JP2012100599A - Stem cell activation apparatus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト、非ヒト動物、植物などの生物や、そこから摘出した組織若しくはその細胞、又は微生物へ、近赤外線を照射して、それらの幹細胞を活性化させ、増殖させるために用いられ、さらに分化もその促進もできる幹細胞活性化装置に関するものである。 The present invention is used for activating and proliferating those stem cells by irradiating living organisms such as humans, non-human animals, plants and the like, tissues or cells thereof extracted therefrom, or microorganisms with near infrared rays. Furthermore, the present invention relates to a stem cell activation device that can further promote differentiation.
再生医療は、事故や病気によって失われた生体の細胞、組織、器官の再生や機能の回復を目的とした医療であり、これからの医学の大きな課題の一つである。 Regenerative medicine is a medical treatment aimed at regenerating and restoring the functions of living cells, tissues, and organs lost due to accidents and illnesses, and is one of the major issues of medicine in the future.
例えば、従来、再生医療として、先天奇形・外傷・術後の変形や組織欠損に対して、患者本人の健全な皮膚・皮下組織、自家組織を患部に移植することにより行われることが多い。しかし、このような再建手術は、患者に対する侵襲性が大きいうえ、患者の患部以外にも採取部の傷を残すことになり、患者への肉体的・精神的負担が大きく、さらに合併症発症のリスクを高めてしまうものである。 For example, conventionally, regenerative medicine is often performed by transplanting the patient's own healthy skin / subcutaneous tissue or autologous tissue to the affected area for congenital malformations, trauma, post-operative deformation or tissue loss. However, such reconstructive surgery is highly invasive to the patient and leaves wounds on the sampled area in addition to the affected area of the patient, resulting in a large physical and mental burden on the patient and the occurrence of complications. It increases the risk.
また、現在、白血病などの血液疾患の治療として造血幹細胞移植が行われている。このとき、骨髄移植か臍帯血移植で、造血幹細胞を採取している。骨髄移植ではドナーの負担が大きく、臍帯血移植では臍帯血の量により移植できる患者が限定される。そのため、造血幹細胞移植には、まだ解決すべき課題が多い。 Currently, hematopoietic stem cell transplantation is performed as a treatment for blood diseases such as leukemia. At this time, hematopoietic stem cells are collected by bone marrow transplantation or cord blood transplantation. Bone marrow transplantation places a heavy burden on the donor, and cord blood transplantation limits the number of patients that can be transplanted depending on the amount of cord blood. Therefore, there are still many problems to be solved for hematopoietic stem cell transplantation.
これに対し、最近注目されている再生医療は、生体内のありとあらゆる組織や器官へ分化することができる幹細胞を利用して、必要とする細胞・組織を得るという医療技術である。すなわち、幹細胞に刺激を加えて、幹細胞を分化誘導し、目的とする細胞、組織、器官を作成し、最終的には失われた組織や器官を再生させる医療技術である。 On the other hand, regenerative medicine that has recently attracted attention is a medical technique in which necessary cells and tissues are obtained using stem cells that can be differentiated into various tissues and organs in a living body. In other words, this is a medical technique in which stem cells are stimulated to induce differentiation of stem cells to create target cells, tissues, and organs, and finally regenerate lost tissues and organs.
このような幹細胞は種々存在することが知られており、生体のほとんどの臓器や組織中に存在している。とりわけ、造血幹細胞や神経幹細胞など様々の幹細胞の中で、どの種類の組織にでも分化することができ、増殖能力も高いＥＳ細胞（Embryonic Stem Cell：胚性幹細胞）と呼ばれている細胞は、万能細胞として、パーキンソン病、心筋梗塞、脊椎損傷、白血病、糖尿病、肝臓病など様々な病気の治療への応用が期待されている。 Such stem cells are known to exist in various ways, and are present in most organs and tissues of the living body. In particular, among various stem cells such as hematopoietic stem cells and neural stem cells, ES cells (Embryonic Stem Cell) that can differentiate into any kind of tissue and have high proliferation ability are As a universal cell, it is expected to be applied to the treatment of various diseases such as Parkinson's disease, myocardial infarction, spinal cord injury, leukemia, diabetes and liver disease.
しかし、ＥＳ細胞は、ヒトでは受精後５〜７日程度、マウスでは３〜４日程度経過した初期胚（受精卵）から作られる細胞であるため倫理的な問題があり、再生医療での実用化には幾多の高いハードルがある。 However, ES cells are cells made from early embryos (fertilized eggs) that have passed about 5-7 days after fertilization in humans and about 3-4 days in mice. There are many high hurdles in conversion.
このＥＳ細胞にかわり最近注目されている幹細胞として、脂肪吸引などの処置で大量に採取可能な脂肪幹細胞、骨髄の中にある間葉系幹細胞などがある。これらの細胞は、骨、軟骨、脂肪、心臓、神経、肝臓などの細胞に誘導できるとされ、再生医療の担い手として注目を浴びている。 Stem cells that have recently attracted attention in place of ES cells include adipose stem cells that can be collected in large quantities by treatment such as liposuction, and mesenchymal stem cells in the bone marrow. These cells are said to be able to be induced into cells such as bone, cartilage, fat, heart, nerve and liver, and are attracting attention as a leader in regenerative medicine.
この幹細胞が利用できれば、生体外、又は生体内で目的の細胞に分化誘導し、その後、患者の患部に移植することで治療が可能となる。 If this stem cell can be used, it can be treated by inducing differentiation into the target cell in vitro or in vivo and then transplanting it to the affected area of the patient.
さらに、この幹細胞を効率よく活性化させ、増殖させてさらに分化させることが可能になれば、再生医療の効率が高められる。具体的には、再生医療に必要な特定の細胞、組織、臓器の作製が可能になったり、造血幹細胞を活性化させて、骨髄移植の成績を改善したり、骨芽細胞を活性化させることにより骨折後の骨皮質の再構成を促進することも可能になる。 Furthermore, if this stem cell can be efficiently activated, proliferated and further differentiated, the efficiency of regenerative medicine can be increased. Specifically, it is possible to create specific cells, tissues, and organs necessary for regenerative medicine, activate hematopoietic stem cells, improve bone marrow transplantation results, and activate osteoblasts This also facilitates the reconstruction of the bone cortex after the fracture.
そのため、再生医療の分野では、幹細胞をいかに患者の負荷を少なくして採取するか、採取した幹細胞をいかに増殖させるかに着目して、研究開発がなされている。 For this reason, in the field of regenerative medicine, research and development have been conducted focusing on how to collect stem cells with a reduced patient load and how to expand the collected stem cells.
例えば、特許文献１には、ヒトの羊膜上皮細胞層中に骨芽細胞へ分化する細胞が存在すること、また、胎盤から羊膜を分離し細胞を生体外で培養することにより、骨芽細胞へ分化誘導できることが開示されている。
For example,
また、特許文献２には、ヒトの脂肪片からコラゲナーゼ処理により脂肪片中に存在する細胞外マトリクスを消化し細胞群にした後、遠心分離により成熟脂肪細胞の集団を分離し、さらに初代培養することで骨芽細胞へ分化誘導する繊維芽細胞の分離法が、開示されている。
Further, in
しかし、組織に対して低侵襲であって、簡便に幹細胞を活性化したり、さらに増殖したりして安全かつ効率よく分化させることが、患者・医師の双方から強く望まれている。 However, there is a strong demand from both patients and doctors that it is minimally invasive to tissues, and that stem cells can be simply activated or further proliferated for safe and efficient differentiation.
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、ヒト、非ヒト動物、植物など生物や、そこから摘出した組織若しくはその細胞、又は微生物に対して、極めて低侵襲であり、それらの幹細胞を効率よく活性化させ、増殖させることができ、さらに分化させたりそれらについて促進させたりすることができる簡易な幹細胞活性化装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and is extremely minimally invasive to living organisms such as humans, non-human animals, plants, tissues or cells extracted therefrom, or microorganisms. It is an object of the present invention to provide a simple stem cell activation device that can efficiently activate and proliferate stem cells, and further differentiate or promote them.
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の幹細胞活性化装置は、近赤外線出射源からの出射光線の内の１４００〜１５００ｎｍの波長を吸収、反射又は散乱させてその他の１１００〜１４００ｎｍと１５００〜１８００ｎｍとの近赤外線を透過させるフィルタが、前記近赤外線出射源と前記近赤外線で照射される幹細胞分化すべき対象組織及び／又はそれの細胞との経路途中に、配置されていることを特徴とする。
The stem cell activation device according to
請求項２に記載の幹細胞活性化装置は、請求項１に記載されたもので、前記フィルタが、水層を有していることを特徴とする。
The stem cell activation device according to
請求項３に記載の幹細胞活性化装置は、請求項１に記載されたもので、前記近赤外線の波長域が、１０００〜１８００ｎｍであることを特徴とする。
The stem cell activation device according to
請求項４に記載の幹細胞活性化装置は、請求項１に記載されたもので、前記近赤外線出射源が、前記出射光線であるレーザー光を出射するレーザーダイオード、又は前記出射光線を出射する発光ダイオード、タングステンランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、カーボンヒータ若しくはセラミックスヒータであることを特徴とする。
The stem cell activation device according to claim 4 is the stem cell activation device according to
請求項５に記載の幹細胞活性化装置は、請求項１に記載されたもので、前記近赤外線出射源が、前記出射光線をパルス出射させる発振回路若しくは連続出射させる出射回路、その出射光線の単回ショット若しくは複数回ショットを出射させるタイマー、その出射の開始と停止とをさせるスイッチ回路、及び／又は前記近赤外線出射源の出力を増幅させる増幅回路に、接続されていることを特徴とする。
The stem cell activation device according to
請求項６に記載の幹細胞活性化装置は、請求項１に記載されたもので、前記近赤外線出射源と前記フィルタとの対を、一対又は複数対、有することを特徴とする。
The stem cell activation device according to claim 6 is the stem cell activation device according to
請求項７に記載の幹細胞活性化装置は、請求項６に記載されたもので、前記近赤外線出射源と前記フィルタとの対が、単数又は複数のハンドピースの各先端部に取付けられていることを特徴とする The stem cell activation device according to claim 7 is the stem cell activation device according to claim 6, wherein a pair of the near-infrared ray emission source and the filter is attached to each distal end portion of one or a plurality of handpieces. It is characterized by
請求項８に記載の幹細胞活性化装置は、請求項７に記載されたもので、前記経路途中で前記フィルタの先方に、前記対象へ近接あるいは接触するサファイアガラス冷却窓が、前記ハンドピースの表面に露出して取付けられていることを特徴とする。 The stem cell activation device according to claim 8 is the device according to claim 7, wherein a sapphire glass cooling window that approaches or contacts the target in the middle of the path is a surface of the handpiece. It is characterized by being attached to be exposed.
請求項９に記載の幹細胞活性化装置は、請求項１に記載されたもので、前記対象組織及び／又はそれの細胞が、ヒト、非ヒト動物、及び植物から選ばれる何れかの生物の組織及び／又はそれの細胞であることを特徴とする。
The stem cell activation device according to claim 9 is the device according to
前記の目的を達成するためになされた請求項１０に記載の幹細胞活性化方法は、近赤外線出射源からの出射光線の内の１４００〜１５００ｎｍの波長を吸収、反射又は散乱させてその他の１１００〜１４００ｎｍと１５００〜１８００ｎｍとの近赤外線を透過させるフィルタが、前記近赤外線出射源と前記近赤外線で照射される幹細胞分化すべき、ヒト、非ヒト動物若しくは植物から摘出した対象組織及び／又はそれの細胞との経路途中に、配置し、前記フィルタを介して前記近赤外線を前記対象組織及び／又はそれの細胞へ照射することを特徴とする。
The stem cell activation method according to
本発明の幹細胞活性化装置は、ヒト、非ヒト動物、植物など生物や、そこから摘出した組織若しくはその細胞、又は微生物に対して、極めて低侵襲であり、再生医療に必要なそれらの幹細胞を効率よく活性化させ、さらに増殖させ、必要に応じて併用される他の方法の有無に関わらず又それに影響を受けることなく、また効率よく簡便に分化させたりそれらを促進させたりすることができる簡易なものである。 The stem cell activation device of the present invention is extremely minimally invasive to living organisms such as humans, non-human animals, plants, tissues extracted from them, or microorganisms, and those stem cells necessary for regenerative medicine are used. It can be efficiently activated, further proliferated, and can be differentiated and promoted efficiently and easily with or without the influence of other methods used in combination. It's simple.
この幹細胞活性化装置によれば、冷却による温度調節、正常細胞損傷を惹起し易い波長のフィルタ調整によって正常細胞の損傷を最小限に防ぐことが可能で、さらに幹細胞の周辺に存在する分化した余計な細胞をアポトーシス様細胞死させるので、幹細胞だけを選択的に、非常に効率よく、活性化させ、増殖させて、さらに分化させたりそれらを促進させたりすることができる。 According to this stem cell activation device, it is possible to prevent damage to normal cells to a minimum by adjusting the temperature by cooling, and adjusting the filter with a wavelength that is likely to cause normal cell damage. Cells are killed by apoptosis-like cells, so that only stem cells can be selectively and very efficiently activated, expanded, further differentiated and promoted.
この幹細胞活性化装置は、簡易な構造であって持ち運び自在な小型のものであり、煩雑な操作を経ずに幹細胞を効率よく活性化させ、増殖させて、さらに分化させたりそれらを促進させたりすることができるものである。 This stem cell activation device has a simple structure and is small and portable, and can efficiently activate and proliferate stem cells without complicated operations and further differentiate them or promote them. Is something that can be done.
近赤外線は、遠赤外線に比べ波長が短く、エネルギーが高いため、概して、培養液、組織、生体においてそれらの深層に到達し難い。さらに、近赤外線を培養液等に、直接照射すると、液表層の水分子に吸収され、培養液を容易く過度の温度上昇、乃至は沸騰させてしまう。また、生体においては、皮膚表層で吸収されて熱傷などの有害事象を生じさせ易い。 Near-infrared rays are shorter in wavelength and higher in energy than far-infrared rays, so that it is generally difficult to reach those deep layers in a culture solution, tissue, or living body. Furthermore, when near-infrared rays are directly irradiated to a culture solution or the like, it is absorbed by water molecules on the surface of the solution, and the culture solution is easily raised to an excessive temperature or boiled. Moreover, in the living body, it is easily absorbed by the skin surface layer and causes an adverse event such as a burn.
それにも係わらず、この幹細胞活性化装置によれば、そのような問題を生じない。特に、ハンドピースの先端にサファイアガラス冷却窓を設けることによって、培養液、組織、生体などの表層を直接冷却することができるので、高出力で照射しても、過度の温度上昇、熱感、疼痛、熱傷、正常細胞損傷などの有害事象を最小限に抑えることができる。さらに培養液、組織、生体などの表層を冷却することで、その表層での水分子の分子運動を抑制し近赤外線の吸収を最小限に抑えて、その表層の温度を過度に上昇させることなく、所望の波長の近赤外線を深層に効率よく到達させることができる。 Nevertheless, the stem cell activation device does not cause such a problem. In particular, by providing a sapphire glass cooling window at the tip of the handpiece, it is possible to directly cool the surface layer of the culture solution, tissue, living body, etc., even if irradiated with high output, excessive temperature rise, heat feeling, Adverse events such as pain, burns, and normal cell damage can be minimized. Furthermore, by cooling the surface layer of the culture medium, tissue, living body, etc., the molecular motion of water molecules on the surface layer is suppressed, the absorption of near infrared rays is minimized, and the temperature of the surface layer is not increased excessively. , Near infrared rays having a desired wavelength can efficiently reach the deep layer.
この幹細胞活性化装置によれば、過度の温度上昇を生じる可能性が低いため、貴重な生体外、又は生体内の幹細胞を損傷してしまう可能性が、極めて低い。また、生体においても、有害事象を生じる可能性が低いため、臨床現場の患者にとって身体的負担が軽減される。 According to this stem cell activation device, the possibility of causing an excessive temperature rise is low, and therefore the possibility of damaging precious in vitro or in vivo stem cells is extremely low. Also, in the living body, since there is a low possibility of causing an adverse event, the physical burden is reduced for patients in the clinical field.
さらに、この幹細胞活性化装置を用いた幹細胞活性化方法によれば、特殊な設備や施設を必要とせず簡易に、幹細胞を活性化させ、増殖させて、さらに分化させたりそれらを促進させたりして、再生医療材料の提供や、再生医療の治療に用いることができるため、医療費削減に資する。 Furthermore, according to the stem cell activation method using this stem cell activation device, the stem cells can be easily activated, proliferated, further differentiated or promoted without requiring special equipment or facilities. Therefore, it can be used for the provision of regenerative medical materials and the treatment of regenerative medicine, which contributes to reducing medical costs.
以下、本発明を実施するための好ましい形態の例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。 Hereinafter, examples of preferable modes for carrying out the present invention will be described in detail, but the scope of the present invention is not limited to these modes.
本発明の幹細胞活性化装置１について、実施の一形態を示す図１を参照しながら説明する。幹細胞活性化装置１は、所定の近赤外線のみを選択的に、ヒト、非ヒト動物、植物などの生物やそこから摘出した組織若しくはその細胞、又は微生物などの対象細胞・対象組織・対象個体に到達させるためのものである。
The stem
この幹細胞活性化装置１は、近赤外線出射源１５であるＡｌＧａＡｓ（アルミニウム・ガリウム・ヒ素）系やＧａＡｓ系のレーザーダイオードと、そこから出射する近赤外線を含む出射光線であるレーザー光の出射方向に、１４００〜１５００ｎｍの波長及び１８００ｎｍを超える波長を吸収してその範囲の波長の透過を低減させる第一のフィルタ１６ａ、及び１０００ｎｍ未満の波長、好ましくは１１００ｎｍ未満の波長を遮蔽してその範囲の波長のみを透過させる第二のフィルタ１６ｂとを、有している。レーザー光の出射方向でフィルタ１６ｂの先方に、レンズ１７と、生体２へ接触する近赤外線透過性のサファイアガラス冷却窓１８とが、配置されている。レーザーダイオード１５に隣接しつつ対峙している第一のフィルタ１６ａと、サファイアガラス冷却窓１８とに、夫々、クーラー１９ａ・１９ｂが取付けられている。
This stem
第一のフィルタ１６ａは、水層を有するものであって、例えば石英やガラス等のセルに水が充填されたものであり、その水に１４００〜１５００ｎｍの波長と１８００ｎｍを超える波長好ましくは１７００ｎｍを超える波長とが吸収されることによって、その波長の透過を低減させるものである。その水層は、蒸留水、イオン交換水、水道水であってもよく、無機塩や有機塩のような電解質、糖のような非電解質例えば生理食塩水やリンゲル液、メタノールやエタノールのようなモノアルコール、エチレングリコールのようなポリオールである添加物の単数又は複数を溶解した水溶液であってもよい。そのレーザー光が通過するフィルタ１６ａ中の水層の厚さが厚過ぎると、レーザー光２０を照射したときに対象細胞、組織での生理作用、効果が小さくなってしまい、一方、その厚さが薄過ぎると、レーザー光２０を照射したとき、対象細胞、組織に届く前にレーザー光２０が吸収されて、過熱され、過度の温度上昇や生体では火傷を負ったり熱感・疼痛を感じたりしてしまう。その厚さは、近赤外線出射源の出力強度にもよるが、０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ程度であることが好ましい。
The
第二のフィルタ１６ｂは、例えば１１００ｎｍ未満の波長をガラス中に分散した光吸収物質により吸収し、一方、１１００ｎｍ以上の波長を対象細胞、組織へ透過させるものである。フィルタ１６ｂは、例えば市販されている近赤外線フィルタであってもよく、それと紫外線フィルタとを組合わせた複合フィルタであってもよい。近赤外線フィルタは、より具体的には、誘電体膜コーティングフィルタ、光学ガラスフィルタ、樹脂製フィルタが挙げられる。誘電体膜コーティングフィルタは、屈折率の異なる金属酸化物や金属フッ化物を交互に複数層積層したものであり、透明薄膜による光の干渉を利用して１１００ｎｍ未満の近赤外線波長領域の光を選択的に遮蔽するもので、例えば蒸着ＴｉＯ２のような高屈折率層と蒸着ＳｉＯ２のような低屈折率層との相互積層膜のような誘電体多層膜がガラス基板のような透明基板に付された誘電体多層膜コーティングフィルタが挙げられる。光学ガラスフィルタは、主成分Ｐ２Ｏ５とＣｕＯとに０．５％以下のＶ２Ｏ５や金属フッ化物を含有するＣｕＯ−弗燐酸塩系ガラス、樹脂製フィルタは、ジイモニウム系色素のような近赤外線吸収色素を５０％以下含有する樹脂フィルムが挙げられる。１１００ｎｍ未満の波長を遮断するものであれば、遮断波長の異なる複数の紫外線遮蔽フィルタ・赤外線遮蔽フィルタや、フィルタ赤外線透過フィルタ・コールドフィルタを組合せて用いてもよい。照射される近赤外線の波長域が１０００〜１８００ｎｍであることが好ましく、１０００〜１７００ｎｍ又は１１００〜１８００ｎｍであるとなお一層好ましい。
For example, the
作業者が持つハンドピース３０のハウジング内に、順に並んで配置されたレーザーダイオード１５、フィルタ１６ａ・１６ｂ、及びレンズ１７と、それに沿って配置されたクーラー１９ａ・１９ｂとが、内蔵されている。そのハンドピース３０の先端表面にサファイアガラス冷却窓１８が取付けられて、対象細胞、組織と接触できるように、露出している。
A
クーラー１９ａ・１９ｂは、水冷クーラー、空冷クーラー、整流器若しくはサイリスタ変換器を用いた熱交換冷却器、熱電変換素子のようなものであり、第一のフィルタ１６ａやサファイアガラス冷却窓１８に蓄積した熱を放出するものである。
The
レーザー光をパルス出射させるために発振回路１１が、変調回路１３に接続され、さらに接続コードを介してハンドピース３０内のレーザーダイオード１５に、接続されている。レーザー光を所定時間続けて出射させるタイマー１２と、その出射を単回又は複数回繰り返して出射させるスイッチ回路１４とが、変調回路１３に接続されている。また、ハンドピース３０内のクーラー１９ａ・１９ｂに、クーラー制御回路２１が接続されている。これら回路１１・１３・１４・２１やタイマー１２が、幹細胞活性化装置１の制御器本体４０のハウジング内に、内蔵されている。
An
レーザーダイオード１５の背面側に近赤外線反射板（不図示）が設けられていてもよい。レーザーダイオード１５に代えて、ＡｌＧａＡｓ系やＧａＡｓ系の発光ダイオードを用いてもよい。
A near-infrared reflector (not shown) may be provided on the back side of the
幹細胞活性化装置１は、以下のようにして使用される。
The stem
１回の照射治療毎に、発振回路１１からの発振をタイマー１２により、変調回路１３で例えば０．５〜１００ミリ秒のパルス幅で０．５〜１００ミリ秒間隔の近赤外線のパルス出射となるように変調し、及び／又はスイッチ回路１４で１ショット当り０．１〜１０秒間連続の単回ショット又は２〜２０回の複数回ショットとなるように変調し、それに応じて、増幅回路（不図示）を介して、所望の５〜６５Ｊ／ｃｍ２の出射出力となるような電圧を、レーザーダイオード１５に印加する。この照射は、１回照射のみ、あるいは、毎日あるいは一定期間の間隔をおいての複数回照射も可能である。
For each irradiation treatment, the oscillation from the
すると、フラッシュランプとなるレーザーダイオード１５からは、広範な波長の近赤外線を含むレーザー光がパルス出射されて、出射される。不必要な波長域のものはフィルタ１６ａ・１６ｂで低減又は遮蔽される。即ち、その近赤外線は第一のフィルタ１６ａに至り、フィルタ１６ａ内の水層に、１４００〜１５００ｎｍの波長が一部分吸収される結果その波長の透過が低減され、また１８００ｎｍを超える波長が殆んど吸収される結果その波長の透過が遮断される。このとき第一のフィルタ１６ａは、クーラー制御回路２１からの指示信号に従って駆動するクーラー１９ａによって冷却される結果、近赤外線の吸収によって水温上昇する第一のフィルタ１６ａ内の水層も同時に冷却される。さらにレーザー光は、第二のフィルタ１６ｂに至り、１１００ｎｍ未満の波長が殆んど吸収される結果その波長の透過が殆んど遮断される。レーザー光は必要に応じてレンズ１７で集束され、サファイアガラス冷却窓１８を経て、照射すべき所望の波長を有する近赤外線２０となって、外界へ出射される。
Then, the
ハンドピース３０先端のサファイアガラス冷却窓１８を、ヒト、非ヒト動物、植物などの生物やそこから摘出した組織若しくはその細胞、又は微生物などの対象細胞・対象組織例えばそれらが培養されている培養液、対象個体へ向けて、接触、または可能な限り近づける。すると、近赤外線２０は、培養液、あるいは生体個体の皮膚の表皮・真皮を経て、対象細胞、組織へ到達する。このとき、近赤外線２０により、表層が加熱されるが、サファイアガラス冷却窓１８が近接していることにより、表層の熱が、熱伝導率の高い冷却窓１８のサファイアへ伝導する。サファイアガラス冷却窓１８は、クーラー制御回路２１からの指示信号に従って駆動するクーラー１９ｂによって冷却される結果、過度の温度上昇、熱感、火傷、疼痛などの有害事象を生じないように、常に表層を冷却している。
The sapphire
近赤外線２０は、この冷却窓１８により、過度の温度上昇、熱感、火傷、疼痛などの有害事象を生じることなく、さらに表面で吸収されることなく安全に、対象細胞、組織に到達し、幹細胞を活性化させ、増殖させてさらに分化促進させる。生体の健常組織においては、この近赤外線２０がタンパクなどの熱変性を生じさせることがなく、豊富な血流で過度の温度上昇から保護されている。一方、周辺の幹細胞以外の増殖期の細胞は、近赤外線２０に対する感受性が高いため、近赤外線２０のエネルギーがより周辺の幹細胞以外の増殖期の細胞に吸収される。その結果、周辺の幹細胞以外の増殖期の細胞の自然死を誘導し、幹細胞を活性化させ、増殖させることができ、さらに分化させたりそれらを促進させたりすることもできる。
The near-
図２に、幹細胞活性化装置１の別な態様を示す。近赤外線出射源１５は、１１００〜１８００ｎｍの近赤外線を包含する赤外線であれば紫外線や可視光までの波長域を出射するものであってもよいので、図２に示すように、前記のレーザーダイオードに代えて、近赤外線を出射するランプ、例えばタングステンをフィラメントにした白色電球であるタングステンランプ、ハロゲンを封入しておりタングステン線条を有する電球であるハロゲンランプ、キセノンガスを封入した放電灯であるキセノンランプであってもよい。近赤外線中の１４００〜１５００ｎｍの波長を吸収する第一のフィルタ１６ａは、石英やガラスのような透明無機素材製、又はエポキシ樹脂やシリコーン樹脂のような透明樹脂製のセルの内空２３に水を通過させるものであってもよい。フィルタ１６ａ・１６ｂの順が、逆であってもよい。
FIG. 2 shows another embodiment of the stem
図２の幹細胞活性化装置１は以下のように動作する。フラッシュランプとなるタングステンランプ１５から出射し又は反射板２２で反射した広範な波長の出射光線が、パルス出射される。その光線が第一のフィルタ１６ａに至り、その一部がフィルタ１６ａのセルの内空２３の水に吸収されて、１４００〜１５００ｎｍの波長の透過が低減され、１８００ｎｍを超える波長の透過が遮断される。クーラー制御回路２１（図１参照）の指示信号に従ってポンプ（不図示）が駆動して内空２３の水が循環し、フィルタ１６ａが冷却される。さらに光線は、第二のフィルタ１６ｂに至り、１１００ｎｍ未満の波長の透過が殆んど遮断される。光線は、適宜レンズ１７で集束され、サファイアガラス冷却窓１８を経て、照射すべき所望の波長を有する近赤外線２０となって、対象細胞、組織へ出射される。
The stem
図３に、幹細胞活性化装置１の別な態様を示す。図３に示すように、近赤外線出射源１５は、前記のレーザーダイオードに代えて、近赤外線を含む熱線を出射するヒータ、例えば炭素繊維を発熱源とするカーボンヒータ、絶縁セラミックスを加熱して熱放射源としたり又は半導体セラミックスを発熱源としたりするセラミックヒータであってもよい。近赤外線中の１４００〜１５００ｎｍの波長を吸収する第一のフィルタ１６ａは、これら棒状のヒータを挿入している石英製又はガラス製の透明内管とそれらを挿入している石英、ガラス、又はエポキシ樹脂やシリコーン樹脂のような樹脂製の外管とからなる二重管２４、その内管・外管の間の内空２３を流れる水で、形成されているものであってもよい。ヒータ１５は、熱線を連続出射させるために、発振回路や変調回路を有していなくてもよく、それに代えて増幅回路を有していてもよく、近赤外線２０の出射方向に、近赤外線２０をパスル出射できるようにシャッター（不図示）が設けられていてもよい。
FIG. 3 shows another aspect of the stem
図３の幹細胞活性化装置１は以下のように動作する。タイマー１２又はスイッチ回路１４（図１参照）により増幅回路（不図示）を介して、所望の出射出力となるような電圧を、ヒータ１５に印加する。ヒータ１５から出射した熱線が、その周りを取り囲んでいる第一のフィルタ１６ａに至り、その一部がフィルタ１６ａの二重管２４の間の内空２３の水に吸収されて、１４００〜１５００ｎｍの波長の透過が低減され、１８００ｎｍを超える波長の透過が遮断される。クーラー制御回路２１（図１参照）の指示信号に従ってポンプ（不図示）が駆動して内空２３の水が循環し、フィルタ１６ａと共にヒータ１５が冷却される。フィルタ１６ａを透過した熱線は、直接に又は反射板２２で反射されて第二のフィルタ１６ｂに至り、１１００ｎｍ未満の波長の透過が殆んど遮断される。熱線は、適宜レンズ１７で集束され、サファイアガラス冷却窓１８を経て、照射すべき所望の波長を有する近赤外線２０となって、対象細胞、組織へ照射される。
The stem
図４に、幹細胞活性化装置１のハンドピース３０の一態様を示す。図４に示すように、ハンドピース３０のハウジング３１内に、第一の管状フィルタ１６ａ（図２参照）が内蔵されている。そのフィルタ１６ａの中に近赤外線出射源１５が挿入されている。フィルタ１６と近赤外線出射源１５との間を、水が循環している。ハウジング３１に、照射のオンオフを制御するスイッチ３２が設けられ、スイッチ回路１４（図１参照）に接続されていてもよい。スイッチ３２をオンモードにすると、近赤外線出射源１５からのレーザー光が出射されサファイアガラス冷却窓１８を経て、近赤外線２０が照射される。オンオフ制御は、制御器本体４０側で行われてもよい。
FIG. 4 shows one aspect of the
近赤外線出射源とフィルタ１６ａとの対が、一対設けられている例を、図４に示したが、複数のハンドピース３０に夫々一対ずつ設けられていてもよく、単数又は複数のハンドピース３０に夫々複数対ずつ設けられていてもよい。
FIG. 4 shows an example in which a pair of a near-infrared ray emission source and a
このような幹細胞活性化装置として、例えば近赤外線治療器Ｔｉｔａｎ（キュテラ社製：商品名）を用いてもよい。 As such a stem cell activation device, for example, a near-infrared treatment device Titan (manufactured by Cutera, Inc .: trade name) may be used.
幹細胞活性化装置１は、ラットの骨髄幹細胞に用いた例を示したが、ヒト、又は非ヒト動物、植物など生物の細胞、組織やそれらの培養液に用いてもよく、直接それらの個体に用いてもよく、また微生物に用いてもよい。
Although the stem
これらの幹細胞活性化装置１によれば、対象細胞、組織へ照射する近赤外線２０の波長を１０００〜１８００ｎｍ、好ましくは１０００〜１７００ｎｍ又は１１００〜１８００ｎｍに限定することができる。
According to these stem
赤外線、とりわけ通常の２５００ｎｍ以下の波長の近赤外線は、波動特性と粒子特性との両方を示す電磁波であり、水、ヘモグロビン、又はミオグロビンに強く吸収されるので、照射されて皮膚を透過すると、皮膚表面の汗、真皮中の水分、ヘモグロビン、又は肉様膜中のミオグロビンを含む皮下組織、及び骨皮質に吸収され、それらへ影響を与えつつ、脂肪細胞により拡散される。生体へこのような近赤外線の照射を行うと、発汗して皮膚表面の水分を増やし、血管を拡張して、コラーゲン、エラスチン、及び水結合タンパクの発現を誘発し、真皮中の水分量を増加させ、これにより、更なる近赤外線による損傷から皮下組織を保護する。また、近赤外線に繰り返し曝されると、皮膚、筋肉の菲薄化、及び癌細胞の殺細胞作用を非熱的に誘発する。 Infrared rays, especially near infrared rays with a wavelength of 2500 nm or less, are electromagnetic waves that exhibit both wave characteristics and particle characteristics and are strongly absorbed by water, hemoglobin, or myoglobin. It is absorbed into and affected by adipose cells while affecting the surface sweat, moisture in the dermis, hemoglobin, or subcutaneous tissue containing myoglobin in the fleshy membrane, and bone cortex. When a near-infrared ray is irradiated on a living body, sweating increases moisture on the skin surface, dilates blood vessels, induces expression of collagen, elastin, and water-binding protein, and increases the amount of water in the dermis. This protects the subcutaneous tissue from further near-infrared damage. In addition, repeated exposure to near infrared radiation non-thermally induces skin and muscle thinning and cancer cell killing.
しかし、この幹細胞活性化装置１によって、接触冷却と同時に特定波長で近赤外線照射を行うと、幹細胞を活性化させ、増殖させることができ、さらに分化させたりそれらを促進させたりすることもできる。具体的には、近赤外線が、骨芽細胞及び造血幹細胞を刺激し、その結果、骨髄細胞を再生させ、また骨皮質質量を増加させ骨髄細胞を増殖させるのである。この特定波長による幹細胞の分化促進効果の詳細は、必ずしも明らかではないが、この特定波長とする必然性は、以下のように推察される。
However, when the near-infrared irradiation at a specific wavelength is performed simultaneously with the contact cooling by the stem
１１００ｎｍ未満、特に１０００ｎｍ未満の波長のものは、波長が短く、エネルギーが高いため、培養液、生体において深層に到達し難い。さらに、近赤外線を直接照射すると、表層の水分子に吸収され、培養液を容易に過度の温度上昇、あるいは沸騰させてしまう。また、生体においては、皮膚表層で吸収されて熱傷などの有害事象を生じさせ易い。これらの有害事象を防ぐため、１１００ｎｍ未満、特に１０００ｎｍ未満の波長のもの照射されないようにしてある。また、これらの波長は、生体においては、皮膚表層のメラニンに極めて高率に吸収される所為で、メラニンを大量に有する有色人種の皮膚や、白色人種と言えども色素沈着、乳輪、乳頭、陰部などの有色部を有する皮膚へ照射すると強い疼痛や熱傷などの有害事象を併発することから、照射されないようにしてある。 Those having a wavelength of less than 1100 nm, particularly less than 1000 nm, are short in wavelength and high in energy, so that it is difficult to reach a deep layer in a culture solution or a living body. Furthermore, when near infrared rays are directly irradiated, it is absorbed by water molecules on the surface layer, and the culture solution easily rises in temperature or boils easily. Moreover, in the living body, it is easily absorbed by the skin surface layer and causes an adverse event such as a burn. In order to prevent these adverse events, irradiation with a wavelength of less than 1100 nm, particularly less than 1000 nm is prevented. In addition, in the living body, these wavelengths are absorbed by melanin on the skin surface at a very high rate, so that the skin of colored people having a large amount of melanin and pigmentation, areola, Irradiation to skin with colored parts such as the nipple and pubic area is accompanied by strong adverse events such as pain and burns, so it is not irradiated.
１８００ｎｍを超える波長のものは、表層の水分子に吸収され、培養液を容易に過度の温度上昇、あるいは沸騰させてしまい、また、生体中の表皮よりも深部の組織まで到達させることができたとしても、そのエネルギー量が幹細胞活性化・増殖には不充分なものであるから、照射されないようにしてある。 Those having a wavelength exceeding 1800 nm were absorbed by water molecules on the surface layer, and the culture broth easily increased excessively or boiled, and could reach a deeper tissue than the epidermis in the living body. However, since the amount of energy is insufficient for stem cell activation / proliferation, it is not irradiated.
一方、１４００〜１５００ｎｍの波長の近赤外線は、培養液表層の水分子、生体中のヘモグロビンやミオグロビンと、水とに、極めて高率で吸収されてしまうものである。その所為でその波長の近赤外線は、培養液を容易に過度の温度上昇、あるいは沸騰させてしまい、また、生体中のヘモグロビンの多い部位、例えば赤みのある皮膚部位、炎症部位、粘膜部位に、照射すると、それらの部位で特に吸収されるため、熱傷などの有害事象を惹き起こす。また、その波長の近赤外線を何処かの皮膚に、照射すると、そこの真皮の水分に高率に吸収されるため、強い疼痛を惹き起こす。そこで、その波長の近赤外線は、照射されないようにしてある。このように、近赤外線は、水、ヘモグロビンの多い部位ではその部位で高率に吸収されてしまうため、培養液深層、生体の深部組織に到達させることが困難であったが、この幹細胞活性化装置１により、充分量の特定の近赤外線を、深部であっても確実に所望の対象細胞・組織へ安全に到達させることができる。
On the other hand, near-infrared rays having a wavelength of 1400 to 1500 nm are absorbed at a very high rate by water molecules on the surface of the culture solution, hemoglobin and myoglobin in the living body, and water. For that reason, near-infrared rays of that wavelength can easily cause excessive temperature rise or boiling of the culture solution, and also in parts of the body where there is a lot of hemoglobin, such as reddish skin parts, inflammation parts, mucous membrane parts, Irradiation is especially absorbed at those sites, causing adverse events such as burns. In addition, when a near infrared ray of that wavelength is irradiated to some skin, it is absorbed at a high rate by the moisture of the dermis, causing strong pain. Therefore, the near infrared ray of that wavelength is not irradiated. Thus, near-infrared light is absorbed at a high rate at sites with a lot of water and hemoglobin, so it was difficult to reach the deep layer of the culture solution and the deep tissue of the living body. With the
以上のように、幹細胞活性化装置１は、１４００〜１５００ｎｍの波長の近赤外線を特殊フィルタでカットできるように設計されている。そのため、幹細胞活性化装置１によれば、この培養液中の細胞、組織、生体のヘモグロビンやメラニンの多い部位にもその近赤外線の照射が可能となり、有害事象を減少させること、さらに深層、深部組織へ充分量の近赤外線を到達させて、それらの幹細胞を活性化させ、増殖させることができ、さらに分化させたりそれらを促進させたりすることも、可能である。
As described above, the stem
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。以下に、本発明を適用する幹細胞活性化装置を用いた実施例について説明する。 Examples of the present invention will be described in detail below, but the scope of the present invention is not limited to these examples. Below, the Example using the stem cell activation apparatus to which this invention is applied is described.
幹細胞活性化装置で、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞に近赤外線を照射したときの組織変化について、測定、評価した。具体的方法は、以下の通りである。 With a stem cell activation device, tissue changes when near-infrared rays were irradiated to cells in vivo were measured and evaluated. A specific method is as follows.
（実施例１）
先ず、以下に、本発明を完成するに至った医学的研究結果を詳細に説明する。
皮膚を透過して真皮、皮下組織を加熱し得るほど極めて透過性・吸収性の高い近赤外線が、真皮のみならず、皮膚より深部の組織である骨、骨髄など血管成分の多い組織を損傷する可能性について検討した。
Example 1
First, the medical research results that led to the completion of the present invention will be described in detail below.
Near-infrared rays, which are extremely permeable and absorbable enough to heat the dermis and subcutaneous tissue through the skin, damage not only the dermis but also tissues with many vascular components such as bone and bone marrow deeper than the skin. The possibility was examined.
近赤外線照射には、真皮のコラーゲン産生を促進させて、しわ・たるみを引き締める治療、若返り医療に用いられる前記の近赤外線治療器を、幹細胞活性化装置として使用した。この治療器は、広帯域の近赤外線光源をフィルタリングした特定波長の近赤外線の照射が可能なものであり、水分によく吸収される１１００〜１８００ｎｍの波長の近赤外線を、１４００〜１５００ｎｍの波長を吸収・反射又は散乱されるフィルタに通してから、接触冷却のためのサファイアガラス製冷却窓から、照射するものである。このフィルタリング後の特定波長の近赤外線は、水分やヘモグロビンに強く吸収される波長を含まないため、組織深部まで近赤外線エネルギーを安全に到達させることができるように調整されたものである。サファイアガラス製冷却窓を２０℃に調節しておき、表層に対して照射の直前、照射中、及び照射直後に渡る冷却を行って、過剰な表層加熱を防止した。 For the near-infrared irradiation, the above-mentioned near-infrared treatment device used for the treatment of rejuvenating medicine and the treatment of tightening wrinkles and sagging by promoting collagen production in the dermis was used as a stem cell activation device. This treatment device is capable of irradiating a near-infrared light having a specific wavelength filtered with a broadband near-infrared light source, and absorbs a near-infrared wavelength of 1100 to 1800 nm, which is well absorbed by moisture, and a wavelength of 1400 to 1500 nm. -It irradiates from the cooling window made from a sapphire glass for contact cooling after passing through the filter reflected or scattered. The near-infrared light having a specific wavelength after filtering does not include a wavelength that is strongly absorbed by moisture or hemoglobin, and thus is adjusted so that the near-infrared energy can safely reach the deep part of the tissue. The cooling window made of sapphire glass was adjusted to 20 ° C., and the surface layer was cooled immediately before irradiation, during irradiation, and immediately after irradiation to prevent excessive surface layer heating.
この幹細胞活性化装置による照射スポットは、１０ｍｍ×３０ｍｍの範囲である。照射１ショット当たり４〜１０秒間隔の連続照射パルスによるエネルギー照射により、フルエンス範囲が５〜６５Ｊ／ｃｍ２までのエネルギーを、所望の対象組織や細胞へ到達させることができる。 The irradiation spot by this stem cell activation device is in the range of 10 mm × 30 mm. By irradiating energy with a continuous irradiation pulse at intervals of 4 to 10 seconds per irradiation shot, energy having a fluence range of 5 to 65 J / cm 2 can reach a desired target tissue or cell.
被検体として、体重３６０ｇ〜４４０ｇのオスのウィスターラット（Rattus norvegicus albinus）３５匹を用いて、室温２４度（±１．５度）に設定した環境下、１２時間の明暗サイクルのもと、水とラット用食餌とを自発的に摂取できる環境で行った。 As subjects, 35 male Wistar rats (Rattus norvegicus albinus) weighing 360 to 440 g were used under an environment set at a room temperature of 24 degrees (± 1.5 degrees) under a 12 hour light / dark cycle, And rat food were voluntarily ingested.
先ず組織学的研究のために、背部を剃毛した無痛下のラットを均等に７群に分けた。うち５群に対して、前記特定波長の近赤外線照射を行った。近赤外線の照射出力を４０Ｊ／ｃｍ２の強度とし、照射回数を３回とした。その照射間隔は、１週間とした。 First, for histological studies, painless rats with shaved back were equally divided into 7 groups. Of those, 5 groups were irradiated with near infrared rays of the specific wavelength. The near infrared irradiation output was 40 J / cm 2 , and the number of irradiations was three. The irradiation interval was 1 week.
この幹細胞活性化装置を用いて照射した近赤外線照射量は、８．７５時間程度の日光浴を行った場合と同等量の太陽熱放射中の近赤外線に曝された量に相当するものである。 The amount of near-infrared radiation irradiated using this stem cell activation device corresponds to the amount of near-infrared radiation in solar heat radiation equivalent to the amount of sun bathing for about 8.75 hours.
それらのラットの背部に近赤外線を照射したのち、７日間（１週間）後、３０日間（１ヶ月間）後、６０日間（２ヶ月間）後、９０日間（３ヶ月間）後、１８０日間（６ヶ月間）後に、麻酔下で、棘突起を含めつつ皮膚・皮下組織を採取した。採取した組織検体を、採取直後に中性緩衝ホルマリン２０％で固定し、パラフィン包埋処理を行い、厚さ３〜４μｍの標本を作製した。
7 days (1 week), 30 days (1 month), 60 days (2 months), 90 days (3 months), 180 days after irradiating the back of these rats with near infrared rays After (six months), under anesthesia, the skin / subcutaneous tissue was collected including the spinous processes. The collected tissue specimen was fixed with neutral buffered
検体の染色は、細胞核を青紫色に染め、細胞質、結合組織、赤血球などを赤色に染めるヘマトキシリン・エオジン染色（以下ＨＥ染色）、及び幹細胞を茶色に染める抗ＣＤ３４抗体による免疫組織化学的染色により行った。 Sample staining is performed by staining the cell nucleus in blue-purple, staining the cytoplasm, connective tissue, red blood cells, etc. in red, and hematoxylin / eosin staining (hereinafter referred to as HE staining), and immunohistochemical staining with anti-CD34 antibody that stains stem cells in brown. It was.
なお、近赤外線非照射のラット２群をコントロール群とし、実験開始時と６ヵ月後に、照射群と同様に、棘突起を含めつつ皮膚・皮下組織を採取して、標本を作製した。 In addition, 2 groups of rats not irradiated with near infrared rays were used as a control group, and at the start of the experiment and 6 months later, as in the irradiated group, skin and subcutaneous tissues were collected including spinous processes to prepare specimens.
図５は、近赤外線非照射と照射の有無と、組織採取時期が異なるラットの棘突起内の骨髄の光学顕微鏡写真である。 FIG. 5 is an optical micrograph of the bone marrow in the spinous process of rats with different near-infrared non-irradiation, irradiation presence, and tissue collection time.
図５(Ａ)は、近赤外線非照射のコントロール群の実験開始時のラットの棘突起内の骨髄を、抗ＣＤ３４抗体免疫染色した結果を示す写真である。棘突起の骨皮質に囲まれた内部は、紫色に染まっている骨髄細胞が占め、わずかに茶色に染まった幹細胞が認められる。 FIG. 5 (A) is a photograph showing the result of anti-CD34 antibody immunostaining of the bone marrow in the spinous process of the rat at the start of the experiment in the non-irradiated control group. The inside of the spinous process surrounded by the bone cortex is occupied by bone marrow cells that are stained purple, and stem cells that are stained slightly brown are observed.
図５(Ｂ)は、最終照射後７日間経過したラットの棘突起内の骨髄を、抗ＣＤ３４抗体免疫染色した結果を示す写真である。この写真から明らかなように、紫色に染まっている骨髄細胞が減少し、白い空泡に見える脂肪が誘導され、増加している。また、骨皮質内側に沿って茶色に染まった幹細胞の増加が認められる。 FIG. 5 (B) is a photograph showing the results of anti-CD34 antibody immunostaining of the bone marrow in the spinous process of a rat 7 days after the final irradiation. As is clear from this photograph, the bone marrow cells stained purple are decreased, and fat that appears as white empty bubbles is induced and increased. Moreover, the increase of the stem cell dye | stained brown along the bone cortex inner side is recognized.
図５(Ｃ)は、最終照射後３０日間経過したラットの棘突起内の骨髄を、抗ＣＤ３４抗体免疫染色した結果を示す写真である。７日間経過後と同様に、紫色に染まっている骨髄細胞が減少し、白い空泡に見える脂肪が誘導され、増加している。また、骨皮質内側に沿って茶色に染まった幹細胞の増加が認められる。
FIG. 5 (C) is a photograph showing the result of anti-CD34 antibody immunostaining of the bone marrow in the spinous process of a
図５(Ｄ)は、最終照射後９０日間経過したラットの棘突起内の骨髄を、抗ＣＤ３４抗体免疫染色した結果を示す写真である。骨芽細胞が活性化され、骨皮質が厚くなり、切片作成時に骨髄細胞が損傷され、抗ＣＤ３４抗体免疫染色では骨髄細胞数が測定できなかったために、連続切片のＨＥ染色で骨髄細胞数を測定した。依然として、紫色に染まっている骨髄細胞が減少し、白い空泡に見える脂肪が増加し、骨皮質内側に沿って茶色に染まった幹細胞が増加している。 FIG. 5 (D) is a photograph showing the result of anti-CD34 antibody immunostaining of the bone marrow in the spinous process of rats 90 days after the last irradiation. Since osteoblasts are activated, bone cortex is thickened, bone marrow cells are damaged at the time of section preparation, and the number of bone marrow cells cannot be measured by anti-CD34 antibody immunostaining, the number of bone marrow cells is measured by HE staining of continuous sections did. Still, the bone marrow cells that are stained purple decrease, the fat that appears as white air bubbles increases, and the stem cells that stain brown increase along the inside of the bone cortex.
図５(Ｅ)は、最終照射後１８０日間経過したラットの棘突起内の骨髄を、抗ＣＤ３４抗体免疫染色した結果を示す写真である。９０日間経過後と同様に、骨芽細胞が活性化され、骨皮質が厚くなり、切片作成時に骨髄細胞が損傷され、抗ＣＤ３４抗体免疫染色では骨髄細胞数が測定できなかったために、連続切片のＨＥ染色で骨髄細胞数を測定した。依然として、紫色に染まっている骨髄細胞が減少し、白い空泡に見える脂肪が増加し、骨皮質内側に沿って茶色に染まった幹細胞が増加している。 FIG. 5 (E) is a photograph showing the result of anti-CD34 antibody immunostaining of bone marrow in the spinous process of a rat that has passed 180 days after the final irradiation. As after 90 days, osteoblasts were activated, bone cortex was thickened, bone marrow cells were damaged at the time of section preparation, and the number of bone marrow cells could not be measured by anti-CD34 antibody immunostaining. The number of bone marrow cells was measured by HE staining. Still, the bone marrow cells that are stained purple decrease, the fat that appears as white air bubbles increases, and the stem cells that stain brown increase along the inside of the bone cortex.
図５(Ｆ)は、近赤外線非照射のコントロール群の１８０日間経過したラットの棘突起内の骨髄を、抗ＣＤ３４抗体免疫染色した結果を示す写真である。実験開始時のコントロール群と同様に、棘突起の骨皮質に囲まれた内部は、紫色に染まっている骨髄細胞が占め、わずかに茶色に染まった幹細胞が認められる。 FIG. 5 (F) is a photograph showing the result of anti-CD34 antibody immunostaining of the bone marrow in the spinous process of a rat that had passed 180 days of the control group that was not irradiated with near infrared rays. Similar to the control group at the start of the experiment, the inside of the spinous process surrounded by the bone cortex is occupied by bone marrow cells stained purple, and stem cells stained slightly brown are observed.
また、採取した試料について、ヘマトキシリン・エオシン染色、及び抗ＣＤ３４抗体を用いた免疫組織化学的染色により、ＣＤ３４陽性幹細胞、及び造血幹細胞を測定して、評価した。また、トランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ）を用いて、アポトーシスを評価した。 The collected samples were evaluated by measuring CD34-positive stem cells and hematopoietic stem cells by hematoxylin and eosin staining and immunohistochemical staining using an anti-CD34 antibody. Apoptosis was also assessed using transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).
さらに、棘突起の上部に位置する皮下脂肪細胞、骨髄脂肪細胞、皮質骨、造血性骨髄細胞（ＨＢＭＣｓ）、ＣＤ３４陽性幹細胞（ＣＤ３４−ＰＳＣｓ）を、評価した。評価は、デジタル写真を用いて撮影しその画像データを取り込んだ後、セクション毎に同面積の５視野で定量化し、平均値を算出して最終的な数値を得るというものである。各視野は、株式会社キーエンス社製の顕微鏡BIOREVO BZ-9000を用いて撮影した。撮影した画像データは、アドビシステムズ社製のAdobe Photoshopを用いて画像処理した。各測定時点における夫々の群の統計学的有意性は、マン・ホイットニーのＵ検定によるものである。P<0.05を「有意差有り」とした。 Furthermore, subcutaneous adipocytes, bone marrow adipocytes, cortical bone, hematopoietic bone marrow cells (HBMCs) and CD34 positive stem cells (CD34-PSCs) located above the spinous processes were evaluated. In the evaluation, after taking a digital photograph and taking in the image data, the section is quantified in five fields of view having the same area for each section, and an average value is calculated to obtain a final numerical value. Each field of view was photographed using a microscope BIOREVO BZ-9000 manufactured by Keyence Corporation. The captured image data was subjected to image processing using Adobe Photoshop manufactured by Adobe Systems. The statistical significance of each group at each time point is due to the Mann-Whitney U test. P <0.05 was defined as “significantly different”.
図６は、本発明を適用する幹細胞活性化装置を用いて健常ラット背部に近赤外線を照射したときの骨髄内の各測定時点において、それらのデータの内、骨髄細胞数、脂肪細胞面積、ＣＤ３４陽性幹細胞数を示す図である。 FIG. 6 shows the number of bone marrow cells, the area of adipocytes, CD34 among the data at each measurement time point in the bone marrow when the back of a healthy rat was irradiated with near infrared rays using the stem cell activation device to which the present invention is applied. It is a figure which shows the number of positive stem cells.
図５，６から明らかな通り、非照射の実験開始時コントロール群及び１８０日間経過後コントロール群に比べて、近赤外線照射により、骨髄細胞数は減少しており、アポトーシス様細胞死による骨髄への非熱的損傷が認められた。しかし、そのような損傷は、近赤外線に対する生体防御システムにより最小限に抑えられている。この生体防御システムは、近赤外線照射によって、皮質骨質量を、肉様膜の筋膜上のＣＤ３４陽性細胞、及び骨皮質の内表面に存在するＣＤ３４陽性幹細胞（ＣＤ３４−ＰＳＣｓ）の発現により増加させたり、またその結果として、皮下脂肪細胞数や骨髄脂肪細胞数を増加させたりする。真皮の肥厚は、皮下組織層及び骨髄細胞を、近赤外線による損傷から保護する働きがあった。 As is clear from FIGS. 5 and 6, the number of bone marrow cells decreased by near-infrared irradiation compared to the control group at the start of the non-irradiation experiment and the control group after 180 days. Non-thermal damage was observed. However, such damage is minimized by the biological defense system against near infrared rays. This biological defense system increases the cortical bone mass by the expression of CD34 positive cells on the fleshy fascia and CD34 positive stem cells (CD34-PSCs) present on the inner surface of the bone cortex by near infrared irradiation. As a result, the number of subcutaneous fat cells or bone marrow fat cells is increased. The thickening of the dermis served to protect the subcutaneous tissue layer and bone marrow cells from damage by near infrared rays.
また、図５，６から明らかな通り、近赤外線照射により、非照射の実験開始時コントロール群及び１８０日間経過後コントロール群に比べて、脂肪細胞面積、ＣＤ３４陽性幹細胞数が増加することがわかった。 Further, as is apparent from FIGS. 5 and 6, it was found that the adipocyte area and the number of CD34 positive stem cells were increased by near-infrared irradiation compared to the non-irradiation experiment control group and the control group after 180 days. .
即ち、この生体防御システムでは、近赤外線照射によって、皮下脂肪細胞数や骨髄脂肪細胞数、骨髄中のＣＤ３４陽性幹細胞数を増加させたり、また皮質骨質量を増加させたりする。さらにこの影響はラットにおいても１８０日間と極めて長期にわたって維持されることが示唆された。とくに、ＣＤ３４陽性幹細胞数においては、１８０日間経過時まで増加したままで、活性化されたと考えられる。 That is, in this biological defense system, the number of subcutaneous fat cells, the number of bone marrow adipocytes, the number of CD34 positive stem cells in the bone marrow, and the mass of cortical bone are increased by near infrared irradiation. Furthermore, it was suggested that this effect is maintained for a very long period of 180 days even in rats. In particular, it is considered that the number of CD34-positive stem cells was activated while increasing until the lapse of 180 days.
また、肉様膜の筋膜上に存在する皮下脂肪細胞は、近赤外線照射後７日経過後に急激に誘導され、徐々に減少したものの、照射しなかったコントロール群の初日及び１８０日経過後に比べて、近赤外線照照射後７日、３０日、９０日及び１８０日経過後にも、有意な増加が認められたままであった（何れもP<0.05）。なお、皮下脂肪細胞は、照射しなかったコントロール群では初日と１８０日経過後とに有意差が認められなかった。 Subcutaneous fat cells present on the fleshy fascia were rapidly induced 7 days after the near infrared irradiation and gradually decreased, but compared with the first day and 180 days after the non-irradiated control group. Even after 7 days, 30 days, 90 days, and 180 days after the irradiation with near infrared light, a significant increase was observed (both P <0.05). In the control group that was not irradiated with subcutaneous fat cells, no significant difference was observed between the first day and after 180 days.
さらに、皮質骨質量は１８０日間、着実に増加していた。コントロール初日と照射後７日経過後との間（P=0.8340）、コントロール初日と照射後３０日経過後との間（P=0.3472）に、ラットの皮質骨質量は、夫々有意差は特に認められなかった。しかし、コントロール初日と、照射後９０日及び１８０日経過後との間に、ラットの皮質骨質量は、有意な増加が認められた（P<0.05）。なお、コントロール群初日と１８０日経過後との間（P=0.7540）に、ラットの皮質骨質量は、夫々有意差が特に認められなかった。 Furthermore, cortical bone mass was steadily increasing for 180 days. There was no significant difference in cortical bone mass between the first day of control and 7 days after irradiation (P = 0.8340) and between the first day of control and 30 days after irradiation (P = 0.3472). It was. However, a significant increase in rat cortical bone mass was observed between the first day of control and 90 and 180 days after irradiation (P <0.05). There was no significant difference in the cortical bone mass between the first day of the control group and after 180 days (P = 0.7540).
また、図６から明らかな通り、近赤外線照射群の造血性骨髄細胞は、照射後７日後に急速に減少し、照射後３０日経過後から１８０日経過後までに、徐々に増加した。近赤外線非照射のコンロトール群の初日又は１８０日経過後に対し、照射後７日、３０日、９０日、及び１８０日経過後のラットの造血性骨髄細胞に、有意な減少が認められた（P<0.05）。 Further, as is apparent from FIG. 6, hematopoietic bone marrow cells in the near-infrared irradiation group rapidly decreased 7 days after irradiation and gradually increased from 30 days after irradiation to 180 days after irradiation. A significant decrease was observed in the hematopoietic bone marrow cells of rats 7 days, 30 days, 90 days, and 180 days after irradiation, compared to the first day or 180 days after the irradiation of the near-infrared non-irradiated control hole group (P <0.05).
また、図６から明らかな通り、骨髄脂肪細胞は、照射後７日経過後に急激に誘導されて増加し、そののち、徐々に減少してはいるが、非照射のコントロールの初日又は１８０日経過後に対し、照射後７日、３０日、９０日、及び１８０日経過後のラットの骨髄脂肪細胞に、有意な増加が認められた（P<0.05）。 In addition, as is apparent from FIG. 6, bone marrow adipocytes are rapidly induced to increase 7 days after irradiation, and then gradually decrease, but on the first day of non-irradiated control or after 180 days. In contrast, a significant increase was observed in rat bone marrow adipocytes 7 days, 30 days, 90 days, and 180 days after irradiation (P <0.05).
また、肉様膜の筋膜上に存在するＣＤ３４陽性細胞は、照射後７日経過後に急激に増加し、そののち、徐々に減少したように観察される。 Further, CD34 positive cells existing on the fascia of the fleshy membrane are observed to increase rapidly after 7 days from irradiation and then gradually decrease.
また、図６から明らかな通り、骨髄中のＣＤ３４陽性幹細胞（ＣＤ３４−ＰＳＣｓ）は、照射７日経過後に急激に増加し、そののち、照射後１８０日経過時まで、増加し続けた。非照射のコントロール群の初日又は１８０日経過時に対し、照射後７日、３０日、９０日、及び１８０日経過後のラットのＣＤ３４陽性幹細胞に、有意な増加が認められた（P<0.05）。ＣＤ３４陽性幹細胞は、骨皮質の内表面に最も多く観察された。 Moreover, as is apparent from FIG. 6, CD34 positive stem cells (CD34-PSCs) in the bone marrow increased rapidly after 7 days of irradiation, and then continued to increase until 180 days after irradiation. A significant increase was observed in the CD34-positive stem cells of rats 7 days, 30 days, 90 days, and 180 days after irradiation, compared to the first day or 180 days after the non-irradiated control group (P <0.05). CD34 positive stem cells were most frequently observed on the inner surface of the bone cortex.
また、ＴＵＮＥＬ染色法により骨髄を調べたところ、非照射のコントロール群の初日及び照射後６０日経過後にＴＵＮＥＬ染色は陰性だったのに対し、照射後７日及び３０日経過後にＴＵＮＥＬ染色は陽性であった。ＴＵＮＥＬはＤＮＡ断片化を同定し、またアポトーシス又は壊死の何れかに対して陽性となる。照射後７日及び３０日経過後の組織における、繊維芽細胞および／又はリンパ細胞の炎症と過形成を含む壊死とを示す所見は見当たらなかった。
When the bone marrow was examined by the TUNEL staining method, TUNEL staining was negative on the first day of the non-irradiated control group and 60 days after irradiation, whereas TUNEL staining was positive after 7 and 30 days after irradiation. there were. TUNEL identifies DNA fragmentation and is positive for either apoptosis or necrosis. There was no evidence of fibroblast and / or lymphocyte inflammation and necrosis including hyperplasia in
近赤外線は、アポトーシス様細胞死を誘発する。活発に増殖中の細胞は、赤色及び近赤外色に対する感受性が増大している。増殖癌細胞がＴ２強調核磁気共鳴診断装置（ＭＲＩ）で水分が強調されて観察されるのと同様に、この増殖癌細胞も充分な水分量を含むため、近赤外線感受性が高い。従って、近赤外線照射は、増殖細胞に損傷を与えるようであり、それはアポトーシス様細胞死が観察されたような骨髄細胞数の有意な減少からも、明らかである。また、近赤外線照射により、骨髄細胞は一旦は減少したが、その後に増加したことから、骨髄細胞への損傷は可逆的であると考えられる。 Near-infrared induces apoptosis-like cell death. Actively proliferating cells have increased sensitivity to red and near infrared colors. Just as the proliferating cancer cells are observed with the water emphasized by a T2-weighted nuclear magnetic resonance diagnostic apparatus (MRI), the proliferating cancer cells also contain a sufficient amount of water, and thus have high near-infrared sensitivity. Thus, near-infrared irradiation appears to damage proliferating cells, which is also evident from a significant decrease in bone marrow cell numbers where apoptosis-like cell death was observed. In addition, bone marrow cells once decreased by near-infrared irradiation, but increased after that, so it is considered that damage to bone marrow cells is reversible.
このような特定波長の近赤外線が、ラットの棘突起中の骨髄の深さにまで到達するのはラットの皮膚が薄く（１０００〜１３００μｍ）と棘突起が体表面近くに存在するためと推察される。 It is inferred that the near-infrared rays of such a specific wavelength reach the bone marrow depth in the rat spinous process because the rat skin is thin (1000 to 1300 μm) and the spinous process is present near the body surface. The
これらの結果から明らかなように、この特定波長の近赤外線照射は、肉様膜の筋膜上に存在する皮下脂肪細胞、及び皮下脂肪細胞近隣の脂肪由来幹細胞を活性化させる。 As is clear from these results, this near-infrared irradiation at a specific wavelength activates subcutaneous fat cells present on the fascia of the fleshy membrane and fat-derived stem cells in the vicinity of the subcutaneous fat cells.
脂肪由来幹細胞は、間葉幹細胞由来の骨髄に比べて、高濃度でＣＤ３４を発現する。ＣＤ３４＋ヒト脂肪由来幹細胞は、ＣＤ３４−ヒト脂肪由来幹細胞に比べ、より高い増殖能を有している。このことから、近赤外線はＣＤ３４＋脂肪由来幹細胞を活性化したり刺激したりする結果、肉様膜の筋膜上に存在する皮下脂肪細胞の増加を引き起こすものと推察される。顕微鏡観察すると、脂肪組織は大きい散乱体を有している。液相の油分は透過し易いが、固相の油分は、相当に散乱し易い。長期的に誘導された皮下脂肪細胞は、下層の肉様膜のような組織を近赤外線による損傷から保護しているようである。 Adipose-derived stem cells express CD34 at a higher concentration than bone marrow derived from mesenchymal stem cells. CD34 + human adipose-derived stem cells have higher proliferation ability than CD34− human adipose-derived stem cells. From this, it is inferred that near-infrared rays activate and stimulate CD34 + adipose-derived stem cells, resulting in an increase in subcutaneous adipocytes existing on the fascia of the fleshy membrane. When observed under a microscope, adipose tissue has large scatterers. Liquid phase oil is easy to permeate, but solid phase oil is much more likely to scatter. Long-term induced subcutaneous fat cells appear to protect tissues such as the underlying flesh-like membrane from near-infrared damage.
近赤外線照射は、特に骨皮質の内表面にあるＣＤ３４陽性幹細胞（ＣＤ３４−ＰＳＣｓ）を活性化し、皮質骨質量を徐々に増大させ、また骨髄脂肪細胞を急激に誘導する。ＣＤ３４は、初期の造血細胞において高濃度となる幹細胞活性化段階でのマーカーである。骨の内表面に存する骨芽細胞から形成される造血幹細胞の増殖と分化を調整する生態的な微環境で、造血成長因子が産生される。骨芽細胞数の増加は、造血幹細胞数及び骨皮質質量の増加に比例する。近赤外線の散乱は骨髄脂肪細胞により増加し、また近赤外線の吸収は高い骨密度により増加していた。また、急激に誘発された骨髄脂肪細胞及び徐々に増加した骨皮質は、近赤外線から骨髄細胞を保護することが可能である。 Near-infrared irradiation activates CD34 positive stem cells (CD34-PSCs), particularly on the inner surface of the bone cortex, gradually increasing cortical bone mass and rapidly inducing bone marrow adipocytes. CD34 is a marker at the stage of stem cell activation that is high in early hematopoietic cells. Hematopoietic growth factors are produced in an ecological microenvironment that regulates the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells formed from osteoblasts present on the inner surface of bone. The increase in osteoblast number is proportional to the increase in hematopoietic stem cell number and bone cortical mass. Near-infrared scattering was increased by bone marrow adipocytes, and near-infrared absorption was increased by high bone density. Also, rapidly induced bone marrow adipocytes and gradually increased bone cortex can protect the bone marrow cells from near infrared.
これらの結果は、この幹細胞活性化装置は、この近赤外線照射により幹細胞を効率よく活性化させ、増殖させてさらに分化促進させることができることを示している。また、温度調節によって正常細胞の損傷を最小限に防ぐことも可能で、さらに幹細胞の周辺に存在する分化した細胞をアポトーシス様細胞死させるので、幹細胞だけを選択的に、非常に効率よく、活性化させ、増殖させてさらに分化促進させることができることが明らかである。近赤外線照射は、表層の組織及び骨髄細胞に損傷を与えたが、脂肪細胞及び骨皮質質量を増加させる幹細胞を活性化させるという特長がある。 These results indicate that this stem cell activation device can efficiently activate stem cells by this near infrared irradiation and proliferate them to further promote differentiation. In addition, it is possible to prevent damage to normal cells to a minimum by adjusting the temperature, and since apoptotic cells die in the differentiated cells that exist around the stem cells, so that only the stem cells are selectively and very efficiently activated. Clearly, it can be made to proliferate and be further differentiated. Near-infrared irradiation damages surface tissues and bone marrow cells, but has the advantage of activating stem cells that increase fat cells and bone cortical mass.
これらの結果からも明らかなように、この幹細胞活性化装置によれば、深部の組織構造への近赤外線の到達が可能であり、幹細胞の分化促進が可能となる。 As is clear from these results, according to this stem cell activation device, it is possible to reach near-infrared rays to a deep tissue structure and to promote differentiation of stem cells.
図７に、４００〜約３０００ｎｍの波長と、本発明を適用する実施例の幹細胞活性化装置を用いたときの放射照度、及びメラニン、ヘモグロビン、水の吸収係数との相関を示す。図７から明らかなように、幹細胞活性化装置から出射される近赤外線は、特に１０００〜１８００ｎｍの波長域で放射照度が高いが、その内、１４００〜１５００ｎｍの波長域では放射照度が特に低いので、前記のように、ヘモグロビンやメラニンの多い部位にもその近赤外線の照射が可能となっている。 FIG. 7 shows the correlation between the wavelength of 400 to about 3000 nm, the irradiance when using the stem cell activation device of the example to which the present invention is applied, and the absorption coefficients of melanin, hemoglobin, and water. As is apparent from FIG. 7, the near infrared ray emitted from the stem cell activation device has a high irradiance particularly in the wavelength range of 1000 to 1800 nm, but among them, the irradiance is particularly low in the wavelength range of 1400 to 1500 nm. As mentioned above, near-infrared rays can be irradiated even on a portion rich in hemoglobin or melanin.
この幹細胞活性化装置によりラットの幹細胞を活性化させ、増殖させてさらに分化促進させる例を示したが、それと同様に、他の哺乳動物のみならず各種動物でも、植物でも同様の結果を示すことができ、また、培養液中で幹細胞を活性化させ、増殖させることができ、さらに分化させたりそれらを促進させたりすることもでき、またそれからシート状培養皮膚や培養臓器へ誘導することも可能である。 In this example, the stem cell activation device activates rat stem cells and proliferates them to promote further differentiation. Similarly, it shows similar results not only in other mammals but also in various animals and plants. In addition, stem cells can be activated and proliferated in the culture medium, and can be further differentiated and promoted, and then induced into sheet-like cultured skin and organs. It is.
本発明の幹細胞活性化装置、及びそれを用いた幹細胞活性化方法により、ヒト、非ヒト動物、植物などの生物や、そこから摘出した組織若しくはその細胞、又は微生物に用いて幹細胞を活性化させ、増殖させることができ、さらに分化させたりそれらを促進させたりすることもできる。分化した幹細胞は、再生医療の原材料として、疾病による摘出手術、外傷による損傷部位などの復元に、使用される。 The stem cell activation device of the present invention and the stem cell activation method using the same activate a stem cell using a living organism such as a human, a non-human animal, a plant, a tissue or a cell extracted from the organism, or a microorganism. , And can be further differentiated or promoted. The differentiated stem cells are used as a raw material for regenerative medicine for excision surgery due to diseases and restoration of damaged sites due to trauma.
１は幹細胞活性化装置、２は生体、３は対象組織又は細胞、１１は発振回路、１２はタイマー、１３は変調回路、１４はスイッチ回路、１５は近赤外線出射源、１６ａ・１６ｂはフィルタ、１７はレンズ、１８はサファイアガラス冷却窓、１９ａ・１９ｂはクーラー、２０は近赤外線、２１はクーラー制御回路、２２は反射板、２３は内空、２４は二重管、３０はハンドピース、３１はハウジング、３２はスイッチである。 1 is a stem cell activation device, 2 is a living body, 3 is a target tissue or cell, 11 is an oscillation circuit, 12 is a timer, 13 is a modulation circuit, 14 is a switch circuit, 15 is a near infrared emission source, 16a and 16b are filters, 17 is a lens, 18 is a sapphire glass cooling window, 19a and 19b are coolers, 20 is near infrared, 21 is a cooler control circuit, 22 is a reflector, 23 is an interior, 24 is a double tube, 30 is a handpiece, 31 Is a housing, and 32 is a switch.
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