JP2012031101A - Composition for amelioration of non-alcoholic steatohepatitis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または治療に有用な組成物に関する。 The present invention relates to a composition useful for the prevention and / or treatment of nonalcoholic steatohepatitis.
非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、以下、ＮＡＦＬＤと称する）は、我が国の疾患治療において最も頻繁に遭遇する肝疾患の一つである。食生活の欧米化とともにその罹患率が増加しており、その治療薬の提供は重要な社会的課題である。ＮＡＦＬＤの原因としては、食生活の異常、肥満、糖尿病や高脂血症などの生活習慣病への罹患が挙げられる。 Non-alcoholic fatty liver disease (hereinafter referred to as NAFLD) is one of the most frequently encountered liver diseases in the treatment of diseases in Japan. The incidence is increasing with the westernization of the diet, and the provision of therapeutic drugs is an important social issue. Causes of NAFLD include abnormal eating habits, obesity, morbidity in lifestyle-related diseases such as diabetes and hyperlipidemia.
非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、以下、ＮＡＳＨと称する）は、アルコール過剰摂取を起因としないが、アルコール性肝障害に類似した進展を示す症例である。一般人の約１〜２％、ＮＡＦＬＤ患者の約１０％がＮＡＳＨである。ＮＡＳＨは脂肪肝に肝臓の炎症、壊死と肝線維化を来す病態であり、肝硬変、肝細胞癌にまで進展する。ＮＡＳＨの原因としては、食生活の異常、肥満、糖尿病や高脂血症などの生活習慣病が挙げられるが、発症機序は不明である。脂肪肝に加え、肝臓に何らかのストレスがかかることによって発生するのではないかと考えられている。 Non-alcoholic steatohepatitis (hereinafter referred to as NASH) is a case that does not result from excessive alcohol intake but progresses similar to alcoholic liver injury. About 1-2% of the general population and about 10% of NAFLD patients have NASH. NASH is a pathological condition that causes liver inflammation, necrosis and liver fibrosis in fatty liver, and progresses to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Causes of NASH include dietary abnormalities, obesity, lifestyle-related diseases such as diabetes and hyperlipidemia, but the onset mechanism is unknown. In addition to fatty liver, it is thought to be caused by some kind of stress on the liver.
現在、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを指摘された患者は食生活の改善や運動療法といった治療が主体となり、その他まだ、有効な治療法が確立されてはいない。これまで米国を中心にＮＡＳＨを含むＮＡＦＬＤの薬物療法に関して多くの臨床治験が報告されているにも関わらず、これらの疾患に対する有効な薬物療法は依然確立されていない。 At present, patients who have been pointed out to NAFLD or NASH are mainly treated for improvement of diet and exercise therapy, and other effective treatment methods have not been established yet. Although many clinical trials have been reported so far regarding pharmacotherapy of NAFLD including NASH mainly in the United States, effective pharmacotherapy for these diseases has not been established yet.
緑茶の水抽出物には複数のポリフェノール類が含まれ、これらはカテキン類として知られている。緑茶に含まれる代表的な茶カテキンはエピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートがある。これらのカテキン類は血圧上昇抑制作用、血中コレステロール調節作用、血糖値調節作用、抗酸化作用、老化抑制作用、抗突然変異作用、抗癌作用、抗菌作用、抗う蝕作用および抗アレルギー作用等の生理活性を有していることが知られている。 The green tea water extract contains a plurality of polyphenols, which are known as catechins. Representative tea catechins contained in green tea include epicatechin, epigallocatechin, epicatechin gallate, and epigallocatechin gallate. These catechins have a blood pressure increase inhibitory effect, blood cholesterol control effect, blood glucose level adjustment effect, antioxidant effect, aging inhibitory effect, antimutation effect, anticancer effect, antibacterial effect, anticariogenic effect and antiallergic effect, etc. It is known to have physiological activity.
カテキン類の肝障害への作用については、本発明者を含むグループはカテキン類が非アルコール性脂肪性肝疾患に有用であること（特許文献１）を報告している。これは緑茶カテキンの投与により、非アルコール性脂肪性肝疾患患者の肝脂肪沈着を抑制し、その結果肝障害が改善されることを示唆するものである。また、特許文献２はカテキン類を含む緑茶抽出物とカフェインを含む飲料が肝機能改善に有用であることを開示するものである。特許文献２ではカテキン類とカフェインを含む飲料を肝機能が正常範囲を超える対象に１２ヶ月飲用させたところ、血中のＧＰＴ、ＧＯＴおよびγ−ＧＰＴの数値が改善されることを示す。 Regarding the action of catechins on liver damage, the group including the present inventor has reported that catechins are useful for non-alcoholic fatty liver disease (Patent Document 1). This suggests that administration of green tea catechin suppresses liver fat deposition in patients with nonalcoholic fatty liver disease, and as a result, liver damage is improved. Patent document 2 discloses that a green tea extract containing catechins and a beverage containing caffeine are useful for improving liver function. Patent Document 2 shows that when a drink containing catechins and caffeine is drunk for 12 months to a subject whose liver function exceeds the normal range, the values of GPT, GOT, and γ-GPT in blood are improved.
ところでエピガロカテキンガレートの３”位置がＯ−メチル化された３”Ｏ−メチルエピガロカテキンガレート（以下「３”メチル化ＥＧＣＧ」）は一般的に日本で栽培されている品種の茶にはほとんど含まれておらず、「べにふうき」などの中国、台湾系統のアッサム雑種の特定の品種の茶葉にのみ含有されている。特許文献１および２において用いた緑茶カテキンには３”メチル化ＥＧＣＧは含まれていない。 By the way, 3 "O-methyl epigallocatechin gallate (hereinafter" 3 "methylated EGCG") in which the 3 "position of epigallocatechin gallate is O-methylated is generally found in teas of cultivars cultivated in Japan. It is rarely contained, and is contained only in tea leaves of certain varieties of Assam hybrids from China and Taiwan, such as “Benifuuki”. The green tea catechins used in Patent Documents 1 and 2 do not contain 3 "methylated EGCG.
最近になって３”メチル化ＥＧＣＧに抗アレルギー作用があることが見出されている（特許文献３および４）。また、３”メチル化ＥＧＣＧが抗腫瘍作用を有することについても、本発明者等のグループが報告している（特許文献５）。 Recently, it has been found that 3 "methylated EGCG has an antiallergic action (Patent Documents 3 and 4). The present inventors have also found that 3" methylated EGCG has an antitumor action. Have been reported (Patent Document 5).
メチル化部位を特定しないメチル化エピガロカテキンガレート（メチル化ＥＧＣＧ）が脂肪蓄積抑制作用を有することが特許文献６（特開平２００６−２９８７９２）に報告されている。特許文献６ではインビトロでメチル化ＥＧＣＧと共に培養した培養脂肪細胞において中性脂肪の蓄積が抑制されること、およびその作用がメチル化ＥＧＣＧを含有しない他の茶葉抽出物より高いことを開示する。 It is reported in Patent Document 6 (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-298792) that methylated epigallocatechin gallate (methylated EGCG) that does not specify a methylation site has a fat accumulation inhibitory action. Patent Document 6 discloses that accumulation of neutral fat is suppressed in cultured adipocytes cultured with methylated EGCG in vitro, and that its action is higher than other tea leaf extracts not containing methylated EGCG.
上記のとおり、カテキン類には肝疾患改善作用を有することが知られているが、この作用は肝臓に蓄積した脂肪を除去することに付随するものと考えられている。また３”メチル化ＥＧＣＧにはインビトロでの脂肪蓄積抑制作用が報告されているが、その肝臓への作用についての報告は無い。 As described above, catechins are known to have a liver disease ameliorating action, but this action is considered to be accompanied by removal of fat accumulated in the liver. In addition, 3 "methylated EGCG has been reported to inhibit fat accumulation in vitro, but there is no report on its effect on the liver.
本発明は非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または治療のための組成物を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the composition for the prevention and / or treatment of non-alcoholic steatohepatitis.
本発明は下式（Ｉ）：
で示される３”Ｏ−メチルエピガロカテキンガレート（３”メチル化ＥＧＣＧ）および／または３”Ｏ−メチルガロカテキンガレート（３”メチル化ＧＣＧ）を含有する、非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または治療剤を提供する。
The present invention provides the following formula (I):
Prevention of nonalcoholic steatohepatitis comprising 3 "O-methylepigallocatechin gallate (3" methylated EGCG) and / or 3 "O-methylgallocatechin gallate (3" methylated GCG) A therapeutic agent is provided.
本発明の組成物は、非アルコール性脂肪性肝炎の治療、予防に好適に用いられる。本発明の組成物は、医薬品として提供されてもよいし、または飲料を含む健康食品として提供されてもよい。 The composition of the present invention is suitably used for the treatment and prevention of nonalcoholic steatohepatitis. The composition of the present invention may be provided as a pharmaceutical or a health food including a beverage.
本発明の組成物は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおいて、脂肪蓄積への作用は乏しいにも拘らず、一方で肝臓に対する抗酸化作用並びに抗炎症作用を惹起し、インスリン感受性を回復させることが確認された。よって本発明の組成物は、非アルコール性脂肪性肝疾患、特に非アルコール性脂肪性肝炎を効果的に治療および／または予防することが可能である。 The composition of the present invention induces an antioxidative action and an anti-inflammatory action on the liver in a non-alcoholic steatohepatitis (NASH) model mouse, while having a poor effect on fat accumulation, and has an insulin sensitivity. It was confirmed to recover. Therefore, the composition of the present invention can effectively treat and / or prevent nonalcoholic fatty liver disease, particularly nonalcoholic steatohepatitis.
本発明において用いられる３”メチル化ＥＧＣＧおよび３”メチル化ＧＣＧは、化学合成によって調製しても、天然物から抽出してもよい。３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＣＧを含有する天然物としては、ダージリン系雑種であるべにふうき、べにほまれ、べにふじ、やえほ、するがわせ、ゆたかみどり、かなやみどり、おくむさし、青心大パン、青心ウーロン、大葉ウーロン、紅花、べにひかり、やまかい、やまみどり、からべに、香駿、そうふう、および、おくみどり、などの品種の茶葉が知られている。茶葉より３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＥＧを抽出する場合は、水または湯で抽出しても、その他公知のいずれの方法にて抽出してもよい。３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＣＧが含有されていれば抽出物の純度は低くてもよく、または該茶葉そのもの、もしくは茶葉を乾燥、粉砕したものを用いても良い。その他本発明において用いられる３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＣＧは特開２００７−３０６８０６記載の方法等、公知のいずれの方法を用いて調製されたものであってもよい。なお、本明細書において３”メチル化ＥＧＣＧと３”メチル化ＧＣＧを特に区別せずに称する場合に「メチル化カテキン」と記載する。
本発明の組成物としては、特に３”メチル化ＥＧＣＧを含有するものが好ましい。
The 3 "methylated EGCG and 3" methylated GCG used in the present invention may be prepared by chemical synthesis or extracted from natural products. Natural products containing 3 "methylated EGCG and / or 3" methylated GCG include the darjeelin hybrids Benifuuki, Benihore, Benifuji, Yaeho, Shigarase, Yutaka Midori, Kanaya Midori , Okumusashi, blue heart large bread, blue heart oolong, large leaf oolong, safflower, benihikari, yamakai, yamamidori, karabe, scent, sofu and okumidori It has been. When extracting 3 "methylated EGCG and / or 3" methylated GEG from tea leaves, it may be extracted with water or hot water, or any other known method. If 3 "methylated EGCG and / or 3" methylated GCG are contained, the purity of the extract may be low, or the tea leaves themselves or those obtained by drying and pulverizing tea leaves may be used. In addition, 3 "methylated EGCG and / or 3" methylated GCG used in the present invention may be prepared by any known method such as the method described in JP-A-2007-306806. In the present specification, 3 "methylated EGCG and 3" methylated GCG are referred to as "methylated catechin" when not specifically distinguished.
As the composition of the present invention, a composition containing 3 "methylated EGCG is particularly preferable.
本願の組成物の剤形としては、経口投与あるいは非経口投与（静脈内、皮内、腹腔内投与等）等の投与経路や投与目的に応じて錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤、軟膏、坐剤など適当な剤形とすればよい。 The dosage form of the composition of the present application includes tablets, powders, granules, capsules, injections according to the administration route and purpose of oral administration or parenteral administration (intravenous, intradermal, intraperitoneal administration, etc.). Appropriate dosage forms such as ointments and suppositories may be used.
本発明の組成物には適当な添加剤を含有させてもよい。添加剤としては特に限定されず賦形剤、希釈剤、増量剤、溶剤、潤滑剤、補助剤、結合剤、崩壊剤、被覆剤、カプセル化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、抗酸化剤、矯味剤、芳香剤、着色剤など、製剤学に関する一般書籍に記載されているものから必要に応じて適宜選択すればよい。 A suitable additive may be contained in the composition of the present invention. Additives are not particularly limited, excipients, diluents, extenders, solvents, lubricants, adjuvants, binders, disintegrants, coating agents, encapsulating agents, emulsifiers, dispersing agents, suspending agents, thickening agents. Agents, tonicity agents, buffering agents, soothing agents, preservatives, antioxidants, flavoring agents, fragrances, coloring agents, etc. That's fine.
本発明の組成物には、本発明の目的に反しない限り他の有効成分を含有させてもよい。また、本発明の組成物は、３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＣＧ以外の他のカテキン類、例えば茶抽出物としてこれらのメチル化カテキンと同時に抽出されるカテキン類を含有させてもよい。 The composition of the present invention may contain other active ingredients as long as the object of the present invention is not violated. The composition of the present invention contains 3 "methylated EGCG and / or other catechins other than 3" methylated GCG, for example, catechins extracted simultaneously with these methylated catechins as tea extracts. Also good.
本発明の組成物はまた、健康食品として提供されてもよいし、飲食物に配合するための粉、塊、液状等の製剤として提供されてもよい。飲食物としては、式Ｉの化合物を含有する飲料、例えば茶飲料が例示される。 The composition of the present invention may be provided as a health food, or may be provided as a preparation such as powder, lump or liquid for blending with food or drink. Examples of the food and drink include beverages containing the compound of formula I, such as tea beverages.
本発明の組成物は、ＮＡＳＨ患者に投与するのみならず、他の生活習慣病に既に罹患している、あるいはその可能性が高いと考えられるＮＡＳＨへの罹患の可能性が高い患者においてＮＡＳＨ予防のために用いてもよい。 The composition of the present invention is not only administered to NASH patients, but also prevents NASH in patients who are already suffering from other lifestyle-related diseases or are highly likely to suffer from NASH. May be used for
本発明の組成物の投与量は対象者の年齢、性別、体重、症状、投与経路等によって適宜決定すればよく、特に限定されない。成人男性（体重約５０キログラム）のＮＡＳＨ予防または治療のために経口投与する場合の非限定的投与量としては、メチル化カテキンを１日２０〜１５００ｍｇ、好ましくは３０〜１０００ｍｇ、特に１００〜２００ｍｇ程度が例示される。本発明に用いられるメチル化カテキンには明らかな毒性は認められておらず、多量に摂取しても健康上の問題が生じることはないと考えられる。 The dosage of the composition of the present invention may be determined as appropriate according to the age, sex, weight, symptom, route of administration, etc. of the subject and is not particularly limited. Non-limiting doses for oral administration for the prevention or treatment of NASH in adult males (body weight of about 50 kilograms) include methylated catechins of 20 to 1500 mg, preferably 30 to 1000 mg, particularly about 100 to 200 mg per day. Is exemplified. The methylated catechin used in the present invention has no apparent toxicity, and it is considered that no health problem will occur even if a large amount is consumed.
汎用されているＮＡＳＨモデルマウスを用いた。生後７週目雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにメチオニン・コリン（Ｍ／Ｃ）欠乏飼料（和光純薬工業株式会社、日本国大阪市）を摂取させＮＡＳＨモデルを作製した。
１８週目以降、動物を４群に分け、それぞれの飲料水をメチル化カテキン、または通常のカテキンを含有するものに変更した。アサヒ飲料株式会社提供のリョクチャエキスパウダーを用いた。下記に示すＮｏ．１〜３いずれかのリョクチャエキスパウダー１．５２８ｍｇが５ｍｌの飲料水に含まれるように飲料水を調製した。
なお、５ｍｌは体重２０ｇのマウス６匹が１日に摂取するであろう飲料水の量に匹敵する。各リョクチャエキスパウダーの量は、低濃度メチル化カテキン投与群においてはマウス１匹が１日につき０．００６８ｍｇのメチル化カテキンが投与される量であり、体重５０ｋｇのヒトに換算するとその投与量は１７ｍｇ／日となる量である。また、高濃度メチル化カテキン投与群では、マウス１匹につき０．０６ｍｇ／日、体重５０ｋｇのヒト換算で１５０ｍｇ／日のメチル化カテキンが投与される量である。
A commonly used NASH model mouse was used. Seven-week-old male C57BL / 6 mice were fed a methionine / choline (M / C) deficient diet (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) to produce a NASH model.
From the 18th week, the animals were divided into 4 groups, and each drinking water was changed to one containing methylated catechins or normal catechins. Ryokucha extract powder provided by Asahi Beverage Co., Ltd. was used. No. shown below. Drinking water was prepared so that 1.528 mg of any one of 1-3 ryokcha extract powder was contained in 5 ml of drinking water.
Note that 5 ml is comparable to the amount of drinking water that 6 mice weighing 20 g would consume daily. The amount of each mushroom extract powder is the amount in which 0.0068 mg of methylated catechin is administered per mouse in a low-concentration methylated catechin-administered group. The amount is 17 mg / day. In the high-concentration methylated catechin administration group, the amount of methylated catechin administered is 0.06 mg / day per mouse and 150 mg / day in terms of a human body weight of 50 kg.
各群は１）飲料水対照群（通常飲料水）、２）高濃度メチル化カテキン投与群（Ｎｏ．２のリョクチャエキスパウダー添加飲料水）、３）低濃度メチル化カテキン投与群（Ｎｏ．１のリョクチャエキスパウダー添加飲料水）、４）通常カテキン投与群（Ｎｏ．３のリョクチャエキスパウダー添加飲料水）である。各群それぞれ６匹とした。試験期間中、各動物には飲料水並びにＭ／Ｃ欠乏飼料を自由に摂取させた。 Each group is 1) drinking water control group (ordinary drinking water), 2) high-concentration methylated catechin administration group (drinking water with No. 2 ryokcha extract powder), 3) low-concentration methylated catechin administration group (No. 1) 4) Normal catechin-administered group (No. 3 ryokcha extract powder-added drinking water). There were 6 animals in each group. During the test period, each animal had free access to drinking water and M / C deficient diet.
２８週目に殺戮し、肝臓を取り出した。１）肝体重比の算出、２）肝組織学的評価、３）抗8-hydro-2'-deoxyguanosine（8OhdG）抗体を用いた免疫組織化学による酸化ストレスの評価、４）ＴＮＦαシグナル系タンパク質発現並びにインスリンシグナル系タンパク質の発現を調べた。 At the 28th week, he was killed and the liver was removed. 1) Liver-body weight ratio calculation, 2) Liver histological evaluation, 3) Evaluation of oxidative stress by immunohistochemistry using anti-8-hydro-2'-deoxyguanosine (8OhdG) antibody, 4) TNFα signal system protein expression In addition, the expression of insulin signal protein was examined.
１）肝体重比
２８週目の殺戮前に各動物の体重を測定した。その後肝臓を取り出し、その重さを測定して肝体重比を算出した。結果を図１に示す。
肝体重比は４つの群間で有意差は認められなかった。
1) Liver weight ratio The body weight of each animal was measured before the slaughter of the 28th week. Thereafter, the liver was taken out and its weight was measured to calculate the liver weight ratio. The results are shown in FIG.
The liver weight ratio was not significantly different among the four groups.
２）肝組織学的評価
取り出した肝臓の切片を作成し、顕微鏡下で細胞形態を観察した。観察結果を下記表に示すグレードに分けて判定した：
結果を図２Ａ〜Ｆに示す。図２Ａより明らかなように、全ての群で肝脂肪化、即ち肝細胞への脂肪沈着が認められ、その程度には群間で差が無かった。このことは、従来の先行文献に示された、メチル化カテキンの脂肪肝への投与により、肝脂肪が低下する事実に反するが、これは、一旦沈着した脂肪を除去する効果が発揮される期間より短い期間において、評価したため、或いは、肝脂肪除去乃至は減少させるには不十分である少量の投与量であったと推測される。 The results are shown in FIGS. As apparent from FIG. 2A, hepatic steatosis, that is, fat deposition on hepatocytes, was observed in all groups, and there was no difference between the groups. This is contrary to the fact that hepatic fat is reduced by the administration of methylated catechin to fatty liver as shown in the prior literature, but this is a period during which the effect of removing the once deposited fat is exhibited. It is presumed that the dose was small enough to be evaluated in a shorter period or insufficient to remove or reduce liver fat.
一方で、炎症細胞浸潤、風船化肝細胞、マクロリーディング小体、脂肪肉芽腫、肝細胞周囲線維化についてはいずれも飲料水対照群で上昇した値が高濃度メチル化カテキン投与群では飲料水対照群および通常カテキン投与群に比して有意に低値を示した。即ち、肝臓に蓄積した脂肪を除去することなく、肝臓の炎症所見が改善されている。これにより、従来文献において示唆されている、３”メチル化ＥＧＣＧが沈着した脂肪を除去し、脂肪が除去されることにより肝機能が回復するということとは異なり、肝脂肪を除去あるいは低減させずに、肝機能を回復させるという、これまで提唱された作用機作とは異なる作用機差にてＮＡＳＨの治療に有用であることが見出された。 On the other hand, inflammatory cell infiltration, ballooning hepatocytes, macroreading bodies, lipogranulomas, and fibrosis around the hepatocytes all increased in the drinking water control group, but in the high concentration methylated catechin administration group The value was significantly lower than that of the group and normal catechin administration group. That is, the inflammation findings of the liver are improved without removing fat accumulated in the liver. This removes the fat deposited with 3 "methylated EGCG suggested in the prior art and restores liver function by removing the fat, without removing or reducing liver fat. In addition, it was found that NASH is useful for the treatment of NASH with a mechanism of action different from the mechanism of action proposed so far, which is to restore liver function.
３）酸化ストレス評価
抗8-hydro-2’-deoxyguanosine(8OhdG)抗体を用いた免疫組織染色による酸化ストレスの評価を行った。８ＯＨｄＧはＤＮＡ中のグアニン塩基が酸化損傷を受けて生成する物質であり、細胞内におけるその存在は酸化ストレスに相関する。
得られた肝臓切片に対して一次抗体としてマウス由来ＨＯＨｄＧモノクローナル抗体（日本老化制御研究所、袋井市）を、二次抗体としてビオチン化二次抗体（ABCkitblue-labeled bottle)を用いて常法に従い免疫染色した。その後、ヘマトキシリン核染色し、顕微鏡下で8ＯＨｄＧの存在を観察した。観察結果を下記グレードに基づき判定した：
3) Oxidative stress evaluation Oxidative stress was evaluated by immunohistochemical staining using an anti-8-hydro-2'-deoxyguanosine (8OhdG) antibody. 8OHdG is a substance produced by oxidative damage of a guanine base in DNA, and its presence in cells correlates with oxidative stress.
The obtained liver slice was immunized according to a conventional method using a mouse-derived HOHdG monoclonal antibody (Nippon Aging Control Laboratory, Fukuroi City) as a primary antibody and a biotinylated secondary antibody (ABC kit blue-labeled bottle) as a secondary antibody. Stained. Thereafter, hematoxylin nuclear staining was performed, and the presence of 8OHdG was observed under a microscope. The observation results were judged based on the following grades:
図３から明らかなように高濃度メチル化カテキン投与群の肝細胞内の8OhdG発現は他の投与群と比較して明らかに減少しており、高濃度メチル化カテキンの投与により酸化ストレスが抑制されることがわかる。 As is clear from FIG. 3, the expression of 8OhdG in the hepatocytes of the high-concentration methylated catechin-administered group is clearly reduced compared to the other administration groups, and oxidative stress is suppressed by administration of the high-concentration methylated catechin. I understand that
４）インスリンシグナル系並びにTNFαシグナル系タンパク質発現の観察
２８週目に取り出した肝臓をホモジェナイザーにより組織を破壊し、タンパク質を抽出した。インスリンシグナル系（抗ＩＲＳ−１およびｐＩＲＳ−１抗体）、およびＴＮＦαシグナル系（抗ＡＫＴ、ｐＡＫＴ、ＴＮＦ−α、ＮＦ−ｋβ、ｐＮＦ−ｋβ、β−ａｃｔｉｎの各抗体）（各１ｍｇ／ｍｌ）を用いて常法に従いウェスタンブロット解析を行い、各タンパク質の発現を調べた。結果を図４に示す。
4) Observation of insulin signal system and TNFα signal system protein expression The liver was removed from the 28th week, the tissue was destroyed with a homogenizer, and the protein was extracted. Insulin signal system (anti-IRS-1 and pIRS-1 antibodies), and TNFα signal system (anti-AKT, pAKT, TNF-α, NF-kβ, pNF-kβ, β-actin antibodies) (each 1 mg / ml) Western blot analysis was performed according to a conventional method, and the expression of each protein was examined. The results are shown in FIG.
図４より明らかなように、高濃度メチル化カテキン投与群においては、ＩＲＳ−１およびｐ（リン酸化）ＩＲＳ−１の発現が顕著に高かった。これにより、ＮＡＳＨモデルマウスにおいて減少しているインスリン感受性がメチル化カテキンの投与により回復したことがわかる。一方で、ｐＡＫＴ、ＮＦκβ、ｐＮＦκβの発現は明らかに減少しており、またＴＮＦαも減少傾向が認められた。これらの炎症性メディエーターの発現が減少していることにより、メチル化カテキンにはＮＡＳＨモデルマウス肝臓において抗炎症作用を惹起していることがわかる。 As is clear from FIG. 4, the expression of IRS-1 and p (phosphorylated) IRS-1 was remarkably high in the high concentration methylated catechin administration group. This shows that the insulin sensitivity decreased in the NASH model mice was recovered by administration of methylated catechin. On the other hand, the expression of pAKT, NFκβ, and pNFκβ was clearly decreased, and TNFα also decreased. The decrease in the expression of these inflammatory mediators indicates that methylated catechin induces an anti-inflammatory effect in the NASH model mouse liver.
上記結果より、本願発明の組成物は、従来考えられていたカテキン類による肝蓄積脂肪の除去による肝疾患の改善とは全く別の作用機作、即ち抗炎症作用並びに酸化ストレス抑制作用により肝機能を改善することがわかる。 From the above results, the composition of the present invention has a completely different mechanism of action from the improvement of liver diseases by removing the accumulated fat of the liver by catechins, which has been conventionally considered, that is, liver function by anti-inflammatory action and oxidative stress inhibitory action. It turns out that it improves.
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