JP2012034725A - 単核球分離管、単核球分離システム、単核球の分離方法、単核球、及び、体内投与用薬剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】遠心分離処理前には試料溶液が収納されると共に遠心分離処理後には低比重成分である単核球が位置する上チャンバ110と、遠心分離処理前には遠心分離媒体が収納されると共に遠心分離処理後には不要成分である高比重成分が位置する下チャンバ120と、上チャンバ110の下側開口と下チャンバ120の上側開口とを開閉自在に接続する三方活栓130と、上チャンバ110の上側開口を密栓する蓋140と、を備える
【選択図】図1
Description
図1は本実施形態に係る単核球分離管100の概略図である。図1に示すように、単核球分離管100は、上端側に配置された導入開口111及び下端側に配置された下側開口112を有する筒体からなる上チャンバ110と、上端側に上側開口121が配置され下端側が閉塞した有底筒体からなる下チャンバ120と、第1接続口131、第2接続口132及び第3接続口133を有する3個の流体通路を備えた三方活栓130と、を備える。
上述の実施形態では単核球分離管100について説明をしたが、第2実施形態では第1実施形態の単核球分離管100を用いる閉鎖系の単核球分離システム900について説明をする。
〈ヨード造影剤を用いた骨髄幹細胞の単離〉
実施例1では、ヨード造影剤としてイオヘキソールを使用し、単核球の分離を試みた。ヒト骨髄液の原液10mlに対して、10U/mlの医療用ヘパリンナトリウム(ノボ・ヘパリンナトリウム:持田製薬[注射用医薬品])を良く混合したものを分離原液として用いた。この骨髄液に医療用生理食塩水(大塚生食注:大塚製薬[注射用医薬品])を10ml加えることにより、試料溶液としての幹細胞分離用骨髄液を調整した。遠心分離媒体は、医療用造影剤(オムニパーク350:第一三共株式会社[注射用医薬品])を18.68ml、医療用生理食塩水(大塚生食注:大塚製薬[注射用医薬品])を51.76ml及び医療用蒸留水(大塚蒸留水:大塚製薬[注射用医薬品])を29.56ml混和することにより作成した。作成されたこの遠心分離媒体の比重は1.077、浸透圧(生理食塩液に対する比)は1.0、pHは7.4であった。
一方、対照群として、遠心分離媒体としてフィコールを使用して単核球の分離を試みた。脳梗塞患者に対する自己骨髄幹細胞移植の臨床試験[臨床試験ID番号:日本UMIN000001133、米国NCT01028794]と同様に、遠心分離媒体としてフィコール[GEHealthcare社製:Ficoll-Paque PREMIUM]を用い、その他の条件は上述の〈ヨード造影剤を用いた骨髄幹細胞の単離〉と同様とした。単核球を含む細胞液の分離を行った後、生理食塩水と遠心機を用い、2度洗浄を行うことによりフィコールの除去を行った。
更に、対照群として、遠心分離媒体としてヒドロキシルエチルデンプンを使用し単核球の分離を試みた。ヒト骨髄液5mlをヘパリン混和の生理食塩水5mlと混和した。さらに、ヒドロキシルエチルデンプンを最終ヒドロキシルエチルデンプン濃度が1%となるように加え、得られた骨髄液を室温で40分間静置し、赤血球成分を沈降させ上清液を回収した。回収液を、濃縮機セルプロセッサーにセットし、脂肪分、骨片等の微小浮遊物を分離した。次いで、洗浄及び濃縮操作により、7mlの単核球を含む細胞液を得た。
実施例2では、ヒト幹細胞治療薬の効果判定に有効なSCID(SevereCombined Immunodeficiency=重症免疫不全)マウス脳梗塞モデル(左中大脳動脈M1遠位部閉塞モデル)を用いて、実施例1で得られた単核球を含む細胞液の治療薬剤としての効果の検討を行った。他の手法との比較検討のため、(i)本発明で分離された細胞液投与群(以下、幹細胞群)、(ii)フィコールによる分離された細胞群(以下、フィコール群)、(iii)ヒドロキシルエチルデンプンにより分離された細胞群(以下、デンプン群)、(iv)生理食塩水投与群(以下、生食群)を設定した。
実施例3では、ヒト幹細胞治療薬の効果判定に有効なSCID(重症免疫不全)マウス下肢虚血モデル(左大腿動脈閉塞モデル)を用いて、実施例1で得られた単核球を含む細胞液の治療薬剤としての効果の検討を行った。他の手法との比較検討のため、(i)本発明で分離された細胞液投与群(以下、幹細胞群)、(ii)フィコールによる分離された細胞群(以下、フィコール群)、(iii)ヒドロキシルエチルデンプンにより分離された細胞群(以下、デンプン群)、(iv)生理食塩水投与群(以下、生食群)を設定した。
〈単核球分離管による骨髄幹細胞の単離〉
遠心分離媒体は、医療用造影剤(オムニパーク350:第一三共株式会社[注射用医薬品])を16.68ml、医療用生理食塩水(大塚生食注:大塚製薬[注射用医薬品])を51.76ml及び医療用蒸留水(大塚蒸留水:大塚製薬[注射用医薬品])を29.56ml混和することにより作成した。作成された遠心分離媒体の比重は1.077、浸透圧(生理食塩液に対する比)は1.0、pHは7.4であった。そして単核球分離管は図1に示したものと同様の構成とし、約10mlの遠心分離媒体を単核球分離管100の下チャンバ120に配置した。
SCIDマウス脳梗塞モデル(左中大脳動脈M1遠位部閉塞モデル)を用いて、上記の〈単核球分離管による骨髄幹細胞の単離〉で得られた単核球を含む細胞液の治療薬剤としての効果の検討を行った。(i)本発明で分離された細胞液投与群(幹細胞群)、及び(ii)生理食塩水投与群(生食群)を設定した。各群6匹の脳梗塞モデルマウスに対し、脳梗塞作成2日後に5x105個の細胞(あるいは生理食塩水)を尾静脈より投与し、それぞれ投与群の脳神経機能回復促進効果の検証を行った。神経機能回復の評価項目に関しては、細胞投与30日後の大脳皮質神経機能をオープンフィールドテストで評価し、統計解析はt検定を用いて行った。図7は、SCIDマウス脳虚血モデルにおける30分間の総活動量(移動活動量+立ち上がり反応)の暗条件に対する反応性の測定結果である。図7に示すように、生食群と比し、幹細胞群では有意な機能回復促進が観察された。なお有意確率は5%であった。
SCIDマウス下肢虚血モデル(左大腿動脈閉塞モデル)を用いて、上記の〈単核球分離管による骨髄幹細胞の単離〉で得られた骨髄幹細胞液の治療薬剤としての効果の検討を行った。(i)本発明で分離された細胞液投与群(幹細胞群)、及び(ii)生理食塩水投与群(生食群)を設定した。各群6匹の下肢虚血モデルマウスに対し、下肢虚血作成直後に計1x106個の細胞(あるいは生理食塩水)を3か所の大腿部筋肉内に投与し、下肢虚血モデル作成30日後の救肢促進効果の検証を行った。虚血レベルは、0点:正常、1点:軽度の変色、2点:中等度から重度の変色、3点:壊死、4点:離断のようにして評価を行った。統計解析はマン・ホイットニ検定を用いて行った。図8は、SCIDマウス下肢虚血モデルにおける救肢効果の測定結果である。図8に示すように、生食群と比し、幹細胞群で有意な救肢効果が観察された。なお有意確率は5%であった。
〈単核球分離システムの準備〉
実施例5では、図2に示した単核球分離システムを用いて単核球の単離を試みた。試料溶液バッグ210には予め、10mlの希釈用生理食塩水(大塚生食注:大塚製薬)及び100単位のヘパリンナトリウム(ノボ・ヘパリンナトリウム)が収納された。また、遠心分離媒体として、造影剤(オムニパーク140:第一三共株式会社)を23.3ml、生理食塩水(大塚生食注:大塚製薬)を25.9ml及び蒸留水(大塚蒸留水:大塚製薬)を0.8ml混和することにより作成した。作成された遠心分離媒体の比重は1.077、浸透圧(生理食塩液に対する比)は1.0、pHは7.4であった。この約10mlの遠心分離媒体を単核球分離管100の下チャンバ120に予め配置した。エア用バック220には、予め約10mlの無塵無菌空気を入れるとともに、30ml以上の拡張能を持たせた。全てのクランプは閉の状態とした。
次に、ヒト骨髄液の原液10mlを注射器により試料溶液バッグ210に注入して、良く混和した。そして図3に示したように、試料溶液バッグ210を点滴台350に懸架すると共に、単核球分離管100をチューブラックに立てた後、第1クランプ311及び第2クランプ321を開放した。全ての骨髄液が単核球分離管100に移動した後、第1クランプ311及び第2クランプ321を閉鎖し、ヒートシーラーにより第1チューブ310を閉鎖し、ヒートシーリングポイントの試料溶液バッグ210側で切断した。
SCIDマウス脳梗塞モデル(左中大脳動脈M1遠位部閉塞モデル)を用いて、上記の〈単核球分離システムによる骨髄幹細胞の単離〉で得られた単核球を含む細胞液の治療薬剤としての効果の検討を行った。(i)本発明で分離された細胞液投与群(幹細胞群)、及び(ii)生理食塩水投与群(生食群)を設定した。各群6匹の脳梗塞モデルマウスに対し、脳梗塞作成2日後に5x105個の細胞(あるいは生理食塩水)を尾静脈より投与し、それぞれ投与群の脳神経機能回復促進効果の検証を行った。神経機能回復の評価項目に関しては、細胞投与30日後の大脳皮質神経機能をオープンフィールドテストで評価し、統計解析はt検定を用いて行った。図9は、SCIDマウス脳虚血モデルにおける30分間の総活動量(移動活動量+立ち上がり反応)の暗条件に対する反応性の測定結果である。図9に示すように、生食群と比し、幹細胞群では有意な機能回復促進が観察された。なお有意確率は5%であった。
SCIDマウス下肢虚血モデル(左大腿動脈閉塞モデル)を用いて、上記の〈単核球分離システムによる骨髄幹細胞の単離〉で得られた単核球を含む細胞液の治療薬剤としての効果の検討を行った。(i)本発明で分離された細胞液投与群(幹細胞群)、及び(ii)生理食塩水投与群(生食群)を設定した。各群6匹の下肢虚血モデルマウスに対し、下肢虚血作成直後に計1x106個の細胞(あるいは生理食塩水)を3か所の大腿部筋肉内に投与し、下肢虚血モデル作成30日後の救肢促進効果の検証を行った。虚血レベルは、0点:正常、1点:軽度の変色、2点:中等度から重度の変色、3点:壊死、4点:離断のようにして評価を行った。統計解析はマン・ホイットニ検定を用いて行った。図10は、SCIDマウス下肢虚血モデルにおける救肢効果の測定結果である。図10に示すように、生食群と比し、幹細胞群で有意な救肢効果が観察された。なお有意確率は5%であった。
110:上チャンバ
120:下チャンバ
130:三方活栓
131:第1接続口
132:第2接続口
133:第3接続口
140:蓋
150:ケース
210:試料溶液バッグ
220:エアバッグ
230:単核球収納バッグ
310:第1チューブ
311:第1クランプ
312:フィルター
320:第2チューブ
321:第2クランプ
330:第3チューブ
350,360:点滴台
900:単核球分離システム
Claims (11)
- 単核球を含む複数成分からなる試料溶液を、遠心分離媒体を用いて遠心分離処理することで、前記複数成分を比重の違いにより分離させ、低比重成分である単核球を採取するための単核球分離管であって、
上側に配置されて前記試料溶液が導入される導入開口及び下側に配置された下側開口を有し、遠心分離処理前には前記試料溶液が収納されると共に遠心分離処理後には前記低比重成分である単核球が位置する上チャンバと、
上側に上側開口が配置され下側が閉塞し、遠心分離処理前には前記遠心分離媒体が収納されると共に遠心分離処理後には不要成分である高比重成分が位置する下チャンバと、
前記上チャンバの下側開口と前記下チャンバの上側開口とを連通状態又は非連通状態に切り換える活栓と、
前記上チャンバの前記導入開口を密栓する蓋と、
を備えることを特徴とする単核球分離管。 - 前記活栓は、第1、第2及び第3接続口を有する3個の流体通路を備えた三方活栓であり、
第1接続口は前記上チャンバの下側開口に接続され、
第2接続口は前記下チャンバの上側開口に接続され、
遠心分離処理後に三方活栓の前記第1接続口及び前記第3接続口を連通させて、前記低比重成分である単核球を前記第3接続口から取り出すことを特徴とする請求項1に記載の単核球分離管。 - 前記遠心分離媒体は、ヨード造影剤を主成分とし、且つ、前記下チャンバに収納されていることを特徴とする請求項1又は2に記載の単核球分離管。
- 前記ヨード造影剤は、イオヘキソール、イオパミドール、イオメプロール、イオキシラン、イオベルソール、又はイオプロミドから選択される非イオン性水溶性ヨード造影剤であることを特徴とする請求項3記載の単核球分離管。
- 請求項1に記載の単核球分離管と、
単核球を含む複数成分からなる試料溶液が収納される試料溶液バッグと、
前記単核球分離管に対して空気を出し入れするエアバッグと、
前記単核球分離管の蓋を貫通して、前記上チャンバと前記試料溶液バッグとを接続する第1チューブと、
前記単核球分離管の蓋を貫通して、前記上チャンバと前記エアバッグとを接続する第2チューブと、を備えることを特徴とする単核球分離システム。 - 請求項2乃至4の何れか1項に記載の単核球分離管と、
単核球を含む複数成分からなる試料溶液が収納される試料溶液バッグと、
前記単核球分離管に対して空気を出し入れするエアバッグと、
分離された低比重成分である単核球を収納する単核球収納バッグと、
前記単核球分離管の蓋を貫通して、前記上チャンバと前記試料溶液バッグとを接続する第1チューブと、
前記単核球分離管の蓋を貫通して、前記上チャンバと前記エアバッグとを接続する第2チューブと、
前記単核球収納バッグと前記三方活栓の第3接続口とを接続する第3チューブと、を備えることを特徴とする単核球分離システム。 - ヨード造影剤を遠心分離媒体の主成分とする比重遠心分離法により、単核球を含む複数成分からなる試料溶液から単核球を分離する単核球の分離方法。
- 前記ヨード造影剤は、イオヘキソール、イオパミドール、イオメプロール、イオキシラン、イオベルソール、又はイオプロミドから選択される非イオン性水溶性ヨード造影剤である請求項7記載の単核球の分離方法。
- 請求項7又は8記載の単核球の分離方法により分離された単核球。
- 請求項9記載の単核球を有効成分として含む体内投与用薬剤。
- 脳疾患治療、神経変性疾患治療、末梢血管疾患治療、心疾患治療、脳性麻痺治療、腎梗塞治療、認知症治療、慢性腎不全治療、又は、慢性心不全治療のいずれかに使用される請求項10記載の体内投与用薬剤。
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