JP2012076998A - Melanoma metastasis inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、メラノーマ転移抑制剤、メラノーマ転移抑制方法、メラノーマ転移抑制剤調製のための使用、メラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a melanoma metastasis inhibitor, a melanoma metastasis inhibitor method, a use for preparing a melanoma metastasis inhibitor, and a screening method for a melanoma metastasis inhibitor.
メラノーマ（悪性黒色腫）は、メラノサイト（メラニン色素産生細胞）が癌化して生じる悪性腫瘍であり、全身の皮膚、粘膜のほか、目、脊髄、脳等の臓器にも発生する。メラノーマは早期の段階から転移が生じ易く、化学療法や放射線療法にも抵抗性であるため、悪性度の高い腫瘍として知られている（非特許文献１および２）。そのため、メラノーマの治療は基本的には外科的手術に頼らざるを得ないが、転移が生じると外科的手術でも処置し切れなくなる場合が多く、有効な治療法が求められている。 Melanoma (malignant melanoma) is a malignant tumor that occurs when melanocytes (melanin-producing cells) become cancerous, and occurs not only in the skin and mucous membranes of the whole body but also in organs such as the eyes, spinal cord, and brain. Melanoma is known as a highly malignant tumor because it tends to metastasize from an early stage and is resistant to chemotherapy and radiation therapy (Non-patent Documents 1 and 2). Therefore, treatment of melanoma must basically depend on surgical operation, but when metastasis occurs, it is often impossible to treat even surgical operation, and an effective treatment method is required.
ＳＩＲＴ１は、ＮＡＤを補酵素とするクラスIIIに属するヒストンデアセチラーゼであり、酵母や線虫、ショウジョウバエで過剰発現をおこなうと寿命が延長するＳｉｒ２遺伝子の哺乳類ホモログである。ＳＩＲＴ１は、ヒストンＨ３やＨ４のアセチル化されたリシン残基を脱アセチル化する他、各種の転写因子を調節して細胞の死、分化、代謝などに関与することが近年の研究によりしだいに明らかにされつつある。例えば、ＳＩＲＴ１が、転写因子ｐ５３を脱アセチル化してｐ５３活性を抑制することによりアポトーシスを抑えたり、転写因子ＦＯＸＯｓを脱アセチル化して細胞の酸化ストレスに対する耐性を高める他、核内受容体ＰＰＡＲγの転写を抑えて脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を抑制したり、転写コアクチベータＰＧＣ−１αを活性化して糖の新生を促進しさらにミトコンドリアでの酸化的リン酸化を促進させたりすることが明らかにされている。 SIRT1 is a histone deacetylase belonging to class III that uses NAD as a coenzyme, and is a mammalian homolog of the Sir2 gene whose lifespan is extended when overexpressed in yeast, nematodes, and Drosophila. In recent years, it has become clear that SIRT1 is involved in cell death, differentiation, metabolism, etc. by regulating various transcription factors in addition to deacetylating histone H3 and H4 acetylated lysine residues It is being made. For example, SIRT1 suppresses apoptosis by deacetylating the transcription factor p53 and suppressing p53 activity, and deacetylates the transcription factor FOXOs to increase the resistance to cellular oxidative stress. In addition, transcription of the nuclear receptor PPARγ Clearly suppresses differentiation of preadipocytes into adipocytes, activates transcriptional coactivator PGC-1α, promotes gluconeogenesis, and further promotes oxidative phosphorylation in mitochondria Has been.
非特許文献３には、ＳＩＲＴ１遺伝子の発現を阻害すると、転写因子ＦＯＸＯ１を介して血管新生が抑制されることが記載されている。また、非特許文献４には、ＳＩＲＴ２が細胞運動に関係することが示唆されている。しかし、ＳＩＲＴ２は、ＳＩＲＴ１と類似のNAD+-dependent ＨＤＡＣドメイン及びＣｄｋリン酸化部位を持つが、他の部分は全く異なる別の遺伝子産物である（非特許文献４の図１Ｄ参照）。 Non-Patent Document 3 describes that inhibition of SIRT1 gene expression suppresses angiogenesis through the transcription factor FOXO1. Non-Patent Document 4 suggests that SIRT2 is related to cell movement. However, SIRT2 has another NAD + -dependent HDAC domain and Cdk phosphorylation site similar to SIRT1, but is another gene product that is completely different (see FIG. 1D of Non-Patent Document 4).
しかし、ＳＩＲＴ１を阻害すると、メラノーマの転移を抑制することについては何ら知られていなかった。 However, it has not been known at all that inhibiting SIRT1 suppresses melanoma metastasis.
本発明の課題は、実用的なメラノーマ転移抑制剤やメラノーマ転移抑制方法を提供することや、実用的なメラノーマ転移抑制剤調製のための使用を提供することや、メラノーマ転移抑制剤の実用的なスクリーニング方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a practical melanoma metastasis inhibitor and a method for inhibiting melanoma metastasis, to provide a use for preparing a practical melanoma metastasis inhibitor, and to use a practical melanoma metastasis inhibitor. It is to provide a screening method.
本発明者らは、ニコチンアミド、スプリトマイシン、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ等のＳＩＲＴ１阻害作用物質が、メラノーマ細胞の細胞移動を阻害すること、及び、ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、in vivoにおいて、メラノーマ細胞の転移を抑制すること等を見い出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have confirmed that SIRT1 inhibitory agents such as siRNA against nicotinamide, splitomycin, SIRT1 inhibit cell migration of melanoma cells, and that SIRT1 inhibitory agents inhibit melanoma cell metastasis in vivo. The present inventors have found out the suppression and the like and have completed the present invention.
すなわち本発明は、（１）ＳＩＲＴ１阻害作用物質を含有するメラノーマ転移抑制剤や、（２）ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、ニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする上記（１）に記載のメラノーマ転移抑制剤に関する。 That is, the present invention relates to (1) a melanoma metastasis inhibitor containing a SIRT1 inhibitory agent, and (2) a SIRT1 inhibitory agent is nicotinamide, splitomycin, sirtinol, siRNA against SIRT1, antisense RNA against SIRT1, and SIRT1 The melanoma metastasis inhibitor according to (1) above, which is selected from the group consisting of miRNA.
また本発明は、（３）ＳＩＲＴ１阻害作用物質を投与することを特徴とするメラノーマ転移抑制方法や、（４）ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、ニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする上記（３）に記載のメラノーマ転移抑制方法に関する。 The present invention also provides (3) a method for inhibiting melanoma metastasis, comprising administering a SIRT1 inhibitory agent, and (4) a SIRT1 inhibitory agent comprising nicotinamide, splitomycin, sirtinol, siRNA against SIRT1, anti-SIRT1 The method for suppressing melanoma metastasis according to (3) above, wherein the method is selected from the group consisting of miRNA for sense RNA and SIRT1.
さらに本発明は、（５）ＳＩＲＴ１阻害作用物質のメラノーマ転移抑制剤調製のための使用や、（６）ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、ニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする上記（５）に記載の使用に関する。 The present invention further relates to (5) use of a SIRT1 inhibitory agent for preparing a melanoma metastasis inhibitor, The use according to (5) above, which is selected from the group consisting of miRNAs against SIRT1.
また本発明は、（７）以下の工程を有することを特徴とするメラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法；被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程；測定の結果得られたヒストンデアセチラーゼ活性の値を、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値と比較する工程；被検物質の存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値が、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値より低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；に関する。 The present invention also includes (7) a screening method for a melanoma metastasis inhibitor characterized by comprising the following steps; a step of measuring the histone deacetylase activity of SIRT1 in the presence of a test substance; Comparing the obtained histone deacetylase activity value with the value of SIRT1 histone deacetylase activity in the absence of the test substance; the value of SIRT1 histone deacetylase activity in the presence of the test substance And a step of evaluating the test substance as a melanoma metastasis inhibitor when the histone deacetylase activity of SIRT1 in the absence of the test substance is lower than the value.
本発明のメラノーマ転移抑制剤やメラノーマ転移抑制方法は、メラノーマの転移を効果的に抑制することができる。そのメラノーマ転移抑制効果は、in vivoにおいても実証されているため、非常に実用性が高い。本発明のメラノーマ転移抑制剤やメラノーマ転移抑制方法を用いてメラノーマの転移を抑制すると、メラノーマ除去手術後の再発率を低減させたり、メラノーマの悪化を抑制・遅延させたりすることができるため、メラノーマの治療の可能性を顕著に向上させることが可能となる。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法は、実用性の高いメラノーマ転移抑制剤を効率良くスクリーニングすることができる。 The melanoma metastasis inhibitor and the melanoma metastasis inhibition method of the present invention can effectively inhibit melanoma metastasis. The inhibitory effect on melanoma metastasis has been demonstrated in vivo, and is therefore highly practical. When melanoma metastasis is suppressed using the melanoma metastasis inhibitor or the melanoma metastasis suppression method of the present invention, it is possible to reduce the recurrence rate after melanoma removal surgery or to suppress / delay deterioration of melanoma. It is possible to significantly improve the possibility of treatment. Moreover, the screening method for a melanoma metastasis inhibitor of the present invention can efficiently screen for a highly practical melanoma metastasis inhibitor.
本発明のメラノーマ転移抑制剤としては、ＳＩＲＴ１阻害作用物質を含有している限り特に制限されず、また本発明のメラノーマ転移抑制方法としては、ＳＩＲＴ１阻害作用物質を投与する方法であれば特に制限されず、そしてまた、本発明の使用としては、ＳＩＲＴ１阻害作用物質をメラノーマ転移抑制剤の調製のために使用する方法であれば特に制限されない。後述の実施例の結果から明らかなように、ＳＩＲＴ１を阻害すれば、メラノーマ転移を抑制し得るからである。本発明におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質としては、いずれかの哺乳動物のＳＩＲＴ１の活性（好ましくはヒストンデアセチラーゼ活性）を阻害する物質である限り特に制限されないが、例えばニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡを好適に例示することができ、中でもニコチンアミド、スプリトマイシン、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡをより好適に例示することができ、安全性や入手の容易性や投与の容易性の観点から、ニコチンアミド、スプリトマイシンをさらに好適に例示することができる。上記のニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinolは、市販のものを使用することができる。また、上記のＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡは、ＳＩＲＴ１の配列情報に基づいて、適宜設計し、そのメラノーマ細胞転移抑制効果を確認することにより、得ることができる。 The melanoma metastasis inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it contains a SIRT1 inhibitory substance, and the melanoma metastasis inhibitory method of the present invention is not particularly limited as long as it is a method of administering a SIRT1 inhibitory substance. In addition, the use of the present invention is not particularly limited as long as it is a method using a SIRT1 inhibitory agent for the preparation of a melanoma metastasis inhibitor. This is because, as is clear from the results of Examples described later, melanoma metastasis can be suppressed by inhibiting SIRT1. The SIRT1 inhibitory substance in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits SIRT1 activity (preferably histone deacetylase activity) of any mammal. For example, nicotinamide, splitomycin, sirtinol, SIRT1 SiRNA against SIRT, antisense RNA against SIRT1, and miRNA against SIRT1 can be preferably exemplified, among which nicotinamide, splitomycin, siRNA against SIRT1 can be more suitably exemplified, and safety, availability, and administration From the viewpoint of easiness, nicotinamide and splitomycin can be further exemplified. Commercially available nicotinamide, splitomycin and sirtinol can be used. The siRNA for SIRT1 and the antisense RNA for SIRT1 can be obtained by designing appropriately based on the sequence information of SIRT1 and confirming its melanoma cell metastasis inhibitory effect.
本発明のメラノーマ転写抑制剤では、２種類以上のＳＩＲＴ１阻害作用物質を併用してもよい。また、上記の哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。 In the melanoma transcription inhibitor of the present invention, two or more kinds of SIRT1 inhibitory agents may be used in combination. In addition, the mammal is not particularly limited, and humans, monkeys, mice, rats, hamsters, guinea pigs, cows, pigs, horses, rabbits, sheep, goats, cats, dogs and the like can be preferably exemplified. Of these, humans can be more preferably exemplified.
ある被検物質が、ＳＩＲＴ１阻害作用物質であるかどうかは、被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程；測定の結果得られたヒストンデアセチラーゼ活性の値を、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値と比較する工程；被検物質の存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値が、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値より低い場合に、その被検物質をＳＩＲＴ１阻害作用物質と評価する工程；を有する方法により、容易に確認することができる。上記のＳＩＲＴ１タンパク質は、公知のＳＩＲＴ１の配列情報に基づいて、所望の哺乳動物からＳＩＲＴ１遺伝子を単離し、該遺伝子を適当な発現ベクターにインテグレイトして発現させた後、そのＳＩＲＴ１を単離することによって容易に入手することができる。ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性は、ＳＩＲＴ１の基質であるアセチル化されたｐ５３の３８２番目のリシン又は３２０番目のリシンを含む蛍光標識ペプチド（Biomol社製）等を用いて測定することができる。 Whether a certain test substance is a SIRT1 inhibitory agent is determined by measuring the histone deacetylase activity of SIRT1 in the presence of the test substance; the value of histone deacetylase activity obtained as a result of the measurement. The step of comparing with the value of histone deacetylase activity of SIRT1 in the absence of the test substance; the value of histone deacetylase activity of SIRT1 in the presence of the test substance is SIRT1 in the absence of the test substance When the test substance is lower than the histone deacetylase activity, the test substance can be easily confirmed by a method comprising the step of evaluating the test substance as a SIRT1 inhibitory agent. The above-mentioned SIRT1 protein is isolated from a desired mammal based on the known SIRT1 sequence information, and the SIRT1 protein is integrated into an appropriate expression vector and expressed, and then the SIRT1 is isolated. Can be easily obtained. The histone deacetylase activity of SIRT1 can be measured using, for example, a fluorescence labeled peptide (Biomol) containing the 382rd lysine or 320th lysine of acetylated p53 which is a substrate of SIRT1.
本発明におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質のメラノーマ転移抑制効果を確認する方法としては、特に制限されないが、メラノーマ細胞をコンフルエントになるまで培養し、メラノーマ細胞の層を形成させる工程；メラノーマ細胞の層に被検物質を添加する工程；被検物質の添加から一定時間経過後に、メラノーマ細胞の層をスクラッチする工程；スクラッチした部分（スクラッチ部分）を、スクラッチから一定時間経過後に観察して、メラノーマ細胞のスクラッチ部分への移動の程度を測定する工程；メラノーマ細胞のスクラッチ部分への移動の程度を、被検物質非添加の場合の程度と比較する工程；メラノーマ細胞のスクラッチ部分への移動の程度が、被検物質非添加の場合の程度と比較して低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；を有する方法（Wound Healing Assay）や、メラノーマ細胞が浸潤し得る組成物の表面にメラノーマ細胞を接触させ、被検物質存在下でのメラノーマ細胞の浸潤の程度を測定する工程；メラノーマ細胞の浸潤の程度を、被検物質非存在下の場合の程度と比較する工程；メラノーマ細胞の浸潤の程度が、被検物質非存在下の場合の程度と比較して低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；を有する方法（Invasion Assay）を好適に例示することができる。上記のWound Healing Assayにおける「スクラッチ部分への移動の程度」としては、スクラッチ直後におけるスクラッチ部分の面積と比較したときの、スクラッチから一定時間経過後のスクラッチ部分の面積の低下の程度を好適に用いることができ、上記のInvasion Assayにおける「メラノーマ細胞が浸潤し得る組成物」としては、マトリジェルを好適に用いることができる。上記のWound Healing Assay及びInvasion Assayとして、より具体的には、後述の実施例２に記載の方法、及び、実施例３に記載の方法をそれぞれ好適に例示することができる。 The method for confirming the melanoma metastasis-suppressing effect of the SIRT1 inhibitory substance in the present invention is not particularly limited, but is a step of culturing melanoma cells until they become confluent to form a melanoma cell layer; A step of adding a substance; a step of scratching a melanoma cell layer after a lapse of a certain time from the addition of a test substance; a scratched portion of the melanoma cell by observing a scratched portion (scratch portion) after a lapse of a certain time from the scratch Measuring the degree of movement of the melanoma cell; comparing the degree of movement of the melanoma cell to the scratch part with the degree of no addition of the test substance; the degree of movement of the melanoma cell to the scratch part Inhibiting the melanoma metastasis of the test substance when it is low compared to the case of no substance addition A method (Wound Healing Assay) comprising: a step of contacting a melanoma cell with a surface of a composition that can infiltrate melanoma cells, and measuring a degree of infiltration of the melanoma cells in the presence of a test substance; Comparing the degree of melanoma cell invasion with that in the absence of the test substance; if the degree of melanoma cell infiltration is low compared to the degree in the absence of the test substance, A method (Invasion Assay) having a step of evaluating a test substance as a melanoma metastasis inhibitor can be preferably exemplified. As the “degree of movement to the scratch part” in the above Wound Healing Assay, the degree of decrease in the area of the scratch part after a lapse of a certain time from the scratch as compared with the area of the scratch part immediately after the scratch is preferably used. Matrigel can be suitably used as the “composition capable of infiltrating melanoma cells” in the above Invasion Assay. More specifically, as the above wound healing assay and invasion assay, the method described in Example 2 described later and the method described in Example 3 can be preferably exemplified.
本発明に用いるＳＩＲＴ１阻害作用物質における、好ましいメラノーマ転移抑制効果としては、後述の実施例２に記載のWound Healing Assayと同様の方法において、スクラッチから２４時間後のスクラッチ部分（wounded area）の面積が、コントロールの場合のその面積に対して、１．１倍以上であることが好ましく、１．２倍以上であることがより好ましい。また、後述の実施例３に記載のInvasion Assayと同様においては、４８時間インキュベートした後の浸潤細胞数が、コントロールの場合と比較して、２分の１以下であることが好ましく、３分の１以下であることがより好ましい。また、後述の実施例６に記載のin vivo移植アッセイと同様の方法においては、投与群の総マウス数に対するInvasion（＋）のマウス（転移を生じているマウス）数の割合が、コントロール群におけるその割合の２分の１以下であることが好ましく、３分の１以下であることがより好ましい。 In the SIRT1 inhibitory substance used in the present invention, as a preferable melanoma metastasis inhibitory effect, in the same method as the wound healing assay described in Example 2 described later, the area of the scratched area (wounded area) 24 hours after the scratch is The area in the case of the control is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more. In addition, in the same manner as the Invasion Assay described in Example 3 described later, the number of infiltrating cells after 48 hours of incubation is preferably less than or equal to half that of the control case. More preferably, it is 1 or less. In the same method as the in vivo transplantation assay described in Example 6 described later, the ratio of the number of Invasion (+) mice (metastasis-producing mice) to the total number of mice in the administration group was It is preferable that it is 1/2 or less of the ratio, and it is more preferable that it is 1/3 or less.
本発明のメラノーマ転移抑制剤は、所望のメラノーマ転移抑制効果が得られる限り、前述のＳＩＲＴ１阻害作用物質の他に、他のメラノーマ転移抑制剤や抗がん剤等の任意成分をふくんでいてもよい。 The melanoma metastasis inhibitor of the present invention may contain other components such as other melanoma metastasis inhibitors and anticancer agents in addition to the SIRT1 inhibitory action substance as long as the desired melanoma metastasis inhibitory effect is obtained. Good.
本発明のメラノーマ転移抑制剤に含有されるＳＩＲＴ１阻害作用物質は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、優れたメラノーマ転移抑制効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＳＩＲＴ１阻害作用物質を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。 The SIRT1 inhibitory substance contained in the melanoma metastasis inhibitor of the present invention can be made into an appropriate preparation by a conventional method. The dosage form of the preparation may be a solid preparation such as a powder or a granule, but from the viewpoint of obtaining an excellent melanoma metastasis inhibitory effect, it is preferably a liquid such as a solution, emulsion or suspension. As a method for producing the above liquid agent, for example, a method of mixing a SIRT1 inhibitory agent with a solvent and a method of further mixing a suspending agent or an emulsifier can be preferably exemplified. As described above, when the SIRT1 inhibitory agent in the present invention is used as a preparation, an appropriate pharmaceutically acceptable carrier, for example, an excipient, a binder, a solvent, a dissolution agent, is used as necessary in the preparation. Auxiliary agent, suspending agent, emulsifier, isotonic agent, buffer agent, stabilizer, soothing agent, preservative, antioxidant, coloring agent, lubricant, disintegrant, wetting agent, adsorbent, sweetener Arbitrary components such as an agent and a diluent can be blended.
本発明のメラノーマ転移抑制剤の投与方法としては、所望のメラノーマ転移抑制剤が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を例示することができる。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤の投与量や投与回数や投与濃度は、投与対象のメラノーマ状態や投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができる。なお、本発明のメラノーマ転移抑制剤を抗がん剤と併用すると、メラノーマの治療の可能性を顕著に向上させることが可能となるため好ましい。 The administration method of the melanoma metastasis inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as the desired melanoma metastasis inhibitor is obtained, and is intravenous, oral, intramuscular, subcutaneous, transdermal, transnasal, Examples include transpulmonary administration. In addition, the dose, frequency and dose of the melanoma metastasis inhibitor of the present invention can be appropriately adjusted according to the melanoma state of the administration subject, the body weight of the administration subject, and the like. In addition, it is preferable to use the melanoma metastasis inhibitor of the present invention in combination with an anticancer agent because the possibility of treating melanoma can be remarkably improved.
本発明のメラノーマ転移抑制剤の転移抑制対象となるメラノーマ（悪性黒色腫）の種類としては、特に制限されないが、悪性黒子型、末端黒子型、結節型、表在拡大型のいずれであってもよい。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤に含有されるＳＩＲＴ１阻害作用物質が阻害作用を発揮するＳＩＲＴ１の由来である哺乳動物の種類は、該メラノーマ転移抑制剤の投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、より安定して優れたメラノーマ転移抑制効果を得る観点から、好ましい。 The type of melanoma (malignant melanoma) that is subject to metastasis suppression by the melanoma metastasis inhibitor of the present invention is not particularly limited, but any of malignant melanoma type, terminal melanoma type, nodule type, superficial enlarged type Good. Further, the mammal to be administered with the melanoma metastasis inhibitor of the present invention is not particularly limited, but human, monkey, mouse, rat, hamster, guinea pig, cow, pig, horse, rabbit, sheep, goat, cat, A dog etc. can be illustrated suitably, and a human can be illustrated more suitably among them. The SIRT1 inhibitory substance contained in the melanoma metastasis inhibitor of the present invention exhibits the inhibitory action, and the kind of mammal derived from SIRT1 is the same as the kind of mammal to be administered with the melanoma metastasis inhibitor. It is preferable from the viewpoint of obtaining a more stable and excellent melanoma transition inhibitory effect.
本発明のメラノーマ転移抑制方法におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質やその投与方法については、メラノーマ転移抑制剤について前述したのと同様である。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤調製のための使用におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質やそれをメラノーマ転移抑制剤に調製する方法も、メラノーマ転移抑制剤について前述したのと同様である。 The SIRT1 inhibitory agent and its administration method in the melanoma metastasis suppression method of the present invention are the same as those described above for the melanoma metastasis inhibitor. Moreover, the SIRT1 inhibitory action substance in the use for preparation of the melanoma metastasis inhibitor of this invention and the method of preparing it into a melanoma metastasis inhibitor are the same as that mentioned above about the melanoma metastasis inhibitor.
本発明のメラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法としては、被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程；測定の結果得られたヒストンデアセチラーゼ活性の値を、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値と比較する工程；及び、被検物質の存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値が、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値より低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；を有している限り特に制限されない。このような本発明のメラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法によれば、ＳＩＲＴ１阻害作用物質を効率良くスクリーニングすることができ、すなわち、実用性の高いメラノーマ転移抑制剤を効率良くスクリーニングすることができる。 The screening method for the melanoma metastasis inhibitor of the present invention includes a step of measuring the histone deacetylase activity of SIRT1 in the presence of a test substance; the value of histone deacetylase activity obtained as a result of the measurement Comparing the value of histone deacetylase activity of SIRT1 in the absence of the substance; and the value of histone deacetylase activity of SIRT1 in the presence of the test substance If it has a step of evaluating the test substance as a melanoma metastasis inhibitor when it is lower than the value of histone deacetylase activity, it is not particularly limited. According to such a screening method for a melanoma metastasis inhibitor of the present invention, a SIRT1 inhibitory agent can be efficiently screened, that is, a highly practical melanoma metastasis inhibitor can be efficiently screened.
上記の、被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程としては、特に制限されないが、ＳＩＲＴ１の基質であるアセチル化されたｐ５３の３８２番目のリシン又は３２０番目のリシンを含む蛍光標識ペプチド（Biomol社製）等を被検物質の存在下で用いることによって、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定することを好適に例示することができる。 The step of measuring the histone deacetylase activity of SIRT1 in the presence of the test substance is not particularly limited, but the 382rd lysine or 320th lysine of acetylated p53 which is a substrate of SIRT1 The measurement of the histone deacetylase activity of SIRT1 can be suitably exemplified by using a fluorescently labeled peptide containing Biotin (manufactured by Biomol) or the like in the presence of a test substance.
この他、本発明には、メラノーマの転移抑制における、ＳＩＲＴ１阻害作用物質の使用も含まれる。この使用におけるＳＩＲＴ１阻害物質の使用方法については、メラノーマ転移抑制剤について前述したのと同様である。 In addition, the present invention includes the use of a SIRT1 inhibitory substance in suppressing metastasis of melanoma. About the usage method of the SIRT1 inhibitor in this use, it is the same as that mentioned above about the melanoma metastasis inhibitor.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
［メラノーマ細胞におけるＳＩＲＴ１の局在］
通常の培養細胞においては、ＳＩＲＴ１は核で発現していることが知られている。メラノーマ細胞におけるＳＩＲＴ１の局在を調べるために、ＭＭ４１８細胞（ヒトメラノーマ細胞株）、Ｂ１６Ｆ１細胞（マウスメラノーマ細胞株；低転移性）、Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウスメラノーマ細胞；高転移性）を用意して、以下の実験を行なった。なお、上記の３種類の細胞は、札幌医科大学皮膚科学講座から入手した。札幌医科大学皮膚科学講座は、ＭＭ４１８細胞をQueensland Institute of Medical Research, Brisbane, Australiaから譲り受け、Ｂ１６Ｆ１細胞及びＢ１６Ｆ１０細胞をAmerican Type Culture Collectionから購入した。
[Localization of SIRT1 in melanoma cells]
In normal cultured cells, SIRT1 is known to be expressed in the nucleus. In order to investigate the localization of SIRT1 in melanoma cells, MM418 cells (human melanoma cell line), B16F1 cells (mouse melanoma cell line; low metastatic), B16F10 cells (mouse melanoma cell; high metastatic) are prepared, The following experiment was conducted. The above three types of cells were obtained from the Department of Dermatology, Sapporo Medical University. The Department of Dermatology at Sapporo Medical University received MM418 cells from Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Australia, and purchased B16F1 cells and B16F10 cells from the American Type Culture Collection.
１．ＲＴ−ＰＣＲ
ＭＭ４１８細胞、Ｂ１６Ｆ１細胞及びＢ１６Ｆ１０細胞のそれぞれから、常法にしたがってトータルＲＮＡを抽出した。ＳＩＲＴ１を増幅し得るプライマーセットを用いて、常法にしたがって、前述のトータルＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行なった。その結果を、図１Ａに示す。図１Ａから分かるように、いずれのメラノーマ細胞においても、ＳＩＲＴ１に相当する位置にバンドが確認された。
1. RT-PCR
Total RNA was extracted from each of MM418 cells, B16F1 cells, and B16F10 cells according to a conventional method. RT-PCR was performed on the above total RNA according to a conventional method using a primer set capable of amplifying SIRT1. The result is shown in FIG. 1A. As can be seen from FIG. 1A, a band was confirmed at a position corresponding to SIRT1 in any melanoma cell.
２．トータルタンパク質に対するウエスタンブロット
Ｂ１６Ｆ１細胞、Ｂ１６Ｆ１０細胞及びＣＯＳ ＳＩＲＴ１細胞（ＣＯＳ細胞に、ＳＩＲＴ１を発現する発現ベクターを導入した細胞）のそれぞれから、常法にしたがってトータルタンパク質を抽出した。得られたトータルタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動して分離した後、分離したタンパク質をメンブレンにトランスファーした。このメンブレンをブロッキングバッファーにてブロッキングした後、洗浄バッファーにて洗浄を行なった。洗浄したメンブレンに、ＳＩＲＴ１特異的な１次抗体を添加してインキュベートしてから洗浄し、次いで、ＨＲＰで標識した２次抗体を添加してインキュベートを行なった後、洗浄した。洗浄したメンブレンに、ＨＲＰの発色基質を添加した。メンブレン上の発色の様子を観察した結果を図１Ｂに示す。図１Ｂに示されているように、Ｂ１６Ｆ１細胞及びＢ１６Ｆ１０細胞のいずれの場合も、ポジティブコントロールであるＣＯＳ ＳＩＲＴ１細胞の場合と同様の位置に、ＳＩＲＴ１のバンドが検出された。なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨの検出を行うことによって、各レーンのトータルタンパク質量が同等であることを確認した。以上の結果より、Ｂ１６Ｆ１細胞及びＢ１６Ｆ１０細胞において、ＳＩＲＴ１が実際に発現していることが確認できた。
2. Western Blot for Total Protein Total protein was extracted from each of B16F1 cells, B16F10 cells, and COS SIRT1 cells (cells in which an expression vector expressing SIRT1 was introduced into COS cells) according to a conventional method. The obtained total protein was separated by electrophoresis on SDS-PAGE, and then the separated protein was transferred to a membrane. The membrane was blocked with a blocking buffer and then washed with a washing buffer. SIRT1-specific primary antibody was added to the washed membrane for incubation and then washed, and then secondary antibody labeled with HRP was added for incubation followed by washing. An HRP chromogenic substrate was added to the washed membrane. The result of observing the state of color development on the membrane is shown in FIG. 1B. As shown in FIG. 1B, in both the B16F1 cell and the B16F10 cell, a band of SIRT1 was detected at the same position as in the case of the COS SIRT1 cell as a positive control. In addition, it confirmed that the total protein amount of each lane was equivalent by detecting GAPDH as an internal standard. From the above results, it was confirmed that SIRT1 was actually expressed in B16F1 cells and B16F10 cells.
３．蛍光免疫染色
メラノーマ細胞におけるＳＩＲＴ１の局在を調べるために、以下の方法で免疫蛍光染色を行なった。
3. Fluorescent immunostaining In order to examine the localization of SIRT1 in melanoma cells, immunofluorescent staining was performed by the following method.
Ｂ１６Ｆ１細胞及びＭＭ４１８細胞を用意した。また、メラニン細胞の前駆細胞であるメラノブラストも用意した。メラノブラストは、生後１日のマウスの皮膚から単離培養して得た。得られた細胞がメラノブラストであることの確認は、そのマーカーであるＴＲＰ１の発現を確認することによって行なった。前述のＢ１６Ｆ１細胞、ＭＭ４１８細胞、メラノブラストの３種類の細胞のそれぞれについて、ＳＡＲＴ１特異的抗体及び赤色蛍光標識したその２次抗体；チロジナーゼ（tyrosinase）特異的抗体及び緑色蛍光標識したその２次抗体；又は、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ；を用いて染色を行なった。その結果を図１Ｃに示す。なお、「Ｍｅｒｇｅ」とは、「ＳＩＲＴ１」、「チロジナーゼ」、「Ｈｏｅｃｈｉｓｔ」にて染色した結果を重ね合わせたものを示す。図１Ｃの結果から分かるように、Ｈｏｅｃｈｉｓｔにて染色された核の周囲の細胞質において、ＳＩＲＴ１やチロジナーゼが発現していることが示された。また、メラノーマ細胞と同様に、メラノブラストにおいても、ＳＩＲＴ１は細胞質で優位に発現していることが示された。 B16F1 cells and MM418 cells were prepared. In addition, melanoblasts, which are progenitor cells of melanocytes, were also prepared. Melanoblast was obtained by culturing isolated from the skin of a mouse a day after birth. Confirmation that the obtained cell was melanoblast was performed by confirming the expression of its marker TRP1. For each of the aforementioned three types of cells, B16F1 cells, MM418 cells, and melanoblasts, a SART1-specific antibody and a red fluorescent-labeled secondary antibody; a tyrosinase-specific antibody and a green fluorescent-labeled secondary antibody; Alternatively, staining was performed using Hoechist ;. The result is shown in FIG. 1C. “Merge” refers to a superposition of the results of staining with “SIRT1”, “tyrosinase”, and “Hoechist”. As can be seen from the results in FIG. 1C, it was shown that SIRT1 and tyrosinase are expressed in the cytoplasm around the nucleus stained with Hoechist. Moreover, it was shown that SIRT1 is predominantly expressed in the cytoplasm in melanoblasts as well as in melanoma cells.
４．核画分、細胞質画分及びミトコンドリア画分に対するウエスタンブロット
メラノーマ細胞におけるＳＩＲＴ１の局在を調べるために、Ｂ１６Ｆ１細胞の核画分、細胞質画分及びミトコンドリア画分のそれぞれに対して、ウエスタンブロットを試みた。具体的には以下のような方法で行なった。
4). Western blotting for nuclear, cytoplasmic and mitochondrial fractions To investigate the localization of SIRT1 in melanoma cells, we attempted western blotting for the nuclear, cytoplasmic and mitochondrial fractions of B16F1 cells. It was. Specifically, the following method was used.
Ｂ１６Ｆ１細胞を破砕した後、遠心分離法によって、核画分、細胞質画分、及び、ミトコンドリア画分を得た。それぞれの画分について、実施例１の２．と同様の方法でウエスタンブロットを行なった。その結果を図１Ｄに示す。図１Ｄから分かるように、ＳＩＲＴ１は、細胞質画分において特に検出された。なお、各画分が、核画分、細胞質画分、ミトコンドリア画分であることを確認するために、核マーカータンパク質であるＬａｍｉｎ Ａ／Ｃ、細胞質マーカータンパク質であるｃ−ＡＳＴ、ミトコンドリアマーカータンパク質であるｍ−ＡＳＴの発現の検出も行った。以上の結果より、Ｂ１６Ｆ１細胞において、ＳＩＲＴ１は細胞質にて発現していることが示された。 After disrupting B16F1 cells, a nuclear fraction, a cytoplasmic fraction, and a mitochondrial fraction were obtained by centrifugation. For each fraction, see 2. in Example 1. Western blotting was performed in the same manner as above. The result is shown in FIG. 1D. As can be seen from FIG. 1D, SIRT1 was specifically detected in the cytoplasmic fraction. In order to confirm that each fraction is a nuclear fraction, a cytoplasmic fraction, and a mitochondrial fraction, Lamin A / C that is a nuclear marker protein, c-AST that is a cytoplasmic marker protein, and a mitochondrial marker protein We also detected the expression of certain m-AST. From the above results, it was shown that SIRT1 is expressed in the cytoplasm in B16F1 cells.
［Wound Healing Assay］
ＳＩＲＴ１が、メラノーマ細胞の細胞移動に関与しているかどうかを調べるために、以下のような方法でWound Healing Assayを行なった。
[Wound Healing Assay]
In order to examine whether SIRT1 is involved in cell migration of melanoma cells, Wound Healing Assay was performed by the following method.
サンプル薬剤として、ＳＩＲＴ１等のＳＩＲＴファミリーの阻害物質であるニコチンアミド（ＮＡ）を５ｍＭ含む溶液；ＳＩＲＴ１の活性化物質であるニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）を１ｍＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；の３種類を用意した。２４ウェルプレートの各ウェルに、Ｂ１６Ｆ１細胞を同量ずつ播種した。５％ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ）を各ウェルに添加して、コンフルエントになるまで約一晩培養し、その後、前述と同様の培地を用いて各ウェルの培地を交換した。次いで、サンプル薬剤をウェルに投与して、Ｂ１６Ｆ１細胞をサンプル薬剤に暴露し、２４時間後にイエローチップで細胞の層をスクラッチした。スクラッチした部分（wounded area）を、スクラッチしてから０ｈ、４ｈ、６ｈ、１０ｈ、１２ｈ及び２４ｈ後に顕微鏡で観察し、０ｈ時点でのwounded areaの面積を１００％としたときの、各時点でのwounded areaの面積の割合（％）を測定した。スクラッチした部分についてのこの測定は、各サンプルの１本のwoundについて、それぞれ３〜５個所ずつ行なった。スクラッチ直後（０ｈ）及び２４時間後（２４ｈ）のwounded areaの観察結果を図２左に示す。また、０ｈ時点のwounded areaの面積を１００％としたときの、２４ｈ時点でのwounded areaの面積の割合（％）の平均値を図２右に示す。図２左及び右の結果から分かるように、ＳＩＲＴ１阻害物質であるＮＡを添加した場合は、２４ｈ時点でもwounded areaの面積は０ｈ時点とほとんど変わらなかったが、コントロールの場合は、２４ｈ時点でのwounded areaの面積が０ｈ時点のそれと比較して有意に（約３０％弱）低下し、ＳＩＲＴ１活性化物質であるＮＡＤを添加した場合は、２４ｈ時点のwounded areaの面積が０ｈ時点のそれと比較して顕著に（約５０％）低下した。すなわち、ＳＩＲＴ１活性を活性化すると、スクラッチ後のwounded areaの面積の低下が促進され、ＳＩＲＴ１活性を阻害すると、スクラッチ後のwounded areaの面積の低下が抑制されることが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。 Solution containing 5 mM nicotinamide (NA), an inhibitor of SIRT such as SIRT1, as a sample drug; Solution containing 1 mM nicotinamide dinucleotide (NAD), an activator of SIRT1, distilled water (control) Three types were prepared. Each well of a 24-well plate was seeded with the same amount of B16F1 cells. Dulbecco's modified Eagle's medium (DME) supplemented with 5% FBS was added to each well and cultured for approximately overnight until confluent, and then the medium in each well was replaced using the same medium as described above. Sample drug was then administered to the wells to expose B16F1 cells to the sample drug, and the cell layer was scratched with a yellow chip 24 hours later. The scratched area (wounded area) is observed with a microscope at 0h, 4h, 6h, 10h, 12h and 24h after scratching, and the area of the wounded area at 0h is 100%. The area ratio (%) of the wounded area was measured. This measurement of the scratched part was performed at 3 to 5 locations for each wound of each sample. The observation result of the wounded area immediately after scratching (0h) and 24 hours later (24h) is shown on the left side of FIG. Also, the average value of the percentage (%) of the area of the wounded area at 24h when the area of the wounded area at 0h is 100% is shown on the right of FIG. As can be seen from the results in the left and right of FIG. 2, when NA which is a SIRT1 inhibitor was added, the area of the wounded area was almost the same as that at the time of 0h even at the time of 24h. The area of the wounded area is significantly (less than about 30%) lower than that at 0h. When NAD, which is a SIRT1 activator, is added, the wounded area at 24h is compared with that at 0h. Markedly (about 50%). That is, it was shown that activation of SIRT1 activity promotes a decrease in the area of wounded area after scratching, and inhibition of SIRT1 activity suppresses a decrease in the area of wounded area after scratching. In addition, when the same experiment was repeated 3 times in total, the same result was obtained.
Ｂ１６Ｆ１細胞に代えて、Ｂ１６Ｆ１０細胞を用いたこと、サンプル薬剤として、前述の５ｍＭのＮＡ溶液及びコントロール液を用いたこと、及び、wounded areaを比較する時点を０ｈと１０ｈとしたこと以外は、上記の方法と同じ方法でWound Healing Assayを行なった。スクラッチ直後（０ｈ）及び１０時間後（１０ｈ）のwounded areaの観察結果を図３左に示す。また、０ｈ時点のwounded areaの面積を１００％としたときの、１０ｈ時点でのwounded areaの面積の割合（％）の平均値を図３右に示す。図３左及び右の結果から分かるように、ＳＩＲＴ１阻害物質であるＮＡを添加した場合は、１０ｈ時点のwounded areaの面積が０ｈ時点のそれと比較してわずかに（約１０％）低下しただけであったが、コントロールの場合は、１０ｈ時点でのwounded areaの面積が、０ｈ時点のそれと比較して顕著に（約５５％）低下した。すなわち、Ｂ１６Ｆ１０細胞を用いた場合も、Ｂ１６Ｆ１細胞を用いた場合と同様に、ＳＩＲＴ１活性を阻害すると、スクラッチ後のwounded areaの面積の低下が抑制されることが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。 Other than using B16F10 cells instead of B16F1 cells, using the 5 mM NA solution and the control solution described above as sample drugs, and setting the time points for comparing wounded areas to 0h and 10h. The Wound Healing Assay was performed in the same manner as above. The observation results of the wounded area immediately after scratching (0 h) and after 10 hours (10 h) are shown on the left of FIG. Also, the average value of the percentage (%) of the area of the wounded area at the time of 10h when the area of the wounded area at the time of 0h is 100% is shown on the right side of FIG. As can be seen from the results on the left and right of FIG. 3, when NA which is a SIRT1 inhibitor was added, the area of the wounded area at 10h was slightly decreased (about 10%) compared with that at 0h. However, in the case of the control, the area of the wounded area at 10 h was significantly (about 55%) lower than that at 0 h. That is, in the case of using B16F10 cells, it was shown that, as in the case of using B16F1 cells, inhibition of SIRT1 activity suppresses the reduction of the wounded area after scratching. In addition, when the same experiment was repeated 3 times in total, the same result was obtained.
以上のWound Healing Assayの結果は、ＳＩＲＴ１活性の程度が低くなるにつれて、メラノーマ細胞株の細胞移動（cell migration）が阻害されること、及び、ＳＩＲＴ１の活性の程度が高くなるにつれて、メラノーマ細胞株の細胞移動が促進されることを表すものであり、ＳＩＲＴ１がメラノーマ細胞株の細胞移動に関与していることが明らかとなった。 The results of the above Wound Healing Assay show that cell migration of the melanoma cell line is inhibited as the SIRT1 activity decreases, and that the melanoma cell line increases as the SIRT1 activity increases. This indicates that cell migration is promoted, and it was revealed that SIRT1 is involved in cell migration of melanoma cell lines.
［Invasion Assay（Matrigel Assay）］
メラノーマ細胞の細胞移動を、浸潤性の観点から評価するために、以下のような方法でInvasion Assayを行なった。
[Invasion Assay (Matrigel Assay)]
In order to evaluate the cell migration of melanoma cells from the viewpoint of invasiveness, Invasion Assay was performed by the following method.
まず、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＮＡＤを１ｍＭ含む溶液；ＳＩＲＴ１等のＳＩＲＴファミリーの阻害物質であるスプリトマイシン（ＳＰ）を１００μＭ含む溶液；ＳＩＲＴ１の活性化物質であるレスベラトロール（ＲＥＳ）を１０ｎＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；の５種類を用意した。次に、１２ウェルプレートのウェル内にセルカルチャーインサート（cell culture insert）を置いた。市販のものを５０倍希釈したマトリジェルを、１ウェルあたり５０μｌずつ添加して、セルカルチャーインサートをコーティングした。次いで、その１２ウェルプレートをクリーンベンチ内で２時間乾燥し、ウェル内に残った液体は吸引して除去した。セルカルチャーインサートを、いずれかのサンプル薬剤を添加した浸潤アッセイ用培地（ＦＢＳ（−）ＤＥＭ）に３７℃で２時間浸してインキュベートして、マトリジェルを再膨化させた。そのセルカルチャーインサート上に、１ウェルあたり５００００個のメラノーマ細胞を播種した後、セルカルチャーインサートの下層の培地をＦＢＳ（＋）ＤＥＭに変換して、３７℃で４８時間インキュベートした。セルカルチャーインサートに付着した細胞をメタノールで固定してギムザ染色を行い、セルカルチャーインサートの下面（細胞を播種した面の逆側の面）に浸潤した細胞（以下、「浸潤細胞」ともいう。）を顕微鏡にて顕微鏡撮影し、その顕微鏡写真の浸潤細胞数を目視により計測した。この計測は、各サンプルにつき、顕微鏡写真５〜６枚ずつを用いて行なった。 First, as a sample drug, a solution containing 5 mM NA; a solution containing 1 mM NAD; a solution containing 100 μM of splitomycin (SP), an inhibitor of SIRT family such as SIRT1, and the like; resveratrol (RES, an activator of SIRT1) ), 10 nM solution; distilled water (control); Next, a cell culture insert was placed in the well of a 12-well plate. Matrigel diluted 50-fold with a commercially available product was added at 50 μl per well to coat the cell culture insert. Next, the 12-well plate was dried in a clean bench for 2 hours, and the liquid remaining in the well was removed by suction. The cell culture insert was incubated for 2 hours at 37 ° C. in an invasion assay medium (FBS (−) DEM) supplemented with any sample drug to re-expand the matrigel. After seeding 50000 melanoma cells per well on the cell culture insert, the medium below the cell culture insert was converted to FBS (+) DEM and incubated at 37 ° C. for 48 hours. Cells attached to the cell culture insert are fixed with methanol, stained with Giemsa, and infiltrated into the lower surface of the cell culture insert (the surface opposite to the cell-seeded surface) (hereinafter also referred to as “infiltrating cells”). Was microscopically photographed with a microscope, and the number of infiltrating cells in the micrograph was measured visually. This measurement was performed using 5 to 6 photomicrographs for each sample.
細胞として、Ｂ１６Ｆ１細胞を用い、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＳＰを１００μＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；を用いたInvasion Assayの結果を図４に示す。図４左の３つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図４右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を表す。図４から分かるように、ＳＩＲＴ１の阻害物質であるＮＡやＳＰを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に低下することが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。 FIG. 4 shows the results of Invasion Assay using B16F1 cells as cells and a solution containing 5 mM NA as a sample drug; a solution containing 100 μM SP; distilled water (control). The three panels on the left of FIG. 4 show the results of observation of the Matrigel on the lower surface of the Giemsa-stained cell culture insert with an electron microscope, and the right side of FIG. 4 shows the number of infiltrated cells (average) measured visually with an electron microscope. Represents a graph of each sample drug. As can be seen from FIG. 4, it was shown that the number of infiltrating cells was significantly reduced when NA or SP, which is an inhibitor of SIRT1, was added as compared to the control. In addition, when the same experiment was repeated 3 times in total, the same result was obtained.
また、細胞として、Ｂ１６Ｆ１細胞を用い、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＮＡＤを１ｍＭ含む溶液；ＲＥＳを１０ｎＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；を用いたInvasion Assayの結果を図５に示す。図５左の４つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図５右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を表す。図５から分かるように、ＳＩＲＴ１の阻害物質であるＮＡを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に低下し、ＳＩＲＴ１の活性化物質であるＮＡＤやＲＥＳを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に増加することが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。 Further, FIG. 5 shows the results of Invasion Assay using B16F1 cells as cells and using 5 mM NA as a sample drug; 1 mM NAD solution; 10 nM RES solution; distilled water (control). Shown in The four panels on the left of FIG. 5 show the results of observation of the Matrigel on the lower surface of the Giemsa-stained cell culture insert with an electron microscope, and the right side of FIG. 5 shows the number of infiltrated cells (average) measured visually with an electron microscope. Represents a graph of each sample drug. As can be seen from FIG. 5, when NA which is an inhibitor of SIRT1 was added, the number of infiltrating cells was significantly reduced as compared with the case of control, and NAD and RES which were activators of SIRT1 were added. The case showed a significant increase in the number of infiltrating cells compared to the control case. In addition, when the same experiment was repeated 3 times in total, the same result was obtained.
さらに、細胞として、Ｂ１６Ｆ１０細胞を用い、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＳＰを１μＭ含む溶液；ＮＡＤを１ｍＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；を用いたInvasion Assayの結果を図６に示す。図６左の４つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図６右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を表す。図６から分かるように、ＳＩＲＴ１の阻害物質であるＮＡやＳＰを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に低下し、ＳＩＲＴ１の活性化物質であるＮＡＤを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に増加することが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。 Furthermore, FIG. 6 shows the results of Invasion Assay using B16F10 cells as cells, a solution containing 5 mM NA as a sample drug, a solution containing 1 μM SP, a solution containing 1 mM NAD, and distilled water (control). Shown in The four panels on the left of FIG. 6 show the results of observation of the Matrigel on the lower surface of the Giemsa-stained cell culture insert with an electron microscope, and the right side of FIG. 6 shows the number of infiltrated cells (average) measured visually with an electron microscope. Represents a graph of each sample drug. As can be seen from FIG. 6, when NA or SP, which is an inhibitor of SIRT1, was added, the number of infiltrating cells was significantly reduced compared to the case of control, and NAD, an activator of SIRT1, was added. The case showed a significant increase in the number of infiltrating cells compared to the control case. In addition, when the same experiment was repeated 3 times in total, the same result was obtained.
また、細胞として、ＭＭ４１８細胞を用い、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＳＰを１μＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；を用いたInvasion Assayの結果を図７に示す。図７左の３つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図７右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を表す。図７から分かるように、ＳＩＲＴ１の阻害物質であるＮＡやＳＰを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に低下することが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。 FIG. 7 shows the results of Invasion Assay using MM418 cells as cells and a solution containing 5 mM NA as a sample drug; a solution containing 1 μM SP; distilled water (control). The three panels on the left of FIG. 7 show the results of observation of the Matrigel on the lower surface of the Giemsa-stained cell culture insert with an electron microscope, and the right side of FIG. 7 shows the number of infiltrated cells visually measured with an electron microscope (average). Represents a graph of each sample drug. As can be seen from FIG. 7, it was shown that the number of infiltrating cells was significantly reduced when NA or SP, which is an inhibitor of SIRT1, was added, as compared with the case of control. In addition, when the same experiment was repeated 3 times in total, the same result was obtained.
以上のInvasion Assayの結果は、ＳＩＲＴ１活性の程度が低くなるにつれて、メラノーマ細胞株の浸潤が阻害されること、及び、ＳＩＲＴ１の活性の程度が高くなるにつれて、メラノーマ細胞株の浸潤が促進されることを表している。これにより、ＳＩＲＴ１がメラノーマ細胞株の細胞移動に関与していることが、浸潤の面からも確認された。 As a result of the above Invasion Assay, infiltration of the melanoma cell line is inhibited as the degree of SIRT1 activity decreases, and infiltration of the melanoma cell line is promoted as the degree of SIRT1 activity increases. Represents. Thereby, it was confirmed also from the surface of infiltration that SIRT1 is concerned in the cell migration of a melanoma cell line.
［MTT Assay（Cell Proliferation Assay）］
上記実施例２のWound Healing Assayや上記実施例３のInvasion Assayの結果が、コントロール以外のサンプル薬剤の細胞毒性によるものでないことを確認するために、以下のような方法でMTT Assayを行なった。
[MTT Assay (Cell Proliferation Assay)]
In order to confirm that the results of the wound healing assay of Example 2 and the Invasion Assay of Example 3 were not due to the cytotoxicity of the sample drug other than the control, MTT Assay was performed by the following method.
まず、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＳＰを１００μＭ含む溶液；ＮＡＤを１ｍＭ含む溶液；ＲＥＳを１０ｎＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；の５種類を用意した。次に、９６ウェルプレートの各ウェルに、Ｂ１６Ｆ１細胞を１×１０３ｃｅｌｌずつ播種し、さらに、各ウェルにいずれか１種類のサンプル薬剤を添加して２４時間インキュベートした。それから、各ウェルの培養液を、サンプル薬剤を含まない通常の培養液に交換した後、ＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中にＭＴＴを５ｍｇ／ｍｌで含む溶液）を各ウェルに２０μｌずつ添加して、３時間インキュベートした。各ウェルから培養液を除去してから、各ウェルにＤＭＳを１００μｌずつ添加して、ウェルプレートを１０分間程度振とうした。次いで、５７０ｎｍの波長にて各ウェルの溶液の吸光度を測定した。吸光度の測定は、各サンプルについて３〜６ウェルずつに対して行なった。 First, five kinds of sample drugs were prepared: a solution containing 5 mM NA; a solution containing 100 μM SP; a solution containing 1 mM NAD; a solution containing 10 nM RES; and distilled water (control). Next, 1 × 10 3 cells of B16F1 cells were seeded in each well of a 96-well plate, and any one kind of sample drug was added to each well and incubated for 24 hours. Then, after the culture medium in each well was replaced with a normal culture medium not containing the sample drug, 20 μl of MTT solution (a solution containing MTT at 5 mg / ml in PBS) was added to each well for 3 hours. Incubated. After removing the culture medium from each well, 100 μl of DMS was added to each well, and the well plate was shaken for about 10 minutes. The absorbance of the solution in each well was then measured at a wavelength of 570 nm. Absorbance was measured for 3 to 6 wells for each sample.
コントロールにおける吸光度を１００％としたときの、各サンプル薬剤における吸光度の値（平均）を、図８に示す。図８から分かるように、いずれのサンプル薬剤の場合も、コントロールの場合と有意差は見られなかった。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。これにより、上記実施例２のWound Healing Assayや上記実施例３のInvasion Assayの結果が、コントロール以外のサンプル薬剤の細胞毒性によるものでないことが示された。 FIG. 8 shows the absorbance value (average) of each sample drug when the absorbance in the control is 100%. As can be seen from FIG. 8, no significant difference was observed with any of the sample drugs from the control. In addition, when the same experiment was repeated 3 times in total, the same result was obtained. Thus, it was shown that the results of the wound healing assay of Example 2 and the Invasion Assay of Example 3 were not due to the cytotoxicity of sample drugs other than the control.
［Sirt1-siRNA Assay］
ＳＩＲＴ１が実際に細胞移動に関与しているかどうかを調べるために、ＳＩＲＴ１のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ」ともいう）を用いて、Sirt1-siRNA Assayを試みることとした。そこで、Sirt1-siRNA Assayに先立って、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡを細胞内で発現する細胞株を作製した。
[Sirt1-siRNA Assay]
In order to examine whether SIRT1 is actually involved in cell migration, it was decided to try the Sirt1-siRNA Assay using SIRT1 siRNA (hereinafter also referred to as “SIRT1-siRNA”). Therefore, prior to the Sirt1-siRNA Assay, a cell line that expresses SIRT1-siRNA in cells was prepared.
１．ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞の作製
マウスＳＩＲＴ１のヌクレオチド配列情報（Genbankアクセッションナンバー；NM_019812）に基づいて、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡを設計した。その配列を配列番号１に示す。このＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡは、ショートヘアピン型のｓｉＲＮＡであり、マウスＳＩＲＴ１ ｃＤＮＡ（Genbankアクセッションナンバー；AY377984）のコード領域の１６４５〜１６６４番目のヌクレオチド配列を標的配列としている。このＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡをレンチウイルスベクターにインテグレイトして、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ／レンチウイルスベクターを作製した。このＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ／レンチウイルスベクターを、Ｂ１６Ｆ１細胞に感染させることにより、細胞内でＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」という）を得た。また、コントロールとして、レンチウイルスベクターをＢ１６Ｆ１細胞に感染させることにより、Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）を得た。なお、前述のレンチウイルスベクターは、国立神経センターより譲り受けたものであり、Araki T, Sasaki Y, Milbrandt J. Increased nuclear NAD biosynthesis and SIRT1 activation prevent axonal degeneration. Science. 2004 Aug 13;305(5686):1010-3.に記載されているレンチウイルスベクターと同じものである。
1. Preparation of SIRT1-siRNA-expressing B16F1 cells SIRT1-siRNA was designed based on the nucleotide sequence information of mouse SIRT1 (Genbank accession number; NM — 019812). The sequence is shown in SEQ ID NO: 1. This SIRT1-siRNA is a short hairpin siRNA, and has a nucleotide sequence from 1645 to 1664 in the coding region of mouse SIRT1 cDNA (Genbank accession number; AY377984) as a target sequence. This SIRT1-siRNA was integrated into a lentiviral vector to produce a SIRT1-siRNA / lentiviral vector. By infecting B16F1 cells with this SIRT1-siRNA / lentiviral vector, cells expressing SIRT1-siRNA in the cells (hereinafter referred to as “SIRT1-siRNA-expressing B16F1 cells”) were obtained. As a control, B16F1 cells (C4) were obtained by infecting B16F1 cells with a lentiviral vector. In addition, the above-mentioned lentiviral vector was inherited from the National Neurological Center, Araki T, Sasaki Y, Milbrandt J. Increased nuclear NAD biosynthesis and SIRT1 activation prevent axonal degeneration. Science. 2004 Aug 13; 305 (5686): This is the same as the lentiviral vector described in 1010-3.
２．ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞におけるＲＴ−ＰＣＲ
次に、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞において、ＳＩＲＴ１の発現が低下していることを確認するために、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）、レンチウイルスベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）（コントロール）、及び、Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ）（コントロール）のそれぞれについて、上記実施例１の１．記載の方法と同様の方法でＳＩＲＴ１に関するＲＴ−ＰＣＲを行なった。その結果を図９の左上に示す。図９の左上から分かるように、レンチウイルスベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）（コントロール）やＢ１６Ｆ１細胞（Ｃ）（コントロール）の場合と比較して、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）では、ＳＩＲＴ１の発現が低下していることが示された。これにより、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）内では、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡが発現しており、ＳＩＲＴ１の発現が低下していることが分かった。
2. RT-PCR in SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells
Next, in order to confirm that the expression of SIRT1 is decreased in SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells, SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells (si-1), lentiviral vector-introduced B16F1 cells (C4) (control) For each of B16F1 cells (C) (control), 1. of the above Example 1. RT-PCR for SIRT1 was performed in the same manner as described. The result is shown in the upper left of FIG. As can be seen from the upper left of FIG. 9, compared to the case of lentiviral vector-introduced B16F1 cells (C4) (control) and B16F1 cells (C) (control), SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells (si-1) It was shown that the expression of SIRT1 is reduced. Thereby, it was found that SIRT1-siRNA was expressed in SIRT1-siRNA-expressing B16F1 cells (si-1), and SIRT1 expression was decreased.
３．ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞におけるWound Healing Assay
次に、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞の細胞移動が低下しているかどうかを調べるために、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）、及び、レンチウイルスベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）（コントロール）について、上記実施例２記載の方法と同様の方法でWound Healing Assayを行なった。スクラッチした部分（wounded area）を、スクラッチしてから０ｈ及び２４ｈ後に顕微鏡で観察し、０ｈ時点でのwounded areaの面積を１００％としたときの、各時点でのwounded areaの面積の割合（％）を測定した。スクラッチした部分についてのこの測定は、各サンプルの１本のwoundについて、それぞれ３〜５個所ずつ行なった。スクラッチ直後（０ｈ）及び２４時間後（２４ｈ）のwounded areaの観察結果を図９左下に示す。また、０ｈ時点のwounded areaの面積を１００％としたときの、２４ｈ時点でのwounded areaの面積の割合（％）の平均値を図９右に示す。図９の左下及び右から分かるように、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞では、細胞移動が有意に低下していることが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。
3. Wound healing assay in SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells
Next, in order to examine whether the cell migration of SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells is reduced, SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells (si-1) and lentiviral vector-introduced B16F1 cells (C4) (control) Wound healing assay was performed by the same method as described in Example 2 above. The scratched portion (wounded area) is observed with a microscope at 0h and 24h after scratching, and the percentage of the area of the wounded area at each time point when the area of the wounded area at 0h time point is 100% (% ) Was measured. This measurement of the scratched part was performed at 3 to 5 locations for each wound of each sample. The observation result of the wounded area immediately after scratching (0h) and 24 hours later (24h) is shown in the lower left of FIG. Further, the average value of the percentage (%) of the area of the wounded area at the time of 24h when the area of the wounded area at the time of 0h is 100% is shown on the right side of FIG. As can be seen from the lower left and right of FIG. 9, it was shown that cell migration was significantly reduced in SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells. In addition, when the same experiment was repeated 3 times in total, the same result was obtained.
４．ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞におけるInvasion Assay
ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞の細胞移動を、浸潤性の観点から評価するために、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）及びレンチウイルスベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）（コントロール）について、上記実施例３記載の方法と同様の方法でInvasion Assayを行なった。その結果を図１０に示す。図１０左の２つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図１０右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を細胞の種類ごとにグラフ化した結果を表す。図１０から分かるように、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞においては、コントロールの細胞と比較して、浸潤細胞の数が有意に低下することが示された。
4). Invasion Assay in SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells
In order to evaluate the cell migration of SIRT1-siRNA-expressing B16F1 cells from the viewpoint of invasion, SIRT1-siRNA-expressing B16F1 cells (si-1) and lentiviral vector-introduced B16F1 cells (C4) (control) are described in the above examples. Invasion Assay was performed by the same method as described in 3. The result is shown in FIG. The two panels on the left of FIG. 10 show the results of observation of the Matrigel on the lower surface of the Giemsa-stained cell culture insert with an electron microscope, and the right side of FIG. 10 shows the number (average) of infiltrated cells visually measured with an electron microscope. Represents the result of graphing for each cell type. As can be seen from FIG. 10, in SIRT1-siRNA expressing B16F1 cells, it was shown that the number of infiltrating cells was significantly reduced as compared to control cells.
５．ＳＩＲＴ２〜７のｓｉＲＮＡを発現するＢ１６Ｆ１細胞におけるInvasion Assay
Ｂ１６Ｆ１細胞において、ＳＩＲＴ１以外のＳＩＲＴファミリーであるＳＩＲＴ２〜ＳＩＲＴ７の発現を低下させた場合に、浸潤性がどのように変化するかを調べるために、ＳＩＲＴ２〜ＳＩＲＴ７のいずれかのｓｉＲＮＡを細胞内で発現する細胞についてInvasion Assayを試みることとした。そこで、そのInvasion Assayに先立って、ＳＩＲＴ２〜ＳＩＲＴ７のいずれかのｓｉＲＮＡを細胞内で発現する細胞を作製した。
5. Invasion Assay in B16F1 cells expressing siRNA of SIRT2-7
In B16F1 cells, in order to examine how invasiveness changes when the expression of SIRT2 to SIRT7, which is a SIRT family other than SIRT1, is reduced, any siRNA of SIRT2 to SIRT7 is expressed in the cell. We decided to try Invasion Assay for the cells that do. Therefore, prior to the Invasion Assay, cells expressing any one of the siRNAs SIRT2 to SIRT7 were produced.
マウスＳＩＲＴ２〜７のそれぞれのヌクレオチド配列情報に基づいて、ＳＩＲＴ２のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡ」ともいう）、ＳＩＲＴ３のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡ」ともいう）、ＳＩＲＴ４のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡ」ともいう）、ＳＩＲＴ５のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡ」ともいう）、ＳＩＲＴ６のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡ」ともいう）及びＳＩＲＴ７のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡ」ともいう）を設計した。これらのＳＩＲＴ２〜７のｓｉＲＮＡを、それぞれ市販のＦＳＰ−ｓｉベクターにインテグレイトして、ＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクターを作製した。作製したこれらのベクターを、Ｂ１６Ｆ１細胞にトランスフェクションすることにより、細胞内でＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、細胞内でＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、細胞内でＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、細胞内でＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、細胞内でＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、及び、細胞内でＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）を得た。これらのＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、及び、ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡを発現する細胞を併せて、「ＳＩＲＴ２〜７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう。また、コントロールとして、ＦＳＰ−ｓｉベクターをＢ１６Ｆ１細胞にトランスフェクションすることにより、ＦＳＰ−ｓｉベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞を得た。 Based on each nucleotide sequence information of mouse SIRT2-7, SIRT2 siRNA (hereinafter also referred to as “SIRT2-siRNA”), SIRT3 siRNA (hereinafter also referred to as “SIRT3-siRNA”), SIRT4 siRNA (hereinafter referred to as “SIRT2-siRNA”). "SIRT4-siRNA"), SIRT5 siRNA (hereinafter also referred to as "SIRT5-siRNA"), SIRT6 siRNA (hereinafter also referred to as "SIRT6-siRNA") and SIRT7 siRNA (hereinafter "SIRT7-siRNA") (Also called). These siRT2-7 siRNAs were each integrated into a commercially available FSP-si vector, and SIRT2-siRNA / FSP-si vector, SIRT3-siRNA / FSP-si vector, SIRT4-siRNA / FSP-si vector, SIRT5 -SiRNA / FSP-si vector, SIRT6-siRNA / FSP-si vector, SIRT7-siRNA / FSP-si vector were prepared. By transfecting these prepared vectors into B16F1 cells, cells that express SIRT2-siRNA in the cells (hereinafter also referred to as “SIRT2-siRNA-expressing B16F1 cells”), and SIRT3-siRNA are expressed in the cells. Cells (hereinafter also referred to as “SIRT3-siRNA expressing B16F1 cells”), cells that express SIRT4-siRNA in the cells (hereinafter also referred to as “SIRT4-siRNA expressing B16F1 cells”), and cells that express SIRT5-siRNA. Cells (hereinafter also referred to as “SIRT5-siRNA-expressing B16F1 cells”), cells expressing SIRT6-siRNA in the cells (hereinafter also referred to as “SIRT6-siRNA-expressing B16F1 cells”), and SIRT7-siRNA in the cells. Express Vesicles (hereinafter, also referred to as "SIRT7-siRNA expressing B16F1 cells") was obtained. Cells expressing these SIRT2-siRNA, cells expressing SIRT3-siRNA, cells expressing SIRT4-siRNA, cells expressing SIRT5-siRNA, cells expressing SIRT6-siRNA, and expressing SIRT7-siRNA The cells are also referred to as “SIRT2-7-siRNA expressing B16F1 cells”. Further, as a control, an FSP-si vector-introduced B16F1 cell was obtained by transfecting an FSP-si vector into a B16F1 cell.
ＳＩＲＴ２〜７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞の細胞移動を、浸潤性の観点から評価するために、ＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ２−ｓｉ）、ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ３−ｓｉ）、ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ４−ｓｉ）、ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ５−ｓｉ）、ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ６−ｓｉ）、ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ７−ｓｉ）、及び、ＦＳＰ−ｓｉベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（ＦＳＰ−ｓｉ）（コントロール）について、上記実施例３記載の方法と同様の方法でInvasion Assayを行なった。その結果を図１１に示す。図１１左の９つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図１１右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を細胞の種類ごとにグラフ化した結果を表す。図１１から分かるように、ＳＩＲＴ２〜７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞のいずれの場合も、コントロールと比較して、有意な差は見られなかった。 In order to evaluate the cell migration of SIRT2-7-siRNA expressing B16F1 cells from the viewpoint of invasiveness, SIRT2-siRNA expressing B16F1 cells (SIRT2-si), SIRT3-siRNA expressing B16F1 cells (SIRT3-si), SIRT4-siRNA Expression B16F1 cells (SIRT4-si), SIRT5-siRNA expression B16F1 cells (SIRT5-si), SIRT6-siRNA expression B16F1 cells (SIRT6-si), SIRT7-siRNA expression B16F1 cells (SIRT7-si), and FSP-si Vector-introduced B16F1 cells (FSP-si) (control) were subjected to Invasion Assay in the same manner as described in Example 3 above. The result is shown in FIG. The nine panels on the left side of FIG. 11 show the results of observation of the Matrigel on the lower surface of the Giemsa-stained cell culture insert with an electron microscope, and the right side of FIG. 11 shows the number (average) of infiltrated cells visually measured with an electron microscope. Represents the result of graphing for each cell type. As can be seen from FIG. 11, no significant difference was observed in any of the SIRT2-7-siRNA expressing B16F1 cells as compared to the control.
［in vivoにおける、Ｂ１６Ｆ１細胞の移植アッセイ］
ＳＩＲＴ１阻害作用物質を投与することによって、in vivoにおけるメラノーマ転移が実際に抑制されるかどうかを確認するために、図１２に概略した方法で、Ｂ１６Ｆ１細胞の移植アッセイを行なった。具体的には、以下のような方法で移植アッセイを行なった。
[In vivo B16F1 cell transplantation assay]
In order to confirm whether or not melanoma metastasis in vivo is actually suppressed by administering a SIRT1 inhibitory agent, a transplantation assay of B16F1 cells was performed by the method outlined in FIG. Specifically, the transplantation assay was performed by the following method.
４週齢の雌のＣ５７ＢＬ６マウスを２０〜２４匹用意し、それぞれのＣ５７ＢＬ６マウスの右側腹部を剃毛した。コントロール群として、１０〜１３匹のＣ５７ＢＬ６マウスの腹腔に０．１ｃｃの生理食塩水を投与し、治療群（ＮＡ投与群）として１０〜１２匹のＣ５７ＢＬ６マウスの腹腔に０．１ｃｃのＮＡ（in PBS）を０．５ｍｇ／ｇで投与した。生理食塩水又はＮＡを投与するのと同時に、各マウスの右側腹部に、Ｂ１６Ｆ１細胞（in DME）を０．１ｃｃ／匹（１×１０６個／匹）ずつ皮下注射した。翌日以降は、コントロール群のマウスには、前述したのと同様に０．１ｃｃの生理食塩水を各マウスに腹腔内投与し、治療群のマウスには、前述したのと同様に０．１ｃｃのＮＡ（in PBS）を０．５ｍｇ／ｇで各マウスに腹腔内投与した。Ｂ１６Ｆ１細胞の皮下注射以降、マウスが死亡するまで、各マウスの腫瘍径（tumor size）（ｍｍ３）の計測と、両群中の生存マウス数（The number of survival mouse）の確認とを、毎日行なった。死亡したマウスは、解剖して、メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１細胞）の腹腔内浸潤又はリンパ節転移の有無を目視で確認した。以上の移植アッセイを、３回繰り返した。両群のマウスにおける腫瘍径の推移及び生存マウス数の推移の結果を図１３に示す。図１３の上段の３つのパネルは、ＮＡ投与群のマウスにおける腫瘍径の平均の推移と、コントロール群のマウスにおける腫瘍径の平均の推移を示す。図１３の上段の結果から分かるように、１回目と３回目の移植アッセイでは、コントロール群のマウスにおける腫瘍径の方がＮＡ投与群のそれよりも若干上回る傾向を示したが、２回目の移植アッセイでは、ＮＡ投与群のマウスにおける腫瘍径の方がコントロール群のそれよりも若干上回る傾向を示しており、両群の腫瘍径の推移に有意差は見られなかった。また、図１３の下段の３つのパネルは、両群における生存マウス数の推移を示す。図１３の下段の結果から分かるように、ＮＡ群のマウスの生存数の推移と、コントロール群のマウスの生存数の推移にはそれほどの差は見られなかった。 20 to 24 4-week-old female C57BL6 mice were prepared, and the right flank of each C57BL6 mouse was shaved. As a control group, 0.1 cc of physiological saline was administered to the abdominal cavity of 10 to 13 C57BL6 mice, and 0.1 cc of NA (in) was administered to the abdominal cavity of 10 to 12 C57BL6 mice as a treatment group (NA administration group). PBS) was administered at 0.5 mg / g. Simultaneously with the administration of saline or NA, 0.1 cc / mouse (1 × 10 6 cells / mouse) of B16F1 cells (in DME) was subcutaneously injected into the right flank of each mouse. On the following day, 0.1 cc of physiological saline was intraperitoneally administered to each mouse in the control group as described above, and 0.1 cc of the treatment group was administered to mice in the treatment group as described above. NA (in PBS) was intraperitoneally administered to each mouse at 0.5 mg / g. After subcutaneous injection of B16F1 cells, measurement of the tumor size (mm 3 ) of each mouse and confirmation of the number of survival mice in both groups were performed daily until the mice died. I did it. The dead mice were dissected and visually checked for intraperitoneal infiltration of melanoma cells (B16F1 cells) or lymph node metastasis. The above transplantation assay was repeated three times. FIG. 13 shows the results of changes in the tumor diameter and the number of surviving mice in both groups of mice. The upper three panels in FIG. 13 show the average transition of the tumor diameter in the mice of the NA administration group and the average transition of the tumor diameter in the mice of the control group. As can be seen from the results in the upper part of FIG. 13, in the first and third transplantation assays, the tumor diameter in the control group mice tended to be slightly larger than that in the NA administration group. In the assay, the tumor diameter in mice in the NA administration group tended to be slightly larger than that in the control group, and there was no significant difference in the transition of tumor diameter between the two groups. In addition, the lower three panels in FIG. 13 show changes in the number of surviving mice in both groups. As can be seen from the results in the lower part of FIG. 13, there was no significant difference between the change in the survival number of the mice in the NA group and the change in the survival number of the mice in the control group.
また、上記の移植アッセイにおけるマウスの死因は、腫瘍死よりも、ストレスによると思われる消化管出血、或いは腫瘍からの出血死が多かった。そこで、上記の移植アッセイにおいて、メラノーマ細胞の腹腔内浸潤又はリンパ節転移の存在が確認されたマウスのみについて、その累積生存率をコントロール群（Ｃ）とＮＡ投与群（Ｎ）に分けて比較した結果を図１４に示す。図１４から分かるように、この場合のコントロール群の累積生存日数は、２１日から３６日くらいの間に分布しており、その平均生存日数は２８．３８日であったのに対し、ＮＡ投与群の累積生存日数は１８日から４５日くらいの間に分布しており、その平均生存日数は３７．５５６日であった。すなわち、メラノーマ細胞の腹腔内浸潤又はリンパ節転移の存在が確認されたマウスに関しては、ＮＡ投与群では、コントロール群に対して有意な延命効果が示された。 In addition, the cause of death of mice in the above transplantation assay was more gastrointestinal hemorrhage, which seems to be due to stress, or death from bleeding from the tumor than tumor death. Therefore, in the transplantation assay described above, the cumulative survival rate of only mice in which the presence of intraperitoneal infiltration or lymph node metastasis of melanoma cells was confirmed was divided into the control group (C) and the NA administration group (N) for comparison. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 14, the cumulative survival days of the control group in this case were distributed between 21 and 36 days, and the average survival days were 28.38 days, whereas NA administration The cumulative survival days of the group were distributed between 18 days and 45 days, and the average survival days were 37.556 days. That is, regarding the mice in which the presence of intraperitoneal infiltration of melanoma cells or the presence of lymph node metastasis was confirmed, the NA administration group showed a significant life-prolonging effect compared to the control group.
また、上記の移植アッセイにおいて、正常組織へのメラノーマ細胞の浸潤が確認されたマウス（Invasion（＋）のマウス）の割合（％）を両群について算出した結果を図１５に示す。図１５から分かるように、コントロール群においては、該群の総マウス数に対するInvasion（＋）のマウス（転移を生じているマウス）数の割合が３１．４％であったのに対し、ＮＡ投与群（ＮＡ群）におけるその割合は１１．８％であった。すなわち、ＮＡ投与群におけるInvasion（＋）のマウス数の割合は、コントロール群におけるその割合の約３分の１であった。これにより、ＳＩＲＴ１の阻害物質（ＮＡ）を投与すると、メラノーマ細胞の転移抑制効果が得られることが、in vivoにおいて実証された。 FIG. 15 shows the results of calculating the ratio (%) of mice (Invasion (+) mice) in which infiltration of melanoma cells into normal tissue was confirmed in the above transplantation assay for both groups. As can be seen from FIG. 15, in the control group, the ratio of the number of Invasion (+) mice (mice with metastasis) to the total number of mice in the group was 31.4%, whereas NA administration The ratio in the group (NA group) was 11.8%. That is, the ratio of the number of Invasion (+) mice in the NA administration group was about one third of that ratio in the control group. Thus, it was demonstrated in vivo that administration of a SIRT1 inhibitor (NA) provides an effect of suppressing melanoma cell metastasis.
Claims (7)
被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程；
測定の結果得られたヒストンデアセチラーゼ活性の値を、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値と比較する工程；
被検物質の存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値が、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値より低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程； The screening method of the melanoma metastasis inhibitor characterized by having the following processes.
Measuring the histone deacetylase activity of SIRT1 in the presence of a test substance;
Comparing the value of histone deacetylase activity obtained as a result of the measurement with the value of histone deacetylase activity of SIRT1 in the absence of the test substance;
When the value of histone deacetylase activity of SIRT1 in the presence of the test substance is lower than the value of histone deacetylase activity of SIRT1 in the absence of the test substance, the test substance is treated as a melanoma metastasis inhibitor. The step of evaluating;
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