JP2012039966A - Protein having cellobiohydrolase activity with inactivated cellulose binding domain - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、バイオマスに含まれるセルロースを有効利用するためのセロビオヒドロラーゼ及びその利用に関する。 The present invention relates to cellobiohydrolase for effectively utilizing cellulose contained in biomass and use thereof.
近年、有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。なかでも、セルロースの利用が期待されている。セルロースは、糖であるグルコースがβ−１，４グリコシド結合によって縮合した高分子化合物であり、分子間水素結合により強固な結晶構造を構成している。セルロースを分解し、さらに、グルコースに糖化し発酵原料として用いるには、セルロースを単糖まで分解（糖化）するには、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼという、少なくとも３種類のセルラーゼ（セルロース分解酵素）セルラーゼの相乗効果が必要である。 In recent years, as an alternative to finite petroleum resources, there is an increasing expectation for biomass derived from the photosynthesis of plants, and various attempts have been made to use biomass for energy and various materials. Among these, the use of cellulose is expected. Cellulose is a polymer compound in which glucose, which is a sugar, is condensed by β-1,4 glycosidic bonds, and constitutes a strong crystal structure by intermolecular hydrogen bonding. In order to decompose cellulose and further saccharify it into glucose and use it as a raw material for fermentation, in order to decompose cellulose into monosaccharide (saccharification), at least three types of cellulases (cellulose, endoglucanase, cellobiohydrolase and β-glucosidase) The synergistic effect of cellulase is necessary.
自然界においては、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）やトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）などある種のカビ等が強力なセルラーゼを分泌することが知られている。セルラーゼは、通常、セルロース結合ドメインという、基質であるセルロースに結合するためのドメインを有していることが多い。セルロース結合ドメインを有することにより、水不溶性のセルロースや水溶性のオリゴマーに結合し、セルロースを分解しやすくなると考えられている。しかしながら、こうしたセルロース結合ドメインを有しないセルラーゼも天然に存在しており、例えば、T. reesei由来のエンドグルカナーゼ３やシロアリ腸内細菌由来のセルラーゼなどが挙げられる。 In nature, it is known that certain molds such as Clostridium thermocellum and Trichoderma reesei secrete strong cellulases. Cellulases usually have a domain called a cellulose binding domain for binding to cellulose as a substrate. By having a cellulose-binding domain, it is believed that it binds to water-insoluble cellulose and water-soluble oligomers, making it easier to decompose cellulose. However, such a cellulase having no cellulose binding domain also exists in nature, and examples thereof include endoglucanase 3 derived from T. reesei and cellulase derived from termite gut bacteria.
一方、本来的に存在するセルロース結合ドメインを人工的に欠失させたエンドグルカナーゼが開示されている（特許文献１）。この文献には、この接合菌由来のエンドグルカナーゼにおいてセルロース結合ドメインを欠失させることでエンドグルカナーゼ活性が向上したことが記載されている。 On the other hand, an endoglucanase obtained by artificially deleting a cellulose-binding domain that originally exists is disclosed (Patent Document 1). This document describes that the endoglucanase activity was improved by deleting the cellulose binding domain in the endoglucanase derived from this zygomycete.
効率的にあるいは低コストにセルロースを利用するには、強力なセルラーゼあるいは相乗効果の高いセルラーゼを提供することが必要である。ここで、セルラーゼの一種であるセロビオヒドロラーゼとして、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）由来のセロビオヒドロラーゼが知られている（非特許文献１）。 In order to use cellulose efficiently or at low cost, it is necessary to provide a strong cellulase or a cellulase having a high synergistic effect. Here, cellobiohydrolase derived from Phanerochaete chrysosporium is known as a cellobiohydrolase which is a kind of cellulase (Non-patent Document 1).
P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼは高い相乗効果を奏するため、さらなる比活性の向上が求められている。 Since cellobiohydrolase derived from P. chrysosporium has a high synergistic effect, further improvement in specific activity is required.
また、特許文献１に開示される特定の接合菌由来のエンドグルカナーゼについては、セルロース結合ドメインの欠失がエンドグルカナーゼ活性向上に寄与していた。セルロース結合ドメインは、セルロースに結合する部位ではあるため、通常は、当該部位がセルロース分解活性に寄与するもの考えられ、当該部位の欠失は酵素活性の低下を招くことが予想される。また、セルロース結合ドメインと触媒部位とがセルロースに対して一定の位置関係が、セルロースの分解に寄与することも想定されており、かかる場合には、セルロース結合ドメインの欠失は、著しく酵素活性を低下させることがある。ましてや、セルロース結合ドメインの欠失がセルラーゼ活性の向上に寄与するセルラーゼをアミノ酸配列等から識別することもできなかった。加えて、こうした酵素活性の変化は、基質であるセルロースの状態により変動することもあった。したがって、本来的にセルロース結合ドメインを有するセルラーゼからセルロース結合活性を不活性化させることが、そのセルラーゼの酵素活性の向上に寄与するかどうかは全く予測することはできなかった。 Moreover, about the endoglucanase derived from the specific zygomycete disclosed in Patent Document 1, the deletion of the cellulose binding domain contributed to the endoglucanase activity improvement. Since the cellulose-binding domain is a site that binds to cellulose, it is usually considered that the site contributes to cellulolytic activity, and deletion of the site is expected to cause a decrease in enzyme activity. It is also assumed that a certain positional relationship between the cellulose-binding domain and the catalytic site contributes to cellulose degradation. In such a case, deletion of the cellulose-binding domain significantly increases the enzyme activity. May decrease. Furthermore, the cellulase in which the deletion of the cellulose binding domain contributes to the improvement of the cellulase activity could not be identified from the amino acid sequence or the like. In addition, such changes in enzyme activity may vary depending on the state of cellulose as a substrate. Therefore, it could not be predicted at all whether inactivation of cellulose-binding activity from a cellulase having a cellulose-binding domain contributes to improvement of the enzyme activity of the cellulase.
そこで、本明細書の開示は、より優れた比活性を備えるセロビオヒドロラーゼを提供し、さらにその利用を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present disclosure is to provide a cellobiohydrolase having a more excellent specific activity, and to provide its use.
本発明者らは、P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの活性向上を目的として、種々検討しているなか、基質過剰条件下において、見かけの酵素活性が低下する傾向があるという知見を得た。人工的な環境下でのセルロースの分解・糖化反応を考慮すると、反応効率を向上させるためには、基質濃度は著しく高い環境下での反応を行うことが求められる。したがって、このセロビオヒドロラーゼをセルロースの糖化に用いるには不利であると考えられた。そこで、本発明者らは、過剰のセルロースの存在下においては、セルロース結合ドメインが存在することにより、セロビオヒドロラーゼがセルロースから離れにくくなり、引き続き生じうる酵素反応を阻害する可能性があるとの推論に至った。そして、このセロビオヒドロラーゼからセルロース結合ドメインを欠失させてセルロース結合活性を低下させたところ、セロビオヒドロラーゼ活性が向上するという知見を得た。本明細書の開示は、これらの知見に基づいて提供される。 The present inventors have obtained the finding that apparent enzyme activity tends to decrease under substrate-excess conditions during various studies for the purpose of improving the activity of cellobiohydrolase II derived from P. chrysosporium. . Considering the degradation / saccharification reaction of cellulose in an artificial environment, in order to improve the reaction efficiency, it is required to perform the reaction in an environment where the substrate concentration is extremely high. Therefore, it was considered that this cellobiohydrolase is disadvantageous for use in saccharification of cellulose. Therefore, the present inventors have said that in the presence of excess cellulose, the presence of the cellulose binding domain makes it difficult for cellobiohydrolase to leave the cellulose and inhibits the subsequent enzymatic reaction. It led to inference. And when cellulose binding domain was deleted from this cellobiohydrolase and cellulose binding activity was reduced, the knowledge that cellobiohydrolase activity improved was acquired. The disclosure herein is provided based on these findings.
本明細書の開示によれば、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化しており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
According to the disclosure of the present specification, a protein having cellobiohydrolase activity in which the cellulose binding domain is inactivated in any of the following amino acid sequences (a) to (d).
(A) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) amino acid sequence having one or more amino acid substitutions, deletions and / or additions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (c) SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence having 75% or more identity with the amino acid sequence represented by (d) DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a part thereof, and hybridizing under stringent conditions Amino acid sequence encoded by soybean DNA (e) Amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 75% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
本明細書の開示によれば、また、上記タンパク質をコードする、ＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む発現用コンストラクト、当該発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞、上記タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示する細胞も提供される。 According to the disclosure of the present specification, DNA encoding the protein, an expression construct containing the DNA, a cell transformed with the expression DNA construct, secreting the protein outside the cell or in the cell surface layer Presenting cells are also provided.
本明細書の開示によれば、セルロースの分解産物の生産方法であって、上記タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解する工程、を備える、セルロースの分解産物の生産方法が提供される。 According to the disclosure of the present specification, there is provided a method for producing a degradation product of cellulose, comprising the step of degrading cellulose using one or more cellulases containing the protein. A production method is provided.
本明細書の開示によれば、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、上記タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解してセルロース分解産物を取得する工程と、微生物により前記セルロース分解産物を含む炭素源を発酵して、前記有用物質を生産する工程と、を備える、方法が提供される。また、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、前記微生物の細胞外に分泌又は細胞表層に提示される上記タンパク質を含む、１種又は２種以上のセルラーゼの存在下、前記微生物を用いて、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備える、方法も提供される。 According to the disclosure of the present specification, a method for producing a useful substance by fermentation of microorganisms, which uses one or more cellulases containing the protein to decompose cellulose to obtain a cellulose degradation product. There is provided a method comprising: a step of fermenting a carbon source containing the cellulose degradation product by a microorganism to produce the useful substance. Also, a method for producing a useful substance by fermentation of microorganisms, wherein the microorganisms are contained in the presence of one or more cellulases containing the protein secreted outside the cells of the microorganisms or displayed on the cell surface. And using the method of fermenting a carbon source containing at least cellulose to produce the useful substance.
さらに、本明細書の開示によれば、上記タンパク質を含むセルラーゼ組成物及び上記タンパク質を含む、タンパク質複合体も提供される。 Furthermore, according to the indication of this specification, the protein complex containing the cellulase composition containing the said protein and the said protein is also provided.
本明細書の開示は、バイオマスに含まれるセルロースを有効利用するための活性の高いPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼ及びその利用に関する。本明細書に開示されるタンパク質は、基質であるセルロースに対する結合活性が不活性化されることで、セルロースに対する分解活性（比活性）が、当該不活性化前よりも高められている。なお、セルロース結合活性の不活性化による比活性に対する効果は、各種セルラーゼにおいて異なり、不活性化の効果を当業者といえども予測することはできなかった。また、本タンパク質におけるセロビオヒドロラーゼ活性の向上程度は、通常の変異導入による改変による活性向上と同等あるいはそれ以上であり、当業者の予測を超えるものであった。 The disclosure of the present specification relates to a cellobiohydrolase derived from Phanerochaete chrysosporium having high activity for effectively utilizing cellulose contained in biomass and use thereof. The protein disclosed in the present specification has a degrading activity (specific activity) with respect to cellulose higher than that before the inactivation by inactivating the binding activity with respect to cellulose as a substrate. In addition, the effect with respect to the specific activity by inactivation of a cellulose binding activity differs in various cellulases, and even the expert could not anticipate the effect of inactivation. Moreover, the improvement degree of the cellobiohydrolase activity in this protein is equal to or more than the improvement in activity by the modification by the usual mutation introduction, and exceeds the prediction of those skilled in the art.
Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼは、本来的に、他の１種又は２種以上のセルラーゼと組み合わせることにより高い相乗効果を発揮してセルロースを分解できるため、本明細書に開示されるタンパク質によれば、さらに活性の高いセルロース分解能を有する組み合わせを提供でき、セルロースの分解、セルロースからの有用物質の生産を効率的に行うことができるようになる。 The cellobiohydrolase derived from Phanerochaete chrysosporium is inherently capable of degrading cellulose with a high synergistic effect when combined with one or more other cellulases. For example, it is possible to provide a highly active combination having cellulose resolving power, and to efficiently decompose cellulose and produce useful substances from cellulose.
セルロース結合活性の不活性化による、セロビオヒドロラーゼ活性（比活性）の向上には、本来的に有していたセルロース結合ドメインによる、セルロースの過剰存在下における、非生産的なセロビオヒドロラーゼのセルロースへの吸着を抑制するものと推測されるが、推論であって、本発明を拘束するものではない。 Cellulobiohydrolase activity (specific activity) can be improved by inactivating the cellulose binding activity. Cellulobiohydrolase is a non-productive cellobiohydrolase cellulose in the presence of excess cellulose due to the inherent cellulose binding domain. It is presumed to suppress the adsorption to the water, but it is inference and does not restrict the present invention.
以下、本明細書の開示に含まれる種々の実施形態について詳細に説明する。なお、本明細書において用いる「ＧＨＦ（Glycoside Hydrolase Family）」とは、ＣＡＺｙ（Carbohydrate active Enzymes）のホームページ（http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html）において提供される、グリコシド加水分解酵素の分類である。 Hereinafter, various embodiments included in the disclosure of the present specification will be described in detail. As used herein, “GHF (Glycoside Hydrolase Family)” means glycoside hydrolysis provided on the homepage of CAZy (Carbohydrate active Enzymes) (http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html). It is a classification of degrading enzymes.
（セルロース結合ドメインが不活性化されたPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼ）
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、Phanerochaete chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIのアミノ酸配列をコードしている（Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂａｉａｌ． ６０（１２），４３８７−４３９３（１９９４））。Phanerochaete chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端側にセルロース結合ドメインを有し、リンカー領域を介して活性ドメインを有している。本タンパク質は、Phanerochaete chrysosporiumから取得したセロビオヒドロラーゼ IIのアミノ酸配列（配列番号２）において、セルロース結合活性が不活性化されているが、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質である。このような本タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において以下に説明するような各種態様でセルロース結合ドメインが不活性化され、しかも、セロビオヒドロラーゼ活性を維持するアミノ酸配列を有するタンパク質である。
(Cellobiohydrolase from Phanerochaete chrysosporium with inactivated cellulose binding domain)
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 encodes the amino acid sequence of cellobiohydrolase II of Phanerochaete chrysosporium (Appl. Environ. Microbaial. 60 (12), 4387-4393 (1994)). Cellobiohydrolase II of Phanerochaete chrysosporium has a cellulose-binding domain on the N-terminal side in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and has an active domain via a linker region. This protein is a protein having cellobiohydrolase activity although the cellulose binding activity is inactivated in the amino acid sequence of cellobiohydrolase II (SEQ ID NO: 2) obtained from Phanerochaete chrysosporium. Such a protein is a protein having an amino acid sequence in which the cellulose-binding domain is inactivated in various aspects as described below in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that maintains cellobiohydrolase activity. is there.
（セルロース結合ドメインの不活性化の態様）
本タンパク質における、セルロース結合ドメインの不活性化の態様としては、セルロース結合ドメインの部分的又は全体の欠失が挙げられる。セルロース結合ドメインは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２番目から３７番目までのアミノ酸３６残基の領域とされており、不活性化の態様としては、このアミノ酸配列において１個以上、典型的には、複数個から全体（１００％）に及ぶアミノ酸の欠失が挙げられる。好ましくは、２以上の連続したアミノ酸の欠失である。たとえば、セルロース結合ドメインを除去したアミノ酸配列を配列番号３に示す。
(Mode of inactivation of cellulose-binding domain)
Examples of the inactivation of the cellulose-binding domain in the present protein include partial or complete deletion of the cellulose-binding domain. The cellulose binding domain is a region of 36 amino acid residues from the 2nd to the 37th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the inactivation mode is typically one or more in this amino acid sequence. Specifically, deletion of amino acids ranging from a plurality to the whole (100%) can be mentioned. Preferably, it is a deletion of two or more consecutive amino acids. For example, the amino acid sequence from which the cellulose binding domain has been removed is shown in SEQ ID NO: 3.
アミノ酸が欠失されている領域やアミノ酸の数は、セルロース結合活性を評価することにより決定することができる。セルロース結合ドメインが部分的に欠失されている場合、セルロース結合ドメインをコードするアミノ酸配列の２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、一層好ましくは６０％以上、より一層好ましくは７０％以上、さらに一層好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、欠失されている。典型的には、セルロース結合ドメインのＮ末端側又はＣ末端側から連続してアミノ酸が欠失されているが、好ましくは、Ｎ末端側から連続して複数個のアミノ酸が欠失されている。 The region where the amino acid is deleted and the number of amino acids can be determined by evaluating the cellulose binding activity. When the cellulose binding domain is partially deleted, it is 20% or more of the amino acid sequence encoding the cellulose binding domain, preferably 30% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, more preferably 90% or more are deleted. Typically, amino acids are continuously deleted from the N-terminal side or C-terminal side of the cellulose binding domain, but preferably a plurality of amino acids are continuously deleted from the N-terminal side.
セルロース結合ドメインの不活性化は、タンパク質においてセルロース結合ドメインの一部又は全体が欠失している態様が好ましい。アミノ酸の欠失により、ペプチド鎖が短くなり、異種タンパク質としての合成量を増大させることができる。特に、本タンパク質を、試験管内におけるタンパク質生産や遺伝子工学的に異種タンパク質として微生物宿主等において生産させる場合には、好適である。 The inactivation of the cellulose binding domain is preferably an embodiment in which a part or all of the cellulose binding domain is deleted in the protein. Deletion of amino acids shortens the peptide chain and increases the amount of synthesis as a heterologous protein. In particular, this protein is suitable for production in a microorganism host or the like as a heterogeneous protein in terms of protein production or genetic engineering in a test tube.
あるタンパク質がセルロース結合ドメイン活性（セルロース結合活性）を有しているか否か又はその程度は、例えば、タンパク質とアビセルとの結合力を測定することで評価することができる。具体的には、酢酸緩衝液pH5.0でけん濁したアビセルにタンパク質を添加し攪拌そして氷上にて一定時間静置後の遠心上清のタンパク質量を測定することで評価できる。その遠心上清にタンパク質がないかあるいは少ない時にはセルロース結合ドメイン活性を有すると言える。 Whether or not a certain protein has cellulose-binding domain activity (cellulose-binding activity) can be evaluated, for example, by measuring the binding force between the protein and Avicel. Specifically, the protein can be evaluated by adding the protein to Avicel suspended in acetate buffer pH 5.0, stirring and measuring the amount of protein in the centrifuged supernatant after standing for a certain time on ice. It can be said that it has a cellulose-binding domain activity when there is no or little protein in the supernatant.
セルロース結合活性の不活性化の他の態様としては、セルロース結合ドメインにおける１以上のアミノ酸の置換及び/又は挿入が挙げられる。置換又は挿入されているアミノ酸の部位や個数、置換又は挿入されて新たにセルロース結合ドメイン中に配置されるアミノ酸の種類は、得られた変異体タンパク質につき、セルロース結合活性を評価することで適宜決定することができる。 Other aspects of inactivating cellulose binding activity include substitution and / or insertion of one or more amino acids in the cellulose binding domain. The site and number of amino acids that are substituted or inserted, and the types of amino acids that are newly placed in the cellulose-binding domain after substitution or insertion are determined as appropriate by evaluating the cellulose-binding activity of the obtained mutant protein. can do.
セルロース結合ドメインの不活性化は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオヒドロラーゼIIのセルロース結合活性と比較したとき、当該結合活性より低くなっていればよく、その程度は問わないが、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオヒドロラーゼIIのセルロース結合活性の６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは４０％以下、一層好ましくは３０％以下、より一層好ましくは２０％以下、さらに一層好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下である。 Inactivation of the cellulose-binding domain is not limited as long as it is lower than the cellulose-binding activity of cellobiohydrolase II consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, compared to the cellulose-binding activity. Preferably, it is 60% or less, more preferably 50% or less, still more preferably 40% or less, more preferably 30% or less, more than the cellulose binding activity of cellobiohydrolase II consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. More preferably, it is 20% or less, still more preferably 10% or less, and most preferably 5% or less.
本タンパク質は、セロビオヒドロラーゼ活性を有している。セロビオヒドロラーゼ活性は、例えば、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で１００倍希釈後、１％リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）又は２．５％Ａｖｉｃｅｌを同量添加し（０．５％ＰＳＣ又は１．２５％Ａｖｉｃｅｌ）、４０℃で１６時間反応させ、反応液を、ＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）にて遠心上精の還元糖量を測定することにより、測定できる。セロビオヒドロラーゼ活性の程度は、特に問わないが、セルロース結合活性の不活性化により、本タンパク質のセロビオヒドロラーゼ活性が向上することがわかっている。本タンパク質のセロビオヒドロラーゼ活性は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオヒドロラーゼIIのセロビオヒドロラーゼ活性と比較したとき、好ましくは、当該活性の同等又はそれ以上であり、より好ましくは１１０％以上、さらに好ましくは１２０％以上、一層好ましくは１３０％以上、より一層好ましくは１４０％以上、さらに一層好ましくは１５０％以上、最も好ましくは１６０％以上である。 This protein has cellobiohydrolase activity. The cellobiohydrolase activity is, for example, 100-fold diluted with 50 mM acetate buffer pH 5.0, and then the same amount of 1% phosphate-swelling cellulose (PSC) or 2.5% Avicel is added (0.5% PSC or 1.%). 25% Avicel) at 40 ° C. for 16 hours, and the reaction solution is measured by measuring the amount of reducing sugar in the centrifugal supernatant by TZ assay (Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115). Can be measured. The degree of cellobiohydrolase activity is not particularly limited, but it has been found that cellobiohydrolase activity of this protein is improved by inactivating the cellulose binding activity. The cellobiohydrolase activity of this protein is preferably equal to or more than that of cellobiohydrolase activity of cellobiohydrolase II consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and more preferably 110% or more, more preferably 120% or more, more preferably 130% or more, still more preferably 140% or more, still more preferably 150% or more, and most preferably 160% or more.
本タンパク質は、また、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列においてセルロース結合ドメインが不活性化されつつ、セロビオヒドロラーゼ活性を有するものであってもよい。すなわち、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の変異体であって、セルロース結合活性やセロビオヒドロラーゼ活性を有する改変体において、セルロース結合ドメインが不活性化された態様が挙げられる。典型的には、セロビオヒドロラーゼ活性ドメインにおいては有効な変異を有し、かつセルロース結合ドメインには、セルロース結合活性が不活性化されるような変異を備えるタンパク質が挙げられる。このような本タンパク質においては、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定関係のあるアミノ酸配列において各種態様でセルロース結合ドメインが不活性化されており、しかも、セロビオヒドロラーゼ活性を維持するアミノ酸配列を有している。 This protein may also have cellobiohydrolase activity while the cellulose binding domain is inactivated in the amino acid sequence having a certain relationship with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. That is, for example, a variant of a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which a cellulose binding domain is inactivated in a variant having cellulose binding activity or cellobiohydrolase activity can be mentioned. . Typically, proteins that have an effective mutation in the cellobiohydrolase activity domain and that have a mutation that inactivates the cellulose binding activity in the cellulose binding domain. In such a protein, an amino acid sequence in which the cellulose-binding domain is inactivated in various aspects in the amino acid sequence having a certain relationship with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and maintains cellobiohydrolase activity have.
こうした本タンパク質の他の一態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、欠失、置換及び／又は付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上２５個以下程度である。より好ましくは、１個以上２０個以下である。さらに好ましくは１個以上１５個以下であり、一層このましくは１０個以下であり、より一層好ましくは５個以下である。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。このような態様としては、たとえば、セロビオヒドロラーゼの活性ドメインやセルロース結合ドメインに隣接するリンカードメインの一部又は全部の欠失などが挙げられる。また、セロビオヒドロラーゼ活性向上のためのアミノ酸置換の導入等が挙げられる。 In another embodiment of the present protein, the cellulose binding domain is inactive in an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And a protein having cellobiohydrolase activity. As for the amino acid mutation with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, deletion, substitution and / or addition may be any one kind, or two or more kinds may be combined. The total number of these mutations is not particularly limited, but is preferably about 1 or more and 25 or less. More preferably, it is 1 or more and 20 or less. More preferably, they are 1 or more and 15 or less, More preferably, it is 10 or less, More preferably, it is 5 or less. As an example of amino acid substitution, conservative substitution is preferable, and specific examples include substitution within the following groups. (Glycine, alanine) (valine, isoleucine, leucine) (aspartic acid, glutamic acid) (asparagine, glutamine) (serine, threonine) (lysine, arginine) (phenylalanine, tyrosine). Examples of such an embodiment include deletion of a part or all of the linker domain adjacent to the cellobiohydrolase active domain and the cellulose binding domain. Moreover, introduction | transduction of the amino acid substitution for cellobiohydrolase activity improvement etc. is mentioned.
さらに他の一態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。同一性は好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、一層好ましくは９５％以上である。最も好ましくは、９８％以上である。 Yet another embodiment is a protein having a cellobiohydrolase activity in which the cellulose binding domain is inactivated in the amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Is mentioned. The identity is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more. Most preferably, it is 98% or more.
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。 As used herein, identity or similarity is a relationship between two or more proteins or two or more polynucleotides determined by comparing sequences, as is known in the art. In the art, “identity” means between protein or polynucleotide sequences, as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of such sequences. Means the degree of sequence invariance. Similarity is also the correlation between protein or polynucleotide sequences, as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of partial sequences. Means the degree of More specifically, it is determined by sequence identity and conservation (substitutions that maintain specific amino acids in the sequence or physicochemical properties in the sequence). The similarity is referred to as Similarity in the BLAST sequence homology search result described later. The method for determining identity and similarity is preferably a method designed to align the longest between the sequences to be compared. Methods for determining identity and similarity are provided as programs available to the public. For example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program by Altschul et al. (Eg Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)). The conditions for using software such as BLAST are not particularly limited, but it is preferable to use default values.
さらに他の一態様として、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましく９５％以上、最も好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましく９５％以上、最も好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列において、セルロース結合ドメインが不活性化されており、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。 In yet another embodiment, the DNA encoded by the DNA comprising the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the DNA hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA or a part thereof. Examples thereof include proteins in which the cellulose-binding domain is inactivated and have cellobiohydrolase activity. The stringent condition refers to, for example, a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, a nucleic acid having high base sequence identity, that is, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, with the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Most preferably, the complementary strand of DNA consisting of a base sequence having 97% or more identity is hybridized, and the complementary strand of a nucleic acid having lower homology is not hybridized. More specifically, the sodium salt concentration is 15 to 750 mM, preferably 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM, the temperature is 25 to 70 ° C., preferably 50 to 70 ° C., more preferably 55 to 65 ° C., formamide The condition is that the concentration is 0 to 50%, preferably 20 to 50%, more preferably 35 to 45%. Furthermore, under stringent conditions, the filter washing conditions after hybridization are usually such that the sodium salt concentration is 15 to 600 mM, preferably 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C., preferably It is 55-70 degreeC, More preferably, it is 60-65 degreeC. From the above, as yet another aspect, the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% As described above, a protein having cellobiohydrolase activity in which the cellulose binding domain is inactivated in the amino acid sequence encoded by DNA having a base sequence having 97% or more identity is most preferable.
なお、Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの活性ドメインにおける改変体のアミノ酸配列としては、特開２０１０-４１９９６号公報に開示される各種の改変体のアミノ酸配列が挙げられる。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１０個のアミノ酸置換(T130I/S134Q/S183T/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/Q381S/F382L)を有するアミノ酸配列及び同アミノ酸配列において１５個のアミノ酸置換(T112S/N125K/T130I/S134Q/S183T/Q204K/F206Y/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/I365V/Q381S/F382L)を含むアミノ酸配列が挙げられる。 The amino acid sequences of the variants in the active domain of cellobiohydrolase II derived from Phanerochaete chrysosporium include the amino acid sequences of various variants disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-41996. Further, the amino acid sequence having 10 amino acid substitutions (T130I / S134Q / S183T / A241E / M259I / Q307R / A309S / T342H / Q381S / F382L) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and 15 in the same amino acid sequence Examples include amino acid sequences containing amino acid substitutions (T112S / N125K / T130I / S134Q / S183T / Q204K / F206Y / A241E / M259I / Q307R / A309S / T342H / I365V / Q381S / F382L).
本タンパク質は、P. chrysosporiumから取得したセロビオヒドロラーゼ IIのアミノ酸配列（配列番号２）において、以下の表１に示される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備えることができる。「アミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備える」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に表１から選択される１又は２以上のアミノ酸置換を備えるほか、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列と対比したときに、表１から選択される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備えていることをいう。 This protein can have an amino acid substitution corresponding to one or more amino acid substitutions shown in Table 1 below in the amino acid sequence of cellobiohydrolase II (SEQ ID NO: 2) obtained from P. chrysosporium. “Having an amino acid substitution corresponding to one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence” means that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has one or more amino acid substitutions selected from Table 1, In the amino acid sequence having a certain relationship with the amino acid sequence represented by No. 2, the amino acid corresponding to one or more amino acid substitutions selected from Table 1 when compared with the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 2 It means having a substitution.
なお、アミノ酸置換を備えるとは、当該位置において、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とをそれぞれ特定して意味するほか、結果として「アミノ酸置換」によって特定されるアミノ酸を備えていればよいことを意味する。すなわち、「Ｍ２５９Ｌ」のアミノ酸置換を備えるとは、配列番号２において２５９位に相当する部位にＬ（ロイシン）を備えていることを意味する。以下、本タンパク質が備えることのできる変異であるアミノ酸置換について説明する。 The term “with amino acid substitution” means that the amino acid before substitution and the amino acid after substitution are respectively specified at the position, and as a result, it is only necessary to have an amino acid identified by “amino acid substitution”. Means. That is, having an amino acid substitution of “M259L” means having L (leucine) at the site corresponding to position 259 in SEQ ID NO: 2. Hereinafter, amino acid substitution, which is a mutation that can be included in the present protein, will be described.
本タンパク質は、表２に示す各欄に示す１又は２以上のアミノ酸置換を備えるものであってもよい。なかでも、本タンパク質は、好ましくは、少なくとも、Ｍ２５９Ｌ、Ｍ２５９Ｉ、Ｔ３４２Ｈ、Ｑ３８１Ｓ＋Ｆ３８２Ｌから選択される１種又は２種以上に相当するアミノ酸置換を備えている。これらの各変異に組み合わせて、好ましくは、Ｔ１３０Ｉ及びＳ１３４の双方又はいずれかを含んでいることが好ましい。さらに、追加して、好ましくは、Ｍ２５９Ｉの変異を含んでいる。さらにまた、好ましくは、Ａ２４１Ｅの変異を含んでいることが好ましい。さらに追加して、好ましくは、Ｑ３０７Ｒ＋Ａ３０９Ｓの双方又はいずれかの変異を含んでいる。さらにまた、加えて、Ｓ１８３Ｔの変異を含んでいることが好ましい。さらに追加して、Ｔ１１２Ｓ、Ｎ１２５Ｋ、Ｑ２０４Ｋ、Ｉ３６５Ｖ及びＦ２０６Ｙからなる群から選択される１又は２以上の変異を含んでいることが好ましく、より好ましくは３種以上であり、さらに好ましくは４種以上であり、一層好ましくは５種である。 This protein may have one or more amino acid substitutions shown in each column shown in Table 2. Among them, the present protein preferably has at least one amino acid substitution corresponding to one or more selected from M259L, M259I, T342H, and Q381S + F382L. In combination with each of these mutations, it is preferable that T130I and / or S134 is preferably included. In addition, it preferably contains a M259I mutation. Furthermore, it is preferable that a mutation of A241E is preferably included. In addition, preferably it contains both or any of the mutations of Q307R + A309S. In addition, it preferably contains a mutation of S183T. In addition, it preferably contains one or more mutations selected from the group consisting of T112S, N125K, Q204K, I365V and F206Y, more preferably 3 or more, and still more preferably 4 or more. More preferably, there are 5 types.
以上のことから、好ましい変異体としては、たとえば、少なくとも以下の表３に示す組み合わせのアミノ酸置換を備えるものが挙げられる。なかでも、第３世代以降が好ましく、より好ましくは第４世代以降、さらに好ましくは第５世代以降、一層好ましくは第６世代以降、最も好ましくは第７世代以降である。表３中、Ｓｅｐｔ２５の組み合わせのアミノ酸置換を備え、さらに、Ｔ１１２Ｓ、Ｎ１２５Ｋ、Ｑ２０４Ｋ、Ｉ３６５Ｖ及びＦ２０６Ｙからなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸置換を備えるタンパク質も好ましい。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において部分的な欠失を生じさせたり、アミノ酸の置換、付加を導入するには、公知の各種の手法を採用できる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列や当該配列と一定の関係を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ等の遺伝子情報を改変する方法を用いることができる。例えば、アミノ酸配列において欠失部位を形成するには、ＤＮＡの一部をＰＣＲ等により増幅したり、あるいはこうして部分的に増幅したＤＮＡ断片を適宜結合することで任意の部位に欠失を導入することができる。また、例えば、アミノ酸配列に置換及び／又は付加などの変異を導入して遺伝子情報を改変して本発明のタンパク質を得るには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998を参照することができる。なかでも、エラープローンＰＣＲ等によりランダム変異を導入する分子進化的手法を利用する無細胞タンパク質合成系を採用することが好ましい。エラープローンＰＣＲに適用する無細胞タンパク質合成系としては、公知のあるいは本出願人が出願した特開２００６−６１０８０号公報及び特開２００３−１１６５９０号公報に記載のタンパク質合成系を用いることができる。本出願人によるこれらの無細胞タンパク質合成系を用いることで活性型の酵素を容易に得ることができる。このため、これらのタンパク質合成系が適用されたエラープローンＰＣＲは、本発明のタンパク質を取得する手法として好ましく用いることができる。 Various known techniques can be employed to cause partial deletions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and to introduce amino acid substitutions and additions. For example, a method of modifying gene information such as an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or DNA encoding an amino acid sequence having a certain relationship with the sequence can be used. For example, in order to form a deletion site in an amino acid sequence, a part of DNA is amplified by PCR or the like, or a DNA fragment thus amplified is appropriately combined to introduce a deletion at an arbitrary site. be able to. In addition, for example, in order to obtain a protein of the present invention by introducing a mutation such as substitution and / or addition into an amino acid sequence to obtain the protein of the present invention, a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method equivalent thereto Can be adopted. For example, mutations are introduced using a mutation introduction kit (for example, Mutan-K (manufactured by TAKARA) or Mutan-G (manufactured by TAKARA)) using site-directed mutagenesis. Moreover, gene mutation introduction and chimera genes can be constructed by techniques such as error introduction PCR and DNA shuffling. Error introduction PCR and DNA shuffling are techniques known in the art. For example, for error introduction PCR, Chen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5618-5622 In addition, molecular evolution engineering methods such as DNA shuffling and cassette PCR are described in, for example, Kurtzman, AL, Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, JT, Heinrichs, V., Patten PA, Advances in directed protein evolution. by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol., 12, 361-370, 2001, and Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase See Gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998. Among these, it is preferable to employ a cell-free protein synthesis system that uses a molecular evolution method for introducing random mutations by error-prone PCR or the like. As a cell-free protein synthesis system applied to error-prone PCR, a protein synthesis system described in Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 2006-61080 and 2003-116590 filed by the applicant of the present application can be used. By using these cell-free protein synthesis systems by the present applicant, an active enzyme can be easily obtained. For this reason, error-prone PCR to which these protein synthesis systems are applied can be preferably used as a technique for obtaining the protein of the present invention.
なお、本タンパク質は、決定されたアミノ酸配列や塩基配列に基づいて、化学的な合成方法のほか、遺伝子工学的な方法によって製造され、必要に応じて精製される。 In addition, based on the determined amino acid sequence and base sequence, this protein is produced not only by a chemical synthesis method but also by a genetic engineering method and purified as necessary.
本タンパク質は、セルロース結合ドメインが不活性化されているために、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIやその改変体よりも、基質であるセルロースへの結合能が低減又は喪失している。一方、本タンパク質は、セロビオヒドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼやβ−グルコシダーゼとの相乗効果においても、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等以上の活性を有している。 This protein binds to cellulose, which is a substrate, rather than cellobiohydrolase II derived from Phanerochaete chrysosporium consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and its variants because the cellulose binding domain is inactivated. Performance is reduced or lost. On the other hand, this protein also has an activity equal to or higher than that of the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in cellobiohydrolase activity and synergistic effect with endoglucanase and β-glucosidase.
（セルラーゼ組成物）
本明細書の開示によれば、本タンパク質と、さらに、他のセルラーゼ、たとえば、他のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼからなる群から選択される１種又は２種以上を組み合わせの組成物が提供される。本組成物によれば、本タンパク質の優れたセロビオヒドロラーゼ活性により高いセルロース分解活性を呈することができる。本組成物に含まれる本タンパク質以外のセルラーゼとしては、特に限定しないで、公知のセルラーゼから適宜選択される。例えば、Phanerochaete chrysosporium由来でない他起源のエンドグルカナーゼが挙げられる。他起源由来のエンドグルカナーゼとしては、公知の各種エンドグルカナーゼが挙げられ、これらを単独であるいは２種類以上を適宜組み合わせて用いることができる。たとえば、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼのなかでも、好ましくは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。より好ましくはTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼである。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼは、こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
(Cellulase composition)
According to the disclosure of the present specification, the composition of the present protein and another cellulase, for example, one or more selected from the group consisting of other cellobiohydrolases, endoglucanases and β-glucosidases Things are provided. According to this composition, a high cellulolytic activity can be exhibited due to the excellent cellobiohydrolase activity of this protein. Cellulases other than the present protein contained in the present composition are not particularly limited and are appropriately selected from known cellulases. For example, endoglucanases of other origins not derived from Phanerochaete chrysosporium can be mentioned. Examples of endoglucanases derived from other sources include various known endoglucanases, which can be used alone or in combination of two or more. An example is endoglucanase belonging to GHF5. Among endoglucanases classified as GHF5, preferably, endoglucanase derived from Trichoderma reesei, endoglucanase derived from Aspergillus oryzae, and endoglucanase derived from Aspergillus niger can be preferably used. More preferred is an endoglucanase derived from Trichoderma reesei endoglucanase Aspergillus niger. The endoglucanase classified as GHF5 can be used by appropriately combining one or more selected from such endoglucanases.
エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ１２に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼが挙げられる。また、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼであってもよい。こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ７及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼであってもよい。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。 The endoglucanase includes endoglucanase belonging to GHF12. Among these, endoglucanase derived from Trichoderma reesei, endoglucanase derived from Aspergillus niger, and endoglucanase derived from Aspergillus oryzae can be mentioned. Further, it may be an endoglucanase derived from Phanerochaete chrysosporium. One or more selected from these endoglucanases can be used in appropriate combination. The endoglucanase may be an endoglucanase belonging to GHF7 and GHF45. Among these, an endoglucanase derived from Trichoderma reesei can be preferably used.
本セルラーゼ組成物は、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼを含んでいてもよい。Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼは、セロビオヒドロラーゼII及びその改変体をPhanerochaete chrysosporiumの培養物等から取得した場合においてセロビオヒドロラーゼII及びその改変体とともに容易に取得できる。 The cellulase composition may contain an endoglucanase derived from Phanerochaete chrysosporium. The endoglucanase derived from Phanerochaete chrysosporium can be easily obtained together with cellobiohydrolase II and its variant when cellobiohydrolase II and its variant are obtained from a culture of Phanerochaete chrysosporium or the like.
本セルラーゼ組成物は、エンドグルカナーゼ以外の他のセルラーゼを含むことができる。例えば、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼＩを含有することができる。セロビオヒドロラーゼＩは、セロビオヒドロラーゼＩが、セロビオヒドロラーゼII等と協動することにより、一層セルロース分解の相乗効果が発揮される。セロビオヒドロラーゼＩは、Phanerochaete chrysosporium由来であってもよいし、他起源であってもよい。 The cellulase composition may contain other cellulases other than endoglucanases. For example, cellobiohydrolase I belonging to GHF7 can be contained. As for cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase I cooperates with cellobiohydrolase II and the like, so that a synergistic effect of cellulose degradation is further exhibited. Cellobiohydrolase I may be derived from Phanerochaete chrysosporium or from other sources.
本セルラーゼ組成物は、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のセルラーゼ生産菌の培養物（培養上清であってもよい）から取得された２種類以上のセルラーゼを含有していてもよい。セルラーゼ生産菌としては、特に限定されないで、適宜選択できるが、エンドグルカナーゼの起源としてTrichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae等が好ましく挙げられる。より好ましくは、Trichoderma reeseiである。 The present cellulase composition may contain two or more cellulases obtained from a culture of cellulase-producing bacteria other than Phanerochaete chrysosporium (may be a culture supernatant). The cellulase-producing bacterium is not particularly limited and can be appropriately selected. Preferred examples of endoglucanase include Trichoderma reesei, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae and the like. More preferred is Trichoderma reesei.
本セルラーゼ組成物は、化学的あるいは遺伝子工学的に本タンパク質及び必要に応じて他のセルラーゼを生産し、組み合わせることによって得ることができる。本セルラーゼ組成物を構成する全てのセルラーゼを同一の宿主細胞で遺伝子工学的に生産し、その培養上清や培養菌体を回収することによって、本セルラーゼ組成物を得るようにしてもよい。 This cellulase composition can be obtained by producing and combining the present protein and, if necessary, other cellulases chemically or genetically. You may make it obtain this cellulase composition by producing all the cellulases which comprise this cellulase composition by genetic engineering with the same host cell, and collect | recovering the culture supernatant and culture | cultivation microbial cells.
本セルラーゼ組成物は、本タンパク質及び他のセルラーゼを、それぞれ精製したものとして含有していてもよいし、未精製タンパク質として他タンパク質やその他の成分を含んでいてもよい。また、その製剤形態は、特に限定されず、固形製剤（粉末（凍結乾燥体等）、タブレット等、顆粒等）であってもよいし、溶液（流通時においては凍結体であることが好ましい。）であってもよい。 The present cellulase composition may contain the present protein and other cellulases as purified ones, or may contain other proteins and other components as unpurified proteins. The form of the preparation is not particularly limited, and may be a solid preparation (powder (lyophilized body, etc.), tablet, granule, etc.) or a solution (a frozen body during distribution). ).
（タンパク質複合体）
本明細書に開示されるタンパク質複合体は、本タンパク質と、本タンパク質をコヘシン−ドックリン結合によりコヘシンタンパク質上に備えている。ある種の細菌が、複数種類のセルラーゼを保持するタンパク質構造体を自己細胞表層に構築することが知られており、当該タンパク質構造体がセルロソームとして知られている。セルロソームは、セルラーゼが、スキャホールディンタンパク質に保持されて構成されており、セルロソームとスキャホールディンタンパク質とは、それぞれが備えるドックリンドメインとコヘシンドメインとの間の結合、すなわち、コヘシン−ドッケリン結合により結合されている。公知のセルロソームにおけるドックリンドメイン及びコヘシンドメインのアミノ酸配列は既にいくつか開示されている。コヘシン−ドックリン結合は、非共有結合性であって、そのアミノ酸配列に依存した水素結合等に基づくと考えられる。したがって、こうした開示に従い、ドックリンドメインを付加した本タンパク質と１又は２以上のコヘシンドメインを備えるスキャホールディンタンパク質とにより、人工的なセルロソーム、すなわち、タンパク質複合体を構築することができる。
(Protein complex)
The protein complex disclosed in the present specification includes the present protein and the present protein on the cohesin protein through a cohesin-docklin bond. It is known that a certain kind of bacteria constructs a protein structure holding a plurality of types of cellulases on the surface of its own cell, and the protein structure is known as a cellulosome. The cellulosome is composed of cellulase held in a scaffoldin protein. The cellulosome and scaffoldin protein are bound between the dockrin domain and the cohesin domain, ie, the cohesin-dockerin bond. Are combined. Several amino acid sequences of the dockrin domain and cohesin domain in known cellulosomes have already been disclosed. The cohesin-docklin bond is considered to be non-covalent and based on a hydrogen bond depending on the amino acid sequence. Therefore, according to this disclosure, an artificial cellulosome, that is, a protein complex, can be constructed by the present protein to which a dockrin domain is added and a scaffoldin protein having one or more cohesin domains.
本タンパク質複合体においては、本タンパク質には、ドックリンドメインが付加されている。ドックリンドメインは、コヘシン−ドックリン結合により後述するコヘシンタンパク質に本タンパク質を結合させる部位である。ドックリンドメインは、例えば、公知のセルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼの一部に備えられている。本セルラーゼ複合体に用いるドックリンドメインとしては、公知の各種のセルロソーム生産微生物のセルラーゼのドックリンドメインから選択される。例えば、C. thermocellumのエンドグルカナーゼのドックリンドメインを含むアミノ酸配列が挙げられる。ドックリンリンドメインは、活性ドメインのＮ末端側及びＣ末端側のいずれの側にあってもよいが、好ましくは、Ｃ末端側に配置される。 In the present protein complex, a dockerin domain is added to the present protein. A dockerin domain is a site | part which makes this protein couple | bond with the cohesin protein mentioned later by a cohesin-docklin bond. The dockerin domain is provided, for example, in a part of cellulase constituting the cellulosome of a known cellulosome-producing microorganism. The dockerin domain used in the present cellulase complex is selected from the known dockerin domains of cellulases of various cellulosome-producing microorganisms. For example, an amino acid sequence containing the dockrin domain of C. thermocellum endoglucanase can be mentioned. The dockerin domain may be on either the N-terminal side or the C-terminal side of the active domain, but is preferably located on the C-terminal side.
本タンパク質複合体は、本セルラーゼ組成物が含みうる他のセルラーゼがコヘシンタンパク質に保持されていてもよい。他のセルラーゼに関しても、本タンパク質と同様に、ドックリンドメインが付加されている。他のセルラーゼに付加されるドックリンドメインは、本タンパク質に付加されるドックリンドメインと同一であってもよいし異なっていてもよい。 In the present protein complex, another cellulase that may be contained in the present cellulase composition may be retained in the cohesin protein. For other cellulases, a dockerin domain is added as in the present protein. The dockerin domain added to other cellulases may be the same as or different from the dockerin domain added to the present protein.
コヘシンタンパク質は、コヘシンタンパク質は、本タンパク質が備えるドックリンドメインを結合する１又は２以上のコヘシンドメインを有している。これにより、コヘシンタンパク質は、本タンパク質をコヘシン−ドックリン結合で保持でき、本タンパク質複合体の骨格として機能する。また、本タンパク質複合体は、他のセルラーゼを保持するための異なるコヘシンドメインの組み合わせあるいは配列を有するコヘシンタンパク質を備えていてもよい。 The cohesin protein has one or more cohesin domains that bind to the dockrin domain of the protein. Thereby, the cohesin protein can hold | maintain this protein by a cohesin-docklin coupling | bonding, and functions as a frame | skeleton of this protein complex. In addition, the protein complex may include a cohesin protein having a combination or sequence of different cohesin domains for holding other cellulases.
（コヘシンドメイン）
コヘシンタンパク質が備える、１又は２以上のコヘシンドメインは、セルロソームのスキャホールディンタンパク質が備えるコヘシンドメインに由来している。コヘシンドメインは、セルロソーム生産微生物の形成するセルロソームにおけるタイプＩ〜III骨格タンパク質に備えられる触媒活性のあるセルラーゼ等を非共有結合で結合するドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等）。すなわち、コヘシンドメインとしては、セルロソームのタイプＩ骨格タンパク質上のタイプＩコヘシンドメイン、同タイプII骨格タンパク質上のタイプIIコヘシンドメイン及びタイプIII骨格タンパク質上のタイプIIIコヘシンドメインが挙げられる。こうした各種タイプのコヘシンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプのコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
(Cohesin domain)
One or more cohesin domains provided in the cohesin protein are derived from the cohesin domain provided in the cellulosomal scaffoldin protein. The cohesin domain is known as a domain that binds a catalytically active cellulase or the like provided in type I to III skeletal proteins in cellulosomes formed by cellulosome-producing microorganisms (Nakaku et al., Protein nucleic acid enzyme, Vol.44, No.10 (1999), p41-p50, Demain, AL, et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69 (1), 124-54 (2005), Doi, RH, et al., J. Bacterol., 185 (20), 5907-5914 (2003), etc.). That is, the cohesin domain includes a type I cohesin domain on a cellulosome type I skeletal protein, a type II cohesin domain on the same type II skeletal protein, and a type III cohesin domain on a type III skeletal protein. Many of these types of cohesin domains have been sequenced in various cellulosome-producing microorganisms. The amino acid sequences and DNA sequences of these various types of cohesins are various protein databases and DNA sequence databases accessible via NCBI HP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), etc. Can be obtained more easily.
コヘシンドメインは、こうしたコヘシンドメインに由来するドメインであって、キメラタンパク質のドックリンドメインと結合することができる。セルラーゼの活性ドメインへのドックリンドメインのキメラ化は活性ドメインの活性が意図せずに低下することなどにより困難な場合があることから、キメラタンパク質のドックリンドメインに応じてコヘシンドメインを選択することができる。また、コヘシン−ドックリン結合の強度等も考慮してコヘシンドメインを選択することができる。 A cohesin domain is a domain derived from such a cohesin domain and can bind to the dockerin domain of the chimeric protein. Chimerization of the dockerin domain into the active domain of cellulase may be difficult due to unintentionally reduced activity of the active domain, so select the cohesin domain according to the dockerin domain of the chimeric protein be able to. In addition, the cohesin domain can be selected in consideration of the strength of the cohesin-docklin bond and the like.
本タンパク質複合体にあっては、例えば、キメラタンパク質のドックリンドメインが例えば、C. thermocellumのcelＡのドックリンドメインに対して、C. thermocellumのスキャホールディンタンパク質のコヘシンドメインが挙げられる。 In the present protein complex, for example, the dockerin domain of the chimeric protein may be, for example, the cohesin domain of the C. thermocellum scaholdin protein relative to the dockin domain of celA of C. thermocellum.
本タンパク質複合体は、タンパク質の複合体として、それ自体独立した形態であってもよいし、適当なキャリアに固定化ないし保持されていてもよい。また、後述するように、酵母等の微生物の表層に提示された状態であってもよい。本セルラーゼ複合体は、例えば、それぞれのタンパク質を公知のタンパク質製造方法により取得し、これらのタンパク質を接触させる条件下において、コヘシンタンパク質に対してキメラタンパク質を自己集合させることにより、本セルラーゼ複合体を取得できる。 The present protein complex may be an independent form as a protein complex, or may be immobilized or held on an appropriate carrier. Moreover, the state shown on the surface layer of microorganisms, such as yeast, may be sufficient so that it may mention later. The cellulase complex is obtained by, for example, obtaining each protein by a known protein production method, and self-assembling the chimeric protein with the cohesin protein under the conditions in which these proteins are brought into contact with each other. Can be obtained.
また、本タンパク質複合体は、その構成タンパク質のうち１又は２以上を分泌発現する微生物の培養上清又はそのタンパク質精製物を混合してすべての構成タンパク質を接触させて自己集合させることによって取得できる。なお、構成タンパク質のすべてが微生物によって分泌発現されなくてもよく、必要に応じ微生物によって生産されない構成タンパク質を別途製造して混合してもよい。また、構成タンパク質のすべてを分泌発現する微生物の場合、この微生物の培養上清に、これらタンパク質が自己集合可能な状態で含まれるため、その培養上清に、本タンパク質複合体を取得できる。 In addition, the present protein complex can be obtained by mixing a culture supernatant of a microorganism that secretes and expresses one or more of its constituent proteins or a protein purified product thereof, bringing all the constituent proteins into contact with each other and allowing them to self-assemble. . Note that not all of the constituent proteins may be secreted and expressed by the microorganism, and if necessary, constituent proteins that are not produced by the microorganism may be separately produced and mixed. In addition, in the case of a microorganism that secretes and expresses all of the constituent proteins, since the protein is contained in the culture supernatant of the microorganism in a state capable of self-assembly, the protein complex can be obtained in the culture supernatant.
（本タンパク質をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む発現用コンストラクト）
本明細書に開示されるＤＮＡは、本タンパク質をコードしている。かかるＤＮＡは、本タンパク質をコードしている限り、異なるコドンを用いてコードされるＤＮＡも含まれる。本明細書に開示される発現用コンストラクトは、本タンパク質をコードするＤＮＡを含んでいる。本タンパク質をコードするＤＮＡは、発現用コンストラクトを導入しようとする宿主細胞において本タンパク質を発現可能に保持されていればよい。例えば、宿主細胞で作動可能なプロモーターの制御下に連結されるとともに適切なターミネーターをその下流に有した状態で保持されている。プロモーターは、構成的プロモーターであっても誘導的プロモーターであってもよい。本発現用コンストラクトにおいて、このような状態のＤＮＡは、宿主染色体内に組み込み可能に備えられていてもよいし、染色体外に保持可能に備えられていてもよい。本発現用コンストラクトには、こうした外来ＤＮＡの導入に伴って、宿主において利用可能な選択マーカー遺伝子も同時に保持されていることが好ましい。本発現用コンストラクトは、特に真核微生物、好ましくは、酵母での本タンパク質の発現用であることが好ましい。
(DNA encoding this protein, expression construct containing the DNA)
The DNA disclosed herein encodes this protein. Such DNA includes DNA encoded using different codons as long as it encodes the present protein. The expression construct disclosed in the present specification contains DNA encoding the present protein. The DNA encoding the protein may be retained so that the protein can be expressed in the host cell into which the expression construct is to be introduced. For example, it is linked under the control of a promoter operable in the host cell and is held in a state having an appropriate terminator downstream thereof. The promoter may be a constitutive promoter or an inducible promoter. In the expression construct, the DNA in such a state may be provided so as to be able to be incorporated into the host chromosome, or may be provided so as to be able to be held outside the chromosome. It is preferable that the present expression construct simultaneously retains a selectable marker gene that can be used in the host as the foreign DNA is introduced. The present expression construct is particularly preferably used for expression of the present protein in a eukaryotic microorganism, preferably yeast.
本発現用コンストラクトは、本タンパク質を既に説明したタンパク質複合体を構成可能な形態で発現可能に構築されていてもよい。すなわち、本タンパク質に対してドックリンドメインを付加した融合タンパク質を発現可能に形成されていてもよい。さらに、タンパク質複合体を構成可能な発現用コンストラクトとして、コヘシンタンパク質をコードするＤＮＡを含む、コヘシンタンパク質の発現用コンストラクトを構築してもよい。こうした発現コンストラクトにおいて、融合タンパク質やコヘシンタンパク質のコード化ＤＮＡは、本タンパク質をコードするＤＮＡと同様、各種形態でコンストラクトに備えられる。 The expression construct may be constructed so that it can be expressed in a form that can constitute the protein complex that has already been described for the protein. That is, it may be formed so that a fusion protein in which a dockerin domain is added to the present protein can be expressed. Further, as a construct for expression capable of constituting a protein complex, a construct for expressing a cohesin protein including DNA encoding the cohesin protein may be constructed. In such an expression construct, the encoded DNA of the fusion protein or cohesin protein is prepared in various forms in the same manner as the DNA encoding the present protein.
（発現用ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞、上記タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示する真核微生物）
本明細書に開示される形質転換細胞は、本発現用ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞である。本形質転換細胞は、本発現用ＤＮＡコンストラクトによって形質転換されることにより、本タンパク質を発現可能となっている。
(Cells transformed with expression DNA constructs, eukaryotic microorganisms that secrete the above proteins extracellularly or present them on the cell surface)
The transformed cell disclosed in the present specification is a cell transformed with the DNA construct for expression. The transformed cell can express the protein by being transformed with the expression DNA construct.
本形質転換細胞は、本タンパク質又は本タンパク質複合体を発現可能な細胞であればよく、その種類を限定しないが、本タンパク質の生産及び回収を考慮すると、大腸菌などの細菌等が挙げられるが、好ましくは、本タンパク質によるセルロースの分解及び資化のための真核微生物である。真核微生物は、特に限定しないが、例えば、公知の各種酵母を利用できる。後述するエタノール発酵等を考慮すると、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。また、真核微生物は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soya）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）等の麹菌であってもよい。異種タンパク質を大量に発現させるには、セルラーゼ非生産菌がより好ましい。また、Trichoderma reeseiなどのセルラーゼ生産菌で生産させることも好ましい。本タンパク質は、セルロース結合ドメインが不活性化されているため、セルラーゼ生産菌が生産するセルロース結合ドメインを有するセルラーゼとは異なる場所で働くことができる。したがって、セルラーゼ生産菌において本タンパク質を生産させることで、全体としてセルロース分解活性の高いセルラーゼの組み合わせ（セルラーゼ製剤）を提供できることになる。 The transformed cell may be any cell that can express the present protein or the present protein complex, and the type thereof is not limited. However, in consideration of production and recovery of the present protein, bacteria such as Escherichia coli may be mentioned. Preferably, it is a eukaryotic microorganism for degradation and assimilation of cellulose by the present protein. The eukaryotic microorganism is not particularly limited, and for example, various known yeasts can be used. In consideration of ethanol fermentation described later, yeasts of the genus Saccharomyces cerevisiae such as Saccharomyces cerevisiae, yeasts of the genus Schizosaccharomyces pombe such as Schizosaccharomyces pombe, Candida shehatae, etc. Yeast of the genus Candida, yeast of the genus Pichia such as Pichia stipitis, yeast of the genus Hansenula, yeast of the genus Trichosporon, yeast of the genus Brettanomyces, the genus Pachysolen And yeast of the genus Yamadazyma, yeasts of the genus Kluyveromyces such as Kluyveromyces marxianus and Kluveromyces lactis. Of these, Saccharomyces yeasts are preferable from the viewpoint of industrial availability. Of these, Saccharomyces cerevisiae is preferable. In addition, eukaryotic microorganisms are Aspergillus oryzae, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus soya, Aspergillus soyya, Aspergillus soya Aspergillus (Aspergillus kawachii), Aspergillus awamori (Aspergillus saitoi), Aspergillus saitoi, etc. may be used. Cellulase non-producing bacteria are more preferable for expressing a large amount of heterologous protein. Moreover, it is also preferable to produce it with a cellulase-producing bacterium such as Trichoderma reesei. Since this cellulose-binding domain is inactivated, this protein can work in a different place from a cellulase having a cellulose-binding domain produced by a cellulase-producing bacterium. Therefore, by producing this protein in a cellulase-producing bacterium, a cellulase combination (cellulase preparation) having high cellulolytic activity as a whole can be provided.
本形質転換細胞は、本形質転換細胞のセルロースの分解への利用を考慮すると、本タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示するものであることが好ましい。本タンパク質に細胞外分泌性や細胞表層提示性を付与するには、公知の分泌シグナルや表層提示用のシステムを用いることができる。例えば、分泌シグナルや凝集性タンパク質又はその一部のアミノ酸配列が付与される。分泌シグナルとしては、例えば、Rhizopus oryzaeやC. albicansのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーなどが挙げられる。また、凝集性タンパク質としては、α−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドが挙げられる。また、所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。 In consideration of the use of the transformed cell for cellulose degradation, the transformed cell is preferably one that secretes the protein outside the cell or presents it on the cell surface. In order to impart extracellular secretion properties and cell surface presentation properties to this protein, known secretion signals and surface layer presentation systems can be used. For example, a secretory signal, an aggregating protein, or a part of the amino acid sequence is given. Examples of the secretion signal include secretion signals of glucoamylase genes of Rhizopus oryzae and C. albicans, yeast invertase leader, α factor leader and the like. Examples of the aggregating protein include a peptide consisting of 320 amino acid residues in the 5 'region of the SAG1 gene encoding α-agglutinin. Polypeptides and techniques for displaying a desired protein on the cell surface are disclosed in WO01 / 79483, JP2003-235579, WO2002 / 042483, WO2003 / 016525, and JP2006. No. 136223, Fujita et al. (Fujita et al., 2004. Appl Environ Microbiol 70: 1207-1212 and Fujita et al., 2002. Appl Environ Microbiol 68: 5136-5141.), Murai et al., 1998. Appl Environ Microbiol 64: 4857 -4861.
本形質転換細胞は、本タンパク質複合体を細胞外に分泌又は細胞表層に提示するものであることも好ましい。本形質転換細胞は、好ましくは、コヘシンタンパク質を細胞表層提示し、本タンパク質を細胞外に分泌して、コヘシンタンパク質に本タンパク質をコヘシン−ドッケリン結合を介して保持させて、タンパク質複合体を細胞表層に提示する。 The transformed cell is also preferably one that secretes the protein complex extracellularly or presents it on the cell surface. The transformed cell preferably presents the cohesin protein on the surface of the cell, secretes the protein outside the cell, allows the cohesin protein to retain the protein via a cohesin-dockerin bond, and forms a protein complex. Present on the cell surface.
本タンパク質、本タンパク質複合体及びこれらを細胞外に分泌又は細胞表層に提示する細胞、好ましく酵母などの真核微生物は、向上されたセロビオヒドロラーゼ活性及び増強された相乗効果により、セルロースの分解、糖化、及び糖化と発酵とを同時進行させるＣＢＰ（連結バイオプロセス（糖化発酵同時進行））において、セルロースの分解効率を高めて、セルロースの効率的利用を具現化することができる。 The present protein, the present protein complex, and cells that secrete them outside the cell or present them on the cell surface, preferably eukaryotic microorganisms such as yeast, are able to decompose cellulose by improved cellobiohydrolase activity and enhanced synergistic effect, In CBP (linked bioprocess (simultaneous progress of saccharification and fermentation)) in which saccharification and saccharification and fermentation proceed simultaneously, the decomposition efficiency of cellulose can be increased and the efficient use of cellulose can be realized.
以上説明した本明細書に開示される形質転換細胞は、いずれも、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて作製することができる。真核微生物などの宿主細胞の形質転換のためのベクター及びその構築方法は、当業者において周知であって、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に開示されている。また、コヘシンタンパク質やドックリンドメインを有するタンパク質を真核微生物において発現させるためのベクター及びその構築方法も、同様に、当業者において周知である。また、形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることも、同様に当業者において周知である。 Any of the transformed cells disclosed in the present specification described above can be prepared according to the method described in Molecular Cloning 3rd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, etc. . Vectors for the transformation of host cells such as eukaryotic microorganisms and methods for their construction are well known to those skilled in the art and disclosed in Molecular Cloning 3rd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, etc. Yes. Similarly, vectors for expressing cohesin proteins and proteins having a dockrin domain in eukaryotic microorganisms and construction methods thereof are also well known to those skilled in the art. In addition, for transformation, various conventionally known methods such as transformation method, transfection method, conjugation method, protoplast method, electroporation method, lipofection method, lithium acetate method and the like can be used as well. Well known in the art.
なお、本明細書の開示によれば、本セルラーゼ複合体を構成する第１〜第３のキメラタンパク質及び当該キメラタンパク質をコードするＤＮＡも提供される。 In addition, according to the indication of this specification, the DNA which codes the 1st-3rd chimeric protein which comprises this cellulase complex, and the said chimeric protein is also provided.
（セルロースの分解産物の生産方法）
本明細書に開示されるセルロースの分解産物の生産方法は、本明細書の開示によれば、本タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解する工程、を備えることができる。本方法によれば、セロビオヒドロラーゼ活性が向上した本タンパク質を用いることにより、効率的にセルロースを分解できる。分解工程で用いる１種又は２種以上のセルラーゼとしては、本セルラーゼ組成物に含まれうる他のセルラーゼから適宜選択して用いることができる。分解工程においては、セルラーゼは、本セルラーゼ組成物として供給されてもよいし、本タンパク質複合体として提供されていてもよい。分解工程における処理温度や時間等の条件は、用いるセルラーゼの種類及びセルロースの供給形態によって適宜設定することができる。
(Production method of cellulose degradation products)
According to the disclosure of the present specification, the method for producing a degradation product of cellulose disclosed in the present specification comprises the step of decomposing cellulose using one or more cellulases containing the present protein. Can do. According to this method, cellulose can be efficiently decomposed by using the present protein having improved cellobiohydrolase activity. As 1 type (s) or 2 or more types of cellulases used at a decomposition | disassembly process, it can select from the other cellulases which can be contained in this cellulase composition suitably, and can use them. In the decomposition step, cellulase may be supplied as the present cellulase composition or may be provided as the present protein complex. Conditions such as treatment temperature and time in the decomposition step can be appropriately set depending on the type of cellulase used and the supply form of cellulose.
本明細書において、セルロースとは、バイオマスから他の成分から分離工程を経たセルロースとして供給されてもよいし、リグニン、ヘミセルロース及び／又はペクチンが共存する未処理あるいは部分的な前処理を施したバイオマスなどセルロースを含有する材料として供給されてもよい。こうしたバイオマス資源としては、稲ワラ、麦ワラ、バガス、枯れ草等の廃棄資源のほか、未利用資源であってもよい。また、本明細書において、セルロース分解産物としては、セルロースの低分子化物であればよく、グルコース、そのオリゴマー、セロビオース等が挙げられる。 In the present specification, the cellulose may be supplied as a cellulose that has undergone a separation step from other components from biomass, or biomass that has been subjected to untreated or partial pretreatment in which lignin, hemicellulose, and / or pectin coexist. For example, it may be supplied as a material containing cellulose. Such biomass resources may be waste resources such as rice straw, wheat straw, bagasse, and dead grass, as well as unused resources. Moreover, in this specification, as a cellulose degradation product, what is necessary is just the low molecular weight thing of a cellulose, and glucose, its oligomer, cellobiose etc. are mentioned.
（有用物質の生産方法）
本明細書の開示によれば、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、本タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解してセルロース分解産物を取得する工程と、微生物によりセルロース分解産物を含む炭素源を発酵して、前記有用物質を生産する工程と、を備える、方法が提供される。本生産方法によれば、本タンパク質を用い、向上したセロビオヒドロラーゼ活性がセルロースの分解に寄与するため、効率的にセルロースを分解することができる。本生産方法では、セルロースの分解工程と、当該分解工程で得られたセルロース分解産物を含む炭素源を微生物により発酵する工程と、をそれぞれ独立して実施することができる。したがって、セルロースの分解工程は、本セルラーゼ組成物や本タンパク質複合体を、酵素製剤として用いてセルロースを分解し、その後、このセルロース分解物を発酵工程に供給して発酵してもよい。
(Useful substance production method)
According to the disclosure of the present specification, a method for producing a useful substance by fermentation of microorganisms, wherein one or two or more cellulases containing the present protein are used to decompose cellulose to obtain a cellulose degradation product. There is provided a method comprising: a step of fermenting a carbon source containing a cellulose degradation product by a microorganism to produce the useful substance. According to this production method, since the improved cellobiohydrolase activity contributes to the degradation of cellulose using this protein, it is possible to efficiently degrade the cellulose. In this production method, the cellulose decomposition step and the step of fermenting the carbon source containing the cellulose decomposition product obtained in the decomposition step with microorganisms can be carried out independently. Therefore, in the cellulose decomposition step, the cellulase composition or the protein complex may be used as an enzyme preparation to decompose cellulose, and then the cellulose decomposition product may be supplied to the fermentation step for fermentation.
本明細書の開示によれば、発酵のための微生物の細胞外に分泌又は細胞表層に提示される本タンパク質を含む、１種又は２種以上のセルラーゼの存在下、前記微生物を用いて、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備えることができる。このような生産方法によれば、セロビオヒドロラーゼ活性の向上したタンパク質を細胞外に発現する発酵用微生物を用いることで、いわゆる糖化・発酵同時プロセス（ＣＢＰ）を効率的に行うことができる。１種又は２種以上のセルラーゼは、全て発酵用微生物の細胞表層に提示されていてもよいし、部分的に細胞外から添加されていてもよい。こうしたセルラーゼは、発酵用微生物の表層において本タンパク質複合体を構築していてもよい。 According to the disclosure of the present specification, cellulose is used in the presence of one or more cellulases containing the present protein secreted outside the cells of microorganisms for fermentation or displayed on the cell surface. And a step of fermenting a carbon source containing at least the above-mentioned useful substance. According to such a production method, a so-called simultaneous saccharification / fermentation process (CBP) can be efficiently performed by using a fermentation microorganism that expresses a protein having improved cellobiohydrolase activity outside the cell. One kind or two or more kinds of cellulases may all be presented on the cell surface of the fermentation microorganism, or may be partially added from outside the cell. Such cellulase may construct the present protein complex in the surface layer of the microorganism for fermentation.
発酵用の微生物は、酵母などのエタノール生産微生物や麹菌等の真核微生物を好ましく用いることができる。微生物は、人工的に取得された微生物であってもよい。例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して得られる本来の代謝物でない化合物を産生可能に遺伝子工学的に改変したものであってもよい。このような微生物を用いることで、例えば、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリンの生産、プラスチック・化成品原料を生産するなどのバイオリファイナリー技術に適用できる。有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましく、上記したように、バイオリファイナリー技術全般にわたる物質を対象とすることができる。 As the microorganism for fermentation, an ethanol-producing microorganism such as yeast and a eukaryotic microorganism such as koji mold can be preferably used. The microorganism may be an artificially obtained microorganism. For example, it may be genetically engineered so that it can produce a compound that is not the original metabolite obtained by replacing or adding one or more enzymes in the metabolic system from glucose by genetic recombination. Good. By using such microorganisms, for example, biochemicals such as the production of fine chemicals (coenzyme Q10, vitamins and their raw materials, etc.) by adding an isoprenod synthesis pathway, the production of glycerin by modification of glycolysis, and the raw materials for plastics and chemical products. Applicable to refinery technology. Although it does not specifically limit as a useful substance, The thing which can produce | generate microorganisms using glucose is preferable, and as above-mentioned, the substance over the biorefinery technique can be made into object.
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作は既出のMolecular Cloningに従い行った。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to these Examples. The gene recombination operation described below was performed according to the previously described Molecular Cloning.
（セルロース結合ドメインを有しないPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの合成）
ファネロケーテ由来セロビオヒドラーゼII（ＰｃＣＢＨ２）はセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）と触媒ドメインがリンカーでつながった構造を持っている。今回ＣＢＤ機能を喪失させるため、ＰｃＣＢＨ２のＣＢＤ部位を取り除き、「リンカー−触媒ドメイン」からなるペプチドを合成した。
(Synthesis of cellobiohydrolase II from Phanerochaete chrysosporium without cellulose binding domain)
Phanerocatete cellobiohydrase II (PcCBH2) has a structure in which a cellulose-binding domain (CBD) and a catalytic domain are connected by a linker. In order to lose the CBD function this time, the CBD site of PcCBH2 was removed, and a peptide consisting of “linker-catalyst domain” was synthesized.
（ＣＢＤを欠失したPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの試験内合成のためのＤＮＡ断片の調製）
pET23bのNdeI/HindIIIにファネロケーテ由来セロビオヒドラーゼ遺伝子（配列番号１）を挿入したプラスミドpET23b_PcCBH2wtをテンプレートに、２種類のオリゴマー配列（5’-GGATCTGCGGTCACGACCACCTCCGTT -3’（配列番号４）, 5’- CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’（配列番号５））をプライマーとしてインバースＰＣＲを行った。取得したＰＣＲ産物につき、アガロースゲル電気泳動、ゲル染色にて目的バンドを取り出し、ゲル中のＤＮＡをキット（Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-up System、Promega）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ断片をポリヌクレオチドキナーゼ（New England BioLabs）で両5’- 末端をリン酸化後、ライゲーションキット(DNA Ligation kit、Takara)を用いてライゲーション反応をさせた。ライゲーション産物を大腸菌DH5α株に導入し、その形質転換体を培養後、プラスミド抽出精製キット（QIAprep Spin Miniprep Kit、Qiagen）で目的のＤＮＡ断片を含むプラスミドを取り出した。ＣＢＤ部位の欠失は、シーケンスにより確認した。
(Preparation of DNA fragment for in-situ synthesis of cellobiohydrolase II from Phanerochaete chrysosporium lacking CBD)
Two types of oligomer sequences (5'-GGATCTGCGGTCACGACCACCTCCGTT-3 '(SEQ ID NO: 4), 5'- CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT, using the plasmid pET23b_PcCBH2wt into which the cellobiohydrase gene (SEQ ID NO: 1) was inserted into NdeI / HindIII of pET23b Inverse PCR was performed using -3 ′ (SEQ ID NO: 5) as a primer. For the obtained PCR product, the target band was taken out by agarose gel electrophoresis and gel staining, and the DNA in the gel was extracted using a kit (Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System, Promega). The extracted DNA fragment was phosphorylated at both 5′-ends with a polynucleotide kinase (New England BioLabs), and then ligated using a ligation kit (DNA Ligation kit, Takara). The ligation product was introduced into E. coli DH5α strain, the transformant was cultured, and a plasmid containing the target DNA fragment was taken out using a plasmid extraction purification kit (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen). The deletion of the CBD site was confirmed by sequencing.
（ＣＢＤを欠失したPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼII改変体の試験内合成のためのＤＮＡ断片の調製）
次いで、ＣＢＨ２改変体として、Sept25：PcCBH2に１０個のアミノ酸置換(T130I/S134Q/S183T/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/Q381S/F382L)を行った改変体及びMall4：PcCBH2に１５個のアミノ酸置換(T112S/N125K/T130I/S134Q/S183T/Q204K/F206Y/A241E/M259I/Q307R/A309S/T342H/I365V/Q381S/F382L)を行った改変体につき、それぞれＣＢＤを欠失させたＤＮＡ断片を、ＰｃＣＢＨ２についてのＤＮＡ断片を含むプラスミド構築に準じて調製した。
(Preparation of DNA fragments for in-situ synthesis of cellobiohydrolase II variants derived from Phanerochaete chrysosporium lacking CBD)
Next, as a CBH2 variant, a variant in which 10 amino acid substitutions (T130I / S134Q / S183T / A241E / M259I / Q307R / A309S / T342H / Q381S / F382L) were made in Sept25: PcCBH2, and 15 in Mall4: PcCBH2 For the variants in which amino acid substitutions (T112S / N125K / T130I / S134Q / S183T / Q204K / F206Y / A241E / M259I / Q307R / A309S / T342H / I365V / Q381S / F382L) were performed, DNA fragments lacking CBD were respectively obtained. , Prepared according to the construction of a plasmid containing a DNA fragment for PcCBH2.
（セルラーゼの試験管内合成方法）
試験管内合成の鋳型として、作製したプラスミドに対して２本のプライマー（5’- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’（配列番号６）、 5’- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’（配列番号７））で増幅、PCR purification kit (Qiagen)で精製したＰＣＲ産物を使用した。なおこのＰＣＲ産物には、T7プロモーター配列、開始コドン、遺伝子配列、終始コドン、ターミネーター配列が含まれている。
(Method for in vitro synthesis of cellulase)
Amplification with two primers (5'- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3 '(SEQ ID NO: 6), 5'-TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3' (SEQ ID NO: 7)) as a template for in vitro synthesis, PCR purification kit PCR products purified with (Qiagen) were used. This PCR product includes a T7 promoter sequence, an initiation codon, a gene sequence, a termination codon, and a terminator sequence.
試験管内合成は、表４に示す組成の反応液で、26℃、3時間、in vitroでの転写翻訳共役反応を行なった。無細胞蛋白質合成反応の促進剤として、ＡＴＰの枯渇を補うためにクレアチンキナーゼをＡＴＰ生成酵素（ＡＤＰ＋ホスホクレアチン→ＡＴＰ）として、リファンピシンはＲＮＡ合成開始阻害剤、フォリン酸はＲＮＡ転写阻害剤として添加した。また、タンパク質のフォールディングを助ける因子として、各種シャペロンを高発現した大腸菌Ａ１９株から抽出したＳ３０菌体抽出液（−ＤＴＴ）を用いた。更に、Ｓ−Ｓ結合形成促進因子であるカビ由来プロテインジスルフィドイソメラーゼも添加した。なお合成されたセルラーゼ量を評価するため、蛍光標識されたリジン（FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System：プロメガ）を混ぜて合成反応を行った。 For in vitro synthesis, a reaction solution having the composition shown in Table 4 was used for in vitro transcription / translation coupling reaction at 26 ° C. for 3 hours. As a promoter of cell-free protein synthesis reaction, creatine kinase was added as an ATP-generating enzyme (ADP + phosphocreatine → ATP) to compensate for ATP depletion, rifampicin was added as an RNA synthesis initiation inhibitor, and folinic acid was added as an RNA transcription inhibitor . In addition, S30 cell extract (-DTT) extracted from Escherichia coli A19 strain that highly expressed various chaperones was used as a factor to assist protein folding. Furthermore, mold-derived protein disulfide isomerase, which is an SS bond formation promoting factor, was also added. In order to evaluate the amount of cellulase synthesized, a synthetic reaction was performed by mixing lysine (FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System: Promega) labeled with fluorescence.
（試験管内合成反応におけるセルラーゼ合成量の評価）
ＣＢＤ欠失状態（リンカー−触媒ドメイン）とＣＢＤ保有状態（ＣＢＤ−リンカー−触媒ドメイン）とのそれぞれにつき、野生型ＰｃＣＢＨ２及び２種類のＰｃＣＢＨ２改変体の試験管内合成量及び比活性を評価した。
(Evaluation of cellulase synthesis in in vitro synthesis reaction)
For each of the CBD deletion state (linker-catalyst domain) and the CBD retention state (CBD-linker-catalyst domain), the in vitro synthesis amount and specific activity of wild-type PcCBH2 and two types of PcCBH2 variants were evaluated.
合成量の評価は、無細胞合成時に蛍光標識されたリジン（FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System：プロメガ）を取り込ませた合成産物をSDS-PAGE後、蛍光イメージアナライザー（FLA9000：富士フィルム株式会社）で検出、画像解析ソフトであるMulti Gauge（富士フィルム株式会社）での解析により行った。なお今回使用したＰｃＣＢＨ２野生型および改変体はそれぞれ、ＣＢＤ保有状態とＣＢＤ欠失状態で同数のリジンを持っているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの目的バンドの蛍光量でその合成量が比較評価できる。結果を図１に示す。図１には、セルラーゼの試験管内合成量を、野生型及び改変体につき、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の合成量に対する相対量として示す。 The amount of synthesis was evaluated by SDS-PAGE of the synthetic product incorporating fluorescently labeled lysine (FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System: Promega) during cell-free synthesis, and then with a fluorescence image analyzer (FLA9000: Fuji Film Co., Ltd.). Detection and analysis were performed with Multi Gauge (Fuji Film Co., Ltd.), which is image analysis software. Since the PcCBH2 wild type and the variant used this time have the same number of lysines in the CBD possessed state and the CBD deleted state, the amount of synthesis can be compared and evaluated by the amount of fluorescence of the target band in SDS-PAGE. The results are shown in FIG. In FIG. 1, the amount of cellulase synthesized in vitro is shown as a relative amount with respect to the amount of synthesis in the CBD possessing state as the CBD retaining state (black) and the CBD deficient state (grey) for the wild type and the variant.
図１に示すように、野生型ＰｃＣＢＨ２ではＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ有状態よりも合成量が約１．３倍向上していた（図１）。また評価した２つのＰｃＣＢＨ２変異体では共に、ＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ保有状態よりも合成量が約１．７倍向上していた。 As shown in FIG. 1, in the wild-type PcCBH2, the amount of synthesis was improved about 1.3 times in the CBD deletion state than in the CBD presence state (FIG. 1). In addition, in both of the two PcCBH2 mutants evaluated, the synthesis amount was about 1.7 times higher in the CBD deletion state than in the CBD possession state.
（セルラーゼ（セロビオヒドロラーゼ）比活性の評価）
試験管内合成されたセルラーゼは、野生型及び各ＰｃＣＢＨ２改変体でＣＢＤ保有状態及びＣＢＤ欠失状態で同じセルラーゼ量となるように試験管内合成試薬で希釈し、その活性を評価した。具体的には、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で１００倍希釈後、１％リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）又は２．５％Ａｖｉｃｅｌを同量添加し（０．５％ＰＳＣ又は１．２５％Ａｖｉｃｅｌ）、４０℃で１６時間反応させた。反応液を、ＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）にて遠心上精の還元糖量を測定し、セルラーゼ比活性とした。図２及び図３には、セルラーゼの比活性を、野生型及び改変体につき、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の活性に対する相対比活性として示す。
(Evaluation of specific activity of cellulase (cellobiohydrolase))
The cellulase synthesized in vitro was diluted with an in vitro synthesis reagent so that the same cellulase amount was obtained in the wild-type and each PcCBH2 variant in the CBD retention state and the CBD deletion state, and the activity was evaluated. Specifically, after 100-fold dilution with 50 mM acetate buffer pH 5.0, the same amount of 1% phosphoric acid swollen cellulose (PSC) or 2.5% Avicel is added (0.5% PSC or 1.25% Avicel). ) And reacted at 40 ° C. for 16 hours. For the reaction solution, the amount of reducing sugar in the centrifugal supernatant was measured by the TZ assay method (Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115) to obtain the cellulase specific activity. 2 and 3 show the specific activity of the cellulase as the relative specific activity with respect to the activity of the CBD possessing state as the CBD retaining state (black) and the CBD deletion state (grey) for the wild type and the variant.
（１）比活性の比較（ＰＳＣが基質の場合）
野生型ＰｃＣＢＨ２、改変体Ｓｅｐｔ２５およびＭａｌｌ４を用いて、ＰＳＣを基質とした条件でのＣＢＤ有欠失状態の比活性を評価した。結果は、図２に示すように、評価した野生型及び各改変体でＣＢＤ欠失状態はＣＢＤ保有状態よりも比活性が向上していた。すなわち、野生型及びＳｅｐｔ２５では２倍以上、Ｍａｌｌ４では、４倍以上であった。
(1) Comparison of specific activities (when PSC is a substrate)
Using wild-type PcCBH2, variants Sept25 and Mall4, the specific activity in the CBD-deficient state under conditions using PSC as a substrate was evaluated. As a result, as shown in FIG. 2, the specific activity was improved in the CBD-deficient state as compared with the CBD possessed state in the evaluated wild type and each variant. That is, it was 2 times or more in wild type and Sept25, and 4 times or more in Mall4.
（２）比活性の比較（Ａｖｉｃｅｌが基質の場合）
野生型ＰｃＣＢＨ２、改変体Ｓｅｐｔ２５およびＭａｌｌ４を用いて、Ａｖｉｃｅｌを基質とした条件でのＣＢＤ欠失／保有状態の比活性を評価した。結果は、図３に示すように、評価した野生型及び各改変体でＣＢＤ欠失状態はＣＢＤ保有状態よりも比活性が向上していた。すなわち、野生型では１．４倍、Ｓｅｐｔ２５では１．２倍、Ｍａｌｌ４では、１．７倍であった。
(2) Comparison of specific activities (when Avicel is a substrate)
Using wild-type PcCBH2, variants Sept25 and Mall4, the specific activity of the CBD deletion / carrying state under conditions using Avicel as a substrate was evaluated. As a result, as shown in FIG. 3, the specific activity was improved in the CBD-deficient state as compared to the CBD possessed state in the evaluated wild type and each variant. That is, it was 1.4 times for the wild type, 1.2 times for Sept25, and 1.7 times for Mall4.
（トリコデルマ由来のエンドグルカナーゼ２のＣＢＤ欠失／保有状態での比活性比較）
本実施例では、トリコデルマ由来のエンドグルカナーゼ２（ＴｒＥＧ２、ＧＨＦ５）を用いて、そのＣＢＤ欠失変異体を合成し、実施例３に準じて、ＣＢＤ欠失／保有状態での比活性測定を行った。ＣＢＤ欠失変異体のＤＮＡ断片を含むプラスミド作製は、上記エンドグルカナーゼIIの遺伝子（GenBankアクセッション番号P07982（配列番号１２）に対して、プライマー配列（5’- GGGGTCCGATTTGCCGGCGTTAACAT-3’（配列番号８））及び5’- CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’ （配列番号９））を用いる以外は、実施例１に準じてプラスミドを構築し、各ペプチドを試験管内合成した。
(Comparison of specific activity of Trichoderma-derived endoglucanase 2 in CBD deletion / retention state)
In this example, a CBD deletion mutant was synthesized using endoglucanase 2 (TrEG2, GHF5) derived from Trichoderma, and the specific activity was measured in the CBD deletion / retention state according to Example 3. It was. A plasmid containing a DNA fragment of a CBD deletion mutant was prepared by using a primer sequence (5′-GGGGTCCGATTTGCCGGCGTTAACAT-3 ′ (SEQ ID NO: 8) with respect to the gene for endoglucanase II (GenBank Accession No. P07982 (SEQ ID NO: 12)). ) And 5′-CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 9)), plasmids were constructed according to Example 1, and each peptide was synthesized in vitro.
実施例３と同様に、ＰＳＣ（０．５％）及びＡｖｉｃｅｌ（１．２５％）を基質としてＣＢＤ欠失／保有状態での比活性を評価した。さらに、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、０．２％）を使用して同様にして比活性を評価した。結果を図４に示す。図４には、セルラーゼの比活性を、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の活性に対する相対比活性として示す。 As in Example 3, the specific activity in the CBD deletion / retention state was evaluated using PSC (0.5%) and Avicel (1.25%) as substrates. Furthermore, specific activity was similarly evaluated using carboxymethylcellulose (CMC, 0.2%) as a substrate. The results are shown in FIG. In FIG. 4, the specific activity of cellulase is shown as a relative specific activity with respect to the activity of the CBD possessing state as the CBD retaining state (black) and the CBD deletion state (grey).
図４に示すように、トリコデルマ由来のエンドグルカナーゼＩＩについては、ＰＳＣが基質の場合には、ＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ保有状態よりも比活性が高いことが示された。また、Ａｖｉｃｅｌが基質の場合には、ＣＢＤ欠失状態の方がＣＢＤ保有状態よりも比活性が低いことが示された。さらに、ＣＭＣが基質の場合には、ＣＢＤ保有状態とＣＢＤ欠失状態はほぼ同じ比活性を示した。以上のことから、ＧＨＦ４５とは異なるＧＨＦ２のエンドグルカナーゼでのＣＢＤ削除の効果は、基質によって様々で、一概にＣＢＤ削除による比活性の向上を示すことはできなかった。 As shown in FIG. 4, for Trichoderma-derived endoglucanase II, when PSC was a substrate, it was shown that the CBD deletion state had higher specific activity than the CBD possession state. Moreover, when Avicel was a substrate, it was shown that the CBD deletion state has a lower specific activity than the CBD possession state. Furthermore, when CMC was a substrate, the CBD possessing state and the CBD deletion state showed almost the same specific activity. From the above, the effect of CBD deletion by GHF2 endoglucanase different from GHF45 varies depending on the substrate, and it has not been possible to generally show an increase in specific activity by CBD deletion.
（ファネロケーテ由来のセロビオヒドラーゼ７ＣのＣＢＤ欠失／保有状態での比活性比較）
ＰｃＣＢＨ２とは異なるファネロケーテ由来のセロビオヒドラーゼ７Ｃ（ＰｃＣＢＨ７Ｃ、ＧＨＦ７）を用いて、そのＣＢＤ欠失変異体を合成し、実施例４と同様にしてＣＢＤ欠失／保有状態での比活性測定を行った。ＰｃＣＢＨ７ＣのＣＢＤ欠失変異体のＤＮＡ断片を含むプラスミドの作製は、ＰｃＣＢＨ７Ｃ遺伝子（GenBankアクセッション番号M22220H（配列番号１３））に対して、プライマー配列（5’- TTAGCCGGTGTACGTGGTGTTGAGGT-3’ （配列番号１０）及び5’-AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCA -3’ （配列番号１１））を用いる以外は、実施例１に準じて行い、各ペプチドを試験管内合成した。実施例３と同様に、ＰＳＣ（０．５％）を基質としてＣＢＤ欠失／保有状態での比活性を評価した。結果を図５に示す。図５には、セルラーゼの比活性を、ＣＢＤ保有状態（黒）及びＣＢＤ欠失状態（灰色）として、ＣＢＤ保有状態の活性に対する相対比活性として示す。
(Comparison of specific activity of cellobiohydrase 7C derived from funerokete in CBD deletion / retention state)
A cellobiohydrase 7C (PcCBH7C, GHF7) derived from funerocate different from PcCBH2 was used to synthesize the CBD deletion mutant, and the specific activity was measured in the CBD deletion / retention state in the same manner as in Example 4. went. A plasmid containing a DNA fragment of a CBD deletion mutant of PcCBH7C was prepared by using a primer sequence (5′-TTAGCCGGTGTACGTGGTGTTGAGGT-3 ′) (SEQ ID NO: 10) against the PcCBH7C gene (GenBank accession number M22220H (SEQ ID NO: 13)). And 5′-AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCA -3 ′ (SEQ ID NO: 11)), each peptide was synthesized in vitro in the same manner as in Example 1. As in Example 3, the specific activity in the CBD deficient / retained state was evaluated using PSC (0.5%) as a substrate. The results are shown in FIG. In FIG. 5, the specific activity of cellulase is shown as a relative specific activity with respect to the activity of the CBD possessing state as the CBD retaining state (black) and the CBD deletion state (grey).
図５に示すように、実施例３におけるＰｃＣＢＨ２の結果とは異なり、ＣＢＤ保有状態の方がＣＢＤ欠失状態よりも比活性が高かった（図５）。以上の結果から、ＰｃＣＢＨ２と同じファネロケーテ由来のセロビオヒドラーゼでも、ＣＢＤの欠失が比活性を向上させるわけではないことがわかる。 As shown in FIG. 5, unlike the results of PcCBH2 in Example 3, the specific activity was higher in the CBD retention state than in the CBD deletion state (FIG. 5). From the above results, it can be seen that deletion of CBD does not improve the specific activity even in the same cellobiohydrase derived from funerocate as PcCBH2.
（耐熱化変異体）
（１）耐熱性候補変異の選定
P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼII（PcCBH2）は、触媒ドメインとセルロース結合ドメイン（CBD）がリンカーでつながった構造を持つ。以下に、触媒ドメイン内のアミノ酸置換による耐熱化変異体の取得について説明する。
(Heat-resistant mutant)
(1) Selection of heat resistant candidate mutations
Cellobiohydrolase II (PcCBH2) derived from P. chrysosporium has a structure in which the catalytic domain and the cellulose binding domain (CBD) are connected by a linker. Hereinafter, acquisition of a thermostable mutant by amino acid substitution in the catalytic domain will be described.
（２）耐熱性候補変異を含む変異体の構築
耐熱化への初期配列としてPcCBH2変異体5−6（配列番号１４、配列番号１５）を用いた。変異体5−6は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、そのCBDのみに、アミノ酸置換（S22P置換（塩基配列上の変異：T64C））及び同義置換（塩基配列上の変異：G9A）をそれぞれ各一つ備えており、試験管内合成において野生型PcCBH2よりもタンパク質合成量が高い変異体であることがわかっている。耐熱化変異体の取得にあたり、変異体5−6に対して、以下の表５に示す変異（アミノ酸置換）を有する変異体作成した。すなわち、これらの変異体に相当するアミノ酸配列をそれぞれコードするオリゴマーＤＮＡ及びその直近の相補鎖オリゴマーＤＮＡをプライマーとして用いてインバースＰＣＲ法でプラスミド鎖を増幅し、５’−末端をリン酸化後、ライゲーションによるプラスミドの環状化、大腸菌への形質転換を経て取得した。各変異体の変異導入は、シーケンスを行い確認した。
(2) Construction of mutant containing heat-resistant candidate mutation PcCBH2 mutant 5-6 (SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15) was used as an initial sequence for heat resistance. Mutant 5-6 has an amino acid substitution (S22P substitution (mutation on the base sequence: T64C)) and synonymous substitution (mutation on the base sequence: G9A) only in its CBD in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is known that these are mutants that have higher protein synthesis than wild-type PcCBH2 in vitro synthesis. In obtaining the heat-resistant mutant, a mutant having the mutation (amino acid substitution) shown in Table 5 below was prepared for mutant 5-6. That is, the plasmid DNA was amplified by the inverse PCR method using the oligomer DNA encoding the amino acid sequence corresponding to these mutants and the nearest complementary strand oligomer DNA as primers, phosphorylated at the 5'-end, and then ligated. It was obtained through circularization of the plasmid by E. coli and transformation into E. coli. Mutation introduction of each mutant was confirmed by sequencing.
４３種の変異体を試験管内で合成した。試験管内合成の鋳型として、（１）で取得したＤＮＡに対してプライマー（5’- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’（配列番号１６）、 5’- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’（配列番号１７））を用いて増幅させたPCR産物を、PCR purification kit (Qiagen)で精製したものを用いた。なお、このPCR産物には、T7プロモーター配列、開始コドン、遺伝子配列、終始コドン、ターミネーター配列が含まれている。 Forty-three variants were synthesized in vitro. As a template for in vitro synthesis, the DNA obtained in (1) was amplified using primers (5′-ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3 ′ (SEQ ID NO: 16), 5′-TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 17)). A PCR product purified with a PCR purification kit (Qiagen) was used. This PCR product includes a T7 promoter sequence, an initiation codon, a gene sequence, a termination codon, and a terminator sequence.
変異体の試験管内合成は、表６に示す組成の反応液で、２６℃、３時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写翻訳共役反応として行った。無細胞蛋白質合成反応の促進剤として、ＡＴＰの枯渇を補うためにクレアチンキナーゼをＡＴＰ生成酵素（ＡＤＰ＋ホスホクレアチン→ＡＴＰ）として、リファンピシンはＲＮＡ合成開始阻害剤、フォリン酸はＲＮＡ転写阻害剤として添加した。また、タンパク質のフォールディングを助ける因子として、各種シャペロンを高発現した大腸菌Ａ１９株から抽出したＳ３０菌体抽出液（−ＤＴＴ）を用いた。更に、Ｓ−Ｓ結合形成促進因子である、カビ由来プロテインジスルフィドイソメラーゼも添加した。 The in vitro synthesis of the mutant was performed as a transcription / translation coupling reaction in vitro at 26 ° C. for 3 hours in a reaction solution having the composition shown in Table 6. As a promoter of cell-free protein synthesis reaction, creatine kinase was added as an ATP-generating enzyme (ADP + phosphocreatine → ATP) to compensate for ATP depletion, rifampicin was added as an RNA synthesis initiation inhibitor, and folinic acid was added as an RNA transcription inhibitor . In addition, S30 cell extract (-DTT) extracted from Escherichia coli A19 strain that highly expressed various chaperones was used as a factor to assist protein folding. Furthermore, mold-derived protein disulfide isomerase, which is an SS bond formation promoting factor, was also added.
（３）変異体の耐熱試験方法
合成した変異体を、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１００倍に希釈、４９，５０，５１，５２，５３及び５４℃の各温度で２時間保温する熱処理後、その残存活性をリン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）分解（反応条件：４０℃、１６時間）後の遠心上清の還元糖量をＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）を用いて評価した。残存活性は熱処理前の活性との比で表した。またセルラーゼの耐熱温度は上記残存活性が５０％となるときの温度と定義した。
(3) Heat-resistant test method of mutant The synthesized mutant is diluted 100 times with 50 mM acetate buffer (pH 5.0), and kept at 49, 50, 51, 52, 53 and 54 ° C. for 2 hours. After the heat treatment, the residual activity was determined by the TZ assay method (Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985)) after the degradation of phosphate swelling cellulose (PSC) (reaction conditions: 40 ° C., 16 hours). 109-115). The residual activity was expressed as a ratio with the activity before heat treatment. The heat-resistant temperature of cellulase was defined as the temperature at which the residual activity was 50%.
（４）有利変異の選定
以上の耐熱性評価の結果、１３個の耐熱性が向上した変異体が得られた。その耐熱性を向上させた変異を有利変異と呼ぶこととした。今回に実験で得られた有利変異を表７及び図６に示す。図６に示すように、これらの有利変異は、いずれも、５２℃環境下で２時間保温後において、氷冷保持条件と比較して１．３〜７倍残存活性を向上させるものであった。
（５）第１世代変異体の選択
有利変異を一つずつ親配列に加算したＤＮＡを合成し、当該ＤＮＡを鋳型として、各変異体を実施例６の（２）と同様にして試験管内合成して、（３）に記載の方法に準じて耐熱性評価を行ったところ、最も耐熱性が高かった有利変異Ｍ−１８による変異体第１世代とした。
(5) Selection of first-generation mutants DNA in which advantageous mutations are added to the parent sequence one by one is synthesized, and each mutant is synthesized in vitro in the same manner as (2) of Example 6 using the DNA as a template. Then, when the heat resistance was evaluated according to the method described in (3), the mutant first generation by the advantageous mutation M-18 having the highest heat resistance was obtained.
（６）第２世代の選択
実施例２で得た変異体Ｔ３４２Ｈ（Ｍ１−１８）に有利変異Ｑ３８１Ｓ／Ｆ３８２Ｌ（Ｍ１−２０）を導入した変異体（Ｗ１８２０）を実施例１と同様にして合成し、（３）に記載の方法に準じて耐熱性を評価した。結果を図７に示す。図７に示すように、有利変異を蓄積したＷ１８＋２０の耐熱性はＭ１−１８及びＭ１−２０と比較して向上していた。この変異体を第２世代として選択した。
(6) Selection of Second Generation A mutant (W1820) obtained by introducing the advantageous mutation Q381S / F382L (M1-20) into the mutant T342H (M1-18) obtained in Example 2 was synthesized in the same manner as in Example 1. The heat resistance was evaluated according to the method described in (3). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 7, the heat resistance of W18 + 20 accumulating advantageous mutations was improved compared to M1-18 and M1-20. This mutant was selected as the second generation.
（７）第３世代の選択
実施例３で得られた変異体Ｗ１８＋２０に有利変異（Ｍ１−１，−２，−４，−１２）をそれぞれ導入し、その変異体を上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図８に示す。図８に示すように、有利変異Ｔ１３０Ｉ／Ｓ１３４Ｑ（Ｍ１−４）を導入した変異体（Ｔｒｉ４）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第３世代として選択した。
(7) Selection of third generation An advantageous mutation (M1-1, -2, -4, -12) was introduced into the mutant W18 + 20 obtained in Example 3, respectively, and the mutant was the same as (2) above. The heat resistance was evaluated in the same manner as (3) above. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8, the heat resistance of the mutant (Tri4) into which the advantageous mutation T130I / S134Q (M1-4) was introduced was most improved. This mutant was selected as the third generation.
（８）第４世代の選択
実施例４で得られた有利変異が３個導入された変異体Ｔｒｉ４に４つの有利変異（Ｍ１−１，−１１，−１２，−１４，−１５）をそれぞれ導入した変異体を、上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図９に示す。図９に示すように、有利変異Ｍ２５９Ｉ（Ｍ１−１５）を導入した変異体（Ｑｕａｒｄ１５）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第４世代として選択した。
(8) Selection of fourth generation Four advantageous mutations (M1-1, -11, -12, -14, -15) were respectively added to the mutant Tri4 introduced with three advantageous mutations obtained in Example 4. The introduced mutant was synthesized in the same manner as in the above (2), and the heat resistance was evaluated in the same manner as in the above (3). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 9, the heat resistance of the mutant (Quad15) introduced with the advantageous mutation M259I (M1-15) was most improved. This mutant was selected as the fourth generation.
（９）第５世代の選択
実施例５で得られた有利変異が４個導入された変異体Ｑｕａｒｄ１５に４つの有利変異（Ｍ１−１，−１１，−１２，−２７）をそれぞれ導入し、その変異体を、上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図１０に示す。図１０に示すように、耐熱評価した。その結果、有利変異Ａ２４１Ｅ（Ｍ１−１２）を導入した変異体（Ｑｕｉｎｔ１２）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第５世代として選択した。
(9) Selection of fifth generation Four advantageous mutations (M1-1, -11, -12, -27) were introduced into the mutant Quad15 into which four advantageous mutations obtained in Example 5 were introduced, The mutant was synthesized in the same manner as in the above (2), and the heat resistance was evaluated in the same manner as in the above (3). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 10, the heat resistance was evaluated. As a result, the heat resistance of the mutant (Quint12) introduced with the advantageous mutation A241E (M1-12) was most improved. This mutant was selected as the fifth generation.
（１０）第６世代の選択
実施例６で得られた有利変異が５個導入された変異体Ｑｕｉｎｔ１２に耐熱性への寄与度が高かった有利変異Ｑ３０７Ｒ／Ａ３０９Ｓ（Ｍ１−３７）とその他の３つの有利変異（Ｍ１−１，−２１，−２５）をそれぞれ導入した変異体を、上記（２）と同様にして合成し、上記（３）と同様にして耐熱性を評価した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、Ｑｕｉｎｔ１２にＱ３０７Ｒ／Ａ３０９Ｓ及び有利変異Ｓ１８３Ｔ（Ｍ１−２５）を導入した変異体（Ｓｅｐｔ２５）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第６世代として選択した。
(10) Selection of 6th generation Advantageous mutation Q307R / A309S (M1-37) and the other 3 which had a high contribution to heat resistance to mutant Quint12 introduced with 5 advantageous mutations obtained in Example 6 Mutants into which each of the advantageous mutations (M1-1, -21, -25) was introduced were synthesized in the same manner as in the above (2), and the heat resistance was evaluated in the same manner as in the above (3). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 11, the heat resistance of the mutant (Sept25) in which Q307R / A309S and the advantageous mutation S183T (M1-25) were introduced into Quant12 was most improved. This mutant was selected as the sixth generation.
（１１）スクリーニングによる耐熱化変異体の取得
加算していない有利変異（Ｍ１−１，−２，−１１，−２１，−２７）を変異体Ｓｅｐｔ２５にばらつきを持って導入後、スクリーニングにより最も高い耐熱性を有する変異体の取得を試みた。具体的には、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて変異を導入し、その変異体９２個をクローニングした。上記（２）と同様にして試験管内合成した変異体を５６℃にて２時間の熱処理後、熱処理前に対する残存活性を指標にスクリーニングを行った。結果を図１２に示す。図１２に示すように、熱処理に対する残存活性がSept25と比較して約5倍向上した変異体が得られた。
(11) Acquisition of heat-resistant mutants by screening After introduction of non-additive advantageous mutations (M1-1, -2, -11, -21, -27) with variation in mutant Sept25, the highest is obtained by screening. An attempt was made to obtain mutants having heat resistance. Specifically, mutations were introduced using QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), and 92 mutants thereof were cloned. The mutants synthesized in vitro in the same manner as in (2) above were subjected to screening after the heat treatment at 56 ° C. for 2 hours and using the residual activity before the heat treatment as an index. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 12, a mutant was obtained in which the residual activity against heat treatment was improved about 5 times compared to Sept25.
（１２）スクリーニングで得られた変異体の耐熱性評価
上記スクリーニングで、残存活性が高かった上位３個の変異体について、上記（３）と同様に耐熱性を評価した。結果を図１３に示す。図１３に示すように、評価した３変異体は共にＳｅｐｔ２５と比較して耐熱温度が１℃向上していた。
(12) Evaluation of heat resistance of mutants obtained by screening The top three mutants having the highest residual activity in the above screening were evaluated for heat resistance in the same manner as in (3) above. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 13, all of the three mutants evaluated had a heat resistant temperature improved by 1 ° C. compared to Sept25.
（１３）スクリーニングで得られた耐熱化変異体のアミノ酸配列の決定
上記で得られた耐熱化変異体のアミノ酸配列を塩基配列解析行うことで解析した。その結果、残りの有利変異（Ｍ１−１，−２，−１１，−２１，−２７）がすべて入っていることが分かった。この得られたクローンを耐熱化実験での最終変異体（Ｍａｌｌ４と呼ぶ）こととした。
(13) Determination of amino acid sequence of the thermostable mutant obtained by screening The amino acid sequence of the thermostable mutant obtained above was analyzed by base sequence analysis. As a result, it was found that all of the remaining advantageous mutations (M1-1, -2, -11, -21, -27) were included. This obtained clone was designated as the final mutant (referred to as Mall4) in the heat resistance experiment.
各世代の変異体における変異の組み合わせを以下の表に示す。
（１４）各世代の耐熱化変異体を耐熱性評価
これまでに得られた各世代の耐熱変異体につき、上記（３）と同様に耐熱性を評価した。結果を図１４に示す。図１４に示すように、その結果、有利変異を加えるに従い耐熱温度が向上していることが確認できた。初期変異体５−６の耐熱温度が４９．９℃であるのに対し、耐熱化変異体Ｓｅｐｔ２５は４．４℃向上した５４．３℃、さらに最終変異体Ｍａｌｌ４では５．４℃向上した５４．３℃であった。
(14) Evaluation of heat resistance of each generation of heat-resistant mutants The heat resistance of each generation of heat-resistant mutants obtained so far was evaluated in the same manner as in (3) above. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 14, as a result, it was confirmed that the heat-resistant temperature was improved as the advantageous mutation was added. The heat resistance temperature of the initial mutant 5-6 is 49.9 ° C., whereas the heat resistant mutant Sept25 is improved by 4.4 ° C. to 54.3 ° C., and the final mutant Mall4 is increased by 5.4 ° C. 54 It was 3 ° C.
（CBD欠失PcCBH2変異体の耐熱性評価）
さらに、耐熱化変異体Mall4のCBD部位を削除した変異体を作製した。当該変異体は、実施例１に準じて試験管内合成した。Mall４及びそのＣＢＤ欠失変異体の耐熱性を評価した。また、変異体５−６の評価も併せて行った。結果を図１５に示す。図１５に示すように、耐熱化変異体Mall4からCBDを欠失させた変異体は、Mall4CBD保有体と同様、変異体５−６よりも、高い耐熱性を有していた。
(Evaluation of heat resistance of Cc-deficient PcCBH2 mutants)
Furthermore, a mutant in which the CBD site of the heat-resistant mutant Mall4 was deleted was prepared. The mutant was synthesized in vitro according to Example 1. The heat resistance of Mall4 and its CBD deletion mutant was evaluated. Moreover, the variant 5-6 was also evaluated. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 15, the mutant in which CBD was deleted from the heat-resistant mutant Mall4 had higher heat resistance than that of the mutant 5-6, like the Mall4CBD carrier.
（CBD欠失変異体のセルロースへの結合力の評価）
配列番号２で表されるアミノ酸配列の野生型PcCBH2（CBD保有）、上記の耐熱性変異体Mall4及びそれぞれのCBD欠失変異体を用いて、各セルラーゼのセルロースへの結合力をアビセルからの遊離率で評価した。具体的には、酵母で分泌発現そしてアビセルカラムで精製したそれぞれのセルラーゼ１００ngを、50mM酢酸緩衝液pH5.0でけん濁したアビセル１００ul（終濃度2％(w/v)）に添加、攪拌後、氷上で2時間静置させた。なお、コントロール実験として、アビセル無条件でも行った。それぞれの遠心上清のセルラーゼ活性を測定し、セルラーゼのアビセルからの遊離率を算出した。結果を図１６に示す。
(Evaluation of binding ability of CBD deletion mutants to cellulose)
Using the wild-type PcCBH2 (having CBD) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the heat-resistant mutant Mall4 and the respective CBD deletion mutants, the binding power of each cellulase to cellulose is released from Avicel. The rate was evaluated. Specifically, 100 ng of each cellulase expressed in yeast and purified with an Avicel column was added to 100 ul of Avicel suspended in 50 mM acetate buffer pH 5.0 (final concentration 2% (w / v)) and stirred. And left on ice for 2 hours. As a control experiment, Avicel was also performed unconditionally. Cellulase activity of each centrifugal supernatant was measured, and the release rate of cellulase from Avicel was calculated. The results are shown in FIG.
図１６に示すように、CBD保有セルラーゼの遊離率は約０．１であったのに対しCBD失活変異体では０．３〜０．５の値を示した。以上の結果より、CBD欠失セルラーゼは、保有セルラーゼと比較して、アビセルに対する結合性が低下していた。 As shown in FIG. 16, the release rate of the CBD-carrying cellulase was about 0.1, whereas the CBD inactivated mutant showed a value of 0.3 to 0.5. From the above results, the CBD-deficient cellulase had a reduced binding property to Avicel compared to the retained cellulase.
配列番号４〜１３，１６、１７：プライマー
配列番号１４，１５：Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼの変異体
SEQ ID NOs: 4-13, 16, 17: Primers SEQ ID NOs: 14, 15: Variants of cellobiohydrolase derived from Phanerochaete chrysosporium
Claims (15)
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列 A protein having cellobiohydrolase activity, wherein the cellulose binding domain is inactivated in any of the following amino acid sequences (a) to (d):
(A) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) amino acid sequence having one or more amino acid substitutions, deletions and / or additions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (c) SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence having 75% or more identity with the amino acid sequence represented by (d) DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a part thereof, and hybridizing under stringent conditions Amino acid sequence encoded by soybean DNA (e) Amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 75% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解する工程、を備える、セルロースの分解産物の生産方法。 A method for producing a degradation product of cellulose,
A method for producing a degradation product of cellulose, comprising the step of degrading cellulose using one or more cellulases containing the protein according to claim 1.
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを用いて、セルロースを分解してセルロース分解産物を取得する工程と、
微生物により前記セルロース分解産物を含む炭素源を発酵して、前記有用物質を生産する工程と、
を備える、方法。 A method for producing useful substances by fermentation of microorganisms,
Using one or more cellulases containing the protein according to any one of claims 1 to 3, decomposing cellulose to obtain a cellulose degradation product;
Fermenting a carbon source containing the cellulose degradation product by a microorganism to produce the useful substance;
A method comprising:
前記微生物の細胞外に分泌又は細胞表層に提示される請求項１に記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼの存在下、前記微生物を用いて、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備える、方法。 A method for producing useful substances by fermentation of microorganisms,
A carbon source containing at least cellulose is fermented using the microorganism in the presence of one or more cellulases containing the protein according to claim 1 secreted outside the cell of the microorganism or presented on the cell surface. And producing the useful substance.
A protein complex comprising the protein according to claim 1.
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