JP2012023998A - Method for controlling expression of target gene in eukaryotic cell, rna molecule and dna molecule - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、真核細胞において目的遺伝子の発現を制御するための方法と、当該方法で用いるRNA分子とDNA分子に関するものである。 The present invention relates to a method for controlling the expression of a target gene in a eukaryotic cell, and an RNA molecule and a DNA molecule used in the method.
細胞は様々な遺伝子発現の調節機構を有しており、例えば、特定の酵素が必要となった際にそれをコードする遺伝子の発現を開始したり、また、特定の遺伝子が過剰に発現したりしないようにしている。 Cells have various gene expression regulation mechanisms, such as when a specific enzyme is needed, it begins to express the gene that encodes it, or a specific gene is overexpressed. I try not to.
このような機構としては、大腸菌のラクトースオペロンが有名である。ラクトースオペロンでは、グルコースが存在せず且つラクトースが存在するときに、ラクトース分解酵素であるβ−ガラクトシダーゼが産生されるように制御されている。 As such a mechanism, the lactose operon of E. coli is famous. The lactose operon is controlled so that β-galactosidase, which is a lactose degrading enzyme, is produced when glucose is not present and lactose is present.
このラクトースオペロンを利用すれば、原核細胞において、IPTGなどのラクトース類縁体による遺伝子発現の促進が可能である。しかし、遺伝子発現の促進に用いられる化合物はラクトース類縁体に限定され、所望の分子により遺伝子発現を制御することはできない。また、真核細胞でこのラクトースオペロンを用いることはできない。 If this lactose operon is utilized, gene expression can be promoted by a lactose analog such as IPTG in prokaryotic cells. However, compounds used for promoting gene expression are limited to lactose analogs, and gene expression cannot be controlled by a desired molecule. In addition, this lactose operon cannot be used in eukaryotic cells.
真核細胞で機能する分子応答性の遺伝子発現制御機構も、ごくわずかではあるが見出されている。しかし、やはり発現制御に使用できる化合物が限られる。 Molecular responsive gene expression control mechanisms that function in eukaryotic cells have also been found to a small extent. However, there are still limited compounds that can be used for expression control.
その他にも、代謝産物などの特定分子により遺伝子の発現を制御する機構が原核生物で見出されている。詳しくは、図1のとおり、この機構においては、タンパク質をコードする遺伝子の上流にリボソーム結合部位(RBS)が存在し、さらにその上流には代謝産物などの結合部位(アプタマー)が存在する。通常は、リボソーム結合部位にリボソームが結合し、その下流の遺伝子が翻訳されるが、代謝産物などがアプタマーに結合するとリボソーム結合部位の構造が変化してリボソームが結合できなくなり、結果として翻訳が阻害される。このようにして、原核細胞の中には、特定遺伝子の過剰発現が抑制されているものがある。このような機構は、リボ核酸(RNA)がそれ自体で遺伝子発現を制御していることから、リボスイッチと呼ばれている。 In addition, mechanisms that control gene expression by specific molecules such as metabolites have been found in prokaryotes. Specifically, as shown in FIG. 1, in this mechanism, a ribosome binding site (RBS) exists upstream of a gene encoding a protein, and a binding site (aptamer) such as a metabolite exists further upstream. Normally, the ribosome binds to the ribosome binding site and the downstream gene is translated, but when a metabolite or the like binds to the aptamer, the structure of the ribosome binding site changes and the ribosome cannot bind, resulting in inhibition of translation. Is done. In this way, some prokaryotic cells have suppressed overexpression of specific genes. Such a mechanism is called a riboswitch because ribonucleic acid (RNA) controls gene expression by itself.
所望の分子に結合するアプタマー自体は、試験管内人工進化法で獲得することが可能であるため、アプタマーを用いた人工リボスイッチシステムの構築方法が確立できれば、所望の分子により遺伝子発現を制御でき得る。また、天然から見出されているリボスイッチは、通常、上述したような遺伝子発現を抑制するタイプのものであるが、産業上より有用な促進タイプのリボスイッチの構築も可能であり得る。実際、原核細胞で働く人工リボスイッチシステムがいくつか報告されている。 Aptamers that bind to the desired molecule can be obtained by in vitro artificial evolution. Therefore, if a method for constructing an artificial riboswitch system using the aptamer can be established, gene expression can be controlled by the desired molecule. . In addition, riboswitches found in nature are usually of the type that suppresses gene expression as described above, but it may also be possible to construct a promotion type riboswitch that is more useful industrially. In fact, several artificial riboswitch systems that work in prokaryotic cells have been reported.
ところが、上記の原核細胞のリボスイッチを真核細胞に応用することはできない。真核細胞では、原核細胞と異なり、mRNA内部のリボソーム結合部位へのリボソームの結合の可否により翻訳が制御されているのではなく、リボソームはmRNAの5’末端に結合し、翻訳が開始されることによる。 However, the prokaryotic riboswitch cannot be applied to eukaryotic cells. In eukaryotic cells, unlike prokaryotic cells, translation is not controlled by whether or not ribosomes bind to ribosome binding sites inside mRNA, but ribosomes bind to the 5 ′ end of mRNA and translation begins. It depends.
しかし、真核生物でも所望の分子によりmRNAの翻訳を制御する技術が開発されている。 However, even in eukaryotes, a technique for controlling translation of mRNA by a desired molecule has been developed.
例えば、特許文献1と非特許文献1〜2には、図2のとおり、特定化合物へ選択的に結合するアプタマーをmRNAの5’非翻訳領域やスプライシングサイトに挿入し、特定分子のアプタマーへの結合によりリボソームによるスキャニングやスプライソソームによるスプライシングを阻害し、結果として翻訳を阻害するシステムが開示されている。しかし、かかるシステムでは翻訳を阻害することはできても、特定分子を用いて翻訳を促進することはできない。 For example, in Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 and 2, as shown in FIG. 2, an aptamer that selectively binds to a specific compound is inserted into the 5 ′ untranslated region or splicing site of mRNA, Disclosed is a system that inhibits scanning by ribosomes and splicing by spliceosomes by binding, and consequently inhibits translation. However, even though such a system can inhibit translation, it cannot promote translation using a specific molecule.
また、特許文献2と非特許文献3〜4には、特定の分子により切断活性が抑制される核酸(リボザイム)や特定の分子により切断活性が付与される核酸(アプタザイム)をmRNAに挿入したシステムが開示されている。本発明者らは、同様のシステムを応用し、特定の分子を検出するためのシステムを開発している(特許文献3)。ところが、かかるシステムは複雑で設計自体が困難であり、また、核酸の切断を伴うために一方向の制御しかできない上に、システムの応答性は核酸酵素の活性に大きく依存するという欠点を有する。 Patent Document 2 and Non-Patent Documents 3 to 4 describe a system in which a nucleic acid (ribozyme) whose cleavage activity is suppressed by a specific molecule or a nucleic acid (aptozyme) whose cleavage activity is imparted by a specific molecule is inserted into mRNA. Is disclosed. The present inventors have developed a system for detecting a specific molecule by applying a similar system (Patent Document 3). However, such a system is complicated and difficult to design itself. Further, since it involves the cleavage of nucleic acid, it can only be controlled in one direction, and the responsiveness of the system greatly depends on the activity of the nucleic acid enzyme.
さらに、特許文献4〜5と非特許文献5〜7には、mRNAとは異なるRNAに分子応答性を付与し、アンチセンス効果やRNAi効果により翻訳を制御するシステムが記載されている。しかし当該システムでは、mRNAとは異なるRNAが必要であるため、二種のRNAの転写量や転写場所の調整が必要である。また、複数のRNAを用いると、他の遺伝子に悪影響を及ぼす可能性が増大するという問題が生じる。 Furthermore, Patent Documents 4 to 5 and Non-Patent Documents 5 to 7 describe systems in which molecular responsiveness is imparted to RNA different from mRNA, and translation is controlled by an antisense effect or RNAi effect. However, since this system requires RNA different from mRNA, it is necessary to adjust the transcription amount and transcription site of the two types of RNA. In addition, when a plurality of RNAs are used, there is a problem that the possibility of adversely affecting other genes increases.
上述したように、従来、真核細胞において導入遺伝子の発現や翻訳を制御するためのシステムは既に開発されている。しかしながら、mRNA以外のRNAやRNA酵素を用いることなく、導入遺伝子の発現を所望の分子により簡便に制御できる技術は無かった。 As described above, conventionally, systems for controlling transgene expression and translation in eukaryotic cells have already been developed. However, there has been no technique that can easily control the expression of a transgene with a desired molecule without using RNA or RNA enzyme other than mRNA.
そこで、本発明が解決すべき課題は、mRNA以外のRNAやRNA酵素を用いることなく、導入遺伝子の発現を所望の分子により簡便に制御するためのRNA分子を提供することにある。また、本発明は、当該RNA分子をコードするDNA分子と、当該DNA分子を用いて目的遺伝子を真核細胞において発現するための方法を提供することも目的とする。 Therefore, the problem to be solved by the present invention is to provide an RNA molecule for easily controlling the expression of a transgene with a desired molecule without using RNA or RNA enzyme other than mRNA. Another object of the present invention is to provide a DNA molecule encoding the RNA molecule and a method for expressing the target gene in eukaryotic cells using the DNA molecule.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、内部リボソーム結合サイト配列を有するウィルスmRNAを利用し、特に、その5’末端に5’末端ステムループを導入して真核細胞で主要な5’末端依存性の翻訳を抑制し、且つ適切なモジュレータ配列とアプタマー配列を導入することによりリガンドの存在・不存在時における内部リボソーム結合サイトの三次元構造の変化を制御すれば、リガンドの存在・不存在に応じて目的遺伝子の発現を明確に制御できることを見出して、本発明を完成した。 This inventor repeated earnest research in order to solve the said subject. As a result, viral mRNA having an internal ribosome binding site sequence is used, and in particular, a 5 ′ end stem loop is introduced at its 5 ′ end to suppress major 5 ′ end dependent translation in eukaryotic cells, and By introducing appropriate modulator and aptamer sequences to control the change in the three-dimensional structure of the internal ribosome binding site in the presence or absence of the ligand, the expression of the target gene can be clarified according to the presence or absence of the ligand. As a result, the present invention was completed.
本発明に係るRNA分子は、リガンドにより目的遺伝子の発現を制御できるRNA分子であって、5’側から以下の構造および配列を有することを特徴とする。 The RNA molecule according to the present invention is an RNA molecule that can control the expression of a target gene by a ligand, and has the following structure and sequence from the 5 'side.
(a) 5’末端依存性翻訳を阻害する5’末端ステムループ;
(b) リガンド不存在時に、下記アプタマー配列の一部と相補的に結合してモジュレータ配列ステムループを形成するモジュレータ配列;
(c) リガンド不存在時には、モジュレータ配列および下記アプタマー配列の一部と共にステムループを形成し、リガンド存在時には下記anti−内部リボソーム結合サイト配列(以下、内部リボソーム結合サイトを「IRES」(Internal Ribosome Entry Site)と略記する)と相補的二重鎖を形成するanti−anti−IRES配列;
(d) リガンドとの結合能を有するアプタマー配列;
(e) リガンド不存在時にはIRESの一部と相補的二重鎖を形成してIRESへのリボソームの結合を阻害し、リガンド存在時にはanti−anti−IRES配列と相補的二重鎖を形成するanti−IRES配列;
(f) IRES;および
(g) 目的遺伝子
(A) a 5 ′ end stem loop that inhibits 5 ′ end dependent translation;
(B) a modulator sequence that forms a modulator sequence stem loop by complementary binding to a portion of the aptamer sequence described below in the absence of a ligand;
(C) When a ligand is absent, a stem loop is formed together with a modulator sequence and a part of the following aptamer sequence. When a ligand is present, the following anti-internal ribosome binding site sequence (hereinafter referred to as “IRES” (Internal Ribosome Entry) Site) and an anti-anti-IRES sequence forming a complementary duplex;
(D) an aptamer sequence capable of binding to a ligand;
(E) In the absence of a ligand, it forms a complementary duplex with a portion of the IRES to inhibit ribosome binding to the IRES, and in the presence of a ligand, it forms an complementary duplex with the anti-anti-IRES sequence. An IRES sequence;
(F) IRES; and (g) gene of interest
上記IRESに対するanti−IRES配列の相補塩基長としては、6以上、12以下が好適である。当該相補塩基長が6以上であれば、リガンドが存在していないときにanti−IRES配列がIRESとより確実に相補鎖を形成し、IRESの働きを阻害してIRES依存性の翻訳を有効に抑制できる。また、当該相補塩基長が12以下であれば、リガンドの存在によりanti−IRES配列がより確実にIRESから脱離し、IRES依存性翻訳を開始せしめることが十分に可能になる。 The complementary base length of the anti-IRES sequence for the IRES is preferably 6 or more and 12 or less. If the complementary base length is 6 or more, the anti-IRES sequence more reliably forms a complementary strand with the IRES in the absence of a ligand, effectively inhibiting IRES-dependent translation by inhibiting the function of the IRES. Can be suppressed. If the complementary base length is 12 or less, the anti-IRES sequence can be more reliably detached from the IRES due to the presence of the ligand, and the IRES-dependent translation can be started sufficiently.
上記anti−IRES配列に対するanti−anti−IRES配列の相補塩基長としては、6以上、12以下が好適である。当該相補塩基長が6以上であれば、リガンドが存在しているときにanti−anti−IRES配列がanti−IRES配列とより確実に相補鎖を形成してanti−IRES配列の働きを阻害し、IRES依存性の翻訳を有効に進行せしめることが可能になる。また、当該相補塩基長が12以下であれば、リガンドの不存在時にanti−IRES配列がanti−anti−IRES配列から脱離し、より確実にIRESに結合して不活性化することが可能になる。 The complementary base length of the anti-anti-IRES sequence relative to the anti-IRES sequence is preferably 6 or more and 12 or less. If the complementary base length is 6 or more, when a ligand is present, the anti-anti-IRES sequence more reliably forms a complementary strand with the anti-IRES sequence and inhibits the action of the anti-IRES sequence, It becomes possible to effectively proceed with IRES-dependent translation. If the complementary base length is 12 or less, the anti-IRES sequence can be detached from the anti-anti-IRES sequence in the absence of the ligand, and can be more reliably bound to the IRES and inactivated. .
上記モジュレータ配列がアプタマー配列の一部のみならず、anti−anti−IRES配列の一部とも相補的二重鎖を形成する場合、その相補塩基長としては、5以下が好適である。モジュレータ配列のanti−anti−IRES配列の一部に結合する部分の塩基配列は、anti−IRES配列の一部と同一にならざるを得ない。よって、上記相補塩基長が過剰に長いと、モジュレータ配列自体がIRESに結合し、IRES配列依存性の翻訳を阻害するおそれがあり得る。しかし上記相補塩基長が5以下であれば、かかる阻害を有効に抑制することができる。 When the modulator sequence forms a complementary duplex with not only a part of the aptamer sequence but also a part of the anti-anti-IRES sequence, the complementary base length is preferably 5 or less. The base sequence of the portion that binds to a part of the anti-anti-IRES sequence of the modulator sequence must be the same as a part of the anti-IRES sequence. Therefore, if the complementary base length is excessively long, the modulator sequence itself may bind to IRES and inhibit IRES sequence-dependent translation. However, when the complementary base length is 5 or less, such inhibition can be effectively suppressed.
上記アプタマー配列の一部に対するモジュレータ配列の相補塩基長としては、4以上、8以下が好適である。当該相補塩基長が4以上である場合、リガンドが存在しないときにモジュレータ配列がアプタマー配列へより確実に結合し、IRES依存性の翻訳を有効に抑制できる。一方、当該相補塩基長が8以下である場合には、リガンドの存在によるアプタマーの三次元構造変化に応じてモジュレータ配列がアプタマー配列からより確実に脱離し、anti−anti−IRES配列とanti−IRES配列との結合を抑制せず、ひいてはIRES依存性の翻訳を促進することができる。即ち、当該相補塩基長が4以上、8以下である場合には、リガンドによるIRES依存性の翻訳のオン−オフスイッチが非常に有効に働く。 The complementary base length of the modulator sequence for a part of the aptamer sequence is preferably 4 or more and 8 or less. When the complementary base length is 4 or more, the modulator sequence binds more reliably to the aptamer sequence when no ligand is present, and IRES-dependent translation can be effectively suppressed. On the other hand, when the complementary base length is 8 or less, the modulator sequence is more reliably detached from the aptamer sequence in accordance with the three-dimensional structural change of the aptamer due to the presence of the ligand, and the anti-anti-IRES sequence and the anti-IRES sequence. The binding to the sequence is not suppressed, and thus IRES-dependent translation can be promoted. That is, when the complementary base length is 4 or more and 8 or less, an on / off switch for IRES-dependent translation by a ligand works very effectively.
但し、アプタマー配列の一部とモジュレータ配列との好適な相補塩基長は、アプタマーの配列にも依存する。よって、同様の好適な態様は、モジュレータ配列ステムループ構造の安定性によって定めることが好ましい。かかる基準として、モジュレータ配列ステムループ構造のギブズ自由エネルギー(ΔG)が−17.5kcal/mol以上、−8.5kcal/mol以下である場合が好適である。上記で述べた理由と同様に、リガンドの存在・不存在によるモジュレータ配列ステムループ構造、即ちモジュレータ配列とanti−anti−IRES配列の一部およびアプタマー配列の一部との結合と脱離が明確となり、リガンドによるIRES依存性の翻訳のスイッチが非常に有効に働く。 However, the preferred complementary base length between a part of the aptamer sequence and the modulator sequence also depends on the aptamer sequence. Thus, it is preferable that the same preferred embodiment is defined by the stability of the modulator array stem loop structure. As such a criterion, the Gibbs free energy (ΔG) of the modulator array stem loop structure is preferably −17.5 kcal / mol or more and −8.5 kcal / mol or less. For the same reason as described above, the modulator sequence stem-loop structure due to the presence or absence of the ligand, that is, the binding and desorption of the modulator sequence and a part of the anti-anti-IRES sequence and a part of the aptamer sequence are clarified. The switch of IRES-dependent translation by ligands works very effectively.
上記IRESとしては、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのものが好適であり、また、anti−IRES配列としては、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのIRESの三次元構造における偽結節IIIまたはステムループVに結合可能なものが好適である。これらIRESとanti−IRES配列の優れた効果は、後述する実験により実証されている。 The above-mentioned IRES is preferably those of the Chabanus stink bug enteric virus, and the anti-IRES sequence is capable of binding to the pseudonodule III or the stem loop V in the three-dimensional structure of the IRES of the Chabae stink bug enteric virus. Is preferred. The excellent effects of these IRES and anti-IRES sequences have been demonstrated by experiments described below.
本発明に係るDNA分子は、上記RNA分子をコードするものであり、且つ当該コード領域の上流にプロモータ配列を有することを特徴とする。 The DNA molecule according to the present invention encodes the above RNA molecule, and has a promoter sequence upstream of the coding region.
本発明に係る目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための第一の方法は、上記RNA分子またはDNA分子を真核細胞の抽出物と混合し、反応させる工程を含むことを特徴とする。 A first method for controlling the expression of a target gene according to the present invention in a eukaryotic cell includes a step of mixing and reacting the RNA molecule or DNA molecule with an eukaryotic cell extract. .
また、本発明に係る目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための第二の方法は、上記DNA分子を真核細胞にトランスフェクションする工程;および、真核細胞にリガンドを導入することにより、内部リボソーム結合サイトを活性化する工程を含むことを特徴とする。 In addition, a second method for controlling the expression of a target gene according to the present invention in a eukaryotic cell includes a step of transfecting the DNA molecule into a eukaryotic cell; and by introducing a ligand into the eukaryotic cell. And a step of activating an internal ribosome binding site.
上記RNA分子、DNA分子と遺伝子発現の制御方法は、真核細胞またはその抽出物を用い、リガンドの存在・不存在に応じて目的遺伝子の発現を明確に制御できる点で非常に有用である。 The above RNA molecule, DNA molecule and gene expression control method is very useful in that eukaryotic cells or extracts thereof can be used and the expression of the target gene can be clearly controlled depending on the presence or absence of the ligand.
本発明によれば、従来、真核細胞における導入遺伝子発現の制御は複雑なシステムなどを用いない限りオフ制御しかできなかったのに対して、ウィルスのIRES(内部リボソーム結合サイト)を用いた簡便なシステムにより、導入遺伝子の発現をオン制御することができる。 According to the present invention, conventionally, control of transgene expression in eukaryotic cells could only be controlled off unless a complex system or the like was used, whereas simple control using a viral IRES (internal ribosome binding site). This system enables on-regulation of transgene expression.
よって本発明は、リガンドを用いた導入遺伝子発現の制御を通じて、タンパク質の他、薬剤などの化合物の製造、疾病の治療や診断、バイオセンサーやバイオイメージング、合成生物学、タンパク質の働きや細胞の活動の網羅的な解析など、幅広い応用が考えられるものとして、産業上非常に有用である。また、本発明に係る核酸は、ウィルスにおいても発現や翻訳が可能であるので、ウィルス研究にも適用可能である。 Therefore, the present invention can control the expression of transgenes using ligands, produce proteins and other compounds such as drugs, treat and diagnose diseases, biosensors and bioimaging, synthetic biology, protein functions and cell activities It is very useful in industry as a wide range of applications such as exhaustive analysis. Moreover, since the nucleic acid according to the present invention can be expressed and translated in viruses, it can also be applied to virus research.
以下、本発明に係るRNA分子の構造と配列を、5’末端側から説明する。なお、本発明に係るRNA分子の具体的な一例が図10に示されている。 Hereinafter, the structure and sequence of the RNA molecule according to the present invention will be described from the 5 'end side. A specific example of the RNA molecule according to the present invention is shown in FIG.
(a) 5’末端ステムループ
5’末端ステムループは、本発明に係るRNA分子の5’末端に存在し、その末端配列同士が相補鎖を形成しているステムループ構造を有するものである。その主な役割は、真核細胞での5’末端依存性翻訳、即ち、mRNAの5’末端へのリボソームの結合により開始される翻訳を阻害することにある。また、モジュレータ配列とanti−anti−IRES配列の一部およびアプタマー配列の一部との相補鎖の形成を安定化するという役割も有する。
(A) 5 ′ terminal stem loop The 5 ′ terminal stem loop is present at the 5 ′ terminal of the RNA molecule according to the present invention, and has a stem loop structure in which the terminal sequences form complementary strands. Its main role is to inhibit 5 ′ end-dependent translation in eukaryotic cells, ie translation initiated by the binding of ribosomes to the 5 ′ end of mRNA. It also has a role of stabilizing the formation of a complementary strand between the modulator sequence and a part of the anti-anti-IRES sequence and a part of the aptamer sequence.
5’末端ステムループとしては、上記作用効果を示すものであれば特に制限されないが、その塩基長は少なくとも10塩基長程度であればよく、好ましくは10塩基長以上、200塩基長以下程度、より好ましくは12塩基長以上、100塩基長以下程度、さらに好ましくは15塩基長以上、50塩基長以下程度である。その両末端配列同士による相補鎖の長さとしては、4塩基長以上、45塩基長以下程度が好ましく、6塩基長以上、22塩基長以下程度がより好ましい。ループ部分の長さは、3塩基長以上、10塩基長以下程度が好ましく、4塩基長以上、5塩基長以下程度がより好ましい。また、T7ファージのg10leader配列の5’末端部など、天然に存在する5’末端ステムループやその人工合成物を利用してもよい。 The 5 ′ terminal stem loop is not particularly limited as long as it exhibits the above-mentioned effects, but the base length may be at least about 10 bases, preferably about 10 bases or more and about 200 bases or less. Preferably it is about 12 base length or more and about 100 base length or less, More preferably, it is about 15 base length or more and about 50 base length or less. The length of the complementary strand formed by the both terminal sequences is preferably about 4 to 45 base length, more preferably about 6 to 22 base length. The length of the loop part is preferably about 3 to 10 bases, more preferably about 4 to 5 bases. Alternatively, a naturally occurring 5'-end stem loop such as the 5 'end of the g10 leader sequence of T7 phage or an artificial synthetic product thereof may be used.
なお、本発明における相補鎖には、A−UおよびG−Cの組合せのみからなる完全相補鎖のみでなく、その間にそれ以外の組合せが存在していても全体として完全相補鎖と同等の融解温度(Tm)を示す不完全相補鎖も含まれるものとする。 In addition, the complementary strand in the present invention is not only a completely complementary strand consisting only of the combination of AU and GC, but also as a whole, even if there are other combinations between them, the melting as much as the complete complementary strand as a whole Incomplete complementary strands indicating temperature (Tm) are also included.
(b) モジュレータ配列
モジュレータ配列は、リガンドの存在・不存在によるIRES依存性翻訳の制御効率を高めるための配列である。より詳しくは、リガンド不存在時にはanti−anti−IRES配列およびアプタマー配列と共にステムループ構造を形成することによりanti−anti−IRES配列とanti−IRES配列との相補鎖の形成を抑制し、IRES依存性翻訳を抑制する。一方、リガンド存在時には、アプタマーへのリガンドの結合によるアプタマーの三次元構造変化に応じてアプタマー配列から脱離してanti−anti−IRES配列とanti−IRES配列との相補鎖の形成を可能にし、anti−IRES配列をIRESから脱離させ、IRES依存性の翻訳を開始できるようにする。
(B) Modulator sequence The modulator sequence is a sequence for increasing the control efficiency of IRES-dependent translation by the presence or absence of a ligand. More specifically, in the absence of a ligand, formation of a complementary loop between the anti-anti-IRES sequence and the anti-IRES sequence is suppressed by forming a stem-loop structure together with the anti-anti-IRES sequence and the aptamer sequence. Suppress translation. On the other hand, when a ligand is present, the anti-anti-IRES sequence and the anti-IRES sequence can be formed by desorption from the aptamer sequence according to the three-dimensional structural change of the aptamer due to the binding of the ligand to the aptamer. -Remove the IRES sequence from the IRES so that IRES dependent translation can be initiated.
モジュレータ配列は、アプタマー配列の一部と相補的に結合するものであることから、その3’末端部の塩基配列はアプタマー配列の5’末端部と相補的なものとすればよい。 Since the modulator sequence is complementary to a part of the aptamer sequence, the base sequence at the 3 'end may be complementary to the 5' end of the aptamer sequence.
モジュレータ配列は、anti−anti−IRES配列の一部と相補的二重鎖を形成していてもよい。その場合、その5’末端部の塩基配列はanti−anti−IRES配列の3’末端部と相補的なものとなる。 The modulator sequence may form a complementary duplex with part of the anti-anti-IRES sequence. In that case, the base sequence at the 5 'end is complementary to the 3' end of the anti-anti-IRES sequence.
モジュレータ配列の塩基長は、上記作用を発揮できるように最適化すればよい。例えば、モジュレータ配列とanti−anti−IRES配列との間で相補的二重鎖が形成される場合、当該相補的配列の塩基長は、1以上、5以下とすることが好ましい。モジュレータ配列とanti−anti−IRES配列は相補的であり、さらにanti−anti−IRES配列とanti−IRES配列と相補的であることから、モジュレータ配列の一部はanti−IRES配列と同一となる。よって、上記相補塩基長が過剰に長いと、モジュレータ配列自体がIRESに結合し、IRES配列依存性の翻訳を阻害するおそれがあり得る。しかし上記相補塩基長が5以下であれば、かかる阻害を有効に抑制することができる。 What is necessary is just to optimize the base length of a modulator arrangement | sequence so that the said effect | action can be exhibited. For example, when a complementary duplex is formed between a modulator sequence and an anti-anti-IRES sequence, the base length of the complementary sequence is preferably 1 or more and 5 or less. Since the modulator sequence and the anti-anti-IRES sequence are complementary and further complementary to the anti-anti-IRES sequence and the anti-IRES sequence, a part of the modulator sequence is identical to the anti-IRES sequence. Therefore, if the complementary base length is excessively long, the modulator sequence itself may bind to IRES and inhibit IRES sequence-dependent translation. However, when the complementary base length is 5 or less, such inhibition can be effectively suppressed.
また、モジュレータ配列のアプタマー配列の一部に対する相補塩基長としては、4以上、8以下が好適である。当該相補塩基長が4以上である場合、リガンドが存在しないときにモジュレータ配列がアプタマー配列へより確実に結合し、IRES依存性の翻訳を有効に抑制できる。一方、当該相補塩基長が8以下である場合には、リガンドの存在によるアプタマーの三次元構造変化に応じてモジュレータ配列がアプタマー配列からより確実に脱離し、anti−anti−IRES配列とanti−IRES配列との結合を抑制せず、ひいてはIRES依存性の翻訳を促進することができる。即ち、当該相補塩基長が4以上、8以下である場合には、リガンドによるIRES依存性の翻訳のスイッチが非常に有効に働く。 Moreover, as a complementary base length with respect to a part of aptamer sequence of a modulator sequence, 4 or more and 8 or less are suitable. When the complementary base length is 4 or more, the modulator sequence binds more reliably to the aptamer sequence when no ligand is present, and IRES-dependent translation can be effectively suppressed. On the other hand, when the complementary base length is 8 or less, the modulator sequence is more reliably detached from the aptamer sequence in accordance with the three-dimensional structural change of the aptamer due to the presence of the ligand, and the anti-anti-IRES sequence and the anti-IRES sequence. The binding to the sequence is not suppressed, and thus IRES-dependent translation can be promoted. That is, when the complementary base length is 4 or more and 8 or less, the IRES-dependent translation switch by the ligand works very effectively.
さらに、モジュレータ配列は、モジュレータ配列ステムループ構造のギブズ自由エネルギー(ΔG)を計算し、その値が適切なものとなるようにして、非常に簡便にデザインすることが可能である。より詳しくは、先ず、アプタマーについては、後述するようにリガンドを決定すれば、そのリガンドに選択的かつ強固に結合できる塩基配列を常法により決定することができる。また、anti−anti−IRES配列も、IRESの作用を有効に阻害できるanti−IRES配列を決定すれば、その相補鎖として決定できる。こうして決定されたアプタマー配列の一部とanti−anti−IRES配列の一部とステムループ構造を構成できるモジュレータ配列を適当にデザインし、例えば、RNA structureなどのコンピュータソフト(Mathews,D.H.ら, Proceedings of the National Academy of Sciences,第101号,第7287〜7292頁(2004年)参照)によりステムループ構造のギブズ自由エネルギー(ΔG)を計算し、その値が好ましくは−17.5kcal/mol以上、−8.5kcal/mol以下になるようにすればよい。当該値が−8.5kcal/mol以下であれば、リガンドが存在しない場合にモジュレータ配列ステムループ構造を十分安定的に維持でき、IRES依存性翻訳をより確実に抑制できる。一方、当該値が小さ過ぎるとリガンドが存在していてもモジュレータ配列ステムループ構造が解消されず、IRES依存性翻訳が開始されないおそれがあり得るので、当該値としては−17.5kcal/mol以上が好ましい。なお、RNA structureによるギブズ自由エネルギー(ΔG)は、数秒あれば計算可能である。 Furthermore, the modulator array can be designed very simply by calculating the Gibbs free energy (ΔG) of the modulator array stem-loop structure and making the value appropriate. More specifically, first, regarding an aptamer, if a ligand is determined as described later, a base sequence capable of binding selectively and firmly to the ligand can be determined by a conventional method. The anti-anti-IRES sequence can also be determined as its complementary strand by determining an anti-IRES sequence that can effectively inhibit the action of IRES. A modulator sequence capable of constituting a stem-loop structure with a part of the aptamer sequence determined in this way and a part of the anti-anti-IRES sequence is appropriately designed. For example, computer software such as RNA structure (Mathews, DH et al. , Proceedings of the National Academy of Sciences, No. 101, pages 7287-7292 (2004)), the Gibbs free energy (ΔG) of the stem-loop structure is calculated, and the value is preferably −17.5 kcal / mol. As described above, it may be set to −8.5 kcal / mol or less. If the value is −8.5 kcal / mol or less, the modulator sequence stem-loop structure can be maintained sufficiently stably when no ligand is present, and IRES-dependent translation can be more reliably suppressed. On the other hand, if the value is too small, the modulator sequence stem-loop structure may not be resolved even if a ligand is present, and IRES-dependent translation may not be started. Therefore, the value is −17.5 kcal / mol or more. preferable. Note that the Gibbs free energy (ΔG) by RNA structure can be calculated in a few seconds.
(c) anti−anti−IRES配列
anti−anti−IRES配列は、リガンドが存在していないときにはモジュレータ配列とモジュレータ配列ステムループを構成する一方で、リガンドが存在しているときにはanti−IRES配列と相補的二重鎖を形成し、anti−IRES配列をIRESから脱離させてIRESを活性化させる作用を有する。
(C) anti-anti-IRES sequence The anti-anti-IRES sequence forms a modulator sequence and a modulator sequence stem loop when no ligand is present, and is complementary to the anti-IRES sequence when a ligand is present. An anti-IRES sequence is released from the IRES and activates the IRES.
anti−anti−IRES配列の塩基配列は、モジュレータ配列とステムループを形成するに適する配列とする。例えば、その3’末端部がモジュレータ配列の5’末端部と相補的二重鎖を形成してステムループの幹部分となる場合、両者の塩基配列は、互いに相補的なものとする。また、同時に、リガンド存在時にはanti−IRES配列と相補的二重鎖を形成するため、anti−IRES配列と相補的である必要がある。 The base sequence of the anti-anti-IRES sequence is a sequence suitable for forming a stem loop with the modulator sequence. For example, when the 3 'end portion forms a complementary double strand with the 5' end portion of the modulator sequence and becomes the stem portion of the stem loop, both base sequences are complementary to each other. At the same time, when a ligand is present, a complementary double strand is formed with the anti-IRES sequence, so that it must be complementary to the anti-IRES sequence.
anti−anti−IRES配列は、上記作用を十分に発揮できるようデザインすればよいが、好適にはanti−IRES配列との相補鎖とすることができる。ここで、anti−anti−IRES配列は、anti−IRES配列に対する相補塩基長が6以上となるようにすることが好ましい。当該相補塩基長が6以上であれば、リガンドが存在しているときにanti−anti−IRES配列がanti−IRES配列とより確実に相補鎖を形成してanti−IRES配列の働きを阻害し、IRES依存性の翻訳を有効に進行せしめることが可能になる。一方、当該相補鎖長が長過ぎると、anti−IRES配列との親和性が過剰になり、リガンドが存在しない場合でもanti−IRES配列によるIRESの不活性化作用が十分に発揮されず、IRES依存性翻訳が開始されるおそれがあり得るので、当該相補鎖長は15以下が好ましく、12以下がより好ましい。 The anti-anti-IRES sequence may be designed so as to sufficiently exhibit the above-described action, but can preferably be a complementary strand with the anti-IRES sequence. Here, the anti-anti-IRES sequence preferably has a base length complementary to the anti-IRES sequence of 6 or more. If the complementary base length is 6 or more, when a ligand is present, the anti-anti-IRES sequence more reliably forms a complementary strand with the anti-IRES sequence and inhibits the action of the anti-IRES sequence, It becomes possible to effectively proceed with IRES-dependent translation. On the other hand, if the complementary chain length is too long, the affinity with the anti-IRES sequence becomes excessive, and even when no ligand is present, the inactivation action of the IRES by the anti-IRES sequence is not sufficiently exhibited, and it depends on IRES. Since there is a possibility that sexual translation may be initiated, the complementary strand length is preferably 15 or less, and more preferably 12 or less.
(d) アプタマー
アプタマーは、リガンドに対して選択的かつ強固に結合できるものであり、リガンドの存在により三次元構造を変化させてIRESを活性化させる作用を有する。より詳しくは、リガンド不存在時にはモジュレータ配列およびanti−anti−IRES配列と共にモジュレータ配列ステムループを形成する。一方、リガンド存在時にはリガンドの包接によりその三次元構造が変化し、隣接するanti−anti−IRES配列とanti−IRES配列とを近付けて相補的二重鎖を形成させ、anti−IRES配列をIRESから脱離させることによりIRESを活性化させ、IRES依存性翻訳を開始させる。
(D) Aptamer An aptamer is capable of selectively and firmly binding to a ligand, and has an action of activating IRES by changing the three-dimensional structure due to the presence of the ligand. More specifically, a modulator sequence stem loop is formed with a modulator sequence and an anti-anti-IRES sequence in the absence of a ligand. On the other hand, when a ligand is present, its three-dimensional structure changes due to inclusion of the ligand, and adjacent anti-anti-IRES sequences and anti-IRES sequences are brought close to each other to form complementary duplexes. IRES is activated by desorption from and initiates IRES-dependent translation.
アプタマーの塩基配列は、試験管内人工進化法(SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)法ともいわれる。Tuerk,C.ら,Science,第240巻,第505〜510頁(1990年)を参照)により、使用するリガンドに応じて最適化することが可能である。この方法は、リガンドに対し、ランダムな塩基配列の多数のオリゴヌクレオチドの混合物であるオリゴヌクレオチドライブラリを作用させ、親和性の高いオリゴヌクレオチドを選出し、選出されたオリゴヌクレオチドを増幅するという作業を繰り返すものである。これによって、リガンドに対して選択的かつ強固に結合するオリゴヌクレオチドを最適化することが可能になる。 The base sequence of the aptamer is referred to as an in vitro artificial evolution method (referred to as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) method, see Tuerk, C. et al., Science, Vol. 240, pages 505 to 510 (1990)). Therefore, it is possible to optimize depending on the ligand to be used. In this method, an oligonucleotide library that is a mixture of a large number of oligonucleotides having random base sequences is allowed to act on a ligand, an oligonucleotide having a high affinity is selected, and the selected oligonucleotide is amplified. Is. This makes it possible to optimize oligonucleotides that bind selectively and tightly to the ligand.
(e) anti−IRES配列
anti−IRES配列は、リガンドの存在・不存在に応じてIRESから脱離または結合することにより、IRESを活性化したり或いは不活性化する作用を有するものである。より詳しくは、リガンドが存在しない場合、anti−IRES配列はIRESの構造中、その重要な部分に結合してIRESを不活性化する。一方、リガンドが存在する場合には、anti−anti−IRES配列と相補的二重鎖を形成してIRESから脱離するので、IRESは活性化される。
(E) anti-IRES sequence The anti-IRES sequence has an action of activating or deactivating IRES by detaching from or binding to IRES depending on the presence or absence of a ligand. More specifically, in the absence of a ligand, the anti-IRES sequence binds to an important portion of the IRES structure and inactivates the IRES. On the other hand, when a ligand is present, the IRES is activated because it forms a complementary duplex with the anti-anti-IRES sequence and desorbs from the IRES.
anti−IRES配列は、IRESの作用効果の発揮に重要な部分に対する相補鎖としてデザインすることができる。例えば、使用するIRESの塩基配列の解析やX線結晶構造解析などにより、ループやステムループ、偽結節など、重要な三次元構造を見出す。その上で、IRESに加えて、5’末端ステムループ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子およびIRESの特定部位に対する相補鎖を有するmRNAや、当該相補鎖を有さない以外は同様のmRNAとIRESの特定部位に対する相補的なアンチセンスDNAやアンチセンスRNAなどを用いた予備実験で、レポーター遺伝子の発現試験を行い、IRES依存性翻訳に重要な部分を決定する。anti−IRES配列は、このように決定された重要部分に相補的な塩基配列とすればよい。 The anti-IRES sequence can be designed as a complementary strand to a portion important for exerting the effect of IRES. For example, important three-dimensional structures such as loops, stem loops, and false nodules are found by analyzing the base sequence of the IRES used or X-ray crystal structure analysis. On top of that, in addition to IRES, mRNA having a 5 'terminal stem loop, a reporter gene such as luciferase, and a complementary strand to a specific site of IRES, or a similar mRNA and a specific site of IRES except for not having the complementary strand In a preliminary experiment using antisense DNA or antisense RNA complementary to, a reporter gene expression test is performed to determine an important part for IRES-dependent translation. The anti-IRES sequence may be a base sequence complementary to the important part determined in this way.
anti−IRES配列のIRESに対する相補塩基長としては、6以上が好適である。当該相補塩基長が6以上であれば、リガンドが存在していないときにanti−IRES配列がIRESとより確実に相補鎖を形成し、IRESの働きを阻害してIRES依存性の翻訳を有効に抑制できる。一方、当該相補塩基長が長過ぎると、リガンドが存在していてもanti−IRES配列がIRESから脱離できず、IRESが活性化されないおそれがあり得るので、当該相補塩基長としては、15以下が好ましく、12以下がより好ましい。 The base length complementary to IRES of the anti-IRES sequence is preferably 6 or more. If the complementary base length is 6 or more, the anti-IRES sequence more reliably forms a complementary strand with the IRES in the absence of a ligand, effectively inhibiting IRES-dependent translation by inhibiting the function of the IRES. Can be suppressed. On the other hand, if the complementary base length is too long, the anti-IRES sequence cannot be detached from the IRES even if a ligand is present, and the IRES may not be activated. Is preferable, and 12 or less is more preferable.
(f) IRES
IRES(内部リボソーム結合サイト)は、主にウィルスのRNA分子の内部に存在して翻訳の開始に関与するものであり、40Sリボソームや60Sリボソームがここに結合することにより翻訳が開始される。
(F) IRES
The IRES (internal ribosome binding site) is mainly present inside the viral RNA molecule and is involved in the initiation of translation, and translation is initiated by binding of 40S ribosome or 60S ribosome here.
IRESは、上述したようにその三次元構造を決定し、その作用効果の発揮に重要な部位を特定した上で用いてもよいが、既に塩基配列や三次元構造が明らかにされているものを用いることもできる。そのようなIRESとしては、チャバネアオカメムシ腸管ウィルス、コオロギ麻痺病ウィルス、C型肝炎ウィルス、ポリオウィルスなどのIRESを挙げることができる。 The IRES may be used after determining its three-dimensional structure as described above and specifying a site important for exerting its action and effect. However, the IRES has already been clarified in its base sequence and three-dimensional structure. It can also be used. Examples of such IRES include IRES such as Chabanae stink bug enterovirus, cricket paralysis virus, hepatitis C virus, poliovirus and the like.
なお、本発明者の実験的知見によれば、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのIRESにおいては、偽結節IIIとステムループVという三次元構造がIRES依存性翻訳にとり非常に重要であるので、anti−IRES配列は、これら三次元構造に係る塩基配列と相補的なものとすればよい。 According to the experimental findings of the present inventor, the three-dimensional structure of pseudo-nodule III and stem loop V is very important for IRES-dependent translation in the IRES of the Chabae stink bug enteric virus. The sequence may be complementary to the base sequence related to these three-dimensional structures.
(g) 目的遺伝子
本発明の目的遺伝子は、本発明に係る核酸分子により発現させることを所望する任意のものであればよく、特に制限されない。例えば、生産の望まれる有用なタンパク質をコードする遺伝子;ルシフェラーゼ遺伝子やGFF遺伝子(診断、バイオセンサー、バイオイメージングなどのため);その役割やネットワークを明らかにしたいタンパク質をコードする遺伝子(タンパク質の解析などのため);代謝カスケードの一部を担う遺伝子(合成生物学などのため)などを挙げることができる。
(G) Target gene The target gene of the present invention may be any gene desired to be expressed by the nucleic acid molecule according to the present invention, and is not particularly limited. For example, a gene encoding a useful protein desired to be produced; a luciferase gene or a GFF gene (for diagnosis, biosensor, bioimaging, etc.); a gene encoding a protein whose role or network is to be clarified (protein analysis, etc.) A gene responsible for part of the metabolic cascade (for synthetic biology, etc.).
3’末端の配列は、本発明の作用効果を阻害しない限り、特に制限されないし、また、特に設ける必要はない。例えば、目的遺伝子やIRESなどに結合し、その発現や作用を阻害するような配列は当然に用いることはできない。一方、エキソヌクレアーゼ対策として、特に問題を起こさない中立的な100塩基以上の配列を3’末端に設けることも可能である。さらに、ポリA配列を導入してもよい。 The sequence at the 3 'end is not particularly limited as long as it does not inhibit the action and effect of the present invention, and need not be provided. For example, a sequence that binds to a target gene or IRES and inhibits its expression or action cannot be used as a matter of course. On the other hand, as a measure against exonuclease, it is also possible to provide a neutral sequence of 100 bases or more that does not cause a problem at the 3 'end. Furthermore, a poly A sequence may be introduced.
本発明で用いるリガンドは、本発明に係るRNA分子において、アプタマーに結合してその三次元構造を変化させ、IRESを活性化させるものであれば特に制限されず、原則として所望のものを用いることができる。例えば、比較的低分子の有機化合物;金属イオンなどの無機化合物;増殖因子、酵素、受容体、膜タンパク質、ウィルスタンパク質などのタンパク質およびその一部などを挙げることができる。 The ligand used in the present invention is not particularly limited as long as it binds to an aptamer, changes its three-dimensional structure, and activates IRES in the RNA molecule according to the present invention. Can do. For example, a relatively low-molecular organic compound; an inorganic compound such as a metal ion; a protein such as a growth factor, an enzyme, a receptor, a membrane protein, or a viral protein and a part thereof can be used.
例えば、細胞膜を通じてリガンドを外部から細胞内に取り込ませる場合、水溶性の低分子有機化合物を用いることができる。このようなリガンドとしては、テオフィリン、フラビンモノヌクレオチド、テトラサイクリン、スルホローダミンを挙げることができる。その他、細胞内分子をリガンドとして用いることも可能である。但し、リガンドとしては、細胞毒性を示さないものを用いることが好ましい。 For example, when a ligand is taken into a cell from the outside through a cell membrane, a water-soluble low molecular weight organic compound can be used. Examples of such a ligand include theophylline, flavin mononucleotide, tetracycline, and sulforhodamine. In addition, intracellular molecules can be used as ligands. However, it is preferable to use a ligand that does not show cytotoxicity.
本発明に係るDNA分子は、上記RNA分子をコードするものであり、且つ当該コード領域の上流にプロモータ配列を有することを特徴とする。かかるDNA分子は、真核細胞自体や真核細胞の抽出物からなる遺伝子発現システムにおいて、所望のリガンドを用いて所望の目的遺伝子を発現させることができる点で有用である。 The DNA molecule according to the present invention encodes the above RNA molecule, and has a promoter sequence upstream of the coding region. Such a DNA molecule is useful in that a desired target gene can be expressed using a desired ligand in a gene expression system comprising a eukaryotic cell itself or an eukaryotic cell extract.
より詳しくは、本発明に係るDNA分子を真核細胞にトランスフェクションして発現させ、さらに細胞内にリガンドを導入してIRESを活性化させることにより、目的遺伝子を発現せしめることができる。また、遺伝子発現システムを含む真核細胞の抽出物と本発明に係るDNA分子を混合し、当該DNAからRNAへの転写とタンパク質への翻訳を促進して、目的遺伝子を発現させることができる。 More specifically, the target gene can be expressed by transfecting and expressing a DNA molecule according to the present invention in a eukaryotic cell, and further activating IRES by introducing a ligand into the cell. In addition, an eukaryotic cell extract containing a gene expression system and a DNA molecule according to the present invention can be mixed to promote transcription of the DNA into RNA and translation into a protein, thereby expressing a target gene.
本発明に係るDNA分子のプロモータは、使用する真核細胞に応じたものを適宜選択すればよい。例えば、酵母に対してはGAL、動物に対してはSV40といったウィルスプロモータを用いることができる。 What is necessary is just to select suitably the promoter of the DNA molecule based on this invention according to the eukaryotic cell to be used. For example, a viral promoter such as GAL for yeast and SV40 for animals can be used.
本発明に係るDNA分子のトランスフェクション手段は、特に制限されない。一般的には、本発明に係るDNA分子を、使用する真核細胞に応じたプラスミドベクターやウィルスベクターに組み込んだ上で、真核細胞に導入する。また、本発明に係るDNA分子の両末端に、使用する真核細胞のDNAの相同配列を設け、相同組換えできる可能性もある。 The DNA molecule transfection means according to the present invention is not particularly limited. Generally, the DNA molecule according to the present invention is introduced into a eukaryotic cell after being incorporated into a plasmid vector or viral vector according to the eukaryotic cell to be used. In addition, there is a possibility that homologous recombination can be achieved by providing homologous sequences of the DNA of the eukaryotic cell to be used at both ends of the DNA molecule according to the present invention.
以上で説明した本発明に係るRNA分子とDNA分子は、真核細胞やウィルスへ導入した上で、リガンドを添加することにより、目的遺伝子を発現させることができるし、また、真核細胞の遺伝子発現システムを用い、in vitroで目的遺伝子を発現させることもできる。即ち、本発明において、真核細胞で目的遺伝子を発現することには、真核細胞自体を用いる態様のみならず、真核細胞の遺伝子発現システムを用いて無細胞的に目的遺伝子を発現させる態様も含むものとする。 The RNA molecule and DNA molecule according to the present invention described above can be expressed in a target gene by adding a ligand after being introduced into a eukaryotic cell or virus. The target gene can also be expressed in vitro using an expression system. That is, in the present invention, expression of a target gene in a eukaryotic cell is not limited to an embodiment using the eukaryotic cell itself, but an embodiment in which the target gene is expressed in a cell-free manner using a gene expression system of a eukaryotic cell. Shall also be included.
真核細胞の抽出物からなる遺伝子発現システムを利用する場合、具体的には、先ず、リボソームなど、DNAやRNAからタンパク質を合成するための物質を含む真核細胞抽出物を調製する。例えば植物細胞からかかる抽出物は、植物種子を粉砕して胚芽を選別し、胚芽を洗浄してから微粉砕し、メタノールやエタノールなどで抽出することにより得られる。また、かかる抽出物は市販品を用いてもよい。次に、得られた真核細胞抽出物と上記DNAまたはRNAとを混合し、反応させればよい。その際、アミノ酸などタンパク質合成に必要な基質などを添加してもよいし、RNAポリメラーゼなど、DNAからRNAへの転写に必要な物質をさらに添加してもよい。反応温度や反応時間は適宜調整すればよいが、例えば、20℃以上、40℃以下程度で、30分間以上、10時間以下程度反応させることができる。 When using a gene expression system comprising an eukaryotic cell extract, specifically, first, an eukaryotic cell extract containing a substance for synthesizing a protein from DNA or RNA, such as ribosome, is prepared. For example, such an extract from plant cells can be obtained by pulverizing plant seeds to select germs, washing the germs, then finely pulverizing them, and extracting with methanol or ethanol. Moreover, you may use a commercial item for this extract. Next, the obtained eukaryotic cell extract and the DNA or RNA may be mixed and reacted. At that time, a substrate necessary for protein synthesis such as amino acid may be added, or a substance necessary for transcription from DNA to RNA such as RNA polymerase may be further added. The reaction temperature and reaction time may be appropriately adjusted. For example, the reaction can be performed at 20 ° C. or more and 40 ° C. or less for 30 minutes or more and 10 hours or less.
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited by the following examples, but may be appropriately modified within a range that can meet the purpose described above and below. Of course, it is possible to implement them, and they are all included in the technical scope of the present invention.
実験例1 PSIV IRESの最適化
(1) 鋳型DNAの調製
チャバネアオカメムシ腸管ウィルス(以下、「PSIV」という)のゲノムRNA(図3)において、第5951〜6204塩基であり、非構造タンパク質前駆体をコードする第1ORFの3’側末端の53塩基を5’側に、キャプシドタンパク質前駆体をコードする第2ORFの5’側末端であり、キャプシドタンパク質前駆体のN末端の4つのアミノ酸をコードする12塩基を3’側に、内部リボソーム結合サイト(IRES)をコードする遺伝子をそれらの間に有するRNAに対応する鋳型DNAであるpPSIV−IRES−NCP(Genscript社製の人工合成物)を、PrimeSTAR MAX DNAPolymerase(Takara Bio社製)を用いたPCRにより増幅した。また、ホタルルシフェラーゼ遺伝子(pE01−Luc,以下、「F−Luc」という)も同様に増幅した。これらDNAをライゲーションし、同様に増幅した。得られたDNAを用い、図6のステムループ構造(以下、「5’−SL」という)をコードする遺伝子を5’末端に、さらに翻訳を促進するためのT7プロモータ配列を有する鋳型DNAを調製した。
Experimental Example 1 Optimization of PSIV IRES (1) Preparation of template DNA In the genomic RNA (Fig. 3) of Chabaen stink bug enterovirus (hereinafter referred to as "PSIV"), it has 5951-6204 bases and is a nonstructural protein precursor 53 bases of the 3 'end of the first ORF that encodes the 5' end, 5 'end of the second ORF that encodes the capsid protein precursor, and encodes the 4 amino acids of the N terminal of the capsid protein precursor PPSIV-IRES-NCP (an artificial product manufactured by Genscript), which is a template DNA corresponding to RNA having 12 bases on the 3 ′ side and a gene encoding an internal ribosome binding site (IRES) between them, was added to PrimeSTAR. MAX DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio) was used. It was amplified by CR. A firefly luciferase gene (pE01-Luc, hereinafter referred to as “F-Luc”) was also amplified in the same manner. These DNAs were ligated and amplified similarly. Using the obtained DNA, a template DNA having a gene encoding the stem loop structure of FIG. 6 (hereinafter referred to as “5′-SL”) at the 5 ′ end and a T7 promoter sequence for further promoting translation is prepared. did.
また、上記と同様にして、上記鋳型DNAにおいて、第1ORFの3’側末端の53塩基を含まない、即ち、PSIVゲノムの第6004〜6204塩基を含む鋳型DNA;並びに、IRESをコードする遺伝子の一部が欠損、即ち、それぞれPSIVゲノムの第6017〜6204塩基、第6073〜6204塩基および第6101〜6204塩基を含む鋳型DNAを調製した。 Further, in the same manner as described above, the template DNA does not include the 53 base at the 3 ′ end of the first ORF, that is, the template DNA includes the 6004 to 6204 bases of the PSIV genome; and the gene encoding the IRES. Template DNAs were prepared that were partially defective, ie, containing bases 6017-6204, 6073-6204, and 6101-6204 of the PSIV genome, respectively.
(2) 鋳型mRNAの調製
MEGAscript T7 Kit(Applied Biosystems社製)を用い、上記各鋳型DNAを転写した鋳型mRNAを得た。RNeasy MinElute Cleanup Kit(QIAGEN社製)を用い、得られた鋳型mRNAを精製し、また、波長260nmの光の吸収を利用して鋳型mRNAを定量した。
(2) Preparation of template mRNA Using the MEGAscript T7 Kit (manufactured by Applied Biosystems), a template mRNA obtained by transcription of each template DNA was obtained. The obtained template mRNA was purified using RNeasy MinElute Cleanup Kit (manufactured by QIAGEN), and the template mRNA was quantified using absorption of light at a wavelength of 260 nm.
得られた5種の鋳型mRNAを、図4に示す。図4中の数字は、PSIVゲノムRNA中の塩基番号を示す。また、LとSLとPKは、翻訳に必要なIRESの三次元構造を示し、Lはループ(loop)、SLはステムループ(stem-loop)、PKは偽結節(pseudoknot)を示す。また、5’−SLは、配列番号1(SEQ ID NO:1)の配列を有し、5’末端のステムループであり、真核細胞における5’末端が介在する翻訳を阻害する役割を有する。N−CPは、PSIVゲノムにおける第6193〜6204塩基であり、キャプシドタンパク質前駆体をコードする第2ORFの5’側末端であって、キャプシドタンパク質前駆体のN末端の4つのアミノ酸をコードする12塩基である。当該配列は、IRESが介在する翻訳を促進する役割を有する。F−Lucは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子である。 The obtained 5 types of template mRNA are shown in FIG. The numbers in FIG. 4 indicate base numbers in PSIV genomic RNA. L, SL, and PK indicate the three-dimensional structure of IRES necessary for translation, L indicates a loop, SL indicates a stem-loop, and PK indicates a pseudoknot. 5′-SL has the sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1), is a stem loop at the 5 ′ end, and has a role of inhibiting translation mediated by the 5 ′ end in eukaryotic cells. . N-CP is 6193-6204 bases in the PSIV genome, 12 bases encoding 4 amino acids at the 5 ′ end of the second ORF encoding the capsid protein precursor and N-terminal of the capsid protein precursor It is. The sequence has a role of promoting IRES-mediated translation. F-Luc is a firefly luciferase gene.
(3) 鋳型mRNAの翻訳
WEPRO1240 Expression Kit(CellFree Science社製)を用い、上記で得られた鋳型mRNAを無細胞翻訳した。具体的には、上記鋳型mRNA(3pmol)、小麦胚芽抽出物(WEPRO1240,2μL)、クレアチンキナーゼ(終濃度で40ng/μL)および標準コムギ無細胞タンパク質合成用基質(終濃度で1×)の混合物(10μL)を、26℃で1時間インキュベートした。
(3) Translation of template mRNA Using the WEPRO1240 Expression Kit (manufactured by CellFree Science), the template mRNA obtained above was cell-free translated. Specifically, a mixture of the above template mRNA (3 pmol), wheat germ extract (WEPRO1240, 2 μL), creatine kinase (final concentration 40 ng / μL) and standard wheat cell-free protein synthesis substrate (final concentration 1 ×) (10 μL) was incubated at 26 ° C. for 1 hour.
(4) ルシフェラーゼアッセイ
上記(3)の反応混合物を水で11倍に希釈し、その5μLをLuciferase Assay Reagent containing luciferin(Promega社製,75μL)と混合した。反応混合液をブラック96ウェルプレートに入れ、マルチラベルプレートカウンター(Perkin−Elmer社製,Wallac ARVO MX)を用い、蛍光強度を測定した。以上の翻訳から測定を3回ずつ行い、その平均値を算出した。結果を、2番目の鋳型mRNA(図4の2:IRES6004−Luc,以下、「鋳型mRNA2」のように示す)の値を100%とする相対活性により図5に示す。
(4) Luciferase assay The reaction mixture of the above (3) was diluted 11 times with water, and 5 μL thereof was mixed with Luciferase Assay Reagent containing luciferin (Promega, 75 μL). The reaction mixture was placed in a black 96-well plate, and the fluorescence intensity was measured using a multi-label plate counter (Perkin-Elmer, Wallac ARVO MX). Measurement was performed three times from the above translation, and the average value was calculated. The results are shown in FIG. 5 in terms of relative activity with the value of the second template mRNA (FIG. 4: 2: IRES6004-Luc, hereinafter referred to as “template mRNA2”) being 100%.
図5のとおり、鋳型mRNA2で最も翻訳効率が高かった。鋳型mRNA2は、全IRESを含んでいる一方で、第1ORFの一部を含んでいない。それに対して、全IRESを含むが第1ORFの一部を含む鋳型mRNA1では、翻訳効率が低下している。かかる結果は、第1ORFの一部がIRESの三次元構造に影響を与えることによると考えられる。一方、IRESの一部が欠損している鋳型mRNA4〜5では、翻訳活性がほとんど見られなかった。かかる結果からは、本システムにおいては、5’末端が介在する翻訳が5’−SLによりほぼ完全に阻害されていることが分かる。 As shown in FIG. 5, the translation efficiency was highest for template mRNA2. Template mRNA2 contains the entire IRES but not part of the first ORF. On the other hand, the translation efficiency is reduced in the template mRNA1 that contains the entire IRES but contains a part of the first ORF. Such a result is considered to be due to a part of the first ORF affecting the three-dimensional structure of the IRES. On the other hand, almost no translational activity was observed in template mRNAs 4 to 5 in which a part of IRES was deleted. From these results, it can be seen that in this system, translation mediated by the 5 'end is almost completely inhibited by 5'-SL.
実験例2 Anti−IRESによる翻訳の阻害
mRNA発現を制御するためには、リガンドが存在しない場合に翻訳を抑制しなければならない。そのため、IRES介在性翻訳を効率的に阻害できるAnti−IRESを探索した。
Experimental Example 2 Inhibition of translation by Anti-IRES In order to control mRNA expression, translation must be suppressed in the absence of a ligand. Therefore, we searched for Anti-IRES that can efficiently inhibit IRES-mediated translation.
詳しくは、上記実験例1(1)〜(2)と同様の方法により、図6に示す5’末端ステムループ(5’−SL)とPSIV−IRESのIRESとの間(Xn)に、IRESの重要な三次元構造であるループ(L)、ステムループ(SL)または偽結節(PK)の何れかに関与する配列と相補的な以下の配列が挿入されたmRNAを調製した。 Specifically, by the same method as in Experimental Example 1 (1) to (2), IRES is inserted between the 5 ′ end stem loop (5′-SL) and the IRES of PSIV-IRES shown in FIG. 6 (Xn). MRNA was prepared in which the following sequences complementary to the sequences involved in any of the important three-dimensional structures of loop (L), stem loop (SL), or pseudonodule (PK) were inserted.
得られたmRNAを用い、上記実験例1(3)〜(4)と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例1の鋳型mRNA2の値を100%とする相対活性により図7に示す。 Using the obtained mRNA, translation efficiency was calculated by the same method as in Experimental Example 1 (3) to (4). The results are shown in FIG. 7 by relative activity with the value of template mRNA 2 in Experimental Example 1 set to 100%.
図7のとおり、PK−IIIに結合する鋳型mRNA8、cPK−IIに結合する鋳型mRNA11およびSL−Vに結合する鋳型mRNA13の阻害活性が非常に優れており、特に鋳型mRNA8と鋳型mRNA13が、重要なIRES部分が欠損している鋳型mRNA4と匹敵するほど阻害活性が優れていた。なお、鋳型mRNA8は、PK−IIIを構成する配列の一方に結合し、IRESの三次元構造を変化させることにより、IRES介在性翻訳を阻害すると考えられる。 As shown in FIG. 7, the template mRNA 8 binding to PK-III, the template mRNA 11 binding to cPK-II, and the template mRNA 13 binding to SL-V are very excellent. Particularly, the template mRNA 8 and the template mRNA 13 are important. The inhibitory activity was superior to that of the template mRNA4 lacking the IRES portion. Template mRNA 8 is considered to inhibit IRES-mediated translation by binding to one of the sequences constituting PK-III and changing the three-dimensional structure of IRES.
実験例3 Anti−IRESの長さの検討
次に、IRES介在性翻訳を阻害するに十分なanti−IRESの塩基長を調べた。
Experimental Example 3 Examination of Anti-IRES Length Next, the base length of anti-IRES sufficient to inhibit IRES-mediated translation was examined.
上記実験例1(1)〜(2)と同様の方法により、以下のとおり、上記実験例2で最も阻害活性に優れていた鋳型mRNA8のanti−IRESの長さを変更した鋳型mRNAを調製した。 In the same manner as in Experimental Example 1 (1) and (2), a template mRNA was prepared in which the length of the anti-IRES of the template mRNA 8 having the most excellent inhibitory activity in Experimental Example 2 was changed as follows. .
得られたmRNAを用い、上記実験例1(3)〜(4)と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例1の鋳型mRNA2の値を100%とする相対活性により図8に示す。 Using the obtained mRNA, translation efficiency was calculated by the same method as in Experimental Example 1 (3) to (4). The results are shown in FIG. 8 by relative activity with the value of template mRNA 2 in Experimental Example 1 set to 100%.
図8の結果のとおり、anti−IRESの塩基長が4になると阻害活性が全く無くなった。一方、塩基長が7〜8であればほぼ完全に阻害できることが明らかとなった。 As shown in the results of FIG. 8, when the base length of anti-IRES was 4, the inhibitory activity was completely lost. On the other hand, it was revealed that when the base length is 7 to 8, it can be almost completely inhibited.
実験例4 Anti−IRESによる翻訳の阻害の回復
mRNA発現のオン−オフを制御するためには、リガンドにより変化したIRESの構造を元に戻し、IRES介在性翻訳を回復させる必要がある。そこで、anti−IRESへ相補的に結合してその機能を阻害するanti−anti−IRESを検討した。
Experimental Example 4 Restoration of Translation Inhibition by Anti-IRES In order to control the on / off of mRNA expression, it is necessary to restore the IRES-mediated translation by restoring the IRES structure changed by the ligand. Then, anti-anti-IRES which couple | bonds with anti-IRES complementarily and inhibits the function was examined.
上記実験例1(1)〜(2)と同様の方法により、上記実験例2の鋳型mRNA8において、5’−SLとanti−IRESとの間(Yn)に、5塩基(ループ)を介して、塩基長の異なる以下のanti−anti−IRESを有する鋳型mRNAを調製した。 By the same method as in Experimental Example 1 (1) to (2), in the template mRNA 8 of Experimental Example 2, between 5′-SL and anti-IRES (Yn), via 5 bases (loop) A template mRNA having the following anti-anti-IRES having different base lengths was prepared.
得られたmRNAを用い、上記実験例1(3)〜(4)と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例1の鋳型mRNA2の値を100%とする相対活性により図9に示す。 Using the obtained mRNA, translation efficiency was calculated by the same method as in Experimental Example 1 (3) to (4). The results are shown in FIG. 9 in terms of relative activity with the value of template mRNA 2 in Experimental Example 1 set to 100%.
図9の結果のとおり、相補塩基長が3〜5では、anti−IRESにより阻害されたIRES介在性翻訳を回復させることはできなかった。しかし、相補塩基長が7の場合はほぼ50%までIRES介在性翻訳を回復させることができ、anti−IRESと同じ塩基長のanti−anti−IRESを使った場合には、約80%までIRES介在性翻訳を回復させることができた。このように、anti−IRESとanti−anti−IRESとで二本鎖を形成させれば、IRESの構造を元に戻し、IRES介在性翻訳を回復させることができ得ることが明らかにされた。 As shown in the results of FIG. 9, when the complementary base length was 3 to 5, IRES-mediated translation inhibited by anti-IRES could not be recovered. However, when the complementary base length is 7, the IRES-mediated translation can be restored to almost 50%. When the anti-IRES having the same base length as the anti-IRES is used, the IRES is reduced to about 80%. Intervening translation could be restored. Thus, it was clarified that if an anti-IRES and an anti-anti-IRES form a double strand, the IRES structure can be restored and IRES-mediated translation can be restored.
実施例1
上記実験例1〜4の結果をもって、リガンドによりmRNA発現のオン−オフを制御するシステムとして、以下の戦略を案出した。
・ 5’末端に5’−SLを設け、5’末端介在性翻訳を抑制し、IRES介在性翻訳を利用する
・ リガンドと強固かつ選択的に結合できるアプタマー配列を、anti−IRESとanti−anti−IRESとの間に挿入する
・ モジュレータ配列(MS)をanti−anti−IRESの5’側に挿入し、anti−IRES/anti−anti−IRESの二重鎖の形成を制御する
・ 翻訳効率のオン−オフの比を高めるため、モジュレータ配列を最適化する
上記の戦略に基づく一例を、図10に示す。
Example 1
Based on the results of Experimental Examples 1 to 4, the following strategy was devised as a system for controlling on / off of mRNA expression by a ligand.
-5'-SL is provided at the 5 'end to suppress 5'-end-mediated translation and use IRES-mediated translation.-Aptamer sequences that can bind strongly and selectively to ligands include anti-IRES and anti-anti -Insertion between the IRES-Modulator sequence (MS) is inserted 5 'to the anti-anti-IRES to control the formation of anti-IRES / anti-anti-IRES duplexes-Translation efficiency An example based on the above strategy of optimizing the modulator arrangement to increase the on-off ratio is shown in FIG.
図10の左図は、リガンドが存在しない場合を示し、モジュレータ配列(MS)がanti−anti−IRESの3’末端とアプタマー配列の5’末端と結合してステムループ(MS−SL)を形成している。その結果、anti−anti−IRESはanti−IRESと結合できないため、anti−IRESはIRESの重要部位と結合し、IRESの三次元構造を変化させる。よって、5’末端介在性翻訳は5’−SLにより阻害されている上に、IRES介在性翻訳も抑制されるため、mRNAは翻訳されない。 The left figure of FIG. 10 shows the case where no ligand is present, and the modulator sequence (MS) binds to the 3 ′ end of the anti-anti-IRES and the 5 ′ end of the aptamer sequence to form a stem loop (MS-SL). is doing. As a result, since anti-anti-IRES cannot bind to anti-IRES, anti-IRES binds to an important site of IRES and changes the three-dimensional structure of IRES. Therefore, 5 'end-mediated translation is inhibited by 5'-SL and IRES-mediated translation is also suppressed, so mRNA is not translated.
一方、アプタマーへ強固かつ選択的に結合するリガンドが存在する場合(図10の右図)、アプタマーへのリガンドの結合によりモジュレータ配列(MS)がアプタマーとanti−anti−IRESから遊離し、anti−anti−IRESとanti−IRESとの二重鎖形成が可能となり、その結果、IRESの三次元構造が回復し、IRES介在性翻訳が進行する。 On the other hand, when there is a ligand that binds tightly and selectively to the aptamer (right diagram in FIG. 10), the modulator sequence (MS) is released from the aptamer and anti-anti-IRES by binding of the ligand to the aptamer, and anti- Anti-IRES and anti-IRES can form a duplex, and as a result, the three-dimensional structure of IRES is restored and IRES-mediated translation proceeds.
上記の戦略を実現化すべく、上記実験例4の鋳型mRNA aa8を基にして、テオフィリンをリガンドとすることができるmRNAをデザインし、上記実験例1(1)〜(2)と同様の方法で合成した。具体的には、鋳型mRNA aa8において、anti−anti−IRESとanti−IRESとの間にテオフィリンアプタマー配列を挿入し、また、anti−anti−IRESと5’−SLとの間にモジュレータ配列(MS)を挿入した。 In order to realize the above strategy, an mRNA capable of using theophylline as a ligand is designed based on the template mRNA aa8 of Experimental Example 4 and the same method as in Experimental Examples 1 (1) and (2) above. Synthesized. Specifically, in template mRNA aa8, a theophylline aptamer sequence is inserted between anti-anti-IRES and anti-IRES, and a modulator sequence (MS) is inserted between anti-anti-IRES and 5′-SL. ) Was inserted.
この際、モジュレータ配列(MS)において、anti−anti−IRESと結合する部分は、5’−AGAC−3’という4塩基に固定し、アプタマー配列と結合する部分を検討した。anti−anti−IRESと結合する部分を4塩基に固定した理由は、モジュレータ配列(MS)の3’側は必然的にanti−IRESの5’側と同じにならざるを得ないので、モジュレータ配列(MS)自体がIRESと結合して翻訳が阻害されるおそれがあるが、上記実験例3の鋳型mRNA8−4と8−r4のとおり、4塩基長であれば、モジュレータ配列(MS)がIRESに結合して無条件に翻訳が阻害されることはないからである。 At this time, in the modulator sequence (MS), the portion that binds to anti-anti-IRES was fixed to 4 bases of 5'-AGAC-3 ', and the portion that bound to the aptamer sequence was examined. The reason for fixing the portion that binds to anti-anti-IRES to 4 bases is that the 3 ′ side of the modulator sequence (MS) must be the same as the 5 ′ side of the anti-IRES, so the modulator sequence There is a possibility that (MS) itself binds to IRES and the translation is inhibited, but as shown in template mRNAs 8-4 and 8-r4 in Experimental Example 3 above, if the length is 4 bases, the modulator sequence (MS) is IRES. This is because it does not unconditionally inhibit translation.
また、モジュレータ配列(MS)のうちアプタマー配列と結合する部分(Zn)は、以下のとおり2〜8塩基長、モジュレータ配列(MS)全体としては6〜12塩基長のものをデザインした。 Moreover, the part (Zn) couple | bonded with an aptamer sequence among modulator arrangement | sequences (MS) designed 2-8 base length as follows, and the modulator sequence (MS) whole designed 6-12 base length.
上記mRNAを用い、1mMテオフィリンが存在する場合と存在しない場合において、上記実験例1(3)〜(4)と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例1の鋳型mRNA2の値を100%とする相対活性により図11に示す。 Using the above mRNA, the translation efficiency was calculated by the same method as in Experimental Example 1 (3) to (4) in the presence and absence of 1 mM theophylline. The results are shown in FIG. 11 by relative activity with the value of template mRNA 2 in Experimental Example 1 set to 100%.
図11の結果のとおり、モジュレータ配列(MS)のうちアプタマー配列に結合する部分が5塩基長以上、全体で9塩基長以上であれば、リガンドであるテオフィリンが存在しない場合における翻訳が十分に抑制されていた。このことは、モジュレータ配列(MS)がanti−anti−IRESとアプタマー配列に結合していることから、anti−IRESがIRESと結合してその三次元構造を変化させていることによると考えられる。一方、モジュレータ配列(MS)のうちアプタマー配列に結合する部分が8塩基長、全体で12塩基長の場合、テオリフィンが存在していても翻訳が十分に進行しなかった。その理由は、テオリフィンが存在していてもモジュレータ配列(MS)がanti−anti−IRESとアプタマー配列から離れず、anti−IRESもIRESから離れられないことによると考えられる。 As shown in the results of FIG. 11, if the portion of the modulator sequence (MS) that binds to the aptamer sequence is 5 bases or more in length and 9 bases or more in total, translation in the absence of theophylline as a ligand is sufficiently suppressed. It had been. This is probably because the modulator sequence (MS) is bound to the anti-anti-IRES and the aptamer sequence, so that the anti-IRES is bound to the IRES and changes its three-dimensional structure. On the other hand, when the portion of the modulator sequence (MS) that binds to the aptamer sequence is 8 bases long and 12 bases in total, translation did not proceed sufficiently even if theorifin was present. The reason is considered to be that the modulator sequence (MS) is not separated from the anti-anti-IRES and the aptamer sequence even when theorifin is present, and the anti-IRES is not separated from the IRES.
それに対して、モジュレータ配列(MS)のうちアプタマー配列に結合する部分が5〜7塩基長、全体で9〜11塩基長の場合、テオフィリンが存在していない場合に対する存在している場合の比(ON/OFF比)が約8倍から10倍までと非常に高いものとなっている。このように本発明によれば、リガンドにより遺伝子の発現を制御できることが証明された。また、本実施例では無細胞の真核細胞遺伝子発現システムを用いたが、かかる態様で良好な結果が得られたことにより、真核細胞自体を用いた形質転換技術でも同様の結果が得られると考えられる。 On the other hand, when the portion of the modulator sequence (MS) that binds to the aptamer sequence is 5 to 7 bases long, and the total length is 9 to 11 bases, the ratio of the presence of theophylline to the absence of theophylline ( (ON / OFF ratio) is very high from about 8 to 10 times. Thus, according to the present invention, it was proved that gene expression can be controlled by a ligand. In addition, although a cell-free eukaryotic gene expression system was used in this example, the same result can be obtained even by a transformation technique using the eukaryotic cell itself because good results were obtained in this mode. it is conceivable that.
また、各mRNAにおいて、mRNA発現のオン−オフ制御に最も重要であるモジュレータ配列ステムループ(MS−SL)のギブズ自由エネルギー(ΔG)を、RNAの構造から計算した。結果を図11に示す。 In each mRNA, the Gibbs free energy (ΔG) of the modulator sequence stem loop (MS-SL), which is most important for on / off control of mRNA expression, was calculated from the RNA structure. The results are shown in FIG.
図11の結果のとおり、ギブズ自由エネルギー(ΔG)が大き過ぎるとおそらくモジュレータ配列ステムループが不安定となり、リガンドが存在しない場合でもIRES依存性翻訳が開始されてしまう一方で、小さ過ぎるとモジュレータ配列ステムループが過剰に安定化し、リガンドが存在してもIRES依存性翻訳が開始されない場合があることが分かった。 As shown in FIG. 11, if the Gibbs free energy (ΔG) is too large, the modulator array stem loop is likely to be unstable, and IRES-dependent translation is initiated even in the absence of a ligand, whereas if it is too small, the modulator array It has been found that the stem loop is over-stabilized and IRES-dependent translation may not be initiated in the presence of ligand.
実施例2
上記実施例1の結果に基づき、リガンドとしてテオフィリンを用いるシステムを他のリガンドとアプタマー配列との組合せに適用するため、mRNAをデザインした。
Example 2
Based on the results of Example 1 above, mRNA was designed to apply a system using theophylline as a ligand to combinations of other ligands and aptamer sequences.
具体的には、図12のテオリフィン−アプタマーの他、フラビンモノヌクレオチド(FMN)−アプタマー、テトラサイクリン(tc)−アプタマー、スルホローダミンB−アプタマーの組合せを用いたmRNAにおいて、モジュレータ配列ステムループ(MS−SL)のギブズ自由エネルギー(ΔG)が、上記実施例1で最もON/OFF比が高かったmRNAであるtheo5の−11.7kcal/molに近くなるように、モジュレータ配列(MS)をデザインし、上記実施例1(1)〜(2)の方法と同様にして調製した。但し、テトラサイクリンなどの濃度が高過ぎるとIRES介在性翻訳が阻害されるおそれがあり得るため、テオフィリンの濃度のみ1mMとし、他の濃度は0.3mMとした。各mRNAにおけるモジュレータ配列(MS)とギブズ自由エネルギー(ΔG)を以下に示す。 Specifically, in the mRNA using the combination of flavin mononucleotide (FMN) -aptamer, tetracycline (tc) -aptamer and sulforhodamine B-aptamer in addition to the theorifin-aptamer of FIG. 12, the modulator sequence stem loop (MS- The modulator sequence (MS) is designed so that the Gibbs free energy (ΔG) of SL) is close to −11.7 kcal / mol of theo5, which is the mRNA having the highest ON / OFF ratio in Example 1 above. Prepared in the same manner as in the methods of Examples 1 (1) and (2) above. However, if the concentration of tetracycline or the like is too high, IRES-mediated translation may be inhibited. Therefore, only the theophylline concentration was 1 mM, and the other concentrations were 0.3 mM. The modulator sequence (MS) and Gibbs free energy (ΔG) in each mRNA are shown below.
上記mRNAを用い、各リガンドが存在する場合と存在しない場合において、上記実験例1(3)〜(4)と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例1の鋳型mRNA2の値を100%とする相対活性により図13に示す。 Using the mRNA, the translation efficiency was calculated by the same method as in Experimental Examples 1 (3) to (4) in the presence and absence of each ligand. The results are shown in FIG. 13 by relative activity with the value of template mRNA 2 in Experimental Example 1 set to 100%.
図13の結果のとおり、各リガンドを用いない場合の翻訳効率は、mRNA theo5と同等に低い一方で、各リガンドを用いた場合の翻訳効率は向上した。特にリガンドとしてテトラサイクリンを用いた場合のON/OFF比は飛び抜けて高く、約30にも達した。 As shown in the results of FIG. 13, the translation efficiency when each ligand was not used was as low as that of mRNA theo5, while the translation efficiency when each ligand was used was improved. In particular, when tetracycline was used as a ligand, the ON / OFF ratio was extremely high, reaching about 30.
Claims (11)
(a) 5’末端依存性翻訳を阻害する5’末端ステムループ;
(b) リガンド不存在時に、下記アプタマー配列の一部と相補的に結合してモジュレータ配列ステムループを形成するモジュレータ配列;
(c) リガンド不存在時には、モジュレータ配列および下記アプタマー配列の一部と共にステムループを形成し、リガンド存在時には下記anti−内部リボソーム結合サイト配列と相補的二重鎖を形成するanti−anti−内部リボソーム結合サイト配列;
(d) リガンドとの結合能を有するアプタマー配列;
(e) リガンド不存在時には内部リボソーム結合サイトの一部と相補的二重鎖を形成して内部リボソーム結合サイトへのリボソームの結合を阻害し、リガンド存在時にはanti−anti−内部リボソーム結合サイト配列と相補的二重鎖を形成するanti−内部リボソーム結合サイト配列;
(f) 内部リボソーム結合サイト;および
(g) 目的遺伝子 An RNA molecule capable of controlling expression of a target gene by a ligand, wherein the RNA molecule has the following structure and sequence from the 5 'side.
(A) a 5 ′ end stem loop that inhibits 5 ′ end dependent translation;
(B) a modulator sequence that forms a modulator sequence stem loop by complementary binding to a portion of the aptamer sequence described below in the absence of a ligand;
(C) An anti-anti-internal ribosome that forms a stem loop together with a modulator sequence and a part of the following aptamer sequence in the absence of a ligand and forms a complementary duplex with the anti-internal ribosome binding site sequence in the presence of the ligand Binding site sequence;
(D) an aptamer sequence capable of binding to a ligand;
(E) In the absence of a ligand, a complementary duplex is formed with a part of the internal ribosome binding site to inhibit the binding of the ribosome to the internal ribosome binding site, and in the presence of the ligand, an anti-anti-internal ribosome binding site sequence An anti-internal ribosome binding site sequence forming a complementary duplex;
(F) an internal ribosome binding site; and (g) a gene of interest.
請求項1〜8のいずれかに記載のRNA分子または請求項9に記載のDNA分子を、真核細胞の抽出物と混合し、反応させる工程を含むことを特徴とする方法。 A method for controlling the expression of a target gene in a eukaryotic cell, comprising:
A method comprising mixing and reacting the RNA molecule according to any one of claims 1 to 8 or the DNA molecule according to claim 9 with an eukaryotic cell extract.
請求項9に記載のDNA分子を真核細胞にトランスフェクションする工程;および
真核細胞にリガンドを導入することにより、内部リボソーム結合サイトを活性化する工程を含むことを特徴とする方法。 A method for controlling the expression of a target gene in a eukaryotic cell, comprising:
A method comprising transfecting a eukaryotic cell with the DNA molecule of claim 9 and activating an internal ribosome binding site by introducing a ligand into the eukaryotic cell.
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