JP2011525533A - 実質的に立体異性的に純粋な縮合二環式プロリン化合物の調製のための生体触媒法 - Google Patents
実質的に立体異性的に純粋な縮合二環式プロリン化合物の調製のための生体触媒法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本開示は、構造式IIからVII
ファイル名CX2−020WO01.txtとしてコンピュータで読み込み可能な形式(CRF)で37C.F.R.§1.821に従って同時に電子的に提出された「配列一覧」は、参照により本明細書に組み込む。配列一覧の電子コピーは、2009年6月23に110Kバイトのファイルサイズで作成された。
二環式プロリン類似体は、ペプチド模倣薬の発見および開発に用いられている(A.Trabocchiら(2008年)、Amino Acids(2008)34:1−24頁)。C型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤ボセプレビル(SCH505034;((1R,2S,5S)−N−(4−アミノ−1−シクロブチル−3,4−ジオキソブタン−2−イル)−3−((S)−2−(3−tert−ブチルウレイド)−3,3−ジメチルブタノイル)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボキサミド)(Malcolmら(2006年)、Antimicrob.Agents Chemother.50(3):1013 20頁)およびテラプレビル(VX950;N−((S)−1−シクロヘキシル−2−((S)−1−((1S,3aR,6aS)−1−((R)−3−(2−(シクロプロピルアミノ)−2−オキソアセチル)ヘキサノイル)ヘキサヒドロシクロペンタ[c]ピロロ−2(1H)−イル)−3,3−ジメチル−1−オキソブタン−2−イルアミノ)−2−オキソエチル)ピラジン−2−カルボキサミド)(Perniら(2006年)、Antimicrob.Agents Chemother.50(3):899 909頁)。
本開示は、立体的に定義された治療薬の合成における新規な中間体として特に有用である、それらの塩および水和物を含む、以下の構造式II(a)の実質的に立体異性的に純粋な二環式イミン化合物(および構造式II(b)のそれらの二量体)
5.1 本開示の縮合二環式プロリン化合物
5.1.1 式II(a)および(b)の縮合二環式プロリン化合物
本開示は、それらの塩および水和物を含む、以下の構造式II(a)の実質的に鏡像異性的に純粋な縮合二環式プロリン化合物およびそれらの二量体である構造式II(b)の化合物ならびにそれらの混合物
本開示は、それらの塩、水和物および混合物を含む、構造式III(a)および(b)
さらに、本開示は、それらの塩、水和物および混合物を含む、構造式IV(a)および(b)
本開示は、それらの塩および水和物を含む、構造式V
本開示は、それらの塩および水和物を含む、構造式VI
さらに、本開示は、それらの塩および水和物を含む、構造式VII
構造式Iのアミン化合物を構造式IIの対応するイミン化合物に酸化することができる、本開示のモノアミンオキシダーゼは、配列番号2、配列番号6および配列番号32のアミノ酸配列と比較して1つ以上のアミノ酸置換を有する。そのようなアミノ酸置換は、酵素活性の増大、立体選択性、熱安定性、溶媒安定性、生成物阻害の減少、基質阻害の減少または反応副生成物に対する感受性の低下などの1つ以上の改善された特性をモノアミンオキシダーゼに与える。そのようなアミノ酸置換は、例えば、E.コリ宿主細胞などであるが、これに限定されない異種宿主中の組換えにより発現させたタンパク質としての、宿主細胞中のモノアミンオキシダーゼの発現レベル、溶解度および/または安定性も改善し得る。一実施形態において、アミノ酸置換S465Gは、E.コリにおける本開示のモノアミンオキシダーゼの発現レベル、溶解度および/または安定性の実質的な増大をもたらす。
本明細書で用いているように、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
本開示の複素二環式化合物は、本明細書で開示した生物学的触媒としてのモノアミンオキシダーゼを用いた下で開示する生体触媒法を用いて合成される。
本開示は、基質である構造式Iの化合物を構造式IIの化合物に立体選択的に酸化または変換することができる操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素を提供する。特定の実施形態において、本開示は、基質である化合物(1)を化合物(2)に立体選択的に酸化または変換することができる操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素を提供する。他の実施形態において、本開示は、基質である化合物(3)を化合物(4)に立体選択的に酸化または変換することができる操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素を提供する。両方の例において、本開示のモノアミンオキシダーゼは、アスペルギルス・ニガー(配列番号2)もしくはアスペルギルス・オリザ(配列番号32)もしくはそのハイブリッド(配列番号6)の天然に存在する野生型モノアミンオキシダーゼと比較したとき、または他の操作改変モノアミンオキシダーゼ酵素(例えば、配列番号8の酵素)と比較したとき、改善された特性も示す。改善が望ましい酵素特性は、酵素活性、熱安定性、pH活性プロファイル、補因子の必要、阻害物質(例えば、生成物阻害)に対する無反応性、立体特異性、立体選択性、溶媒安定性、溶解度ならびに宿主細胞中の安定性および発現レベルを含むが、これらに限定されない。改善は、酵素活性などの単一酵素特性または酵素活性および立体選択性などの各種酵素特性の組合せに関するものであり得る。
他の態様において、本開示は、本明細書で開示した操作改変モノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを創出するために遺伝子発現を制御する1つ以上の異種調節配列に作動可能に連結することができる。操作改変モノアミンオキシダーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築体を適切な宿主細胞に導入して、対応するモノアミンオキシダーゼポリペプチドを発現させることができる。
他の態様において、本開示は、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、該ポリヌクレオチドは、宿主細胞における該モノアミンオキシダーゼの発現のために1つ以上の制御配列に作動可能に連結されている。本開示の発現ベクターによりコードされるモノアミンオキシダーゼポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞は、当技術分野で周知であり、E.コリ、ラクトバシルス・ケフィル(Lactobacillus kefir)、ラクトバシルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバシルス・マイノル(Lactobacillus minor)、ストレプトミセス属およびサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)細胞などの細菌細胞;酵母細胞(例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス(Pichia pastoris)(ATCCアクセッション番号201178))などの真菌細胞;ドロソフィラ(Drosophila)S2およびスポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞などの昆虫細胞;CHO、COS、BHK、293およびBowes黒色腫細胞などの動物細胞;ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。上述の宿主細胞についての適切な培地および増殖条件は、当技術分野で周知である。
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたモノアミンオキシダーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、酸化反応を触媒する天然に存在するモノアミンオキシダーゼをアスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・オリザから得る(または由来である)。いくつかの実施形態において、親ポリヌクレオチド配列は、指定された宿主細胞におけるモノアミンオキシダーゼの発現を増大させるためにコドン最適化される。実例として、アスペルギルス・ニガーの野生型モノアミンオキシダーゼポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列は、Genbankデータベースにおいて利用可能なアスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼ配列(Genbankアクセッション番号L38858)の公知のアミノ酸配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから構築した。配列番号1と呼ぶ親ポリヌクレオチド配列は、E.コリにおける発現のためにコドン最適化し、モノアミンオキシダーゼ遺伝子の発現をlacプロモーターおよびlacIリプレッサー遺伝子の制御下において、コドン最適化ポリヌクレオチドを発現ベクター中にクローニングした。E.コリにおける活性モノアミンオキシダーゼを発現するクローンを同定し、遺伝子の配列を決定して、それらの同一性を確認した。示された配列(配列番号2)は、アスペルギルス・ニガーモノアミンオキシダーゼから進化させた操作改変モノアミンオキシダーゼのほとんどの実験およびライブラリー構築の出発点として用いた親配列であった。
本明細書で述べたモノアミンオキシダーゼは、各A、MおよびM’が上述の通りである、以下の構造式Iの基質化合物の構造式II(a)の立体異性体生成物への酸化を触媒することができる。
本開示の様々な特徴および実施形態は、例示するものであって、限定するものではない、以下の代表的な実施例で例示する。
モノアミンオキシダーゼコード化遺伝子は、参照により本明細書に組み込む、米国仮出願第60/848,950号の実施例1に記載されたモノアミンオキシダーゼの報告されたアミノ酸配列およびコドン最適化アルゴリズムに基づいてE.コリ(W3110fhuAまたはUM2)における発現のためにデザインした。遺伝子は、例えば、42ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを用いて合成し、lacプロモーターの制御下で発現ベクターpCK110900(米国特許出願公開第20060195947号における図3に示されている)にクローニングした。該発現ベクターは、P15a複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含む。得られたプラスミドを標準的方法を用いてE.コリW3110中に形質転換した。コドン最適化遺伝子の例およびコード化ポリペプチドも表4に示す。野生型モノアミンオキシダーゼの活性は、Zhouら(Zhouら、「A One−Step Fluorometric Method for the Continuous Measurement of Monoamine Oxidase Activity」、1997、Anal.Biochem.、253:169 74頁)およびSzutowiczら(Szutowiczら、「Colorimetric Assay for Monoamine Oxidase in Tissues Using Peroxidase and 2,2’ Azino(3 ethylbenzthaizoline−6−sulfonic Acid)as Chromogen」、1984、Anal.Biochem.、138:86−94頁)により開示されたものを含む、当技術分野で公知の方法またはその変法を用いて確認した。酵素活性の比較は、本明細書で詳細にさらに述べたように、または例えば、ZhouおよびSzutowiczの方法を用いて、酵素の定義された調製物、設定条件下での定義されたアッセイおよび1つ以上の定義された基質を用いて行った。一般的に、溶解物を比較する場合、宿主細胞により産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために同一の発現系および同一の宿主細胞を使用するのみならず、アッセイに供した細胞の数およびタンパク質の量も決定した。
モノアミンオキシダーゼ粉末は、次のように振とうフラスコ培養から製造した:目的とするモノアミンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを含むE.コリの単一微生物コロニーを、30μg/mlクロラムフェニコールおよび1%グルコースを含む50mlのLuria Bertaniブロス中に接種する。恒温槽中で250rpmで振とうしながら細胞を30℃で一夜(少なくとも16時間)増殖させる。培養は、1リットルフラスコ中で250mlの2XYT(16g/lバクト−トリプトン、10g/L酵母エキス、5g/L NaCl、pH7.0)、1mM MgSO4、30μg/mlクロラムフェニコール中に0.2の600nmでの光学濃度(OD600)まで希釈し、30℃で増殖させる。培養のOD600が0.6から0.8であるときにモノアミンオキシダーゼ遺伝子の発現を1mM IPTGにより誘導し、一夜(少なくとも16時間)温置する。細胞を遠心分離(5000rpm、15分、4℃)により収集し、上清を捨てる。細胞ペレットを等容積の冷(4℃)100mMトリエタノールアミン(塩酸塩)緩衝液、pH7.0(場合によって2mM MgSO4を含む)を用いて再懸濁し、上のように遠心分離により収集する。洗浄済み細胞を2容積の冷トリエタノールアミン(塩酸塩)緩衝液、pH7.0に再懸濁し、温度を4℃に維持しながらFrench Pressに12000psiで2回通す。細胞デブリを遠心分離(9000rpm、45分、4℃)により除去する。透明な溶解物上清を収集し、−20℃で保存する。凍結透明溶解物の凍結乾燥によって、粗モノアミンオキシダーゼ酵素の乾燥粉末が得られる。
モノアミンオキシダーゼ粉末は、次のように発酵により製造した:曝気撹拌15L発酵槽中で、0.88g/L硫酸アンモニウム、0.98g/Lのクエン酸ナトリウム、12.5g/Lのリン酸水素二カリウム三水和物、6.25g/Lのリン酸二水素カリウム、6.2g/LのTastone−154酵母エキス、0.083g/Lのクエン酸第二鉄アンモニウムならびに2g/Lの塩化カルシウム二水和物、2.2g/Lの硫酸亜鉛七水和物、0.5g/Lの硫酸マンガン一水和物、1g/Lの硫酸銅七水和物、0.1g/Lのモリブデン酸アンモニウム四水和物および0.02g/Lの四ホウ酸ナトリウム十水和物を含む8.3mL/Lの微量元素溶液を含む6.0Lの増殖培地を30℃の温度にする。発酵槽に目的とするモノアミンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを含むE.コリW3110の後期指数培養を接種し、実施例3で述べたように振とうフラスコ中で0.5の開始OD600から2.0に増殖させる。発酵槽を500 1500rpmで撹拌し、溶存酸素レベルを30%以上の飽和度に維持するために空気を1.0−15.0L/分で発酵容器に供給する。培養のpHは、20容積/容積%水酸化アンモニウムの添加により7.0に制御する。培養の増殖は、500g/Lセレロース(cerelose)、12g/L塩化アンモニウムおよび10.4g/L硫酸マグネシウム七水和物を含む供給溶液を加えることにより維持する。培養が50のOD600に達したならば、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)を1mMの最終濃度まで加えることにより、モノアミンオキシダーゼの発現を誘導する。次いで、培養をさらに14時間増殖させる。収集するまで培養を4℃に冷却し、4℃に維持する。Sorval RC12BP遠心分離機で4℃で、5000Gで40分間遠心分離することにより、細胞を収集する。収集した細胞は、次の下流回収工程に直接用いるまたはこのような使用まで4℃で保存する。
6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンの変換および6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサ−2−エン生成物の立体異性体純度を下で述べるキラルGC法により決定した。溶出の順序は次の通りであった:基質(1)(保持時間約7分)、所望の(1R,2S)−イミン(2)(約10.6分)、望ましくない(1R,2S)イミン(約11.0分);カラム:Supelco Betadex225(部品番号24348)、.25mm×30m×.25um;オーブン温度:85℃等温;キャリヤー流量:1.1ml/分;注入量:4μL;注入スプリット:100:1;注入部温度=200℃;FID検出。
オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロールの変換および生成物の立体異性体純度を下で述べるキラルGC法により決定した。溶出の順序は次の通りであった:基質(3)(保持時間約2.7分)、所望の(3aS,6aR)イミン(4)(約5.5分)、望ましくない(3aR,6aS)−イミン(約5.8分)。イミン(4)のイミン二量体は、注入部口においてイミンに熱分解する。カラム:Supelco Betadex225(部品番号24348)、.25mm×30m×.25um;オーブン温度:120℃等温;キャリヤー流量:1.1ml/分;注入量:4μL;注入スプリット:100:1;注入部温度=200℃;FID検出。
本明細書で開示した野生型モノアミンオキシダーゼを、6,6ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン(化合物(1))を6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサ−2−エン(化合物(2))に酸化するそれらの能力についてスクリーニングした。空気中の50mL3頚フラスコに25mLの100mM pH3.0リン酸カリウム緩衝液および330μLの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを加えて、均一な溶液を得た。pHを濃H3PO4により約7.3に調整した。pH調整済み溶液に60μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)およびpH8.0リン酸カリウム緩衝液中150mgの配列番号2(A.ニガー)または配列番号32(A.オリザ)を有する野生型モノアミンオキシダーゼ粉末(実施例2の振とうフラスコ法により調製した)を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で24時間撹拌した。pHは、1−5μLずつの1N NaOHのフィードバック制御添加により7.2に維持した。(アミン反応物は中性pHにおいてプロトン化されており、イミン生成物はプロトン化されない。この作用により、pHを維持するために中和されなければならないプロトンが放出される。)
本明細書で開示した野生型モノアミンオキシダーゼを、(オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール(化合物(3))を(3aS,6aR)1,3a,4,5,6,6aヘキサヒドロシクロペンタ[c]ピロール)(化合物(4))に酸化するそれらの能力についてスクリーニングした。空気中の50mL3頚フラスコに25mLの100mM pH8.0リン酸カリウム緩衝液および375mgのオクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール塩酸塩を加え、1N NaOHでpHを約7.3に調整した。pH調整済み溶液に60μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrichから購入;カタログ番号C−3515)およびpH8.0リン酸カリウム緩衝液中150mgの配列番号2(A.ニガー)を有する野生型モノアミンオキシダーゼ粉末(実施例2の振とうフラスコ法により調製した)を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で24時間撹拌した。pHは、1−5μLずつの1N NaOHのフィードバック制御添加により7.2に維持した。24時間後にNaOH消費はほとんどまたは全く認められなかった。pHを約14に至らせる10N NaOHで反応をクエンチさせ、混合物をCDCl3で抽出した。遠心分離(5分間6000rpm)により相分離した後、CDCl3溶液の1H−NMR分析で、アミン(3)のイミン(4)への変換はほとんどまたは全く示されなかった。
定向進化により得られ、進化モノアミンオキシゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドライブラリーをE.コリ中に形質転換し、1%グルコースおよび30μg/mLクロラムフェニコール(CAM)を含むLuria−Bertani(LB)ブロス上で平板培養する。30℃で少なくとも16時間温置した後、Q−bot(商標)ロボットコロニー採取装置(Genetix USA,Inc.、Beaverton、OR)を用いてコロニーを採取し、180μLのTerrificブロス(TB)、1%グルコース、30μg/mLクロラムフェニコール(CAM)および2mM MgSO4を含む96ウエルシャローウエルマイクロタイタープレート中に入れる。200rpmで振とうしながら細胞を30℃で一夜増殖させる。次いで、この培養の20μLを、350μLのTerrificブロス(TB)、2mM MgSO4および30μg/mL CAMを含む96ディープウエルプレート中に移す。250rpmで振とうしながらディープウエルプレートを30℃で2.5から3時間温置した後(OD600 0.6−0.8)、イソプロピルβDチオガラクトシド(IPTG)を1mMの最終濃度まで加えることにより、細胞培養による組換え遺伝子発現を誘導する。次いで、プレートを250rpmで振とうしながら30℃で15−23時間温置する。
96ウエルプレート上のモノアミンオキシダーゼ変異体を含む溶解物を実施例8で述べたように調製した。
300rpmのオーバーヘッド撹拌機を取り付けた500mL4頚フラスコに約25℃の150mLのMilli−Q水および1.2mL(約1.0g;約9mモル)の6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを加えて、pHが11.8の均一溶液を得た。pHが7.5に達するまでNa2S2O5を少しずつ加えた。無色溶液に300μLのAntifoam−204(Sigmaカタログ番号A−6226)および600μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)を加えて、pH7.5の無色溶液を得た。この溶液に配列番号10を有する1.5gのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例3による発酵により製造)を加えて、黄色溶液を得た。空気スパージングプローブを挿入したところ(空気流量約60mL/分)、反応混合物のpHは直ちに低下し始めた。2N NaOHのフィードバック制御投与によりpHを維持した。約30分後に、pHは安定な状態のままであり、さらなる塩基の投与は行われなかった。さらに10分(合計40分)後に、120mLの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンNaHSO3溶液(20.8gの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを150mLのdH2Oに加え、pH7.2に達するのに十分なNa2S2O5を加えることによって調製した)を反応物に0.25mL/分の速度で加えた。反応混合物のpHは直ちに低下し始め、2N NaOHの投与が再開された。約8時間(9時間の合計反応時間)後に6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンおよびNaHSO3の溶液の添加を完了した。塩基の添加を続け、基質の添加を完了した後に塩基の添加速度を増加させた。200μLの分割試料を採取し、200μLの8N NaOHでクエンチし(アミノスルホネートを破壊して遊離イミンを得るため)、600μLのCDCl3で抽出した。CDCl3抽出物の1H−NMR分析により、基質(1)のアザビシクロ[3.1.0]ヘキサ−2−エン化合物(2)への完全な変換が示された(1H−NMR(300MHz,CDCl3)スペクトル:δ7.42(s,1H,N=C−H)、3.81(dd;J=6.1,17.8;1H)、3.50(dd;J=2.1,17.8;1H)、2.06(m;1H)、1.62(m,1H)、1.03(s,3)、0.80(s,3H))。
空気中の50mL3頚フラスコに25mLの100mM pH3.0リン酸カリウム緩衝液および330μLの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを加えて、均一な溶液を得た。濃H3PO4を用いてpHを約7.5に調整した。pH調整済み溶液に、60μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)およびpH8.0リン酸カリウム緩衝液中配列番号4、6または8を有する150mgのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例2による方法により調製)を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で24時間撹拌した。pHは、1−5μLずつの1N NaOHのフィードバック制御添加により7.4に維持した。次いで、pHを約14に至らせる10N NaOHで反応をクエンチさせた。混合物の試料をCDCl3で抽出した。遠心分離(6000rpmで5分間)による相分離後に、1H−NMR分析により、アミン(1)のイミン(2)への少なくとも95%の変換が示された。実施例4によるキラルGC分析により、(1R,5S)−イミン鏡像異性体(2)が示された。(1S,2R)鏡像異性体は検出されなかった。
空気中の50mL3頚フラスコに25mLの100mM pH3.0リン酸カリウム緩衝液および330μLの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを加えて、均一な溶液を得た。濃H3PO4を用いてpHを約7.5に調整した。pH調整済み溶液に、60μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)およびpH8.0リン酸カリウム緩衝液中配列番号4、6または8の150mgのポリペプチドのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例2による方法により調製)を加えた。ヘッドスペースを酸素流でフラッシュし、得られた淡黄色の溶液を空気中で24時間撹拌した。pHは、1−5μLずつの1N NaOHのフィードバック制御添加により7.2に維持した。次いで、pHを約14に至らせる10N NaOHで反応をクエンチさせた。混合物の試料をCDCl3で抽出した。遠心分離(6000rpmで5分間)による相分離後に、1H−NMR分析により、アミン(1)のイミン(2)への少なくとも95%の変換が示された。実施例4によるキラルGC分析により、(1R,5S)−イミン鏡像異性体(2)が示された。(1S,2R)鏡像異性体は検出されなかった。
100mLフラスコに40mLのdH2Oおよび1.8mLの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを加えて、pHが約11.4の均一な溶液を得た。この溶液に2.7gのNa2S2O5を加えて、均一な溶液とし、約1mLの8N NaOHを加えることによりpHを約7.5に調整した。この溶液に60μLのAntifoam−204(Sigmaカタログ番号A−6226)、120μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)および10mLの100mM pH8.0リン酸カリウム緩衝液中配列番号8のポリペプチドの300mgのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例2による方法により調製)を加えた。空気をフリットガラスを通して反応混合物中にスパージングし、得られた淡黄色溶液を空気スパージングにより24時間室温(約21℃)で24時間撹拌した。pHは、1μLずつの2.5N NaOHのフィードバック制御添加により7.4に維持した。反応をクエンチさせ、イミン−重亜硫酸付加体(アミノスルホネート)をpHを約14に至らせる10N NaOHで破壊して遊離イミンを得て、生成物をMTBE中への抽出により抽出分離した。相分離の後、蒸留により(1R,5S)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサ−2−エンは86%の収率で分離された。CDCl3中1H−NMRによる分析(実施例10と同様の)により、化合物(1)のイミン化合物(2)への変換が確認された。実施例4の方法によるキラルGC分析により、(1R,5S)−イミン鏡像異性体(2)が示された。(1S,2R)鏡像異性体は検出されなかった。
300rpmのオーバーヘッド撹拌機を取り付けた室温(約21℃)の500mL4頚フラスコに150mLのMilli−Q水および1.2mL(約1.0g;約9mモル)の6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを加えて、pHが11.8の均一溶液を得た。pHが7.5に達するまでNa2S2O5を少しずつ加えた。無色溶液に300μLのAntifoam−204(Sigmaカタログ番号A−6226)および600μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)を加えて、pH7.5の無色溶液を得た。この溶液に配列番号8のポリペプチドの1.5gのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例3により調製)を加えて、黄色溶液を得た。空気スパージングプローブを挿入し、空気を反応物中に約60mL/分の速度でスパージングしたところ、反応混合物のpHは直ちに低下し始めたことが認められた。2N NaOHのフィードバック制御添加によりpHを維持した。約30分後に、pHは安定な状態のままであったので、さらなる塩基の添加は行わなかった。さらに10分(合計40分)後に、120mLの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン/NaHSO3溶液(20.8gの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンと150mLのdH2OおよびpH7.2に達するのに十分なNa2S2O5)を反応混合物に0.25mL/分の速度で加えた。反応混合物のpHが直ちに低下し始め、2N NaOHの添加が再開された。約8時間(9時間の合計反応時間)後に6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン/NaHSO3の添加を完了した。塩基の添加を続け、基質添加を完了した後に塩基の添加速度を増加させた。pHを約14に至らせる(およびイミン−重亜硫酸付加体を破壊する)10N NaOHで反応をクエンチさせ、混合物をMTBEで抽出した。相分離後、MTBE溶液の蒸留により(1R,5S)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサ−2−エンが72%の収率で分離された。CDCl3中1H−NMR分析(実施例10と同様に)により、化合物(1)のイミン化合物(2)への変換が確認された。実施例4の方法によるキラルGC分析により、(1R,5S)−イミン鏡像異性体(2)が示された。(1S,2R)鏡像異性体は検出されなかった。
100mLフラスコに40mLのdH2Oおよび1.8mLの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを加えて、pHが約11.4の均一溶液を得た。この溶液に2.7gのNa2S2O5を加えて、均一溶液とし、約1mLの8N NaOHでpHを約7.5に調整した。この溶液に60μLのAntifoam−204(Sigmaカタログ番号A−6226)、120μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)および10mLの100mM pH8.0リン酸カリウム緩衝液中配列番号8のポリペプチドの300mgのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例2による方法により調製)を加えた。空気をフリットガラスを通して反応混合物中に約10mL/分の速度でスパージングし、得られた淡黄色溶液を空気中で24時間室温(約21℃)で24時間撹拌した。終始、pHを1μLずつの2.5N NaOHのフィードバック制御添加により7.4に維持した。24時間後に、1.0g(1.3当量)のNaCNを(1R,2S,5S)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−スルホネートを次いで含む反応混合物に加えた。室温(約21℃)でさらに15分間撹拌した後、混合物をMTBEで抽出した。(2−Me−THFも抽出に用いることができる。)相分離および溶媒除去後に、1.78g(収率90%)の(1R,2S,5S)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボニトリルが淡黄色固体として分離された。CDCl3中1H−NMRによる分析により、(1R,2S,5S)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボニトリルの調製が確認された(1H−NMR(300MHz,CDCl3)スペクトル:δ3.92(d,J=1.2,1H,NC(H)(CN))、3.25(m,1H)、2.96(dd,J=2.1,17.0)、1.48(dd;J=1,2,12.2;1H)、1.42(m,1H)、1.13(s,3H)、1.11(S,3H))。
段階1。オーバーヘッド撹拌機(300rpm)を取り付けた室温(約21℃)の500mL4頚フラスコに150mLのMilli−Q水および1.2mL(約1.0gおよび9mモル)の6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを加えて、pHが11.8の均一溶液を得た。pHが7.5に達するまでNa2S2O5を少しずつ加えた。無色溶液に300μLのAntifoam−204(Sigmaカタログ番号A−6226)および600μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)を加えて、pH7.5の無色溶液を得た。この溶液に配列番号12を有する300mgのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例3の方法により調製)を加えて、黄色溶液を得た。空気スパージングプローブ(約60mL/分の空気流速)を挿入したところ、反応混合物のpHは直ちに低下し始めた。2N NaOHのフィードバック制御添加によりpHを維持した。約40分後に、pHは安定な状態のままであり、さらなる塩基の添加は行われなかった。さらに10分(合計50分)後に、150mLの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンNaHSO3溶液(26.1gの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンと160mLのdH2OおよびpH7.2に達するのに十分なNa2S2O5)を反応混合物に0.12mL/分の速度で加えた。反応混合物のpHは直ちに低下し始め、2N NaOHの添加が再開された。約21時間(約22時間の合計反応時間)後に6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン/NaHSO3の添加を完了した。塩基の添加を基質添加を完了した後に高い速度で続けた。24時間後に、1HNMR分析により反応が完結したと判断された。
実施例16または17に従って調製した(1R,2S,5S)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボニトリルを、PCT国際出願公開WO2007/075790に記載された手順により対応する実質的に鏡像異性的に純粋な(1R,2S,5S)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボン酸メチルエステルに変換する。
手順は、配列番号8のモノアミンオキシダーゼ粉末を実施例3の方法により調製したことを除いて、NaCNの添加まで実施例15のものと同一である。24時間後、表5に示すようにNaCNを反応混合物に少しずつ加えた(1.0当量のNaCNは720mgの95%NaCNであった)。各規定の時間間隔の後、200μLの分割試料を採取し、1mLのCDCl3で抽出し、次いで1H−NMRにより分析した。((1R,5S)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボニトリルの所望の2Sおよび望ましくない2Rエピマーの間の比)間のトランス/シス比をアミノニトリルメチンプロトン共鳴の1H−NMR積分(トランス=3.92ppmにおける二重線;シス=4.22ppmにおける二重線)により決定した。
段階1。オーバーヘッド撹拌機(300rpm)を取り付けた室温(約21℃)の500mL4頚フラスコに150mLのMilli−Q水および1.2mL(約1.0gおよび9mモル)の6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンを加えて、pHが11.8の均一溶液を得た。pHが7.5に達するまでNa2S2O5を少しずつ加えた。無色溶液に300μLのAntifoam−204(Sigmaカタログ番号A−6226)および600μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)を加えて、pH7.5の無色溶液を得た。この溶液に配列番号12を有する300mgのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例3の方法により調製)を加えて、黄色溶液を得た。空気スパージングプローブ(約60mL/分の空気流速)を挿入したところ、反応混合物のpHは直ちに低下し始めた。2N NaOHのフィードバック制御添加によりpHを維持した。約40分後に、pHは安定な状態のままであり、さらなる塩基の添加は行われなかった。さらに10分(合計50分)後に、150mLの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンNaHSO3溶液(26.1gの6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサンと160mLのdH2OおよびpH7.2に達するのに十分なNa2S2O5)を反応混合物に0.12mL/分の速度で加えた。反応混合物のpHは直ちに低下し始め、2N NaOHの添加が再開された。約21時間(約22時間の合計反応時間)後に6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン/NaHSO3の添加を完了した。塩基の添加を基質添加を完了した後に高い速度で続けた。24時間後に、1HNMR分析により反応が完結したと判断された。
段階1。手順は、実施例18の段階1と同一である。
空気中の50mL3頚フラスコに25mLの100mM pH8.0リン酸カリウム緩衝液および375mgのオクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール塩酸塩を加えた後、1N NaOHを加えることによってpHを約7.5に調整した。pH調整済み溶液に60μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)およびpH8.0リン酸カリウム緩衝液中配列番号4を有する150mgのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例2の方法により調製した)を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で24時間撹拌し、この間に1−5μLずつの1N NaOHのフィードバック制御添加によりpHを7.4に維持した。pHを約14に至らせる10N NaOHで反応をクエンチさせ、生成物をCDCl3中への抽出によって分離し、変換を1H−NMRにより分析したところ、1,3a,4,5,6,6a−ヘキサヒドロシクロペンタ[c]ピロールの生成が示された。
空気中の50mL3頚フラスコに25mLの100mM pH8.0リン酸カリウム緩衝液および400mgのオクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール塩酸塩、500mgのNa2S2O5を加え、10N NaOHによりpHを約7.5に調整した。pH調整済み溶液に30μLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)およびpH8.0リン酸カリウム緩衝液中配列番号10を有する300mgのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例2の方法により調製した(を加えた。得られた淡黄色の溶液を空気中で24時間撹拌し、この間に1−5μLずつの1N NaOHのフィードバック制御添加によりpHを7.5に維持した。48時間撹拌した後、300mgのNaCNを反応混合物に加えたところ、pHが約9.9に上昇した。室温(約21℃)でさらに1時間撹拌した後、混合物を酢酸エチルで抽出した。相分離および溶媒蒸発後、316mgのオクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール−1−カルボニトリルが分離された(収率82%)。1H−NMRにより、約90%の(1S,3aR,6aS)、「トランス」および約10%の(1R,3aR,6aS)エピマー、「シス」が示された(1H−NMR(300MHz,CDCl3)スペクトル:δ3.95(d,J=6.6,シスアミノニトリルメチンH)、3.62(d,J=1.2;トランスアミノニトリルメチンH)、3.15(m,1H)、2.71(m,2H)、2.62(m,1H)、1.63−1.93(m,3H)、1.55(m,1H)、1.22−1.45(m,3H))。
20℃で、300rpmで撹拌されたジャケット付き3L3頚フラスコに500mLのdH2Oおよび20mLの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液を加えた。濃H3PO4でpHを約7.6に調整して、無色均一溶液を得た。この溶液に2.0mLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Sigma Aldrich;カタログ番号C−3515)および配列番号16のポリペプチドの5.0gのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例3の方法により調製した)を加えて、淡黄色の溶液を得た。容器のヘッドスペースに約0.2L/分の乾燥空気を通気した。反応物のpHは、380mLが添加されるまで、20−100μLずつの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液のフィードバック制御添加により7.5に維持された。(中性溶液中のアミンはプロトン化されており、イミンはプロトン化されない。プロトンは、反応により放出され、pHを維持するために中和されなければならない。この実施例においては、アミン自体がpHスタットの滴定剤として用いられる塩基である。)380mLの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液が添加された後、pHは、反応を完結させる(最初の5g(45mモル)の基質に対応するために1N NaOHのフィードバック制御添加により維持された。さらなるNaOHの消費が認められなくなった後、スラリーの分割試料を採取し、ろ過し、固体を風乾した。
20℃で、300rpmで撹拌されたジャケット付き3L3頚フラスコに500mLのdH2Oおよび20mLの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液を加えた。濃H3PO4でpHを約7.6に調整して、無色均一溶液を得て、これに2.0mLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Novozyme;「Catalyzyme101」)および配列番号16のポリペプチドの5.0gのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例3の方法により調製した)を加えて、淡黄色の溶液を得た。容器のヘッドスペースに約0.2L/分の乾燥空気を通気した。反応物のpHは、380mLが添加されるまで、20−100μLずつの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液のフィードバック制御添加により7.5に維持された。(中性溶液中のアミンはプロトン化されており、イミンはプロトン化されない。プロトンは、反応により放出され、pHを維持するために中和されなければならない。この実施例においては、アミン自体がpHスタットの滴定剤として用いられる塩基である。)380mLの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液が添加された後、pHは、反応を完結させる(最初の5g(45mモル)の基質に対応する)ために1N NaOHの添加により維持された。さらなるNaOHの消費が認められなくなった後、1800mLのMTBEを、その後に45℃に加熱した不均一反応混合物に加えた。Celite(商標)によるろ過の後、下の水相を捨て、上の有機相を10%クエン酸で抽出し、(3aS,6aR)−1,3a,4,5,6,6a−ヘキサヒドロシクロペンタ[c]ピロール塩酸塩を含む酸性水溶液を実施例29の方法による(1R,2S,5S)−6,6−ジメチル−3−アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン−2−カルボン酸の調製に直接用いた。
空気中30℃で、300rpmで撹拌されたジャケット付き500mL3頚フラスコに100mLのdH2Oおよび2.0mLの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液(0.5gの基質)を加えた。濃H3PO4でpHを約7.8に調整して、無色均一溶液を得た。この溶液0.2mLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Novozyme;「Catalyzyme101」)および配列番号36のポリペプチドの0.25gのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例3の方法により調製した)を加えた。反応物のpHが直ちに低下し、pHは、25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液のフィードバック制御添加によりpH7.7に維持された。2時間後、さらに0.25gのモノアミンオキシダーゼ粉末を加えた。(3aR,6aS)オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロールの二量体が反応物から沈殿し始め、反応混合物は、実験中に白色スラリーになった。さらに2時間(合計4時間)後に、ヘッドスペースに約0.6mL/分の酸素を通気し、酸素通気を実験中維持した。24時間の合計反応時間の後、さらに0.5gのモノアミンオキシダーゼを加えた。48.5時間の合計反応時間の後、合計32.3mLの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液を加えた(反応した総基質は8.58gであった)。反応混合物をショートパス蒸留ヘッド(short path distillation head)を取り付けた500mL1頚フラスコに移し、一式を加熱マントルに入れた。加熱マントルを160℃に加熱することにより、二量体が氷浴中に浸漬したレシービングフラスコに水蒸気蒸留し始めた。蒸気相の温度は、約96℃であった。約30分後に、反応物の約1/2が蒸留し、蒸気相の温度は、約98℃であった。この時点で蒸留を中止した。レシービングフラスコ中の白色固体の水中懸濁液を粗フリット漏斗によりろ過し、白色固体を2時間風乾して、7.17g(収率84%)の(3aR,6aS)オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロールの二量体を得た。
20℃で、300rpmで撹拌されたジャケット付き3L3頚フラスコに500mLのdH2Oおよび20mLの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液を加えた。濃H3PO4でpHを約7.6に調整して、無色均一溶液を得て、これに2.0mLのA.ニガーカタラーゼ懸濁液(Novozyme;「Catalyzyme101」)および配列番号16のポリペプチドの5.0gのモノアミンオキシダーゼ粉末(実施例3の方法により調製した)を加えて、淡黄色の溶液を得た。容器のヘッドスペースに約0.2L/分の乾燥空気を通気した。反応物のpHは、20−100μLずつの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液のフィードバック制御添加により7.5に維持された。(3aR,6aS)オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロールの二量体が反応物から沈殿し始め、反応混合物が白色スラリーになった。380mLの25重量%オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール水中溶液を加えた後、水蒸気蒸留(蒸留器ヘッド温度約98℃)により生成物を反応混合物から分離した。レシーバーポットに(3aS,6aR)−1,3a,4,5,6,6a−ヘキサヒドロシクロペンタ[c]ピロールの二量体の水中懸濁液が含まれていた。1.1−1.2当量の濃HClをレシーバーポットに加えて二量体を破壊し、(3aS,6aR)−1,3a,4,5,6,6a−ヘキサヒドロシクロペンタ[c]ピロール塩酸塩の水中均一溶液を得た。この溶液は、実施例27において(1S,3aR,6aS)−オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール−1−カルボニトリルを調製するのに直接用いた。
実施例26で調製した(3aS,6aR)−1,3a,4,5,6,6a−ヘキサヒドロシクロペンタ[c]ピロール塩酸塩の水性酸性溶液を0℃に冷却し、300rpmで撹拌した。0℃の冷却溶液に3mL/分の100mLのdH2O中50gのNaCNを加えた。(シアニドによる塩酸塩溶液の中和によってHCNがインサイツで発生した。)NaCNの添加を開始してから2時間後に、1000mLのトルエン(氷浴中で予冷した)を加えて、二相性混合物を得、これにK2CO3の飽和溶液を、水相のpHが9.8に達するまで、10mL/分の速度で加えた。次いで、下の水相をカニューレを用いて除去し、廃棄する前に漂白剤で処理した(残りのシアニドを破壊するため)。上の有機懸濁液/乳濁液をCelite(商標)545の20gの床(高さ約1/4”×直径約3”)を通して室温(約21℃)で約15分間にわたりろ過して、約1000mLの無色有機相および約300mLの黄色水相ならびに約100mLの「ラグ相(rag phase)」(上の有機相と下の水相との間にある中間層)を得た。Celite(商標)パッドをトルエン2×100mLで洗浄した。溶液を分液漏斗中で合わせ、水相およびラグ層を排出させ、廃棄のために漂白剤で処理した。有機相から有機相の分割試料を採取し、蒸発乾固した。1H−NMR(300MHz,CDCl3)分析により、(1S,3aR,6aS)−オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール−1−カルボニトリル(「トランス」)およびこの1Rエピマー(「シス」)が約30:1の比率で存在することが示された(1H−NMR(300MHz,CDCl3)スペクトル:δ3.95(d,J=6.6,シスアミノニトリルメチンH)、3.62(d,J=1.2;トランスアミノニトリルメチンH)、3.15(m,1H)、2.71(m,2H)、2.62(m,1H)、1.63−1.92(m,3H)、1.55(m,1H)、1.22−1.45(m,3H))。有機相を約0℃に冷却し、250mLの濃HCl(氷浴中で予冷した)で2回抽出した。この後、完全で、即時的な相分割が起こった。(抽出が発熱性であったため、抽出溶液を予冷することが必要であった。溶液の温度は、約4℃からほぼ室温まで上昇した。(1S,3aR,6aS)−オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール−1−カルボニトリル塩酸塩を含む合わせた濃縮HCl抽出物(合計約600mL)を合わせ、実施例28において(1S,3aR,6aS)−オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール−1−カルボン酸塩酸塩を作製するのに直接用いた。
実施例27からの(1S,3aR,6aS)−オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール−1−カルボニトリル塩酸塩溶液を加熱して24時間還流し、この後、約300mLの水/HClを蒸留させ、残りの溶液を約50−60℃に冷却した。温溶液を500mLのトルエンに加え、残りの水(約100−120mL)をトルエン共沸物として蒸留させた。すべての水が除去された後、得られた褐色固体および淡黄色トルエンの重質スラリー懸濁液を室温(約21℃)に冷却した。固体をろ過漏斗上に収集し、トルエン(2×200mL)で洗浄した。黄褐色固体を2時間風乾し、真空中でさらに一夜乾燥して、159g(オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロールからの総収率72%)の(1S,3aR,6aS)−オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール−1−カルボン酸塩酸塩をNH4Cl副生成物との1:1混合物として得た。
段階1:磁気撹拌棒を備えた1650mL厚肉ガラス圧力ビン(Ace Glass,Inc.、8648−157)に実施例28において調製した75g(306.9mモル)の(1S,3aR,6aS)−オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール−1−カルボン酸塩酸塩/塩化アンモニウム混合物、375mLのジクロロメタンおよび497mLの酢酸t−ブチルを入れた。得られた混合物を周囲温度(約21℃)で激しく撹拌し、大きい凝集物を破壊して自由撹拌懸濁液を得た。この懸濁液を食塩水−氷浴を用いて0℃の内部温度に冷却し、75.4mL(1162mモル)のメタンスルホン酸を15分間にわたって1滴ずつ加えた。この間に内部温度が5℃に上昇した。圧力ビンを密封し、反応混合物を18時間にわたって激しく撹拌しながら周囲温度(約21℃)に加温した。この間に反応混合物は、琥珀色溶液中白色無機塩の懸濁液になった。混合物を氷浴中で冷却し、圧力ビンに注意深く通気し、蓋を取り外した。混合物を3Lフラスコに移し、撹拌しながら氷浴中で冷却した。400mLの50%(重量:重量)水中NaOHを、混合物の温度を20℃未満に維持しながら、35分間にわたって混合物に加えた。撹拌を停止し、相を分離させた。有機相(約850mL)を除去し、別個の容器に移した。残りの水相およびラグ層(pH13、約800mL)を375mLのジクロロメタンで抽出した。有機相を合わせ(約1250mL)、水(2×225mL)で洗浄した。得られた有機相をろ過して、ラグ層および不溶性物質を除去し、ロータリー真空蒸発により溶媒を除去して、48.3gの暗琥珀色の油を得た。油の1HNMRスペクトルは、(1S,3aR,6aS)−オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール−1−カルボン酸t−ブチルエステルを示した。
Claims (48)
- 構造式II(a)、II(b)、III(a)またはIV(a)
Aは、O、CR1R2、−C=C−または−CH2−CH2−であり、R1およびR2は、それぞれ独立に−H、−COOH、−X、−NH2、−CH2NHC(NH)NH2、−CX3、−CH3、−CH2CH3から選択され、ならびにXは、F、ClおよびBrから選択され、
MおよびM’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにMおよびM’の両方が存在する場合、MおよびM’は、同じであり、OおよびCR3R4から選択され、R3およびR4は、Hであり、またはMのR3もしくはR4およびM’のR3もしくはR4は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
(a)MおよびM’がOである場合、AはOではなく、ならびにAがOである場合、MおよびM’はOではなく、
(b)MおよびM’がCR3R4である場合、Aは、−CH=CH−または−CH2−CH2−であり得、ならびに
(c)MおよびM’がCR3R4であり、ならびに1つ以上の立体中心を有する場合、MおよびM’の立体中心は、反対の立体化学を有する。]。 - MおよびM’が存在せず、ならびにAが、−CH2−、−CH(CH3)−、−CH(C2H5)−、−C(CH3)2−、−C(C2H5)2−、−CF2−、−CCl2−、−CBr2−、C(CF3)2−、−CH(COOH)−、−C(COOH)2−、−CH(NH2)−および−CH(CH2NHC(NH)NH2)−からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
- MおよびM’がOであり、ならびにAが−CH2−、−C(CH3)2−および−C(C2H5)2−からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
- MおよびM’が−CH2−であり、ならびにAが−O−、−CH2−、−C(CH3)2−、−CH(CH3)−、−C(C2H5)2−、−CH(C2H5)−、−CF2−、−CCl2−、−CBr2−、C(CF3)2−、−CH(COOH)−、−C(COOH)2−、−CH(NH2)−および−C(H2)NHC(NH)NH2−からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
- MおよびM’が−CH2−であり、ならびにAが−O−、−CH2−および−C(CH3)2−からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
- MおよびM’が存在しない、請求項1に記載の化合物。
- MおよびM’が−CH2−である、請求項1に記載の化合物。
- Aが−CH2−である、請求項1に記載の化合物。
- Aが−C(CH3)2−である、請求項1に記載の化合物。
- Aが−C(CH3)2−である、請求項7に記載の化合物。
- Aが−C(CF3)2−である、請求項7に記載の化合物。
- Aが−CH2−である、請求項8に記載の化合物。
- 請求項1の実質的に立体異性的に純粋な化合物の対を含む混合物であって、化合物の対が(i)構造式II(a)およびII(b)の化合物;(ii)構造式III(a)およびIII(b)の化合物;ならびに(iii)構造式IV(a)およびIV(b)の化合物から選択される、混合物。
- 化合物の対が構造式III(a)およびIII(b)の対であり、ならびに混合物中の構造式III(a)の化合物の量が混合物中の構造式III(b)の化合物の量より多い、請求項18の混合物。
- 構造式III(a)の化合物の量と構造式III(b)の化合物の量の比が少なくとも5:1である、請求項19の混合物。
- 化合物の対が構造式IV(a)およびIV(b)の対であり、ならびに混合物中の構造式IV(a)の化合物の量が混合物中の構造式IV(b)の化合物の量より多い、請求項18の混合物。
- 構造式IV(a)の化合物の量と構造式IV(b)の化合物の量の比が少なくとも10:1である、請求項21の混合物。
- 構造式II(a)
Aは、O、CR1R2、−C=C−または−CH2−CH2−であり、R1およびR2は、それぞれ独立に−H、−COOH、−X、−NH2、−CH2NHC(NH)NH2、−CX3、−CH3、−CH2CH3から選択され、ならびにXは、F、ClおよびBrから選択され、
MおよびM’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにMおよびM’の両方が存在する場合、MおよびM’は、同じであり、OおよびCR3R4から選択され、R3およびR4は、Hであり、またはMのR3もしくはR4およびM’のR3もしくはR4は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
(a)MおよびM’がOである場合、AはOではなく、ならびにAがOである場合、MおよびM’はOではなく、
(b)MおよびM’がCR3R4である場合、Aは、−CH=CH−または−CH2−CH2−であり得、ならびに
(c)MおよびM’がCR3R4であり、ならびに1つ以上の立体中心を有する場合、MおよびM’の立体中心は、反対の立体化学を有する。]
による実質的に立体異性的に純粋な化合物(その塩および水和物を含む。)を調製する方法であって、
構造式I
によるアミン化合物を、モノアミンオキシダーゼ酵素が構造式Iのアミン化合物を構造式II(a)の対応するイミン化合物に酸化する条件下でモノアミンオキシダーゼ酵素と補因子の存在下で酸素と接触させる段階を含む、方法。 - 補因子がモノアミンオキシダーゼ酵素と非共有結合で結合している、請求項23の方法。
- 補因子が、FAD、FMN、NADおよびNADPからなる群から選択される、請求項23の方法。
- 過酸化水素(H2O2)の酸素分子および水への不均化を触媒する成分をさらに含む、請求項23の方法。
- 成分が、Pd、Feおよびカタラーゼ酵素からなる群から選択される、請求項26の方法。
- モノアミンオキシダーゼ酵素がアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)またはアスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)から得られるまたは由来である、請求項23の方法。
- モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号2の野生型A.ニガーモノアミンオキシダーゼと少なくとも90%同一であるまたは配列番号32の野生型A.オリザモノアミンオキシダーゼと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項23の方法。
- モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号4、8、10、12、14、16、18、20および36からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項23の方法。
- 構造式III(a)による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物および構造式III(b)による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物(それらの塩および水和物を含む。)
Aは、O、CR1R2、−C=C−または−CH2−CH2−であり、R1およびR2は、それぞれ独立に−H、−COOH、−X、−NH2、−CH2NHC(NH)NH2、−CX3、−CH3、−CH2CH3から選択され、ならびにXは、F、ClおよびBrから選択され、
MおよびM’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにMおよびM’の両方が存在する場合、MおよびM’は、同じであり、OおよびCR3R4から選択され、R3およびR4は、Hであり、またはMのR3もしくはR4およびM’のR3もしくはR4は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
(a)MおよびM’がOである場合、AはOではなく、ならびにAがOである場合、MおよびM’はOではなく、
(b)MおよびM’がCR3R4である場合、Aは、−CH=CH−または−CH2−CH2−であり得、ならびに
(c)MおよびM’がCR3R4であり、ならびに1つ以上の立体中心を有する場合、MおよびM’の立体中心は、反対の立体化学を有する。]
を含む混合物を調製する方法であって、構造式I
によるアミン化合物を、構造式III(a)による実質的に鏡像異性的アミノスルホネート化合物および構造式III(b)による実質的に鏡像異性的アミノスルホネート化合物を含む混合物を生成する条件下で、補因子と結合したモノアミンオキシダーゼ酵素の存在下で酸素と、および重亜硫酸塩と接触させる段階を含む、方法。 - 重亜硫酸塩が、モノアミンオキシダーゼの前または同時に反応物に加えられる、請求項31の方法。
- 重亜硫酸塩がモノアミンオキシダーゼの添加の後に加えられる、請求項31の方法。
- 構造式Iによるアミン化合物が、重亜硫酸塩の添加の前に酸素および補因子と結合したモノアミンオキシダーゼ酵素と接触させられる、請求項31の方法。
- モノアミンオキシダーゼ酵素がアスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・オリザから得られるまたは由来である、請求項31の方法。
- モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号2の野生型A.ニガーモノアミンオキシダーゼと少なくとも90%同一であるまたは配列番号32の野生型A.オリザモノアミンオキシダーゼと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項31の方法。
- モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号4、8、10、12、14、16、18、20および36からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項31の方法。
- 構造式IV(a)
Aは、O、CR1R2、−C=C−または−CH2−CH2−であり、R1およびR2は、それぞれ独立に−H、−COOH、−X、−NH2、−CH2NHC(NH)NH2、−CX3、−CH3、−CH2CH3から選択され、ならびにXは、F、ClおよびBrから選択され、
MおよびM’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにMおよびM’の両方が存在する場合、MおよびM’は、同じであり、OおよびCR3R4から選択され、R3およびR4は、Hであり、またはMのR3もしくはR4およびM’のR3もしくはR4は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
(a)MおよびM’がOである場合、AはOではなく、AがOである場合、MおよびM’はOではなく、
(b)MおよびM’がCR3R4である場合、Aは、−CH=CH−または−CH2−CH2−であり得、ならびに
(c)MおよびM’がCR3R4であり、ならびに1つ以上の立体中心を有する場合、MおよびM’の立体中心は、反対の立体化学を有する。]
による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物(その塩および水和物を含む。)を調製する方法であって、
構造式I
によるアミン化合物を、以下の構造式III(a)による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物および構造式III(b)による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノスルホネート化合物
構造式III(a)およびIII(b)による化合物を、構造式IV(a)による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成する条件下でシアニドと接触させる段階を含む、方法。 - 補因子がモノアミンオキシダーゼ酵素と非共有結合で結合している、請求項38の方法。
- 補因子が、FAD、FMN、NADおよびNADPからなる群から選択される、請求項38の方法。
- モノアミンオキシダーゼ酵素がアスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・オリザから得られるまたは由来である、請求項38の方法。
- モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号2の野生型A.ニガーモノアミンオキシダーゼと少なくとも90%同一であるまたは配列番号32の野生型A.オリザモノアミンオキシダーゼと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項38の方法。
- モノアミンオキシダーゼ酵素が、配列番号4、8、10、12、14、16、18、20および36からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項38の方法。
- 構造式VI(a)
Aは、O、CR1R2、−C=C−または−CH2−CH2−であり、R1およびR2は、それぞれ独立に−H、−COOH、−X、−NH2、−CH2NHC(NH)NH2、−CX3、−CH3、−CH2CH3から選択され、ならびにXは、F、ClおよびBrから選択され、
MおよびM’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにMおよびM’の両方が存在する場合、MおよびM’は、同じであり、OおよびCR3R4から選択され、R3およびR4は、Hであり、またはMのR3もしくはR4およびM’のR3もしくはR4は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
(a)MおよびM’がOである場合、AはOではなく、ならびにAがOである場合、MおよびM’はOではなく、
(b)MおよびM’がCR3R4である場合、Aは、−CH=CH−または−CH2−CH2−であり得、ならびに
(c)MおよびM’がCR3R4であり、ならびに1つ以上の立体中心を有する場合、MおよびM’の立体中心は、反対の立体化学を有する。]
による実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物(その塩を含む。)を調製する方法であって、
構造式IV(a)
による実質的に鏡像異性的に純粋なアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式VIによる実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物に変換される条件下で酸および水と接触させる段階を含む、方法。 - 構造式VI
Aは、O、CR1R2、−C=C−または−CH2−CH2−であり、R1およびR2は、それぞれ独立に−H、−COOH、−X、−NH2、−CH2NHC(NH)NH2、−CX3、−CH3、−CH2CH3から選択され、ならびにXは、F、ClおよびBrから選択され、
MおよびM’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにMおよびM’の両方が存在する場合、MおよびM’は、同じであり、OおよびCR3R4から選択され、R3およびR4は、Hであり、またはMのR3もしくはR4およびM’のR3もしくはR4は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
(a)MおよびM’がOである場合、AはOではなく、AがOである場合、MおよびM’はOではなく、
(b)MおよびM’がCR3R4である場合、Aは、−CH=CH−または−CH2−CH2−であり得、ならびに
(c)MおよびM’がCR3R4であり、1つ以上の立体中心を有する場合、MおよびM’の立体中心は、反対の立体化学を有する。]
による実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物(その塩を含む)を調製する方法であって、
構造式III(a)による立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物、構造式III(b)による実質的に立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物またはそれらの混合物を、
による実質的に立体異性的に純粋なアミノニトリル化合物を生成する条件下でシアニドと接触させる段階、ならびに
構造式IV(a)のアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式VIによる実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物に変換される条件下で酸および水と接触させる段階を含む、方法。 - 構造式V
R5は、(C1−C6)アルキルであり、
Aは、O、CR1R2、−C=C−または−CH2−CH2−であり、R1およびR2は、それぞれ独立に−H、−COOH、−X、−NH2、−CH2NHC(NH)NH2、−CX3、−CH3、−CH2CH3から選択され、ならびにXは、F、ClおよびBrから選択され、
MおよびM’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにMおよびM’の両方が存在する場合、MおよびM’は、同じであり、OおよびCR3R4から選択され、R3およびR4は、Hであり、またはMのR3もしくはR4およびM’のR3もしくはR4は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
(a)MおよびM’がOである場合、AはOではなく、ならびにAがOである場合、MおよびM’はOではなく、
(b)MおよびM’がCR3R4である場合、Aは、−CH=CH−または−CH2−CH2−であり得、ならびに
(c)MおよびM’がCR3R4であり、ならびに1つ以上の立体中心を有する場合、MおよびM’の立体中心は、反対の立体化学を有する。]
による実質的に鏡像異性的に純粋な化合物(その塩を含む。)を調製する方法であって、
構造式VI
による実質的に立体異性的に純粋なアミノ酸化合物を、構造式VIによるアミノ酸化合物が構造式Vによる実質的に鏡像異性的に純粋なアミノエステル化合物に変換される条件下で酸ならびにR5−OHおよびR5OC(O)CH3からなる群から選択される化合物と接触させる段階を含む、方法。 - 構造式V
R5は、(C1−C6)アルキルであり、Aは、O、CR1R2、−C=C−または−CH2−CH2−であり、R1およびR2は、それぞれ独立に−H、−COOH、−X、−NH2、−CH2NHC(NH)NH2、−CX3、−CH3、−CH2CH3から選択され、ならびにXは、F、ClおよびBrから選択され、
MおよびM’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにMおよびM’の両方が存在する場合、MおよびM’は同じであり、OおよびCR3R4から選択され、R3およびR4は、Hであり、またはMのR3もしくはR4およびM’のR3もしくはR4は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
(a)MおよびM’がOである場合、AはOではなく、ならびにAがOである場合、MおよびM’はOではなく、
(b)MおよびM’がCR3R4である場合、Aは、−CH=CH−または−CH2−CH2−であり得、ならびに
(c)MおよびM’がCR3R4であり、ならびに1つ以上の立体中心を有する場合、MおよびM’の立体中心は、反対の立体化学を有する。]
による実質的に立体異性的に純粋なアミノエステル化合物(その塩を含む)を調製する方法であって、
構造式III(a)による立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物、構造式III(b)による実質的に立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物またはそれらの混合物
構造式IV(a)のアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式Vによる実質的に立体異性的に純粋なアミノエステル化合物に変換される条件下で酸およびアルコールと接触させる段階を含む、方法。 - 構造式VII
Aは、O、CR1R2、−C=C−または−CH2−CH2−であり、R1およびR2は、それぞれ独立に−H、−COOH、−X、−NH2、−CH2NHC(NH)NH2、−CX3、−CH3、−CH2CH3から選択され、ならびにXは、F、ClおよびBrから選択され、
MおよびM’は、両方が存在していてよく、または両方が存在していなくてよく、ならびにMおよびM’の両方が存在する場合、MおよびM’は同じであり、OおよびCR3R4から選択され、R3およびR4は、Hであり、またはMのR3もしくはR4およびM’のR3もしくはR4は、メチレン架橋を形成しており、
但し、
(a)MおよびM’がOである場合、AはOではなく、ならびにAがOである場合、MおよびM’はOではなく、
(b)MおよびM’がCR3R4である場合、Aは、−CH=CH−または−CH2−CH2−であり得、ならびに
(c)MおよびM’がCR3R4であり、ならびに1つ以上の立体中心を有する場合、MおよびM’の立体中心は、反対の立体化学を有する。]による実質的に立体異性的に純粋なアミノアミド化合物(その塩を含む。)を調製する方法であって、
以下の構造式III(a)による立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物、構造式III(b)による実質的に立体異性的に純粋な重亜硫酸アミン付加体化合物またはそれらの混合物
構造式IV(a)のアミノニトリル化合物を、アミノニトリル化合物が構造式VIIによる実質的に立体異性的に純粋なアミノアミド化合物に変換される条件下で酸と接触させる段階を含む、方法。
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