JP2012080791A - Method for evaluating predisposition to pediatric solid tumor or esophageal cancer, evaluation kit, agent for the same, and method for selecting the same - Google Patents
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Description
本発明は、小児固形腫瘍または食道癌素因の評価方法及び評価キット、また、その薬剤及びその選択方法に関する。 The present invention relates to a method and kit for evaluating a predisposition to a childhood solid tumor or esophageal cancer, and a drug and a selection method thereof.
ユーイング肉腫ファミリー（Ewing sarcoma family of tumours：ESFT）は、骨や軟組織の小円形細胞腫瘍であり、骨ユーイング腫瘍、骨外性ユーイング腫瘍、末梢神経上皮腫（peripheral neuroepithelioma：PNET）、アスキン腫瘍（胸壁のPNET）が含まれる(非特許文献１)。十代の若者に多く、さらに５年生存率が50％以下とその予後は不良である(非特許文献２)。 The Ewing sarcoma family of tumours (ESFT) is a small round cell tumor of bone and soft tissue, including bone Ewing tumor, extraosseous Ewing tumor, peripheral neuroepithelioma (PNET), askin tumor (chest wall) (Non-Patent Document 1). It is more common among teenagers, and the 5-year survival rate is 50% or less, and the prognosis is poor (Non-patent Document 2).
ESFTの遺伝子の際立った特徴は、その多くにEWS-FLI-1または他の関連融合遺伝子が存在することであり、ESFTの成長におけるその重要な役割を強調している(非特許文献３)。実際、未分化マウス骨髄細胞にEWS-FLI-1融合遺伝子を形質導入するとESFTに似た腫瘍が再生され、ESFTにおけるこの融合が果たす病因的役割を裏付けている(非特許文献４)。
しかし、ESFTの成長及び／またはESFT素質に他の共同する遺伝子的変化が関与しているかどうかは、依然として不明である。
A prominent feature of ESFT genes is the presence of EWS-FLI-1 or other related fusion genes in many of them, highlighting its important role in ESFT growth (Non-patent Document 3). Indeed, when EWS-FLI-1 fusion gene is transduced into undifferentiated mouse bone marrow cells, a tumor resembling ESFT is regenerated, supporting the pathogenic role of this fusion in ESFT (Non-patent Document 4).
However, it remains unclear whether other joint genetic changes are involved in ESFT growth and / or ESFT predisposition.
未分化リンパ腫キナーゼ（anaplastic lymphoma kinase：ALK）は、未分化大細胞リンパ腫（anaplastic large cell lymphoma：ALCL）内でのt(2;5)(p23;q35)転座により生成されたNPM-ALK融合キナーゼとして同定された受容体チロシンキナーゼの一つである(非特許文献５、６)。ALKはまた、ALCLに加え炎症性筋線維芽細胞腫瘍内でも異なる融合キナーゼの生成にも関与していて(非特許文献７)、inv(2)(p21p23)により別の融合キナーゼ（EML4-ALK）を生成する一部の非小細胞肺癌の病因である(非特許文献８)。 Anaplastic lymphoma kinase (ALK) is an NPM-ALK fusion generated by t (2; 5) (p23; q35) translocation in anaplastic large cell lymphoma (ALCL) It is one of receptor tyrosine kinases identified as kinases (Non-Patent Documents 5 and 6). ALK is also involved in the generation of different fusion kinases in inflammatory myofibroblast tumors in addition to ALCL (Non-patent Document 7), and another fusion kinase (EML4-ALK) is obtained by inv (2) (p21p23). This is the etiology of some non-small cell lung cancers that produce (Non-patent Document 8).
また、最近になって、大部分の家族性神経芽腫症例における神経芽腫素質の主な原因が、複数の生殖細胞系ALK変異であることが証明されている。さらに、本発明者らによって、散発性神経芽腫症例の約8％において体細胞機能獲得型変異またはALK遺伝子増幅が起こっていることを報告している(非特許文献９〜１２)。
Recently, it has been demonstrated that the major cause of neuroblastoma predisposition in most familial neuroblastoma cases is multiple germline ALK mutations. Furthermore, the present inventors have reported that somatic cell function gain mutation or ALK gene amplification occurs in about 8% of sporadic neuroblastoma cases (Non-Patent
ESFTと神経芽腫は、全く異なる臨床病理学的特徴及び分子遺伝学的特徴を有してはいるが、両腫瘍はさまざまな神経分化度を示し、両腫瘍の神経堤起原の可能性を示す報告がある(非特許文献１３、１４)。さらに、近年の分子免疫組織化学的研究により、ESFT及び神経芽腫ではALKが頻繁に発現されていることが立証され(非特許文献１５、１６)、これにより、ESFT由来細胞株に加え、多数の原発性ESFT症例におけるALKの変異状態の研究も促された。 Although ESFT and neuroblastoma have completely different clinicopathological and molecular genetic features, both tumors show varying degrees of neuronal differentiation, indicating the potential for neural crest origin of both tumors. There are reports to show (Non-Patent Documents 13 and 14). Furthermore, recent molecular immunohistochemical studies have demonstrated that ALK is frequently expressed in ESFT and neuroblastoma (Non-Patent Documents 15 and 16), and in addition to ESFT-derived cell lines, many The study of ALK mutation status in primary ESFT cases was also encouraged.
しかし、ALKの変異状態と、小児固形腫瘍または食道癌との関係については、知見がなかった。 However, there was no knowledge of the relationship between ALK mutation status and pediatric solid tumors or esophageal cancer.
そこで、本発明は、小児固形腫瘍または食道癌の素因を評価する方法及び評価キット、また、その薬剤及びその選択方法を提供することを課題とする。 Then, this invention makes it a subject to provide the method and evaluation kit which evaluate the predisposition of a child solid tumor or esophageal cancer, its agent, and its selection method.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価方法は、小児固形腫瘍または食道癌を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ALK遺伝子の変異を検知する工程を有することを特徴とする。 The method for assessing a predisposition for a childhood solid tumor or esophageal cancer according to the present invention is a method for assessing whether or not the childhood solid tumor or esophageal cancer has a predisposition that can cause pediatric solid tumor or esophageal cancer. It has the process of detecting the variation | mutation of a gene.
小児固形腫瘍としては、神経芽腫以外の腫瘍が好適に対象となる。 As a child solid tumor, tumors other than neuroblastoma are preferably targeted.
ALK遺伝子変異の検知としては、そのＳＮＰまたはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型の検知が有用である。ＳＮＰに変異があれば素因があると評価し、逆に、ＳＮＰに変異がなければ素因がない可能性があると間接的に評価してもよい。 As detection of ALK gene mutation, detection of the SNP or a genetic polymorphism in a linkage disequilibrium relationship with it is useful. If there is a mutation in the SNP, it may be evaluated that there is a predisposition, and conversely, if there is no mutation in the SNP, it may be indirectly evaluated that there may be no predisposition.
少なくとも、A1280V、R1192G、A876Tのいずれかのアミノ酸変異を生じさせるＳＮＰがある場合に、小児固形腫瘍または食道癌を生じ得る素因を有すると評価してもよい。 If there is at least a SNP that causes any amino acid mutation of A1280V, R1192G, or A876T, it may be evaluated as having a predisposition to cause childhood solid tumor or esophageal cancer.
特に、A1280Vの変異が、GCGからGTGへの変異であるか、R1192Gの変異が、CGGからGGGへの変異であるか、A876Tの変異が、GCCからACCへの変異であることを指標としてもよい。 In particular, whether the A1280V mutation is a GCG to GTG mutation, the R1192G mutation is a CGG to GGG mutation, or the A876T mutation is a GCC to ACC mutation. Good.
遺伝子多型の検知には、ダイレクトシークエンス法、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＨＲＭ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、Ｑ−ｐｒｏｂｅ法（ＱＰ法）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法のいずれかが利用可能である。 For detection of gene polymorphism, direct sequencing method, BAC array CGH method, FISH method, RFLP method, PCR-SSCP method, allele-specific oligonucleotide hybridization method, TaqMan PCR method, Invader method, HRM method, SmartAmp method, Any of Q-probe method (QP method), MALDI-TOF / MS method, molecular beacon method, RCA method, UCAN method, nucleic acid hybridization method using DNA chip or DNA microarray can be used.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価キットは、小児固形腫瘍または食道癌を生じ得る素因を有するか否かを評価するキットであって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ALK遺伝子のA1280V、R1192G、A876Tの少なくともいずれかにおけるＳＮＰ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検知する手段を備えることを特徴とする。 The childhood solid tumor or esophageal cancer predisposition evaluation kit of the present invention is a kit for evaluating whether or not a childhood solid tumor or esophageal cancer has a predisposition to cause pediatric solid tumor or esophageal cancer. It comprises a means for detecting a SNP in at least one of A1280V, R1192G, and A876T of a gene, or a gene polymorphism in a linkage disequilibrium relationship therewith.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤候補物質選定方法は、小児固形腫瘍または食道癌の治療薬、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤の候補物質を選定する方法であって、試験物質の存在下及び非存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、それぞれの細胞においてチロシンキナーゼの酵素活性の上昇度を測定する工程と、その酵素活性の上昇を抑制する効果を有する試験物質を候補物質として選定する工程を含むことを特徴とする。 The method for selecting a drug candidate substance for childhood solid tumor or esophageal cancer according to the present invention is a method for selecting a candidate drug for a childhood solid tumor or esophageal cancer drug or a drug that reduces the predisposition to cause the disease. A step of culturing mammalian cells in the presence and absence of a substance, a step of measuring the increase in enzyme activity of tyrosine kinase in each cell, and a test substance having an effect of suppressing the increase in enzyme activity The method includes a step of selecting as a candidate substance.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤は、小児固形腫瘍または食道癌、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、チロシンキナーゼの酵素活性の上昇を抑制する効果を有することを特徴とする。 The drug for pediatric solid tumor or esophageal cancer of the present invention is a drug that reduces the predisposition to cause pediatric solid tumor or esophageal cancer, or a disease thereof, and has an effect of suppressing an increase in the enzyme activity of tyrosine kinase. Features.
本発明によると、小児固形腫瘍や食道癌の早期治療や予防に寄与する。 The present invention contributes to early treatment and prevention of childhood solid tumors and esophageal cancer.
以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、前記特許文献など従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能であり、また、薬剤の製造方法及び装置についても従来公知の技術を適宜適用可能である。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described. Embodiments can be appropriately changed in design by using conventionally known techniques such as the above-mentioned patent documents, and conventionally known techniques can be appropriately applied to methods and apparatuses for producing drugs.
本研究では、東京大学倫理委員会の承認の上（承認番号：1598）、総数で80の匿名化された原発性ESFT保存検体を東京大学倫理委員会の規定に従って解析した。原発性腫瘍は全て1993年11月から2008年12月の間に共同研究病院において手術または生検により取得した。EWS-FLI1、EWS-ERG、EWS-ETV1またはEWS-FEV融合転写産物の存在が、良質なＲＮＡ検体が得られた44検体で、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により確認された。本研究には、17のESFT由来細胞株も含まれる。UTP-ES1、ALK変異ESFT細胞株、SCMC-ES1の樹立、SJES系、SK系及びES-1-OT以外の細胞株は、the Japanese Cancer Resource Cell Bank(http://cellbank.nibio.go.jp/wwwjcrbj.htm)から入手した。これら細胞株は全て、ウシ胎仔血清10％を添加したRPMI1640培地(GIBCO RLB,Grand Island,NY,USA)中で培養した。 In this study, with the approval of the University of Tokyo Ethics Committee (approval number: 1598), a total of 80 anonymized primary ESFT specimens were analyzed according to the rules of the University of Tokyo Ethics Committee. All primary tumors were obtained by surgery or biopsy at a collaborative hospital between November 1993 and December 2008. The presence of EWS-FLI1, EWS-ERG, EWS-ETV1 or EWS-FEV fusion transcript was confirmed by reverse transcription polymerase chain reaction in 44 samples from which good quality RNA samples were obtained. The study also includes 17 ESFT-derived cell lines. Cell lines other than UTP-ES1, ALK mutant ESFT cell line, establishment of SCMC-ES1, SJES line, SK line and ES-1-OT are available at the Japanese Cancer Resource Cell Bank (http: //cellbank.nibio.go. (jp / wwwjcrbj.htm). All of these cell lines were cultured in RPMI 1640 medium (GIBCO RLB, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% fetal calf serum.
まず、ESFT検体中におけるALKの変異及び発現の分析を行った。
ALK遺伝子のエクソン20から28をゲノム遺伝子からPCR増幅し、DNAへテロ二本鎖分析及び／または直接塩基配列決定法により変異について調査した。PCRの条件及びプライマーは非特許文献９の通りである。ALK発現の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応分析は、症例9、症例35及びUTP-ES1について行った。ALK変異検体のゲノムコピー数の解析は、GeneChip単一ヌクレオチド多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）遺伝子決定マイクロアレイ（Affymetrix GeneChip 250K NspI;Santa Clara,CA,USA）及び非特許文献９のCNAG/AsCNARを使用して行った。
First, mutations and expression of ALK in ESFT samples were analyzed.
次に、変異ALKの機能解析を行った。
ALKWT-FLAG及びALKF1174L-FLAGは、それぞれ、野生型ALKのFLAGタグ付きcDNA及びそのF1174L変異体である（非特許文献９）。A1280V変異体のFLAGタグ付きcDNA(ALKA1280V-FLAG)は、腫瘍検体の全RNAからハイフィディリティPCRにより単離した。再配列解析後、各cDNAを発現プラスミドpcDNA3に組み込み、EffecteneTMトランスフェクション試薬（QIAGEN,Tokyo,Japan）を使ってNIH3T3細胞に遺伝子導入した。
変異ALKキナーゼのウェスタンブロット分析及びインビトロキナーゼ測定は非特許文献９の方法により行った。ALK変異ESFT細胞株、UTP-ES1以外に、ESFT（SJES-7及びSJES-6）及び神経芽腫（SK-N-SH）細胞株もALK阻害剤TAE684(非特許文献１７)の濃度を変えながら培養し、それぞれの細胞の成長をCellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay
(Promega,Tokyo,Japan)を使って測定した。コントロールとしてNIH3T3細胞を使用した。UTP-ES1に対するTAE684のIC50値は、GrapfPad Prism 5 software（GraphPad,La Jolla,CA,USA）を使用して非線形回帰により算出した。同じ細胞株をALK特異的siRNAまたは非特異的siRNAでトランスフェクトし、細胞成長に対する効果を既報(9)のようにCellTiter-GloTMを使用して生存細胞数を測定することにより評価した。
Next, functional analysis of mutant ALK was performed.
ALK WT -FLAG and ALK F1174L -FLAG are wild-type ALK FLAG-tagged cDNA and its F1174L mutant, respectively (Non-patent Document 9). A1280V mutant FLAG-tagged cDNA (ALK A1280V- FLAG) was isolated from total RNA of tumor specimens by high fidelity PCR. After rearrangement analysis, each cDNA was incorporated into the expression plasmid pcDNA3 and introduced into NIH3T3 cells using Effectene ™ transfection reagent (QIAGEN, Tokyo, Japan).
Western blot analysis and in vitro kinase measurement of mutant ALK kinase were performed by the method of
(Promega, Tokyo, Japan). NIH3T3 cells were used as a control. The IC 50 value of TAE684 against UTP-ES1 was calculated by non-linear regression using GrapfPad Prism 5 software (GraphPad, La Jolla, CA, USA). The same cell line was transfected with ALK-specific siRNA or non-specific siRNA, and the effect on cell growth was assessed by measuring the number of viable cells using CellTiter-Glo ™ as described previously (9).
図1は、ALKのタンパク構造を示す説明図であり、図2は、Ewing肉腫の症例で検出されたALK変異を示す説明図である。
ESFTにおけるALK異常については、原発性ESFT80検体及びEFST由来17細胞株について、DNAへテロ二本鎖形成分析及び／またはALKのALK膜近傍ドメイン及びキナーゼドメインを包含するPCR増幅されたALKエクソンの直接塩基配列決定により、ALK変異をスクリーニングしたところ、３つの腫瘍検体、症例9のA1280V、症例9から樹立されたUTP-ES1及び症例35のR1192Gのキナーゼドメイン内に２つのヌクレオチドミスセンス変化が見出された。両変化はまた、それらの対応正常DNAにも存在し、生殖細胞系由来であることが確認された。腫瘍検体における変異ALKの発現は両症例において認められた。
FIG. 1 is an explanatory diagram showing the protein structure of ALK, and FIG. 2 is an explanatory diagram showing an ALK mutation detected in a case of Ewing sarcoma.
For AFT abnormalities in ESFT, for primary ESFT80 specimens and 17 cell lines derived from EFST, DNA heteroduplex formation analysis and / or direct PCR amplified ALK exon including ALK near ALK membrane domain and kinase domain Screening for ALK mutations by sequencing revealed two nucleotide missense changes in the kinase domains of three tumor specimens, A1280V in
これらのヌクレオチド変化は50人の健常ボランティアには同定されず、dbSNPデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)にも登録されていなかった。さらに、これらの変化は、これまで家族性及び／または散発性神経芽腫（非特許文献９〜１２、１８）について報告された14のアミノ酸位置での20の変異のいずれにも一致せず、したがって、非機能的な一塩基型多型というよりはむしろ新規生殖細胞系変異を意味していると考えられる。
対応正常DNAは、この位置に明確にヘテロ接合体クロマトグラムを示したのに対して、症例9及びUTP-ES1腫瘍検体だけが変異（1280V）対立遺伝子を含有していた。このことに一致して、SNPアレイ分析により、野生型対立遺伝子が変異対立遺伝子の複製による染色体の誤分離により失われたと思われる第2染色体全体の獲得片親ダイソミー（aUPD）が明らかにされた。機能獲得対立遺伝子を選択するaUPDは、骨髄増殖性疾患におけるJAK2変異に対して十分に立証されていて（非特許文献１９）、神経芽腫細胞株においても報告されている（非特許文献９）。ALK発現は、ALK変異を有する症例9、症例35、UTP-ES1検体に検出された。
These nucleotide changes were not identified in 50 healthy volunteers and were not registered in the dbSNP database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Furthermore, these changes are not consistent with any of the 20 mutations at the 14 amino acid positions previously reported for familial and / or sporadic neuroblastoma (Non-Patent Documents 9-12, 18), Therefore, it is thought to mean a novel germline mutation rather than a non-functional single nucleotide polymorphism.
Corresponding normal DNA clearly showed a heterozygote chromatogram at this position, whereas
図３は、生殖細胞系変異ALKを有する患者の臨床病理学的所見を示す表である。
症例9は、前月から持続性の右頭痛のために収容された9歳の少年である。臨床検査及び頭部のコンピュータ断層撮影により、副鼻腔を含む右鼻腔に固形腫瘍を有することが明らかになった。リンパ節腫脹や転移の兆候は見られなかった。腫瘍は、過色素性の核と少量の細胞質を有する小円形細胞から成っていた。腫瘍細胞は、ビメンチン、CD99 (MIC2)、CD56、S-100及び神経特異的エノラーゼ（NSE）陽性であったが、ミオグロビン、デスミン、ケラチン及び白血球共通抗原（LCA）陰性であった。腫瘍検体中にEWS-FLI1融合転写産物が検出された。患者は多剤化学療法による治療を受けたが、最初の診断から12ヶ月後に死亡した。
症例35は、左の斜視、眼球突出及び鼻出血を有する6歳の少年である。CTスキャンにより、左鼻気道及び副鼻腔を含む大きな小葉腫瘤が検出された。転移の兆候は見られなかった。腫瘍は、少量の細胞質を有する小円形細胞から成っていて、ビメンチン、CD99、CD56、及びNSE陽性、S-100及びCD57弱陽性であった。ミオシン、デスミン及びHHF35は陰性であった。細胞発生学的検討は、t(2;22)(q35;q11)を示し、EWS-FEV融合転写産物が患者の腫瘍中に検出された。患者は、放射線化学療法及びタンデム自家末梢血幹細胞移植後、完全に寛解した。
FIG. 3 is a table showing clinicopathological findings of patients with germline mutation ALK.
２つの生殖細胞系変異は、異なる種にわたり、かつ分子進化を通して高度に保存されているキナーゼドメイン内のアミノ酸を伴っていたので、これら変異のALKキナーゼ活性に対する効果を詳細に検討した。
FLAGタグ付きALK変異、ALKA1280VをFLAGタグ付き野生型ALK及び神経芽腫由来ALK変異体ALKF1174Lと共にNIH3T3細胞内で過渡的に発現させ（非特許文献９）、免疫沈降したALKタンパク質のインビトロにおけるチロシンキナーゼ活性をpoly-GluTyrペプチドを基質に使用して測定した。
Since the two germline mutations were accompanied by amino acids within the kinase domain that were highly conserved across different species and throughout molecular evolution, the effects of these mutations on ALK kinase activity were examined in detail.
In vitro expression of ALK protein immunoprecipitated by transiently expressing FLAG-tagged ALK mutation, ALK A1280V in NIH3T3 cells together with FLAG-tagged wild-type ALK and neuroblastoma-derived ALK mutant ALK F1174L (Non-patent Document 9) Tyrosine kinase activity was measured using poly-GluTyr peptide as a substrate.
図４は、各ALK変異タンパクの自己リン酸化を示すウェスタンブロット分析の写真である。
ALK変異体、ALKA1280Vは、ALKF1174L と同様、自己リン酸化を示し、インビトロチロシンキナーゼ活性も野生型ALKに比較して上昇していた。予想されるように、Akt、Stat3及びErkのリン酸化の増大によって証明されるように、変異を形質導入したNIH3T3細胞の下流ALKシグナル伝達経路のリン酸化が増進されていて、ALKA1280V変異体の上昇したチロシンキナーゼ活性は、変異導入されたNIH3T3細胞内においてALKのシグナル伝達経路の下流を活性化した。
FIG. 4 is a photograph of Western blot analysis showing autophosphorylation of each ALK mutant protein.
The ALK mutant, ALK A1280V , showed autophosphorylation similar to ALK F1174L, and the in vitro tyrosine kinase activity was also increased compared to wild type ALK. As expected, the phosphorylation of the downstream ALK signaling pathway of the NIH3T3 cells transduced with the mutation was enhanced as evidenced by increased phosphorylation of Akt, Stat3 and Erk, and the ALK A1280V mutant Increased tyrosine kinase activity activated downstream of the ALK signaling pathway in mutated NIH3T3 cells.
図５は、神経芽腫及びユーイング肉腫ファミリー（ESFT）由来細胞株において、ALK阻害剤TAE684の影響を示すグラフである。ALK変異を有する（UTP-ES1）または有さない（SJES-6及びSJES-7）場合の細胞成長に対するALK阻害剤TAE684の影響を、三重試験の平均細胞数±S.D.をプロットして示す。ALK変異神経芽腫由来細胞株SK-N-SH及びNIH3T3細胞に対する、成長阻害のプロフィールを合わせて示す。
図６は、siRNAによるALKノックダウンによるUTP-ES1細胞成長の阻害を示すブロット写真及びグラフである。非特異的バンドは、ローディング・コントロールを示す。
ALK阻害剤TAE684及びsiRNAによるALKノックダウンを使用して、ALK変異ESFT細胞株及びUTP-ES1の細胞増殖に対するALK阻害の効果を検討した。UTP-ES1の細胞増殖は、76.1nMのIC50でTAE684により効果的に阻害された。これは、SK-N-SH（48.7nM）、ALK変異体及びTAE684感受性神経芽腫細胞株に対するIC50とほぼ同じである（非特許文献１７）が、ALK発現のないNIH3T3細胞のIC50（341nM）より実質的に低い値である。
同様に、変異ALKをsiRNAによりノックダウンしたUTP-ES1では、非特異的siRNAでトランスフェクトしたコントロールに比較して、細胞増殖が顕著に抑制された。
FIG. 5 is a graph showing the effect of ALK inhibitor TAE684 in neuroblastoma and Ewing sarcoma family (ESFT) -derived cell lines. The effect of the ALK inhibitor TAE684 on cell growth with (UTP-ES1) or without (UTJ-ES1) or without (SJES-6 and SJES-7) with ALK mutation is shown by plotting the mean cell number ± SD of triplicate tests. The growth inhibition profiles for ALK mutant neuroblastoma-derived cell lines SK-N-SH and NIH3T3 cells are also shown.
FIG. 6 is a blot photograph and graph showing inhibition of UTP-ES1 cell growth by ALK knockdown by siRNA. Non-specific bands indicate loading controls.
Using ALK knockdown with ALK inhibitors TAE684 and siRNA, the effect of ALK inhibition on cell growth of ALK mutant ESFT cell line and UTP-ES1 was examined. Cell proliferation of UTP-ES1 was effectively inhibited by TAE684 with an IC 50 of 76.1 nM. This is almost the same as the IC 50 for SK-N-SH (48.7 nM), ALK mutant and TAE684-sensitive neuroblastoma cell line (Non-patent Document 17), but the IC 50 of NIH3T3 cells without ALK expression ( The value is substantially lower than 341 nM).
Similarly, in UTP-ES1, in which mutant ALK was knocked down by siRNA, cell proliferation was remarkably suppressed as compared to the control transfected with non-specific siRNA.
新規ALK生殖細胞系変異を有する２つの症例で、ESFTを発現した他の家族は知られていなく、そのゲノムDNAを入手できなかったので、変異の同時分離やESFT発生の確認または変異が新たな変異であるのか親から遺伝されたものであるのかを決定することはできなかった。しかし、キナーゼドメイン（β4のR1192及び活性化ループのA1280）内の高保存アミノ酸の置換後、下流シグナル伝達経路の構成的活性化と同様、ALKA1280V変異のキナーゼ活性が上昇する。TAE684またはsiRNA仲介遺伝子ノックアウトによる変異ALKの阻害は、ALKA1280Vを有するUTP-ES1の増殖を抑制した。一方、R1192G変異は、３つの異なる家族性神経芽腫家系でプロリンに変異していた（R1192P）アミノ酸と同じアミノ酸に起こっていた（非特許文献１０）。以上のように、症例9及び症例35に見られたこれら新規の生殖細胞系変異は、ESFTの発生の素因となっていた。
In two cases with new ALK germline mutations, no other family members that expressed ESFT were known and their genomic DNA was not available, so the simultaneous isolation of mutations, confirmation of ESFT occurrence, or mutation was new. It was not possible to determine whether the mutation was inherited from the parent. However, after substitution of highly conserved amino acids within the kinase domain (R1192 of β4 and A1280 of the activation loop), the kinase activity of the ALK A1280V mutation is increased, as is constitutive activation of the downstream signaling pathway. Inhibition of mutant ALK by TAE684 or siRNA-mediated gene knockout suppressed the growth of UTP-ES1 with ALK A1280V . On the other hand, the R1192G mutation occurred in the same amino acid as the amino acid that was mutated to proline (R1192P) in three different familial neuroblastoma families (Non-patent Document 10). As described above, these novel germline mutations seen in
神経芽腫及びESFTの両腫瘍は類似した組織構造を示し、どちらも神経堤細胞から生じると推測されるので、生殖細胞系ALK変異の神経芽腫及びESFTの両者との関連については、さらに検討する必要がある。生殖細胞系ALK変異の活性化はそのキャリアに神経芽腫を生じさせやすくするが、その浸透度は不完全であり、家族性神経芽腫の発生には他の遺伝子の関与が必要であることは明らかである。予想されるように、今回のESFTの2症例はまた、EWS-FLI1及びEWS-FEV融合を形成するEWS関連転座を有し、ESFTの病因にこれらの融合が果たす明確な役割の根拠となっている。しかし、ESFTの発生にはEWS融合だけでは十分でなく、さらに遺伝子の変化が必要である可能性が、ALK抑制剤及びALK特異的siRNAによるALK変異ESFT細胞成長の抑制により示唆された。ALK変異神経芽腫細胞株LAN-5におけるEWS-FLI1の異種発現が、神経芽腫細胞に類似の遺伝子発現プロフィールと同様に、神経芽腫特異的マーカー及びESFT特異的マーカーの新たな発現を抑制したことは興味深い（非特許文献１４）。また、この2症例におけるESFT腫瘍が、ESFTの発症部位としては比較的稀であるが、嗅神経芽腫にも関与している鼻腔または副鼻腔に発生したことは注目すべきである（非特許文献２０）。ESFTと神経芽腫との間の病原性のつながりの可能性についてさらに研究する必要がある。
結論として、ALK生殖細胞系変異は、家族性神経芽腫だけでなく、一部のESFT症例の発生に関与していることを示唆するものであった。低分子量化合物による変異キナーゼの抑制は、一部のESFTの治療効果を有する可能性がある。
Since both neuroblastoma and ESFT tumors have similar histological structures and both are presumed to originate from neural crest cells, the relationship between germline ALK mutations with both neuroblastoma and ESFT is further investigated. There is a need to. Activation of germline ALK mutations makes the carrier more susceptible to neuroblastoma, but its penetrance is incomplete and the development of familial neuroblastoma requires the involvement of other genes Is clear. As expected, these two cases of ESFT also have EWS-related translocations that form the EWS-FLI1 and EWS-FEV fusions and provide a clear basis for their role in the pathogenesis of ESFT. ing. However, EWS fusion alone is not sufficient for ESFT development, and further gene changes may be required, as indicated by suppression of ALK mutant ESFT cell growth by ALK inhibitors and ALK-specific siRNA. Heterologous expression of EWS-FLI1 in the ALK mutant neuroblastoma cell line LAN-5 suppresses new expression of neuroblastoma-specific and ESFT-specific markers as well as gene expression profiles similar to neuroblastoma cells It is interesting (Non-Patent Document 14). It should be noted that the ESFT tumors in these two cases occurred in the nasal cavity or paranasal sinuses, which are relatively rare as the onset of ESFT, but are also involved in olfactory neuroblastoma (non-patented Reference 20). Further research is needed on the possible pathogenic link between ESFT and neuroblastoma.
In conclusion, ALK germline mutations were implicated in the development of some ESFT cases, not just familial neuroblastoma. Inhibition of mutant kinases by low molecular weight compounds may have some ESFT therapeutic effects.
以上の知見から、ALK遺伝子の変異を検知することによって、神経芽腫以外の小児固形腫瘍または食道癌の素因を評価できることが明らかとなった。
ALK遺伝子変異の検知としては、そのＳＮＰまたはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型の検知が有用である。ＳＮＰに変異があれば素因があると評価し、逆に、ＳＮＰに変異がなければ素因がない可能性があると間接的に評価できる。
From the above findings, it became clear that the predisposition of childhood solid tumors other than neuroblastoma or esophageal cancer can be evaluated by detecting mutations in the ALK gene.
As detection of ALK gene mutation, detection of the SNP or a genetic polymorphism in a linkage disequilibrium relationship with it is useful. If there is a mutation in the SNP, it can be evaluated that there is a predisposition, and conversely, if there is no mutation in the SNP, it can be indirectly evaluated that there may be no predisposition.
特に、A1280V、R1192G、A876Tのいずれかのアミノ酸変異を生じさせるＳＮＰに注目し、A1280Vの変異が、GCGからGTGへの変異であるか、R1192Gの変異が、CGGからGGGへの変異であるか、A876Tの変異が、GCCからACCへの変異であることを指標としてもよい。 In particular, paying attention to the SNP that causes any amino acid mutation of A1280V, R1192G, or A876T, whether the A1280V mutation is a GCG to GTG mutation or the R1192G mutation is a CGG to GGG mutation The indicator may be that the A876T mutation is a mutation from GCC to ACC.
なお、AALK遺伝子には、ヒト由来ｃＤＮＡや、相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、尿酸輸送能を有するポリペプチドをコードするヒト由来の同質遺伝子、哺乳動物におけるそれらの相同物も含まれる。 The AALK gene is a human-derived isogenic gene that hybridizes with human-derived cDNA or DNA consisting of a complementary base sequence under stringent conditions and encodes a polypeptide having a uric acid transport ability, in mammals. Their homologues are also included.
遺伝子多型を決定するには、ヒト血液または組織を材料として、ダイレクトシークエンス法や、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＨＲＭ法、SmartAmp法、Q-probe法（QP法）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法などが利用できる。 In order to determine the gene polymorphism, using human blood or tissue as a material, direct sequencing method, BAC array CGH method, FISH method, RFLP method, PCR-SSCP method, allele-specific oligonucleotide hybridization method, TaqMan PCR method , Invader method, HRM method, SmartAmp method, Q-probe method (QP method), MALDI-TOF / MS method, molecular beacon method, RCA method, UCAN method, nucleic acid hybridization method using DNA chip or DNA microarray, etc. Available.
ダイレクトシークエンシング法などによると、ゲノムＤＮＡから直接ＳＮＰを検出することができる。
また、クローンや、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＲＣＫ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法などにより、特定のゲノムＤＮＡ領域を増幅した後に、少なくとも多型部位を含む対立遺伝子の一部の塩基配列の決定、多型部位に特異的にハイブリダイズするプローブによる検出、多型部位を含む遺伝子断片の分子量の測定を行ったりしてもよい。
増幅産物は、塩基配列の決定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法等による分子量の測定、制限酵素断片長の解析、ＳＳＣＰによる検出、電気泳動などによって、ＳＮＰを決定することができる。
According to the direct sequencing method or the like, SNP can be directly detected from genomic DNA.
In addition, after amplification of a specific genomic DNA region by clone, PCR method, LCR method, SDA method, RCK method, LAMP method, NASBA method, etc., the base sequence of a part of the allele including at least the polymorphic site Determination, detection with a probe that specifically hybridizes to the polymorphic site, or measurement of the molecular weight of the gene fragment containing the polymorphic site may be performed.
The amplification product can be determined for SNP by determination of the base sequence, measurement of molecular weight by MALDI-TOF mass spectrometry, analysis of restriction enzyme fragment length, detection by SSCP, electrophoresis, and the like.
例えば、ＴａｑＭａｎ法は、アレル特異的なオリゴヌクレオチドと鋳型とのハイブリダイゼーションとＰＣＲ法を同時に行い、蛍光エネルギー移動現象を用いてＳＮＰを検出する方法である。蛍光色素と消光物質により標識したアレル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するように設計したプライマーでＰＣＲを行うと、プライマーからの伸長反応が進むと同時に、Ｔａｑポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によりハイブリダイズしたプローブが切断される。蛍光色素が消光物質と離れると蛍光が生じ、またＰＣＲ反応により鋳型が増幅するため、蛍光強度は指数関数的に増強する。２種類のアレルに特異的なプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば、１回のアッセイでホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することもできる。 For example, the TaqMan method is a method in which hybridization of an allele-specific oligonucleotide and a template and a PCR method are simultaneously performed and SNP is detected using a fluorescence energy transfer phenomenon. When an allele-specific probe labeled with a fluorescent dye and a quencher is hybridized to a target site and PCR is performed with a primer designed to amplify a region containing this site, the extension reaction from the primer proceeds, The hybridized probe is cleaved by the 5 ′ nuclease activity of Taq polymerase. When the fluorescent dye is separated from the quencher, fluorescence is generated, and the template is amplified by the PCR reaction, so that the fluorescence intensity increases exponentially. By labeling probes specific to the two types of alleles with different fluorescent dyes, homozygotes and heterozygotes can be distinguished in a single assay.
インベーダー法は、２種類のオリゴヌクレオチドを用い、これらのプローブが鋳型ＤＮＡと形成する特異的な構造を認識して切断する酵素反応に基づく方法である。目的塩基配列の第１の部位に実質的に相補的なインベーダープローブと、3'末端側が目的塩基配列の第２の部位と実質的に相補的であり5'末端側には鋳型と非相補的で一本鎖を形成するフラップを含むアレルプローブとの２種類の異なるプローブで、目的とする塩基配列を認識する。これらのプローブが鋳型の隣接する領域にハイブリダイズすると、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの3'末端が侵入し、この構造が酵素により切断されてフラップが遊離する。遊離したフラップはあらかじめ標識しておくことにより定量することができる。フラップ−ＦＲＥＴプローブを２組用意し、異なる蛍光色素で標識することにより、１回のアッセイで各ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。 The invader method is a method based on an enzymatic reaction in which two types of oligonucleotides are used, and these probes recognize and cleave specific structures formed with template DNA. An invader probe that is substantially complementary to the first site of the target base sequence, the 3 ′ end side is substantially complementary to the second site of the target base sequence, and the 5 ′ end side is non-complementary to the template The target base sequence is recognized by two different probes, including an allele probe containing a flap that forms a single strand. When these probes hybridize to adjacent regions of the template, the 3 ′ end of the invader probe enters the SNP site, and this structure is cleaved by the enzyme to release the flap. The released flap can be quantified by labeling in advance. By preparing two sets of flap-FRET probes and labeling with different fluorescent dyes, each homozygote and heterozygote can be distinguished in one assay.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、ＳＮＰ部位に隣接するプライマーを作製し、ＰＣＲ増幅させた試料ＤＮＡを鋳型として、ｄｄＮＴＰを用いて１塩基分だけプライマー伸長反応を行い、伸長反応生成物の質量分析により、付加したｄｄＮＴＰを識別する方法である。プライマーの蛍光標識を必要とすることなく、短時間で大量の試料を処理することができる。 In MALDI-TOF mass spectrometry, a primer adjacent to the SNP site is prepared, a PCR-amplified sample DNA is used as a template, ddNTP is used for primer extension reaction, and the extension reaction product is subjected to mass spectrometry. This is a method for identifying the added ddNTP. A large number of samples can be processed in a short time without the need for fluorescent labeling of the primer.
ＲＣＡ法は、環状の一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら長い相補鎖ＤＮＡを合成していくＤＮＡ増幅手段を、ＳＮＰタイピングに応用した方法である。ＳＮＰの識別をＲＣＡ法による増幅の有無で行う。すなわち、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になりうる一本鎖プローブをゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせて連鎖反応を行う。プローブの端を識別したいＳＮＰの部位としておけば、その部位がマッチしていれば連結され環状となってＲＣＡによる増幅が起こるが、ミスマッチであれば連結されず環状とならないためＲＣＡ増幅は起こらない。この２種類の増幅反応を識別することによってＳＮＰを決定することができる。 The RCA method is a method in which a DNA amplification means in which a circular single-stranded DNA is used as a template and a DNA polymerase synthesizes a long complementary strand DNA while moving on the template is applied to SNP typing. The SNP is identified by the presence or absence of amplification by the RCA method. That is, a single-stranded probe that can anneal with genomic DNA and hybridize to the genomic DNA is hybridized to genomic DNA to perform a chain reaction. If the end of the probe is identified as the SNP site to be identified, if the site matches, it will be connected and become circular, and amplification by RCA will occur, but if it is mismatched, it will not be connected and will not become circular, so RCA amplification will not occur . The SNP can be determined by discriminating between these two types of amplification reactions.
ＤＮＡチップ法は、多型部位を含むオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置したＤＮＡチップを用いて、ＰＣＲ増幅させた蛍光標識ｃＤＮＡやｃＲＮＡとハイブリダイゼーションする方法である。多くのＳＮＰを迅速に検出することができる。 The DNA chip method is a method of hybridizing with PCR-amplified fluorescently labeled cDNA or cRNA using a DNA chip in which an oligonucleotide probe containing a polymorphic site is arranged on a microarray. Many SNPs can be detected quickly.
アミノ酸配列の多型を決定する方法には、例えば、二次元電気泳動法やマイクロフルーイディクス法によるプロテオーム解析、質量分析装置を用いたペプチドマッピングとアミノ酸配列分析、プロテインシークエンサーによるアミノ酸配列分析、プロテインチップを用いてポリペプチドとリガンドとの相互作用を検出する方法などが利用できる。 Methods for determining amino acid sequence polymorphism include, for example, proteome analysis using two-dimensional electrophoresis and microfluidics, peptide mapping and amino acid sequence analysis using a mass spectrometer, amino acid sequence analysis using a protein sequencer, protein chip A method for detecting the interaction between a polypeptide and a ligand using the above can be used.
例えば、二次元電気泳動法は、一般的には、一次元目に等電点電気泳動を、二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うものであり、１枚のゲルで数千のタンパク質を分離することができる。等電点電気泳動には、両性担体や固定化ｐＨ勾配ゲルストリップを用いる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、１種類のｐＨの緩衝液を用いる連続緩衝液系と、複数のｐＨの緩衝液を用いる不連続緩衝液系とがある。また、分離するタンパク質の種類によって、低ＢＩＳ濃度ゲル電気泳動、濃度勾配ゲル電気泳動、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを用いることができる。分離されたタンパク質は、クーマシーブルー染色や銀染色や蛍光試薬を用いてゲル上で感度よく検出できる。また、ALKポリペプチドに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法も利用可能である。 For example, two-dimensional electrophoresis generally performs isoelectric focusing in the first dimension and SDS-PAGE in the second dimension, and separates thousands of proteins on a single gel. be able to. For isoelectric focusing, an amphoteric carrier or an immobilized pH gradient gel strip is used. SDS-PAGE includes a continuous buffer system using a buffer solution of one kind of pH and a discontinuous buffer system using a buffer solution of a plurality of pHs. Depending on the type of protein to be separated, low BIS concentration gel electrophoresis, concentration gradient gel electrophoresis, tricine-SDS-PAGE, or the like can be used. The separated protein can be detected with high sensitivity on a gel using Coomassie blue staining, silver staining, or a fluorescent reagent. A Western blotting method using an antibody against ALK polypeptide can also be used.
質量分析方法の一つであるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、タンパク質試料とシナピン酸等のレーザー光を吸収するマトリクスとの混合、乾燥後に強力なパルスレーザー光を照射し、マトリクスからのエネルギー移動によるタンパク質試料のイオン化を行い、初期加速による試料分子イオンの飛行時間差でイオンの分子量を分析する方法である。ペプチドを質量分析計内部で断片化し、断片の質量解析からアミノ酸配列やアミノ酸組成などを得るためには、質量分離部を複数連結したタンデム質量分析法が利用され、エレクトロスプレーイオン化法を用いた三連四重極型やハイブリッド型やイオントラップ型分析計等も用いられる。 The MALDI-TOF / MS method, which is one of the mass spectrometry methods, mixes a protein sample with a matrix that absorbs laser light such as sinapinic acid, irradiates a powerful pulsed laser light after drying, and transfers energy from the matrix. In this method, ionization of a protein sample is performed, and the molecular weight of the ions is analyzed based on the time-of-flight difference of the sample molecular ions due to initial acceleration. In order to fragment peptides inside a mass spectrometer and obtain amino acid sequences, amino acid compositions, etc. from the mass analysis of fragments, tandem mass spectrometry with multiple mass separation units is used, and electrospray ionization is used. A quadrupole type, a hybrid type, an ion trap type analyzer and the like are also used.
プロテインチップ法は、基板上に並べたタンパク質や、ペプチド、抗体、発現タンパク質などと試料との相互作用を、包括的かつ迅速に行うことができる。 The protein chip method can comprehensively and rapidly perform the interaction between a sample and proteins arranged on a substrate, peptides, antibodies, expressed proteins, and the like.
本発明による評価キットは、小児固形腫瘍または食道癌を生じ得る素因を有するか否かを評価するキットであって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ALK遺伝子のA1280V、R1192G、A876Tの少なくともいずれかにおけるＳＮＰ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検知する手段を備える。
すなわち、ALK遺伝子多型を含むポリヌクレオチド、または多型を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対、多型を検出するためのポリヌクレオチドとして提供してもよい。
The evaluation kit according to the present invention is a kit for evaluating whether or not there is a predisposition to cause pediatric solid tumor or esophageal cancer, using a sample containing a human gene of a subject, and using at least one of A1280V, R1192G, and A876T of the ALK gene. Means for detecting a SNP in any one or a genetic polymorphism in a linkage disequilibrium relationship therewith is provided.
That is, it may be provided as a polynucleotide containing an ALK gene polymorphism, a primer pair for amplifying a DNA fragment containing the polymorphism, or a polynucleotide for detecting the polymorphism.
なお、ポリヌクレオチドとは、ポリリボヌクレオチドとポリデオキシリボヌクレオチドの双方を含み、それらは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡ、それらの断片などが挙げられる。
また、ポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含む。ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸や、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。その修飾には、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、カルボキシル末端において、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化などが挙げられる。
Polynucleotide includes both polyribonucleotide and polydeoxyribonucleotide, which may be unmodified RNA or DNA, modified RNA or DNA, for example, DNA, cDNA, genomic DNA, mRNA, unprocessed RNA And fragments thereof.
Polypeptides are those in which two or more amino acids are linked by peptide bonds, and include those called relatively short-chain peptides or oligopeptides to long-chain proteins called proteins. Polypeptides may contain amino acids other than the 20 genetically encoded amino acids and modified amino acids. The modifications include acetylation, acylation, ADP ribosylation, amidation, biotinylation, covalent bonding with lipids and lipid derivatives, and cross-linking at the main chain, amino acid side chain, amino terminus, and carboxyl terminus of the peptide bond. Examples include formation, disulfide bond, addition of sugar chain, addition of GPI anchor, phosphorylation and prenylation.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤候補物質選定方法は、小児固形腫瘍または食道癌の治療薬、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤の候補物質を選定する方法であって、試験物質の存在下及び非存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、それぞれの細胞においてチロシンキナーゼの酵素活性の上昇度を測定する工程と、その酵素活性の上昇を抑制する効果を有する試験物質を候補物質として選定する工程を含む。 The method for selecting a drug candidate substance for childhood solid tumor or esophageal cancer according to the present invention is a method for selecting a candidate drug for a childhood solid tumor or esophageal cancer drug or a drug that reduces the predisposition to cause the disease. A step of culturing mammalian cells in the presence and absence of a substance, a step of measuring the increase in enzyme activity of tyrosine kinase in each cell, and a test substance having an effect of suppressing the increase in enzyme activity Including a step of selecting as a candidate substance.
哺乳動物としては、マウスなどが挙げられ、その生体を構成している組織や細胞も含む。また、試料としては、生物に由来するポリヌクレオチドを含有するものであって、組織や細胞から採取される体液、皮膚、毛根、粘膜、内臓、胎盤、臍帯血等を含む。
同様に、ヒトALK遺伝子または非ヒトALK遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、A1280V、R1192G、A876Tのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトALK遺伝子または非ヒトALK遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、ALK遺伝子を欠損させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、ヒトALK遺伝子または非ヒトALK遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、A1280V、R1192G、A876Tのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトALK遺伝子または非ヒトALK遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、或いはそれら細胞株より調製した細胞膜小胞を用いてもよい。
Mammals include mice and the like, and include tissues and cells constituting the living body. Samples contain polynucleotides derived from living organisms, and include body fluids collected from tissues and cells, skin, hair roots, mucous membranes, viscera, placenta, umbilical cord blood, and the like.
Similarly, a non-human animal overexpressing a human ALK gene or a non-human ALK gene, a non-human overexpressing a human ALK gene or a non-human ALK gene containing a mutation of at least one of A1280V, R1192G, and A876T Animal, non-human cell line or human cell line deficient in ALK gene, non-human cell line or human cell line over-expressed human ALK gene or non-human ALK gene, at least one of A1280V, R1192G, A876T A non-human cell line or a human cell line overexpressing a human ALK gene or a non-human ALK gene containing the above mutation, or a cell membrane vesicle prepared from these cell lines may be used.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤は、小児固形腫瘍または食道癌、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、チロシンキナーゼの酵素活性の上昇を抑制する効果を有する。 The childhood solid tumor or esophageal cancer drug of the present invention is a drug that reduces the predisposition to cause childhood solid tumor or esophageal cancer, or a disease thereof, and has an effect of suppressing an increase in the enzyme activity of tyrosine kinase.
また、本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤は、小児固形腫瘍または食道癌、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、ALKタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態で有するか、または、ALKタンパク質に相当するポリペプチドを細胞内に導入可能な形態で有するものとしても提供可能である。前者によると、長期間にわたって安定に尿酸輸送を改善させることができ、後者によると、注射等の投与によって簡便に尿酸輸送を改善させることができる。 In addition, the childhood solid tumor or esophageal cancer drug of the present invention is a drug that reduces the predisposition to cause childhood solid tumor or esophageal cancer, or a disease thereof, and can introduce a polynucleotide encoding ALK protein into the cell. Or having a polypeptide corresponding to ALK protein in a form that can be introduced into cells. According to the former, uric acid transport can be stably improved over a long period of time, and according to the latter, uric acid transport can be simply improved by administration such as injection.
なお、ポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態とは、ポリヌクレオチドが細胞内に導入され、細胞内のALK遺伝子がALKを発現するようにコードされているALKを発現すること可能とする形態を意味する。同様に、ポリペプチドを細胞内に導入可能な状態とは、ポリペプチドが細胞内に導入され、細胞内のALKと同様な機能を発揮することを可能とする形態を意味する。 The form in which the polynucleotide can be introduced into the cell is a form in which the polynucleotide is introduced into the cell, and the ALK gene in the cell can express ALK encoded to express ALK. means. Similarly, the state in which a polypeptide can be introduced into a cell means a form in which the polypeptide is introduced into the cell and can perform the same function as ALK in the cell.
ALKポリヌクレオチドは、既知のヌクレオチド配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて既存のcDNAライブラリーをスクリーニングする方法や、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたRT-PCR等の方法によって取得することができる。 The ALK polynucleotide can be obtained by a method of screening an existing cDNA library using an oligonucleotide probe prepared based on a known nucleotide sequence, or a method such as RT-PCR using an oligonucleotide primer.
A1280V、R1192G、A876TのいずれにもＳＮＰのないALKが好ましく、そのポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な状態にするためには、例えば、むき出しDNAとする方法や、組換えウイルスベクターの形態で製剤化する方法が用いられる。ウイルスベクターには、バキョロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科などのウイルスのゲノムに由来するものが利用できる。 ALK without any SNP is preferred in any of A1280V, R1192G, and A876T. In order to make the polynucleotide in a state that can be introduced into cells, for example, a method using bare DNA or a preparation in the form of a recombinant viral vector Is used. As viral vectors, those derived from the genomes of viruses such as Bacyroviridae, Parvoviridae, Picornoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Adenoviridae, and Picornaviridae can be used.
また、生体より取り出した組織または細胞にポリヌクレオチド発現ベクターを導入した後に、生体に戻すようにしてもよい。そのような場合は、ポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクターを、例えばマイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法などのトランスフェクションにより細胞内に導入する方法が利用できる。 Alternatively, the polynucleotide expression vector may be introduced into the tissue or cells removed from the living body and then returned to the living body. In such a case, a method of introducing an expression vector incorporating a polynucleotide into a cell by transfection such as a microinjection method or an electroporation method can be used.
ウイルスベクターや発現ベクターにおけるポリヌクレオチドは、全身性または組織特異的に発現するプロモーター支配下に連結してもよい。また、ウイルスベクターを腎臓特異的に感染させる場合には、経皮的に動脈にカテーテルを挿入して、X線でカテーテルの位置を確認しながら腎臓動脈にカテーテルを挿入して組換えベクターを導入することが可能である。 Polynucleotides in viral vectors and expression vectors may be linked under the control of a systemic or tissue-specific expression promoter. In addition, when a viral vector is specifically infected with a viral vector, a catheter is inserted into the artery percutaneously, and the recombinant vector is introduced by inserting the catheter into the renal artery while confirming the position of the catheter with X-rays. Is possible.
ALKポリペプチドは、前記のALKポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的方法により作成することができる。すなわち、ポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでALKポリペプチドを得ることができる。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組換えれば、大腸菌や枯草菌等の原核細胞や、酵母や、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞の発現産物としてALKポリペプチドを得ることができる。
また、ALKポリペプチドは、公知の化学合成法に準じて合成することもできる。
The ALK polypeptide can be prepared by a genetic engineering method using the ALK polynucleotide. That is, ALK polypeptide can be obtained in vitro by preparing RNA from a vector having a polynucleotide by in vitro transcription and performing in vitro translation using this as a template. Further, if the polynucleotide is recombined into an expression vector, an ALK polypeptide can be obtained as an expression product of prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as yeast, insect cells and mammalian cells.
ALK polypeptides can also be synthesized according to known chemical synthesis methods.
ALKポリペプチドは、ペプチド誘導体として提供してもよい。この誘導体には、合成や精製を促進するための修飾、物理、化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾などを含む。
ペプチド誘導体におけるその他の修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化などが含まれる。より具体的には、ペプチド誘導体は、ALKポリペプチドの活性を破壊せず、またこれを含有する組成物に毒性を与えない範囲において、残基の側鎖またはN末端基もしくはC末端基として生じる機能性基として調製することができる。例えば、体液中でポリペプチドの残存を延長するポリエチレングリコール側鎖を含む誘導体、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたはアミンと反応することによるカルボキシル基のアミド、アシル部分と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のN−アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離の水酸基のO−アシル誘導体などが挙げられる。
ALK polypeptides may be provided as peptide derivatives. Such derivatives include modifications to promote synthesis and purification, modifications to promote physical and chemical stabilization, stability and instability to metabolism in vivo, and activation modifications such as conditioning.
Other modifications in peptide derivatives include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, flavin covalent bond, heme moiety covalent bond, nucleotide or nucleotide derivative covalent bond, lipid or lipid derivative covalent bond, Phosphatidylinositol covalent bond, cross-linking, cyclization, disulfide bond, demethylation, cross-linking covalent bond formation, cystine formation, pyroglutamate formation, formylation, gamma-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation, iodine , Methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, lipid binding, sulfation, selenoylation and the like. More specifically, peptide derivatives occur as residue side chains or N-terminal or C-terminal groups to the extent that they do not destroy the activity of the ALK polypeptide and do not cause toxicity to the composition containing it. It can be prepared as a functional group. For example, derivatives containing polyethylene glycol side chains that extend the persistence of polypeptides in body fluids, aliphatic esters of carboxyl groups, amides of carboxyl groups by reacting with ammonia or amines, amino acid residues formed with acyl moieties N-acyl derivatives of free amino groups or O-acyl derivatives of free hydroxyl groups formed with acyl moieties.
ALKポリペプチドはまた、薬理学的に許容し得る塩として提供してもよい。この塩には、ポリペプチドのカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の双方を含む。
カルボキシル基の塩は、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛などの無機塩や、トリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを用いて形成された有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸や硫酸などの鉱酸との塩、酢酸やシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。
ALK polypeptides may also be provided as pharmacologically acceptable salts. This salt includes both a carboxyl group salt and an amino acid addition salt of a polypeptide.
Examples of the salt of the carboxyl group include inorganic salts such as sodium, calcium, ammonium, iron, and zinc, and salts with organic bases formed using amines such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine, and procaine. It is done. Examples of acid addition salts include salts with mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, and salts with organic acids such as acetic acid and oxalic acid.
このようなALKポリペプチドを細胞内に導入可能な形態に製剤化するには、例えば、ポリペプチドのN末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融合ポリペプチドの利用が挙げられる。細胞膜通過ペプチドとしては、HIV-1・TATのPTDや、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアのPTDを使用することができる。融合ポリペプチドは、例えば、ALKポリヌクレオチドとPTDポリヌクレオチドとを連結して作製した融合ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子工学的に作製することができる。また、EDCやβ−アラニン等の架橋剤を介して、ポリペプチドとPTDペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結した融合ポリペプチドを作成することもできる。このような融合ポリペプチドは、経皮的に動脈にカテーテルを挿入して、X線でカテーテルの位置を確認しながら腎臓動脈にカテーテルを挿入して組換えベクターを導入することが可能である。 In order to formulate such an ALK polypeptide into a form that can be introduced into cells, for example, use of a fusion polypeptide in which a cell membrane-passing peptide is linked to the N-terminal side of the polypeptide can be mentioned. Peptides of HIV-1 and TAT and DTD of Drosophila homeobox protein antennapedia can be used as cell membrane-passing peptides. The fusion polypeptide can be prepared by genetic engineering using, for example, a fusion polynucleotide prepared by linking an ALK polynucleotide and a PTD polynucleotide. In addition, a fusion polypeptide in which cell membrane-passing peptides are linked by a method of binding a polypeptide and a PTD peptide via a crosslinking agent such as EDC or β-alanine can also be prepared. Such a fusion polypeptide can be transcutaneously inserted into an artery and the recombinant vector introduced by inserting the catheter into the renal artery while confirming the position of the catheter with X-rays.
本発明によると、小児固形腫瘍や食道癌の早期治療や予防に有効であり、産業上有用である。 According to the present invention, it is effective for early treatment and prevention of childhood solid tumors and esophageal cancer, and is industrially useful.
本発明は、小児固形腫瘍または食道癌素因の評価方法及び評価キット、また、その薬剤及びその選択方法に関する。 The present invention relates to a method and kit for evaluating a predisposition to a childhood solid tumor or esophageal cancer, and a drug and a selection method thereof.
ユーイング肉腫ファミリー（Ewing sarcoma family of tumours：ESFT）は、骨や軟組織の小円形細胞腫瘍であり、骨ユーイング腫瘍、骨外性ユーイング腫瘍、末梢神経上皮腫（peripheral neuroepithelioma：PNET）、アスキン腫瘍（胸壁のPNET）が含まれる(非特許文献１)。十代の若者に多く、さらに５年生存率が50％以下とその予後は不良である(非特許文献２)。 The Ewing sarcoma family of tumours (ESFT) is a small round cell tumor of bone and soft tissue, including bone Ewing tumor, extraosseous Ewing tumor, peripheral neuroepithelioma (PNET), askin tumor (chest wall) (Non-Patent Document 1). It is more common among teenagers, and the 5-year survival rate is 50% or less, and the prognosis is poor (Non-patent Document 2).
ESFTの遺伝子の際立った特徴は、その多くにEWS-FLI-1または他の関連融合遺伝子が存在することであり、ESFTの成長におけるその重要な役割を強調している(非特許文献３)。実際、未分化マウス骨髄細胞にEWS-FLI-1融合遺伝子を形質導入するとESFTに似た腫瘍が再生され、ESFTにおけるこの融合が果たす病因的役割を裏付けている(非特許文献４)。
しかし、ESFTの成長及び／またはESFT素質に他の共同する遺伝子的変化が関与しているかどうかは、依然として不明である。
A prominent feature of ESFT genes is the presence of EWS-FLI-1 or other related fusion genes in many of them, highlighting its important role in ESFT growth (Non-patent Document 3). Indeed, when EWS-FLI-1 fusion gene is transduced into undifferentiated mouse bone marrow cells, a tumor resembling ESFT is regenerated, supporting the pathogenic role of this fusion in ESFT (Non-patent Document 4).
However, it remains unclear whether other joint genetic changes are involved in ESFT growth and / or ESFT predisposition.
未分化リンパ腫キナーゼ（anaplastic lymphoma kinase：ALK）は、未分化大細胞リンパ腫（anaplastic large cell lymphoma：ALCL）内でのt(2;5)(p23;q35)転座により生成されたNPM-ALK融合キナーゼとして同定された受容体チロシンキナーゼの一つである(非特許文献５、６)。ALKはまた、ALCLに加え炎症性筋線維芽細胞腫瘍内でも異なる融合キナーゼの生成にも関与していて(非特許文献７)、inv(2)(p21p23)により別の融合キナーゼ（EML4-ALK）を生成する一部の非小細胞肺癌の病因である(非特許文献８)。 Anaplastic lymphoma kinase (ALK) is an NPM-ALK fusion generated by t (2; 5) (p23; q35) translocation in anaplastic large cell lymphoma (ALCL) It is one of receptor tyrosine kinases identified as kinases (Non-Patent Documents 5 and 6). ALK is also involved in the generation of different fusion kinases in inflammatory myofibroblast tumors in addition to ALCL (Non-patent Document 7), and another fusion kinase (EML4-ALK) is obtained by inv (2) (p21p23). This is the etiology of some non-small cell lung cancers that produce (Non-patent Document 8).
また、最近になって、大部分の家族性神経芽腫症例における神経芽腫素質の主な原因が、複数の生殖細胞系ALK変異であることが証明されている。さらに、本発明者らによって、散発性神経芽腫症例の約8％において体細胞機能獲得型変異またはALK遺伝子増幅が起こっていることを報告している(非特許文献９〜１２)。
Recently, it has been demonstrated that the major cause of neuroblastoma predisposition in most familial neuroblastoma cases is multiple germline ALK mutations. Furthermore, the present inventors have reported that somatic cell function gain mutation or ALK gene amplification occurs in about 8% of sporadic neuroblastoma cases (
ESFTと神経芽腫は、全く異なる臨床病理学的特徴及び分子遺伝学的特徴を有してはいるが、両腫瘍はさまざまな神経分化度を示し、両腫瘍の神経堤起原の可能性を示す報告がある(非特許文献１３、１４)。さらに、近年の分子免疫組織化学的研究により、ESFT及び神経芽腫ではALKが頻繁に発現されていることが立証され(非特許文献１５、１６)、これにより、ESFT由来細胞株に加え、多数の原発性ESFT症例におけるALKの変異状態の研究も促された。 Although ESFT and neuroblastoma have completely different clinicopathological and molecular genetic features, both tumors show varying degrees of neuronal differentiation, indicating the potential for neural crest origin of both tumors. There are reports to show (Non-Patent Documents 13 and 14). Furthermore, recent molecular immunohistochemical studies have demonstrated that ALK is frequently expressed in ESFT and neuroblastoma (Non-Patent Documents 15 and 16), and in addition to ESFT-derived cell lines, many The study of ALK mutation status in primary ESFT cases was also encouraged.
しかし、ALKの変異状態と、小児固形腫瘍または食道癌との関係については、知見がなかった。 However, there was no knowledge of the relationship between ALK mutation status and pediatric solid tumors or esophageal cancer.
そこで、本発明は、小児固形腫瘍または食道癌の素因を評価する方法及び評価キット、また、その薬剤及びその選択方法を提供することを課題とする。 Then, this invention makes it a subject to provide the method and evaluation kit which evaluate the predisposition of a child solid tumor or esophageal cancer, its agent, and its selection method.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価方法は、小児固形腫瘍または食道癌を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ALK遺伝子の変異を検知する工程を有することを特徴とする。 The method for assessing a predisposition for a childhood solid tumor or esophageal cancer according to the present invention is a method for assessing whether or not the childhood solid tumor or esophageal cancer has a predisposition that can cause pediatric solid tumor or esophageal cancer. It has the process of detecting the variation | mutation of a gene.
小児固形腫瘍としては、神経芽腫以外の腫瘍が好適に対象となる。 As a child solid tumor, tumors other than neuroblastoma are preferably targeted.
ALK遺伝子変異の検知としては、そのＳＮＰまたはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型の検知が有用である。ＳＮＰに変異があれば素因があると評価し、逆に、ＳＮＰに変異がなければ素因がない可能性があると間接的に評価してもよい。 As detection of ALK gene mutation, detection of the SNP or a genetic polymorphism in a linkage disequilibrium relationship with it is useful. If there is a mutation in the SNP, it may be evaluated that there is a predisposition, and conversely, if there is no mutation in the SNP, it may be indirectly evaluated that there may be no predisposition.
少なくとも、A1280V、R1192G、A876Tのいずれかのアミノ酸変異を生じさせるＳＮＰがある場合に、小児固形腫瘍または食道癌を生じ得る素因を有すると評価してもよい。 If there is at least a SNP that causes any amino acid mutation of A1280V, R1192G, or A876T, it may be evaluated as having a predisposition to cause childhood solid tumor or esophageal cancer.
特に、A1280Vの変異が、GCGからGTGへの変異であるか、R1192Gの変異が、CGGからGGGへの変異であるか、A876Tの変異が、GCCからACCへの変異であることを指標としてもよい。 In particular, whether the A1280V mutation is a GCG to GTG mutation, the R1192G mutation is a CGG to GGG mutation, or the A876T mutation is a GCC to ACC mutation. Good.
遺伝子多型の検知には、ダイレクトシークエンス法、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＨＲＭ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、Ｑ−ｐｒｏｂｅ法（ＱＰ法）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法のいずれかが利用可能である。 For detection of gene polymorphism, direct sequencing method, BAC array CGH method, FISH method, RFLP method, PCR-SSCP method, allele-specific oligonucleotide hybridization method, TaqMan PCR method, Invader method, HRM method, SmartAmp method, Any of Q-probe method (QP method), MALDI-TOF / MS method, molecular beacon method, RCA method, UCAN method, nucleic acid hybridization method using DNA chip or DNA microarray can be used.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価キットは、小児固形腫瘍または食道癌を生じ得る素因を有するか否かを評価するキットであって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ALK遺伝子のA1280V、R1192G、A876Tの少なくともいずれかにおけるＳＮＰ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検知する手段を備えることを特徴とする。 The childhood solid tumor or esophageal cancer predisposition evaluation kit of the present invention is a kit for evaluating whether or not a childhood solid tumor or esophageal cancer has a predisposition to cause pediatric solid tumor or esophageal cancer. It comprises a means for detecting a SNP in at least one of A1280V, R1192G, and A876T of a gene, or a gene polymorphism in a linkage disequilibrium relationship therewith.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤候補物質選定方法は、小児固形腫瘍または食道癌の治療薬、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤の候補物質を選定する方法であって、試験物質の存在下及び非存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、それぞれの細胞においてチロシンキナーゼの酵素活性の上昇度を測定する工程と、その酵素活性の上昇を抑制する効果を有する試験物質を候補物質として選定する工程を含むことを特徴とする。 The method for selecting a drug candidate substance for childhood solid tumor or esophageal cancer according to the present invention is a method for selecting a candidate drug for a childhood solid tumor or esophageal cancer drug or a drug that reduces the predisposition to cause the disease. A step of culturing mammalian cells in the presence and absence of a substance, a step of measuring the increase in enzyme activity of tyrosine kinase in each cell, and a test substance having an effect of suppressing the increase in enzyme activity The method includes a step of selecting as a candidate substance.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤は、小児固形腫瘍または食道癌、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、チロシンキナーゼの酵素活性の上昇を抑制する効果を有することを特徴とする。 The drug for pediatric solid tumor or esophageal cancer of the present invention is a drug that reduces the predisposition to cause pediatric solid tumor or esophageal cancer, or a disease thereof, and has an effect of suppressing an increase in the enzyme activity of tyrosine kinase. Features.
本発明によると、小児固形腫瘍や食道癌の早期治療や予防に寄与する。 The present invention contributes to early treatment and prevention of childhood solid tumors and esophageal cancer.
以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、前記特許文献など従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能であり、また、薬剤の製造方法及び装置についても従来公知の技術を適宜適用可能である。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described. Embodiments can be appropriately changed in design by using conventionally known techniques such as the above-mentioned patent documents, and conventionally known techniques can be appropriately applied to methods and apparatuses for producing drugs.
本研究では、東京大学倫理委員会の承認の上（承認番号：1598）、総数で80の匿名化された原発性ESFT保存検体を東京大学倫理委員会の規定に従って解析した。原発性腫瘍は全て1993年11月から2008年12月の間に共同研究病院において手術または生検により取得した。EWS-FLI1、EWS-ERG、EWS-ETV1またはEWS-FEV融合転写産物の存在が、良質なＲＮＡ検体が得られた44検体で、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により確認された。本研究には、17のESFT由来細胞株も含まれる。UTP-ES1、ALK変異ESFT細胞株、SCMC-ES1の樹立、SJES系、SK系及びES-1-OT以外の細胞株は、the Japanese Cancer Resource Cell Bank(http://cellbank.nibio.go.jp/wwwjcrbj.htm)から入手した。これら細胞株は全て、ウシ胎仔血清10％を添加したRPMI1640培地(GIBCO RLB,Grand Island,NY,USA)中で培養した。 In this study, with the approval of the University of Tokyo Ethics Committee (approval number: 1598), a total of 80 anonymized primary ESFT specimens were analyzed according to the rules of the University of Tokyo Ethics Committee. All primary tumors were obtained by surgery or biopsy at a collaborative hospital between November 1993 and December 2008. The presence of EWS-FLI1, EWS-ERG, EWS-ETV1 or EWS-FEV fusion transcript was confirmed by reverse transcription polymerase chain reaction in 44 samples from which good quality RNA samples were obtained. The study also includes 17 ESFT-derived cell lines. Cell lines other than UTP-ES1, ALK mutant ESFT cell line, establishment of SCMC-ES1, SJES line, SK line and ES-1-OT are available at the Japanese Cancer Resource Cell Bank (http: //cellbank.nibio.go. (jp / wwwjcrbj.htm). All of these cell lines were cultured in RPMI 1640 medium (GIBCO RLB, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% fetal calf serum.
まず、ESFT検体中におけるALKの変異及び発現の分析を行った。
ALK遺伝子のエクソン20から28をゲノム遺伝子からPCR増幅し、DNAへテロ二本鎖分析及び／または直接塩基配列決定法により変異について調査した。PCRの条件及びプライマーは非特許文献９の通りである。ALK発現の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応分析は、症例9、症例35及びUTP-ES1について行った。ALK変異検体のゲノムコピー数の解析は、GeneChip単一ヌクレオチド多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）遺伝子決定マイクロアレイ（Affymetrix GeneChip 250K NspI;Santa Clara,CA,USA）及び非特許文献９のCNAG/AsCNARを使用して行った。
First, mutations and expression of ALK in ESFT samples were analyzed.
次に、変異ALKの機能解析を行った。
ALKWT-FLAG及びALKF1174L-FLAGは、それぞれ、野生型ALKのFLAGタグ付きcDNA及びそのF1174L変異体である（非特許文献９）。A1280V変異体のFLAGタグ付きcDNA(ALKA1280V-FLAG)は、腫瘍検体の全RNAからハイフィディリティPCRにより単離した。再配列解析後、各cDNAを発現プラスミドpcDNA3に組み込み、EffecteneTMトランスフェクション試薬（QIAGEN,Tokyo,Japan）を使ってNIH3T3細胞に遺伝子導入した。
変異ALKキナーゼのウェスタンブロット分析及びインビトロキナーゼ測定は非特許文献９の方法により行った。ALK変異ESFT細胞株、UTP-ES1以外に、ESFT（SJES-7及びSJES-6）及び神経芽腫（SK-N-SH）細胞株もALK阻害剤TAE684(非特許文献１７)の濃度を変えながら培養し、それぞれの細胞の成長をCellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay
(Promega,Tokyo,Japan)を使って測定した。コントロールとしてNIH3T3細胞を使用した。UTP-ES1に対するTAE684のIC50値は、GrapfPad Prism 5 software（GraphPad,La Jolla,CA,USA）を使用して非線形回帰により算出した。同じ細胞株をALK特異的siRNAまたは非特異的siRNAでトランスフェクトし、細胞成長に対する効果を既報(9)のようにCellTiter-GloTMを使用して生存細胞数を測定することにより評価した。
Next, functional analysis of mutant ALK was performed.
ALK WT -FLAG and ALK F1174L -FLAG are wild-type ALK FLAG-tagged cDNA and its F1174L mutant, respectively (Non-patent Document 9). A1280V mutant FLAG-tagged cDNA (ALK A1280V- FLAG) was isolated from total RNA of tumor specimens by high fidelity PCR. After rearrangement analysis, each cDNA was incorporated into the expression plasmid pcDNA3 and introduced into NIH3T3 cells using Effectene ™ transfection reagent (QIAGEN, Tokyo, Japan).
Western blot analysis and in vitro kinase measurement of mutant ALK kinase were performed by the method of
(Promega, Tokyo, Japan). NIH3T3 cells were used as a control. The IC 50 value of TAE684 against UTP-ES1 was calculated by non-linear regression using GrapfPad Prism 5 software (GraphPad, La Jolla, CA, USA). The same cell line was transfected with ALK-specific siRNA or non-specific siRNA, and the effect on cell growth was assessed by measuring the number of viable cells using CellTiter-Glo ™ as described previously (9).
図1は、ALKのタンパク構造を示す説明図であり、図2は、Ewing肉腫の症例で検出されたALK変異を示す説明図である。
ESFTにおけるALK異常については、原発性ESFT80検体及びEFST由来17細胞株について、DNAへテロ二本鎖形成分析及び／またはALKのALK膜近傍ドメイン及びキナーゼドメインを包含するPCR増幅されたALKエクソンの直接塩基配列決定により、ALK変異をスクリーニングしたところ、３つの腫瘍検体、症例9のA1280V、症例9から樹立されたUTP-ES1及び症例35のR1192Gのキナーゼドメイン内に２つのヌクレオチドミスセンス変化が見出された。両変化はまた、それらの対応正常DNAにも存在し、生殖細胞系由来であることが確認された。腫瘍検体における変異ALKの発現は両症例において認められた。
FIG. 1 is an explanatory diagram showing the protein structure of ALK, and FIG. 2 is an explanatory diagram showing an ALK mutation detected in a case of Ewing sarcoma.
For AFT abnormalities in ESFT, for primary ESFT80 specimens and 17 cell lines derived from EFST, DNA heteroduplex formation analysis and / or direct PCR amplified ALK exon including ALK near ALK membrane domain and kinase domain Screening for ALK mutations by sequencing revealed two nucleotide missense changes in the kinase domains of three tumor specimens, A1280V in
これらのヌクレオチド変化は50人の健常ボランティアには同定されず、dbSNPデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)にも登録されていなかった。さらに、これらの変化は、これまで家族性及び／または散発性神経芽腫（非特許文献９〜１２、１８）について報告された14のアミノ酸位置での20の変異のいずれにも一致せず、したがって、非機能的な一塩基型多型というよりはむしろ新規生殖細胞系変異を意味していると考えられる。
対応正常DNAは、この位置に明確にヘテロ接合体クロマトグラムを示したのに対して、症例9及びUTP-ES1腫瘍検体だけが変異（1280V）対立遺伝子を含有していた。このことに一致して、SNPアレイ分析により、野生型対立遺伝子が変異対立遺伝子の複製による染色体の誤分離により失われたと思われる第2染色体全体の獲得片親ダイソミー（aUPD）が明らかにされた。機能獲得対立遺伝子を選択するaUPDは、骨髄増殖性疾患におけるJAK2変異に対して十分に立証されていて（非特許文献１９）、神経芽腫細胞株においても報告されている（非特許文献９）。ALK発現は、ALK変異を有する症例9、症例35、UTP-ES1検体に検出された。
These nucleotide changes were not identified in 50 healthy volunteers and were not registered in the dbSNP database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Furthermore, these changes are not consistent with any of the 20 mutations at the 14 amino acid positions previously reported for familial and / or sporadic neuroblastoma (Non-Patent Documents 9-12, 18), Therefore, it is thought to mean a novel germline mutation rather than a non-functional single nucleotide polymorphism.
Corresponding normal DNA clearly showed a heterozygote chromatogram at this position, whereas
図３は、生殖細胞系変異ALKを有する患者の臨床病理学的所見を示す表である。
症例9は、前月から持続性の右頭痛のために収容された9歳の少年である。臨床検査及び頭部のコンピュータ断層撮影により、副鼻腔を含む右鼻腔に固形腫瘍を有することが明らかになった。リンパ節腫脹や転移の兆候は見られなかった。腫瘍は、過色素性の核と少量の細胞質を有する小円形細胞から成っていた。腫瘍細胞は、ビメンチン、CD99 (MIC2)、CD56、S-100及び神経特異的エノラーゼ（NSE）陽性であったが、ミオグロビン、デスミン、ケラチン及び白血球共通抗原（LCA）陰性であった。腫瘍検体中にEWS-FLI1融合転写産物が検出された。患者は多剤化学療法による治療を受けたが、最初の診断から12ヶ月後に死亡した。
症例35は、左の斜視、眼球突出及び鼻出血を有する6歳の少年である。CTスキャンにより、左鼻気道及び副鼻腔を含む大きな小葉腫瘤が検出された。転移の兆候は見られなかった。腫瘍は、少量の細胞質を有する小円形細胞から成っていて、ビメンチン、CD99、CD56、及びNSE陽性、S-100及びCD57弱陽性であった。ミオシン、デスミン及びHHF35は陰性であった。細胞発生学的検討は、t(2;22)(q35;q11)を示し、EWS-FEV融合転写産物が患者の腫瘍中に検出された。患者は、放射線化学療法及びタンデム自家末梢血幹細胞移植後、完全に寛解した。
FIG. 3 is a table showing clinicopathological findings of patients with germline mutation ALK.
２つの生殖細胞系変異は、異なる種にわたり、かつ分子進化を通して高度に保存されているキナーゼドメイン内のアミノ酸を伴っていたので、これら変異のALKキナーゼ活性に対する効果を詳細に検討した。
FLAGタグ付きALK変異、ALKA1280VをFLAGタグ付き野生型ALK及び神経芽腫由来ALK変異体ALKF1174Lと共にNIH3T3細胞内で過渡的に発現させ（非特許文献９）、免疫沈降したALKタンパク質のインビトロにおけるチロシンキナーゼ活性をpoly-GluTyrペプチドを基質に使用して測定した。
Since the two germline mutations were accompanied by amino acids within the kinase domain that were highly conserved across different species and throughout molecular evolution, the effects of these mutations on ALK kinase activity were examined in detail.
In vitro expression of ALK protein immunoprecipitated by transiently expressing FLAG-tagged ALK mutation, ALK A1280V in NIH3T3 cells together with FLAG-tagged wild-type ALK and neuroblastoma-derived ALK mutant ALK F1174L (Non-patent Document 9) Tyrosine kinase activity was measured using poly-GluTyr peptide as a substrate.
図４は、各ALK変異タンパクの自己リン酸化を示すウェスタンブロット分析の写真である。
ALK変異体、ALKA1280Vは、ALKF1174L と同様、自己リン酸化を示し、インビトロチロシンキナーゼ活性も野生型ALKに比較して上昇していた。予想されるように、Akt、Stat3及びErkのリン酸化の増大によって証明されるように、変異を形質導入したNIH3T3細胞の下流ALKシグナル伝達経路のリン酸化が増進されていて、ALKA1280V変異体の上昇したチロシンキナーゼ活性は、変異導入されたNIH3T3細胞内においてALKのシグナル伝達経路の下流を活性化した。
FIG. 4 is a photograph of Western blot analysis showing autophosphorylation of each ALK mutant protein.
The ALK mutant, ALK A1280V , showed autophosphorylation similar to ALK F1174L, and the in vitro tyrosine kinase activity was also increased compared to wild type ALK. As expected, the phosphorylation of the downstream ALK signaling pathway of the NIH3T3 cells transduced with the mutation was enhanced as evidenced by increased phosphorylation of Akt, Stat3 and Erk, and the ALK A1280V mutant Increased tyrosine kinase activity activated downstream of the ALK signaling pathway in mutated NIH3T3 cells.
図５は、神経芽腫及びユーイング肉腫ファミリー（ESFT）由来細胞株において、ALK阻害剤TAE684の影響を示すグラフである。ALK変異を有する（UTP-ES1）または有さない（SJES-6及びSJES-7）場合の細胞成長に対するALK阻害剤TAE684の影響を、三重試験の平均細胞数±S.D.をプロットして示す。ALK変異神経芽腫由来細胞株SK-N-SH及びNIH3T3細胞に対する、成長阻害のプロフィールを合わせて示す。
図６は、siRNAによるALKノックダウンによるUTP-ES1細胞成長の阻害を示すブロット写真及びグラフである。非特異的バンドは、ローディング・コントロールを示す。
ALK阻害剤TAE684及びsiRNAによるALKノックダウンを使用して、ALK変異ESFT細胞株及びUTP-ES1の細胞増殖に対するALK阻害の効果を検討した。UTP-ES1の細胞増殖は、76.1nMのIC50でTAE684により効果的に阻害された。これは、SK-N-SH（48.7nM）、ALK変異体及びTAE684感受性神経芽腫細胞株に対するIC50とほぼ同じである（非特許文献１７）が、ALK発現のないNIH3T3細胞のIC50（341nM）より実質的に低い値である。
同様に、変異ALKをsiRNAによりノックダウンしたUTP-ES1では、非特異的siRNAでトランスフェクトしたコントロールに比較して、細胞増殖が顕著に抑制された。
FIG. 5 is a graph showing the effect of ALK inhibitor TAE684 in neuroblastoma and Ewing sarcoma family (ESFT) -derived cell lines. The effect of the ALK inhibitor TAE684 on cell growth with (UTP-ES1) or without (UTJ-ES1) or without (SJES-6 and SJES-7) with ALK mutation is shown by plotting the mean cell number ± SD of triplicate tests. The growth inhibition profiles for ALK mutant neuroblastoma-derived cell lines SK-N-SH and NIH3T3 cells are also shown.
FIG. 6 is a blot photograph and graph showing inhibition of UTP-ES1 cell growth by ALK knockdown by siRNA. Non-specific bands indicate loading controls.
Using ALK knockdown with ALK inhibitors TAE684 and siRNA, the effect of ALK inhibition on cell growth of ALK mutant ESFT cell line and UTP-ES1 was examined. Cell proliferation of UTP-ES1 was effectively inhibited by TAE684 with an IC 50 of 76.1 nM. This is almost the same as the IC 50 for SK-N-SH (48.7 nM), ALK mutant and TAE684-sensitive neuroblastoma cell line (Non-patent Document 17), but the IC 50 of NIH3T3 cells without ALK expression ( The value is substantially lower than 341 nM).
Similarly, in UTP-ES1, in which mutant ALK was knocked down by siRNA, cell proliferation was remarkably suppressed as compared to the control transfected with non-specific siRNA.
新規ALK生殖細胞系変異を有する２つの症例で、ESFTを発現した他の家族は知られていなく、そのゲノムDNAを入手できなかったので、変異の同時分離やESFT発生の確認または変異が新たな変異であるのか親から遺伝されたものであるのかを決定することはできなかった。しかし、キナーゼドメイン（β4のR1192及び活性化ループのA1280）内の高保存アミノ酸の置換後、下流シグナル伝達経路の構成的活性化と同様、ALKA1280V変異のキナーゼ活性が上昇する。TAE684またはsiRNA仲介遺伝子ノックアウトによる変異ALKの阻害は、ALKA1280Vを有するUTP-ES1の増殖を抑制した。一方、R1192G変異は、３つの異なる家族性神経芽腫家系でプロリンに変異していた（R1192P）アミノ酸と同じアミノ酸に起こっていた（非特許文献１０）。以上のように、症例9及び症例35に見られたこれら新規の生殖細胞系変異は、ESFTの発生の素因となっていた。
In two cases with new ALK germline mutations, no other family members that expressed ESFT were known and their genomic DNA was not available, so the simultaneous isolation of mutations, confirmation of ESFT occurrence, or mutation was new. It was not possible to determine whether the mutation was inherited from the parent. However, after substitution of highly conserved amino acids within the kinase domain (R1192 of β4 and A1280 of the activation loop), the kinase activity of the ALK A1280V mutation is increased, as is constitutive activation of the downstream signaling pathway. Inhibition of mutant ALK by TAE684 or siRNA-mediated gene knockout suppressed the growth of UTP-ES1 with ALK A1280V . On the other hand, the R1192G mutation occurred in the same amino acid as the amino acid that was mutated to proline (R1192P) in three different familial neuroblastoma families (Non-patent Document 10). As described above, these novel germline mutations seen in
神経芽腫及びESFTの両腫瘍は類似した組織構造を示し、どちらも神経堤細胞から生じると推測されるので、生殖細胞系ALK変異の神経芽腫及びESFTの両者との関連については、さらに検討する必要がある。生殖細胞系ALK変異の活性化はそのキャリアに神経芽腫を生じさせやすくするが、その浸透度は不完全であり、家族性神経芽腫の発生には他の遺伝子の関与が必要であることは明らかである。予想されるように、今回のESFTの2症例はまた、EWS-FLI1及びEWS-FEV融合を形成するEWS関連転座を有し、ESFTの病因にこれらの融合が果たす明確な役割の根拠となっている。しかし、ESFTの発生にはEWS融合だけでは十分でなく、さらに遺伝子の変化が必要である可能性が、ALK抑制剤及びALK特異的siRNAによるALK変異ESFT細胞成長の抑制により示唆された。ALK変異神経芽腫細胞株LAN-5におけるEWS-FLI1の異種発現が、神経芽腫細胞に類似の遺伝子発現プロフィールと同様に、神経芽腫特異的マーカー及びESFT特異的マーカーの新たな発現を抑制したことは興味深い（非特許文献１４）。また、この2症例におけるESFT腫瘍が、ESFTの発症部位としては比較的稀であるが、嗅神経芽腫にも関与している鼻腔または副鼻腔に発生したことは注目すべきである（非特許文献２０）。ESFTと神経芽腫との間の病原性のつながりの可能性についてさらに研究する必要がある。
結論として、ALK生殖細胞系変異は、家族性神経芽腫だけでなく、一部のESFT症例の発生に関与していることを示唆するものであった。低分子量化合物による変異キナーゼの抑制は、一部のESFTの治療効果を有する可能性がある。
Since both neuroblastoma and ESFT tumors have similar histological structures and both are presumed to originate from neural crest cells, the relationship between germline ALK mutations with both neuroblastoma and ESFT is further investigated. There is a need to. Activation of germline ALK mutations makes the carrier more susceptible to neuroblastoma, but its penetrance is incomplete and the development of familial neuroblastoma requires the involvement of other genes Is clear. As expected, these two cases of ESFT also have EWS-related translocations that form the EWS-FLI1 and EWS-FEV fusions and provide a clear basis for their role in the pathogenesis of ESFT. ing. However, EWS fusion alone is not sufficient for ESFT development, and further gene changes may be required, as indicated by suppression of ALK mutant ESFT cell growth by ALK inhibitors and ALK-specific siRNA. Heterologous expression of EWS-FLI1 in the ALK mutant neuroblastoma cell line LAN-5 suppresses new expression of neuroblastoma-specific and ESFT-specific markers as well as gene expression profiles similar to neuroblastoma cells It is interesting (Non-Patent Document 14). It should be noted that the ESFT tumors in these two cases occurred in the nasal cavity or paranasal sinuses, which are relatively rare as the onset of ESFT, but are also involved in olfactory neuroblastoma (non-patented Reference 20). Further research is needed on the possible pathogenic link between ESFT and neuroblastoma.
In conclusion, ALK germline mutations were implicated in the development of some ESFT cases, not just familial neuroblastoma. Inhibition of mutant kinases by low molecular weight compounds may have some ESFT therapeutic effects.
以上の知見から、ALK遺伝子の変異を検知することによって、神経芽腫以外の小児固形腫瘍または食道癌の素因を評価できることが明らかとなった。
ALK遺伝子変異の検知としては、そのＳＮＰまたはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型の検知が有用である。ＳＮＰに変異があれば素因があると評価し、逆に、ＳＮＰに変異がなければ素因がない可能性があると間接的に評価できる。
From the above findings, it became clear that the predisposition of childhood solid tumors other than neuroblastoma or esophageal cancer can be evaluated by detecting mutations in the ALK gene.
As detection of ALK gene mutation, detection of the SNP or a genetic polymorphism in a linkage disequilibrium relationship with it is useful. If there is a mutation in the SNP, it can be evaluated that there is a predisposition, and conversely, if there is no mutation in the SNP, it can be indirectly evaluated that there may be no predisposition.
特に、A1280V、R1192G、A876Tのいずれかのアミノ酸変異を生じさせるＳＮＰに注目し、A1280Vの変異が、GCGからGTGへの変異であるか、R1192Gの変異が、CGGからGGGへの変異であるか、A876Tの変異が、GCCからACCへの変異であることを指標としてもよい。 In particular, paying attention to the SNP that causes any amino acid mutation of A1280V, R1192G, or A876T, whether the A1280V mutation is a GCG to GTG mutation or the R1192G mutation is a CGG to GGG mutation The indicator may be that the A876T mutation is a mutation from GCC to ACC.
なお、AALK遺伝子には、ヒト由来ｃＤＮＡや、相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、尿酸輸送能を有するポリペプチドをコードするヒト由来の同質遺伝子、哺乳動物におけるそれらの相同物も含まれる。 The AALK gene is a human-derived isogenic gene that hybridizes with human-derived cDNA or DNA consisting of a complementary base sequence under stringent conditions and encodes a polypeptide having a uric acid transport ability, in mammals. Their homologues are also included.
遺伝子多型を決定するには、ヒト血液または組織を材料として、ダイレクトシークエンス法や、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＨＲＭ法、SmartAmp法、Q-probe法（QP法）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法などが利用できる。 In order to determine the gene polymorphism, using human blood or tissue as a material, direct sequencing method, BAC array CGH method, FISH method, RFLP method, PCR-SSCP method, allele-specific oligonucleotide hybridization method, TaqMan PCR method , Invader method, HRM method, SmartAmp method, Q-probe method (QP method), MALDI-TOF / MS method, molecular beacon method, RCA method, UCAN method, nucleic acid hybridization method using DNA chip or DNA microarray, etc. Available.
ダイレクトシークエンシング法などによると、ゲノムＤＮＡから直接ＳＮＰを検出することができる。
また、クローンや、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＲＣＫ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法などにより、特定のゲノムＤＮＡ領域を増幅した後に、少なくとも多型部位を含む対立遺伝子の一部の塩基配列の決定、多型部位に特異的にハイブリダイズするプローブによる検出、多型部位を含む遺伝子断片の分子量の測定を行ったりしてもよい。
増幅産物は、塩基配列の決定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法等による分子量の測定、制限酵素断片長の解析、ＳＳＣＰによる検出、電気泳動などによって、ＳＮＰを決定することができる。
According to the direct sequencing method or the like, SNP can be directly detected from genomic DNA.
In addition, after amplification of a specific genomic DNA region by clone, PCR method, LCR method, SDA method, RCK method, LAMP method, NASBA method, etc., the base sequence of a part of the allele including at least the polymorphic site Determination, detection with a probe that specifically hybridizes to the polymorphic site, or measurement of the molecular weight of the gene fragment containing the polymorphic site may be performed.
The amplification product can be determined for SNP by determination of the base sequence, measurement of molecular weight by MALDI-TOF mass spectrometry, analysis of restriction enzyme fragment length, detection by SSCP, electrophoresis, and the like.
例えば、ＴａｑＭａｎ法は、アレル特異的なオリゴヌクレオチドと鋳型とのハイブリダイゼーションとＰＣＲ法を同時に行い、蛍光エネルギー移動現象を用いてＳＮＰを検出する方法である。蛍光色素と消光物質により標識したアレル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するように設計したプライマーでＰＣＲを行うと、プライマーからの伸長反応が進むと同時に、Ｔａｑポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によりハイブリダイズしたプローブが切断される。蛍光色素が消光物質と離れると蛍光が生じ、またＰＣＲ反応により鋳型が増幅するため、蛍光強度は指数関数的に増強する。２種類のアレルに特異的なプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば、１回のアッセイでホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することもできる。 For example, the TaqMan method is a method in which hybridization of an allele-specific oligonucleotide and a template and a PCR method are simultaneously performed and SNP is detected using a fluorescence energy transfer phenomenon. When an allele-specific probe labeled with a fluorescent dye and a quencher is hybridized to a target site and PCR is performed with a primer designed to amplify a region containing this site, the extension reaction from the primer proceeds, The hybridized probe is cleaved by the 5 ′ nuclease activity of Taq polymerase. When the fluorescent dye is separated from the quencher, fluorescence is generated, and the template is amplified by the PCR reaction, so that the fluorescence intensity increases exponentially. By labeling probes specific to the two types of alleles with different fluorescent dyes, homozygotes and heterozygotes can be distinguished in a single assay.
インベーダー法は、２種類のオリゴヌクレオチドを用い、これらのプローブが鋳型ＤＮＡと形成する特異的な構造を認識して切断する酵素反応に基づく方法である。目的塩基配列の第１の部位に実質的に相補的なインベーダープローブと、3'末端側が目的塩基配列の第２の部位と実質的に相補的であり5'末端側には鋳型と非相補的で一本鎖を形成するフラップを含むアレルプローブとの２種類の異なるプローブで、目的とする塩基配列を認識する。これらのプローブが鋳型の隣接する領域にハイブリダイズすると、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの3'末端が侵入し、この構造が酵素により切断されてフラップが遊離する。遊離したフラップはあらかじめ標識しておくことにより定量することができる。フラップ−ＦＲＥＴプローブを２組用意し、異なる蛍光色素で標識することにより、１回のアッセイで各ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。 The invader method is a method based on an enzymatic reaction in which two types of oligonucleotides are used, and these probes recognize and cleave specific structures formed with template DNA. An invader probe that is substantially complementary to the first site of the target base sequence, the 3 ′ end side is substantially complementary to the second site of the target base sequence, and the 5 ′ end side is non-complementary to the template The target base sequence is recognized by two different probes, including an allele probe containing a flap that forms a single strand. When these probes hybridize to adjacent regions of the template, the 3 ′ end of the invader probe enters the SNP site, and this structure is cleaved by the enzyme to release the flap. The released flap can be quantified by labeling in advance. By preparing two sets of flap-FRET probes and labeling with different fluorescent dyes, each homozygote and heterozygote can be distinguished in one assay.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、ＳＮＰ部位に隣接するプライマーを作製し、ＰＣＲ増幅させた試料ＤＮＡを鋳型として、ｄｄＮＴＰを用いて１塩基分だけプライマー伸長反応を行い、伸長反応生成物の質量分析により、付加したｄｄＮＴＰを識別する方法である。プライマーの蛍光標識を必要とすることなく、短時間で大量の試料を処理することができる。 In MALDI-TOF mass spectrometry, a primer adjacent to the SNP site is prepared, a PCR-amplified sample DNA is used as a template, ddNTP is used for primer extension reaction, and the extension reaction product is subjected to mass spectrometry. This is a method for identifying the added ddNTP. A large number of samples can be processed in a short time without the need for fluorescent labeling of the primer.
ＲＣＡ法は、環状の一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら長い相補鎖ＤＮＡを合成していくＤＮＡ増幅手段を、ＳＮＰタイピングに応用した方法である。ＳＮＰの識別をＲＣＡ法による増幅の有無で行う。すなわち、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になりうる一本鎖プローブをゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせて連鎖反応を行う。プローブの端を識別したいＳＮＰの部位としておけば、その部位がマッチしていれば連結され環状となってＲＣＡによる増幅が起こるが、ミスマッチであれば連結されず環状とならないためＲＣＡ増幅は起こらない。この２種類の増幅反応を識別することによってＳＮＰを決定することができる。 The RCA method is a method in which a DNA amplification means in which a circular single-stranded DNA is used as a template and a DNA polymerase synthesizes a long complementary strand DNA while moving on the template is applied to SNP typing. The SNP is identified by the presence or absence of amplification by the RCA method. That is, a single-stranded probe that can anneal with genomic DNA and hybridize to the genomic DNA is hybridized to genomic DNA to perform a chain reaction. If the end of the probe is identified as the SNP site to be identified, if the site matches, it will be connected and become circular, and amplification by RCA will occur, but if it is mismatched, it will not be connected and will not become circular, so RCA amplification will not occur . The SNP can be determined by discriminating between these two types of amplification reactions.
ＤＮＡチップ法は、多型部位を含むオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置したＤＮＡチップを用いて、ＰＣＲ増幅させた蛍光標識ｃＤＮＡやｃＲＮＡとハイブリダイゼーションする方法である。多くのＳＮＰを迅速に検出することができる。 The DNA chip method is a method of hybridizing with PCR-amplified fluorescently labeled cDNA or cRNA using a DNA chip in which an oligonucleotide probe containing a polymorphic site is arranged on a microarray. Many SNPs can be detected quickly.
アミノ酸配列の多型を決定する方法には、例えば、二次元電気泳動法やマイクロフルーイディクス法によるプロテオーム解析、質量分析装置を用いたペプチドマッピングとアミノ酸配列分析、プロテインシークエンサーによるアミノ酸配列分析、プロテインチップを用いてポリペプチドとリガンドとの相互作用を検出する方法などが利用できる。 Methods for determining amino acid sequence polymorphism include, for example, proteome analysis using two-dimensional electrophoresis and microfluidics, peptide mapping and amino acid sequence analysis using a mass spectrometer, amino acid sequence analysis using a protein sequencer, protein chip A method for detecting the interaction between a polypeptide and a ligand using the above can be used.
例えば、二次元電気泳動法は、一般的には、一次元目に等電点電気泳動を、二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うものであり、１枚のゲルで数千のタンパク質を分離することができる。等電点電気泳動には、両性担体や固定化ｐＨ勾配ゲルストリップを用いる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、１種類のｐＨの緩衝液を用いる連続緩衝液系と、複数のｐＨの緩衝液を用いる不連続緩衝液系とがある。また、分離するタンパク質の種類によって、低ＢＩＳ濃度ゲル電気泳動、濃度勾配ゲル電気泳動、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを用いることができる。分離されたタンパク質は、クーマシーブルー染色や銀染色や蛍光試薬を用いてゲル上で感度よく検出できる。また、ALKポリペプチドに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法も利用可能である。 For example, two-dimensional electrophoresis generally performs isoelectric focusing in the first dimension and SDS-PAGE in the second dimension, and separates thousands of proteins on a single gel. be able to. For isoelectric focusing, an amphoteric carrier or an immobilized pH gradient gel strip is used. SDS-PAGE includes a continuous buffer system using a buffer solution of one kind of pH and a discontinuous buffer system using a buffer solution of a plurality of pHs. Depending on the type of protein to be separated, low BIS concentration gel electrophoresis, concentration gradient gel electrophoresis, tricine-SDS-PAGE, or the like can be used. The separated protein can be detected with high sensitivity on a gel using Coomassie blue staining, silver staining, or a fluorescent reagent. A Western blotting method using an antibody against ALK polypeptide can also be used.
質量分析方法の一つであるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、タンパク質試料とシナピン酸等のレーザー光を吸収するマトリクスとの混合、乾燥後に強力なパルスレーザー光を照射し、マトリクスからのエネルギー移動によるタンパク質試料のイオン化を行い、初期加速による試料分子イオンの飛行時間差でイオンの分子量を分析する方法である。ペプチドを質量分析計内部で断片化し、断片の質量解析からアミノ酸配列やアミノ酸組成などを得るためには、質量分離部を複数連結したタンデム質量分析法が利用され、エレクトロスプレーイオン化法を用いた三連四重極型やハイブリッド型やイオントラップ型分析計等も用いられる。 The MALDI-TOF / MS method, which is one of the mass spectrometry methods, mixes a protein sample with a matrix that absorbs laser light such as sinapinic acid, irradiates a powerful pulsed laser light after drying, and transfers energy from the matrix. In this method, ionization of a protein sample is performed, and the molecular weight of the ions is analyzed based on the time-of-flight difference of the sample molecular ions due to initial acceleration. In order to fragment peptides inside a mass spectrometer and obtain amino acid sequences, amino acid compositions, etc. from the mass analysis of fragments, tandem mass spectrometry with multiple mass separation units is used, and electrospray ionization is used. A quadrupole type, a hybrid type, an ion trap type analyzer and the like are also used.
プロテインチップ法は、基板上に並べたタンパク質や、ペプチド、抗体、発現タンパク質などと試料との相互作用を、包括的かつ迅速に行うことができる。 The protein chip method can comprehensively and rapidly perform the interaction between a sample and proteins arranged on a substrate, peptides, antibodies, expressed proteins, and the like.
本発明による評価キットは、小児固形腫瘍または食道癌を生じ得る素因を有するか否かを評価するキットであって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ALK遺伝子のA1280V、R1192G、A876Tの少なくともいずれかにおけるＳＮＰ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検知する手段を備える。
すなわち、ALK遺伝子多型を含むポリヌクレオチド、または多型を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対、多型を検出するためのポリヌクレオチドとして提供してもよい。
The evaluation kit according to the present invention is a kit for evaluating whether or not there is a predisposition to cause pediatric solid tumor or esophageal cancer, using a sample containing a human gene of a subject, and using at least one of A1280V, R1192G, and A876T of the ALK gene. Means for detecting a SNP in any one or a genetic polymorphism in a linkage disequilibrium relationship therewith is provided.
That is, it may be provided as a polynucleotide containing an ALK gene polymorphism, a primer pair for amplifying a DNA fragment containing the polymorphism, or a polynucleotide for detecting the polymorphism.
なお、ポリヌクレオチドとは、ポリリボヌクレオチドとポリデオキシリボヌクレオチドの双方を含み、それらは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡ、それらの断片などが挙げられる。
また、ポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含む。ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸や、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。その修飾には、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、カルボキシル末端において、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化などが挙げられる。
Polynucleotide includes both polyribonucleotide and polydeoxyribonucleotide, which may be unmodified RNA or DNA, modified RNA or DNA, for example, DNA, cDNA, genomic DNA, mRNA, unprocessed RNA And fragments thereof.
Polypeptides are those in which two or more amino acids are linked by peptide bonds, and include those called relatively short-chain peptides or oligopeptides to long-chain proteins called proteins. Polypeptides may contain amino acids other than the 20 genetically encoded amino acids and modified amino acids. The modifications include acetylation, acylation, ADP ribosylation, amidation, biotinylation, covalent bonding with lipids and lipid derivatives, and cross-linking at the main chain, amino acid side chain, amino terminus, and carboxyl terminus of the peptide bond. Examples include formation, disulfide bond, addition of sugar chain, addition of GPI anchor, phosphorylation and prenylation.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤候補物質選定方法は、小児固形腫瘍または食道癌の治療薬、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤の候補物質を選定する方法であって、試験物質の存在下及び非存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、それぞれの細胞においてチロシンキナーゼの酵素活性の上昇度を測定する工程と、その酵素活性の上昇を抑制する効果を有する試験物質を候補物質として選定する工程を含む。 The method for selecting a drug candidate substance for childhood solid tumor or esophageal cancer according to the present invention is a method for selecting a candidate drug for a childhood solid tumor or esophageal cancer drug or a drug that reduces the predisposition to cause the disease. A step of culturing mammalian cells in the presence and absence of a substance, a step of measuring the increase in enzyme activity of tyrosine kinase in each cell, and a test substance having an effect of suppressing the increase in enzyme activity Including a step of selecting as a candidate substance.
哺乳動物としては、マウスなどが挙げられ、その生体を構成している組織や細胞も含む。また、試料としては、生物に由来するポリヌクレオチドを含有するものであって、組織や細胞から採取される体液、皮膚、毛根、粘膜、内臓、胎盤、臍帯血等を含む。
同様に、ヒトALK遺伝子または非ヒトALK遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、A1280V、R1192G、A876Tのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトALK遺伝子または非ヒトALK遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、ALK遺伝子を欠損させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、ヒトALK遺伝子または非ヒトALK遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、A1280V、R1192G、A876Tのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトALK遺伝子または非ヒトALK遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、或いはそれら細胞株より調製した細胞膜小胞を用いてもよい。
Mammals include mice and the like, and include tissues and cells constituting the living body. Samples contain polynucleotides derived from living organisms, and include body fluids collected from tissues and cells, skin, hair roots, mucous membranes, viscera, placenta, umbilical cord blood, and the like.
Similarly, a non-human animal overexpressing a human ALK gene or a non-human ALK gene, a non-human overexpressing a human ALK gene or a non-human ALK gene containing a mutation of at least one of A1280V, R1192G, and A876T Animal, non-human cell line or human cell line deficient in ALK gene, non-human cell line or human cell line over-expressed human ALK gene or non-human ALK gene, at least one of A1280V, R1192G, A876T A non-human cell line or a human cell line overexpressing a human ALK gene or a non-human ALK gene containing the above mutation, or a cell membrane vesicle prepared from these cell lines may be used.
本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤は、小児固形腫瘍または食道癌、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、チロシンキナーゼの酵素活性の上昇を抑制する効果を有する。 The childhood solid tumor or esophageal cancer drug of the present invention is a drug that reduces the predisposition to cause childhood solid tumor or esophageal cancer, or a disease thereof, and has an effect of suppressing an increase in the enzyme activity of tyrosine kinase.
また、本発明の小児固形腫瘍または食道癌の薬剤は、小児固形腫瘍または食道癌、またはその疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、ALKタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態で有するか、または、ALKタンパク質に相当するポリペプチドを細胞内に導入可能な形態で有するものとしても提供可能である。前者によると、長期間にわたって安定に尿酸輸送を改善させることができ、後者によると、注射等の投与によって簡便に尿酸輸送を改善させることができる。 In addition, the childhood solid tumor or esophageal cancer drug of the present invention is a drug that reduces the predisposition to cause childhood solid tumor or esophageal cancer, or a disease thereof, and can introduce a polynucleotide encoding ALK protein into the cell. Or having a polypeptide corresponding to ALK protein in a form that can be introduced into cells. According to the former, uric acid transport can be stably improved over a long period of time, and according to the latter, uric acid transport can be simply improved by administration such as injection.
なお、ポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態とは、ポリヌクレオチドが細胞内に導入され、細胞内のALK遺伝子がALKを発現するようにコードされているALKを発現すること可能とする形態を意味する。同様に、ポリペプチドを細胞内に導入可能な状態とは、ポリペプチドが細胞内に導入され、細胞内のALKと同様な機能を発揮することを可能とする形態を意味する。 The form in which the polynucleotide can be introduced into the cell is a form in which the polynucleotide is introduced into the cell, and the ALK gene in the cell can express ALK encoded to express ALK. means. Similarly, the state in which a polypeptide can be introduced into a cell means a form in which the polypeptide is introduced into the cell and can perform the same function as ALK in the cell.
ALKポリヌクレオチドは、既知のヌクレオチド配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて既存のcDNAライブラリーをスクリーニングする方法や、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたRT-PCR等の方法によって取得することができる。 The ALK polynucleotide can be obtained by a method of screening an existing cDNA library using an oligonucleotide probe prepared based on a known nucleotide sequence, or a method such as RT-PCR using an oligonucleotide primer.
A1280V、R1192G、A876TのいずれにもＳＮＰのないALKが好ましく、そのポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な状態にするためには、例えば、むき出しDNAとする方法や、組換えウイルスベクターの形態で製剤化する方法が用いられる。ウイルスベクターには、バキョロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科などのウイルスのゲノムに由来するものが利用できる。 ALK without any SNP is preferred in any of A1280V, R1192G, and A876T. In order to make the polynucleotide in a state that can be introduced into cells, for example, a method using bare DNA or a preparation in the form of a recombinant viral vector Is used. As viral vectors, those derived from the genomes of viruses such as Bacyroviridae, Parvoviridae, Picornoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Adenoviridae, and Picornaviridae can be used.
また、生体より取り出した組織または細胞にポリヌクレオチド発現ベクターを導入した後に、生体に戻すようにしてもよい。そのような場合は、ポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクターを、例えばマイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法などのトランスフェクションにより細胞内に導入する方法が利用できる。 Alternatively, the polynucleotide expression vector may be introduced into the tissue or cells removed from the living body and then returned to the living body. In such a case, a method of introducing an expression vector incorporating a polynucleotide into a cell by transfection such as a microinjection method or an electroporation method can be used.
ウイルスベクターや発現ベクターにおけるポリヌクレオチドは、全身性または組織特異的に発現するプロモーター支配下に連結してもよい。また、ウイルスベクターを腎臓特異的に感染させる場合には、経皮的に動脈にカテーテルを挿入して、X線でカテーテルの位置を確認しながら腎臓動脈にカテーテルを挿入して組換えベクターを導入することが可能である。 Polynucleotides in viral vectors and expression vectors may be linked under the control of a systemic or tissue-specific expression promoter. In addition, when a viral vector is specifically infected with a viral vector, a catheter is inserted into the artery percutaneously, and the recombinant vector is introduced by inserting the catheter into the renal artery while confirming the position of the catheter with X-rays. Is possible.
ALKポリペプチドは、前記のALKポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的方法により作成することができる。すなわち、ポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでALKポリペプチドを得ることができる。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組換えれば、大腸菌や枯草菌等の原核細胞や、酵母や、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞の発現産物としてALKポリペプチドを得ることができる。
また、ALKポリペプチドは、公知の化学合成法に準じて合成することもできる。
The ALK polypeptide can be prepared by a genetic engineering method using the ALK polynucleotide. That is, ALK polypeptide can be obtained in vitro by preparing RNA from a vector having a polynucleotide by in vitro transcription and performing in vitro translation using this as a template. Further, if the polynucleotide is recombined into an expression vector, an ALK polypeptide can be obtained as an expression product of prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as yeast, insect cells and mammalian cells.
ALK polypeptides can also be synthesized according to known chemical synthesis methods.
ALKポリペプチドは、ペプチド誘導体として提供してもよい。この誘導体には、合成や精製を促進するための修飾、物理、化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾などを含む。
ペプチド誘導体におけるその他の修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化などが含まれる。より具体的には、ペプチド誘導体は、ALKポリペプチドの活性を破壊せず、またこれを含有する組成物に毒性を与えない範囲において、残基の側鎖またはN末端基もしくはC末端基として生じる機能性基として調製することができる。例えば、体液中でポリペプチドの残存を延長するポリエチレングリコール側鎖を含む誘導体、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたはアミンと反応することによるカルボキシル基のアミド、アシル部分と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のN−アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離の水酸基のO−アシル誘導体などが挙げられる。
ALK polypeptides may be provided as peptide derivatives. Such derivatives include modifications to promote synthesis and purification, modifications to promote physical and chemical stabilization, stability and instability to metabolism in vivo, and activation modifications such as conditioning.
Other modifications in peptide derivatives include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, flavin covalent bond, heme moiety covalent bond, nucleotide or nucleotide derivative covalent bond, lipid or lipid derivative covalent bond, Phosphatidylinositol covalent bond, cross-linking, cyclization, disulfide bond, demethylation, cross-linking covalent bond formation, cystine formation, pyroglutamate formation, formylation, gamma-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation, iodine , Methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, lipid binding, sulfation, selenoylation and the like. More specifically, peptide derivatives occur as residue side chains or N-terminal or C-terminal groups to the extent that they do not destroy the activity of the ALK polypeptide and do not cause toxicity to the composition containing it. It can be prepared as a functional group. For example, derivatives containing polyethylene glycol side chains that extend the persistence of polypeptides in body fluids, aliphatic esters of carboxyl groups, amides of carboxyl groups by reacting with ammonia or amines, amino acid residues formed with acyl moieties N-acyl derivatives of free amino groups or O-acyl derivatives of free hydroxyl groups formed with acyl moieties.
ALKポリペプチドはまた、薬理学的に許容し得る塩として提供してもよい。この塩には、ポリペプチドのカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の双方を含む。
カルボキシル基の塩は、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛などの無機塩や、トリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを用いて形成された有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸や硫酸などの鉱酸との塩、酢酸やシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。
ALK polypeptides may also be provided as pharmacologically acceptable salts. This salt includes both a carboxyl group salt and an amino acid addition salt of a polypeptide.
Examples of the salt of the carboxyl group include inorganic salts such as sodium, calcium, ammonium, iron, and zinc, and salts with organic bases formed using amines such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine, and procaine. It is done. Examples of acid addition salts include salts with mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, and salts with organic acids such as acetic acid and oxalic acid.
このようなALKポリペプチドを細胞内に導入可能な形態に製剤化するには、例えば、ポリペプチドのN末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融合ポリペプチドの利用が挙げられる。細胞膜通過ペプチドとしては、HIV-1・TATのPTDや、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアのPTDを使用することができる。融合ポリペプチドは、例えば、ALKポリヌクレオチドとPTDポリヌクレオチドとを連結して作製した融合ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子工学的に作製することができる。また、EDCやβ−アラニン等の架橋剤を介して、ポリペプチドとPTDペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結した融合ポリペプチドを作成することもできる。このような融合ポリペプチドは、経皮的に動脈にカテーテルを挿入して、X線でカテーテルの位置を確認しながら腎臓動脈にカテーテルを挿入して組換えベクターを導入することが可能である。 In order to formulate such an ALK polypeptide into a form that can be introduced into cells, for example, use of a fusion polypeptide in which a cell membrane-passing peptide is linked to the N-terminal side of the polypeptide can be mentioned. Peptides of HIV-1 and TAT and DTD of Drosophila homeobox protein antennapedia can be used as cell membrane-passing peptides. The fusion polypeptide can be prepared by genetic engineering using, for example, a fusion polynucleotide prepared by linking an ALK polynucleotide and a PTD polynucleotide. In addition, a fusion polypeptide in which cell membrane-passing peptides are linked by a method of binding a polypeptide and a PTD peptide via a crosslinking agent such as EDC or β-alanine can also be prepared. Such a fusion polypeptide can be transcutaneously inserted into an artery and the recombinant vector introduced by inserting the catheter into the renal artery while confirming the position of the catheter with X-rays.
本発明によると、小児固形腫瘍や食道癌の早期治療や予防に有効であり、産業上有用である。 According to the present invention, it is effective for early treatment and prevention of childhood solid tumors and esophageal cancer, and is industrially useful.
Claims (9)
被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ALK遺伝子の変異を検知する工程を有する
ことを特徴とする小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価方法。 A method for assessing whether a child has a predisposition to cause solid tumor or esophageal cancer, comprising:
A method for evaluating a predisposition to a childhood solid tumor or esophageal cancer, comprising using a sample containing a human gene of a subject and detecting a mutation in the ALK gene.
請求項１に記載の小児固形腫瘍の素因の評価方法。 The method for evaluating a predisposition to a childhood solid tumor according to claim 1, wherein the childhood solid tumor is a tumor other than a neuroblastoma.
ＳＮＰまたはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型の検知である
請求項１または２に記載の小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価方法。 Detection of ALK gene mutation
The method for evaluating a predisposition for a childhood solid tumor or esophageal cancer according to claim 1 or 2, wherein the detection is SNP or a genetic polymorphism in a linkage disequilibrium relationship thereto.
請求項１ないし３のいずれかに記載の小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価方法。 The pediatric solid according to any one of claims 1 to 3, wherein the pediatric solid is evaluated as having a predisposition to cause pediatric solid tumor or esophageal cancer when there is at least a SNP that causes any amino acid mutation of A1280V, R1192G, or A876T. Methods for assessing predisposition to tumor or esophageal cancer.
請求項４に記載の小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価方法。 The child according to claim 4, wherein the A1280V mutation is a GCG to GTG mutation, the R1192G mutation is a CGG to GGG mutation, or the A876T mutation is a GCC to ACC mutation. Methods for assessing predisposition to solid tumors or esophageal cancer
請求項１ないし５のいずれかに記載の小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価方法。 For detection of gene polymorphism, direct sequencing method, BAC array CGH method, FISH method, RFLP method, PCR-SSCP method, allele-specific oligonucleotide hybridization method, TaqMan PCR method, Invader method, HRM method, SmartAmp method, Q Any one of -probe method (QP method), MALDI-TOF / MS method, molecular beacon method, RCA method, UCAN method, nucleic acid hybridization method using DNA chip or DNA microarray The evaluation method of the predisposition of the child solid tumor or esophageal cancer described in 1.
被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ALK遺伝子のA1280V、R1192G、A876T
の少なくともいずれかにおけるＳＮＰ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検知する手段を備える
ことを特徴とする小児固形腫瘍または食道癌の素因の評価キット。 A kit for assessing whether or not the child has a predisposition to cause pediatric solid tumor or esophageal cancer,
Using a sample containing the human gene of the subject, A1280V, R1192G, A876T of ALK gene
A kit for evaluating a predisposition to a childhood solid tumor or esophageal cancer, comprising means for detecting a SNP in at least one of the above, or a genetic polymorphism in a linkage disequilibrium relationship thereto.
試験物質の存在下及び非存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、それぞれの細胞においてチロシンキナーゼの酵素活性の上昇度を測定する工程と、
その酵素活性の上昇を抑制する効果を有する試験物質を候補物質として選定する工程を含む
ことを特徴とする小児固形腫瘍または食道癌の薬剤候補物質選定方法。 A method for selecting a candidate drug for a childhood solid tumor or esophageal cancer treatment, or a drug that reduces the predisposition to causing the disease,
Culturing mammalian cells in the presence and absence of a test substance, measuring the increase in enzyme activity of tyrosine kinase in each cell,
A method for selecting a drug candidate substance for a childhood solid tumor or esophageal cancer, comprising a step of selecting a test substance having an effect of suppressing an increase in enzyme activity as a candidate substance.
チロシンキナーゼの酵素活性の上昇を抑制する効果を有する
ことを特徴とする小児固形腫瘍または食道癌の薬剤。 A drug that reduces the predisposition to causing pediatric solid tumors or esophageal cancer or the disease
A childhood solid tumor or esophageal cancer drug characterized by suppressing an increase in the enzyme activity of tyrosine kinase.
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