ 側壁部材
１５，２５，４５，８５ 凹部
１６，２６，４６，７６，９５，９６ 細胞接着性領域
１７，２７，４７，７７，９７ 細胞接着阻害性領域（親水性膜）
３８，４８，５８，７８，８８ 基材（ガラス板）
３９ 電圧印加端子
４９，９９ 細胞
２９，５９ 細胞試験用基板
10, 20, 40, 50, 70, 80, 90
22, 32, 42, 52, 62, 72, 82
38, 48, 58, 78, 88 Base material (glass plate)
39
Claims (10)
前記基材上に配置された電極と
を備える細胞試験用基板であって、
前記電極は、主電極と、前記主電極に導電可能に接続された補助電極とを含み、
前記主電極上には、細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域とが配置されている
ことを特徴とする前記細胞試験用基板。 A substrate;
A substrate for cell testing comprising an electrode disposed on the substrate,
The electrode includes a main electrode and an auxiliary electrode conductively connected to the main electrode,
The cell test substrate, wherein a cell adhesive region and a cell adhesion inhibitory region adjacent to the cell adhesive region are disposed on the main electrode.
前記細胞試験用基板上の１又は複数の部分領域を底面とし上方に開放された１又は複数の凹部の側壁を形成する側壁部材と
を備える細胞試験用容器であって、
前記凹部の底面を構成する部分領域は、主電極上に配置された細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域とを含む前記細胞試験用容器。 The cell test substrate according to any one of claims 1 to 3,
A cell test container comprising a side wall member forming one or a plurality of recesses opened upward with the one or more partial regions on the cell test substrate as a bottom surface,
The partial area which comprises the bottom face of the said recessed part is the said cell test container containing the cell-adhesive area | region arrange | positioned on a main electrode, and the cell-adhesion inhibitory area adjacent to the said cell-adhesive area | region.
前記細胞試験用基板上の１又は複数の部分領域を底面とし上方に開放された１又は複数の凹部の側壁を形成する側壁部材と
を備える細胞試験用容器であって、
前記凹部の底面を構成する部分領域は、主電極上に配置された細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域と、対向電極と含む前記細胞試験用容器。 The cell test substrate according to claim 4 or 5,
A cell test container comprising a side wall member forming one or a plurality of recesses opened upward with the one or more partial regions on the cell test substrate as a bottom surface,
The cell test container, wherein the partial region constituting the bottom surface of the recess includes a cell adhesive region disposed on the main electrode, a cell adhesion inhibitory region adjacent to the cell adhesive region, and a counter electrode.
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