JP2012117941A - 有機分子の結晶多形の定量方法 - Google Patents

Abstract

【課題】内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少ない含有量で、具体的には、１重量％で含まれる結晶多形を、定量することができる方法を提供する。
【解決手段】有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料を、リートベルト法による多相解析に付すことにより前記結晶多形を定量する方法であって、照射体積一定条件で収集され、ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが前記試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いて多相解析を行う。
【選択図】なし

Description

本発明は、有機分子の結晶多形の定量方法に関するものである。

有機分子の結晶多形は重要である。例えば医薬分野においては、ICH ガイドラインQ6A (International Conference on Harmonization Harmonized Guideline. Q6A Specifications, Test Procedures and Acceptance Criteria for New Drug Substances and New Drug Products, Chemical Substances, 1999)において、結晶多形の存在形（どの結晶形を含んでいるか）を規定すべきであることが記載されており、結晶多形が医薬品の品質や機能に影響を及ぼす場合には、その含量を精密に定量することが重要になっている。

有機分子の結晶多形の定量方法として、例えば非特許文献１には、有機分子の結晶多形が混合した混合粉末試料を、フッ化リチウムを内部標準試料として用いたリートベルト (Rietveld) 法を用いて定量測定する方法が記載されている。そして、上記非特許文献１には、４相の有機分子の結晶多形が混合した粉末試料であっても微量まで定量することができること、特に、２相の有機分子の結晶多形が混合した粉末試料では複相を１重量％以下まで定量することができることが記載されている。

Sampath S. Iyengar et al. (Powder Diffraction 16, 1, 20. (2001)) Zeltan Nemet et al. (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 51, 572. (2010))

ところが、非特許文献１に記載の方法では、フッ化リチウムを内部標準試料として用いている。このため、測定対象の試料とフッ化リチウムとが反応し、これによって結晶多形が変化しているおそれを排除することができない。また、内部標準試料としてフッ化リチウム以外の化合物を用いたとしても、当該化合物と測定対象の試料との反応性や親和性を予め調査する必要がある。

内部標準試料を用いない方法として、非特許文献２には、Famotidineの結晶多形の混合試料を用いて、透過測定法を用いたリートベルト法による多相解析法が記載されている。当該非特許文献２においては、Ｘ線照射体積が一定になり定量測定に好適な方法を採用することにより、即ち、一組のフィルムに挟んで円盤状(foil)に成形した試料を用いることで選択配向を軽減して定量ができることが記載されている。そして、非特許文献２においては、ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが最低角反射に相当する角度を大きく上回る範囲におけるＸ線回折データを用いることにより、測定下限が３重量％で測定した例が記載されている。

本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、その主たる目的は、内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中の前記結晶多形を、従来の方法よりも低い検出下限で定量することができる方法を提供することにある。

本発明者は上記状況の下、照射体積一定条件で収集され、最低角反射に相当する角度を含む範囲における粉末Ｘ線回折データを用い、有機分子の結晶多形の定量を、リートベルト法による多相解析法により実施することにより、内部標準試料を用いることなく、従来の方法よりも低い検出下限で定量することができることを見出した。

即ち、本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法は、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料を、リートベルト法による多相解析に付すことにより前記結晶多形を定量する方法であって、照射体積一定条件で収集され、ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが前記試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いて多相解析を行うことを特徴としている。

上記照射体積一定条件とは、デバイ・シェラー (Debye-Scherrer) 法による透過測定法であることがより好ましい。また、粉砕工程を経ていない粉末試料を用いることがより好ましい。さらに、上記粉末試料が、目開き１５０μｍの篩にて篩別した１０μｍ以上の粗大粒子を含んでいてもよい。

上記方法によれば、照射体積一定条件で収集され、ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが前記試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いるので、精度が向上し、内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少ない含有量で、具体的には、１重量％で含まれる結晶多形を、定量することができる。

また、本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法は、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中の前記結晶多形を、粉末Ｘ線回折強度比を用いて作成した検量線を用いて定量する方法であって、照射体積一定条件であるデバイ・シェラー法による透過測定法を用い、かつ、粉砕工程を経ていない粉末試料を用いることを特徴としている。

ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが測定対象の粉末試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いることがより好ましい。また、上記粉末試料が、目開き１５０μｍの篩にて篩別した１０μｍ以上の粗大粒子を含んでいてもよい。さらに、上記検量線が、結晶多形に含まれる全ての単一結晶の粉末Ｘ線回折強度を含んで作成されていることがより好ましい。

上記方法によれば、照射体積一定条件であるデバイ・シェラー法による透過測定法を用い、かつ、粉砕工程を経ていない粉末試料を用い、粉末Ｘ線回折強度比を用いて作成した検量線を用いて定量するので、精度が向上し、内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少ない含有量で、具体的には、１重量％で含まれる結晶多形を、定量することができる。

本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法によれば、内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少ない含有量で、具体的には、１重量％で含まれる結晶多形を、定量することができるという効果を奏する。

粉末Ｘ線回折光学系の分類を示すチャートである。 透過測定法に用いる装置の概略の構成を示す平面図である。 反射測定法に用いる装置の概略の構成を示す平面図である。 検量線を示すグラフである。 実施例で調製した３−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）−５−（３−メトキシフェニル）−１，６−ナフチリジン−２（１Ｈ）オンのForm Aの粉末結晶の粉末Ｘ線回折データ（ＸＲＤデータ）を示すチャートである。 実施例で調製した３−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）−５−（３−メトキシフェニル）−１，６−ナフチリジン−２（１Ｈ）オンのForm Bの粉末結晶の粉末Ｘ線回折データを示すチャートである。 上記Form Aの粉末結晶を５０重量％、上記Form Bの粉末結晶を５０重量％含む混合試料の粉末Ｘ線回折データを示すチャートである。 上記Form Aの粉末結晶を０．５重量％、上記Form Bの粉末結晶を９９．５重量％含む混合試料の粉末Ｘ線回折データを示すチャートである。

本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法は、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料を、リートベルト法による多相解析に付すことにより前記結晶多形を定量する方法であって、照射体積一定条件で収集され、ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが前記試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いて多相解析を行う方法である。また、本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法は、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中の前記結晶多形を、粉末Ｘ線回折強度比を用いて作成した検量線を用いて定量する方法であって、照射体積一定条件であるデバイ・シェラー法による透過測定法を用い、かつ、粉砕工程を経ていない粉末試料を用いる方法である。尚、本発明における「有機分子」には、白金、金等の金属原子に有機配位子が配位してなる錯体も含まれる。

一言で粉末Ｘ線回折測定といっても、時代や光源、施設等により種々の測定法が利用されている。例えば、中井，泉らによる粉末Ｘ線解析の実際第２版（株式会社朝倉書店，2009）には、代表的な測定法（粉末Ｘ線回折光学系の分類）が紹介されている。市販の粉末Ｘ線回折装置においては、さらに拡張した疑似集中法非対称測定透過法の一つがデバイ・シェラー法として認識されている。本発明においてデバイ・シェラー法とは、図１に示す分類において、疑似集中法非対称測定透過法の一つ、または、平行ビームを用いた非対称測定透過法の一つである。また、本明細書で「反射（測定）法」・「透過（測定）法」と記載があるときは、図１に示す分類とする。尚、図１に示す「平行ビーム」とは、Ｇｅ，Ｓｉからなる完全性の高い結晶モノクロメーターを用いてＸ線を平行化したビームを示す。シンクロトロン放射光施設では一般的であり、実験室装置でも実用化されている。

本発明において「照射体積一定条件」とは、「定量測定」を意味する。粉末Ｘ線回折法は、定性測定および定量測定が可能であり、目的や用途によって使い分けられている。但し、定性測定が簡便に測定できるのに対して、定量測定は、測定対象の試料に応じて個別に測定条件を設定しなければならない。粉末Ｘ線回折を使用する主目的は、種々の結晶・非結晶成分からなる粉末試料に含まれる結晶成分の検出、および、物質の帰属判定である。現在、他の分析法では代替することができず、また、非破壊分析で検出・帰属の精度が高く有用であるため、広く利用されるに至る。一方、例えば1990年以降、利用者の増えたリートベルト解析法に用いることが必須の定量測定は、定性測定と比較して使用頻度が少ない。そのため、定量測定は粉末Ｘ線回折の専門家以外は、あまり馴染みがない。本発明においては、粉末Ｘ線回折法による定量測定を行う。

「ブラッグの条件」は、ｎλ＝２ｄ sinθで表される。ここで、ｎは整数を表し、粉末Ｘ線回折においては通常「１」と置いて差し支えないので、本発明では「１」とする。また、λはＸ線の波長、ｄは結晶格子の面間隔値、θは測定角度を示す。このため、本発明における「ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが測定対象の粉末試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データ」とは、以下のように表現することができる。即ち、「最低角反射を示す角度を２θ１、sinθ＝λ／（２×１．５５）を満たす角度を２θ２とするとき、少なくとも２θ１以上、２θ２以下の測定角度範囲を含む粉末Ｘ線回折データ」である。

照射体積一定条件で収集した粉末Ｘ線回折データは定量性が高く、種々の測定装置に利用することができる。本発明においては、特に、疑似集中法を用いたデバイ・シェラー光学系を備えた装置が好適である。もちろん、SPring-8，Photon Factory等で利用されている平行ビームを用いたデバイ・シェラー光学系を備えた装置も好適である。但し、利用コストや汎用性の面から鑑みて、市販の装置を用いることが望ましい。透過測定法に用いる装置の概略の構成を示す平面図を図２に示す。図２に示すように、透過測定法に用いる装置においては、Ｘ線源(X-ray) から照射されたＸ線が回転する試料、即ち、ガラスキャピラリーに入れられた試料(Capillary Sample)で回折され、回折されたＸ線がスリット(Slit)を介して検出器(Detector)で検出されるようになっている。従って、試料に照射されるＸ線は、一定の照射幅で照射されることになるので、照射体積一定条件となる。

また、照射体積一定条件とすることができるのであれば、最も汎用的なブラッグ・ブレンターノ光学系装置を利用することもできる。但し、有機分子では吸収係数が小さすぎるために、一般に用いられている試料ホルダーでは、汎用のＣｕＫα線等の長波長Ｘ線を用いても、多くの入射Ｘ線が試料を透過してしまって定量することができない。それゆえ、照射体積一定条件とするには、特殊な平板状の深型試料ホルダーが必要になるだけでなく、大量の試料を必要とするので、現実的には試料（粉末試料）に重金属が含まれている（有機分子が錯体である）場合に限られる。反射測定法に用いる装置の概略の構成を示す平面図を図３に示す。図３に示すように、反射測定法に用いる装置においては、Ｘ線源(X-ray) からスリット(Slit)を介して照射されたＸ線が平板状の深型試料ホルダーに入れられた試料(Sample)で反射され、反射されたＸ線が複数のスリット(Slit)を介して検出器(Detector)で検出されるようになっている。従って、試料に照射されるＸ線は、深型試料ホルダーに入れられた試料の深さ（厚さ）が充分であれば、試料を透過することなく反射されることになるので、照射体積一定条件となる。

Ｘ線は、汎用のＣｕＫα線等の長波長Ｘ線が、利用コストやデータ解像度の面から鑑みてより好ましい。但し、試料（粉末試料）に重金属が含まれている（有機分子が錯体である）場合であって特に透過測定法を用いる場合には、試料吸収による回折強度の低下という問題も生じるため、ＣｕＫα線よりも短い波長のＸ線が好ましい。

Ｘ線源は、市販の装置で利用することができる管球が好ましく、より高輝度を実現することができる回転対陰極の光源がより好ましく、ビームの平行性および輝度の観点から、大型放射光施設を用いるＸ線源がさらに好ましいものの、特に限定されるものではない。

Ｘ線は、モノクロメーターを用いて単色化されていることが、リートベルト法による計算時間を短くするために望ましいものの、特に、単色化されている必要はない。

光学系としては、疑似集中法を用いたデバイ・シェラー光学系が、利用コストや汎用性の面から鑑みて好ましい。もちろん、Ｘ線として平行ビームを用いたデバイ・シェラー光学系も好適であり、さらに、格子面間隔傾斜型放物面人工格子を用いた装置や、大型放射光施設がより好ましいものの、特に限定されるものではない。格子面間隔傾斜型放物面人工格子は、一般にパラボリック・ミラーや多相膜ミラーとも呼ばれており、実験室Ｘ線源のような典型的な発散特性Ｘ線源においても高効率でＸ線を平行化することができる、優れた人工格子である。

粉末試料を入れる試料ホルダーとしては、通常、デバイ・シェラー光学系を用いた測定装置で用いられるガラスキャピラリーが最も好ましい。ガラスキャピラリーは、粉末Ｘ線回折法で最大の問題となる選択配向の緩和には、最も効果が高い。測定装置には、測定中にガラスキャピラリーを一定速度で回転させるスピナー機構が装備されていることが必要である。ガラスキャピラリーの材質は、各種化学薬品との親和性が低いホウ珪酸ガラスが最も好ましい。また、粉末試料と反応しないのであれば、ホウ珪酸ガラスよりも吸収係数が小さいリンデマンガラス等の種々のガラス材料も用いることができる。

また、ガラスキャピラリーを用いる代りに、粉末試料を、Ｘ線の回折が無く、吸収係数の小さいフィルム、例えば、膜透過測定法に用いられるマイラーフィルムやカプトンフィルム等のフィルムに挟んで測定することもできる。選択配向が少ない場合には、粉末試料を、反射法に用いられる汎用の平板のホルダーに挟んで測定しても構わない。ホルダーは、平滑性に優れるガラス、アルミニウム板、Ｓｉ無反射基板、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）板等の、測定領域においてＸ線回折の生じない材質で形成されていることが望ましい。フィルムやホルダーを用いる場合、測定装置には、平面回転機構が装備されていることが必要である。

測定装置の検出器としては、多チャンネル型検出器が好ましい。特にガラスキャピラリーを用いるデバイ・シェラー光学系の汎用装置（通常、実験室で用いる装置）では、回折強度が著しく弱いため、従来用いられているシンチレーションカウンター等の検出器では充分なＳ／Ｎ比のデータを得たい場合に測定時間がかかる不都合がある。上記多チャンネル型検出器は、その不都合を解決することができるため好適である。検出方式は、特に限定されるものではなく、位置敏感型および半導体型の両方が適している。

上記デバイ・シェラー光学系を用いた測定装置としては、具体的には、例えば、Bruker AXS社製D8 ADVANCE Vαrio1、PANalytical 社製X' Pert PRO MPD、リガク社製 Smart Labを挙げることができる。

「リートベルト法」は、例えば、中井，泉らによる粉末Ｘ線解析の実際第２版（株式会社朝倉書店，2009）に詳述されている。本発明においては、当該書籍に記載されているリートベルト解析の手法を採用することとするが、具体的な手法は、上記手法にのみ限定されるものではない。

リートベルト解析では、粉末Ｘ線回折装置によって、一定の２θ間隔で一連の回折強度ｙ_ｉ （ｉ＝１，２，３，…）を測定する場合に、全粉末Ｘ線回折パターンに含まれている情報を最大限に抽出するために、近似構造モデルに基づいて計算した回折パターンを実測回折パターンに当てはめる。即ち、ｉ番目の回折点２θ_ｉ に対する計算強度をｆ（２θ_ｉ ；ｘ_１ ，ｘ_２ ，ｘ_３ ，…）≡ｆ_ｉ （ｘ）、統計的重みをｗ_ｉ （＝１／ｙ_ｉ ）としたとき、重み付き残差二乗和

を最小とする一組の可変パラメーターｘを最小二乗法により精密化する。ｆ_ｉ （ｘ）はｘについて非線形なので、ｘの初期値を与え、非線形最小二乗法によりｘを反復改良せねばならない。波長一定で２θ可変の粉末Ｘ線回折法の場合には、実質的にｙ_ｉ に寄与するブラッグ反射の強度を合計し、バックグラウンド強度ｙ_ｂ （２θ_ｉ ）を加えるとｉ番目の測定点でのｆ_ｉ （ｘ）が下式から得られる。

ここで、ｓは回折装置、測定条件、試料（粉末試料）に依存する種々の定数を全て吸収させた尺度因子、Ｓ_Ｒ （θ_ｉ ）はブラッグ・ブレンターノ光学系における平板試料の表面粗さの補正因子、Ａ（θ_ｉ ）は吸収因子、Ｄ（θ_ｉ ）はブラッグ・ブレンターノ光学系において照射幅が一定となるように発散角を自動的に可変する発散スリットを用いるときの補正因子、Ｋは２θ_ｉ におけるブラッグ反射強度に実質的に寄与する反射の番号、ｍＫはブラッグ反射の多重度、Ｆ（ｈ_ｋ ）は結晶構造因子、ｈ_ｋ は回折指数ｈｋｌを表すベクトル、Ｐ_ｋ は試料の選択配向による回折強度の変動を補正するための選択配向関数、Ｌ（θ_ｉ ）はローレンツ・偏光因子、θ_ｉＫはブラッグ角、Ｇ（Δ２θ_ｉＫ）≡Ｇ（２θ_ｉ −２θ_Ｋ ）は回折プロファイル形を近似するためのプロファイル関数を示す。

このうち、結晶構造因子Ｆ（ｈ_ｋ ）は、ｊを単位胞内の原子の番号、ｇ_ｉ を占有率、ｆ_０ｉを原子散乱因子、ｆ_ｉ'をＸ線分散補正の実数部、ｆ_ｊ'' をＸ線分散補正の虚数部、Ｔ_ｊ をデバイーワラー因子（温度因子と呼ぶことが多い）、ｘ_ｉ ，ｙ_ｉ ，ｚ_ｉ を分率座標とすると、

となる。

は単位胞内の全原子についての和を表す。Ｔ_ｊ は原子の熱振動に起因する回折強度の減少を表す因子であり、等方性調和熱振動で近似する場合、

で与えられる。ここで、Ｂ_ｊ とＵ_ｊ は等方性原子変位パラメーター（等方性温度因子や等方性熱振動パラメーターとも呼ばれる）である。

リートベルト法プログラムとしては、例えば、RIETAN-FP ，GSAS，FullProf，TOPAS 等を好適に用いることができるものの、これら特定のプログラムに限定されるものではなく、種々のプログラムを用いることができる。積算時間は、測定対象の試料に応じて、適宜設定すればよい。

本発明における粉末Ｘ線回折データの測定範囲として、照射体積一定条件で収集され、ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが前記試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å（０．１５５ｎｍ）以下（λ＝１．５４０５Åの場合、２θ＞６１．７９７°）の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いる。即ち、実質的に全ての粉末Ｘ線回折データをリートベルト法による多相解析法に用いるので、精度が向上し、内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少ない含有量で含まれる結晶多形の重量分率を精密に定量することができる。

面間隔値ｄを１．５５Å以下（λ＝１．５４０５Åの場合、２θ＞６１．７９７°）、より好ましくは１．２Å以下にすることで、バックグラウンドが複雑になりやすいデバイ・シェラー光学系においても、等方性原子変位パラメーターと強く相関するものの、最小二乗法を比較的安定して収束させることができる。

また、測定対象の試料の最低角反射に相当する面間隔を含むことで、分子組成比の関係等で席占有率が１．０に満たない成分を含む粉末試料であっても、定量性を損なうことなくリートベルト法による解析を実施することができる。尚、有機分子においては、最低角反射に相当する面間隔は必ず１．５５Å以上（通常は４．４３Å以上）に存在する。

リートベルト法による精密化の目安として、Ｒ_ｗｐ値が一つの指標になる。Ｒ_ｗｐ値は１０％以下まで精密化されることが好ましく、７％以下まで精密化されることがより好ましい。それと共に、Ｒ_ｐ 値も１０％以下となることが好ましい。これらＲ_ｗｐ値およびＲ_ｐ 値は、R.A.Young ら (The Rietveld Method, Oxford, 1993)に従って以下のように定義される。

ここで、ｗ_ｉ は統計的重み、ｙ_ｉ は観測強度、ｆ_ｉ （ｘ）は理論回折強度を示す。

リートベルト法による有機分子の結晶多形の定量方法としては、多相解析における各々の結晶相の尺度因子により算出する計算方法が好ましい。例えば、中井，泉らによる粉末Ｘ線解析の実際第２版（株式会社朝倉書店，2009）によると、リートベルト解析プログラムは通常、二つ以上の結晶相からなる混合物も取り扱うことができる。この機能を活用して、結晶相ｉの質量分率ｗ_ｉ （上記統計的重みｗ_ｉ とは異なる）は、リートベルト法により精密化した尺度因子ｓ_ｊ （ｊ＝１，２，３，…）から、

という式で求められる。ここで、Ｚは単位胞中の化学式単位の数、Ｍは化学式単位の質量、Ｖは化学式単位の体積、

は全相についての和を表す。

リートベルト法における有機分子の結晶多形の多相解析において、粒子径および吸収係数から生じるmicroabsorption の問題は、汎用のＣｕＫα線のような長波長Ｘ線においても無視して構わない。結晶多形のため、即ち同一分子・同一組成のため、基本的な吸収係数は同じであり、粒子径による効果だけが異なるからである。有機分子を構成するＣ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ等では吸収係数も小さく問題になることはない。本発明においてもこの考え方に従う。もちろん、粒子径が著しく異なる場合、または、重元素が含まれる場合は、補正することによってより好適になるため、この内容に限定されるものではない。

以上のように、本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法は、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料を、リートベルト法による多相解析に付すことにより前記結晶多形を定量する方法であって、照射体積一定条件で収集され、ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが前記試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いて多相解析を行う方法である。そして、上記照射体積一定条件とは、デバイ・シェラー法による透過測定法であることが好ましい。これにより、実質的に全ての粉末Ｘ線回折データをリートベルト法による多相解析に付すので精度が向上し、分子量が大きく複雑な化学構造を有し互いの有機分子のピーク重畳が激しい試料であっても測定することができ、内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少ない含有量で、具体的には、１重量％で含まれる結晶多形を、定量することができる。

従って、本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法の更なる特徴は、粉砕工程を経ていない粉末試料を用いること、さらには、上記粉末試料が、目開き１５０μｍの篩にて篩別した１０μｍ以上の粗大粒子を含んでいてもよいことにある。Zeltan Nemetら (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 49, 338. (2009)) の報告では、Famotidineの結晶相の定量においては、測定の前処理として行う粉砕工程による影響は無いと記載されている。しかしながら、多くの有機分子の結晶は、粉砕における応力により、結晶形に影響を受けているおそれがある。本発明に係る定量方法によれば、乳鉢を用いてすり潰す（摩砕）等の粉砕工程を経ていない粉末試料を用いることで、粉砕による影響を受けずに測定することができるので、選択配向を生じ易い結晶の有機分子からなる結晶多形であっても、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少ない含有量で、具体的には、１重量％で含まれる結晶多形を、精密に定量することができる。

また、以上のように、本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法は、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中の前記結晶多形を、粉末Ｘ線回折強度比を用いて作成した検量線を用いて定量する方法であって、照射体積一定条件であるデバイ・シェラー法による透過測定法を用い、かつ、粉砕工程を経ていない粉末試料を用いる方法である。そして、ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが測定対象の粉末試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いることが好ましい。これにより、分子量が大きく複雑な化学構造を有し互いの有機分子のピーク重畳が激しい試料であっても測定することができ、内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少なくとも１重量％以上、９９重量％以下の範囲で含まれる結晶多形を、定量することができる。上記検量線は、有機分子の含有量が既知でそれぞれ含有量が異なる５点以上の試料（混合試料）を用いて測定した粉末Ｘ線回折強度を用いて、例えば最小二乗法で求められていることがより好ましい。

また、本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法は、上記粉末試料が、目開き１５０μｍの篩にて篩別した１０μｍ以上の粗大粒子を含んでいてもよいことにある。そして、上記検量線が、結晶多形に含まれる全ての単一結晶の粉末Ｘ線回折強度を含んで作成されていることが好ましい。

即ち、本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法の更なる特徴は、各結晶相の分率座標を固定しながら精密化することで、粉末試料が目開き１５０μｍの篩にて篩別した１０μｍ以上の粗大粒子を含んでいても、当該粗大粒子による回折強度の致命的な変化を防止し、かつ、実質的な解析精度を下げることなく定量することができることを見出したことにある。リートベルト法において、粗大粒子による強い回折は、最小二乗残差として目立つことが多く、弊害が大きい。そのため、リートベルト法プログラムでは、選択配向因子や原子の分率座標を調整して精密化してしまう。このとき、分子間の結合距離、結合角、または、二面角を或る程度の許容範囲で拘束条件をかけながら解析することは、熟練測定者の勘所となっている（熟練を要する作業となっている）。また、分率座標は、有機分子からなる結晶ではパラメーター数が多く、実質的に精密化が不可能な水素原子も多数有しているため、煩雑な解析になることが多い。そのため、最小二乗残差の誤差の掃き溜めとなり易いという問題がある。これに対して、本発明においては、任意性が生じ難いように結晶構造の分率座標だけを全て固定する方法を実施したところ、定量性は実質的に維持されることを見出した。本発明に係る定量方法によれば、粉砕による影響を受けずに測定することができるので、選択配向を生じ易い結晶の有機分子からなる結晶多形であっても、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少なくとも１重量％以上、９９重量％以下の範囲で含まれる結晶多形を、定量することができる。

以下、実施例および比較例によって本発明をより詳細に説明する。
〔試料の調製方法〕
下記実施例に用いる試料を、以下の方法で調製した。

公知の製造方法である特許第３３９０４５３号公報の第２３頁（実施例８６）に記載されている方法によって、３−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）−５−（３−メトキシフェニル）−１，６−ナフチリジン−２（１Ｈ）オンの無色粉末を製造した。そして、上記無色粉末を、ジメチルホルムアミドおよび２−プロパノールの混合溶媒（ジメチルホルムアミド：２−プロパノール＝４：７（容量比））に溶解させた後、再結晶させた。その後、得られた固形分を濾取して乾燥させることにより、３−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）−５−（３−メトキシフェニル）−１，６−ナフチリジン−２（１Ｈ）オンの粉末結晶（以下、単にForm Aと記す）を得た。

一方、上記混合溶媒の代りに水およびエタノールの混合溶媒（水：エタノール＝１：４（容量比））を用いた以外は、上記操作と同様にして無色粉末を溶解させて再結晶させ、得られた固形分を濾取して乾燥させることにより、３−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）−５−（３−メトキシフェニル）−１，６−ナフチリジン−２（１Ｈ）オンの粉末結晶（以下、単にForm Bと記す）を得た。

上記Form Aの粉末Ｘ線回折データ（ＸＲＤデータ）を図５に示すと共に、上記Form Bの粉末Ｘ線回折データを図６に示す。
〔実施例１〕
粉末結晶であるForm AおよびForm Bを、Form Aの含有量（仕込み量）が８０重量％になるように、以下の手順で均一に混合した。試料の汚染を避けるために、メノウ製の乳鉢を容器として使用した。乳鉢にForm A１．００４９９ｇとForm B１．０００４０ｇとを入れて、ステンレス製スパーテルを用いて３０分間手動で混合した。次に、この混合試料にForm A１．００４０１ｇを加えて同様に３０分間手動で混合した後、さらにForm A１．９９９７６ｇを加えて３０分間手動で混合して、Form Aの含有量が８０重量％の混合試料（以下、８０％混合試料と記す）を作成した。得られた８０％混合試料を目開き１５０μｍの篩を用いて篩別した後、Hilgenberg社製１．０ｍｍφほう珪酸ガラスキャピラリーに封管した。

次に、ブルカーＡＸＳ社製高分解能粉末回折装置 D8 ADVANCE with Vαrio1（ＣｕＫα，４０ｋＶ，４０ｍＡ）に１次元高速ＰＳＤ検出器(VÅNTEC-1) を組み合わせた装置を用いて、疑似デバイ・シェラー光学系で測定対象の試料の最低角反射に相当する面間隔から１．１９Å（０．１０９ｎｍ）以下（２θ＞８０．６７６°）の範囲における粉末Ｘ線回折データ（ＸＲＤデータ）を得た。尚、粉末Ｘ線回折法の弱点である選択配向の寄与を低減するために、ほう珪酸ガラスキャピラリーを毎分６０回転で回転させながら室温で測定を行った。

そして、透過法測定であることから、試料のＸ線透過率の実測値を用いて線吸収係数を次式より求めた。

Ｉ_ｘ ＝Ｉ_０ exp（−μｔ）
ここで、μは線吸収係数、ｔは試料厚さ、Ｉ_ｘ は試料透過Ｘ線強度、Ｉ_０ はＸ線強度である。

得られたＸＲＤパターンに対し、RIETAN-FP プログラムパッケージ (Fujio Izumi and Koichi Momma, Solid. State Phenom., 130 15 (2007))を用いてリートベルト２相解析を実施した。ほう珪酸ガラスキャピラリーによる非晶質からの散乱は、こぶ状のバックグラウンドとして測定データの精密化の妨げとなる。そのため、１１次のルジャンドル直交多項式を重畳した複合バックグラウンド関数で、全体のバックグラウンドを見積もった。そのとき、初期のバックグラウンドデータは プログラムPowderX (Cheng Dong, J. Appl. Crystallogr. 32 838 (1999)) にて近似した。プロファイル関数には虎谷の拡張分割Pseude-Voigt関数を使用した。しかしながら、粉末法の貧弱なデータを用い、水素原子まで付加された２相の結晶多形を含む全てのパラメーターを精密化することは、困難であると予測された。そこで、以下のような解析条件を前提に、２相解析を実施した。
（１）二つの結晶構造の分率座標は固定する。
（２）結晶構造に関するパラメーターでは、格子定数、等方性原子変位パラメーターのみを精密化の対象とする。但し、最小二乗法が発散するときには固定する。
（３）その他、尺度因子、プロファイル関数、バックグラウンド関数は精密化する。

リートベルト解析による解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表１に示す。また、最終の信頼度因子を表２に示す。ここでＲ_ｗｐ値、Ｒ_ｐ 値およびＳ値は、R.A.Young ら (The Rietveld Method, Oxford, 1993)の定義に従った。
〔実施例２〕
粉末結晶であるForm AおよびForm Bを、Form Aの含有量が５０重量％になるように、以下の手順で均一に混合した。試料の汚染を避けるために、メノウ製の乳鉢を容器として使用した。乳鉢にForm A１．０００７４ｇとForm B１．０００３１ｇとを入れて、ステンレス製スパーテルを用いて３０分間手動で混合した。次に、この混合試料にForm A０．５０１０３ｇとForm B０．５００７６ｇとを加えて同様に３０分間手動で混合した後、さらにForm A１．００４０６ｇとForm B１．０００００８ｇとを加えて３０分間手動で混合して、Form Aの含有量が５０重量％の混合試料（以下、５０％混合試料と記す）を作成した。上記５０％混合試料の粉末Ｘ線回折データを図７に示す。得られた５０％混合試料を用いて、実施例１と同じ方法で、２相解析を実施した。解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表１に示す。また、最終の信頼度因子を表２に示す。
〔実施例３〕
粉末結晶であるForm AおよびForm Bを、Form Aの含有量が１０重量％になるように、以下の手順で均一に混合した。試料の汚染を避けるために、メノウ製の乳鉢を容器として使用した。乳鉢にForm A０．５００２５ｇとForm B０．５０１３３ｇとを入れて、ステンレス製スパーテルを用いて３０分間手動で混合した。次に、この混合試料にForm B２．００２０３ｇを加えて同様に３０分間手動で混合した後、さらにForm B２.００１６９ｇを加えて３０分間手動で混合して、Form Aの含有量が１０重量％の混合試料（以下、１０％混合試料と記す）を作成した。得られた１０％混合試料を用いて、実施例１と同じ方法で、２相解析を実施した。解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表１に示す。また、最終の信頼度因子を表２に示す。
〔実施例４〕
粉末結晶であるForm AおよびForm Bを、Form Aの含有量が５重量％になるように、以下の手順で均一に混合した。試料の汚染を避けるために、メノウ製の乳鉢を容器として使用した。乳鉢にForm A０．２５０１７ｇとForm B０．２５０３９ｇとを入れて、ステンレス製スパーテルを用いて３０分間手動で混合した。次に、この混合試料にForm B０．５０２１３ｇを加えて同様に３０分間手動で混合した後、さらにForm B２．０００９４ｇを加えて同様に３０分間手動で混合し、次いでForm B１．９９９７５ｇを加えて同様に３０分間手動で混合して、Form Aの含有量が５重量％の混合試料（以下、５％混合試料と記す）を作成した。得られた５％混合試料を用いて、実施例１と同じ方法で、２相解析を実施した。解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表１に示す。また、最終の信頼度因子を表２に示す。
〔実施例５〕
粉末結晶であるForm AおよびForm Bを、Form Aの含有量が２重量％になるように、以下の手順で均一に混合した。試料の汚染を避けるために、メノウ製の乳鉢を容器として使用した。乳鉢にForm A０．１８１３８ｇとForm B０．３２０８３９ｇとを入れて、ステンレス製スパーテルを用いて３０分間手動で混合した。次に、この混合試料にForm B１．０００４９ｇを加えて同様に３０分間手動で混合した後、さらにForm B１．４９９９２ｇを加えて同様に３０分間手動で混合した。次いで、この混合試料にForm B３．００１９７５ｇを加えて同様に３０分間手動で混合した後、さらにForm B３．００７９６ｇを加えて同様に３０分間手動で混合して、Form Aの含有量が２重量％の混合試料（以下、２％混合試料と記す）を作成した。得られた２％混合試料を用いて、実施例１と同じ方法で、２相解析を実施した。解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表１に示す。また、最終の信頼度因子を表２に示す。
〔実施例６〕
粉末結晶であるForm AおよびForm Bを、Form Aの含有量が１重量％になるように、以下の手順で均一に混合した。試料の汚染を避けるために、メノウ製の乳鉢を容器として使用した。乳鉢に実施例５で作成した２％混合試料１．００２０１ｇとForm B１．０００９７ｇとを入れて、ステンレス製スパーテルを用いて３０分間手動で混合した。次に、この混合試料に２％混合試料１．００１０３ｇとForm B１．００７３５ｇとを加えて同様に３０分間手動で混合した後、さらに２％混合試料０．５０４０８ｇとForm B０．５０６０２ｇとを加えて同様に３０分間手動で混合した。次いで、この混合試料に２％混合試料２．５０７１２ｇを加えて同様に３０分間手動で混合して、Form Aの含有量が１重量％の混合試料（以下、１％混合試料と記す）を作成した。得られた１％混合試料を用いて、実施例１と同じ方法で、２相解析を実施した。解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表１に示す。また、最終の信頼度因子を表２に示す。
〔実施例７〕
粉末結晶であるForm AおよびForm Bを、を、Form Aの含有量が０．５重量％になるように、以下の手順で均一に混合した。試料の汚染を避けるために、メノウ製の乳鉢を容器として使用した。乳鉢に実施例５で作成した２％混合試料１．２５１３６ｇとForm B１．２５１５６ｇとを入れて、ステンレス製スパーテルを用いて３０分間手動で混合した。次に、この混合試料にForm B１．００２９４ｇを加えて同様に３０分間手動で混合した後、さらにForm B１．５０１１９ｇを加えて同様に３０分間手動で混合して、Form Aの含有量が０．５重量％の混合試料（以下、０．５％混合試料と記す）を作成した。上記０．５％混合試料の粉末Ｘ線回折データを図８に示す。得られた０．５％混合試料を用いて、実施例１と同じ方法で、２相解析を実施した。解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表１に示す。また、最終の信頼度因子を表２に示す。

〔実施例８〕
実施例１〜７で作成した８０％混合試料，５０％混合試料，１０％混合試料，５％混合試料，２％混合試料，１％混合試料，０．５％混合試料の粉末Ｘ線回折データ、並びに、実施例１と同じ方法で測定した粉末結晶であるForm A（以下、Form A１００％試料と記す）およびForm B（以下、Form B１００％試料と記す）の粉末Ｘ線回折データを用いて、ピーク重畳が無く、Form Aに特徴的な２θ＝６．９°の回折ピークの強度とForm Bに特徴的な２θ＝１０．１°の回折ピークの強度との比（ピーク強度比）から、以下に示す式により検量線を作成して、各混合試料におけるForm AおよびForm Bの定量を行った。

ｙ＝１００×（Ｈａ／（Ｈａ＋Ｈｂ））^ｘ
ここで、ｙはForm Aの量（重量％）、Ｈａは２θ＝６．９°の回折ピーク強度、Ｈｂは２θ＝１０．１°の回折ピーク強度、ｘは最小二乗法を用い、理論値と観測値の差が最小になるようにして求めた値（１．０３７５）である。

８０％混合試料，５０％混合試料，１０％混合試料，５％混合試料，２％混合試料，１％混合試料，０．５％混合試料の粉末Ｘ線回折データから得られた２θ＝６．９°および２θ＝１０．１°のピーク強度の一覧を表３に示す。また、Form A１００％試料およびForm B１００％試料の粉末Ｘ線回折データから得られた２θ＝６．９°および２θ＝１０．１°のピーク強度(counts)の一覧を表４に示す。そして、検量線法による解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表５に示す。また、検量線のグラフを図４に示す。

〔比較例１〕
実施例６で作成した１％混合試料を、目開き１５０μｍの篩を用いて篩別した後、直径２５ｍｍ，深さ０．２ｍｍのガラス製試料台に充填した。次に、株式会社リガク製粉末回折装置RINT-2100V（ＣｕＫα，４０ｋＶ，４０ｍＡ）を用いてブラッグ・ブレンターノ光学系で測定対象の試料の最低角反射に相当する面間隔から１．１７６Å以下（２θ＞８０．０°）の範囲における粉末Ｘ線回折データ（ＸＲＤデータ）を得た。尚、粉末Ｘ線回折法の弱点である選択配向の寄与を低減するために、ガラス製試料台を毎分３０回転で回転させながら室温で測定を行った。さらに、発散スリット１／２°、散乱スリット１／２°、受光スリット０．３ｍｍとし、０．０３°／２θステップ、積算時間４．０sec で、Fixed time法を用いた。

得られたＸＲＤパターンに対し、RIETAN-FP プログラムパッケージを用いてリートベルト２相解析を実施した。１１次のルジャンドル直交多項式を重畳した複合バックグラウンド関数で、全体のバックグラウンドを見積もった。そのとき、初期のバックグラウンドデータは プログラムPowderX (Cheng Dong, J. Appl. Crystallogr. 32 838 (1999)) にて近似した。プロファイル関数には虎谷の拡張分割Pseude-Voigt関数を使用した。また、実施例１と同じ結晶構造を初期モデルとした。しかしながら、粉末法の貧弱なデータを用い、水素原子まで付加された２相の結晶多形を含む全てのパラメーターを精密化することは、困難であると予測された。そこで、実施例１に記載した（１）〜（３）の解析条件を前提に、２相解析を実施した。解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表６に示す。また、最終の信頼度因子を表７に示す。
〔比較例２〕
実施例７で作成した０．５％混合試料を用いた以外は、比較例１と同じ方法で２相解析を実施した。解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表６に示す。また、最終の信頼度因子を表７に示す。
〔比較例３〕
実施例７で得られた粉末Ｘ線回折データ（ＸＲＤデータ）を用い、リートベルト解析に用いる計算範囲を９〜３５°／２θに制限した以外は、実施例７と同じ方法で２相解析を実施した。解析結果、即ち、定量分析結果（検出量）を表８に示す。また、最終の信頼度因子を表９に示す。

〔まとめ〕
上記実施例１〜８の結果と比較例１〜３の結果との対比から明らかなように、本発明に係る定量方法によれば、内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少ない含有量で含まれる結晶多形を、精密に定量することができることが判る。

尚、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施することができ、従って、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。

本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法によれば、内部標準試料を用いることなく、有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中に、少ない含有量で、具体的には、１重量％で含まれる結晶多形を、定量することができる方法を提供することができる。

それゆえ、本発明に係る有機分子の結晶多形の定量方法は、例えば、医薬品の原体の定量性に好適に利用することができる。

Claims (8)

1. 有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料を、リートベルト法による多相解析に付すことにより前記結晶多形を定量する方法であって、
   照射体積一定条件で収集され、ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが前記試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いて多相解析を行うことを特徴とする有機分子の結晶多形の定量方法。
2. 上記照射体積一定条件とは、デバイ・シェラー法による透過測定法であることを特徴とする請求項１に記載の有機分子の結晶多形の定量方法。
3. 粉砕工程を経ていない粉末試料を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の有機分子の結晶多形の定量方法。
4. 上記粉末試料が、目開き１５０μｍの篩にて篩別した１０μｍ以上の粗大粒子を含んでいてもよいことを特徴とする請求項３に記載の有機分子の結晶多形の定量方法。
5. 有機分子の結晶多形を２相以上含有する試料中の前記結晶多形を、粉末Ｘ線回折強度比を用いて作成した検量線を用いて定量する方法であって、
   照射体積一定条件であるデバイ・シェラー法による透過測定法を用い、かつ、粉砕工程を経ていない粉末試料を用いることを特徴とする有機分子の結晶多形の定量方法。
6. ブラッグの条件で計算される面間隔値ｄが測定対象の粉末試料の最低角反射に相当する面間隔以上、１．５５Å以下の範囲における粉末Ｘ線回折データを用いることを特徴とする請求項５に記載の有機分子の結晶多形の定量方法。
7. 上記粉末試料が、目開き１５０μｍの篩にて篩別した１０μｍ以上の粗大粒子を含んでいてもよいことを特徴とする請求項５または６に記載の有機分子の結晶多形の定量方法。
8. 上記検量線が、結晶多形に含まれる全ての単一結晶の粉末Ｘ線回折強度を含んで作成されていることを特徴とする請求項５，６または７に記載の有機分子の結晶多形の定量方法。

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