JP2012093092A - 平板型カラム、それを用いた分離システムおよび分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】クロマトグラフィー分離と電気泳動分離を行う。
【解決手段】一対のガラス基板の間に試料が流れる流路が形成され、その流路において、試料の流れ方向に有機モノリスを有し、試料の流れを横断する方向に電圧を印加するための一対の電極を有する構成の平板型カラムを用いることにより、流れ方向ではクロマトグラフィー分離が進行し、同時に流れを横断する方向に電圧印加をおこなうことで、電気泳動分離を行う。このことにより、試料成分は平板型カラム内で二次元的に分離される。
【選択図】図２

Description

本発明は、電気泳動分離とクロマトグラフィー分離を行う平板型カラム、それを用いた分離システムおよび分離方法に関するものである。

生体分析では多種多様な成分を網羅的に分離・分析することが求められている。多種多様な成分を分離するためには、二次元電気泳動や二次元クロマトグラフィーのように、複数の方法（分離モード）を用いる方法が汎用される（特許文献１、非特許文献１、２参照）。

特開２００５−３１２４０２号公報

"Fast, comprehensive two-dimensional liquid chromatography.", Stoll Dwight R; Li Xiaoping; Wang Xiaoli; Carr Peter W; Porter Sarah E G; Rutan Sarah C, J. Chromatogr. A (2007),1168, 3-43. 奥村宣明、永井克也 「プロテオミクスにおける二次元電気泳動」 Molecular Medicine 別冊、癌ゲノム学、39:158-165 (2002)

従来法では、一つの分離モードでの分離が終了した後、分離された試料の全体、もしくはその一部をさらに別のモードで分離をおこなう。そのため、(1)分離の長時間化や(2)煩雑な操作手順、(3)複雑な流路切り替えシステムが必用などの問題点がある。

本発明は上記点に鑑みて、クロマトグラフィー分離と電気泳動分離を同時に行う平板型カラム、それを用いた分離システムおよび分離方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は、一対の基板の間に試料が流れる流路が形成され、前記流路における前記試料の流れ方向にクロマトグラフィー用固定相を有し、前記流路における前記試料の流れを横断する方向に電圧を印加するための一対の電極を有する平板型カラムを第１の特徴とする。

本発明は、上記した平板型カラムと、前記平板型カラムの流路に移動相を連続的に導入する第１の導入手段と、前記平板型カラムの流路に試料溶液を導入する第２の導入手段と、前記一対の電極間に電圧を印加する電源手段と、を有する分離システムを第２の特徴とする。

本発明は、上記した分離システムにおいて、クロマトグラフィー分離用送液を行うために前記平板型カラムに取り付けられたインターフェイスを有し、このインターフェイスには、移動相供給口と、この移動相供給口よりも下流側に位置する試料溶液導入口とが設けられており、前記第１の導入手段は、前記移動相供給口から前記移動相を供給し、前記第２の導入手段は、前記試料溶液導入口から前記試料溶液を供給することを第３の特徴とする。

本発明は、上記第３の特徴において、前記インターフェイスは、頂点に前記移動相供給口が存在する三角形のものであり、前記移動相供給口から供給された移動相が前記平板型カラムに向かって広がるようになっていることを第４の特徴とする。

本発明は、上記した平板型カラムを用い、前記平板型カラムに導入された試料を前記クロマトグラフィー用固定相によりクロマトグラフィー的に分離すると同時に、前記一対の電極間に電圧を印加して導入された試料を電気泳動分離する分離方法を第５の特徴とする。

本発明の第１実施形態における平板型カラムの全体構成を示す図である。 本発明の第１実施形態における平板型カラムを用いた分離装置の全体構成を示す図である。

（第１実施形態）
表面を3-メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランで修飾したガラス板（40×50 mm）の両端に2つの電極（金メッキした銅箔、10×50 mm、厚さ0.05 mm）を、接着し、その電極の上にさらに3-メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランで修飾したガラス板を接着し、両端に電極を持つ長方形断面（30 mm × 0.05 mm）の流路を有する平板型ガラス空カラムを作成した。この平板型ガラス空カラムに、メタクリル酸ブチル(モノマー，24%)，二メタクリル酸エチレン（架橋剤，16%），1-デカノール（細孔形成剤，34%），シクロヘキサノール（細孔形成剤，26%），2,2-ジメトキシフェニル-2-アセトフェノン（光開始剤，モノマーと架橋剤の合計に対して1%）からなる重合反応溶液を注入した。反応溶液を満たした平板型ガラス空カラムに、0℃に保った恒温装置内で紫外線（強度約4 mW/cm2，波長 254 nm）を照射し，in situ光重合により有機モノリスを調製した。光重合後，メタノールを吸引送液し未反応物を除去し、図1に示す両端に電極を有する平板型ガラスカラムを調製した。

図1に示す平板型ガラスカラムを用いて、図2に示す分離システムを構成した。調製した平板型ガラスカラムにクロマトグラフィー分離のための送液を行うため三角形のインターフェイスを取り付けた。第１の導入手段をなす移動相送液ポンプを用いて、三角形のインターフェイスの頂点に存在する移動相供給口から供給された移動相は、三角形のインターフェイス内の流路を流れ、図に示すように広がって、平板型カラムへ連続的に導入される。インターフェイス内には別途、試料溶液導入口が設置されており、第２の導入手段をなす試料溶液導入ポンプを用いることで、インターフェイス内（カラム内）に試料溶液を導入することができる。導入された試料は、平板型カラム内の有機モノリスにより、クロマトグラフィー的に分離することが可能である。また、平板型カラムの両端に設置された電極に対して、電源手段をなす電源装置を用いて電圧を印加することで、導入された試料を電気泳動させることが可能である。

図２に示す装置を用いて、0.1% トリフルオロ酢酸を添加したメタノールを移動相として平板型カラムに連続的に供給した。平板型カラムに365 nmの紫外光を照射し、CCDカメラをもちいて蛍光観察を行った。

電圧印加を行わない状態で、ピレンとキニーネを試料として用いた際には、疎水性の高いピレンの移動相流れ方向の移動速度が遅く、また疎水性が小さく固定相との相互作用が小さなキニーネの移動速度が大きいことから、クロマトグラフィー分離が可能であることが確認された。また、電圧印加（150 V）をおこなうと、キニーネが流れを横断する方向に電気泳動することが確認された。この横断流れ（電気泳動）は中性物質であるピレンでは観測されなかった。すなわち、電気泳動分離が可能であることが確認された。

上述した実施形態によれば、一対の四角形状のガラス基板の間に試料が流れる流路が形成され、その流路において、試料の流れ方向に有機モノリスを有し、試料の流れを横断する方向に電圧を印加するための一対の電極を有する構成の平板型カラムを用いることにより、クロマトグラフィー分離と電気泳動分離を同時に進行させることができる。つまり、クロマトグラフィー分離と電気泳動分離を直交させることができる両端に電極を有する平板型カラムを用いることにより、流れ方向ではクロマトグラフィー分離が進行し、同時に流れを横断する方向に電圧印加をおこなうことで、電気泳動分離を行う。このことにより、試料成分は平板型カラム内で二次元的に分離される。

（他の実施形態）
上述した実施形態においては、有機モノリスを調製する際の重合反応溶液として、「メタクリル酸ブチル(モノマー，24%)，二メタクリル酸エチレン（架橋剤，16%），1-デカノール（細孔形成剤，34%），シクロヘキサノール（細孔形成剤，26%），2,2-ジメトキシフェニル-2-アセトフェノン（光開始剤，モノマーと架橋剤の合計に対して1%）」を用いているが、これ以外の溶液（例えば、モノマーをメタクリル酸グリシジルに、細孔径製剤を水になど）で代用することもできる。

上述した実施形態においては、有機モノリスを調製する際に光重合反応を用いているが、これ以外の反応（例えば熱重合反応など）を用いることもできる。

上述した実施形態においては、有機モノリス用いて平板型カラムを調製しているがが、これ以外（例えば、無機モノリス、充填剤など）で代用することもできる。

上述した実施形態においては、有機モノリスをクロマトグラフィー用固定相として用いる場合について説明したが、これ以外（例えば、無機モノリス、充填剤など）を固定相として代用することもできる。

また、上述した実施形態においては平板型カラムの構成要素として、ガラスを用いているが、これ以外（例えば石英、テフロン（登録商標）、PEEK、表面に絶縁処理を施した金属など）で代用することもできる。

また、上述した実施形態においては平板型カラムに付随する電極として、金メッキした銅箔を用いているが、これ以外（例えば金、白金、グラファイトなど）で代用することもでき、0.05 mm以外の任意の厚さを用いることができる。

また、上述した実施形態においては40×50 mmのガラス版、10×50 mmの電極を用いているが、これ以外の任意の大きさのもので代用することができる。

Claims (5)

1. 一対の基板の間に試料が流れる流路が形成され、前記流路における前記試料の流れ方向にクロマトグラフィー用固定相を有し、前記流路における前記試料の流れを横断する方向に電圧を印加するための一対の電極を有することを特徴とする平板型カラム。
2. 請求項１に記載の平板型カラムと、
   前記平板型カラムの流路に移動相を連続的に導入する第１の導入手段と、
   前記平板型カラムの流路に試料溶液を導入する第２の導入手段と、
   前記一対の電極間に電圧を印加する電源手段と、を有することを特徴とする分離システム。
3. クロマトグラフィー分離用送液を行うために前記平板型カラムに取り付けられたインターフェイスを有し、
   このインターフェイスには、移動相供給口と、この移動相供給口よりも下流側に位置する試料溶液導入口とが設けられており、
   前記第１の導入手段は、前記移動相供給口から前記移動相を供給し、
   前記第２の導入手段は、前記試料溶液導入口から前記試料溶液を供給することを特徴とする請求項２に記載の分離システム。
4. 前記インターフェイスは、頂点に前記移動相供給口が存在する三角形のものであり、前記移動相供給口から供給された移動相が前記平板型カラムに向かって広がるようになっていることを特徴とする請求項３に記載の分離システム。
5. 請求項１に記載の平板型カラムを用い、前記平板型カラムに導入された試料を前記クロマトグラフィー用固定相によりクロマトグラフィー的に分離すると同時に、前記一対の電極間に電圧を印加して導入された試料を電気泳動分離することを特徴とする分離方法。