JP2012105645A - Egfrエクソン21l858r遺伝子多型検出用プライマー及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定塩基配列の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、10〜50塩基長である下記P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも1種含むEGFRエクソン21 L858Rの遺伝子変異を検出するための多型検出用プライマーセット:(P1)特定塩基配列に相補的な塩基がCであるオリゴヌクレオチドであって、前記P2オリゴヌクレオチドのTm値と比較して高いTm値を示すか、又は前記P2オリゴヌクレオチドよりも1塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、(P2)特定塩基配列の塩基に相補的な塩基がAであるオリゴヌクレオチド、及び当該プライマーセットを用いてEGFRエクソン21の多型を検出する多型検出方法。
【選択図】なし
Description
このため、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤を使用するに際して、その効果を予測するために予測因子の探索が試みられ、EGFR遺伝子変異が重要な因子であることが見出されてきた。このような予測因子として、EGFRエクソン20のコドン790における変異(T790M)(特許文献1、非特許文献1)、エクソン18のコドン719における変異(G719X)などが知られている(非特許文献1)。
EGFRエクソン21L858Rを検出する技術としては、ダイレクトシークエンス法による検出(非特許文献2)又は、SMAP(SMart-Abplification Process) 法による検出方法(非特許文献3)が知られている。
本発明は上記課題を意図してなされたものである。本発明は、EGFRエクソン21の多型を簡便且つ高感度に検出可能なプローブ及びその用途を提供する。
[1]配列番号1の172792番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、塩基配列が10〜50塩基長である下記P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも1種含むEGFRエクソン21の多型を検出するための多型検出用プライマーセット:
(P1)配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基がCであるオリゴヌクレオチドであって、前記P2オリゴヌクレオチドのTm値と比較して高いTm値を示すか、又は前記P2オリゴヌクレオチドよりも1塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、
(P2)配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基がAであるオリゴヌクレオチド。
[2] 前記P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号1の172792番目の塩基の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも1つ有する[1]に記載の多型検出用プライマーセット。
[3] 前記P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号1の172792番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない塩基を有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の5’末端に位置する連続した2〜10塩基の付加配列である[1]又は[2]に記載の多型検出用プライマーセット。
[4] 前記P1オリゴヌクレオチド及び前記P2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号1の172792番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも1つ有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖中に配置された1塩基又は連続した2〜20塩基のミスマッチ塩基である[1]〜[3]のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
[5] 前記P1オリゴヌクレオチド及び前記P2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基を、3’末端側から1〜3番目のいずれかの位置に有する[1]〜[4]のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
[6] 前記P1オリゴヌクレオチドのTm値が、前記P2オリゴヌクレオチドのTm値より0.1℃〜20℃高い[1]〜[5]のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
[7] 前記P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドの鋳型となる配列番号1に示す塩基配列の領域よりも5’末端側となる領域に対する相補配列に相補的なプライマーを更に含む[1]〜[6]のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
[8] 配列番号2〜配列番号11で示されるP1オリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、配列番号12〜配列番号21で示されるP2オリゴヌクレオチドの少なくとも1つを含む[1]〜[7]のいずれかに記載の多型検出用プライマーセット。
[9] 前記[1]記載のP1オリゴヌクレオチドのみからなるEGFRエクソン21の多型を検出するための多型検出用プライマー。
[10] 配列番号1の172792番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも1つ有する[9]記載の多型検出用プライマー。
[11] 配列番号1の172792番目の塩基を相補する塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない1つ以上の塩基を有し、前記相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の5’末端に位置する連続した3〜10塩基の付加配列及びオリゴヌクレオチド鎖中に配置された1塩基又は連続した2〜20塩基のミスマッチ塩基の少なくとも一方である[9]又は[10]記載の多型検出用プライマー。
[12] 配列番号1に示す塩基配列の172792番目に相補的な塩基を、3’末端側から1〜3番目のいずれかの位置に有する[9]〜[11]のいずれかに記載の多型検出用プライマー。
[13] (I) 核酸試料と、前記P1オリゴヌクレオチド及び前記P2オリゴヌクレオチドを含む[1]〜[8]のいずれかに記載の多型検出用プライマーセットとを接触させ、前記核酸試料中の核酸配列を鋳型として増幅を行うこと、(II) EGFRエクソン21の多型を検出可能な多型検出用プローブ及び、前記増幅により得られた一本鎖増幅核酸配列を接触させて、該一本鎖増幅核酸配列と該プローブとのハイブリッドを得ること、(III) 前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、(IV) 前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるTm値を評価すること、及び、(V) 前記Tm値に基づいて、EGFRエクソン21L858Rの存在またはEGFRエクソン21L858Rを有する核酸配列の存在比を評価することと、を含む、EGFR遺伝子における多型検出方法。
[14] 前記増幅を行うことと前記ハイブリッドを得ることを同時に行う[13]のいずれかに記載の多型検出方法。
[15] [13]又は[14]の記載の多型検出方法によりEGFR遺伝子における多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を評価すること、を含むEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法。
[16] 配列番号2〜配列番号11で示されるP1オリゴヌクレオチド及び、配列番号12〜配列番号21で示されるP2オリゴヌクレオチドのいずれかである[13]又は[14]の多型検出用方法に用いられる多型検出用プライマー。
[17] [1]〜[8]のいずれか記載のプライマーセットを含むEGFR遺伝子における多型を検出するための試薬キット。
[18] さらに、EGFRエクソン21 L858Rを検出可能なプローブを含む[17]記載の試薬キット。
本発明のプライマーセットは、配列番号1の172792番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、塩基配列が10〜50塩基長である下記P1及びP2オリゴヌクレオチドであるEGFRエクソン21の多型を検出するための多型検出用プライマーセットである:
(P1)配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基がCであるオリゴヌクレオチドであって、前記P2オリゴヌクレオチドのTm値と比較して高いTm値を示すか、又は前記P2オリゴヌクレオチドよりも1塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、
(P2)配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基がAであるオリゴヌクレオチド。
本明細書では、配列番号1に示す塩基配列の172792番目の位置を、特に「変異部位」という。また、本明細書において「鋳型核酸配列」とは、核酸増幅を行う際にプライマーが鋳型としてアニーリングする配列番号1に示す塩基配列の一部を意味する。
また、本明細書における数値範囲の表示は、当該数値範囲の下限値として表示される数値を最小値として含み、当該数値範囲の上限値として表示される数値を最大値として含む範囲を示す。
組成物中のある成分の量について言及する場合において、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
本発明におけるプライマーセットは、少なくとも1種の変異型プライマーのP1オリゴヌクレオチドと少なくとも1種の野生型プライマーのP2オリゴヌクレオチドで構成される。
P1オリゴヌクレオチドは、配列番号1の172792番目(変異部位)の塩基を含む領域を鋳型として増幅を行うことが可能であると共に、塩基配列が10〜50塩基長であり、配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基がCであるオリゴヌクレオチドである。
P2オリゴヌクレオチドは、配列番号1の172792番目(変異部位)の塩基を含む領域を鋳型として増幅を行うことが可能であると共に、塩基配列が10〜50塩基長であり、配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基がAであるオリゴヌクレオチドである。
Tm値に関する相関関係と塩基長に関する相関関係とは、いずれか一方の相関関係が満たされていればよく、これらの両方が満たされていてもよい。
なお、このような変異部位以外の相補的でない塩基の、オリゴヌクレオチドにおける挿入又は追加位置、塩基数、塩基の種類、等を選択することによって、当該オリゴヌクレオチドのTm値又は塩基長を調整することが可能であるため、当該塩基はP1オリゴヌクレオチドとP2オリゴヌクレオチドのいずれに配置されてもよく、双方に配置されてもよい。
P1オリゴヌクレオチドをP2オリゴヌクレオチドよりも長く設定する場合、両者の長さの差は、特に制限されない。1塩基〜20塩基であり得、好ましくは1塩基〜10塩基であってもよく、より好ましくは1塩基〜5塩基であってもよい。
P1オリゴヌクレオチドの長さを長くするために追加される塩基は、配列番号1に示す塩基配列に相補的であってもよく、対応しないものであってもよい。配列番号1に示す塩基配列に相補的でない塩基の場合には、後述する付加配列に連続していてもいなくてもよい。
例えば、上述したTm値における関係又は塩基長における関係を妨げない限り、各オリゴヌクレオチドは、後述するように、部分的に相補的な配列又は部分的にミスマッチ塩基を有する配列であることが好ましい。このような配列を用いた場合には、例えば、変異の検出感度を高めると共に擬陽性を低く抑制できる。
P1オリゴヌクレオチドとP2オリゴヌクレオチドにそれぞれ付加され得る付加配列は、上述の通り、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない3〜10塩基であってもよく、4〜9塩基であることが好ましく、5〜7塩基であることがより好ましい。この付加配列を5’末端に有することによって、例えば、感度を向上させると共に、各オリゴヌクレオチドが互いの鋳型核酸配列にアニールすることを効果的に抑制されて、又は増殖効率を高くすることができる。また、付加配列をこの範囲の長さにすることで、例えば、擬陽性を抑制でき、又は増幅効率を高めることができる。
このようなミスマッチ塩基の総数は、それぞれのオリゴヌクレオチドを構成する塩基の配列によって異なるが、10個以下であることが好ましく、5個以下であることがより好ましく、3個以下であることが更に好ましい。この程度のミスマッチ塩基の数であれば、例えば、検出感度を高くする又は擬陽性を抑制できるという利点を有する。
なお、ミスマッチ塩基の種類としては、配列番号1に示す塩基配列に対応していない塩基であればよく、特に制限はないが、一般に、比較的結合力が弱い「A」又は「T」であることが好ましい。「A」又は「T」とすることによって、例えば、擬陽性を抑制することができる。
P1オリゴヌクレオチドとP2オリゴヌクレオチドの組み合わせとしては、例えば、以下の組み合わせが挙げられる。中でも、同一長さの付加配列と、異なる位置のミスマッチ塩基を共に含むNo.5〜No.7の組み合わせが、例えば感度及び擬陽性出現の抑制などの観点から好ましい。
P1オリゴヌクレオチドとP2オリゴヌクレオチドは共に、配列番号1に示す塩基配列に対して、所謂リバース側のプライマーを構成する。このため、Fプライマーは、所謂フォワード側のプライマーを構成し、P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドに対する対のプライマーとして作用する。
また、本発明におけるEGFRエクソン21多型検出用プライマーは、上述したプライマーセットにおける前記P1オリゴヌクレオチド及び前記P2オリゴヌクレオチドのいずれか一方のみを含むものである。このプライマーは、各オリゴヌクレオチドは、1種のみオリゴヌクレオチドを有してもよく、例えば、長さ、ミスマッチ塩基の位置、GC含量などが異なる2種以上のオリゴヌクレオチドを含むものであってもよい。
多型検出用プライマーとしてのP1オリゴヌクレオチド又はP2オリゴヌクレオチドについては、個々のオリゴヌクレオチドに関して前述した事項を、そのまま適用可能である。
本発明におけるEGFR遺伝子の多型検出方法は、(I) 核酸試料と、前記プライマーセットとを接触させ、前記核酸を鋳型として増幅を行うこと、
(II) EGFRエクソン21の多型を検出可能なプローブと、前記増幅により得られた一本鎖核酸とを接触させて、該一本鎖核酸と該プローブとのハイブリッドを得ること、
(III) 前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、
(IV) 前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるTmを評価すること、及び、
(V) 前記Tmに基づいて、EGFRエクソン21L858Rの存在を確認することまたはEGFRエクソン21L858Rを有する核酸配列の存在比を評価することと、
を含む。
本多型検出方法では、P1オリゴヌクレオチドとP2オリゴヌクレオチドとを含む前記プライマーセットを同一試料に対して用いることにより、変異型配列を有する核酸が優先的に増幅される。増幅で得られた核酸は、検出用プローブを使用したハイブリダイゼーション工程並びに、Tm値による評価工程及び多型の評価工程に付される。これにより、試料中の核酸における変異型配列を有する核酸の割合が少量であっても、変異型配列を有する核酸が優先的に増幅され、感度よく変異型配列を有する核酸を検出し、多型の確認及び/又は評価を行うことができる。
前記反応系におけるアルブミンの添加割合は、例えば、0.01〜2重量%の範囲であり、好ましくは0.1〜1重量%であり、より好ましくは0.2〜0.8重量%である。前記アルブミンとしては、特に制限されない。例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられる。これらはいずれか1種類でもよいし2種類以上を併用してもよい。
このような各プライマーの添加割合及びプライマーの添加量比とした場合には、例えば、感度を高めることができ、また擬陽性を抑制することができる。
このようなFプライマーの添加割合及びプライマーの添加量比とした場合には、例えば、感度を高めることができる。
前記反応液中のDNAポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
溶媒としては、例えば、Tris−HCl、Tricine、MES、MOPS、HEPES、CAPS等の緩衝液が挙げられ、市販のPCR用緩衝液やPCRキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。また、PCR反応液には、更に、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、KCl、MgCl2、MgSO4等を含んでいてもよい。
ここで用いられるEGFRエクソン21の多型を検出可能なプローブは、配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基(変異部位)に対応する塩基を含む領域の核酸配列、又は、この核酸配列に相補的な配列に対してハイブリダイズ可能な配列を有すればよい。
プローブの長さには、特に制限はないが、5〜50merであることが好ましく、10〜30merであることがより好ましい。プローブの長さがこのような範囲であれば、例えば検出感度を高めることができる。
また、多型検出用プローブを増幅工程でプライマーと共に存在させて使用する場合には、DNAポリメラーゼの反応対象となってプローブ自体の伸長を予防するために、3’末端側に後述する蛍光標識が付加されているか、プローブの3’末端に更にリン酸基が付加されていることが好ましい。
標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、蛍光色素および蛍光団が挙げられる。前記標識化プローブの具体例としては、蛍光色素で標識され、単独(相補配列にハイブリダイズしていないとき)で蛍光を示し且つハイブリッド形成(相補配列にハイブリダイズしているとき)により蛍光が減少(例えば、消光)するプローブが挙げられる。
このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のCが、前記検出目的配列におけるGに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる(蛍光強度が減少する)という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。また、前記標識物質は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
反応系における多型検出用プローブの添加割合は、特に制限されない。例えば、前記プローブを10nmol/L〜400nmol/Lの範囲となるように添加することが好ましく、20nmol/L〜200nmol/Lであることがより好ましい。
例えば、解離における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、85℃〜95℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、1秒〜10分であり、好ましくは1秒〜5分である。また、解離した一本鎖核酸と多型検出用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば、40℃〜50℃である。
なお、ここで「一本鎖増幅核酸」の範囲には、試験対象となっている当初の核酸試料における一本鎖核酸も包含される。
前記増幅一本鎖核酸と多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値の測定は、260nmの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であることが好ましい。標識物質のシグナル測定とすることによって、例えば検出感度を高めることができる。
Tm値測定工程で得られたTm値からは、EGFRエクソン21L858Rに相当する配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基の種類、すなわち、変異型または野生型等の遺伝子型を決定する。Tm解析において、完全に相補であるハイブリッド(マッチ)は、―塩基が異なるハイブリッド(ミスマッチ)よりも、解離を示すTm値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのTm値と、一塩基が異なるハイブリッドのTm値とを決定しておくことにより、目的の塩基部位における遺伝子型を決定することができる。
まず、例えば、野生型の核酸Wtと変異型の核酸Mtとの2種類の核酸の存在比を各々異ならせた複数の核酸混合物を作製し、複数の核酸混合物の各々について、融解曲線解析装置を用いて融解曲線を得る。
図1(A)に、ある1つの核酸混合物の温度と吸光度または蛍光強度等の検出信号との関係で表された融解曲線、及び同図(B)に温度と検出信号の微分値との関係で表された融解曲線(微分融解曲線ともいう)を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Wtの融解温度TmW及び核酸Mtの融解温度TmMを検出して、TmW及びTmMを含む温度範囲の各々を設定する。
なお、温度範囲ΔTW及び温度範囲ΔTMは、同一の幅(例えば、10℃)または異なる幅(例えば、温度範囲ΔTWが10℃、温度範囲ΔTMが7℃)となるように設定してもよい。また、温度範囲ΔTW及び温度範囲ΔTMは、それぞれの融解温度TmからプラスX℃、マイナスX℃の幅(X℃は例えば15℃以内、望ましくは10℃以内)というように設定してもよい。
+・・・+{f(Te−1)−B(Te−1)} ・・・(1)
ただし、Tsは各温度範囲における下限値、Teは上限値である。また、各温度Tにおけるベース値B(T)は、下記(2)式により求まる値であり、検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を検出信号の微分値から減算することにより、検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
ただし、a={f(Te)−f(Ts)}/(Te−Ts) である。
本発明のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法は、前記多型検出方法によりEGFR遺伝子における多型を検出すること(遺伝子多型検出工程)、及び、前記検出結果に基づいてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を評価すること(薬効評価工程)、を含む。
前記多型検出方法では、本発明におけるEGFRエクソン21の多型を検出するための多型検出用プライマーセットを用いて、感度よく且つ簡便にEGFRエクソン21L858Rを検出するので、EGFRエクソン21におけるこの多型に基づいてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の評価を感度よく且つ簡便に行うことができる。
EGFRチロシンキナーゼは、EGFRエクソン21における多型によって反応性が異なることが知られている。具体的には、EGFR遺伝子が野生型である場合には、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による腫瘍縮小効果が期待できると評価することができる。
このように、前記EGFRチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法を適用することによって、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤の効果に対する予測を、信頼性高く且つ簡便に行うことができる。
本発明のEGFR遺伝子における多型を検出するためのキットは、前記P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを含む。
このキットには、EGFR遺伝子における多型を簡便にかつ感度よく検出するために使用可能な上述したプライマーセットが含まれるので、EGFR遺伝子における多型の検出をより簡便に行うことができる。
Fプライマーは、プライマーセットとは、異なる容器に含まれていてもよく、同一の容器に含まれていてもよい。
多型検出用プローブは、プライマーセットとは、異なる容器に含まれていてもよく、同一の容器に含まれていてもよい。
[実施例1]
EGFRエクソン21の多型を検出するために、配列番号1の172643〜172941番目の塩基配列で、172792番目の塩基がGまたはTである塩基配列を含むプラスミドを、上記塩基配列以外の部位で制限酵素処理し、リニアライズしたものを準備した。得られたプラスミド、即ち、配列番号1に示される塩基配列の172792番目の塩基が「G」である変異型プラスミド(以下、「mt」という)と、配列番号1に示される塩基配列の172792番目の塩基が「T」である野生型プラスミド(以下、(以下、「wt」という)を、所定の割合で混合し、複数の核酸試料を調製した。この複数の核酸試料におけるmt含有割合は、それぞれ、3%、1%及び0%とした。
面積比=(mtの鋳型とプローブが結合・解離することにより得たピークの面積)/(Wtの鋳型とプローブが結合・解離することにより得たピークの面積)
変異型プライマーと野生型プライマーを表5に示される組み合わせに変更した以外は、実施例1と同様にして、実施例2〜8のプライマーセットによる多型検出を行った。結果を表5に示す。
比較例1
野生型プライマーを使用せず、変異型プライマーのみを用いて処方を水の量で調整した以外は、実施例1と同様にして多型検出を行った。結果を表5に示す。
特に、付加配列に加えてミスマッチ変異も有する変異型プライマーを、野生型プライマーと共に用いることによって(実施例5〜7)、mt0%における擬陽性を抑えることができ、EGFRエクソン21L858Rの検出において、感度に加えて擬陽性抑制も良好であることがわかる。
実施例5のプライマーセットを用いて、mt0%、0.1%、0.3%及び1%の試料に対する多型検出を行った。
実施例1で作成した各プラスミド混合物を鋳型核酸として、鋳型核酸5,000コピー/μL(20,000copy/test)のものを使用し、かつ、実施例5のプライマーセットを用いた。全自動SNPs検査装置(i−densy、アークレイ社製)と、DNAポリメラーゼを含有するi−densy Pack UNIVERSAL(アークレイ社製)を用いてPCR及びTm解析を行った。PCR反応条件及びTm解析条件は、評価例1と同様としてTm値解析を行った。Tm値解析により得られたグラフを図3〜6に示す。なお、図3〜図6において縦軸は蛍光強度の温度微分値、横軸は温度をそれぞれ示す。
図3〜図6に示されるように、実施例5のプライマーセットを用いて多型検出を行うと、60℃付近の変異型のピークがmt含有量に応じた大きさのピークとして確認できる。従って、実施例5のプライマーセットを用いることによって、mt含量1%以下であっても変異型の存在比に応じた感度で多型を検出することができることがわかる。
Claims (18)
- 配列番号1の172792番目の塩基を含む領域を鋳型として増幅可能であると共に、塩基配列が10〜50塩基長である下記P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドをそれぞれ少なくとも1種含むEGFRエクソン21の多型を検出するための多型検出用プライマーセット:
(P1)配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基がCであるオリゴヌクレオチドであって、前記P2オリゴヌクレオチドのTm値と比較して高いTm値を示すか、又は前記P2オリゴヌクレオチドよりも1塩基以上長いオリゴヌクレオチド、及び、
(P2)配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基がAであるオリゴヌクレオチド。 - 前記P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号1の172792番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも1つ有する請求項1記載の多型検出用プライマーセット。
- 前記P1オリゴヌクレオチド及びP2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号1の172792番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない塩基を有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の5’末端に位置する連続した2〜10塩基の付加配列である請求項1又は請求項2記載の多型検出用プライマーセット。
- 前記P1オリゴヌクレオチド及び前記P2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号1の172792番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも1つ有し、当該相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖中に配置された1塩基又は連続した2〜20塩基のミスマッチ塩基である請求項1〜請求項3のいずれか1項記載の多型検出用プライマーセット。
- 前記P1オリゴヌクレオチド及び前記P2オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基を、3’末端側から1〜3番目のいずれかの位置に有する請求項1〜請求項4のいずれか1項記載の多型検出用プライマーセット。
- 前記P1オリゴヌクレオチドのTm値が、前記P2オリゴヌクレオチドのTm値より0.1℃〜20℃高い請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の多型検出用プライマーセット。
- 前記P1オリゴヌクレオチド又はP2オリゴヌクレオチドの鋳型となる配列番号1に示す塩基配列の領域よりも5’末端側となる領域に対する相補配列に相補的なプライマーを更に含む請求項1〜請求項6のいずれか1項記載の多型検出用プライマーセット。
- 配列番号2〜配列番号11で示されるP1オリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、配列番号12〜配列番号21で示されるP2オリゴヌクレオチドの少なくとも1つを含む請求項1〜請求項7のいずれか1項記載の多型検出用プライマーセット。
- 請求項1記載のP1オリゴヌクレオチドのみからなるEGFRエクソン21の多型を検出するための多型検出用プライマー。
- 配列番号1の172792番目の塩基に相補的な塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない塩基を少なくとも1つ有する請求項9記載の多型検出用プライマー。
- 配列番号1の172792番目の塩基を相補する塩基以外の位置に、配列番号1に示す塩基配列と相補的でない1つ以上の塩基を有し、前記相補的でない塩基が、オリゴヌクレオチド鎖の5’末端に位置する連続した3〜10塩基の付加配列及びオリゴヌクレオチド鎖中に配置された1塩基又は連続した2〜20塩基のミスマッチ塩基の少なくとも一方である請求項9又は請求項10記載の多型検出用プライマー。
- 配列番号1に示す塩基配列の172792番目の塩基に相補的な塩基を、3’末端側から1〜3番目のいずれかの位置に有する請求項9〜請求項11のいずれか1項記載の多型検出用プライマー。
- (I) 核酸試料と、前記P1オリゴヌクレオチド及び前記P2オリゴヌクレオチドを含む請求項1〜請求項8のいずれか1項に記載の多型検出用プライマーセットとを接触させ、前記核酸試料中の核酸配列を鋳型として増幅を行うこと、
(II) EGFRエクソン21の多型を検出可能な多型検出用プローブ及び、前記増幅により得られた一本鎖増幅核酸を接触させて、該一本鎖増幅核酸と該プローブとのハイブリッドを得ること、
(III) 前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させて、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること、
(IV) 前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるTm値を評価すること、及び、
(V) 前記Tm値に基づいて、EGFRエクソン21L858Rの存在またはEGFRエクソン21L858Rを有する核酸配列の存在比を評価することと、
を含む、EGFR遺伝子における多型検出方法。 - 前記増幅を行うことと前記ハイブリッドを得ることを同時に行う請求項13記載の多型検出方法。
- 請求項13又は請求項14記載の多型検出方法によりEGFR遺伝子における多型を検出すること、及び、
前記検出結果に基づいてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性又はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の薬効を評価すること、
を含むEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の評価方法。 - 配列番号2〜配列番号11で示されるP1オリゴヌクレオチド及び、配列番号12〜配列番号21で示されるP2オリゴヌクレオチドのいずれかである請求項13又は請求項14記載の多型検出用方法に用いられる多型検出用プライマー。
- 請求項1〜請求項8のいずれか1項記載のプライマーセットを含むEGFR遺伝子における多型を検出するための多型検出用キット。
- さらに、EGFRエクソン21 L858Rを検出可能なプローブを含む請求項17記載の多型検出用キット。
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