JP2012107935A - Inspection method of cerebral infarction with desmoglein-2 protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、脳梗塞の検査方法、脳梗塞治療または予防効果の評価方法、脳梗塞の予防薬または治療薬のスクリーニング方法、および脳梗塞検査用、脳梗塞治療効果評価用または脳梗塞予防・治療薬候補化合物スクリーニング用のキットに関するものである。 The present invention relates to a method for examining cerebral infarction, a method for evaluating cerebral infarction treatment or prevention effect, a method for screening for cerebral infarction preventive or therapeutic agent, and cerebral infarction examination, cerebral infarction treatment effect evaluation or cerebral infarction prevention / treatment. The present invention relates to a drug candidate compound screening kit.
脳卒中とは、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血などの脳血管障害の総称である。これら脳卒中の病型のうち、最近では脳梗塞が相対的に増加してきている。脳梗塞急性期の薬物療法としては血栓溶解療法、抗凝固療法、抗血小板療法、脳保護薬投与などが用いられ、重篤な患者や出血性脳梗塞を起こした患者に対しては外科的手術が行われる。脳梗塞の症状は急性期にもっとも強く、その後徐々に改善していく。これは、壊死に陥った脳組織が腫脹して、周囲の脳組織も圧迫・障害していることによる。腫脹が引いていくとともに、周囲の組織が機能を回復して症状は固定していくのである。ただし、脳虚血部位から放出されるフリーラジカルは周囲の組織をも壊死させる働きがあるため急性期を過ぎても機能予後の向上につなげるため継続的な治療が必要とされている。 Stroke is a general term for cerebrovascular disorders such as cerebral infarction, cerebral hemorrhage, and subarachnoid hemorrhage. Of these stroke types, cerebral infarction has been relatively increasing recently. Thrombolytic therapy, anticoagulant therapy, antiplatelet therapy, administration of cerebral protective drugs, etc. are used as drug therapy in the acute phase of cerebral infarction. Surgical surgery is performed for patients with severe or hemorrhagic cerebral infarction. Is done. Cerebral infarction symptoms are strongest in the acute phase and then gradually improve. This is because the necrotic brain tissue is swollen and the surrounding brain tissue is also compressed and damaged. As the swelling subsides, the surrounding tissues recover their function and the symptoms are fixed. However, since free radicals released from cerebral ischemic sites have the function of necrosing surrounding tissues, continuous treatment is required to improve the functional prognosis even after the acute phase.
脳梗塞の臨床病型には、脳内小動脈が閉塞して発症するラクナ梗塞、脳内大動脈が粥腫で閉塞して発症するアテローム血栓性脳梗塞、心臓内の血栓が栓子となり脳内動脈を閉塞して発症する心原性脳塞栓症等がある。これらの臨床病型により急性期及び慢性期の適切な治療法が異なるため、脳梗塞患者の臨床病型を迅速に診断する方法が求められていた。
脳梗塞の臨床病型の分類方法としては、臨床症候の観察と心エコー、MRI、MRA、頚部血管エコー等を施行してTOAST分類に準拠した脳梗塞臨床診断のフローチャート（非特許文献１）等により分類する方法や、分子マーカーを用いた方法、具体的には、CRP、D-Dimer、RAGE、MMP-9、S100B、BNP等の分子マーカーを脳梗塞発症24時間以内に同時測定した結果、BNPとD-Dimerで、特定のカットオフ値を設定すると、心原性脳塞栓症を他病型と分類できること（非特許文献２）などが開示されているが、さらに迅速で確実な病型診断が可能となる分子マーカーが求められていた。
The clinical types of cerebral infarction include lacunar infarction that develops when the intracerebral small artery is occluded, atherothrombotic cerebral infarction that develops when the intracerebral aorta is occluded by atheroma, and a thrombus in the heart becomes an obturator. Examples include cardiogenic cerebral embolism that develops by blocking an artery. Since appropriate treatment methods for the acute and chronic phases differ depending on these clinical types, a method for rapidly diagnosing the clinical type of patients with cerebral infarction has been demanded.
As a method of classifying clinical types of cerebral infarction, clinical symptom observation and echocardiography, MRI, MRA, cervical vascular echo, etc. are performed, and a flowchart of clinical diagnosis of cerebral infarction based on TOAST classification (Non-patent Document 1), etc. As a result of simultaneous measurement of molecular markers such as CRP, D-Dimer, RAGE, MMP-9, S100B, BNP within 24 hours of cerebral infarction, Although it has been disclosed that cardiogenic cerebral embolism can be classified as another disease type by setting a specific cutoff value with BNP and D-Dimer (Non-patent Document 2), etc. There was a need for molecular markers that could be diagnosed.
本発明は、上記の問題点に鑑み、脳梗塞患者などの血清や血漿等を用いて迅速かつ確実な脳梗塞の検査を行う方法、及び脳梗塞治療効果の評価方法を提供することを課題とする。 In view of the above problems, the present invention has an object to provide a method for quickly and surely inspecting cerebral infarction using serum or plasma of patients with cerebral infarction and the like, and a method for evaluating cerebral infarction treatment effects. To do.
本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、患者血漿中の、Desmoglein-2蛋白質が病型の異なる患者の血漿中のその濃度の間で異なるという知見を得、Desmoglein-2蛋白質の量が脳梗塞の検査のための有用な指標となることを見出して、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have obtained the knowledge that Desmoglein-2 protein in patient plasma differs between its concentrations in the plasma of patients with different disease types. The present inventors have found that the amount of 2 proteins is a useful index for the examination of cerebral infarction, and completed the present invention.
即ち、本発明は以下を要旨とする。
［１］被検動物より採取された血液試料中のDesmoglein-2蛋白質の蛋白質量を測定する工
程を含む、該動物における脳梗塞の診断のための検査方法。
［２］被検動物より採取された血液試料が、脳梗塞様症状の発症直後から発症後２０日目の間のいずれかの時期において被検動物より採取されたものであることを特徴とする［１］に記載の脳梗塞の診断のための検査方法。
［３］被検動物より採取された血液試料中のDesmoglein-2蛋白質の蛋白質量を測定する工程を含む、該動物における脳梗塞の病型診断のための検査方法。
［４］病型診断が、アテローム血栓性、心原性脳塞栓症、大動脈原性脳塞栓症、Branch atheromatous disease（BAD）、動脈解離、分類不能のいずれかを診断するものである［３］に記載の検査方法。
［５］脳梗塞の予防薬もしくは治療薬が投与された脳梗塞の予防もしくは治療を必要とする動物から採取された血液試料中のDesmoglein-2蛋白質の蛋白質量を測定する工程を含む、該動物における脳梗塞の予防もしくは治療効果の評価方法。
［６］被検体と脳梗塞の予防薬または治療薬の候補化合物を接触させた後、該被検体中のDesmoglein-2蛋白質の蛋白質量を測定する工程を含む、脳梗塞の予防薬または治療薬のスクリーニング方法。
［７］Desmoglein-2蛋白質の蛋白質量を測定し得る試薬を含んでなる、脳梗塞検査用、脳梗塞治療効果評価用、または脳梗塞予防・治療薬候補化合物のスクリーニング用キット。
That is, the gist of the present invention is as follows.
[1] A test method for diagnosing cerebral infarction in an animal, comprising a step of measuring a protein amount of Desmoglein-2 protein in a blood sample collected from the test animal.
[2] The blood sample collected from the test animal is collected from the test animal at any time between immediately after the onset of cerebral infarction-like symptoms and the 20th day after the onset. [1] The examination method for diagnosis of cerebral infarction according to [1].
[3] A test method for diagnosing a cerebral infarction disease in the animal, comprising a step of measuring a protein amount of Desmoglein-2 protein in a blood sample collected from the subject animal.
[4] Diagnosis of the disease type is atherothrombotic, cardiogenic cerebral embolism, aortic cerebral embolism, Branch atheromatous disease (BAD), arterial dissection, or unclassifiable [3] Inspection method described in 1.
[5] The animal comprising a step of measuring a protein amount of Desmoglein-2 protein in a blood sample collected from an animal in need of prevention or treatment of cerebral infarction administered with a cerebral infarction preventive or therapeutic agent Of evaluating the effect of prevention or treatment of cerebral infarction in Japan.
[6] A prophylactic or therapeutic agent for cerebral infarction comprising a step of contacting a subject with a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for cerebral infarction and then measuring the protein amount of Desmoglein-2 protein in the subject Screening method.
[7] A kit for screening for cerebral infarction examination, for evaluating cerebral infarction treatment, or for a candidate compound for preventing or treating cerebral infarction, comprising a reagent capable of measuring the protein amount of Desmoglein-2 protein.
本発明によれば、脳梗塞患者の血漿中の濃度が病型の異なる患者の血漿中のその濃度と異なるDesmoglein-2蛋白質が脳梗塞検査用分子マーカー（本明細書中ではこれを「DSG-2蛋白質マーカー」と称することがある）として提供される。DSG-2蛋白質マーカーを単独で、あるいは他の脳梗塞分子マーカーと組み合わせて用いることにより脳梗塞の迅速、確実な診断、あるいは脳梗塞の病型の分類を行うことが可能となる。 According to the present invention, Desmoglein-2 protein whose plasma concentration in cerebral infarction patients is different from that in plasma of patients with different disease types is expressed as a molecular marker for cerebral infarction examination (hereinafter referred to as “DSG- 2 protein markers ”). By using the DSG-2 protein marker alone or in combination with other cerebral infarction molecular markers, it becomes possible to perform rapid and reliable diagnosis of cerebral infarction, or classification of cerebral infarction pathology.
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
（１）脳梗塞検査方法
本発明の第１は、被検動物より採取された血液試料中の、Desmoglein-2蛋白質量を測定する工程を含む、該動物における脳梗塞の検査方法である。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
(1) Cerebral infarction examination method The first of the present invention is a method for examining cerebral infarction in an animal, comprising a step of measuring the amount of Desmoglein-2 protein in a blood sample collected from the subject animal.
本明細書において、「脳梗塞」とは、脳動脈が血栓または塞栓によって閉塞し虚血状態となり、脳組織が壊死および障害される疾患であり、脳内小動脈が閉塞して発症するラクナ梗塞、脳内大動脈が粥腫で閉塞して発症するアテローム血栓性脳梗塞、心臓内の血栓が栓子となり脳内動脈を閉塞して発症する心原性脳塞栓症、上行大動脈から大動脈弓部にできた粥状硬化巣から栓子が解離して脳内動脈を閉塞して発症する塞栓症である大動脈原性脳塞栓症、主幹動脈にできたプラークが穿通枝の入口部を閉塞することによって生じる穿通枝領域の梗塞である「Branch atheromatous disease」（以下、「BAD」と称することがある）、脳血管の内膜が損傷し血液が動脈壁内に侵入して脳血管を閉塞する動脈解離のいずれをも含む。また、脳梗塞でも急性期、亜急性期、回復期（慢性期）等のいずれをも含む。 In the present specification, “cerebral infarction” is a disease in which the cerebral artery is blocked by a thrombus or embolus and becomes ischemic, and the brain tissue is necrotized and damaged, and a lacunar infarction that develops due to blocking of a small intracerebral artery. Atherothrombotic cerebral infarction caused by occlusion of intracerebral aorta due to atheroma, cardiogenic cerebral embolism caused by occlusion of intracerebral artery due to thrombosis in heart, from ascending aorta to aortic arch Aortic cerebral embolism, which is an embolism that develops when the obturator dissociates from the atherosclerotic lesion and occludes the intracerebral artery, and a plaque formed in the main artery obstructs the entrance of the penetrating branch “Branch atheromatous disease” (hereinafter sometimes referred to as “BAD”), an infarction of the penetrating branch region that occurs, arterial dissection where the intima of the cerebral blood vessel is damaged and blood enters the arterial wall to occlude the cerebral blood vessel Any of these are included. In addition, cerebral infarction includes any of acute phase, subacute phase, recovery phase (chronic phase) and the like.
本明細書においてDesmoglein-2蛋白質（以下、「DSG-2蛋白質」と称することがある）とは、本発明の検査法において血液試料中の含有量を測定する対象であるDesmoglein-2蛋白質を意味し、被検動物に由来する蛋白質であればよいが、ヒト由来の蛋白質として具体的には、下述する特定のアミノ酸配列で示される蛋白質が例示される。さらに、これらと同様の機能を有する蛋白質の断片、誘導体、および変異体も包含される。 In the present specification, Desmoglein-2 protein (hereinafter sometimes referred to as “DSG-2 protein”) means Desmoglein-2 protein, which is a target for measuring the content in a blood sample in the test method of the present invention. Any protein can be used as long as it is derived from a test animal. Specific examples of human-derived proteins include proteins represented by the specific amino acid sequences described below. Furthermore, fragments, derivatives, and mutants of proteins having the same functions as these are also included.
上記検査方法において、「被検動物」は、脳梗塞を起こす可能性のある動物であれば如何なるものでもよく、具体的には、ヒト、サル、あるいはラット等のげっ歯類等が挙げら
れる。本発明の脳梗塞の検査方法は、このうち、脳梗塞の疑いのあるヒト、あるいは脳梗塞発症後のヒト等において特に好ましく行われる。
In the above examination method, the “test animal” may be any animal that may cause cerebral infarction, and specifically includes rodents such as humans, monkeys, and rats. Of these, the method for examining cerebral infarction of the present invention is particularly preferably performed in humans suspected of having cerebral infarction, humans after onset of cerebral infarction, or the like.
また、上記被検動物から採取された「血液試料」としては、DSG-2蛋白質を含有し、その濃度を測定できるものであれば特に制限はないが、具体的には、EDTA血漿、クエン酸血漿等の血漿、血清、全血の何れでもよいが、これらのうち、EDTA血漿が簡便に採取でき、保存が容易で且つ採取量が多いため好ましく用いられる。被検動物から該血液試料を採取するために採血するタイミングは、脳梗塞の診断を行うタイミングであればいずれのタイミングでもよい。脳梗塞は、発症後刻々と症状や病態が変化するので、具体的には以下で詳述する。 The “blood sample” collected from the test animal is not particularly limited as long as it contains DSG-2 protein and can measure its concentration. Specifically, EDTA plasma, citrate Any of plasma such as plasma, serum, and whole blood may be used, but among these, EDTA plasma can be easily collected, is easily stored, and is preferably used because of its large collection amount. The timing for collecting the blood sample from the test animal may be any timing as long as the diagnosis of cerebral infarction is performed. Since cerebral infarction changes in symptoms and pathology from onset to onset, it will be described in detail below.
本発明の検査法において、被検動物から採取した血液試料中の含有量を測定する対象であるDesmoglein-2蛋白質とは、ヒトの場合には、UniProtKBのEntry Name DSG2_HUMANで示されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のデータベースなどにおいて上記Entry Nameを入力することで配列情報を得ることができる。上記アミノ酸配列はヒトのものであるが、被検動物が異なる場合には、該動物由来のホモログ蛋白質が測定対象の蛋白質となる。 In the test method of the present invention, the Desmoglein-2 protein, which is a target for measuring the content in a blood sample collected from a test animal, is composed of an amino acid sequence represented by UniProtKB Entry Name DSG2_HUMAN in the case of humans. It is a protein. For example, sequence information can be obtained by inputting the above Entry Name in a National Center for Biotechnology Information (NCBI) database or the like. The amino acid sequence is human, but when the test animal is different, a homologous protein derived from the animal becomes the protein to be measured.
上記蛋白質の血液試料中の含有量の測定方法としては、該蛋白質の含有量が測定できる方法であれば特に制限はないが、例えば、該蛋白質の抗体を用いた既存の免疫測定法や、クロマトグラフィー技術と飛行時間型質量分析（TOF-MS）を組み合わせて、クロマト担体（例：カチオン交換体、アニオン交換体、疎水性クロマト担体、金属イオンなど）に一定条件下で捕捉されるすべての成分の質量を一括して測定する方法、二次元ゲル電気泳動法等が用いられる。免疫測定法としては、酵素免疫定量法に従い定量検出する方法や、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法等で測定する方法等が好ましい。酵素免疫定量法は、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。また、イムノソルベントを用いる、enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 法を選択するのが、特に好適である。また、ELISAのうちサンドイッチ法は、操作の簡便性、経済上の利便性、とりわけ臨床検査における汎用性を考慮すると、特に好適な測定態様の一つとして挙げられる。これらの測定方法は、例えば、新生化学実験講座（日本生化学会編；東京化学同人）、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (2001))、Antibodies - A Laboratory Manual(E.Harlow, et al., Cold
Spring Harbor Laboratory(1988))等の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じて行うことができる。
The method for measuring the content of the protein in the blood sample is not particularly limited as long as the content of the protein can be measured. For example, an existing immunoassay method using an antibody of the protein or a chromatographic method. All components captured on a chromatographic carrier (eg, cation exchanger, anion exchanger, hydrophobic chromatographic carrier, metal ion, etc.) under certain conditions using a combination of holographic techniques and time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS) For example, a method of measuring the mass of the solution at once, a two-dimensional gel electrophoresis method, or the like is used. As the immunoassay, a method of quantitative detection according to an enzyme immunoassay, a method of measurement by a fluorescence immunoassay, a chemiluminescence immunoassay, or the like is preferable. The enzyme immunoassay method is a detection method using an enzyme as a labeling substance among the labeled immunoassay methods. It is particularly preferable to select an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method using an immunosolvent. Among the ELISA methods, the sandwich method is mentioned as one of the particularly preferable measurement modes in consideration of the convenience of operation, economic convenience, and general versatility in clinical examination. These measurement methods include, for example, the New Chemistry Laboratory (Edited by the Japanese Biochemical Society; Tokyo Kagaku Dojin), Molecular Cloning, A Laboratory Manual (T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (2001)), Antibodies-A Laboratory. Manual (E. Harlow, et al., Cold
It can be carried out according to the method described in a general experiment such as Spring Harbor Laboratory (1988) or the like.
上記測定を行う際に用いられる抗体等（抗体断片を含む）は、対象のDSG-2蛋白質を抗原として公知の方法によって得ることができる。ただし、対象のDSG-2蛋白質を抗原として製造されたものである必要はなく、該蛋白質と少なくとも交差反応性を示し、その含有量を測定することができるものであれば何れのものでもよい。このような免疫測定法、及びそれに用いられる抗体としては、例えばR＆D社製のMonoclonal Anti-human DSG-2 Antibody（カタログNo. MAB947）等が好ましく用いられる。 Antibodies and the like (including antibody fragments) used for the above measurement can be obtained by a known method using the target DSG-2 protein as an antigen. However, it is not necessary to be produced using the target DSG-2 protein as an antigen, and any protein may be used as long as it exhibits at least cross-reactivity with the protein and can measure its content. As such an immunoassay and the antibody used therefor, for example, Monoclonal Anti-human DSG-2 Antibody (catalog No. MAB947) manufactured by R & D is preferably used.
本発明の方法で使用する血液試料は、被検動物から採取直後のものを上記測定に用いることが好ましいが、保存したものを用いてもよい。血液試料の保存方法としては、脳梗塞検査用分子マーカー量が変化しない条件であれば特に制限は無いが、例えば０〜１０℃の凍結しない程度の低温条件、暗所条件および無振動条件下が好ましい。止むをえず凍結する場合には、深凍結などマーカー分子の分解や酸化反応等を避けられる方法が好ましい。 As a blood sample used in the method of the present invention, a blood sample immediately after being collected from a test animal is preferably used for the measurement, but a stored sample may be used. The method for storing the blood sample is not particularly limited as long as the amount of molecular marker for cerebral infarction examination does not change. For example, low temperature conditions such as 0 to 10 ° C. that do not freeze, dark conditions, and no vibration conditions. preferable. In the case of unavoidably freezing, a method capable of avoiding marker molecule decomposition, oxidation reaction, etc., such as deep freezing, is preferable.
本発明の検査方法においては、被検動物から採取された血液試料（本明細書中では、これを「検体」と称することがある）中の上記DSG-2蛋白質マーカーの含有量を測定して、
これを指標として、脳梗塞を検査することができる。また、既存の脳梗塞マーカーであるCRPやD-Dimer等の検体中含有量とを組み合わせることや、臨床症候の観察と心エコー、MRI、MRA、頚部血管エコー等の結果とを関連付けた複合指標を用いることで、より的確に検査することが可能である。
In the test method of the present invention, the content of the DSG-2 protein marker in a blood sample collected from a test animal (in the present specification, this may be referred to as “specimen”) is measured. ,
Using this as an index, cerebral infarction can be examined. In addition, it is a composite index that combines the contents of specimens such as CRP and D-Dimer, which are existing cerebral infarction markers, and links the observation of clinical symptoms with the results of echocardiography, MRI, MRA, cervical vascular echo, etc. It is possible to inspect more accurately by using.
上記脳梗塞検査用分子マーカーの検体中の含有量を指標として上記脳梗塞検査を行う場合には、適当なカットオフ値を規定して検査する方法でもよい。 When the cerebral infarction test is performed using the content of the molecular marker for cerebral infarction test in the specimen as an index, a method may be used in which an appropriate cut-off value is defined for the test.
カットオフ値とは、ある物質に着目して目的とする疾患群と非疾患群（目的とする疾患以外の群）とを判定する場合に定める値をいう。目的とする疾患と非疾患とを判定する場合に、カットオフ値以下であれば陰性、カットオフ値以上であれば陽性として、またはカットオフ値以下であれば陽性、カットオフ値以上であれば陰性として疾患を判定することができる（金井正光編、臨床検査法提要 金原出版株式会社）。 The cut-off value is a value determined when determining a target disease group and a non-disease group (a group other than the target disease) by paying attention to a certain substance. When determining the target disease and non-disease, it is negative if it is below the cut-off value, positive if it is above the cut-off value, or positive if it is below the cut-off value, and if it is above the cut-off value The disease can be determined as negative (Kanai Masamitsu, Clinical Laboratory Proposal Kanehara Publishing Co., Ltd.).
カットオフ値の臨床的有用性を評価する目的で用いられる指標としては、感度と特異度が挙げられる。ある母集団をカットオフ値を用いて判定し、疾病患者のうち、判定で陽性とされたものをａ（真陽性）、疾病患者でありながら判定で陰性とされたものをｂ（偽陰性）、疾病患者でないにも関わらず判定で陽性とされたものをｃ（偽陽性）、疾病患者でなく判定で陰性とされたものをｄ（真陰性）と表したときに、ａ／（ａ＋ｂ）で表される値を感度（真陽性率）、ｄ／（ｃ＋ｄ）で表される値を特異度（真陰性率）として表すことができる。 The index used for the purpose of evaluating the clinical usefulness of the cutoff value includes sensitivity and specificity. A certain population is determined using a cut-off value, and among the diseased patients, a (true positive) is positive in the determination, and b (false negative) is negative in the determination while being a disease patient. A / (a + b) when c (false positive) indicates that the patient is not a disease patient but is positive in the determination and d (true negative) indicates that the patient is not a disease patient and is negative in the determination. Can be represented as sensitivity (true positive rate) and d / (c + d) as specificity (true negative rate).
目的とする疾患群と非疾患群との測定値の分布は通常、一部重複する。したがって、カットオフ値を上下させることにより、感度と特異度は変化する。カットオフ値を下げることにより感度は高くなるが、特異度は低下し、カットオフ値を上げることにより感度は低くなるが、特異度は上がる。判定方法としては、感度と特異度の両者の値が高いほうが好ましい。また、感度と特異度の値が０．５を超えない判定方法は、有用とは認められない。 The distribution of measured values between the target disease group and the non-disease group usually partially overlaps. Therefore, sensitivity and specificity change by raising or lowering the cutoff value. Decreasing the cut-off value increases the sensitivity, but the specificity decreases, and increasing the cut-off value decreases the sensitivity, but increases the specificity. As a determination method, it is preferable that both sensitivity and specificity are higher. A determination method in which the values of sensitivity and specificity do not exceed 0.5 is not recognized as useful.
カットオフ値を設定する方法としては、非疾患群の分布の９５％を含む、中央からの両端のいずれかの値をカットオフ値として設定する方法、非疾患群の分布が正規分布を示す場合、平均値＋２倍の標準偏差（ＳＤ）または平均値−２ＳＤをカットオフ値として設定する方法等が挙げられる。 The method for setting the cut-off value is to set 95% of the distribution of the non-disease group as one of the values at both ends from the center as the cut-off value. When the distribution of the non-disease group shows a normal distribution And a method of setting an average value + 2 times standard deviation (SD) or an average value−2SD as a cut-off value.
また、一般に、診断方法が有用かどうかを判定するためには、前述のように設定されたカットオフ値によって感度と特異度が変化するため、単純にあるカットオフ値での感度と特異度で評価するよりも、カットオフ値を上下させたときに感度や特異度が高く保たれるような指標、例えばＲＯＣ曲線のＡＵＣ値で評価するのが望ましい。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は感度と特異度が両方１００％になるようなカットオフ値が存在する場合に１になり、診断性能が良くない場合に０．５に近づく。したがって、ある診断方法の性能をＲＯＣ曲線のＡＵＣ値で判断する場合には０．７以上であれば該方法は診断方法として適当であると評価することが可能である。本発明に記載のDSG-2蛋白質マーカーについても、ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値０．７以上であったので、後述する脳梗塞検査方法に用いられるものである。 In general, in order to determine whether or not a diagnostic method is useful, the sensitivity and specificity vary depending on the cutoff value set as described above, so the sensitivity and specificity at a certain cutoff value are simply used. Rather than evaluating, it is desirable to evaluate with an index that maintains high sensitivity and specificity when the cut-off value is raised or lowered, for example, the AUC value of the ROC curve. The AUC value of the ROC curve becomes 1 when a cutoff value exists such that both sensitivity and specificity are 100%, and approaches 0.5 when the diagnostic performance is not good. Therefore, when the performance of a certain diagnostic method is judged by the AUC value of the ROC curve, it can be evaluated that the method is suitable as a diagnostic method if it is 0.7 or more. Since the DSG-2 protein marker described in the present invention also has an ROC curve AUC value of 0.7 or more, it is used in the cerebral infarction examination method described later.
（１−１）DSG-2蛋白質マーカーを用いた脳梗塞病型検査方法
本発明のDSG-2蛋白質マーカーを用いた脳梗塞検査方法の具体的方法として、脳梗塞の病型を区別するための検査方法が挙げられる。病型とは、それ自体既知の臨床的に区別されている病型を意味し、具体的には、「アテローム血栓性脳梗塞」（本明細書中では、「アテローム血栓性」と称することがある）、「心原性脳塞栓症」（本明細書中では、「心
原性脳塞栓」と称することがある）、上行大動脈から大動脈弓部にできた粥状硬化巣から栓子が解離して脳内動脈を閉塞して発症する塞栓症である「大動脈原性脳塞栓症」、主幹動脈にできたプラークが穿通枝の入口部を閉塞することによって生じる穿通枝領域の梗塞である「Branch atheromatous disease」（以下、「BAD」と称することがある）、脳血管の内膜が損傷し血液が動脈壁内に侵入して脳血管を閉塞する動脈解離、あるいはそれらのいずれにも該当しない病型（以下、これを「分類不能型」と称することがある）が挙げられる。
(1-1) Cerebral infarction type test method using DSG-2 protein marker As a specific method of the cerebral infarction test method using the DSG-2 protein marker of the present invention, a method for distinguishing cerebral infarction type Examples include inspection methods. The disease type means a clinically distinct disease type known per se, specifically “atherothrombotic cerebral infarction” (herein referred to as “atherothrombotic”). Yes, “cardiogenic cerebral embolism” (sometimes referred to as “cardiogenic cerebral embolism” in this specification), an obturator dissociates from the atherosclerotic lesion formed from the ascending aorta to the aortic arch `` Aortic cerebral embolism '', which is an embolism that develops by blocking the intracerebral artery, is an infarction of the perforated branch region caused by a plaque formed in the main artery blocking the entrance of the perforated branch “Branch atheromatous disease” (hereinafter sometimes referred to as “BAD”), arterial dissection where the intima of the cerebrovascular is damaged and blood enters the arterial wall to occlude the cerebrovascular, or none of them Disease type (hereinafter, this may be referred to as "non-classifiable type") It is.
検体中に含まれるDSG-2蛋白質量を測定することにより脳梗塞の病型を区別するためには、まず、血液試料中のDSG-2蛋白質量において、各病型を区別し得るカットオフ値を上述の方法により決定し、検体中のDSG-2蛋白質量を該カットオフ値と比較して、いずれの病型群に入るかを判断することにより行われる。 In order to distinguish the type of cerebral infarction by measuring the amount of DSG-2 protein contained in the specimen, first, the cut-off value that can distinguish each disease type in the amount of DSG-2 protein in the blood sample Is determined by the method described above, and the amount of DSG-2 protein in the sample is compared with the cut-off value to determine which disease type group is entered.
本発明の血液試料中に含まれるDSG-2蛋白質量により区別し得る病型としては、両病型群の間でDSG-2蛋白質含有量によりお互いが区別されるカットオフ値を設定し得るものであれば特に制限はないが、具体的には、例えば、表１に示すように「アテローム血栓性脳梗塞」と「心原性脳塞栓症」、「心原性脳塞栓症」と「動脈解離」、「アテローム血栓性脳梗塞」と「分類不能型」、「大動脈原性脳塞栓症」と「BAD」、「BAD」と「分類不能型」等が挙げられる。 As a disease type that can be distinguished by the DSG-2 protein amount contained in the blood sample of the present invention, a cut-off value that can be distinguished from each other by the DSG-2 protein content between both disease type groups can be set. If there is no particular limitation, specifically, for example, as shown in Table 1, "atherothrombotic cerebral infarction" and "cardiogenic cerebral embolism", "cardiogenic cerebral embolism" and "artery “Dissociation”, “Atherothrombotic cerebral infarction” and “Classification not possible”, “Aortogenic cerebral embolism” and “BAD”, “BAD” and “Classification not possible” and the like.
これらの測定を行う場合の検体の取得のタイミングは、脳梗塞様症状の発症直後から特に制限はないが、表１に好ましいタイミングを示す。 The timing of obtaining the specimen when performing these measurements is not particularly limited immediately after the onset of cerebral infarction-like symptoms, but Table 1 shows preferred timings.
本発明の測定方法では、予め、上記の区別される病型と臨床的に判断された患者の血液試料中のDSG-2蛋白質量を測定し、上記の方法で、両病型群を区別するカットオフ値を設定する。採取された検体中の上記DSG-2蛋白質マーカーの含有量を測定して、この絶対値を、上記の方法で設定されたカットオフ値と比較することによっていずれの病型に検体を採取した被検者（動物）が含まれるかを判断することができる。臨床的に各種脳梗塞を確認する方法は特に制限がないが、例えば頭部X線CT、頭部MRI、MRA、脳血管造影、頚部血管エコー等の機器診断方法等から確認する方法等が挙げられる。 In the measurement method of the present invention, the amount of DSG-2 protein in a blood sample of a patient clinically determined as the above-mentioned distinct disease type is measured in advance, and the two disease type groups are distinguished by the above method. Set the cutoff value. The content of the DSG-2 protein marker in the collected sample is measured, and this absolute value is compared with the cutoff value set by the above method, so that the sample from which the sample was collected is collected. Whether an examiner (animal) is included can be determined. The method for clinically confirming various cerebral infarctions is not particularly limited, but examples include methods for confirming from device diagnostic methods such as head X-ray CT, head MRI, MRA, cerebral angiography, cervical vascular echo, etc. It is done.
また、上記病型の検査を行う場合には、既存の脳梗塞マーカーであるCRPやD-Dimer等の検体中含有量とを組み合わせることや、臨床症候の観察と心エコー、MRI、MRA、頚部血管エコー等の結果とを関連付けた複合指標を用いることで、より的確に検査することが可能である。 In addition, when testing for the above-mentioned disease types, it is possible to combine the contents in specimens such as CRP and D-Dimer, which are existing cerebral infarction markers, and to observe clinical symptoms and echocardiography, MRI, MRA, cervical By using a composite index that correlates results such as blood vessel echoes, it is possible to inspect more accurately.
（２）脳梗塞測定用キット
本発明は、さらに上記脳梗塞検査に用いるためのキット、あるいは下述する脳梗塞の予防もしくは治療効果の評価、あるいは脳梗塞予防もしくは治療薬のスクリーニング方法を行うためのキットも含まれる。キットの内容は、機器または試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。試薬としては、例えば、免疫測定法によりDSG-2蛋白質マーカーを測定する場合には、抗DSG-2蛋白質マーカー抗体を含む。また、必要に応じ、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、標準物質なども含まれる。生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などにＢＳＡやカゼインなどの蛋白質を含む水溶液などが挙げられる。
(2) Kit for measuring cerebral infarction The present invention further provides a kit for use in the above-described cerebral infarction examination, or evaluation of the prevention or treatment effect of cerebral infarction described below, or a screening method for a cerebral infarction prevention or treatment drug. The kit is also included. The contents of the kit are configured by a combination of equipment or reagents. However, the configuration or form of the kit is not limited as long as it includes a substance that is essentially the same as each component described below, or a substance that is essentially the same as a part thereof. Even if they are different, they are included in the kit of the present invention. Examples of the reagent include an anti-DSG-2 protein marker antibody when the DSG-2 protein marker is measured by an immunoassay. In addition, a biological sample diluent, an antibody-immobilized solid phase, a reaction buffer, a washing solution, a labeled secondary antibody or an antibody fragment thereof, a labeled detection reagent, a standard substance, and the like are also included as necessary. Examples of the diluted solution of the biological sample include an aqueous solution containing a protein such as BSA or casein in a surfactant or a buffer.
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、抗分子マーカー抗体またはそれらの抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等が挙げられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用方法等、公知の方法が挙げられる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体または抗体断片等を疎水固相化したものが挙げられる。 As the antibody-immobilized solid phase, a material in which various polymer materials are shaped to suit the application and anti-molecular marker antibodies or antibody fragments thereof are solid-phased is used. Shapes are tubes, beads, plates, fine particles such as latex, sticks, etc., and materials are polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, gelatin, agarose, cellulose, polyethylene terephthalate, etc. Polymer materials, glass, ceramics and metals. Examples of the method for immobilizing an antibody include known methods such as a physical method and a chemical method, or a combination method thereof. For example, a 96-well polystyrene immunoassay microterplate prepared by subjecting an antibody or antibody fragment to a hydrophobic solid phase can be used.
反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等を含む反応緩衝液が挙げられる。 Any reaction buffer may be used as long as it provides a solvent environment for the binding reaction between the antibody on the antibody-immobilized solid phase and the antigen in the biological sample. However, surfactants, buffers, BSA, Reaction buffers containing proteins such as casein, preservatives, stabilizers, reaction accelerators and the like can be mentioned.
標識された二次抗体またはその抗体断片としては、本発明に用いられる抗体または抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤などを混合したものが用いられる。 As the labeled secondary antibody or antibody fragment thereof, the antibody or antibody fragment used in the present invention is labeled with a labeling enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), bovine small intestine alkaline phosphatase, β-galactosidase, or a buffering agent. , BSA, casein and other proteins, preservatives and the like are used.
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリホスファターゼであれば、４−ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等が挙げられる。 As a reagent for detecting a labeled substance, for example, horseradish peroxidase according to the labeling enzyme, a substrate for absorption measurement such as tetramethylbenzidine or orthophenylenediamine, or a fluorescence such as hydroxyphenylpropionic acid or hydroxyphenylacetic acid. If the luminescent substrate such as a substrate or luminol is alkaline phosphatase, an absorbance measurement substrate such as 4-nitrophenyl phosphate, a fluorescent substrate such as 4-methylumbelliferyl phosphate, and the like can be given.
（３）脳梗塞の予防もしくは治療効果の評価方法
本発明の第２の態様は、脳梗塞の予防薬もしくは治療薬が投与された脳梗塞の予防もしくは治療を必要とする動物から採取された血液試料中のDSG-2蛋白質マーカーの量を測定する工程を含む、該動物における脳梗塞の予防もしくは治療効果の評価方法である。
(3) Method for evaluating effect of prevention or treatment of cerebral infarction The second aspect of the present invention is blood collected from an animal in need of prevention or treatment of cerebral infarction administered with a cerebral infarction preventive or therapeutic agent. A method for evaluating the effect of preventing or treating cerebral infarction in an animal, comprising a step of measuring the amount of a DSG-2 protein marker in a sample.
脳梗塞の予防もしくは治療を必要とする動物とは、具体的には、脳梗塞の症状を示すヒトあるいは（１）記載の動物（これらを単に「被検者」と称することがある）や、上記（１）の方法により脳梗塞と診断された患者等が挙げられる。 Specifically, an animal that requires prevention or treatment of cerebral infarction is a human who exhibits symptoms of cerebral infarction or an animal described in (1) (these may be simply referred to as “subjects”), Examples include patients diagnosed with cerebral infarction by the method (1) above.
脳梗塞予防もしくは治療薬とは、脳梗塞予防または治療薬として用いられているものであればいずれのものでもよいが、例えば、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベーターの等血栓溶解剤、へパリン等の抗凝固剤、サイクロオキシゲナーゼ阻害薬、フォスフォリジエステラーゼ阻害薬、スロンボキセンA2(TXA2)合成阻害薬等の抗血小板剤、フリー
ラジカルスカベンジャー等の脳保護薬等が挙げられる。
The cerebral infarction preventive or therapeutic agent may be any as long as it is used as a cerebral infarction preventive or therapeutic agent. For example, thrombolytic agents such as urokinase and tissue plasminogen activator, antiparin such as heparin, etc. Examples include anticoagulants such as coagulants, cyclooxygenase inhibitors, phosphodiesterase inhibitors, thromboxen A2 (TXA2) synthesis inhibitors, and brain protective agents such as free radical scavengers.
脳梗塞の予防薬もしくは治療薬が投与された脳梗塞の予防もしくは治療を必要とする動物から採取された血液試料におけるDSG-2蛋白質マーカー量が、投与前の量に比べて増加又は減少するか、あるいは、脳梗塞を発症していない対照の動物における量に近づいた場合、予防または治療効果があったと判定することができる。 Whether the amount of DSG-2 protein marker in blood samples collected from animals in need of prevention or treatment of cerebral infarction administered cerebral infarction preventive or therapeutic agent is increased or decreased compared to the amount before administration Alternatively, when approaching the amount in a control animal that does not develop cerebral infarction, it can be determined that there was a prophylactic or therapeutic effect.
病型により治療する脳梗塞予防もしくは治療薬が異なるため、DSG-2蛋白質マーカーで病型診断を行えば患者に対して適切な治療を施すことが可能となる。例えば、ラクナ梗塞と診断されればスロンボキセンA2(TXA2)合成阻害薬で治療を行い、サイクロオキシゲナーゼ阻害薬で脳梗塞の再発を予防できる。 Since the cerebral infarction preventive or therapeutic agent to be treated varies depending on the disease type, it is possible to appropriately treat the patient if the disease type is diagnosed with the DSG-2 protein marker. For example, if a lacunar infarction is diagnosed, it can be treated with a thromboxen A2 (TXA2) synthesis inhibitor and a cyclooxygenase inhibitor can prevent recurrence of cerebral infarction.
（４）脳梗塞予防もしくは治療薬のスクリーニング方法
本発明の第３の態様は、被検体と脳梗塞の予防薬もしくは治療薬の候補化合物を接触させた後、該被検体の血液試料中のDSG-2蛋白質マーカー量を測定する工程を含む、脳梗塞の予防もしくは治療薬のスクリーニング方法である。
(4) Screening method for cerebral infarction preventive or therapeutic agent The third aspect of the present invention is a method for contacting a subject with a candidate compound for a prophylactic or therapeutic agent for cerebral infarction and then DSG in a blood sample of the subject. -2 A screening method for a prophylactic or therapeutic agent for cerebral infarction, comprising a step of measuring the amount of a protein marker.
被検体とは、DSG-2蛋白質マーカーの含有量が、脳梗塞状態と同様の異常を示す非ヒト動物個体、組織、細胞等が用いられる。脳梗塞の症状を有する動物としては、例えば、外科的手法等で脳梗塞状態を形成させた脳梗塞モデル非ヒト動物（Yuji Kuge, Kazuo Minematsu et al. Nylon Monofilament for Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion
in Rats. Stroke, 26, 1655 (1995)）等が挙げられる。被検体とともに、対照として被検体と同種の個体、組織、細胞等でDSG-2蛋白質マーカーの含有量が、健常状態と同様（正常）であるものを用いることも好ましい。
DSG-2蛋白質マーカーをもとに、脳梗塞状態の非ヒト動物個体でヒトにおけるある病型に類似した病態を構築できれば、ある病型の脳梗塞患者における治療薬を開発するための実験系を確立することができる。
As the subject, a non-human animal individual, tissue, cell or the like in which the content of the DSG-2 protein marker exhibits an abnormality similar to that of the cerebral infarction state is used. Examples of animals having cerebral infarction include non-human cerebral infarction models in which cerebral infarction is formed by a surgical technique or the like (Yuji Kuge, Kazuo Minematsu et al. Nylon Monofilament for Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion
in Rats. Stroke, 26, 1655 (1995)). In addition to the subject, it is also preferable to use an individual, tissue, cell, etc. of the same kind as the subject that has a DSG-2 protein marker content similar to that in the normal state (normal) as a control.
Based on the DSG-2 protein marker, an experimental system for developing a therapeutic drug for a patient with cerebral infarction can be established if a non-human animal with cerebral infarction can construct a pathology similar to that in human. Can be established.
これらの被検体に接触させる脳梗塞予防もしくは治療薬候補化合物（以下、「候補化合物」と称することがある）としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、低分子合成化合物などが挙げられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、これらの化合物を含む、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などでもよい。
その投与量、投与方法、処理時間等は、用いる被検体に従って適宜選択すればよい。
Examples of candidate compounds for preventing or treating cerebral infarction (hereinafter sometimes referred to as “candidate compounds”) to be brought into contact with these subjects include peptides, proteins, non-peptidic compounds, low-molecular synthetic compounds, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds. Moreover, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like containing these compounds may be used.
The dose, administration method, treatment time and the like may be appropriately selected according to the subject to be used.
候補化合物と接触させた後に、該被検体中のDSG-2蛋白質マーカーの含有量を測定する方法としては、各被検体に適した方法により行うことができる。例えば、被検体が細胞の場合には、公知の方法に従って細胞抽出液に調製し、これを試料として用いてもよいし、細胞を培養プレートやスライドグラス上に固定化し、これを試料として用いてもよい。例えば、細胞抽出液を調製してこれを試料とする場合には、ELISA法等により検出を行うことができる。これらの試料は、検出の結果得られた数値を正確に比較・解析
できるように、あらかじめ抽出に用いる細胞数をそろえるか、精製されたRNA量又は抽出された蛋白質量をそろえることが好ましい。
候補化合物と接触させた被検体におけるDSG-2蛋白質マーカーの量が、接触前の量に比べて増加、又は減少するか、あるいは、対照の被検体における量に近づいた場合、該候補化合物は脳梗塞の予防または治療効果を有すると判定することができる。
The method for measuring the content of the DSG-2 protein marker in the specimen after contacting with the candidate compound can be carried out by a method suitable for each specimen. For example, when the subject is a cell, it may be prepared as a cell extract according to a known method and used as a sample, or the cell may be immobilized on a culture plate or a slide glass and used as a sample. Also good. For example, when a cell extract is prepared and used as a sample, detection can be performed by ELISA or the like. It is preferable that these samples have the same number of cells used for extraction, or the amount of purified RNA or the amount of extracted protein so that the numerical values obtained as a result of detection can be compared and analyzed accurately.
If the amount of the DSG-2 protein marker in the subject contacted with the candidate compound is increased or decreased compared to the amount before contact, or approaches the amount in the control subject, the candidate compound is It can be determined that it has an effect of preventing or treating infarction.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ DSG-2蛋白質マーカーを用いた脳梗塞病型を判別するための検査方法の評価
脳梗塞の各病型に診断が確定している患者、具体的には、「アテローム血栓性脳梗塞」（表中では、「アテローム血栓性」と称する）、「心原性脳塞栓症」（表中では、「心原性脳塞栓」と称する）、「大動脈原性脳塞栓症」（表中では、「大動脈原性脳塞栓」と称する）、「Branch atheromatous disease」（表中では「BAD」と称する）、「動脈解離」（表中では、「動脈解離」と称する）、あるいはそれらのいずれにも該当しない病型（表中では「分類不能型」と称する）の患者について、脳梗塞発症直後（表中「DAY0」と記載されている）、発症7日後（表中「DAY7」と記載されている）の時点で採血を行い（それぞれ表２中に記載の人数）からそれぞれEDTA血漿を取得した。R＆D社のMonoclonal Anti-human DSG-2 Antibody（カタログNo. MAB947）、R＆D社のBiotinylated Anti human DSG-2 Antibody（カタログNo. BAF947）、及びR&D社のRecombinant Human DSG-2/Fc Chimera（カタログNo. 947-DM）を用いた免疫測定法により、EDTA血漿中のDSG-2蛋白質濃度を測定した。具体的には標準品であるDSG-2蛋白質を用いて検量線を作成し、この検量線からDSG-2蛋白質の濃度を算出した。
Example 1 Evaluation of Test Method for Discriminating Cerebral Infarction Type Using DSG-2 Protein Marker Patients with confirmed diagnosis for each type of cerebral infarction, specifically, “Atherothrombotic cerebral infarction (Referred to in the table as “atherothrombotic”), “cardiogenic cerebral embolism” (referred to as “cardiogenic cerebral embolism” in the table), “aortogenic cerebral embolism” (in the table In this case, it is called “aortic cerebral embolism”), “Branch atheromatous disease” (referred to as “BAD” in the table), “arterial dissection” (referred to as “arterial dissection” in the table), or any of them For patients with a disease type that does not fall under (also referred to as “Classification not possible” in the table), immediately after the onset of cerebral infarction (indicated as “DAY0” in the table), 7 days after onset (indicated as “DAY7” in the table) EDTA plasma was collected from each (number of people listed in Table 2). It was. R & D Monoclonal Anti-human DSG-2 Antibody (Catalog No. MAB947), R & D Biotinylated Anti human DSG-2 Antibody (Catalog No. BAF947), and R & D Recombinant Human DSG-2 / Fc Chimera (Catalog No. 947-DM) was used to measure DSG-2 protein concentration in EDTA plasma. Specifically, a standard curve was prepared using the standard DSG-2 protein, and the concentration of the DSG-2 protein was calculated from this standard curve.
次に各採血時点において判別性能を評価するために、Fawcett, T. (2004) ROC Graphs:
Notes and Practical Considerations for Researchers に記載の方法に従い ROC 曲線の AUC 値を算出した。その結果を表２に示す。それぞれの採血時点において、0.7を上回ったものが目的の疾患とそれ以外の疾患の判別をするための検査方法として有用であることが示される。
Next, Fawcett, T. (2004) ROC Graphs:
The AUC value of the ROC curve was calculated according to the method described in Notes and Practical Considerations for Researchers. The results are shown in Table 2. At each blood sampling time, a value exceeding 0.7 is shown to be useful as a test method for discriminating between the target disease and other diseases.
つまり、発症直後の各病型患者の血漿中のDSG-2蛋白質の濃度を比較することにより、「アテローム血栓性脳梗塞」と「心原性脳塞栓症」の病型の脳梗塞患者を判別するための検査を行うことができ、また、同じ比較において「心原性脳塞栓症」と「動脈解離」の病型の脳梗塞患者の判別をするための検査を行えることがわかった。 In other words, by comparing the concentrations of DSG-2 protein in the plasma of patients with each type of disease immediately after the onset of disease, patients with cerebral infarction with the types of "Atherothrombotic cerebral infarction" and "Cardiogenic cerebral embolism" are distinguished In the same comparison, it was found that a test for distinguishing between “cardiogenic cerebral embolism” and “arterial dissection” cerebral infarction patients can be performed.
また、発症後7日目の各病型患者の血漿中のDSG-2蛋白質の濃度を比較することにより、「アテローム血栓性脳梗塞」と「分類不能型脳梗塞」の病型の脳梗塞患者を判別するための検査を行うことができ、また、同じ比較において、「大動脈原性脳塞栓症」と「Branch
atheromatous disease」の病型の脳梗塞患者の判別、及び「Branch atheromatous disease」と「分類不能型脳梗塞」の病型の脳梗塞患者の判別をするための検査が行えることがわかった。
In addition, by comparing the concentration of DSG-2 protein in the plasma of each patient on the 7th day after the onset of symptoms, patients with cerebral infarction with the disease types of “Atherothrombotic cerebral infarction” and “Unclassifiable cerebral infarction” In the same comparison, “aortic cerebral embolism” and “Branch”
It was found that tests can be performed to discriminate between cerebral infarction patients with the disease type of “atheromatous disease” and cerebral infarction patients with the disease types of “Branch atheromatous disease” and “non-classifiable cerebral infarction”.
本発明の方法によれば脳梗塞の診断の検査や治療・予防効果の評価を行うことができ、医療や診断の分野で有用である。また、本発明の方法によれば脳梗塞の治療・予防薬をスクリーニングすることができ、医薬分野でも有用である。 According to the method of the present invention, diagnosis of cerebral infarction and evaluation of therapeutic / preventive effects can be performed, which is useful in the medical and diagnostic fields. Moreover, according to the method of the present invention, a therapeutic / prophylactic agent for cerebral infarction can be screened, which is also useful in the pharmaceutical field.
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| WO2015165392A1 (en) * | 2014-04-30 | 2015-11-05 | Asclepiumm Taiwan Co., Ltd. | Use of peptide for treating angiogenesis-related diseases |
| WO2023081674A1 (en) * | 2021-11-02 | 2023-05-11 | Arvada Therapeutics, Inc. | Dsg2 compositions and methods |
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