JP2011522552A - 化学的に修飾されたrnaの酵素的合成のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)ssRNAテンプレート(一本鎖RNAテンプレート)を提供するステップと、
(b)リボース、リン酸および/または塩基部分に化学的修飾を有する少なくとも1つのリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、RNA合成に十分な条件下で、ssRNAテンプレートを、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性を有するタンパク質と相互作用させて、化学的に修飾された二本鎖RNA(dsRNA)を提供するステップであって、化学的修飾の結果、dsRNAの検出に使用される放射性、蛍光および/または化学標識で前記dsRNAが標識されないステップと
を含む。
(c)dsRNAをssRNAへと分離し、任意選択で、以下のステップ(d)から(f)を実施するステップと、
(d)ステップ(b)および(c)をn回反復し、nが少なくとも1の整数であるステップと、
(e)最終ステップ(b)を実施するステップと、
(f)反応を停止させるステップと
を含む増幅反応で使用することが好ましい。
a.XXDYS
b.GXPSG
c.YGDD
d.XXYGL
e.XXXXFLXRXX
の配列モチーフの保存された配置を含み、
D:アスパラギン酸
Y:チロシン
S:セリン
G:グリシン
P:プロリン
L:ロイシン
F:フェニルアラニン
R:アルギニン
X:任意のアミノ酸
の意味を有する。
配列番号1:
修飾されたRNAの酵素的合成のための一般的プロトコル
一般的な反応混合物は以下のとおりである:
反応混合物は、
カリシウイルス由来のRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)
緩衝液(5倍):HEPES pH7.6、250mM;MnCl2 25mM;DTT 5mM
リボヌクレオシド三リン酸:X、Y、Z、W
一本鎖RNA(テンプレート);
配列:GCUGAUGCCGUCAAGUUUACCCCC(配列番号7)
蒸留水
からなる。
実施例1から14および比較例15(修飾されていないrNTPのみを含む)の反応混合物を、以下のTable 2(表2)に従って設定した:
ssRNAテンプレート(1μg/μl):ヘテロポリマー配列、19から25ヌクレオチドの長さ
修飾および/または非修飾リボヌクレオシド三リン酸またはデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、10mMのストック溶液として使用した。
カリシウイルスRdRp:サポウイルスRdRp(配列番号4)を、70μMのストック溶液から使用した。
実施例1から14および比較例15の反応混合物を、PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)によって分析した。バンドを、エチジウムブロマイド染色によって検出した。図1に示されるように、実施例1から14の反応混合物は、修飾されていないヌクレオチドしか反応混合物中に含まれていない比較例15の反応混合物中にも存在する、dsRNAマーカー(レーンM)の25bpのフラグメントと同時移動する種を含む。
比較例15(修飾されていないdsRNA産物)、実施例1(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)および実施例13(dsRNA産物+2-F-dGMP)の反応混合物の産物を、イオン交換(IEX)クロマトグラフィーによって精製し、分画した。溶出プロフィールを図2および図3に示す。破線は、dsRNAを表すことが疑われる画分を示す。これらの画分をプールし、さらに分析した。酵素的に合成された(骨格が)修飾された二本鎖RNA(dsRNA産物+2-F-dGMPおよびdsRNA産物+2-O-CH3-CMP)または修飾されていない二本鎖RNA(dsRNA産物)の検出は、プールされた画分を用いて、エチジウムブロマイドによる染色およびUV透過照明後のPAGEによって実施した。比較のために、ssRNAテンプレート(図2Aおよび図2C中のssRNAテンプレート)およびdsRNAについてのマーカー(図2C中のレーンM)もまた、別個のレーン上でゲルに添加した。合成のためのテンプレートとして使用した一本鎖RNAは、マーカーの17bpのバンドの位置に移動する、より小さいバンドとして見出される。合成された修飾されていない二本鎖RNAは、マーカーの25bpのバンドの位置に移動する(dsRNA産物)。合成された2'-O-メチル-シチジン-5'-リン酸で骨格が修飾された二本鎖RNAは、マーカーの25bpのバンドの位置に移動する(図3B、dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)。合成された2'-フルオロ-2'-デオキシ-グアノシン-5'-リン酸で骨格が修飾された二本鎖RNAもまた、マーカーの25bpのバンドの位置に移動する(図3B、dsRNA産物+2-F-dGMP)。
比較例15(修飾されていないdsRNA産物)、実施例1(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP)および実施例13(dsRNA産物+2-F-dGMP)の反応混合物の産物を、二本鎖RNAインターカレート剤(SYBR Green I)と共にインキュベートし、二本鎖RNA産物の融解曲線を、LightCycler機器(Roche Diagnostics)を使用して測定した。骨格が修飾されたRNA(dsRNA産物+2-O-CH3-CMPおよびdsRNA産物+2-F-dGMP、示されるとおり)および修飾されていないRNA(dsRNA産物、示されるとおり)は、図3中に示されるような種々の融点を示す。これらの異なる融解曲線は、RNA骨格中の修飾されたヌクレオチドの組み込みの結果得られる。重要なことに、一本鎖RNAテンプレートは融解曲線を示さず、一本鎖であり、したがってSYBR Green Iに結合できない。修飾されていない比較dsRNAに対する、骨格が修飾されたdsRNA産物の融点におけるシフトにより、修飾されたヌクレオチドをRdRpがdsRNA中に実際に組み込んだことが実証された。
2'-O-CH3-CTPを使用した酵素的合成の反応混合物の産物(dsRNA産物+2-O-CH3-CMP;実施例1)をHPLCによって分析し、引き続いて二本鎖RNAを変性させることにより、センス(テンプレートssRNA)鎖およびアンチセンス(相補的ssRNA)鎖を溶出させた。センス(テンプレートssRNA、分子量7564.41)およびアンチセンス(テンプレートssRNAに対して相補的な合成された一本鎖RNA、分子量8080.73)の質量を、ESI/MSによって測定した。これらは、テンプレートssRNAの予測された質量およびアンチセンス鎖における2'-O-CH3-CMPの組み込みに、正確に対応することが見出された(図5Bおよび5C)。
ssRX21 順向:GCUGAUGCCGUCAAGUUUACCCCC(配列番号7)
ssRX21 逆向:5-P3-GGGGGUAAACUUGACGGCAUCAGC(配列番号8)
Claims (20)
- 化学的に修飾されたRNAを酵素的に合成するための方法であって、
(a)ssRNAテンプレートを提供するステップと、
(b)リボース、リン酸および/または塩基部分に化学的修飾を有する少なくとも1つのリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、RNA合成に十分な条件下で、ssRNAテンプレートを、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性を有するタンパク質と相互作用させて、化学的に修飾された二本鎖RNA(dsRNA)を提供するステップであって、前記化学的修飾の結果、前記dsRNAの検出に使用される放射性、蛍光および/または化学標識でdsRNAが標識されないステップと
を含む方法。 - (c)dsRNAをssRNAへと分離するステップ
をさらに含み、
任意選択で、以下のステップ(d)から(f)、
(d)ステップ(b)および(c)をn回反復し、nが少なくとも1の整数であるステップと、
(e)最終ステップ(b)を実施するステップと、
(f)反応を停止させるステップと
を実施することをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - nが15から40の整数である、請求項2に記載の方法。
- ステップ(c)が、熱変性、化学変性または酵素によって実施される、請求項2または3に記載の方法。
- dsRNAが、ヘリカーゼによってssRNAへと分離される、請求項4に記載の方法。
- RdRp活性を有するタンパク質が「右巻き配座」を有し、前記タンパク質のアミノ酸配列が、
a.XXDYS
b.GXPSG
c.YGDD
d.XXYGL
e.XXXXFLXRXX
の配列モチーフを含み、
D:アスパラギン酸
Y:チロシン
S:セリン
G:グリシン
P:プロリン
L:ロイシン
F:フェニルアラニン
R:アルギニン
X:任意のアミノ酸
の意味を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。 - タンパク質が、カリシウイルス科のウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼである、請求項6に記載の方法。
- タンパク質が、ノロウイルス、サポウイルス、ベシウイルスまたはラゴウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼである、請求項7に記載の方法。
- タンパク質が、ノロウイルス株HuCV/NL/Dresden174/1997/GE(GenBankアクセッション番号AY741811)のRNA依存性RNAポリメラーゼ、サポウイルス株pJG-Sap01(GenBankアクセッション番号AY694184)のRNA依存性RNAポリメラーゼ、およびベシウイルス株FCV/Dresden/2006/GE(GenBankアクセッション番号DQ424892)のRNA依存性RNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- タンパク質が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項8に記載の方法。
- ssRNAテンプレートが、15から30ヌクレオチド、好ましくは21から28ヌクレオチド、より好ましくは21から23ヌクレオチドの長さを有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 化学的に修飾されたdsRNAが、修飾されていないアナログと比較して安定性が増加している、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのリボヌクレオシド三リン酸が、リボース部分に化学的修飾を有する、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- リボース部分の2'-OH基が、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはCNから選択される基により置換され、RがC1〜C6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロがF、Cl、BrまたはIである、請求項13に記載の方法。
- 少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸が、2'-O-メチル-シチジン-5'-三リン酸、2'-アミノ-2'-デオキシ-ウリジン、2'-アジド-2'-デオキシ-ウリジン-5'-三リン酸、2'-フルオロ-2'-デオキシ-グアノシン-5'-三リン酸および2'-O-メチル-5-メチル-ウリジン-5'-三リン酸からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸が、塩基部分に化学的修飾を有する、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸が、5-アミノアリル-ウリジン-5'-三リン酸、6-アザ-ウリジン-5'-三リン酸、8-アザ-アデノシン-5'-三リン酸、5-ブロモ-ウリジン-5'-三リン酸、7-デアザ-アデノシン-5'-三リン酸、7-デアザ-グアノシン-5'-三リン酸、N6-メチル-アデノシン-5'-三リン酸、5-メチル-シチジン-5'-三リン酸、シュード-ウリジン-5'-三リン酸および4-チオ-ウリジン-5'-三リン酸からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオチドが、リン酸部分に化学的修飾を有する、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸がホスホチオエートアナログである、請求項18に記載の方法。
- RdRp活性、好ましくはカリシウイルス科のウイルスのRdRp活性を有するタンパク質と、
RdRp活性を有するタンパク質によるRNA合成に十分な条件を提供するための緩衝液と、
rATP、rGTP、rCTP、rUTPと、
リボース、リン酸および/または塩基部分に化学的修飾を有する少なくとも1つのリボヌクレオシド三リン酸であって、前記化学的修飾が、放射性、蛍光及び化学検出のための標識をもたらさないリボヌクレオシド三リン酸と、
任意選択で停止溶液と、
任意選択でヘリカーゼと
を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
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