JP2012044951A

JP2012044951A - 口腔内の細菌群を改善するラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍＳＧ−Ａ９５）及びその保健組成物

Info

Publication number: JP2012044951A
Application number: JP2010191773A
Authority: JP
Inventors: Zhuyang Xie; 謝主揚; Yushan Wei; 魏▲ゆう▼珊; Jijiang Yang; 楊継江
Original assignee: Syngen Biotech Co Ltd
Current assignee: Syngen Biotech Co Ltd
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2010-08-30
Publication date: 2012-03-08
Anticipated expiration: 2030-08-30
Also published as: JP5108068B2

Abstract

【課題】口腔内細菌群を改善する保健組成物の提供。
【解決手段】本発明の口腔内の細菌群を改善する寄託番号ＣＧＭＣＣ３２４８のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列のコードを含むラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５、及び前記ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５を培地で発酵させて得た発酵産物は口腔内の歯周病細菌の成長を効果的に抑制し、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍＳＧ−Ａ９５）及びその発酵産物から作成した保健組成物は、口腔の歯周病細菌の成長抑制に用いる。
【選択図】図１

Description

本発明は口腔内の細菌成長を抑制するラクトバシラス・ファーメンタム及びその発酵物に関する。

正常な人の口腔内には多くの細菌、黴菌、さらにはウイルスが存在し、そのうち細菌の数が最も多く、１ｍｌの唾液中に１億個もの細菌が存在し、口腔内全体の細菌の種類は６００種を超えるが、これら細菌の全てが病原細菌というわけではなく、中には一部プロバイオティックスも含まれる。通常これらの細菌は相互に細菌集落の相対的平衡を維持しており、直接人を病気に至らしめることはないが、体の免疫力または抵抗力が低下したり、口腔環境が変化したり、薬物の服用または全身的な疾病がある等の状況においては、病原細菌が過度に成長して口腔疾患を引き起こし、軽いものでは口臭、歯垢の発生、歯肉炎の発生など、重いものでは虫歯、歯周病などを引き起こすことがあり、さらには細菌が血管内に侵入して大量に繁殖し、菌血症を発生することさえある。

台湾歯科医師公会全国連合会の年度健康保険資料の統計によると、台湾地区の成人の歯周病罹患率は９割にも達しており、歯の保健の重要性が分かる。

歯周病は一般に歯肉炎（ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ）と歯周炎（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）の２種類に分けることができる。歯肉炎の主な症状は歯肉の出血、腫れ、赤み等である。歯周炎は歯肉支持組織と歯の歯槽骨（ａｌｖｅｏｌａｒｂｏｎｅ）が破壊された状態を指す。

歯周病にかかると、歯と歯肉間の溝が深くなり、「歯周ポケット」（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｐｏｃｋｅｔ）が形成される。通常の歯が健康な人の歯周ポケットの深さは約１ｍｍ〜２ｍｍの間であり、軽度の歯周炎患者の歯周ポケットの深さは約３〜４ｍｍ、中度の患者は４〜６ｍｍ、重度の患者の歯周ポケットの深さは６ｍｍ以上である。歯周ポケットが深くなると、歯肉そのものが短くなる。歯の外観が長く見えるようになったり、歯にぐらつきが生じ始めたりすることは、重度の歯周病の警告であることがある。

歯肉炎及び歯周炎はいずれも「歯周病細菌」（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｂａｃｔｅｒｉａ）に感染して引き起こされるものであり、代表的な細菌にはポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）がある。

唾液中の糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が歯の表面で薄膜を形成し、細菌はここに付着して食べ物の中の糖分を吸い取ると、薄膜が大きく厚くなり、歯垢が形成される。さらに、歯周ポケット中に歯垢が形成されると、歯周病細菌が歯垢中で大量に繁殖する。歯周病細菌は嫌気性であるため、酸素が到達しにくい歯周ポケットは成長に最適な環境となる。歯垢もストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）の温床であり、９０％以上の成人の口腔内にこの細菌があり、この菌は虫歯を引き起こす主要な細菌でもある。ストレプトコッカス・ミュータンスが糖分を分解して発生する酸性物質が歯のエナメル質（ｅｎａｍｅｌ）と象牙質（ｄｅｎｔｉｎ）を侵蝕すると、虫歯となる。

歯周病については、歯周病細菌が歯肉に侵入すると、免疫反応が引き起こされる。歯周病細菌は酵素を分泌して歯肉細胞を溶解し、歯肉内部に侵入する。歯周病細菌の数量がまだ少ないときはその侵入を阻止することができるが、大量に繁殖すると抑制できなくなる。

現在、虫歯または歯周病の発生を予防する方法がいくつかあり、例えば歯の表面に細菌が付着するのを防ぐ抗付着剤を使用し、歯垢の形成を減少して細菌による歯の侵蝕を防ぐ方法（台湾特許出願第０９４１４４３７７号）、抗菌剤を使用して細菌の成長を抑制する方法（米国特許第５３６８８４５号；ＷＯ９２／１４４７５）、または現在広く用いられているフッ素を利用して、エナメル質の酸性物質に対する溶解度を低下させて虫歯を予防する方法などがある。しかしながら、現在乳酸菌及びその口腔疾患治療に対する効果に関する研究は非常に少ない。

台湾特許出願第０９４１４４３７７号米国特許第５３６８８４５号ＷＯ９２／１４４７５

本発明の目的は、寄託番号ＣＧＭＣＣ３２４８のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、さらにＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列のコードを含む前記ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、前記ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５を培地で発酵させて得た発酵産物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、前述のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはその発酵産物を口腔保健に応用し、個体口腔内の歯周病細菌の成長を効果的に抑制して、口腔内細菌群を改善する保健組成物を提供することにある。

本発明のＳＥＱＩＤＮＯ：１は既知のラクトバシラス・ファーメンタムの遺伝物質と明らかな差異がある（図１参照）。このほか、ＡＰＩ５０ＣＨＬ照合で本発明のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５と欧州特許第０１５４５４９号の開示する菌株ＡＤ０００２（寄託番号ＦＥＲＭＰ−７５３９）にも明らかな差異があることが示されており、表１に示すとおりである。

本発明のラクトバシラス・ファーメンタムと欧州特許第０１５４５４９号の開示する菌株ＡＤ０００２（寄託番号ＦＥＲＭＰ−７５３９）のＡＰＩ５０ＣＨＬ照合

また、本発明のいう個体とは哺乳動物であり、ヒトを最良とする。

体外実験または生体実験から分かるように、よく見受けられる歯周病細菌、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）及びアクチノマイセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｖｉｓｃｏｓｕｓ）等は皆ラクトバシラス・ファーメンタム生菌またはその発酵産物の影響を受けて成長を停止し、さらには死亡する。ラクトバシラス・ファーメンタムの口腔内細菌成長を抑制する特性により、ラクトバシラス・ファーメンタムを次に示す口腔細菌性疾患の予防または治療に応用することができる。

（ａ）ポルフィロモナス・ジンジバリスに関連する疾患：歯周疾患（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｄｉｓｅａｓｅ）、骨粗鬆症、海綿静脈洞血栓性静脈炎（Ｃａｖｅｒｎｏｕｓｓｉｎｕｓｔｈｒｏｍｂｏｐｈｌｅｂｉｔｉｓ）、歯周病（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）、心血管疾患、感染性心内膜炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、糖尿病、呼吸系疾患、動脈硬化、冠状動脈心臓病、脳卒中、リウマチ性関節炎。
（ｂ）ストレプトコッカス・サンギスに関連する疾患：虫歯、感染性心内膜炎、急性感染性関節炎（Ａｃｕｔｅｓｅｐｔｉｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、心血管疾患。
（ｃ）ストレプトコッカス・ミュータンスに関連する疾患：虫歯、感染性心内膜炎。
（ｄ）アクチノマイセス・ビスコーサスに関連する疾患：歯周病。

本発明の開示するラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌そのものが、細菌成長を抑制する能力を備えているため、実際の使用上、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５菌株を直接口腔に塗布する方式で使用することができる。そして、菌株の活性を破壊せず口腔内でそれが復原可能であることを前提として、本発明の菌株を冷凍または乾燥して錠剤またはスプレー剤にしたり、液体に溶解させたり、食品または医薬品或いは口腔洗浄剤の添加剤とする方式で製造して使用することもできる。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌の細菌抑制能力を破壊しないあらゆる方式が本発明の適用可能な方式である。

本発明のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物は、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５成分を培養できる培地でラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５を発酵させた後の産物を指す。前記培地の主要成分はブドウ糖、プロテアーゼ、肉エキス、酵母菌エキス、塩類等の物質である。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵後の産物は、透析膜による純化を経ても、例えばＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析膜（ＭＷＣＯ：３５００）を使用して透析を行っても、その細菌抑制効果には影響せず、その抑菌能力は完全にラクトバシラス・ファーメンタム生菌菌体に依存しているのではなく、その発酵過程で発生する代謝物に依存していることが示されている。このため、本発明のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５を有効成分とした口腔保健物は、ラクトバシラス・ファーメンタム生菌体を除去したラクトバシラス・ファーメンタム発酵産物のみを含むことができる。

実際の応用上、本発明はラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物を口腔に塗布したり、錠剤またはスプレー剤としたり、液体に溶解させたり、食品または医薬品、或いは口腔洗浄剤に加えて製造し、使用することもできる。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物の細菌抑制能力を破壊しないあらゆる方式が本発明の適用可能な方式である。

本発明のＳＥＱＩＤＮＯ：１と既知のラクトバシラス・ファーメンタム（米国特許公開第２００２／００９４３２８号中の菌株ＡＴＣＣ１４９３１）のヌクレオチド配列を示す照合図（ＮＣＢＩｂｌａｓｔプログラム使用）である。ＱｕｅｒｙはＡＴＣＣ１４９３１の配列、Ｓｂｊｃｔは本発明のＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５治療群（ｔＬＦＰ４）肝臓組織切片（２００Ｘ）である。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５治療群（ｔＬＦＰ４）腎臓組織切片（２００Ｘ）である。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５治療群（ｔＬＦＢＨ）肝臓組織切片（２００Ｘ）である。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５治療群（ｔＬＦＢＨ）腎臓組織切片（２００Ｘ）である。対照群のテトラサイクリン治療群（ｔＴＣ）肝臓組織切片（２００Ｘ）である。対照群のテトラサイクリン治療群（ｔＴＣ）腎臓組織切片（２００Ｘ）である。対照群の無治療（蒸留水）群（ｔＭＴ）肝臓組織切片（２００Ｘ）である。対照群の無治療（蒸留水）群（ｔＭＴ）腎臓組織切片（２００Ｘ）である。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５予防群（ｐＬＦＰ４）肝臓組織切片（２００Ｘ）である。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５予防群（ｐＬＦＰ４）腎臓組織切片（２００Ｘ）である。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５予防群（ｐＬＦＢＨ）肝臓組織切片（２００Ｘ）である。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５予防群（ｐＬＦＢＨ）肝臓組織切片（２００Ｘ）である。対照群のテトラサイクリン予防群（ｐＴＣ）肝臓組織切片（２００Ｘ）である。対照群のテトラサイクリン予防群（ｐＴＣ）腎臓組織切片（２００Ｘ）である。対照群の無予防（蒸留水）群（ｐＭＴ）肝臓組織切片（２００Ｘ）である。対照群の無予防（蒸留水）群（ｐＭＴ）腎臓組織切片（２００Ｘ）である。

本発明の口腔細菌性疾患の予防または治療に用いる保健組成物は、そのうちの有効成分がラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはその発酵産物であり、ここでは体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）または生体（ｉｎｖｉｖｏ）実験で前記菌体またはその発酵物の歯周病に対する効果を検証する。

体外実験（ｉｎｖｉｔｒｏｓｔｕｄｙ）
ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５を液体培地（本実施例はＭＲＳ培地を採用）で、３０〜３７℃で１５〜２４時間培養後、発酵菌液を３０倍の濃度に濃縮し、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）ＤｉａｌｙｓｉｓＭｅｍｂｒａｎｅ；ＭＷＣＯ：３５００、ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ，ＣＡ）を使用して４８時間透析し、さらに実験の必要に応じてラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５と濃縮した発酵産物を異なる濃度に希釈した。それぞれストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）（ＡＴＣＣ２５１７５）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｓ）（ＡＴＣＣ４９２９５）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ３３２７７）、アクチノマイセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｖｉｓｃｏｓｕｓ）（ＡＴＣＣ１５９８７）とディスク寒天拡散試験（Ｄｉｓｃａｇａｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎｔｅｓｔ）、ブロス希釈法（Ｂｒｏｔｈｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）、ラクトバシラス・ファーメンタム生菌と病原菌の共同培養試験を行い、病原菌成長の抑制状況を調べた。以上４株の病原菌の菌株は財団法人食品工業発展研究所生物資源保存及び研究中心またはＡＴＣＣから購入した。

ＭＲＳ培地は乳酸菌の培養に常用され、その主な成分はブドウ糖、プロテアーゼ、肉エキス、酵母菌エキス、塩類等の物質である。

（ａ）ディスク寒天拡散試験
濁度が０．５比濁度に相当するまで培養したストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノマイセス・ビスコーサス菌液に、無菌棉棒を３秒間浸漬し、寒天表面に３方向に均等に塗布して接種材料を均一に分布させた。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の３０倍発酵産物を透析した後、濃縮４倍（ＬＦＰ４）、濃縮２倍（ＬＦＰ２）及び１倍（ＬＦＰ１）（未濃縮の発酵菌液）に調整し、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌をそれぞれ１×１０^９（ＬＦＢＬ）、２×１０^９（ＬＦＢＭ）、５×１０^９（ＬＦＢＨ）の異なる菌数に希釈した。直径６ｍｍの消毒滅菌済みペーパーディスクを異なる濃度のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の発酵産物または異なる生菌数の菌液中に３秒間浸漬させた後、ディスクを取り出して寒天表面に貼り付け、３７℃の嫌気培養ボックス中に入れて２４時間培養した後、その阻止円の大きさを測定した。

（ｂ）ブロス希釈法（Ｂｒｏｔｈｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）
ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の３０倍発酵産物を透析した後、濃縮４倍（ＬＦＰ４）、濃縮２倍（ＬＦＰ２）及び１倍（ＬＦＰ１）（未濃縮の発酵菌液）に調整し、また別途ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノマイセス・ビスコーサス菌液を無菌標準液体培地（ＢＨＩＢｒｏｔｈ）で濁度が０．５比濁度に相当するまで培養し、それぞれ５０μＬの菌液を試験管中に加え、３７℃の嫌気培養ボックス中に入れて４８時間培養した後、平板計数法で細菌集落数を計算し、サンプルの発育阻止濃度を推算した。

（ｃ）ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５と病原菌の共同培養試験
ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌をストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギス、ポルフィロモナス・ジンジバリスと共に試験管に入れ、３７℃で共同培養した。異なる時間点でサンプリングをそれぞれ行い、平板計数法で細菌集落数を計算し、サンプルの病原菌成長抑制状況を調べた。

動物生体実験（ｉｎｖｉｖｏｓｔｕｄｙ）
実験群と対照群をそれぞれ設定した。ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５実験群は、それぞれ濃縮４倍、濃縮２倍及び１倍（未濃縮発酵菌液）の透析後のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物濃縮液３組と、それぞれ１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９の異なる菌数のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５３組の６組に分けた。対照群は２組（テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）０．２６７ｍｇ／ｍＬ及び蒸留水（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ）とした。

（ａ）動物歯周病予防効果の評価
八週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス各組１２匹（表２）を選び、毎日異なる濃度のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物またはラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌、テトラサイクリン０．２６７ｍｇ／ｍＬまたは蒸留水各１ｍｌを投与し、かつその下顎前歯に歯列矯正用ワイヤ（ｌｉｇａｔｕｒｅｗｉｒｅ）を取り付け、歯周組織に歯周病病原細菌ストレプトコッカス・ミュータンスを接種して、マウスを人工的に歯周組織病変の状態にした。この操作は全部の動物が犠牲になるまで行われ、その病理表徴を観察、記録した。歯科医師による診断で対照群（蒸留水を与えた模擬処置群（ｍｏｃｋ−ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐ））の歯肉に赤い腫れ及び歯垢の出現が開始したら、ワイヤの束縛を解除し、歯周病病原細菌の接種を停止した。ワイヤの束縛を解除した後、４、８、１２、１６日目にマウスの歯周ポケット深度（ｐｏｃｋｅｔｄｅｐｔｈ）を測定し、各組３匹を犠牲にして採血し、検体を取得して組織学的観察を行った。

動物実験予防群のグループ分け（注：ヒトに使用するテトラサイクリン剤量は体重７５ｋｇで１日当たり１０００ｍｇであり、これに基づきマウスの１日に使用する剤量を体重２０ｇで約０．２６７ｍｇと算出）

（ｂ）動物歯周病治療効果の評価
八週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス各組１２匹（表３）を選び、その下顎前歯に歯列矯正用ワイヤを取り付け、対照群の歯肉に赤みと腫れ及び歯垢が出現するまで、歯周組織に歯周病病原細菌ストレプトコッカス・ミュータンスを接種し、マウスを人工的に歯周組織病変の状態にした。それぞれ歯科医師による組織病変の診断後、毎日異なる濃度のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物またはラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌、テトラサイクリン０．２６７ｍｇ／ｍＬまたは蒸留水各１ｍｌを投与し、その病理表徴を観察、記録した。治療開始日からワイヤの束縛を解除し、歯周病病原細菌の接種を停止した。ワイヤ束縛解除後４、８、１２、１６日目にマウスの歯周ポケットの深さを測定し、各組３匹を犠牲にして採血し、検体を取得して組織学的観察を行った。

動物実験治療群のグループ分け

（ｃ）歯周ポケット深度（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｐｏｃｋｅｔｄｅｐｔｈ）の改善割合
対照群を標準として、マン・ホイットニー検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙｔｅｓｔ）を使用し、各群中の各個体の検査を行い、有意差のある個体を改善個体と呼ぶこととした。（改善個体数／群の全個体数）×１００％＝歯周ポケット深度改善割合である。

（ｄ）臨床病理及び生化学検査
死亡していない動物を犠牲にして頚動脈から取った血液を３０００ｒ．ｐ．ｍ．、４℃の条件下で１０分間遠心処理し、上層の血清を取得して自動生化学分析装置でそのＡＬＴ、ＡＳＴ、クレアチニン、ＢＵＮ生化学指標を測定した。且つ、その重要な臓器（肝臓、腎臓）を１０％ホルマリン液で固定し、組織切片のパラフィン包埋後にＨ．Ｅ．染色を行い、病理学的観察を行った。

（統計分析）
実験数値は平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）で表示する。マウスの歯周ポケット状況の実験群と対照群間の統計差異は、縦断的（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ）研究では一元配置分散分析（Ｏｎｅ‐ｗａｙＡＮＯＶＡ）とＤｕｎｎｅｔｔ多重事後比較法（Ｄｕｎｎｅｔｔｍｕｌｔｉｐｌｅｐｏｓｔｈｏｃｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を採用して測定し、横断的（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ）研究では一元配置分散分析とＬＳＤ多重事後比較法（ＬＳＤｍｕｌｔｉｐｌｅｐｏｓｔｈｏｃｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を採用して測定した。また、マン・ホイットニー検定を採用して歯周ポケット改善の個体数を調べた。統計有意水準のｐ値は０．０５である。

（結果）
1．体外実験（ｉｎｖｉｔｒｏｓｔｕｄｙ）
（ａ）ディスク寒天拡散試験
表４にディスク寒天拡散試験の抗菌効果を示す。無菌ペーパーディスクの直径は６ｍｍであり、阻止円が＞６ｍｍであれば抗菌効果があることを示し、そうでなければ抗菌効果がないことを示す。培養温度及び時間は３７℃、２４時間であり、対照群はテトラサイクリンを含むペーパーディスクで、阻止円の数値は平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。

ディスク寒天拡散試験の抗菌効果

表４は、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５濃縮２倍以上の発酵産物及び生菌がアクチノマイセス・ビスコーサス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギスの４種類の病原菌に対して阻止円を形成したことを示している。

（ｂ）ブロス希釈法

最低発育阻止濃度及び抗菌割合（１００％ − （実験群 ÷ 対照群） × １００％）

表５はラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の発酵産物濃度の歯周病原細菌に対する４８時間処理後の異なる抑制効果を示している。全体的にみて、高濃度のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５産物が比較的よい抑制効果を有しているといえる。歯周病原細菌について見ると、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の発酵産物のポルフィロモナス・ジンジバリスに対する抑制効果が最も顕著であり、剤量に依存する現象が見られ、次がアクチノマイセス・ビスコーサスである。ラクトバシラス・ファーメンタムの２倍以上の濃縮産物はこれら４株の病原菌に対してすべて抑制作用がある。

（ｃ）ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５と病原菌の共同培養試験

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌（略称ＬＦ）とストレプトコッカス・ミュータンスの共同培養、病原菌成長抑制状況。

表６はラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌とストレプトコッカス・ミュータンスの共同培養では、低菌数群（７乗）、中菌数群（８乗）、高菌数群（９乗）のいずれも、共同培養４８時間内はストレプトコッカス・ミュータンス病原菌が存在せず、すべてストレプトコッカス・ミュータンス成長抑制の効果があることを示している。

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌とストレプトコッカス・サンギスの共同培養、病原菌成長抑制状況。

表７はラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌とストレプトコッカス・サンギスの共同培養では、高菌数群（９乗）が共同培養１０時間ですでにストレプトコッカス・サンギス病原菌が存在せず、中菌数群（８乗）と低菌数群（７乗）が共同培養１４時間でストレプトコッカス・サンギス病原菌が存在しなくなっており、すべてストレプトコッカス・サンギス成長抑制の効果があることを示している。

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌とポルフィロモナス・ジンジバリスの共同培養、病原菌成長抑制状況。

表８はラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌とポルフィロモナス・ジンジバリスの共同培養では、高菌数群（９乗）が共同培養６時間ですでにポルフィロモナス・ジンジバリス病原菌が存在せず、中菌数群（８乗）が共同培養８時間でポルフィロモナス・ジンジバリス病原菌が存在せず、低菌数群（７乗）が共同培養１４時間でポルフィロモナス・ジンジバリス病原菌が存在しなくなっており、すべてポルフィロモナス・ジンジバリス成長抑制の効果があることを示している。

２．動物生体実験（ｉｎｖｉｖｏｓｔｕｄｙ）
（ａ）動物歯周病予防効果の評価

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５予防群（ｐＬＦ）のマウスの歯周ポケット深度（ｍｍ）（一元配置分散分析とＤｕｎｎｅｔｔ多重事後比較法）の異なる時間点における各群と対照群（ｐＭＴ）の比較。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）

予防群ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物及び生菌数の評価では、各群に異なる濃度のサンプルを与えたときの歯周ポケット深度に対する影響は、異なる時間点で各群共蒸留水を与えた対照群（ｐＭＴ）に対してすべての時間点で有意差があった。テトラサイクリンを与えた予防対照群（ｐＴＣ）はすべての時間点で有意差があった。

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５予防群（ｐＬＦ）のマウスの歯周ポケット深度（ｍｍ）（一元配置分散分析とＬＳＤ多重事後比較法）、各濃度群別の異なる時間点と４日目の比較。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５予防群発酵産物と生菌数の各濃度群別、異なる時間点の群内での比較は、４倍（ｐＬＦＰ４）濃度、高濃度生菌群（ｐＬＦＢＨ）及びテトラサイクリン群（ｐＴＣ）が１２日目及び１６日目の歯周ポケットの改善程度は４日目と比較して有意差があった。

（ｂ）動物歯周病治療効果の評価

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５治療群（ｔＬＦ）のマウスの歯周ポケット深度（ｍｍ）（一元配置分散分析とＤｕｎｎｅｔｔ多重事後比較法）の異なる時間点における、各群と対照群（ｔＭＴ）の比較。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）

治療群ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物及び生菌数の評価では、各群に異なる濃度を与えたときの歯周ポケット深度に対する影響は、異なる時間点の各群間にすべて有意差があった。各時間点で対照群（ｔＭＴ）と比較すると、４倍濃度群（ｔＬＦＰ４）、高濃度生菌群（ｔＬＦＢＨ）及びテトラサイクリン群（ｔＴＣ）が各時間点すべてで有意差があった。１倍及び２倍の発酵産物を与えた群（ｔＬＦＰ１とｔＬＦＰ２）及び低濃度生菌群（ｔＬＦＢＬ）は、８日目を除き、残りの時間点すべてで有意差があった。中濃度生菌群（ｔＬＦＢＭ）は１２日目のみで有意差があった。

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５治療群（ｔＬＦ）のマウスの歯周ポケット深度（ｍｍ）（一元配置分散分析とＬＳＤ多重事後比較法）各濃度群別の異なる時間点と４日目の比較。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）

治療群のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物投与及び生菌数各群では、異なる時間点の群内比較で、高濃度生菌群（ｔＬＦＢＨ）は８、１２、１６日目に（４日目と比較して）有意差があり、テトラサイクリンの組（ｔＴＣ）は１２日目と１６日目に有意差があった。

（ｃ）歯周ポケット深度（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｐｏｃｋｅｔｄｅｐｔｈ）改善割合

ラクトバシラス・ファーメンタム予防群ＳＧ−Ａ９５（ｐＬＦ）歯周ポケット改善割合（予防群中の無処理対照群（ｐＭＴ）と比較して有意差のある（マン・ホイットニー検定、ｐ＜０．０５）改善が見られた個体割合）。

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５予防群歯周ポケット深度改善割合は１６日目に、２倍と４倍濃度群及び低濃度生菌群（ｐＬＦＰ２、ｐＬＦＰ４及びｐＬＦＢＬ）を除き、各群すべて１００％に達した。

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５治療群（ｔＬＦ）歯周ポケット改善割合（無治療対照群（ｔＭＴ）と比較して有意差のある（マン・ホイットニー検定，ｐ＜０．０５）改善が見られた個体割合）。

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５治療群は、中濃度生菌群を除き、１６日目にすべて３３％〜１００％の改善率が見られた。

（ｄ）臨床病理検査
ＳＧ−Ａ９５発酵産物を与えた群または生菌数が最高濃度の各群は１６日目の肝臓、腎臓組織切片（図２〜図５と図１０〜図１３）において、各群の肝臓及び腎臓組織細胞に顕著な毒性傷害の表徴はなく、炎症細胞浸潤もなく、無治療対照群（ｔＭＴまたはｐＭＴ）（図６〜図９と図１４〜図１７）と比較して明らかな差異はなかった。

（結論）
体外実験のディスク寒天拡散試験から、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５濃縮２倍以上の発酵産物はこれら４種類の病原菌に対してすべて阻止円の形成があり、生菌は１×１０^９（ＬＦＢＬ）、２×１０^９（ＬＦＢＭ）または５×１０^９（ＬＦＢＨ）のいずれもアクチノマイセス・ビスコーサス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギスの４種類の歯周病原細菌に対してすべて９〜１０ｍｍの阻止円が形成された。ブロス希釈法試験においては、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の発酵産物濃度が歯周病原細菌に対して異なる程度の抑制効果があることが示された。共同培養のデータから、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５生菌のポルフィロモナス・ジンジバリスに対する抑制効果が最も優れており、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギスに対しても抑制作用があり、且つ生菌数が高いほど抑制効果も良好であることが示された。

歯周病動物モデル生体実験はラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の発酵産物及び生菌の歯周状況に対する改善を示し、予防の効果は治療の効果より優れていた。予防効果について言うと、各群の異なる濃度投与の歯周ポケット深度に対する影響は、異なる時間点で各群とも対照群（ｐＭＴ）に対してすべて有意差のある改善を示した。治療効果の部分は、発酵産物４倍濃度群（ｔＬＦＰ４）、高濃度生菌群（ｔＬＦＢＨ）の効果が最良であった。

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５発酵産物投与または生菌数が最高濃度の各群は、１６日目に動物を犠牲にしたとき取り出した肝臓と腎臓組織に対して病理切片を行い、各群の肝臓及び腎臓組織細胞には顕著な毒性傷害の表徴はなく、安全性が極めて高いことが示された。

体外及び動物生体実験を組み合わせ、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の発酵産物及び生菌は歯周炎の発生を予防でき、歯周炎症の状況を改善することができる。

Claims

ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５であって、寄託番号がＣＧＭＣＣ３２４８のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ,ＳＧ−Ａ９５）。
請求項１に記載のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列のコードを含むことを特徴とする、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５。
ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の発酵産物であって、請求項１に記載のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５を培地で発酵させて得たことを特徴とする、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５の発酵産物。
口腔内細菌群を改善する保健組成物であって、請求項１に記載のラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５または請求項３に記載の発酵産物を含むことを特徴とする、保健組成物。
請求項４に記載の保健組成物であって、そのうちラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５が生菌であり、発酵産物が発酵液であることを特徴とする、保健組成物。
請求項４に記載の保健組成物であって、個体口腔内の歯周病細菌の成長を抑制するために用いることを特徴とする、保健組成物。
請求項６に記載の保健組成物であって、そのうち前記歯周病細菌がストレプトコッカス・ミュータンスまたはストレプトコッカス・サンギス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノマイセス・ビスコーサスを含むことを特徴とする、保健組成物。
請求項６に記載の保健組成物であって、そのうち前記個体が哺乳動物であることを特徴とする、保健組成物。
請求項４に記載の保健組成物であって、そのうち発酵産物が、ラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５成分を培養できる培地でラクトバシラス・ファーメンタムＳＧ−Ａ９５を発酵させた後の産物であることを特徴とする、保健組成物。
請求項４に記載の保健組成物であって、錠剤、スプレー剤、溶液、食品、医薬品または口腔洗浄剤の添加剤のいずれかの態様であることを特徴とする、保健組成物。