JP2011518553A

JP2011518553A - Capture agents and associated methods and systems for detecting and / or classifying targets

Info

Publication number: JP2011518553A
Application number: JP2011504182A
Authority: JP
Inventors: ウォン，ガブリエル，エー; ラデュ，カイウス，ジー; リバス，アントニ; ウィット，オーウェン; ヒース，ジェイムズ，アール
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2011-06-30
Also published as: CA2721085A1; AU2009234162A1; WO2009126828A2; WO2009126828A3; CN102112626A; EP2274443A4; EP2274443A2

Abstract

標的検出するポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および、とくに標的結合成分、骨格成分および制御された方法でカップリングおよび分離できる標準化したモジュール化単位によって形成したエンコード成分を有するモジュール式ポリヌクレオチド捕捉剤は、および関連する方法およびシステム。
【選択図】図１Polynucleotide-encoded capture agents for target detection and in particular modular polynucleotide capture agents having an encoding component formed by a target-binding component, a backbone component and a standardized modular unit that can be coupled and separated in a controlled manner, and related Method and system.
[Selection] Figure 1

Description

（関連出願に対する相互参照）
本明細書は、２００８年４月９日に提出された整理番号ＣＩＴ−５１２７−Ｐの米国特許仮出願第６１１１２３４７８号明細書「遺伝子およびタンパク質の多重細胞分類および検出に関する統一されたプラットフォーム」に対する優先権を主張し、全体に参照することにより組み込まれる。本明細書はまた、２００７年８月１日に提出された整理番号Ｐ０１７−ＵＳの米国特許第１１８８８５０２号明細書「標的を検出および／または分類する方法およびシステム」の一部継続出願であり、それは、２００６年８月２日に提出された整理番号ＣＩＴ−４７０７の米国特許仮出願第６０１８３４８２３号明細書「遺伝子およびタンパク質の多重細胞分類に関する統一されたプラットフォーム」および２００７年７月１６日に提出された整理番号ＣＩＴ−４９４４の米国特許仮出願第６１０９５９６６５号明細書「デジタル対応：定量的およびデジタルタンパク質検出免疫測定」に対する優先権を主張し全体に参照することにより組み込まれる。本明細書はまた、２００８年７月１６日に提出された整理番号Ｐ２３５−ＵＳの米国特許第１２１１７４５９８号明細書「標的分子を検出するマイクロ流体装置、方法およびシステム」および２００８年７月１６日に提出された整理番号Ｐ２６２−ＵＳの米国特許第１２１１７４６０１号明細書「標的分子を検出するアレイ、基質、装置、方法およびシステム」に関連し、共に全体に参照することにより組み込む。 (Cross-reference to related applications)
This specification is prioritized over US Provisional Application No. 611233478 entitled “Unified Platform for Multiple Cell Classification and Detection of Genes and Proteins” filed Apr. 9, 2008, with serial number CIT-5127-P. Claimed and incorporated by reference throughout. This specification is also a continuation-in-part of U.S. Pat. No. 11,888,502 “Method and System for Detecting and / or Classifying Targets” filed Aug. 1, 2007, with serial number P017-US, It is filed on Aug. 2, 2006, US Patent Provisional Application No. 601834823, filed August 2, 2006, “Unified Platform for Multiple Cell Sorting of Genes and Proteins” and Jul. 16, 2007. US Patent Provisional Application No. 610959665, serial number CIT-4944, incorporated herein by reference in its entirety and claiming priority over "digital correspondence: quantitative and digital protein detection immunoassays". This specification also describes U.S. Patent No. 121174598 entitled "Microfluidic Device, Method and System for Detecting Target Molecules", filed July 16, 2008, and reference number P235-US, July 16, 2008. US Pat. No. 12,174,601 entitled “Arrays, Substrates, Apparatuses, Methods and Systems for Detecting Target Molecules”, filed with reference number P262-US, both incorporated by reference in their entirety.

（政府の許可）
アメリカ合衆国政府は、国立衛生研究所によって認められた付与番号ＣＡ１１９３４７号に従って本発明における区別の権利を有する。 (Government permission)
The Government of the United States of America has the right of distinction in the present invention in accordance with grant number CA119347 granted by the National Institutes of Health.

本発明は、生体サンプル等のサンプルにおける１個またはそれ以上の標的、とくにバイオマーカーの検出および／または分類に関連する。より詳細には、標的を検出および／または分類する捕捉剤および関連する方法およびシステムに関連する。 The present invention relates to the detection and / or classification of one or more targets, particularly biomarkers, in a sample such as a biological sample. More particularly, it relates to capture agents and related methods and systems for detecting and / or classifying targets.

標的およびとくにバイオマーカーの高感度検出は、生物学的分子分析の分野において、とくに複数の標的の検出および／または区別の大きさもしくは低濃度でサンプルにおいて存在する標的の検出を目指していたとき、挑戦されていた。病理学検査に対しても基礎生物学研究に対しても、いくつかの方法は様々な種類の生体材料および生体分子の検出に一般的に使われている。 Sensitive detection of targets and especially biomarkers was aimed in the field of biological molecular analysis, especially when detecting multiple targets and / or targets present in a sample at a discriminating magnitude or low concentration, It was a challenge. Several methods are commonly used for the detection of various types of biomaterials and biomolecules, both for pathological examinations and for basic biological research.

一つの生物学的標的の検出に対する研究室において最も一般的に用いられる技術には、ゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロット、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）がある。これらの方法は、組織等の生物学的サンプルにおける１個またはそれ以上のバイオマーカーを検出できる能力を提供し、また、診断目的にも適切である。 The most commonly used techniques in the laboratory for the detection of a single biological target include gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), Western blot, fluorescence in situ hybridization (FISH), and fluorescence activation. There are cell sorting (FACS), polymerase chain reaction (PCR), and enzyme immunoassay (ELISA). These methods provide the ability to detect one or more biomarkers in a biological sample such as tissue and are also suitable for diagnostic purposes.

本発明によって開発したそれに続くポリヌクレオチドのコード化の手法は、それまでの技術を改良し、とくに、高感度および高選択性の標的の多重検出を可能にする。 Subsequent polynucleotide encoding techniques developed by the present invention improve upon the prior art and, in particular, allow for multiplex detection of highly sensitive and highly selective targets.

ここに示すのは、いくつかの実施形態において、柔軟で多目的なモジュール式分子ツールを用いて莫大な量の標的の選択的および感度の高い検出を可能にする、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびとくに分子捕捉剤および関連するアレイ法およびシステムである。 Shown herein are polynucleotide encoded capture agents and particularly molecules that, in some embodiments, allow selective and sensitive detection of vast amounts of targets using a flexible and versatile modular molecular tool. Capture agents and associated array methods and systems.

とくに、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、制御された方法で結合および分離できる標準化した分子単位によって形成した、標的結合部位、骨格部位およびエンコード部位を有する。したがって、ここで説明する分子捕捉剤において、同じ骨格が異なり標的結合構造と結合するだけでなく、同じ骨格は複数の標的結合構造と結合し、これによって、捕捉剤による検出、感度、選択性の達成を大きく改良する。 In particular, the modular polynucleotide encoded capture agent described herein has a target binding site, a backbone site, and an encoding site formed by standardized molecular units that can be bound and separated in a controlled manner. Thus, in the molecular capture agents described here, not only do the same scaffolds bind differently to the target binding structure, but the same scaffold binds to multiple target binding structures, thereby increasing the detection, sensitivity, and selectivity of the capture agent. Greatly improve achievement.

第１態様に従って、標的への特異結合用に設定したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を説明する。モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、標的に特異的に結合するようにした少なくとも１個の結合分子、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにしたエンコードポリヌクレオチド、位置的に区別できる骨格結合ドメインを有する少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着させるようにした骨格分子を有する。骨格分子において、位置的に区別できる骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にする。 In accordance with a first aspect, a modular polynucleotide encoded capture agent configured for specific binding to a target is described. A modular polynucleotide-encoded capture agent comprises at least one binding molecule that is specifically bound to a target, an encoded polynucleotide that is specifically bound to a substrate polynucleotide attached to the substrate, and a positional distinction Having at least one binding molecule having a backbone binding domain capable and a backbone molecule adapted to be attached to the encoding polynucleotide. In the scaffold molecule, a positionally distinguishable scaffold binding domain is specific for at least one binding molecule and substrate polynucleotide that specifically binds to a target when bound to at least one binding molecule and the encoding polynucleotide. Allows the presence of the encoding polynucleotide to bind.

第２態様に従って、サンプルにおける標的を検出する方法およびシステムを開示し、基質に付着した基質ポリヌクレオチド、およびモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を組み合わせて用いる方法およびシステムは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドで結合する骨格分子を有する。モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、少なくとも１個の結合分子は、標的に特異的に血符合するようにし、エンコードポリヌクレオチドは、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにする。 According to a second aspect, a method and system for detecting a target in a sample is disclosed, wherein the method and system using a combination of a substrate polynucleotide attached to a substrate and a modular polynucleotide-encoded capture agent comprises at least one binding molecule and It has a backbone molecule that binds with an encoded polynucleotide. In the modular polynucleotide encoded capture agent, at least one binding molecule is allowed to specifically bind to the target, and the encoded polynucleotide is allowed to specifically bind to the substrate polynucleotide attached to the substrate.

この方法において、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／または前記モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を有する単位、サンプルおよび基質ポリヌクレオチドは、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体における標的に少なくとも１個の結合分子が結合でき、また、基質ポリヌクレオチドにエンコードヌクレオチドが結合できるようにする時間および条件下で接触し、これによって、基質ポリヌクレオチドに結合したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を提供する。この方法において、基質ポリヌクレオチドに結合したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体は、その後、本明細書を読むときに当業者によって特定できる検出技術方法によって検出する。 In this method, the modular polynucleotide-encoded capture agent and / or the unit, sample, and substrate polynucleotide having the modular polynucleotide-encoded capture agent are at least one target in the modular polynucleotide-encoded capture agent-target complex. Of the binding molecule and contact the substrate polynucleotide for a time and under conditions that allow the encoded nucleotide to bind, thereby binding the modular polynucleotide encoded capture agent-target complex bound to the substrate polynucleotide. provide. In this method, the modular polynucleotide-encoded capture agent-target complex bound to the substrate polynucleotide is then detected by detection technique methods that can be identified by those skilled in the art when reading this specification.

このシステムにおいて、基質に付着した基質ポリヌクレオチドを有する基質は、標的に特異的に結合するようにした少なくとも１個の結合分子、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチド、および少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを位置的に区別できる骨格結合ドメインに付着するようにした骨格分子と共に提供する。骨格分子において、位置的に区別できる骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にする。 In this system, a substrate having a substrate polynucleotide attached to a substrate comprises at least one binding molecule adapted to specifically bind to a target, an encoded polynucleotide that specifically binds to a substrate polynucleotide attached to the substrate, And at least one binding molecule and encoding polynucleotide together with a backbone molecule adapted to be attached to a positionally distinguishable backbone binding domain. In the scaffold molecule, a positionally distinguishable scaffold binding domain is specific for at least one binding molecule and substrate polynucleotide that specifically binds to a target when bound to at least one binding molecule and the encoding polynucleotide. Allows the presence of the encoding polynucleotide to bind.

第３態様に従って、複数の標的の標的を分類する方法およびシステムを開示し、この方法およびシステムは、基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドおよび複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を組み合わせて用いる。いくつかの実施形態において、標的は細胞であり、この方法およびシステムは複数の細胞を分類するものである。 According to a third aspect, a method and system for classifying a target of a plurality of targets is disclosed, the method and system using a combination of a plurality of substrate polynucleotides attached to a substrate and a plurality of modular polynucleotide encoded capture agents. In some embodiments, the target is a cell, and the method and system classifies a plurality of cells.

この方法およびシステムにおいて、各基質ポリヌクレオチドは、配列特異的であり他のものと位置的に区別できる。この方法およびシステムにおいて、各モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、複数の標的の補助的な標的に特異的に結合するようにした少なくとも１個の結合分子と、複数の基質ポリヌクレオチドのうちの基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにしたエンコードポリヌクレオチド、および少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを位置的に区別可能な骨格結合ドメインに結合させるようにした骨格分子とを有し、位置的に区別可能な骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にするように骨格分子上に準備する。 In this method and system, each substrate polynucleotide is sequence specific and positionally distinguishable from the others. In this method and system, each modular polynucleotide-encoded capture agent comprises at least one binding molecule adapted to specifically bind to an auxiliary target of a plurality of targets and a substrate of the plurality of substrate polynucleotides. An encoding polynucleotide adapted to specifically bind to the polynucleotide, and a scaffold molecule adapted to bind at least one binding molecule and the encoded polynucleotide to a positionally distinguishable scaffold binding domain; The distinguishable scaffold binding domain is an encoded poly that specifically binds to at least one binding molecule and substrate polynucleotide that specifically binds to a target when bound to at least one binding molecule and the encoded polynucleotide. Backbone components to allow for the presence of nucleotides To prepare the above.

この方法において、複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／または前記複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を形成する単位は、標的に少なくとも１個の結合分子が結合できるようにする時間および条件下でサンプルに接触し、これによって、複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を提供する。この方法において、複数のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体は、その後、エンコードポリヌクレオチドが基質に付着した基質ポリヌクレオチドに結合できるような時間および条件下で複数の基質ポリヌクレオチドに接触し、これによって、基質に結合した複数のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体において複数の標的を分類する。 In this method, the plurality of modular polynucleotide encoded capture agents and / or the units forming the plurality of modular polynucleotide encoded capture agents are in a time and under conditions that allow at least one binding molecule to bind to the target. In contact with the sample, thereby providing a plurality of modular polynucleotide-encoded capture agent-target complexes. In this method, the plurality of polynucleotide-encoded capture agent-target complexes are then contacted with the plurality of substrate polynucleotides for a time and under conditions such that the encoded polynucleotide can bind to the substrate polynucleotide attached to the substrate. Classify multiple targets in multiple polynucleotide-encoded capture agent-target complexes bound to a substrate.

このシステムにおいて、基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドを有する基質は、複数の結合分子と、各結合分子は複数の標的の補助的な標的に特異的に結合し、複数のエンコードポリヌクレオチドと、各エンコードポリヌクレオチドは、基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドに特異的に結合し、複数の結合分子の各結合分子および複数のエンコードポリヌクレオチドの各エンコードポリヌクレオチドを位置的に区別可能な骨格結合ドメインに結合するようにした少なくとも１個の骨格分子とを有し、位置的に区別可能な骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にするように骨格分子上に準備する。 In this system, a substrate having a plurality of substrate polynucleotides attached to a substrate includes a plurality of binding molecules, each binding molecule specifically binding to an auxiliary target of a plurality of targets, and a plurality of encoding polynucleotides; Each encoding polynucleotide specifically binds to each polynucleotide of the plurality of substrate polynucleotides attached to the substrate, and positionally distinguishes each binding molecule of the plurality of binding molecules and each encoding polynucleotide of the plurality of encoding polynucleotides. At least one scaffold molecule adapted to bind to a possible scaffold binding domain, wherein the positionally distinguishable scaffold binding domain is targeted to the target when bound to at least one binding molecule and the encoding polynucleotide. Specific to at least one binding molecule and substrate polynucleotide that specifically bind It is prepared on the scaffold molecule to allow the presence of the encoding polynucleotides binds.

第４態様に従って、骨格分子を説明し、骨格分子は、少なくとも１個の結合分子に付着するようにした第１骨格結合ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドに付着するようにした第２骨格結合ドメインを有し、少なくとも１個の結合分子は、標的に特異的に結合するようにし、エンコードポリヌクレオチドは、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにした。骨格分子において、第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、位置的に区別でき、少なくとも１個の結合分子を第１結合ドメインに、およびエンコードポリヌクレオチドを第２結合ドメインに結合させるとき、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの相互作用を最小化するように骨格分子において準備する。 According to a fourth aspect, a backbone molecule is described, the backbone molecule having a first backbone binding domain adapted to be attached to at least one binding molecule and a second backbone binding domain adapted to be attached to an encoding polynucleotide. At least one binding molecule was allowed to specifically bind to the target, and the encoded polynucleotide was allowed to specifically bind to the substrate polynucleotide attached to the substrate. In the scaffold molecule, the first scaffold binding domain and the second scaffold binding domain are positionally distinguishable, and when binding at least one binding molecule to the first binding domain and the encoded polynucleotide to the second binding domain, Provision is made in the backbone molecule to minimize the interaction of at least one binding molecule and the encoding polynucleotide.

第５態様に従って、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を説明する。ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、標的に特異的に結合する結合分子および結合分子に付着したエンコードポリヌクレオチドから成る。エンコードポリヌクレオチドは、基質ポリヌクレオチドに特異的に結合する配列から成る。基質ヌクレオチドは、基質に付着し、また、エンコードポリヌクレオチドに特異的に結合する配列から成る。ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、エンコードポリヌクレオチドは、関連する制限酵素によって開裂するために存在するエンコードポリヌクレオチドにおいて準備した少なくとも１個の制限酵素部位を有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤とする。 According to a fifth aspect, a polynucleotide encoded capture agent will be described. A polynucleotide-encoded capture agent consists of a binding molecule that specifically binds to a target and an encoded polynucleotide attached to the binding molecule. The encoding polynucleotide consists of a sequence that specifically binds to the substrate polynucleotide. The substrate nucleotide consists of a sequence that is attached to the substrate and that specifically binds to the encoding polynucleotide. In a polynucleotide encoded capture agent, the encoded polynucleotide has at least one restriction enzyme site prepared in the encoded polynucleotide that is present for cleavage by the associated restriction enzyme. In some embodiments, the polynucleotide encoded capture agent is a modular polynucleotide encoded capture agent as described herein.

第６態様に従って、ここで説明する各方法、システムおよびアレイの基質は、液体を運搬するマイクロ流体の特性を有するマイクロ流体要素に関連して操作可能であり、ここで説明する方法において、少なくともエンコードポリヌクレオチドを基質ポリヌクレオチドへの接触は、マイクロ流体特性によって運搬した液体において起こる。加えて、ここで説明する各システムはさらに、マイクロ流体特性を有するマイクロ流体要素を有する。 In accordance with the sixth aspect, the substrate of each method, system, and array described herein is operable in connection with a microfluidic element having the characteristics of a microfluidic carrying a liquid, and in the method described herein, at least encoding Contact of the polynucleotide to the substrate polynucleotide occurs in the liquid carried by the microfluidic properties. In addition, each system described herein further includes a microfluidic element having microfluidic properties.

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ方法およびシステムにおいて、標的結合構造は、骨格構造から切り離し、これによって、関連する当該技術の装置と比較して仕様の柔軟性および多様性を改良することができる。 In modular polynucleotide-encoded capture agents, and related array methods and systems described herein, the target binding structure is decoupled from the backbone structure, thereby allowing specification flexibility and variety compared to related art devices. Can be improved.

加えて、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、１個のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤へ複数の結合分子、とくにタンパク質を付着させ、それぞれ同じ標的に結合するようにできる。したがって、その結果できたモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の感度および／選択性は、制御、とくに改良される。 In addition, modular polynucleotide encoded capture agents, and related array methods and systems described herein, in some embodiments, attach multiple binding molecules, particularly proteins, to a single polynucleotide encoded capture agent. , Each can bind to the same target. Thus, the sensitivity and / or selectivity of the resulting modular polynucleotide encoded capture agent is controlled, particularly improved.

とくに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、当該技術の特定の方法およびシステムと比較すると、標的検出の選択性および感度を改良することができる。 In particular, modular polynucleotide-encoded capture agents, and related arrays, methods and systems described herein, in some embodiments, target detection selectivity and sensitivity as compared to certain methods and systems of the art. Can be improved.

より特別には、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、低親和性の配位子が存在する細胞等の標的、および配位子が複合混合物から０．１％未満の非常に低い存在度で存在する細胞用の標的を検出および／または分類することができる。 More specifically, modular polynucleotide-encoded capture agents, and related arrays, methods and systems described herein, in some embodiments, are targets such as cells in which a low affinity ligand is present, and Targets for cells where the ligand is present in the complex mixture at a very low abundance of less than 0.1% can be detected and / or classified.

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムはまた、いくつかの実施形態において、抗体を必ずしも含まない強固なプラットフォームを用いて標的検出を行うことができる。 Modular polynucleotide-encoded capture agents and related arrays, methods and systems described herein can also perform target detection using a robust platform that does not necessarily include antibodies in some embodiments.

とくに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、高効率での標的の検出および／または分類に関する強固およびモジュール式のアレイを生成することができ、それらの安定性の点で、標的捕捉する表面結合タンパク質を用いる文献のアプローチより顕著に効率を良くするこができる。 In particular, modular polynucleotide-encoded capture agents, and related arrays, methods and systems described herein, in some embodiments, provide robust and modular arrays for highly efficient target detection and / or classification. Can be generated, and in terms of their stability, can be significantly more efficient than literature approaches that use surface-binding proteins to capture targets.

さらに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体の選択的な放出ができ、したがって、検出したおよび／または分類した標的、とくに標的細胞上で多数の生物分析方法の展開を可能にする。 Furthermore, modular polynucleotide encoded capture agents, and related arrays, methods and systems described herein, in some embodiments, can selectively release polynucleotide encoded capture agent-target complexes, and thus Allows the development of numerous bioanalytical methods on detected and / or classified targets, particularly target cells.

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、標的を検出および／または分類するように設計したいくつかのアッセイの実行に関連して使用し、それらには、限定することはないが、ゲノムおよびプロテオームアッセイ、および当業者により特定できる他のアッセイ等のモノパラメータおよびマルチパラメータアッセイがある。とくに、ここで説明したプラットフォームのモジュール方式によって、免疫組織化学、ＦＩＳＨ、および本明細書を読む当業者によって特定できるさらなるアッセイ等の、ガラス基質上で通常行う標準化したアッセイの捕捉した標的（およびとくに捕捉した細胞）上で行うことができる。 Modular polynucleotide encoded capture agents, and related arrays, methods and systems described herein, are used in connection with the performance of several assays designed to detect and / or classify targets. There are mono- and multi-parameter assays such as, but not limited to, genomic and proteomic assays, and other assays that can be identified by those skilled in the art. In particular, the modularity of the platform described here allows the captured target (and especially the standardized assay performed on a glass substrate (and in particular) such as immunohistochemistry, FISH, and additional assays that can be identified by those skilled in the art to read this specification. Captured cells).

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、限定することはないが、分子診断、分子治療研究、組織工学、および生体材料等の様々な分野において用いることができる。 Modular polynucleotide-encoded capture agents and related arrays, methods and systems described herein may be used in various fields such as, but not limited to, molecular diagnostics, molecular therapy research, tissue engineering, and biomaterials Can do.

本発明の１個またはそれ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および説明および以下の説明において示す。他の特性、目的、および利点は、説明、実施例および図面から、および請求項から明らかである。 The details of one or more embodiments of the invention are set forth in the accompanying drawings and the description and the description below. Other features, objects, and advantages will be apparent from the description, examples and drawings, and from the claims.

本明細書の一部に組み込み構成する添付の図面は、本発明の１個またはそれ以上の実施形態を、詳細な説明および実施例とともに示し、本発明の主旨および実施を説明する。
ここで説明する実施形態に従った、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の略図である。ここで説明する実施形態に従った、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の略図である。ここで説明する実施形態に従った、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の略図である。ここで説明する実施形態に従った、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の略図である。ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて行った細胞分類実験の結果を示す。パネルＡは、Ｔ細胞と接触したチロシナーゼＴＣＲに特異的なｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。この画像は、ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体のエンコードポリヌクレオチドに相補的な基質ＤＮＡが付着した基質上のＴ細胞の検出および細胞分類を示す。パネルＢは、互いに結合的に区別可能なｓｓＤＮＡをそれぞれエンコードした２個のセットのｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体を用いた細胞分類を示す。矢印は、標的Ｔ細胞に接触後の各セットの結合を示す。ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて行った細胞分類実験の結果を示す。パネルＡは、相補的基質ポリヌクレオチドおよびＴ細胞に示したように異なる頻度で接触したチロシナーゼＴＣＲに特異的なｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＢは、パネルＡにおいて示したデータの定量化を示すダイアグラムを示す。ここで説明する実施形態に従った骨格（パネルＡ）および関連する最適な骨格（パネルＢ）の代表的な構造を示す。ここで説明する実施形態に従った最適化したポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合能力を実証する実験の結果を示す。とくに、パネルＡは、発現、リフォールディング、および精製の様々な段階で検出したＳＡＣタンパク質に対するＰＡＧＥゲルの変性を示す。ＳＡＣモノマーの分子量は〜１２ｋＤａである。パネルＢは、ｓｓＤＮＡ−ＳＡＣ複合体の形成を検証するために実行したゲル移動度シフトアッセイである。パネルＣは、分子２−（４´−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸（ＨＡＢＡ）を用いてビオチンのＳＡに対するモル比を画定する式を示す。ここで説明する実施形態に従ったポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の捕捉能力を実証する実験の結果を示す。とくに、パネルＡは、ヒトＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（左）およびマウスＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞（右）に特異的なストレプトアビジン骨格およびｐ／ＭＨＣ結合タンパク質等のｓｓＤＮＡエンコードタンパク質のアレイのグレースケールの明視野像を示す。パネルＡの各サブパネルは、示したようにｓｓＤＮＡエンコードタンパク質を相補的基質ＤＮＡおよび特異的な細胞に接触後のアレイの明視野像を示す。パネルＢは、ヒトＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（左）およびマウスＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞（右）（上野パネルと同じ細胞）に特異的な最適化したストレプトアビジン骨格およびｐ／ＭＨＣ結合タンパク質等のｓｓＤＮＡエンコードタンパク質のアレイのグレースケールの明視野像を示す。パネルＢの各サブパネルは、示したようにＳＡＣ−ｓｓＤＮＡｐ／ＭＨＣを相補的基質ＤＮＡおよび特異的な細胞に接触後のアレイの明視野像を示す。従来のタンパク質アレイおよびここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で実行した標的捕捉の比較を示す。パネルＡは、示したような様々なモデル基質上の従来の直接的なｐ／ＭＨＣタンパク質スポッティング戦略と比較して最適化したＳＡ骨格等をさらに含むポリヌクレオチドエンコードタンパク質において存在するｐ／ＭＨＣのアレイのグレースケールの明視野像を示す。パネルＢは、パネルＡにおいて示したデータの定量化を示すダイアグラムである。各データポイントは、３個の別々のスポットから導いた。従来のタンパク質アレイおよびここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で実行した標的捕捉の比較を示す。パネルＡは、ＳＡＣ骨格等をさらに含むｓｓＤＮＡ−エンコードエンコードタンパク質において存在するｐ／ＭＨＣタンパク質のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＢは、ｐ／ＭＨＣタンパク質のみでスポットした誘導体化表面のグレースケールの蛍光画像を示す。各矢印は、異なるスライド上で実行した別々の実験を示す。ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて行った細胞分類実験の結果を示す。パネルＡは、ポリヌクレオチドＡに相補的なｓｓ−ＤＮＡでエンコードしたｐ／ＭＨＣ四量体およびＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞によって提供された標的に接触後の、３個の異なる基質ポリヌクレオチド（Ａ，ＢおよびＣ）のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＢは、ポリヌクレオチドＡに相補的なｓｓ−ＤＮＡでエンコードしたＭａｒｔ−１−特異ＴＣＲに特異的なｐ／ＭＨＣ四量体、ポリヌクレオチドＢに相補的なｓｓ−ＤＮＡでエンコードしたＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ−特異ＴＣＲに特異的なｐ／ＭＨＣ四量体および親油性色素で予め染色したＪｕｒｋｅｔ^{ａ−ＭＡＲＴ−１}Ｊｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞の混合によって提供された標的に接触後の、異なる基質ポリヌクレオチド（Ａ，ＢおよびＣ）のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＣは、示したように異なる希釈（５０％，１０％，１％，０．１％）でＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}に接触後のＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ−特異ＴＣＲに特異的なポリヌクレオチドエンコードタンパク質のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＤは、パネルＣにおいて示したデータの定量化を示すダイアグラムである。ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて行った人工細胞の検出を示す。パネルＡは、Ｆ５ＭＡＲＴ−１ＴＣＲでＰＭＢＣ細胞を形質導入する実験アプローチの概略図およびフローサイトメトリ−によって画定した導入効率を示す関連するダイアグラムを示す。パネルＢは、それぞれＡおよびＢにエンコードした類似の捕捉タンパク質（ＭＡＲＴ−１_{２６−３５}／ＨＬＡ−Ａ２．１）および対照の捕捉タンパク質（ＣＭＶｐｐ６５_{４９５−５０３}／ＨＬＡ−Ａ２．１）を含むマイクロアレイ上で分類した形質導入したＰＢＭＣのグレースケールの明視野像を示す。パネルＣは、共焦点および明視野像の重ね合わせをしめし、パネルＢにおいて示した細胞捕捉が特異であることを検証する（ＭＡＲＴ−１細胞は明るいグレーで示した）。ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の特異性および選択性の検出を示すダイアグラムである。パネルＡは、フローサイトメトリ−によって画定したように、ＥＢＶＢＭＬＦ１_{２５９−２６７}に特異なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の量および特異性を示すダイアグラムである。パネルＢは、フローサイトメトリ−によって画定したように、ＣＭＶｐｐ６５_{４９５−５０３}に特異なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の量および特異性を示すダイアグラムである。ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いた内因性初代細胞の検出を示す。パネルＡは、図１３のＥＢＶ−ＢＭＬＦ−１に特異的なＣＤ８＋細胞に接触した後の、示したポリヌクレオチドエンコードｐ／ＭＨＣ捕捉タンパク質ＥＢＶＢＭＬＦ１_{２５９−２６７}／ＨＬＡ−Ａ２．１およびＣＭＶｐｐ６５_{４９５−５０３}／ＨＬＡ−Ａ２．１等のアレイの画像を示す（患者ＮＲＡ１３）。左側のパネルは、ＣＭＶ−ｐｐ６５ではなくＥＢＶ−ＢＭＬＦ−１（それぞれ図１３におけるフローサイトメトリ−によって検証した）特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を含む患者ＮＲＡ１３の接触および捕捉後の、ｐ／ＭＨＣ捕捉タンパク質ＥＢＶＢＭＬＦ１_{２５９−２６７}／ＨＬＡ−Ａ２．１およびＣＭＶｐｐ６５_{４９５−５０３}／ＨＬＡ−Ａ２．１で（それぞれＡおよびＢｃＤＮＡへ）局在化したアレイを示す。右側の２個のパネルは、蛍光ＥＢＶＢＭＬＦ１_{２５９−２６７}／ＨＬＡ−Ａ２．１（青、白色矢印で図に示す）およびＣＭＶｐｐ６５_{４９５−５０３}／ＨＬＡ−Ａ２．１（赤、黒色矢印でグレースケールの図に示す）での細胞染色後の、アレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＢは、図１３において示したＥＢＶ−ＢＭＬＦ−１（患者ＮＲＡ１３）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＭＶ−ｐｐ６５（患者ＮＲＡ１１）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１の混合物に接触後の、示したようなＥＢＶまたはＣＭＶに特異的なｓｓ−ＤＮＡ−ＳＡＣ−ｐ／ＭＨＣのアレイの画像を示す。左側のパネルは、スポットＡおよびＢ上に局在化したＴ細胞での細胞捕捉後すぐの明視野像を示す。右側の２個のパネルは、蛍光ＥＢＶ（青、白色矢印で図に示す）およびＣＭＶｐ／ＭＨＣ四量体（赤、黒色矢印でグレースケールの図に示す）での細胞染色後の、アレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＣは、フローサイトメトリによって画定した、０．４％未満、０．２％および０．１％のヒトＥＢＶ特異性Ｔ細胞集団の混合物の量および特異性を示すダイアグラムである。パネルＤは、パネルＣの混合物に接触後のＥＢＶに特異的なモジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。ＥＢＶ特異Ｔ細胞集団は、明るいグレーの矢印で示し、非特異性の細胞は黒色の矢印で示す。ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて捕捉した制御放出を示す。パネルＡは、実験アプローチの略図を示す。パネルＢは、（ｉ）ｐ／ＭＨＣアレイ上で捕捉した（ｉｉ）ＢａｍＨＩで処理後（ｉｉｉ）ＥｃｏＲＩで処理後および（ｉｖ）ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで処理後のＪｕｒｋｅｔ^{ａ−ＭＡＲＴ−１}（グレースケールで暗いグレーで示した赤）およびＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}（グレースケールで明るいグレーで示した緑）のグレースケールの蛍光画像である。フローサイトメトリの染色試薬として利用できＤＮＡハイブリダイゼーションによる縣濁液から抗原特異性Ｔ細胞を局在化できる蛍光標識したｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体を示す。パネルａにおいて、Ｃｙ３−標識Ａ´−ＳＡＣ複合体は、蛍光チロシナーゼ３６８−３７６ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体を生成するために使用し、また、フローサイトメトリによってＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞を検出するために使用した。同様の染色プロファイルはｍＣｙ３ＮＡＣＳｐ／ＭＨＣ四量体（下のパネル）および従来のチロシナーゼ３６８−３７６（ＰＥ）ｐ／ＭＨＣ四量体（上のパネル）の間に観察された。パネルｂにおいて、Ｊｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞を、ＤＮＡアレイに露呈する前に３６８−３７６−Ａ´ｐ／ＭＨＣ四量体で染色した。分岐ペプチドの略図を示す。反応性１級アミンは、「星」によって強調し、チオール反応性マレイミド基は破線の四角で強調する。最適化したタンパク質骨格（左側のパネル）およびＳＡＣ３（右側のパネル）から作成したらせん構造Ａ´にエンコードした３６８−３７６／ＨＬＡ−Ａ２．１四量体を用いたＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞の検出を示す。免疫ＰＣＲを用いた細胞表面受容体の検出を示す。パネルＡは、ｓｓＤＮＡでエンコードした蛍光ＭＡＲＴ−１ｐ／ＭＨＣ四量体で染色したＪｕｒｋｅｔ^{ａ−ＭＡＲＴ−１}およびＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}Ｔ細胞のフローサイトメトリ分析を示す。パネルＢは、ｓｓＤＮＡでエンコードした蛍光抗ＥＧＦＲ抗体標識で染色したＣＤグリオーマ細胞およびＪｕｒｋｅｔＴ細胞のフローサイトメトリ分析を示す。下のパネルは、ＰＣＲでエンコードしたｓｓＤＮＡを増大させることによる、類似の細胞受容体の検出を示す（ａ−ＭＡＲＴ−１ＴＣＲ，パネルＣ；ＥＧＦＲ，パネルＤ）。ＤＮＡエンコードｐ／ＭＨＣ四量体およびＤＮＡエンコード抗体を用いた捕捉抗原特異性細胞のＴＣＲ誘発活性の機能プロファイルの略図である。ガラス基質上で捕捉および活性化した抗原特異性Ｔ細胞の機能プロファイルを示す。パネルＡは、３個の異なる時点で３個の異なるサイトカインでエンコードした個々のスポットの蛍光画像を含む。パネルＢは、１個の個々のＩＦＮ−ｙ−クラスターの蛍光拡大図を示す。 The accompanying drawings, which are incorporated in and constitute a part of this specification, illustrate one or more embodiments of the present invention, together with detailed descriptions and examples, and illustrate the spirit and practice of the invention.
1 is a schematic representation of a modular polynucleotide-encoded capture agent, according to embodiments described herein. 1 is a schematic representation of a modular polynucleotide-encoded capture agent, according to embodiments described herein. 1 is a schematic representation of a modular polynucleotide-encoded capture agent, according to embodiments described herein. 1 is a schematic representation of a modular polynucleotide-encoded capture agent, according to embodiments described herein. FIG. 6 shows the results of a cell sorting experiment performed using a modular polynucleotide encoded capture agent according to embodiments described herein. Panel A shows a grayscale fluorescent image of an array of ssDNA-p / MHC tetramers specific for tyrosinase TCR in contact with T cells. This image shows the detection and cell sorting of T cells on a substrate with substrate DNA complementary to the ssDNA-p / MHC tetramer encoding polynucleotide. Panel B shows cell sorting using two sets of ssDNA-p / MHC tetramers, each encoding a ssDNA that can be differentially distinguished from each other. Arrows indicate binding of each set after contact with target T cells. FIG. 6 shows the results of a cell sorting experiment performed using a modular polynucleotide encoded capture agent according to embodiments described herein. Panel A shows a grayscale fluorescence image of an array of ssDNA-p / MHC tetramers specific for complementary substrate polynucleotides and tyrosinase TCRs contacted at different frequencies as shown for T cells. Panel B shows a diagram showing the quantification of the data shown in Panel A. 2 shows representative structures of a framework ( panel A ) and associated optimal framework ( panel B ) according to embodiments described herein. FIG. 6 shows the results of an experiment demonstrating the binding ability of an optimized polynucleotide encoded capture agent according to embodiments described herein. In particular, Panel A shows PAGE gel denaturation for SAC proteins detected at various stages of expression, refolding, and purification. The molecular weight of the SAC monomer is ˜12 kDa. Panel B is a gel mobility shift assay performed to verify the formation of the ssDNA-SAC complex. Panel C shows the formula that defines the molar ratio of biotin to SA using the molecule 2- (4′-hydroxyazobenzene) benzoic acid (HABA). FIG. 6 shows the results of an experiment demonstrating the capture ability of a polynucleotide-encoded capture agent according to the embodiments described herein. In particular, panel A shows a grayscale light of an array of ssDNA-encoded proteins such as a streptavidin backbone and p / MHC binding proteins specific for human TCR transduced T cells (left) and mouse TCR transgenic T cells (right). A field image is shown. Each sub-panel of Panel A shows a bright field image of the array after contacting the ssDNA encoded protein with complementary substrate DNA and specific cells as shown. Panel B shows ssDNA encodings such as optimized streptavidin skeleton and p / MHC binding protein specific for human TCR transduced T cells (left) and mouse TCR transgenic T cells (right) (same cells as Ueno panel) A gray scale bright field image of an array of proteins is shown. Each subpanel of Panel B shows a bright field image of the array after contacting SAC-ssDNA p / MHC with complementary substrate DNA and specific cells as indicated. FIG. 3 shows a comparison of target capture performed with a conventional protein array and a modular polynucleotide encoded capture agent according to embodiments described herein. FIG. Panel A shows an array of p / MHC present in a polynucleotide-encoded protein that further includes an optimized SA backbone, etc., compared to a conventional direct p / MHC protein spotting strategy on various model substrates as shown A gray-scale bright-field image is shown. Panel B is a diagram showing the quantification of the data shown in Panel A. Each data point was derived from three separate spots. FIG. 3 shows a comparison of target capture performed with a conventional protein array and a modular polynucleotide encoded capture agent according to embodiments described herein. FIG. Panel A shows a grayscale fluorescent image of an array of p / MHC proteins present in a ssDNA-encoded protein that further includes a SAC backbone and the like. Panel B shows a grayscale fluorescent image of a derivatized surface spotted with p / MHC protein alone. Each arrow represents a separate experiment performed on a different slide. FIG. 6 shows the results of a cell sorting experiment performed using a modular polynucleotide encoded capture agent according to embodiments described herein. Panel A shows p / MHC tetramers encoded with ss-DNA complementary to polynucleotide A and three different substrate polynucleotides (A, B after contact with the target provided by Jurket ^α-Tyr cells. And C) shows a grayscale fluorescence image of the array. Panel B shows p / MHC tetramer specific for Mart-1-specific TCR encoded with ss-DNA complementary to polynucleotide A, Tyrosinase-specific encoded with ss-DNA complementary to polynucleotide B Different substrate polynucleotides (A, B) after contact with the target provided by a mixture of Jurket ^a-MART-1 Jurket ^α-Tyr cells pre-stained with pCR / MHC tetramer specific for TCR and lipophilic dye And C) shows a grayscale fluorescence image of the array. Panel C shows gray of an array of polynucleotide-encoded proteins specific for Tyrosinase ^- specific TCR after contact with Jurket ^α-Tyr at different dilutions (50%, 10%, 1%, 0.1%) as indicated. A fluorescent image of the scale is shown. Panel D is a diagram showing the quantification of the data shown in Panel C. FIG. 6 illustrates artificial cell detection performed using a modular polynucleotide-encoded capture agent according to embodiments described herein. Panel A shows a schematic diagram of an experimental approach to transducing PMBC cells with F5 MART-1 TCR and related diagrams showing transduction efficiency defined by flow cytometry. Panel B is on a microarray containing similar capture proteins (MART-1 _{26-35 /} HLA-A2.1) and control capture proteins (CMVpp65 _495-503 / _HLA- A2.1) encoded in A and B, respectively. Shows a gray-scale bright-field image of transduced PBMCs classified in. Panel C demonstrates confocal and bright field superposition and verifies that the cell capture shown in panel B is unique (MART-1 cells are shown in light gray). FIG. 2 is a diagram illustrating detection of specificity and selectivity of a modular polynucleotide encoded capture agent according to embodiments described herein. Panel A is a diagram showing the amount and specificity of human CD8 + T cells specific for EBV BMLF1 _259-267 as defined by flow cytometry. Panel B is a diagram showing the amount and specificity of human CD8 + T cells specific for CMV pp65 _495-503 as defined by flow cytometry. FIG. 6 illustrates detection of endogenous primary cells using a modular polynucleotide-encoded capture agent according to embodiments described herein. Panel A, EBV-BMLF1 after contact with specific CD8 + cells showed a polynucleotide encoding p / MHC capture proteins EBV _BMLF1 in FIG 13 259-267 /HLA-A2.1 and CMV _{pp65 495-} An image of an array such as _{503 /} HLA-A2.1 is shown (patient NRA13). The left panel shows p / MHC capture protein EBV after contact and capture of patient NRA13 containing EBV-BMLF-1 specific CD8 + T cells (each verified by flow cytometry in FIG. 13) but not CMV-pp65. Shown are arrays localized to _BMLF1 259-267 / _HLA- A2.1 and CMV pp65 _495-503 / _HLA- A2.1 (to A and B cDNAs, respectively). The two panels on the right are fluorescent EBV BMLF1 _259-267 / _HLA- A2.1 (shown in blue, white arrows) and CMV pp65 _495-503 / _HLA- A2.1 (red, black arrows in gray scale) The gray scale fluorescent image of the array after cell staining in Panel B shows after contact with a 1: 1 mixture of CD8 + T cells specific for EBV-BMLF-1 (patient NRA13) and CD8 + T cells specific for CMV-pp65 (patient NRA11) shown in FIG. Figure 6 shows an image of an array of ss-DNA-SAC-p / MHC specific for EBV or CMV. The left panel shows a bright field image immediately after cell capture with T cells localized on spots A and B. Two panels on the right side of the array after cell staining with fluorescent EBV (blue, white arrow shown in the figure) and CMV p / MHC tetramer (red, black arrow shown in gray scale figure). A gray scale fluorescence image is shown. Panel C is a diagram showing the amount and specificity of a mixture of human EBV-specific T cell populations of less than 0.4%, 0.2% and 0.1% as defined by flow cytometry. Panel D shows a grayscale fluorescent image of an array of modular polynucleotide-encoded proteins specific for EBV after contacting the mixture of Panel C. EBV-specific T cell populations are indicated by light gray arrows and nonspecific cells are indicated by black arrows. FIG. 6 illustrates controlled release captured using a modular polynucleotide-encoded capture agent according to embodiments described herein. Panel A shows a schematic of the experimental approach. Panel B shows (i) Jurket ^a-MART-1 (on gray scale) captured on p / MHC array (ii) after treatment with BamHI (iii) after treatment with EcoRI and (iv) after treatment with BamHI and EcoRI. Gray scale fluorescent images of red (shown in dark gray) and Jurket ^α-Tyr (green shown in light gray on gray scale). FIG. 2 shows a fluorescently labeled ssDNA-p / MHC tetramer that can be used as a staining reagent for flow cytometry and can localize antigen-specific T cells from a suspension by DNA hybridization. In panel a, Cy3-labeled A′-SAC complex is used to generate fluorescent tyrosinase 368-376 ssDNA-p / MHC tetramer and to detect Jurket ^α-Tyr cells by flow cytometry. Used for. Similar staining profiles were observed between mCy3NACS p / MHC tetramer (lower panel) and conventional tyrosinase 368-376 (PE) p / MHC tetramer (upper panel). In panel b, Jurket ^α-Tyr cells were stained with 368-376-A′p / MHC tetramer before being exposed to the DNA array. A schematic representation of a branched peptide is shown. Reactive primary amines are highlighted by “stars” and thiol-reactive maleimide groups are highlighted by dashed squares. Detection of Jurket ^α-Tyr cells using the 368-376 / HLA-A2.1 tetramer encoded in the helical structure A ′ generated from the optimized protein backbone (left panel) and SAC3 (right panel) Show. Figure 2 shows detection of cell surface receptors using immuno-PCR. Panel A shows flow cytometric analysis of Jurket ^a-MART-1 and Jurket ^α-Tyr T cells stained with fluorescent MART-1p / MHC tetramer encoded by ssDNA. Panel B shows flow cytometric analysis of CD glioma cells and Jurket T cells stained with a fluorescent anti-EGFR antibody label encoded with ssDNA. The lower panel shows the detection of similar cell receptors by increasing the PCR-encoded ssDNA (a-MART-1 TCR, panel C; EGFR, panel D). 1 is a schematic diagram of the functional profile of TCR-induced activity of captured antigen-specific cells using DNA-encoded p / MHC tetramer and DNA-encoded antibody. Figure 2 shows the functional profile of antigen-specific T cells captured and activated on a glass substrate. Panel A contains fluorescent images of individual spots encoded with 3 different cytokines at 3 different time points. Panel B shows a magnified view of the fluorescence of one individual IFN-y-cluster.

（発明の詳細な説明）
ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびとくにモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびここで説明する関連するアレイ方法およびシステムは、ＮＡＣＳアプローチまたは技術でも特定できるここで示すアプローチに従って、サンプルにおける１個またはそれ以上の標的を検出するために基質ポリヌクレオチドを組み合わせて用いることができる。 (Detailed description of the invention)
Polynucleotide-encoded capture agents and in particular modular polynucleotide-encoded capture agents and related array methods and systems described herein can be used to target one or more targets in a sample according to the approach shown here, which can also be identified by a NACS approach or technique. A combination of substrate polynucleotides can be used for detection.

単語「ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤」は、標的に特異的に結合するポリヌクレオチドエンコード分子構成を意味する。とくに、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、概して、標的に特異的に結合し、それによって標的に相補的であるように画定した結合成分、結合成分を支持する構造成分、および分子構造にエンコードする構造成分に付着したエンコードポリヌクレオチドを有する。 The term “polynucleotide-encoded capture agent” refers to a polynucleotide-encoded molecular configuration that specifically binds to a target. In particular, polynucleotide-encoded capture agents generally have a binding component defined to specifically bind to and thereby be complementary to a target, a structural component that supports the binding component, and a structural component that encodes a molecular structure. The encoding polynucleotide attached to

「モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤」において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合成分、構造成分およびエンコード成分は、制御された方法で互いに結合または分離できる標準化された分子単位によって形成される。とくに、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、結合成分は、少なくとも１個の結合分子によって形成され、標的に特異的に結合し、またこれによって標的に相補的であると画定し；エンコード成分は、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合し、またこれによって相補的であると画定するようにしたエンコードポリヌクレオチドによって形成し；また、構造成分は、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着する骨格分子によって形成する。とくに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子、骨格分子およびエンコードポリヌクレオチドは、以下でもさらに説明するように図１または図２の概略図に従って１個もしくは他に付着するまたは付着される。 In a “modular polynucleotide encoded capture agent”, the binding, structural and encoding components of the polynucleotide encoded capture agent are formed by standardized molecular units that can be bound or separated from each other in a controlled manner. In particular, in the modular polynucleotide-encoded capture agent described herein, the binding component is defined by at least one binding molecule to bind specifically to the target and thereby be complementary to the target; The encoding component is formed by an encoding polynucleotide that specifically binds to and thereby defines a complementary substrate polynucleotide attached to the substrate; and the structural component includes at least one binding molecule And formed by a backbone molecule attached to the encoding polynucleotide. In particular, in a modular polynucleotide-encoded capture agent, at least one binding molecule, backbone molecule and encoded polynucleotide that specifically binds to the target is 1 according to the schematic of FIG . 1 or FIG. 2 as further described below. Attached to or attached to an individual or other.

ここで用いる用語「付着する」または「付着した」は、２個またはそれ以上の成分を保持するために結合、リンク、力または結ぶことによって結合またはユニット化することを意味し、第１分子を第２分子または材料に直接結合する実施形態および１個またはそれ以上の中間体分子を第１分子および第２分子または材料の間に露呈する実施形態等のように直接または間接的に付着していることも含む。分子には、限定することはないが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびとくにタンパク質および抗体、多糖、アプタマーおよび小分子がある。 As used herein, the term “attach” or “attached” means to bind or unitize by binding, linking, force or tying to hold two or more components, Directly or indirectly attached, such as embodiments that bind directly to a second molecule or material, and embodiments that expose one or more intermediate molecules between the first molecule and the second molecule or material, etc. Including that. Molecules include, but are not limited to, polynucleotides, polypeptides, and especially proteins and antibodies, polysaccharides, aptamers and small molecules.

ここで用いる用語「ポリヌクレオチド」は、２個またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、またはそれら類似体から成る有機ポリマーを示す。用語「ヌクレオチド」は、プリンもしくはピリミジンに接合したリボース糖またはデオキシリボース糖からなるいくつかの化合物のいずれか、および核酸の基本構造単位であるリン酸基を意味する。用語「ヌクレオシド」は、デオキシリボースまたはリボースに結合したプリンまたはピリミジン塩基から成り、とくに核酸において見られる化合物（グアノシンまたはアデノシン）を意味する。用語「ヌクレオチド類似体」または「ヌクレオシド類似体」は、それぞれ、１個またはそれ以上の個々の原子が異なる原子または異なる官能基でり患されたヌクレオチドまたはヌクレオシドを意味する。したがって、用語ポリヌクレオチドには、いずれかの長さのＤＮＡＲＮＡ類似体およびそれらの断片の核酸を含む。３個またはそれ以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ぶ。 As used herein, the term “polynucleotide” refers to an organic polymer composed of two or more nucleotides, nucleosides, or analogs thereof. The term “nucleotide” refers to any of several compounds consisting of ribose or deoxyribose sugars conjugated to purines or pyrimidines, and phosphate groups that are the basic structural units of nucleic acids. The term “nucleoside” refers to a compound (guanosine or adenosine) consisting of a purine or pyrimidine base bound to deoxyribose or ribose, and particularly found in nucleic acids. The term “nucleotide analog” or “nucleoside analog” means a nucleotide or nucleoside in which one or more individual atoms are affected by different atoms or different functional groups, respectively. Thus, the term polynucleotide includes nucleic acids of any length DNA RNA analogs and fragments thereof. A polynucleotide of three or more nucleotides is also referred to as an oligomer or oligonucleotide.

ここで用いる用語「ポリペプチド」は、２個もしくはそれ以上のアミノ酸モノマーから成る有機ポリマーおよび／またはそれらの類似体を示す。用語「ポリペプチド］には、全長タンパク質およびペプチドと、類似体およびそれら断片等のいずれかの長さのアミノ酸ポリマーがある。３個またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドもまた、オリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ぶ。ここで用いる「アミノ酸」、「アミノ酸モノマー」、または「アミノ酸残基」は、非天然の側鎖を有する合成アミノ酸を含みＤおよびＬ光学異性体を含む２０個の天然アミノ酸のいずれかを意味する。用語「アミノ酸類似体」は、１個またはそれ以上の原子を異なる原子、同位体、または異なる官能基のいずれかで置換したが、その天然アミノ酸類似体ではないアミノ酸を意味する。 As used herein, the term “polypeptide” refers to an organic polymer composed of two or more amino acid monomers and / or analogs thereof. The term “polypeptide” includes full-length proteins and peptides and amino acid polymers of any length, such as analogs and fragments thereof. Polypeptides of 3 or more amino acids are also referred to as oligomers or oligonucleotides. As used herein, “amino acid”, “amino acid monomer”, or “amino acid residue” refers to any of the 20 natural amino acids, including synthetic amino acids with unnatural side chains, including D and L optical isomers. means. The term “amino acid analog” refers to an amino acid in which one or more atoms are replaced with either different atoms, isotopes, or different functional groups, but which are not natural amino acid analogs thereof.

ここで用いる用語「タンパク質」は、とくに、限定することはないが、抗体、ＤＮＡ，ＲＮＡ、脂質、代謝物、ホルモン、ケモカイン、および小分子等の他のタンパク質と含む他の生体分子と相互作用することができる特別な二次および三次構造を有するポリペプチドを示す。 The term “protein” as used herein specifically interacts with other biomolecules including, but not limited to, other proteins such as antibodies, DNA, RNA, lipids, metabolites, hormones, chemokines, and small molecules. Figure 2 shows polypeptides with special secondary and tertiary structures that can be made.

ここで用いる用語「抗体」は、抗原による刺激後の活性化Ｂ細胞によって生成し、生態系において免疫反応を促進する抗原に特異的に結合し、概して２個の重質鎖および２個の軽質鎖を含む４個のサブユニットから成るタンパク質を意味する。用語「抗体」には、限定することはないが、モノクローナル抗体、ポリクロ―ナル抗体またはそれら断片を含む天然および合成抗体がある。例示的な抗体には、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＧＩ，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＭおよび同様のものがある。例示的な断片物には、ＦａｂＦｖ，Ｆａｂ‘Ｆ（ａｂ’）２および同様のものがある。モノクローナル抗体は、「エピトープ」と呼ぶ他の生体分子の１個の特定の空間および極性組織に特異的に結合し、それによって相補的であると画定した抗体である。ポリクロ―ナル抗体は、異なる抗原エピトープに結合する各モノクローナル抗体とのモノクローナル抗体の混合物を意味する。抗体は、宿主の免疫付与および血清の収集（ポリクロ―ナル）または連続するハイブリドーマ細胞を準備し分泌タンパク質を収集することによって（モノクローナル）等の、当業者に既知の技術によって準備できる。 The term “antibody”, as used herein, is produced by activated B cells after stimulation with an antigen and specifically binds to an antigen that promotes an immune response in the ecosystem, generally two heavy chains and two light chains. It means a protein consisting of 4 subunits including a chain. The term “antibody” includes natural and synthetic antibodies, including but not limited to monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or fragments thereof. Exemplary antibodies include IgA, IgD, IgGI, IgG2, IgG3, IgM and the like. Exemplary fragments include Fab Fv, Fab'F (ab ') 2, and the like. A monoclonal antibody is an antibody that specifically binds to one specific space and polar tissue of another biomolecule, termed an “epitope”, and is thereby defined as being complementary. Polyclonal antibody refers to a mixture of monoclonal antibodies with each monoclonal antibody binding to a different antigenic epitope. Antibodies can be prepared by techniques known to those skilled in the art, such as immunization of the host and collection of serum (polyclonal) or by preparing continuous hybridoma cells and collecting secreted proteins (monoclonal).

ここで用いる用語「多糖」は、グリコシド結合によって共に接合した単糖によって形成したポリマーである。多糖には、非常に大きく、しばしば分岐した高分子があり、単糖または二糖ポリマーから何百から何千もの単糖を含み１０００Ｄａ〜約２０ＫＤａの分子量を有するポリマーまでいずれかの長さのポリマーがある。例示的な多糖は、グリコーゲン、セルロース、でんぷんおよびキチンを有する。 The term “polysaccharide” as used herein is a polymer formed by monosaccharides joined together by glycosidic bonds. Polysaccharides are very large and often branched polymers, polymers of any length, from mono- or disaccharide polymers to polymers containing hundreds to thousands of monosaccharides and having molecular weights of 1000 Da to about 20 KDa There is. Exemplary polysaccharides have glycogen, cellulose, starch and chitin.

ここで用いる用語「アプタマー」は、特異的な標的に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子を示す。とくに、核酸アプタマーは、ｉｎｖｉｔｒｏ選択または同等の繰り返し環ＳＥＬＥＸ（指数関数的な配位子の系統的進化）を通して、小分子、タンパク質、核酸、および細胞、組織および器官までもの様々な分子標的に結合する核酸種を有する。アプタマーは、抗体と競争する分子認識特性をしばしば必要とするため、バイオ技術および治療用途において利用できる。ペプチドアプタマーは、細胞内の他のタンパク質相互作用で妨げるように設計したタンパク質である。それらは、両端で付着しタンパク質骨格となる様々なタンパク質ループから成る。この二重構造制限は、抗体と比較してペプチドアプタマーの結合親和性を大きく増加させる（ナノモル範囲）。 As used herein, the term “aptamer” refers to an oligonucleic acid or peptide molecule that binds to a specific target. In particular, nucleic acid aptamers are targeted to a variety of molecular targets, including small molecules, proteins, nucleic acids, and cells, tissues and organs, through in vitro selection or equivalent cyclic SELEX (systematic evolution of exponential ligands). Has a nucleic acid species that binds. Aptamers can be used in biotechnology and therapeutic applications because they often require molecular recognition properties that compete with antibodies. Peptide aptamers are proteins that are designed to interfere with other protein interactions within the cell. They consist of various protein loops that attach at both ends and become the protein backbone. This double structure restriction greatly increases the binding affinity of the peptide aptamer compared to the antibody (nanolar range).

ここで用いる用語「小分子」は、ポリマーではなく約１０Ｄａから２０００〜３０００Ｄａの大きさを有する有機化合物を示す。小分子は、生物学的に活性である分子および生物活性を持たない分子を有する。例示的な小分子は、４−［（４−メチルピぺラジン−１−イル）メチル］−Ｎ−［４−メチル−３−［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）−フェニル］−ベンズアミド（Ｇｌｅｅｖｅ（登録商標））、スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸塩、およびスクシンイミジル−６−ヒドラジノニコチン酸酢酸ヒドラゾンを有する。 As used herein, the term “small molecule” refers to an organic compound having a size of about 10 Da to 2000 to 3000 Da rather than a polymer. Small molecules include molecules that are biologically active and molecules that do not have biological activity. An exemplary small molecule is 4-[(4-methylpiperazin-1-yl) methyl] -N- [4-methyl-3-[(4-pyridin-3-ylpyrimidin-2-yl) -phenyl. ] -Benzamide (Gleeve®), sulfosuccinimidyl-6- (biotinamide) hexanoate, and succinimidyl-6-hydrazinonicotinate hydrazone acetate.

ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、少なくとも１個の結合分子は標的に特異的に結合し、エンコード捕捉剤は基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合する。 In the modular polynucleotide encoded capture agent described herein, at least one binding molecule specifically binds to the target, and the encoded capture agent specifically binds to the substrate polynucleotide attached to the substrate.

分子および他方の結合または付着に関してここで用いる単語「特異的な」、「特異的に」または「特異性」は、分子および他方の間の安定した複合体の認識、接触および形成で、各分子および他の分子を有する他方との間の安定した複合体の認識、接触および形成がないことは実質的にないことを意味する。例示的な特異的な結合は、抗体−抗原相互作用、細胞受容体−配位子相互作用、ポリヌクレオチド混成、酵素基質相互作用などである。複合体の分子成分に関してここで用いる用語「特異的な」は、成分が一部である特異的な複合体への成分の独特の関連を意味する。ポリヌクレオチド配列に関してここで用いる用語「特異的な」は、相補配列である単一ポリヌクレオチドｗ有する配列の独特の関連を意味する。 The words “specific”, “specifically” or “specificity” as used herein with respect to binding and attachment of a molecule and the other refer to the recognition, contact and formation of a stable complex between the molecule and the other. And the absence of recognition, contact and formation of a stable complex with the other having other molecules means substantially absent. Exemplary specific bindings are antibody-antigen interactions, cell receptor-ligand interactions, polynucleotide hybridization, enzyme substrate interactions, and the like. The term “specific” as used herein with respect to the molecular components of a complex means a unique association of a component to a specific complex of which the component is a part. The term “specific” as used herein with respect to a polynucleotide sequence means a unique association of sequences having a single polynucleotide w that is a complementary sequence.

ここで用いる単語「基質ポリヌクレオチド」は、基質に付着しその相補的ポリヌクレオチドへの結合能力を維持するポリヌクレオチドを意味する。基質ポリヌクレオチドは、とくに、特異的に結合する配列から成り、これによって、ポリヌクレオチドエンコードタンパク質のエンコードポリヌクレオチドに相補的であると画定する。 As used herein, the term “substrate polynucleotide” refers to a polynucleotide that is attached to a substrate and maintains its ability to bind to its complementary polynucleotide. A substrate polynucleotide consists in particular of a sequence that specifically binds, thereby defining it as being complementary to the encoding polynucleotide of the polynucleotide encoding protein.

ここで用いる「基質」は、下支えまたは底質を示す。例示的な基質には、ガラス板、マイクロタイターウェルプレート、電磁ビーズ、シリコンウェハおよび本発明を読む当業者によって特定可能なさらなる基質がある。 As used herein, “substrate” refers to support or sediment. Exemplary substrates include glass plates, microtiter well plates, magnetic beads, silicon wafers, and additional substrates that can be identified by those skilled in the art reading the present invention.

いくつかの実施形態において、骨格成分に付着したエンコードポリヌクレオチドは、結合成分に対し特異的である。それらの実施形態は、結合成分−標的の特異的な相互作用を用いてタンパク質、サイトカイン、ケモカイン、小分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質などを検出し、標的は標的が必要な既知で感度の高い検出である。いくつかの実施形態において、結合成分および構造成分はタンパク質によって形成する。 In some embodiments, the encoded polynucleotide attached to the backbone component is specific for the binding component. These embodiments use specific binding component-target interactions to detect proteins, cytokines, chemokines, small molecules, DNA, RNA, lipids, etc., where the target is a known and sensitive detection that requires the target It is. In some embodiments, the binding component and the structural component are formed by proteins.

ここで用いる用語「検出する」または「検出」は、限定することはないが、サンプル、反応混合物、分子複合体および基質等の空間の限られた部分における標的もしくはシグナルの実在、存在または事実の画定を示す。検出は、標的もしくはシグナルの量または総量の測定を意味する、関連するまたは含むとき「定量的」であり（定量も意味する）、限定することはないが、標的もしくはシグナルの総量または割合を画定するように設計したいずれかの分析がある。検出は、他の標的またはシグナルに対する相対存在量に関する標的もしくはシグナルの質または種類に関連する、または有するとき「定性的」であり、定量的ではない。 The term “detect” or “detect” as used herein is not limited, but the presence, presence or fact of a target or signal in a limited portion of space such as a sample, reaction mixture, molecular complex and substrate. The definition is shown. Detection refers to the measurement of the amount or total amount of a target or signal, is “quantitative” when related or includes (also means quantification) and defines, without limitation, the total amount or percentage of the target or signal. There is one analysis designed to be. Detection is “qualitative” when it relates to or has a quality or type of target or signal relative to other targets or relative abundance relative to the signal, not quantitative.

ここで用いる用語「標的」は、対象の検体を示す。用語「検体」は、検出しなければならないサンプルにおいて存在するもしくは存在しない物質、化合物または成分を意味する。検体には、限定することはないが、生体分子およびとくにバイオマーカーがある。ここで用いる用語「生体分子」は、生態環境に関連する物質、化合物または成分を示し、限定することはないが、砂糖、アミノ酸、ペプチドタンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機分子、ヘプテン、エピトープ、生体細胞、生体細胞の一部、ビタミン、ホルモンおよび同様のものがある。用語「バイオマーカー」は、限定することはないが、細胞周期の相、健康状態および疾患状態等の生体環境の特定の状態に関連する生体分子を示す。バイオマーカーの存在、非存在、減少、上方調節は、特定の状態に関連し、それを示す。 As used herein, the term “target” refers to the analyte of interest. The term “analyte” means a substance, compound or component that is present or absent in a sample that must be detected. Samples include but are not limited to biomolecules and especially biomarkers. As used herein, the term “biomolecule” refers to a substance, compound or component related to the ecological environment, including but not limited to sugar, amino acids, peptide proteins, oligonucleotides, polynucleotides, polypeptides, organic molecules, heptenes. , Epitopes, living cells, parts of living cells, vitamins, hormones and the like. The term “biomarker” refers to a biomolecule associated with a particular state of the biological environment such as, but not limited to, cell cycle phases, health and disease states. The presence, absence, decrease, upregulation of a biomarker is associated with and indicates a particular condition.

ここで用いる用語「サンプル」は、限定することはないが、生体環境、被試験物、培養物、組織、組み換えタンパク、合成化合物またはそれら一部からの液体等の多量の何かしらのうち指標である限定された量の何かしらを示す。 The term “sample” as used herein is an indicator of a large amount of something such as, but not limited to, a biological environment, a specimen, a culture, a tissue, a recombinant protein, a synthetic compound, or a liquid from a part thereof. Indicates a limited amount of something.

いくつかの実施形態において、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード分子は、少なくとも１個の結合分子、骨格分子およびエンコードポリヌクレオチドを有する。 In some embodiments, the modular polynucleotide encoding molecule has at least one binding molecule, backbone molecule, and encoding polynucleotide.

ここで用いる用語「結合分子」または「親和剤」は、適切な条件下で標的に特異的に結合することができる分子を示す。結合分子または親和剤は、とくに、適切な条件下で少なくとも１個の標的に特異的に結合することができ、例えば、溶液において（例えば、生体由来、または合成した）、細胞表面上で、人工表面上（例えば誘導体化したビーズ、ナノ粒子）または他の混合物においてもしくは当業者に特定できる表面上で標的に結合する。結合分子の例は、所定の標的に対して結合親和性を示すいずれかの分子であり、限定することはないが、抗体、レクチン、Ｆｃ受容体、ＭＨＣタンパク質Ａ／Ｇ、ペプチドアプタマー等のタンパク質結合剤、ポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｅ／ｏＤＮＡ）核酸アプタマー、ペプチド、小分子等の非ペプチド結合剤、およびメシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖａｃ（登録商標））、ブンガロトキシン、ニコチルアセチルコリン受容体などの薬剤がある。モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、親和剤は、結合が直接的にまたは間接的に、例えば中間体分子（例えばビオチン分子）、いずれかの共有結合機構（当業者にによって容易に特定できる）または静電気、Ｆｃ−タンパク質Ａ／Ｇ相互作用、ビオチンなど等の非共有機構を通して行われる骨格に付着する。 The term “binding molecule” or “affinity agent” as used herein refers to a molecule that can specifically bind to a target under suitable conditions. The binding molecule or affinity agent can specifically bind to at least one target, particularly under appropriate conditions, eg, in solution (eg, derived from organisms or synthesized), artificially on the cell surface Bind to the target on the surface (eg, derivatized beads, nanoparticles) or other mixture or on a surface that can be identified by one skilled in the art. Examples of binding molecules are any molecules that exhibit binding affinity for a given target, including but not limited to proteins such as antibodies, lectins, Fc receptors, MHC protein A / G, peptide aptamers Non-peptide binders such as binding agents, polynucleotide (eg RNAe / oDNA) nucleic acid aptamers, peptides, small molecules, and drugs such as imatinib mesylate (Gleevac®), bungarotoxin, nicotyl acetylcholine receptor is there. In a modular polynucleotide-encoded capture agent, an affinity agent is a direct or indirect bond, such as an intermediate molecule (eg, a biotin molecule), any covalent binding mechanism (which can be readily identified by one skilled in the art) or It adheres to the scaffold that is carried out through non-covalent mechanisms such as static electricity, Fc-protein A / G interaction, biotin and the like.

一般的に、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質において用いる結合分子は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ），および当業者に特定可能なさらなる技術等の当該技術における既知の技術で測定することができる検定標的に対して結合親和性および結合選択性を示す。モジュール式ポリヌクレオチド捕捉剤に対する結合分子の選択は、検出する標的および実験設計の観点で当業者によって行う。例えば、標的が細胞であるとき、結合分子は生体分子、とくに特別な細胞の種類の表面に存在するバイオマーカーに対して結合親和性および選択性を示す。例示的な表面分子には、限定することはないが、膜タンパク、受容体、糖タンパク質、イオンチャネルまたは主要組織適合性複合体および本明細書を読む当業者に特定可能な他の分子がある。 In general, the binding molecules used in the modular polynucleotide-encoded proteins described herein are known in the art such as surface plasmon resonance (SPR), enzyme immunoassay (ELISA), and further techniques identifiable to those skilled in the art. The binding affinity and binding selectivity for an assay target that can be measured with this technique is shown. The choice of binding molecule for the modular polynucleotide capture agent is made by one skilled in the art in terms of the target to be detected and the experimental design. For example, when the target is a cell, the binding molecule exhibits binding affinity and selectivity for biomolecules, particularly biomarkers present on the surface of a particular cell type. Exemplary surface molecules include, but are not limited to, membrane proteins, receptors, glycoproteins, ion channels or major histocompatibility complexes and other molecules identifiable to those skilled in the art reading this specification. .

当業者はまた、標的に対する対象の結合分子によって示された結合親和性および選択性の画定に基づき、また骨格に付着可能な結合分子の数から特定の標的に対して適切な結合分子を特定できる（以下参照）。 One skilled in the art can also identify the appropriate binding molecule for a particular target based on the definition of binding affinity and selectivity exhibited by the binding molecule of interest for the target and from the number of binding molecules that can be attached to the scaffold. (See below).

いくつかの実施形態において、適切な骨格を選択するとき、骨格に付着する結合分子の数を調整して、標的に対する捕捉剤の価数（すなわち、標的を有する捕捉剤によって形成した化学結合の数）を制御することによって所定の結合親和性および／または選択性を達成する。 In some embodiments, when selecting an appropriate scaffold, the number of binding molecules attached to the scaffold is adjusted to determine the valence of the capture agent to the target (ie, the number of chemical bonds formed by the capture agent with the target). ) To achieve a predetermined binding affinity and / or selectivity.

例えば、特定の標的に対する低親和性（例えばＫｄ＞１０^−６）の結合分子は、骨格に付着した分子の数を増加させる必要があり、この結合分子を有するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の特定の結合を可能にする。 For example, binding molecules with low affinity for a particular target (eg, Kd> 10 ⁻⁶ ) need to increase the number of molecules attached to the backbone, and identification of modular polynucleotide encoded capture agents with this binding molecule Enables the coupling.

したがって、いくつかの実施形態において、特定の標的に対する捕捉剤の結合親和性は、制御され、とくに、同じまたは異なる結合分子の多岐の複製を提供することによって増加する。とくに、同じまたは異なる結合分子の多岐の複製は、骨格上に適切にあれば、結合分子／骨格構造が非常に高い結合親和性を対象の細胞の種類に示し、それらによって親和剤となる。 Thus, in some embodiments, the binding affinity of a capture agent for a particular target is controlled and specifically increased by providing multiple replications of the same or different binding molecules. In particular, multiple copies of the same or different binding molecules, if appropriate on the scaffold, the binding molecule / backbone structure exhibits a very high binding affinity to the cell type of interest and thereby becomes an affinity agent.

とくに、多岐の配位子捕捉剤は、様々な分子（上述した１個等の）を同じ骨格に結合させることによって組み立てる。これは、標的サンプル（例えば、同じ抗原が存在する細胞からの多細胞表面マーカー、内因性および外因性ペプチド／ＭＨＣ）内に存在する多くの要素を調べるのが望ましい特定の状況において有利である。 In particular, a wide variety of ligand scavengers are assembled by attaching various molecules (such as one described above) to the same skeleton. This is advantageous in certain situations where it is desirable to examine many elements present in the target sample (eg, multicellular surface markers from cells in which the same antigen is present, endogenous and exogenous peptides / MHC).

いくつかの実施形態において、結合分子は、抗体、レクチン、Ｆｃ受容体、ＭＨＣ、タンパク質Ａ／Ｇおよび当業者に特定可能なさら成るタンパク質である。 In some embodiments, the binding molecule is an antibody, lectin, Fc receptor, MHC, protein A / G and further proteins identifiable to those skilled in the art.

とくに、いくつかの実施形態において、結合分子は抗体である。とくに、それらの実施形態において、抗体は、所定の標的に特異的に結合するように生成する。氷的な、混合物においてまたは細胞表面上で（例えばＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ３参照）検出されるバイオマーカーである。後者の場合、抗体はまた、細胞標的を検出および／または分類するのに用いるモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合分子として用いることができる（実施例１３参照）。 In particular, in some embodiments, the binding molecule is an antibody. In particular, in those embodiments, antibodies are generated that specifically bind to a given target. Biomarkers detected in icy, mixed or on cell surfaces (see eg CD4, CD8 and CD3). In the latter case, the antibody can also be used as a binding molecule for a modular polynucleotide encoded capture agent used to detect and / or classify cellular targets (see Example 13).

いくつかの実施形態において、タンパク質はＭＨＣ複合体である。ここで用いる用語「ＭＨＣ」または「ｐ／ＭＨＣ」は、ペプチド主要組織適合性複合体分子（ｐ／ＭＨＣ）および、より特別には、Ｔ細胞上に見られるＴ細胞受容体に結合する同類の結合剤であるヘテロ三量体タンパク質結合剤を示す。とくに、ｐ／ＭＨＣ複合体は、抗原が存在する細胞の細胞表面上に見られるヘテロ三量体タンパク質であり、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩＩＩタンパク質を有する。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ペプチド、鎖、およびＰ２−マイクロ−グロブリンを有する。ＡＰＣ発現ＭＨＣクラスＩタンパク質は、表面分子ＣＤｂによって安定化した細胞毒性Ｔ細胞に抗原フラグメントを提供する。ＭＨＣクラスＩＩはヘテロ三量体ペプチド結合タンパク質およびＭＨＣＩＩＤＭ，ＭＨＣＩＩＤＲ、およびＭＨＣＩＩＤＰ等のリソソーム部分におけるＭＨＣクラスＩＩタンパク質上に乗ったモジュール式抗原を含む。抗原が存在する細胞上で、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、α＆β鎖を有し、Ｔヘルパー細胞上のＴＣＲおよびＣＤ４受容体に結合することによって抗原フラグメントにＴヘルパー細胞を提供する。ＭＨＣクラスＩＩＩは、相補的な成分（例えばＣ２、Ｃ４、因子Ｂ）等の他の免疫成分およびエンコードサイトカイン（例えばＴＮＦ−ａ）およびｈｓｐを有する。 In some embodiments, the protein is an MHC complex. As used herein, the term “MHC” or “p / MHC” refers to the peptide major histocompatibility complex molecule (p / MHC) and more particularly to a similar T cell receptor found on T cells. The heterotrimeric protein binder which is a binder is shown. In particular, the p / MHC complex is a heterotrimeric protein found on the cell surface of cells in which antigen is present, and has MHC class I, MHC class II and MHC class III proteins. MHC class I proteins have peptides, chains, and P2-micro-globulins. APC-expressed MHC class I proteins provide antigenic fragments to cytotoxic T cells stabilized by the surface molecule CDb. MHC class II includes heterotrimeric peptide binding proteins and modular antigens riding on MHC class II proteins in the lysosomal portion such as MHC II DM, MHC II DR, and MHC II DP. On cells where antigen is present, MHC class II proteins have α & β chains and provide T helper cells to antigen fragments by binding to TCR and CD4 receptors on T helper cells. MHC class III has other immune components such as complementary components (eg C2, C4, factor B) and encoded cytokines (eg TNF-a) and hsp.

ＭＨＣに対する典型的な受容体／標的は、ＭＨＣ複合体において存在する様々な抗原（例えばＭＡＲＴ−１、サイトメガロウィルス、チロシナーゼなど）に対して特異的であるＴ細胞上に見られるＴ細胞受容体である。特定の標的に対する適切な標的は、結合特異性ＭＨＣ対象分子の観点で関心の標的に基づいて当業者によって特定することができる。 Typical receptors / targets for MHC are T cell receptors found on T cells that are specific for various antigens present in the MHC complex (eg, MART-1, cytomegalovirus, tyrosinase, etc.). It is. Appropriate targets for a particular target can be identified by those skilled in the art based on the target of interest in terms of the binding specificity MHC subject molecule.

いくつかの実施形態において、ＭＨＣモノマーは、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合分子を提供する。それらの実施形態において、標的は、好ましくは、検出する細胞内に標的がないとき状態または形における分子バイオマーカーまたは他の分子によって提供される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ二量体および三量体は、フローサイトメトリを介して溶液内に抗原特異的Ｔ細胞を検出するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、高い親和相互作用（例えばＴＣＲ−ｐ／ＭＨＣ）を有するＭＨＣ二量体および三量体は、複合体環境においても抗原特異的なＴ細胞を検出するように期待され、チロシナーゼ抗原に対するＴＣＲを発現するＪｕｒｋｅｔ細胞を準最適な捕捉剤で分類する実施例５および図９ａで説明する（下の左側パネル）（図８の二量体および三量体の混合も参照）。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ三量体は、ポリヌクレオチドエンコード骨格と結合させて用いて、有利には、細胞検出および／または分類を目指す用途において用いる（例えば実施例９および１０および図５，６，９，１０，１１，１２および１３−１４，１５，１６，１９，２２参照） In some embodiments, the MHC monomer provides a binding molecule for the modular polynucleotide encoded capture agent described herein. In those embodiments, the target is preferably provided by a molecular biomarker or other molecule in a state or form when there is no target in the cell to be detected. In some embodiments, MHC dimers and trimers can be used to detect antigen-specific T cells in solution via flow cytometry. In some embodiments, MHC dimers and trimers with high affinity interactions (eg, TCR-p / MHC) are expected to detect antigen-specific T cells even in a complex environment, Jurket cells expressing a TCR for tyrosinase antigen are classified in suboptimal capture agents in Example 5 and FIG. 9a (bottom left panel) (see also dimer and trimer mixture in FIG. 8). In some embodiments, MHC trimers are used in conjunction with a polynucleotide-encoded backbone, advantageously in applications aimed at cell detection and / or classification (eg, Examples 9 and 10 and FIGS. 6, 9, 10, 11, 12 and 13-14, 15, 16, 19, 22 )

とくに、いくつかの実施形態において、抗原に存在するＭＨＣの四量体は、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合分子を提供する。ＭＨＣ四量体は、ＭＨＣモノマーまたは二量体よりも対象のＴ細胞に対する大幅に高い親和性を示し、また、フローサイトメトリによって抗原特異的なＴ細胞の検出に対して現在確立した試薬である。ここで説明するモジュール式捕捉剤において骨格と結合するとき、ＭＨＣ四量体は、当該技術において既知のいくつかの方法と比較して高い感度および特異性で標的の検出および／または分類ができる。 In particular, in some embodiments, the tetramer of MHC present in the antigen provides a binding molecule for the modular polynucleotide-encoded capture agent described herein. MHC tetramers exhibit significantly higher affinity for T cells of interest than MHC monomers or dimers and are currently established reagents for detection of antigen-specific T cells by flow cytometry. . When coupled to the scaffold in the modular capture agents described herein, MHC tetramers can detect and / or classify targets with increased sensitivity and specificity compared to several methods known in the art.

図および実施例を含む以下の説明において、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード分子と結合する結合分子の特性および用途を議論するとき、ＭＨＣに対して参照する。当業者は、ＭＨＣよりもたんぱく質および他の分子を作成および使用する説明を適用することができる。とくに、当業者は、ｐ／ＭＨＣ分子ではなく結合たんぱく質を用いるとき、選択の主な決定因子は検出する標的であることを理解できる。例えば、小分子（例えばカフェイン）およびカフェインに特異的なアプタマーを検出することが望ましければ、当業者は、結合部位としてアプタマーを選択し、それを骨格構築に適用する（実施例１３参照）。 In the following description, including the figures and examples, reference will be made to MHC when discussing the properties and uses of binding molecules that bind to the modular polynucleotide encoding molecules described herein. One skilled in the art can apply instructions for making and using proteins and other molecules rather than MHC. In particular, one skilled in the art can understand that when using binding proteins rather than p / MHC molecules, the main determinant of selection is the target to be detected. For example, if it is desired to detect small molecules (eg, caffeine) and aptamers specific for caffeine, one skilled in the art will select the aptamer as a binding site and apply it to scaffold construction (see Example 13). ).

ここで用いる用語「骨格」および「骨格分子」は、エンコードポリヌクレオチド（例えばｓｓＤＮＡタグ）に親和剤（例えばＭＨＣ）を集めるようにした捕捉剤の分子構造を示す。この構造は、タンパク質（ストレプトアビジンまたはＳＡ等）、他の生体分子（ＲＮＡおよびＤＮＡ、ペプチド核酸などのポリヌクレオチド等）、またはポリマーの区別および分離された部位において親和剤およびエンコードポリヌクレオチドに結合できるほかのポリマーから誘導される。 As used herein, the terms “backbone” and “backbone molecule” refer to the molecular structure of a capture agent that is adapted to collect an affinity agent (eg, MHC) on an encoded polynucleotide (eg, ssDNA tag). This structure can bind to affinity agents and encoding polynucleotides at distinct sites and separated sites of proteins (such as streptavidin or SA), other biomolecules (such as RNA and DNA, polynucleotides such as peptide nucleic acids), or polymers. Derived from other polymers.

ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、骨格分子は、骨格結合ドメインを有する少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するように設定する。 In the modular polynucleotide encoded capture agent described herein, the backbone molecule is set to bind to at least one binding molecule having a backbone binding domain and the encoded polynucleotide.

ここで用いる用語「ドメイン」は、独特な構造および機能特性によってマークされた領域を示す。とくに、骨格結合ドメインは、他の分子に結合するようにした骨格の領域である。したがって、本発明の意味における骨格結合ドメインには、他の分子に結合する官能基および骨格に結合するほかの分子によって占領された骨格上の骨格結合領域を有する。官能基を特定したら、関連する骨格結合領域は、大きさおよびとくに付着するのに選択するほかの分子の最大径を特定するのに適切な技術で特定する。いくつかの実施形態において本発明に従ったタンパク質の平均最大径は、選択するタンパク質に依存して約１０Å〜約５０Åであり、小分子に対しては約３Å〜約１０Åであり、また、ポリヌクレオチドに対して約１０Å〜約２０Åである。分子の直径を特定するのに適切な技術には、限定することはないが、結晶化できる分子にたいするＸ線結晶学（例えば参考文献３９〜４１）および結晶化できないポリマー等の分子に対する持続長の技術（例えば参考文献４２〜４３）がある。分子直径を検出するそれらの技術は、本明細書を読む当業者によって特定できる。 As used herein, the term “domain” refers to a region marked by a unique structural and functional property. In particular, the backbone binding domain is a region of the backbone that is adapted to bind to other molecules. Accordingly, the skeleton-binding domain in the sense of the present invention has a skeleton-binding region on the skeleton occupied by functional groups that bind to other molecules and other molecules that bind to the skeleton. Once the functional group has been identified, the relevant backbone binding region is identified by techniques appropriate to determine the size and maximum diameter of other molecules chosen to attach specifically. In some embodiments, the average maximum diameter of a protein according to the invention is about 10 to about 50 cm, depending on the protein selected, about 3 to about 10 mm for small molecules, and poly About 10 to about 20 to nucleotides. Suitable techniques for determining the diameter of a molecule include, but are not limited to, x-ray crystallography for molecules that can be crystallized (eg, refs. 39-41) and sustained lengths for molecules such as polymers that cannot be crystallized. There are techniques (for example, references 42 to 43). Those techniques for detecting molecular diameter can be identified by those skilled in the art reading this specification.

ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、骨格結合ドメインは、互いに位置的に区別でき、したがって覆えない。 In the modular polynucleotide encoded capture agent described herein, the backbone binding domains are positionally distinguishable from each other and are therefore not covered.

分子またはドメインに関してここで用いる単語「位置的に区別できる」は、分子もしくはドメインによって占領された点または範囲に基づいて区別できる分子またはドメインを示す。したがって、位置的に区別できる骨格結合ドメインは、骨格上の異なる点または範囲を占領する結合ドメインであり、それによって位置的に区別できる。 As used herein with respect to a molecule or domain, the term “positionally distinguishable” refers to a molecule or domain that can be distinguished based on the point or extent occupied by the molecule or domain. Thus, a positionally distinguishable backbone binding domain is a binding domain that occupies a different point or range on the backbone and can thereby be positionally distinguished.

とくに、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、骨格分子は、少なくとも１個の結合分子に付着するようにした第１骨格結合ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドを付着するようにした第２骨格結合ドメインを有する。 In particular, in the modular polynucleotide-encoded capture agent described herein, the backbone molecule has a first backbone binding domain that is attached to at least one binding molecule and a second backbone binding that is attached to the encoded polynucleotide. Has a domain.

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、位置的に区別できる官能基および付着分子が骨格上に存在する付着できるようにする関連する骨格結合領域を特定することによって選択する。 In a modular polynucleotide-encoded capture agent, the first and second backbone binding domains identify a functionally distinguishable functional group and an associated backbone binding region that allows attachment molecules to be present on the backbone. To choose by.

化学反応性を有し骨格において存在する分子またはそれら部位（例えば官能基または制限部位）に関してここで用いる用語「存在する」は、分子またはそれら部位はこの化学反応性の検出可能な程度を維持する構造における分子または官能基の形態を意味する。したがって、骨格上に存在する分子または官能基は、適切な条件下で機能および検出できる形態における骨格において存在する分子または部位であり、１個またはそれ以上の化学反応分子またはそれら部位を化学的および／または物理的に特徴付ける。 The term “existing” as used herein with respect to molecules or their sites (eg, functional groups or restriction sites) that are chemically reactive and present in the backbone will maintain the detectable degree of this chemical reactivity for the molecule or those sites. Means the form of a molecule or functional group in a structure. Thus, a molecule or functional group present on the scaffold is a molecule or moiety present in the scaffold in a form that is functional and detectable under appropriate conditions, and chemically and one or more chemically reactive molecules or moieties are chemically and And / or physical characterization.

したがって、本発明のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドが骨格に付着するとき、結合分子は標的に結合するために存在し、エンコードポリヌクレオチドは基質ポリヌクレオチドに結合するために存在する。 Thus, in the modular polynucleotide-encoded capture agent of the present invention, when the binding molecule and the encoding polynucleotide are attached to the backbone, the binding molecule is present to bind to the target and the encoding polynucleotide binds to the substrate polynucleotide. Exists.

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、骨格上の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの存在は、適切な第１および第２骨格結合ドメインを有する骨格を選択することによって達成する。 In a modular polynucleotide encoded capture agent, the presence of binding molecules and encoded polynucleotides on the backbone is achieved by selecting a backbone having appropriate first and second backbone binding domains.

第１骨格結合ドメインにおいて含まれる、結合分子に結合する官能基は、結合分子の化学的性質に依存し、また、本明細書を読む当業者によって特定できる。例えば、結合分子に結合する官能基には、限定することはないが、ＢｉｒＡリガーゼ（ビオチン基を所定のペプチド配列に付着させる酵素）、ホルミルグリシン生成酵素（参考文献４４における実施例で説明した再結合タンパク質内へのアルデヒド基の部位特異的導入）等の他の酵素がある。 The functional group attached to the binding molecule contained in the first backbone binding domain depends on the chemical nature of the binding molecule and can be identified by one of ordinary skill in the art reading this specification. For example, functional groups that bind to a binding molecule are not limited, but include BirA ligase (an enzyme that attaches a biotin group to a predetermined peptide sequence), formylglycine-producing enzyme (re-described in the example in Reference 44). There are other enzymes such as site-specific introduction of aldehyde groups into binding proteins.

第２骨格結合ドメインにおいて含まれる、ポリヌクレオチドに結合する官能基も、本明細書を読む当業者によって特定できる。ポリヌクレオチドに結合する骨格上に存在する例示的な官能基には、スルホルヒジル（例えばシステイン残基において）、第１アミンおよび従来の接合戦略を介して誘導ＤＮＡに付着し、当業者によって特定可能な他の官能基がある。 The functional group attached to the polynucleotide contained in the second backbone binding domain can also be identified by those skilled in the art reading this specification. Exemplary functional groups present on the backbone that bind to the polynucleotide include sulfhydryl (eg, at cysteine residues), primary amines and attached to the derived DNA via conventional conjugation strategies and can be identified by one of ordinary skill in the art. There are other functional groups.

それらの官能基は、骨格上の内因基である（例えば、骨格タンパク質上の負のリジン残基）または、遺伝子クローニング（例えばタンパク質）、合成技術（ポリマー、小分子）等の方法および他の方法によって導入される。骨格に付着するポリヌクレオチドまたは結合分子の複製の数は、骨格上で用いることができる官能基の数に正比例する。 These functional groups are endogenous groups on the backbone (eg, negative lysine residues on backbone proteins) or methods such as gene cloning (eg, proteins), synthetic techniques (polymers, small molecules) and other methods Introduced by. The number of polynucleotides or binding molecule copies attached to the backbone is directly proportional to the number of functional groups that can be used on the backbone.

特異的な第１および第２官能基および関連する骨格結合ドメインは、実験設計の観点で選択する。通常は、骨格は、第１および第２骨格結合ドメインが直角化学物質を用いて結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着することができるように選択する。一連の付着化学反応が直角であると、いずれかの特定の化学反応を行うとき、官能基は、特定の化学物質が直角セット内のいずれかの化学物質と反応しない化学反応に関与および／または行う。例示的な直行化学反応には、骨格がタンパク質であるときシステインーマレイミドカップリング、アミン−ＮＨＳカップリング、およびストレプトアビジンービオチン結合があり、骨格が多糖であるとき、ＮａＩＯ４を有する異なる骨格結合ドメインにおけるＯＨ官能基の制御された酸化物がある。 Specific first and second functional groups and associated backbone binding domains are selected in view of experimental design. Usually, the scaffold is selected such that the first and second scaffold binding domains can be attached to the binding molecule and the encoding polynucleotide using orthogonal chemicals. When a series of attachment chemistry is orthogonal, when performing any particular chemical reaction, the functional group participates in a chemical reaction in which the particular chemical does not react with any chemical in the orthogonal set and / or Do. Exemplary orthogonal chemical reactions include cysteine-maleimide coupling, amine-NHS coupling, and streptavidin-biotin linkage when the backbone is a protein, and different backbone binding domains with NaIO4 when the backbone is a polysaccharide. There is a controlled oxide of the OH functional group in

いくつかの実施形態において、親和剤およびエンコードＤＮＡに適合する異なる骨格結合ドメインに加えて、骨格も対象の標的の環境に匹敵するように選択する（例えば、標的が細胞表面マーカーであれば水溶液において溶解する）。 In some embodiments, in addition to different backbone binding domains that are compatible with the affinity agent and encoding DNA, the backbone is also selected to be comparable to the target environment of interest (eg, in aqueous solution if the target is a cell surface marker). Dissolve).

いくつかの実施形態において、骨格は多座配位子の相互作用を介して特異的な細胞の種類に高い親和性で結合するように、およびその後それらの異なる細胞種類の空間的に方向付け多重化するようにした高分子骨格から成る。 In some embodiments, the scaffolds bind with high affinity to specific cell types via multidentate ligand interactions, and then spatially orientated multiplexes of those different cell types. It consists of a polymer skeleton designed to be

とくに、いくつかの実施形態において、骨格は、モジュール式設計特性を発現する非天然分子によって提供する。それらの実施形態において、タンパク質骨格を設計して、特異的な結合分子おおびエンコードポリヌクレオチドの多くのおよび制御された数の複製を特異的な骨格ポリヌクレオチド結合ドメインで骨格に付着する。 In particular, in some embodiments, the scaffold is provided by a non-natural molecule that expresses modular design characteristics. In those embodiments, the protein backbone is designed to attach many and controlled numbers of copies of specific binding molecules and encoded polynucleotides to the backbone with specific backbone polynucleotide binding domains.

いくつかの実施形態において、骨格は、多くの第２骨格結合ドメインにおいて１個の標準的なエンコードポリヌクレオチド（例えばＤＮＡオリゴマー）の多くの複製の付着を可能にするまたは容易にするように設定することができる。それらの実施形態において、第２骨格結合ドメインは、基質ポリヌクレオチドで被覆した表面上で骨格を特定の点に空間的に方向付けるように用いたエンコードポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションできるように選択できる。 In some embodiments, the scaffold is set to allow or facilitate attachment of many copies of one standard encoding polynucleotide (eg, DNA oligomer) in many second scaffold binding domains. be able to. In those embodiments, the second backbone binding domain can be selected such that it can hybridize with the encoding polynucleotide used to spatially direct the backbone to a particular point on the surface coated with the substrate polynucleotide.

このように設計した骨格は、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤が特異的な細胞種類の空間的に選択的な分類に用いる実施形態において有効である。例えば、多くの骨格は、それぞれが異なる親和剤を有し、また、結合的に区別可能なｓｓＤＮＡオリゴマーで独特にラベル化したが、本発明の観点で当業者に明らかなように個々の部位に多くの細胞種類の混合物を空間的に分類するのと平行して抑制する。例えば、いくつかの実施形態において、ｐ／ＭＨＣと一緒にビオチン化抗体を含むモジュール式捕捉剤を親和試薬として用いるのが好ましく、それぞれ結合的に区別可能なｓｓＤＮＡオリゴマーにエンコードする。抗体は、ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ３などの細胞表面マーカーに従って細胞を分類するのに用いるが、ｐ／ＭＨＣタンパク質は、ＴＣＲによって画定するように抗原特異性に従って細胞を分類する。 The backbone designed in this way is useful in embodiments where modular polynucleotide encoded capture agents are used for spatially selective classification of specific cell types. For example, many scaffolds each have a different affinity agent and are uniquely labeled with a bindably distinguishable ssDNA oligomer, but at individual sites as will be apparent to those skilled in the art in view of the present invention. Suppresses a mixture of many cell types in parallel with spatial classification. For example, in some embodiments, a modular capture agent comprising a biotinylated antibody along with p / MHC is preferably used as an affinity reagent, each encoding a binding distinguishable ssDNA oligomer. Antibodies are used to sort cells according to cell surface markers such as CD4, CD8, CD3, while p / MHC proteins sort cells according to antigen specificity as defined by TCR.

いくつかの実施形態において、骨格の所定の形態およびとくに、骨格タンパク質は、伝統的なクローニング技術または当業者によって特定可能な他の技術等の当業者に既知の技術で修正した対象の骨格の修正を通して達成できる。 In some embodiments, a given form of backbone and, in particular, the backbone protein, is a modification of the subject backbone modified with techniques known to those skilled in the art, such as traditional cloning techniques or other techniques identifiable by those skilled in the art. Can be achieved through.

いくつかの実施形態において、骨格は特異的な捕捉剤に対して最適化することができる。とくに、特異的な捕捉剤において、最適化した骨格は、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを独立してカップリングするよく画定した骨格結合ドメインを有し、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを結合するとき、ポリヌクレオチドおよび結合分子の集合の間の起こりうる接合部分を最小化する。これは、通常、標的および基質ポリヌクレオチドに対して所定の結合親和性を有する捕捉剤に対して、結合分子および骨格に付着したエンコードポリヌクレオチドの間の骨格重複を最小化することによって達成するが、標的および基質ポリヌクレオチドに対する捕捉剤の所定の結合親和性を維持する。 In some embodiments, the scaffold can be optimized for specific capture agents. In particular, in specific capture agents, the optimized backbone has a well-defined backbone binding domain that independently couples the binding molecule and the encoding polynucleotide, and when binding the binding molecule and the encoding polynucleotide, Minimize possible junctions between the collection of nucleotides and binding molecules. This is usually achieved by minimizing backbone overlap between the binding molecule and the encoded polynucleotide attached to the backbone for a capture agent having a predetermined binding affinity for the target and substrate polynucleotides. Maintaining a predetermined binding affinity of the capture agent for the target and substrate polynucleotides.

参考文献は、本発明に従ったモジュール式捕捉剤の異なる形態を示す図１および２に対して用いた。とくに、図１および２の説明において、骨格ドメイン、結合分子ドメイン（タンパク質結合剤ドメイン）およびポリヌクレオチドドメイン（ＤＮＡドメイン）を概略的に示す。すでに上述したように、ここで用いる用語「ドメイン」は、異なる構造的および機能的特定によってマークされた領域である。したがって、骨格分子。結合分子およびに関する用語「ドメイン」は、特定の温度で捕捉剤において結合した分子（骨格分子、結合分子、ポリヌクレオチド）の配座によって画定した特別な領域を示す。特定の分子のドメインは、Ｘ線結晶学、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、ゲル電気泳動および当業者によって特定可能なほかの技術等の、他の分子の大きさおよびとくに三次元構造を特定するのに適切な技術によって画定する。 The reference was used for FIGS. 1 and 2 which show different forms of modular scavengers according to the present invention. In particular, in the description of FIGS. 1 and 2 , a backbone domain, a binding molecule domain (protein binder domain) and a polynucleotide domain (DNA domain) are schematically shown. As already mentioned above, the term “domain” as used herein is a region marked by different structural and functional identification. Thus, the skeletal molecule. The term “domain” for binding molecules and refers to a special region defined by the conformation of the molecules (skeletal molecule, binding molecule, polynucleotide) bound in the capture agent at a particular temperature. The domain of a particular molecule identifies the size and especially the three-dimensional structure of other molecules, such as X-ray crystallography, size exclusion chromatography, mass spectrometry, gel electrophoresis and other techniques that can be identified by those skilled in the art Defined by the appropriate technique.

特定の捕捉剤に対して最適化した骨格において、骨格結合ドメインは、骨格上の結合分子ドメインおよびポリヌクレオチドの間の重複を最小化するように選択し、捕捉剤への所定の結合親和性を提供する。 In a scaffold optimized for a particular capture agent, the backbone binding domain is selected to minimize the overlap between the binding molecule domain on the backbone and the polynucleotide, and a given binding affinity for the capture agent. provide.

いくつかの実施形態において、最適化した骨格は、骨格上のすべて利用できる位置的に区別可能な骨格結合ドメイン上のその結果できた捕捉剤の所定の結合親和性に関連する結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを提供する。一方、いくつかの実施形態において、最適化していない骨格は、付着した結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの数が、骨格上で用いることができる部位の全数に一致しない。例えば、骨格が結合タンパク質に付着する４部位およびＤＮＡに付着する３部位を有すれば、最適化していない骨格は、モル過剰の大きさに関わらず骨格１個に対して4未満の結合タンパク質および３未満を有することができる。骨格ごとの結合分子および／またはポリヌクレオチドのこの存在（または非存在）は測定できる（例えば図８参照）。捕捉剤はまた、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、ＳＰＲなどの伝統的な分析で試験して捕捉剤の効果を測定できる。 In some embodiments, the optimized scaffold is a binding molecule and encoding poly associated with a predetermined binding affinity of the resulting capture agent on all available positionally distinct scaffold binding domains on the scaffold. Nucleotides are provided. On the other hand, in some embodiments, a non-optimized scaffold has a number of attached binding molecules and encoded polynucleotides that do not match the total number of sites that can be used on the scaffold. For example, if the backbone has 4 sites attached to the binding protein and 3 sites attached to the DNA, the non-optimized backbone is less than 4 binding proteins per backbone regardless of the molar excess size and Can have less than 3. This presence (or absence) of binding molecules and / or polynucleotides per backbone can be measured (see, eg, FIG. 8 ). The capture agent can also be tested with traditional analyzes such as ELISA, flow cytometry, SPR, etc. to determine the effect of the capture agent.

特異的な捕捉剤において、骨格はまた２個の部位（すなわち、結合分子およびエンコードポリヌクレオチド）に対する積分点として骨格機能を最適化するように修正できるが、これらの部位に結合する骨格ドメインの間のいずれかの起こりうる相互作用を最小化し、その結果付着した部位の機能効果が低下する。低下した機能効果は、立体障害（結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの間の重複領域）により、骨格上の付着領域の不可逆的な修正は、カップリング化学の性質による。最適化していない骨格（天然ＳＡ）および最適化した骨格（システインＳＡ）を有するＴ細胞効果の比較は、実施例４〜６および図７〜９において説明する。 In specific capture agents, the backbone can also be modified to optimize backbone function as an integration point for two sites (ie, binding molecule and encoded polynucleotide), but between the backbone domains that bind to these sites. Any possible interaction of these is minimized, resulting in a reduced functional effect of the attached site. The reduced functional effect is due to steric hindrance (the overlapping region between the binding molecule and the encoding polynucleotide), and the irreversible modification of the attachment region on the backbone is due to the nature of the coupling chemistry. Comparison of T cell effects with non-optimized scaffold (natural SA) and optimized scaffold (cysteine SA) is illustrated in Examples 4-6 and FIGS. 7-9 .

したがって、特定の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合する特定の骨格分子は、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを結合する骨格結合ドメインを特定することによってそれらの結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに対して最適化し、また、骨格分子の残っている部分を修正して骨格上の骨格結合ドメインを整備し、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの間の相互作用を最小化する。このようにして、特定の骨格分子の最適化した変形を誘導することができる。 Thus, specific backbone molecules that bind to specific binding molecules and encoding polynucleotides are optimized for those binding molecules and encoding polynucleotides by identifying the backbone binding domains that bind the binding molecules and encoding polynucleotides, It also modifies the remaining portion of the backbone molecule to maintain the backbone binding domain on the backbone, minimizing the interaction between the binding molecule and the encoding polynucleotide. In this way, an optimized deformation of a specific skeletal molecule can be induced.

いくつかの実施形態において、骨格はタンパク質である。とくにいくつかの実施形態において、タンパク質骨格は、結合分子に対して特異的に結合できる官能基をすでに含むように提供する。例えば、ストレプトアビジンは、ビオチンに対するその天然の親和性のために良い骨格タンパク質であり、ビオチン化ｐ／ＭＨＣ分子に対する特異性を与える。歩アノ実施例はタンパク質Ａ／Ｇである。これらのタンパク質は、抗体のＦｃ領域に対する天然の親和性を有し、後者は結合タンパク質として用いる。これは、天然の特性がないタンパク質骨格よりも有利であり、この場合、結合タンパク質およびエンコードポリヌクレオチドをカップリングする２個の化学的に直角な処理を導入する必要がある。ほとんどのタンパク質は、大きさおよび配列長さの狭い範囲内にあるため（すなわち溶解度および修飾するのに利用可能な多くの部位等の特性）、いずれのタンパク質も骨格分子として用いることができると期待できる。とくに、生体接合に対して用いる条件において安定であるタンパク質は、とくに骨格として安定であると期待される。 In some embodiments, the scaffold is a protein. In particular, in some embodiments, the protein backbone is provided to already contain a functional group that can specifically bind to the binding molecule. For example, streptavidin is a good scaffold protein because of its natural affinity for biotin and provides specificity for biotinylated p / MHC molecules. Ayano An example is protein A / G. These proteins have a natural affinity for the Fc region of antibodies, the latter being used as binding proteins. This is advantageous over a protein backbone without natural properties, in which case it is necessary to introduce two chemically orthogonal processes that couple the binding protein and the encoding polynucleotide. Most proteins are within a narrow range of sizes and sequence lengths (ie properties such as solubility and the number of sites available for modification), so any protein can be used as a backbone molecule it can. In particular, proteins that are stable under the conditions used for bioconjugation are expected to be particularly stable as scaffolds.

いくつかの実施形態において、骨格タンパク質はストレプトアビジン（ＳＡまたはＳａ）によって形成される。ストレプトアビジンは、配列HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGH DTFTKVKPSAAS （配列番号１）を有するバクテリアＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａｖｉｓｉｎｉｔからの四量体タンパク質である。ＳＡは、その天然配位子ビオチン（Ｋｄ−^{１０−１５}ｍｏｌ／Ｌ）に対して四面体的に配置した、非常に高い親和性および２個の独特の結合部位を有する。ストレプトアビジンのビオチンに対するモル結合能力は、４：１＝ビオチン：ＳＡである。ＳＡは、結合分子に特異的に結合しないが（例えばビオチン相互作用を介する）、代案のカップリング方法をＳＡに結合単位を結合させるのに用いる実施形態は、ビオチンに対してＳＡは４分の１の価数および強い相互作用を有する。特異的には、ＳＡが骨格であるいくつかの実施形態において、Ｃ末端部位は、タンパク質のＮ末端部位上のビオチンに対する結合ポケットの位置の観点からエンコードポリヌクレオチドの付着する部位として選択する。 In some embodiments, the scaffold protein is formed by streptavidin (SA or Sa). Streptavidin is the amount of the bacterial Streptomycete protein from the four Streptomyces proteins of the sequence HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGH DTFTKVKPSAAS (SEQ ID NO: 1). SA has a very high affinity and two unique binding sites arranged tetrahedrally for its natural ligand biotin (Kd- ^10-15 mol / L). The molar binding ability of streptavidin to biotin is 4: 1 = biotin: SA. Although SA does not specifically bind to the binding molecule (eg, via biotin interaction), an embodiment using an alternative coupling method to bind the binding unit to SA is 4 min SA for biotin. Has a valence of 1 and strong interaction. Specifically, in some embodiments where SA is the backbone, the C-terminal site is selected as the site for attachment of the encoded polynucleotide in terms of the location of the binding pocket for biotin on the N-terminal site of the protein.

したがって、骨格タンパク質がストレプトアビジンであるいくつかの実施形態において、結合分子（例えばＭＨＣ分子）は、ビオチン化でき、四量体をタンパク質−配位子対ＳＡと組み立てることができる。いくつかの実施形態において、結合分子はまた、共有結合を介してＳＡとカップリングでき（アミドカップリング等）、これによって、ビオチン−ＳＡ相互作用を介する必要がなくなる。当業者は、選択した実験設計に基づいた最も適切な結合を特定することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＡは、四量体にｐ／ＭＨＣを組み込むのに用いる標準的な骨格として用いる。 Thus, in some embodiments where the scaffold protein is streptavidin, the binding molecule (eg, MHC molecule) can be biotinylated and the tetramer can be assembled with the protein-ligand pair SA. In some embodiments, the binding molecule can also be coupled to SA via a covalent bond (such as amide coupling), thereby eliminating the need for biotin-SA interactions. One skilled in the art can identify the most appropriate binding based on the selected experimental design. In some embodiments of the invention, SA is used as a standard scaffold used to incorporate p / MHC into the tetramer.

骨格がＳＡである実施形態において、修飾したＳＡは、それから由来した分子としても用いることができる（とくにＳＡ−フィコビリタンパク質（ＰＥまたはＡＰＣ）複合体）。いくつかの実施形態において、骨格は、蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体準備に対するＳＡ再結合突然変異体である骨格を用いることができる。それらの実施形態のうちいくつかにおいて、ＳＡ変異体は、例えばその場所でビオチン結合ポケットから除去した、カルボキシ末端でのシステイン残基を組み込んだ変異体を用いることができる。それらの実施形態において、システイン反応性マレイミド誘導体の複合体は、システイン残基は天然ＳＡに存在しないためＣ末端に限定される。 In embodiments where the backbone is SA, the modified SA can also be used as a molecule derived therefrom (particularly the SA-phycobiliprotein (PE or APC) complex). In some embodiments, the scaffold can be a scaffold that is an SA recombination mutant for a fluorescent p / MHC tetramer preparation. In some of those embodiments, the SA variant can be a variant that incorporates a cysteine residue at the carboxy terminus, eg, removed from the biotin binding pocket at that location. In those embodiments, conjugates of cysteine-reactive maleimide derivatives are limited to the C-terminus because cysteine residues are not present in native SA.

より特別には、いくつかの実施形態において、ストレプトアビジン−システイン（ＳＡＣ）と呼ぶ、最適化したストレプトアビジンは、Ｃ末端でいくつかの外因的なアミノ酸を有するものを用いることができる。これらの残基は、誘導体化したＤＮＡ（またはいずれかの他のマレイミド−誘導化分子）をカップリングできるシステインアミノ酸を有する。ＳＡＣ骨格は、配列HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGH DTFTKVGGSGCP（配列番号２）を有する。 More specifically, in some embodiments, an optimized streptavidin, called streptavidin-cysteine (SAC), can be used that has several exogenous amino acids at the C-terminus. These residues have cysteine amino acids capable of coupling derivatized DNA (or any other maleimide-derivatized molecule). The SAC backbone has the sequence HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGH DTFTKVGGSGCP (SEQ ID NO: 2).

本発明において、参考文献をＳＡおよびＳＡＣ骨格に対してしばしば用いる。当業者は、本明細書にＳＡおよびＳＡＣではなく骨格および最適化した骨格を適用することができ、また、実施例の章によって提供されるガイダンスを参照することができる。とくに付加的な骨格タンパク質には、限定することはないが、タンパク質Ａ／Ｇ、分岐ペプチド、ＮＨＣエステルＰＥＧ−マレイミド等の小分子およびそれらの最適化した変異体がある。 In the present invention, references are often used for SA and SAC skeletons. One skilled in the art can apply skeletons and optimized skeletons rather than SA and SAC herein, and can refer to the guidance provided by the Examples section. In particular, additional backbone proteins include, but are not limited to, small molecules such as protein A / G, branched peptides, NHC ester PEG-maleimide, and optimized variants thereof.

所定の標的および予め選択した結合分子を与えたさらなる骨格および最適化した骨格は、以下のアプローチを用いて誘導し，（ａ）第１カップリング化学物質を選択して骨格に予め選択した結合分子を付着し、第２カップリング化学物質を選択して骨格にポリヌクレオチドを付着させるステップと（例えばＮＨＳ−アミンおよびチオールマレイミド化学物質）、（ｂ）候補の骨格構造を選択して、その結果できた捕捉剤の価数および極性を考察するステップと（例えば、価数を増加させるために分岐したペプチドを用いる、結合タンパク質間に空間をつくるためにグリシン−セリン伸展を用いる）、（ｃ）ポリヌクレオチドおよび結合分子を候補の骨格構造にカップリングさせて候補の捕捉剤を提供するステップと、（ｄ）経験的および随意的に所定の標的を特異的に結合させる候補の捕捉剤を試験するステップと、（ｅ）所定の標的への捕捉剤の結合親和性および／または特異性を増加させる必要があればもしくは望ましければいくつかまたはすべてのステップを反復する。最適化が望ましければ、候補の骨格を選択するステップは、予め選択した結合分子およびポリヌクレオチド間の重複を減少、とくに最小化するために骨格を修正するステップを行う、または有する。 Further scaffolds and optimized scaffolds given a given target and a preselected binding molecule are derived using the following approach: (a) a binding molecule preselected for the scaffold by selecting a first coupling chemical And attaching a polynucleotide to the backbone by selecting a second coupling chemical (eg, NHS-amine and thiolmaleimide chemicals), (b) selecting a candidate backbone structure and resulting Considering the valence and polarity of the capture agent (eg, using a branched peptide to increase valence, using glycine-serine extension to create space between binding proteins), (c) poly Coupling nucleotides and binding molecules to a candidate backbone structure to provide a candidate capture agent; (d) empirical and optional Testing candidate capture agents that specifically bind to a given target; and (e) if it is necessary or desirable to increase the binding affinity and / or specificity of the capture agent to the given target. Repeat some or all steps. If optimization is desired, the step of selecting a candidate scaffold comprises or modifies the scaffold to reduce, particularly minimize, the overlap between preselected binding molecules and polynucleotides.

ここで用いる用語「エンコードポリヌクレオチド」は、ここで説明するモジュール式捕捉剤の骨格に付着し、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態において、第１標的に特異的なモジュール式捕捉剤をエンコードするエンコードポリヌクレオチドは、とくに、第１標的が第２標的と異なるとき、第２標的に特異的な捕捉剤をエンコードするエンコードポリヌクレオチドから結合的に区別可能である。 As used herein, the term “encoding polynucleotide” is attached to the backbone of the modular capture agent described herein and is complementary to the substrate polynucleotide attached to the substrate. In some embodiments, an encoding polynucleotide that encodes a modular capture agent specific for a first target encodes a capture agent specific for a second target, particularly when the first target is different from the second target. Can be combined and distinguished from the encoding polynucleotide.

分子に関してここで用いる単語「結合的に区別可能な」は、特異的な分子に特異的に結合することができるそれらの能力に基づいて区別でき、したがって特異的な分子と相補的であると画定できる分子を示す。したがって、第１分子が第３分子と特異的に結合し第３分子と相補的であると画定でき、第２分子が第４分子と特異的に結合し第４分子と相互的であると画定でき、第４分子が第３分子と区別できれば、第１分子は第２分子と結合的に区別できる。したがって、第１エンコードポリヌクレオチドが第１基質ポリヌクレオチドと特異的に結合し（相補的であると画定でき）、第２エンコードポリヌクレオチドが第２基質ポリヌクレオチドと特異的に結合し（相互的であると画定でき）、第１基質ポリヌクレオチドが第２基質ポリヌクレオチドと区別できれば、第１および第２エンコードポリヌクレオチドは結合的に区別できる。 The word “bindingly distinguishable” as used herein with respect to molecules defines that they can be distinguished on the basis of their ability to specifically bind to a specific molecule and are therefore complementary to the specific molecule. Indicates a molecule that can. Thus, the first molecule can be defined as specifically binding to and complementary to the third molecule, and the second molecule specifically defined as binding specifically to the fourth molecule and being reciprocal with the fourth molecule. If the fourth molecule can be distinguished from the third molecule, the first molecule can be distinguished from the second molecule in a binding manner. Thus, the first encoding polynucleotide specifically binds to the first substrate polynucleotide (can be defined as complementary), and the second encoding polynucleotide specifically binds to the second substrate polynucleotide (reciprocally). If the first substrate polynucleotide can be distinguished from the second substrate polynucleotide, the first and second encoding polynucleotides can be distinguished in a combined manner.

ここで説明するアレイ基質、方法およびシステムのいくつかの実施形態において、各基質ポリヌクレオチドおよびエンコードポリヌクレオチドは、互いに結合的に区別できる。ここで説明する方法およびシステムのいくつかの実施形態において、基質の各基質ポリヌクレオチドは、特異な配列であり互いに位置的に区別可能である。 In some embodiments of the array substrates, methods and systems described herein, each substrate polynucleotide and encoding polynucleotide can be combined and distinguished from each other. In some embodiments of the methods and systems described herein, each substrate polynucleotide of the substrate is a unique sequence and is positionally distinguishable from each other.

すでに上述したように、分子に関してここで用いる単語「位置的に区別可能な」は、分子によって占領された点または範囲に基づいて区別できる分子を示す。したがって、位置的に区別可能な基質ポリヌクレオチドは、基質上の異なる点および範囲を占領し、位置的に区別可能な基質ポリヌクレオチドである。 As already mentioned above, the word “positionally distinguishable” as used herein with respect to molecules refers to molecules that can be distinguished based on points or ranges occupied by the molecule. Thus, a positionally distinguishable substrate polynucleotide is a positionally distinguishable substrate polynucleotide that occupies different points and areas on the substrate.

いくつかの実施形態において、エンコードポリヌクレオチドは、１個またはそれ以上の制限酵素に対して１個またはそれ以上の制限酵素認識部位を有する。単語「制限酵素認識部位」は、制限酵素によって認識されるヌクレオチドの特異的な配列を示す。単語「制限酵素」は、制限酵素認識部位として既知の特異的な認識のヌクレオチド配列での二本鎖または一本鎖のＤＮＡを切断するいずれかの酵素を示す。ここで説明するエンコードポリヌクレオチドにおいて含まれる例示的な制限酵素認識部位は、ＥｃｏＲＩＢａｍＨＩ，Ｎｄｅｌおよび当業者に特定できる他の酵素等に対する６塩基制限酵素認識部位がある。さらなる例示的な制限酵素認識部位には、限定することはないが、Ａｖａｌ，ＢｇＩＩＩ，ＤｒａｌＩ，ＥｃｏＲＶおよび参考文献４５において開示されたさらなる制限酵素認識部位があり、全体に参照として組み込む。 In some embodiments, the encoded polynucleotide has one or more restriction enzyme recognition sites for one or more restriction enzymes. The word “restriction enzyme recognition site” refers to the specific sequence of nucleotides recognized by the restriction enzyme. The word “restriction enzyme” refers to any enzyme that cleaves double-stranded or single-stranded DNA at a specific recognition nucleotide sequence known as a restriction enzyme recognition site. Exemplary restriction enzyme recognition sites included in the encoded polynucleotides described herein include 6 base restriction enzyme recognition sites for EcoRI BamHI, Ndel and other enzymes that can be identified by those skilled in the art. Additional exemplary restriction enzyme recognition sites include, but are not limited to, additional restriction enzyme recognition sites disclosed in Aval, BgIII, DralI, EcoRV and reference 45, which are incorporated by reference in their entirety.

いくつかの実施形態において、骨格は、結合的に区別できる捕捉剤間でそれ自体互換性があり、１個の骨格は、異なるモジュール式捕捉剤の構築において用いることができる。さらに、骨格は、一連の改良および最適化をすることができる。いくつかの実施形態において、骨格および少なくとも１個の結合分子も結合的に区別できる。 In some embodiments, the scaffolds are themselves compatible between the binding agents that are distinguishably binding, and one scaffold can be used in the construction of different modular capture agents. Furthermore, the skeleton can undergo a series of improvements and optimizations. In some embodiments, the backbone and at least one binding molecule can also be distinctly distinguished.

いくつかの実施形態において、骨格は、図１（上部パネル）の概略図において示すように放射相称を持たず、図１（下部パネル）および図２（上部右側パネル）の概略図において示すような対称の捕捉剤、または図２（上部左側パネル）の概略図において示すような疑似極性捕捉剤を有する極性の捕捉剤を提供するように設計する。 In some embodiments, the skeleton does not have a radial asymmetry as shown in the schematic diagram of FIG. 1 (upper panel), as shown in the schematic diagrams of FIG. 1 (lower panel) and FIG. 2 (upper right panel). Designed to provide a polar capture agent with a symmetric capture agent, or a pseudopolar capture agent as shown in the schematic of FIG . 2 (upper left panel).

とくに、極性捕捉剤は、結合分子ドメイン、骨格ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドの重複を最小化する捕捉剤である。疑似極性捕捉剤は、結合分子ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドドメインの小部分が互いにおよび骨格ドメインと重複する。合成捕捉剤において、すべての結合分子およびエンコードポリヌクレオチドドメインは、ある程度重複する。各極性捕捉剤、疑似極性捕捉剤および合成捕捉剤において、骨格は結合分子ドメイン、骨格分子ドメインおよびポリヌクレオチドドメインの間の特異的な捕捉剤内の重複を最小化するように最適化する。この最小化は、極性捕捉剤に対して最大である。 In particular, polar capture agents are capture agents that minimize the overlap of the binding molecule domain, the backbone domain, and the encoding polynucleotide. Pseudopolar capture agents have a small portion of the binding molecule domain and the encoding polynucleotide domain overlapping each other and the backbone domain. In synthetic capture agents, all binding molecules and encoded polynucleotide domains overlap to some extent. In each polar capture agent, pseudopolar capture agent, and synthetic capture agent, the backbone is optimized to minimize overlap within the specific capture agent between the binding molecule domain, the backbone molecule domain, and the polynucleotide domain. This minimization is maximum for polar scavengers.

したがって、いくつかの実施形態において、完全に組み立てた、極性のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、非極性捕捉剤に関して高い親和性を有することが期待され、極性捕捉剤において結合分子は対象の標的と自由に相互作用し、またエンコードポリヌクレオチドは、基質上にプリントされたｃＤＮＡと自由に相互作用する。出願人は、約「１８０度転換」の構築の結果フローサイトメトリによってアクセスされて細胞表面マーカーが染色されることが実証された。 Thus, in some embodiments, a fully assembled, polar polynucleotide-encoded capture agent is expected to have a high affinity for non-polar capture agents, where the binding molecule is free from the target of interest. And the encoded polynucleotide is free to interact with the cDNA printed on the substrate. Applicants have demonstrated that the construction of about “180 degree conversion” results in access by flow cytometry to stain cell surface markers.

とくに、出願人は、１本のＤＮＡ鎖（蛍光標識した）をＳＡＣごとに付着するようにＳＡＣ−ＤＮＡ構築物を生産した。この部分は、ＭＨＣ捕捉タンパク質（結合ドメイン）が容易に骨格に分配できるため疑似極性であるが、ＤＮＡドメインは特異である（したがって、構築物の残部と比較して極性である）（以下参照）。この構築物は、放射相称の構築物と直接比較すると、細胞表面受容体より良く結合する（１７８対１５３平均強度）（図２下部パネル参照）。 In particular, Applicants have produced SAC-DNA constructs such that one DNA strand (fluorescently labeled) is attached to each SAC. This part is pseudopolar because the MHC capture protein (binding domain) can be easily distributed to the scaffold, but the DNA domain is unique (and therefore polar compared to the rest of the construct) (see below). This construct binds better than the cell surface receptor (178 vs. 153 average intensity) when compared directly to the radiological construct (see bottom panel in FIG. 2 ).

いくつかの実施形態において、関連するエンコードポリヌクレオチドを有する単一骨格は、単一骨格を有する結合構造のライブラリを対にすることによって結合構造のライブラリを繰り返し用いることができる。それらの実施形態は、同じ骨格（ＳＡＣ−Ａ´）をＭＡＲＴ−１，ＯＶＡ，Ｐｍｅｌ，チロシナーゼ、およびＣＭＶに対して特異的なＮＡＣＳ捕捉剤として用いた図５，６，９，１２Ａ，Ｂ，１３Ｂ，１５ＡＢ，１６，１９，２２における実施例５，８，９および１０において説明する。それらの実施形態において、システムのモジュール方式および交換能力がある。 In some embodiments, a single scaffold having an associated encoding polynucleotide can repeatedly use a library of binding structures by pairing a library of binding structures having a single scaffold. These embodiments show that the same scaffold (SAC-A ′) was used as a NACS capture agent specific for MART-1, OVA, Pmel, tyrosinase, and CMV, FIGS. 5, 6, 9, 12A, B, This will be described in Examples 5, 8, 9 and 10 in 13B, 15AB, 16, 19, and 22. In those embodiments, there is modularity and exchange capability of the system.

いくつかの実施形態において、ここで説明するポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびとくに、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、結合分子を骨格にカップリングさせるのに用いる様々な長さのリンカーを有する。ここで用いる用語「リンカー」は、骨格を結合分子トカップリングさせるまたは接続するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において含まれる分子を示す。リンカーは、それを含む捕捉剤の骨格および結合分子と反応するいずれかの化学分子から由来する。例示的なリンカーには、限定することはないが、ペプチド（例えば１０ｍｅｒ）、核酸、ポリマー（ポリエチレングリコール）および炭素鎖がある。リンカーの長さは、技術知見を有する読者から明らかである、従来の化学方法によって制御する。リンカーは、当該技術の読者に明らかである従来の生体接合方法で付着することができる。 In some embodiments, the polynucleotide-encoded capture agents described herein, and in particular, the modular polynucleotide-encoded capture agents described herein, have different length linkers used to couple the binding molecule to the backbone. Have. As used herein, the term “linker” refers to a molecule comprised in a modular polynucleotide encoded capture agent that couples or connects the backbone to the binding molecule. The linker is derived from any chemical molecule that reacts with the scaffold of the capture agent containing it and the binding molecule. Exemplary linkers include, but are not limited to, peptides (eg, 10 mer), nucleic acids, polymers (polyethylene glycol), and carbon chains. The length of the linker is controlled by conventional chemical methods that will be apparent to the reader with technical knowledge. The linker can be attached by conventional bioconjugation methods that will be apparent to those skilled in the art.

それらの実施形態において、リンカーの含有物は、対象の標的と適切な相互作用する結合タンパク質の自由度を増加させることが期待される。これは、適切な空間方向が高い親和性の相互作用に関して重要である特定のドメインにおいて標的が固定または限定されたとき（例えば、細胞膜に限定された標的細胞表面）相互作用の強度を増加させることが期待される。 In those embodiments, the inclusion of the linker is expected to increase the freedom of the binding protein to properly interact with the target of interest. This increases the strength of the interaction when the target is fixed or confined in a specific domain where the appropriate spatial orientation is important for high affinity interactions (eg target cell surface confined to the cell membrane) There is expected.

いくつかの実施形態において、リンカーはまた、結合分子および含まれるエンコードポリヌクレオチドの間のスペーサとして機能し、結合分子ドメインおよびポリヌクレオチドドメインが互いに干渉しないようにする。例示的なリンカーには、限定することはないが、５０Ｄａ〜５０００Ｄａの大きさの分子がある。 In some embodiments, the linker also functions as a spacer between the binding molecule and the encoded polynucleotide included so that the binding molecule domain and the polynucleotide domain do not interfere with each other. Exemplary linkers include, but are not limited to, molecules between 50 Da and 5000 Da in size.

いくつかの実施形態において、さらに以下で議論するリンカーは、制御された刺激の観点において配座を変化させる従来のリンカーである。 In some embodiments, the linkers discussed further below are conventional linkers that change conformation in terms of controlled stimulation.

いくつかの実施形態において、標的に対する捕捉剤の親和性は、多くの結合単位が１個の骨格にカップリングすることによって増加する。捕捉剤の価数の増加は、互いに隣り合うものが結合するときに参入するために集合錯体の親和性を改良し、実施例５および図７，８および９において説明するように、正味の影響が標的のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤をの全体の関係性において増加する。これは、とくに、モノマーとして標的細胞に対して弱い親和性を有することによって特徴づけられるが、マルチマーにおいて束ねるときに親和性を増加させるＭＨＣ等の結合分子に関連がある。 In some embodiments, the affinity of the capture agent for the target is increased by coupling many binding units to one backbone. Increasing the valence of the scavenger improves the affinity of the assembly complex to enter when adjacent ones bind, and has a net effect as illustrated in Example 5 and FIGS. 7, 8 and 9. Increases in the overall relationship of the target polynucleotide-encoded capture agent. This is particularly characterized by having a weak affinity for the target cell as a monomer, but is related to binding molecules such as MHC that increase the affinity when bundled in multimers.

結合分子が低い親和結合タンパク質によって形成される実施形態において、標的に対する捕捉剤の高い親和性は、標的に効率的に結合するのに必要である。分子配座の就職に関する親和性の変化は、それぞれの相補的な標的へのポリヌクレオチドエンコード分子の相互作用を時間的に制御されるように利用される。例えば、いくつかの細胞表面受容体は、相補的な配位子を結合するときに細胞活性を制御する機能を有する（受容体が特異的である分子）。この活性は、配位子が受容体に結合しないときに逆になるまたは回復する。したがって、結合分子の骨格からの分離および多価の性質を利用することによって、従来のリンカーを用いることによって結合を制御することができる−リンカーは、外因性の外部刺激に応じて構造変化をし、その結果、捕捉剤の結合親和性のために親和性が減少する−また、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤のその後の不活性により標的に結合したままとなる。従来のリンカーの実施例は、Ｗ光に露呈したときに破壊するＷ不安定塩基を組み込んだペプチドまたは核酸である。実際のこの実施例は、Ｗ不安定ペプチドリンカーを介してＳＡＣ−ＤＮＡ骨格にカップリングしたｐ／ＭＨＣタンパク質を用いる。Ｔ細胞受容体に結合するとき捕捉剤は、標的細胞を活性化する。ポリヌクレオチドエンコードｐ／ＭＨＣ捕捉剤は、その後Ｗ光に露呈することによって所定の時間後に除去できる。 In embodiments where the binding molecule is formed by a low affinity binding protein, a high affinity of the capture agent for the target is necessary to efficiently bind to the target. The change in affinity for employment of the molecular conformation is exploited such that the interaction of the polynucleotide-encoded molecule to each complementary target is temporally controlled. For example, some cell surface receptors have the function of controlling cellular activity when binding complementary ligands (molecules for which the receptor is specific). This activity is reversed or restored when the ligand does not bind to the receptor. Thus, by taking advantage of the separation from the backbone of the binding molecule and the multivalent nature, binding can be controlled by using conventional linkers-linkers undergo structural changes in response to exogenous external stimuli. As a result, the affinity is reduced due to the binding affinity of the capture agent-and also remains bound to the target due to subsequent inactivation of the polynucleotide encoded capture agent. Examples of conventional linkers are peptides or nucleic acids that incorporate a W labile base that breaks when exposed to W light. This actual example uses a p / MHC protein coupled to the SAC-DNA backbone via a W labile peptide linker. The capture agent activates the target cell when bound to the T cell receptor. The polynucleotide encoded p / MHC scavenger can then be removed after a predetermined time by exposure to W light.

いくつかの実施形態において、ここで説明するポリヌクレオチドエンコード捕捉剤には、互いに結合的に区別可能な多重結合分子がある。それらの実施形態において、多座配位子エンコード捕捉剤は、同時に多くの標的を調べるのに用いることができる。これは、活性の上昇（上述したように）は、複合体の親和性が個々の結合タンパク質の親和性よりも高いこのシステムに等しく適用するため、標的が細胞表面上のようにドメイン内に組み込まれているときに最も有利である。多座配位子エンコード捕捉剤の実施例には、各タンパク質が異なるペプチド配列から成るｐ／ＭＨＣ複合体がある。他の組み合わせは、ＡｂＡｂ，Ａｂペプチド、Ａｂアパタマー、ペプチドアプタマー、および本発明を読む当業者によって特定可能なさらなる分子等がある。 In some embodiments, the polynucleotide-encoded capture agents described herein include multiple binding molecules that are bindably distinguishable from each other. In those embodiments, the multidentate ligand-encoded capture agent can be used to study many targets simultaneously. This is because increased activity (as described above) applies equally to this system where the affinity of the complex is higher than the affinity of the individual binding proteins, so that the target is incorporated into the domain as on the cell surface. It is most advantageous when Examples of multidentate ligand-encoded capture agents include p / MHC complexes where each protein consists of a different peptide sequence. Other combinations include Ab Ab, Ab peptides, Ab aptamers, peptide aptamers, and additional molecules that can be identified by those skilled in the art reading the present invention.

ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、当業者に特定可能な手順に従った特異的な捕捉および実験設計の観点から単位を結合することによって製造することができる。例えば、結合分子が骨格に特異的に結合する実施形態において、エンコードポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）は、結合分子（例えばＭＨＣ）を組み込む前に骨格（例えばＳＡＣ）に最初にカップリングされる。他の実施形態において、結合分子が骨格に特異的に結合しない、結合単位は共有結合的に付着する必要がある。これは、ポリヌクレオチドの骨格への付着前後のいずれかで起こる。ここで説明するモジュール式捕捉剤を他の骨格および結合分子に組み込むさらなる手順は、当該技術の読者に容易に特定できる。それらの手順は、結合タンパク質単位の特異性がポリヌクレオチド配列によって独特にエンコードされる必要がある限り、試薬を組み込む順序に関わらずここで説明する捕捉剤を組み込むのに適切である。 The modular polynucleotide-encoded capture agents described herein can be made by combining units in terms of specific capture and experimental design according to procedures identifiable to those skilled in the art. For example, in embodiments where the binding molecule specifically binds to the backbone, the encoding polynucleotide (eg, DNA) is first coupled to the backbone (eg, SAC) prior to incorporating the binding molecule (eg, MHC). In other embodiments, the binding unit needs to be covalently attached, where the binding molecule does not specifically bind to the scaffold. This occurs either before or after attachment of the polynucleotide to the backbone. Additional procedures for incorporating the modular capture agents described herein into other scaffolds and binding molecules can be readily identified by those skilled in the art. These procedures are appropriate for incorporating the capture agents described herein, regardless of the order in which the reagents are incorporated, as long as the specificity of the binding protein unit needs to be uniquely encoded by the polynucleotide sequence.

骨格がストレプトアビジンである、いくつかの実施形態において、モジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質は、ビオチン化ＭＨＣ分子を市販のストレプトアビジン（ＳＡ）と通常４：１の割合で酵素的に混合することによって準備し、ストレプトアビジンは通常、蛍光染色分子に接合する。フローサイトメトリに基づいた細胞分類に対してＭＨＣ四量体を改善することに焦点を当てたこの手順の種類は、当業者によって特定できる。 In some embodiments where the scaffold is streptavidin, the modular polynucleotide-encoded protein is prepared by enzymatically mixing biotinylated MHC molecules with commercially available streptavidin (SA), usually in a 4: 1 ratio. However, streptavidin is usually conjugated to a fluorescent staining molecule. The type of this procedure that focuses on improving MHC tetramers relative to cell sorting based on flow cytometry can be identified by those skilled in the art.

例えば、いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、タンパク質−配位子相互作用（ストレプトアビジンビオチン）、タンパク質−タンパク質相互作用（Ｆｃドメインおよびタンパク質Ａ／Ｇ）、または生体接合方法（アミンカップリング、スルヒルジルカップリングなど）を介して接着する。結合分子がＭＨＣであるいくつかの実施形態において、ＭＨＣはＣ末端でビオチン化する。骨格がＳＡＣであるいくつかの実施形態において、ＳＡＣはＣ末端でＤＮＡ修飾する。いくつかの実施形態において、全単位はビオチン−ＭＨＣをＳＡＣ−ＤＮＡでいっぱいにすることによって組み込み、ＳＡＣはビオチンを介して４ＭＨＣタンパク質分子と特異的に結合する。 For example, in some embodiments, the binding protein is a protein-ligand interaction (streptavidin biotin), a protein-protein interaction (Fc domain and protein A / G), or a bioconjugation method (amine coupling, Glue through sulhilyl coupling). In some embodiments where the binding molecule is MHC, the MHC is biotinylated at the C-terminus. In some embodiments where the backbone is SAC, the SAC is DNA modified at the C-terminus. In some embodiments, all units incorporate by filling biotin-MHC with SAC-DNA, and SAC specifically binds to 4MHC protein molecules via biotin.

エンコードポリヌクレオチドのここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤との接合は、結合するタンパク質における１級アミンの存在に依存する技術がある化学的架橋結合等の一般的な生体接合方法で生成する。とくに、ポリヌクレオチドエンコードタンパク質は、全体に参照して組み込むＰＣＴ特許ＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明されたもの等の共有結合接合方法によって生成する。とくに、化学的接合は、骨格タンパク質およびポリヌクレオチド間の共有結合を生成するのに用いて、それらには、ＮＨＳ−アミンカップリング、チオール−チオールカップリング、チオール−マレイミドカップリング、ヒドラジド−アルデヒドカップリングなどがある。これらの生体接合方法は、当該技術の当業者によって証明される。 The conjugation of the encoded polynucleotide to the modular polynucleotide encoded capture agent described herein is generated by common bioconjugation methods such as chemical cross-linking, which have techniques that depend on the presence of primary amines in the protein to be bound. . In particular, the polynucleotide-encoded protein is produced by covalent conjugation methods such as those described in PCT patent WO2008 / 016680, which is incorporated by reference in its entirety. In particular, chemical conjugation is used to generate covalent bonds between scaffold proteins and polynucleotides, including NHS-amine coupling, thiol-thiol coupling, thiol-maleimide coupling, hydrazide-aldehyde cupping. There are rings. These bioconjugation methods are proven by those skilled in the art.

特定のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤と接合するエンコードポリヌクレオチドの数は様々である。とくに、タンパク質部位に付着したポリヌクレオチドの数は、大きさおよびそれによって懸垂部分の立体障害を最小化するように調節するが、結合特異性を維持する。最適化は、全体に参照して組み込むＰＣＴ特許ＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明された手順の方法によって行う（とくに図３および実施例３参照）。それらの実施形態において、捕捉剤の最適化は、捕捉剤の最適化を化学的に進行する（すなわち捕捉剤（例えば抗体）との小分子の化学量論的反応量を変化させる）。 The number of encoded polynucleotides that are conjugated to a particular polynucleotide encoded capture agent varies. In particular, the number of polynucleotides attached to a protein site is adjusted to minimize size and thereby steric hindrance of the suspended portion, but maintain binding specificity. Optimization is performed by the method of procedures described in PCT patent WO2008 / 016680, which is incorporated by reference in its entirety (see in particular FIG. 3 and Example 3). In those embodiments, capture agent optimization proceeds chemically with capture agent optimization (ie, changes the stoichiometric amount of small molecules with the capture agent (eg, antibody)).

いくつかの実施形態において、各タンパク質に付着するエンコードポリヌクレオチドの数は１〜６または６より大きいいずれかとする。いくつかの実施形態において、細胞分類等は、骨格ごとに１〜４個のエンコードポリヌクレオチドを付着すると、標識化の立体効果を最小化するさらなる利点を与え、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を相補的な基質ポリヌクレオチドと高親和性でハイブリダイゼーションする複数のエンコードポリヌクレオチドで標識化することができる。 In some embodiments, the number of encoding polynucleotides attached to each protein is either 1-6 or greater than 6. In some embodiments, such as cell sorting, attaching 1-4 encoded polynucleotides per backbone provides the additional benefit of minimizing the steric effects of labeling and complementing the polynucleotide encoded capture agents. It can be labeled with multiple encoding polynucleotides that hybridize with high affinity to the substrate polynucleotide.

懸垂部分を形成するポリヌクレオチドの長さも、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の基質への結合を最適化する様に制御する。とくに、エンコードポリヌクレオチドの長さは、直交化させるために最適化する。それらの実施形態において、エンコード領域は２０ｍｅｒ認識配列を有する。これらは、全体に参照して組み込むＰＣＴ特許ＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明された手順の方法に従ってコンピュータ内で生成した。とくに、実施例において説明する制限酵素認識部位を有する配列は、全体に参照して組み込むＰＣＴ特許ＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明された手順の方法に従って最初に生成した配列に６塩基の切断部位を加えることによって生成した。 The length of the polynucleotide that forms the suspension is also controlled to optimize the binding of the polynucleotide-encoded capture agent to the substrate. In particular, the length of the encoding polynucleotide is optimized for orthogonalization. In those embodiments, the encoding region has a 20mer recognition sequence. These were generated in a computer according to the method of procedures described in PCT patent WO 2008/016680, which is incorporated by reference in its entirety. In particular, a sequence having a restriction enzyme recognition site described in the Examples has a 6 base cleavage site in the sequence initially generated according to the procedure described in PCT Patent WO2008 / 016680, which is incorporated by reference in its entirety. Generated by adding.

基質ポリヌクレオチドは、当該技術において既知の技術によって生成する。例えば、まずポリヌクレオチドは化学的に合成する。ポリヌクレオチドは、その後ＳｔａｎｆｏｒｄのＰａｔＢｒｏｗｎによって概要が説明されたパラダイムに従って固定する［参考文献４６］。そのように生成した基質ポリヌクレオチドは、その後、本発明を読む当業者によって特定可能な技術に従って基質に付着する。とくに、基質ポリヌクレオチドの生成に適切なポリヌクレオチドは、ポリリジン基質上に少なくとも７５ｍｅｒを有する。 Substrate polynucleotides are produced by techniques known in the art. For example, a polynucleotide is first chemically synthesized. The polynucleotide is then immobilized according to the paradigm outlined by Stanford's Pat Brown [Ref. 46]. The substrate polynucleotide so produced is then attached to the substrate according to techniques identifiable by those skilled in the art reading the present invention. In particular, suitable polynucleotides for the production of substrate polynucleotides have at least 75 mer on the polylysine substrate.

いくつかの実施形態において、エンコードポリヌクレオチドおよび／または基質ポリヌクレオチドを直交化して、エンコードポリヌクレオチドおよび基質ポリヌクレオチドの間の非特異的結合を最小化する。したがって、直交化したポリヌクレオチドには、配列が計算的に生成して不完全な塩基対、準安定状態および／または他の第２構造を最小化して、ポリヌクレオチド間の非特異的な相互作用および関連配列の乱雑な生成に通常関連するポリヌクレオチドにおける非線形第２相互作用を最小化する、ポリヌクレオチドがある。 In some embodiments, the encoding polynucleotide and / or substrate polynucleotide is orthogonalized to minimize non-specific binding between the encoding polynucleotide and the substrate polynucleotide. Thus, orthogonalized polynucleotides can produce non-specific interactions between polynucleotides by computationally generating sequences to minimize incomplete base pairs, metastable states, and / or other secondary structures. There are polynucleotides that minimize non-linear second interactions in polynucleotides that are normally associated with random generation of related sequences.

一連のポリヌクレオチドが計算的に生成するプロセスに関してここで用いる用語「直交化」は、不完全な塩基対、準安定状態および他の第２構造が最小化して、ポリヌクレオチドはその相互的ならせん構造にのみ結合し他には結合しない。本発明において用いる例示的な直交化技術には、全体に参照して組み込むＤｉｒｋｓらによって概論が説明されたパラダイム［参考文献４７］に従って行う直交化がある。 The term “orthogonalization”, as used herein with respect to the process by which a series of polynucleotides are computationally generated, refers to the imperfect base pairing, metastable state, and other secondary structures that minimize the polynucleotide Join only to the structure and not the other. Exemplary orthogonalization techniques used in the present invention include orthogonalization performed according to the paradigm [reference 47] outlined by Dirks et al., Which is incorporated by reference in its entirety.

とくに、いくつかの実施形態において、エンコードポリヌクレオチドおよび関連する相補的な基質ポリヌクレオチドは、実施例６および図５，６，９−１３，１５，１７，１９，２２において詳細を説明するポリヌクレオチドＡ，ＢおよびＣおよび実施例７および図１６において説明するポリヌクレオチドＡＥｃｏＲＩ．ＢＢａｍＨＩ等のポリヌクレオチドを直交化する。 In particular, in some embodiments, the encoding polynucleotide and related complementary substrate polynucleotides are polynucleotides described in detail in Example 6 and FIGS. 5 , 6, 9-13 , 15 , 17 , 19 , 22. A, B and C and the polynucleotide AEcoRI.1 described in Example 7 and FIG . A polynucleotide such as BBamHI is orthogonalized.

さらに直交化したポリヌクレオチドは、さらに、本明細書を読む当業者に明らかな手順に従ったポリヌクレオチドのコンピュータ内直交化（すなわち計算した直交化）等の方法および手順によって特定する。 Further orthogonalized polynucleotides are further identified by methods and procedures, such as in-computer orthogonalization of polynucleotides (ie, calculated orthogonalization) according to procedures apparent to those of skill in the art reading this specification.

結合分子としてＭＨＣを用いるここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、全体に参照して組み込む［参考文献３３］において広く説明された手順を用いて製造する。この手順に従って、ｐ／ＭＨＣタンパク質分子のライブラリは、制御された刺激を通して就職可能な犠牲ペプチドを最初に合成することによって生成する。例えば、いくつかの実施形態において、この犠牲ペプチドはニトロ−フェニル側鎖を有する非天然アミノ酸を含む。この官能基は、Ｗ不安定であり；Ｗが存在すると、犠牲ペプチドは２個の小ペプチドに開裂する。したがって、犠牲ペプチドを与えるｐ／ＭＨＣを生成し、全複合体をＷ光に露呈することができるが、後者は過剰モルの交換ペプチドを含む溶液において行う。Ｗ光上で、犠牲ペプチドは２個に開裂し、全長交換ペプチドを置換し、ＭＨＣは高い親和性を有する。ペプチドのライブラリを用いることによって、１つのＵＶ交換ステップにおいて大きなｐ／ＭＨＣライブラリを生成することができる。 The modular polynucleotide encoded capture agent described herein using MHC as the binding molecule is prepared using the procedure broadly described in [33] incorporated by reference in its entirety. According to this procedure, a library of p / MHC protein molecules is generated by first synthesizing a sacrificial peptide that can be employed through controlled stimulation. For example, in some embodiments, the sacrificial peptide comprises an unnatural amino acid having a nitro-phenyl side chain. This functional group is W unstable; in the presence of W, the sacrificial peptide is cleaved into two small peptides. Thus, p / MHC can be generated that gives the sacrificial peptide and the entire complex can be exposed to W light, but the latter is done in a solution containing an excess molar exchange peptide. On W light, the sacrificial peptide is cleaved into two, replacing the full-length exchange peptide, and MHC has a high affinity. By using a library of peptides, a large p / MHC library can be generated in one UV exchange step.

ここで説明する方法およびシステムは、モノ−パラメータ分析および多パラメータ分析等の標的の検出分析を行うために使用し、これらすべては多重分析として行うことができる。 The methods and systems described herein are used to perform target detection analysis such as mono-parameter analysis and multi-parameter analysis, all of which can be performed as a multiplex analysis.

ここで用いる用語「モノパラメータ」は、１個の標的の存在、非存在または量を画定するのに行う分析を示す。用語「マルチパラメータ」は、複数の標的の存在、非存在または量を画定するのに行う分析を示す。用語「多重」または「多重化」分析は、例えば多重分析の検体の刺激分析等の多重分析反応が１個の反応チャンバにおいて行われるおよび／または単一に分離して検出フォーマットで分析する分析を示す。 As used herein, the term “monoparameter” refers to the analysis performed to define the presence, absence or amount of a target. The term “multi-parameter” refers to the analysis performed to define the presence, absence or amount of multiple targets. The term “multiplexed” or “multiplexed” analysis refers to an analysis in which multiple analytical reactions, such as, for example, stimulus analysis of multiple analytical analytes, are performed in a single reaction chamber and / or separated in a single detection format. Show.

いくつかの実施形態において、ここで説明する方法およびシステムは、有利には、検出する標的が予め画定した疾患に関連する予め画定したバイオマーカーである診断分析をするのに用いることができる。それらの実施形態は、とくに、異なる生体材料および生体分子を一般的に不均一の組織サンプルの異なる領域からそれぞれ測定し、定量するのが難しい不可避のノイズ源を導く診断アプローチにおいて有利である。 In some embodiments, the methods and systems described herein can be advantageously used for diagnostic analysis where the target to be detected is a predefined biomarker associated with a predefined disease. These embodiments are particularly advantageous in diagnostic approaches that lead to inevitable noise sources that are difficult to measure and quantify different biomaterials and biomolecules from different regions of a generally heterogeneous tissue sample, respectively.

ここで説明する方法およびシステムのいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および基質ポリヌクレオチドは図３，４，１２において概略的に示したように組み合わせて用いる。 In some embodiments of the methods and systems described herein, a polynucleotide-encoded capture agent and a substrate polynucleotide are used in combination as shown schematically in FIGS .

図３，４，２１において示した実施形態において、タンパク質アレイからのここで説明したポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、サンプルにおいて標的を検出するために標的に接触させる。図３，４，２１の実施形態は、タンパク質標的を検出および／または分類するのにとくに有利である。 In the embodiment shown in FIGS. 3 , 4 , and 21 , the polynucleotide encoded capture agent described herein from the protein array is contacted with a target to detect the target in the sample. The embodiments of FIGS. 3, 4, and 21 are particularly advantageous for detecting and / or classifying protein targets.

さらなる実施形態において、細胞標的を検出および／または分類するのにとくに適切である、いくつかのまたはすべてのモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード抗体を相補的な基質ポリヌクレオチドに接触させる前に、サンプルに接触させる。それらのさらなる実施形態において、抗体および１個またはそれ以上の関連する標的は、基質が存在しない、例えば溶液相において結合し、両分子は、完全に方向的に自由であり、親和剤の結合部位に対する標的のアクセスは、基質によって害することがない。さらに、行う分析の感度および特異性は、当該技術の関連する方法およびシステムと比較して、基質に結合したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード標的複合体の検出能も改善する。いくつかの上述の利点を示す例示的な実施形態は、図１２および図１７において示す。 In further embodiments, some or all of the modular polynucleotide-encoded capture agents that are particularly suitable for detecting and / or classifying cellular targets, convert the modular polynucleotide-encoded antibody into a complementary substrate polynucleotide. Contact the sample before contacting. In those further embodiments, the antibody and one or more related targets bind in the absence of substrate, eg, in the solution phase, and both molecules are completely directional free and the binding site of the affinity agent. Target access to is not harmed by the substrate. Furthermore, the sensitivity and specificity of the analysis performed also improves the detectability of the modular polynucleotide-encoded target complex bound to the substrate compared to related methods and systems of the art. An exemplary embodiment showing some of the above advantages is shown in FIGS. 12 and 17 .

いくつかの実施形態において、多くの細胞種類は、骨格が異なるポリヌクレオチドでエンコードするようにカップリングするタンパク質結合剤のライブラリを用いることによってアレイ上で分類して、それぞれの異なるタンパク質結合剤の特異性は、異なるＤＮＡ配列でエンコードする。実際に行うこのアプローチの実施例は、実施例８〜１１および図５ｂ，１２ｂ，１５ｂ，１６において示す。 In some embodiments, many cell types are sorted on the array by using a library of protein binders that couple to encode the backbone with different polynucleotides, and the specificity of each different protein binder. Sex encodes with different DNA sequences. Examples of this approach in practice are shown in Examples 8-11 and FIGS. 5b, 12b, 15b, 16 .

ここで説明する方法およびシステムのいくつかの実施形態において、基質に結合するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード標的複合体は最終的に基質から検出する。 In some embodiments of the methods and systems described herein, the modular polynucleotide-encoded target complex that binds to the substrate is ultimately detected from the substrate.

いくつかの実施形態において、複合体の検出は、標識化した分子を提供することによって行い、それらには、検出するモジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質標的複合体に特異的に結合するいずれかの分子（例えば、抗体、アパタマー、ペプチドなど）および標識化シグナル、分子に付着する標識化化合物を提供する標識がある。標識化した分子は、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤複合体に接触し、基質上のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤複合体に結合した標識化合物からの標識化シグナルは、本発明、とくに実施例の章を読む当業者によって特定可能な手順に従って検出する。 In some embodiments, detection of the complex is performed by providing a labeled molecule, which includes any molecule that specifically binds to the modular polynucleotide-encoded protein target complex to be detected ( For example, antibodies, aptamers, peptides, etc.) and labeling signals, labels that provide a labeled compound attached to the molecule. The labeled molecule is contacted with the polynucleotide-encoded capture agent complex, and the labeling signal from the labeled compound bound to the polynucleotide-encoded capture agent complex on the substrate is the same as that described in the section of the invention, particularly the examples. Detect according to a procedure identifiable by the vendor.

１個またはそれ以上の標的および／または複数の標的を以下で詳細に説明するように検出する実施形態において、標識化分子は、複数の標識化分子からなる。それぞれの標識化分子は、１個またはそれ以上の標的／複数の標的のうち１個の標的を特異的に結合する分子および分子に付着した標識化合物があり、標識化合物は標識化シグナルを提供し、それぞれの標識化分子は他のものから検出的に区別できる。 In embodiments in which one or more targets and / or multiple targets are detected as described in detail below, the labeled molecule consists of a plurality of labeled molecules. Each labeled molecule has a molecule that specifically binds one target of one or more targets / multiple targets and a labeled compound attached to the molecule, wherein the labeled compound provides a labeling signal. Each labeled molecule is detectably distinguishable from the others.

標識化分子に関してここで用いる単語「検出的に区別できる」は、分子に付着した標識化合物によって与えられた標識化シグナルの材料に基づいて検出可能な分子を示す。検出的に区別可能な標識化分子を提供するのに用いることができる例示的な標識化合物には、限定することはないが、放射性同位体、フルオロフォア（蛍光色素分子）、化学発光染色、発色団、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、染色、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、配位子（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン）および本発明を読む当業者によって特定可能なさらなる化合物がある。 The word “detectably distinguishable” as used herein with respect to a labeled molecule refers to a molecule that is detectable based on the material of the labeled signal provided by the labeled compound attached to the molecule. Exemplary labeling compounds that can be used to provide detectably distinguishable labeled molecules include, but are not limited to, radioisotopes, fluorophores (fluorescent dye molecules), chemiluminescent staining, color development Groups, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, staining, metal ions, nanoparticles, metal sols, ligands (biotin, avidin, streptavidin or hapten) and identifiable by those skilled in the art reading the present invention There are additional compounds.

いくつかの実施形態において、複数の標識化分子は、複数のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を複数の標識化分子に結合させることができる時間および条件で複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体に接触させる。標識化シグナルは、その後、基質上の複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体に結合する複数の標識化分子から検出する。 In some embodiments, the plurality of labeled molecules are a plurality of modular polynucleotide encoded capture agents at times and conditions that allow a plurality of polynucleotide encoded capture agent-target complexes to bind to the plurality of labeled molecules. -Contact the target complex. The labeled signal is then detected from a plurality of labeled molecules that bind to a plurality of modular polynucleotide-encoded capture agent-target complexes on the substrate.

いくつかの実施形態において、検出方法は、蛍光ベースの読み出しを介して行い、標識化抗体は、限定することはないが、小分子染色、タンパク質発色団、量子ドットおよび金ナノ粒子等のフルオロフォアで標識化する。とくに、いくつかの実施形態において、ここで説明するいずれの方法およびシステムにおいて、検出は、一般的な写真現像液がさらに以下で説明するように金ナノ粒子を増幅することができる金ナノ粒子標識化二次検出システム上で行う。また、読み出しが金粒子の暗場散乱から行われるとき、単一分子デジタルプロテオームができる。さらなる技術は、本発明を読む当業者によって特定でき、詳細はさらに説明しない。 In some embodiments, the detection method is performed via a fluorescence-based readout and the labeled antibody is a fluorophore such as, but not limited to, small molecule staining, protein chromophores, quantum dots and gold nanoparticles. Label with. In particular, in some embodiments, in any of the methods and systems described herein, the detection is a gold nanoparticle label that can amplify gold nanoparticles as described below in a typical photographic developer. On a secondary detection system. Also, a single molecule digital proteome is possible when readout is done from dark field scattering of gold particles. Additional techniques can be identified by those skilled in the art reading the present invention and will not be described in further detail.

複合体または分子の成分としてここで示す用語「標識化分子」は、限定することはないが、放射性同位体、フルオロフォア（蛍光色素分子）、化学発光染色、発色団、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、染色、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、配位子（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン）およびそのようなものがある、検出できる分子を示す。用語「フルオロフォア」は、検出可能な画像において蛍光を示すことができるそれらの基質または部位を示す。結果として、ここで用いる単語「標識化シグナル」は、限定することはないが、放射能、蛍光、化学発光、酵素反応の結果における化合物の生成などがある標識の検出ができる標識から出たシグナルを示す。とくに金ナノ粒子は、検出複合体を金ナノ粒子に結合するサンドウィッチ式検出分析において用いることができる。これは、検出細胞が伝統的な顕微鏡技術を用いて簡単に行うように、タンパク質、ペプチドなどの小分子の検出において明らかである。 The term “labeled molecule” shown here as a component of a complex or molecule includes, but is not limited to, radioisotopes, fluorophores, chemiluminescent stains, chromophores, enzymes, enzyme substrates, enzymes Identifies molecules that can be detected, including cofactors, enzyme inhibitors, staining, metal ions, nanoparticles, metal sols, ligands (biotin, avidin, streptavidin or haptens) and the like. The term “fluorophore” refers to those substrates or sites that can exhibit fluorescence in a detectable image. As a result, the word “labeling signal” as used herein is not limited to a signal from a label that can detect a label, such as radioactivity, fluorescence, chemiluminescence, or the formation of a compound in the result of an enzymatic reaction. Indicates. In particular, the gold nanoparticles can be used in a sandwich detection analysis in which the detection complex is bound to the gold nanoparticles. This is evident in the detection of small molecules such as proteins, peptides, etc., as the detection cells do simply using traditional microscopy techniques.

いくつかの実施形態において、１個の特異的な標的を検出する。それらの実施形態において、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の標的への接触は、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を基質に接触させる前または後に行う。とくに、モジュール式捕捉剤を形成する単位は、単一の反応混合物において接触する。しかし、このアプローチは、骨格および結合分子および骨格およびエンコードポリヌクレオチド（通常すでに特異的である）間の結合特異性を必要とする。 In some embodiments, one specific target is detected. In those embodiments, contacting the modular polynucleotide-encoded capture agent with the target occurs before or after contacting the polynucleotide-encoded capture agent with the substrate. In particular, the units forming the modular scavenger contact in a single reaction mixture. However, this approach requires binding specificity between the backbone and the binding molecule and the backbone and the encoding polynucleotide, which is usually already specific.

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の標的への接触を、モジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質を基質に接触させる前に行う実施形態は、とくに細胞を分類または検出するのに適切である。このアプローチは、実施例１２および図１７において説明する。 Embodiments where the modular polynucleotide-encoded capture agent is contacted with the target prior to contacting the modular polynucleotide-encoded protein with the substrate are particularly suitable for classifying or detecting cells. This approach is illustrated in Example 12 and FIG .

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の標的への接触を、モジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質を基質に接触させる後に行う実施形態は、とくに高感度のタンパク質を分類または検出するのに適切である。 Embodiments where the modular polynucleotide-encoded capture agent is contacted with the target after contacting the modular polynucleotide-encoded protein with the substrate are particularly suitable for classifying or detecting highly sensitive proteins.

ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の標的への接触を、ポリヌクレオチドエンコードタンパク質を基質に接触させる後に行う例示的な実施形態は、実施例３，７，８，９，１０，１１において説明し、図５〜６，９〜１３，１５〜１６，１９，２２において示す。それらの実施形態において、標的に結合したポリヌクレオチドエンコードタンパク質および標的に結合していないポリヌクレオチドエンコードタンパク質の間の同じ特異的基質ポリヌクレオチドの競争が減少して、分析の感度が結果として増加する。さらに、それらの実施形態において、基質上のポリヌクレオチドの濃度を最適化して、高濃度のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を基質に結合させて、逆にその結果正しく組み込んだ複合体が高濃度となり、逆に、各結合を決める平衡熱力学によって全検出感度が高くなる。 Exemplary embodiments in which contact of the polynucleotide-encoded capture agent to the target is performed after contacting the polynucleotide-encoded protein with the substrate are described in Examples 3, 7, 8, 9, 10, 11, and FIGS. 6 , 9 to 13 , 15 to 16 , 19 , and 22 . In those embodiments, competition for the same specific substrate polynucleotide between a polynucleotide-encoded protein that is bound to the target and a polynucleotide-encoded protein that is not bound to the target is decreased, resulting in increased sensitivity of the analysis. Furthermore, in those embodiments, the concentration of the polynucleotide on the substrate is optimized to allow a high concentration of polynucleotide-encoded capture agent to bind to the substrate, resulting in a high concentration of the complex that is correctly incorporated. In addition, the total detection sensitivity is increased by the equilibrium thermodynamics that determine each bond.

図５ａ、６，９−１１，１２Ａｃ，１３ｂ，１５ａｂ，１７ｂ，１９，２２および実施例１，７−１０において説明した方法およびシステムで行うモノパラメータ分析には、限定することはないが、血清における単一マーカーに対する検出、生体サンプルにおける単一タンパク質検出、１個の表面マーカーに従った細胞分類に対するいずれかの分析、および本明細書を読む当業者によって特定可能な更なる分析がある。 Monoparameter analysis performed with the methods and systems described in FIGS. 5a, 6, 9-11, 12Ac, 13b, 15ab, 17b, 19, 22 and Examples 1, 7-10 includes, but is not limited to, serum There are detections for single markers in, detection of single proteins in biological samples, any analysis on cell classification according to a single surface marker, and further analysis that can be identified by one of ordinary skill in the art reading this specification.

とくに、モノパラメータ分析は、サンプルＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞または抗原特異性Ｔ細胞（すなわち、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によってもう片方から区別可能な細胞で、それらに抗原特異性を与える）における検出を行う。 In particular, monoparameter analysis is performed on sample CD8 cells, CD4 cells or antigen-specific T cells (ie, cells that are distinguishable from the other by their T cell receptor (TCR), giving them antigen specificity). Perform detection.

いくつかの実施形態において、複数の標的の検出は、実施例３，８，１０および１１および図３−６，１２ｂ，１５ｂ，１６，２２において概略的に示される方法によって行う。 In some embodiments, the detection of multiple targets is performed by the methods schematically shown in Examples 3, 8, 10 and 11 and FIGS. 3-6, 12b, 15b, 16, 22 .

いくつかの実施形態において、複数の結合的に区別可能なおよび位置的に区別可能なモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤から成るタンパク質アレイを生成する。それらの実施形態は、高感度で異なるタンパク質−標的を分類および／または検出するのにとくに有利である。 In some embodiments, a protein array consisting of a plurality of bindably distinguishable and positionally distinguishable modular polynucleotide encoded capture agents is generated. These embodiments are particularly advantageous for classifying and / or detecting different protein-targets with high sensitivity.

更なる実施形態において、複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、基質ポリヌクレオチドに接触する前に関連する標的を検出するためにサンプルに接触させる。それらの実施形態において、ここで説明する方法およびシステムは、基質がないときに結合タンパク質および標的に関連する改良した感度および選択性のために、また減少した生物付着およびタンパク質変性の観点において、多数のバイオマーカーを定量的および／または定性的に効果的に検出する多重マルチパラメータ分析を行うのに用いることができる。 In a further embodiment, the plurality of modular polynucleotide encoded capture agents are contacted with the sample to detect the associated target prior to contacting the substrate polynucleotide. In those embodiments, the methods and systems described herein are numerous for improved sensitivity and selectivity associated with binding proteins and targets in the absence of substrate, and in terms of reduced biofouling and protein denaturation. Can be used to perform multiplex multi-parameter analysis that effectively and quantitatively and / or qualitatively detects the biomarkers.

実施例３，８−１１において説明し図３−６，１２ｂ，１５ｂ，１６，２２において示す方法およびシステムで行うことができるマルチパラメータ分析には、限定することはないが、いずれかのタンパク質分析、組織分析、血清診断、バイオマーカー、血清プロファイル、マルチパラメータ細胞分類、単一細胞研究、および本明細書を読む当業者によって特定可能な更なる分析がある。 Multi-parameter analysis that can be performed with the methods and systems described in Examples 3 and 8-11 and shown in FIGS . 3-6, 12b, 15b, 16 , and 22 includes, but is not limited to, any protein analysis There are tissue analysis, serodiagnosis, biomarkers, serum profiles, multi-parameter cell classification, single cell studies, and further analysis that can be identified by one of ordinary skill in the art reading this specification.

それらの実施形態のうちいくつかにおいて、マルチパラメータ分析は、多重検出アプローチでサンプルＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞および抗原特異的Ｔ細胞における検出することができる。 In some of these embodiments, multiparameter analysis can be detected in sample CD8 cells, CD4 cells and antigen-specific T cells in a multiplex detection approach.

複数の標的が異なる種類の細胞から成る方法およびシステムの実施形態は、細胞が下部の基質上にプリントした表面マーカー特異的抗体と相互作用するパニング当の当該技術の関連する方法およびシステムよりとくに有利である［参考文献４８］。とくに、基質上の細胞捕捉の効果は、当該技術の方法およびシステムに関して改良するが、これは、パニングすると捕捉抗体の四量体構造を一般的に誘導化された基質に吸収／共有結合的に付着することによって有害におよび不可逆的にダメージを受けるためである。この結果、実施例７において説明し図１０および１１において示すようにＮＡＣＳと比較して反応性が低い表面となる。 Embodiments of methods and systems in which multiple targets consist of different types of cells are particularly advantageous over related methods and systems of the art such as panning where the cells interact with surface marker specific antibodies printed on the underlying substrate. [Reference 48]. In particular, the effect of cell capture on the substrate improves with respect to the methods and systems of the art, which, when panned, absorbs / covalently binds the tetrameric structure of the capture antibody to a generally derivatized substrate. This is because they are harmfully and irreversibly damaged by the adhesion. This results in a surface that is less reactive than NACS as described in Example 7 and shown in FIGS .

いくつかの実施形態において、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、細胞分類アプローチにおいて用いる。 In some embodiments, the modular polynucleotide encoded capture agents described herein are used in a cell sorting approach.

実施例１〜１１において説明し図３〜１３，１５〜１７，１９，２１，２２において示した方法およびシステムで実行可能な標的を分類する分析には、混合物における特定の標的（限定することはないが、細胞標的、タンパク質−標的または遺伝子標的）の検出を必要とする分析があり、これは本明細書を読む当業者によって特定可能である。 The analysis to classify the targets that can be performed with the methods and systems described in Examples 1-11 and shown in FIGS . 3-13 , 15-17 , 19 , 21 , 22 includes specific targets in the mixture (not limited to There are analyzes that do not require detection of cellular targets, protein-targets or gene targets, but can be identified by those skilled in the art reading this specification.

とくに、ここで説明する方法およびシステムは、細胞種類の複合体混合物内で少なくとも１：１０００希釈液から特異的な細胞種類の多重分類を行うことができる。珍しい細胞のこの分類は、細胞特異的な親和剤が比較的弱い結合親和性を示すときでさえもできる。 In particular, the methods and systems described herein are capable of multiple classification of specific cell types from at least a 1: 1000 dilution within a cell type complex mixture. This classification of rare cells can be done even when cell-specific affinity agents exhibit a relatively weak binding affinity.

いくつかの実施形態において、捕捉剤をエンコードするために用いるポリヌクレオチド（例えばＤＮＡオリゴマー）は、相互的な制限エンドヌクレアーゼが解裂できる（解放可能なポリヌクレオチド捕捉剤も）異なる制限酵素部位を有するように設計する。 In some embodiments, the polynucleotide (eg, DNA oligomer) used to encode the capture agent has different restriction enzyme sites that can be cleaved by reciprocal restriction endonucleases (and releasable polynucleotide capture agents). To design.

とくに、制限酵素部位は、異なる制限酵素が結合的に区別可能な捕捉剤上で異なるＤＮＡ配列を認識できるように含まれる。したがって、複数の異なる制限酵素を用いることによって、異なる集団の捕捉剤およびその結果として異なる集団の標的、とくに細胞の接着は、細胞種類を分類するのに用いる配列に特異的な相補的な制限酵素を加えることによって個々に制御することができる。解放した細胞は、さらに集積させる細胞培養によってｉｎｖｉｖｏで増大する、または、本明細書において示すようにモノパラメータもしくはマルチパラメータで遺伝子的にもしくはタンパク質的に（例えばＰＣＲ，ウェスタンブロットなど）分析できる。 In particular, restriction enzyme sites are included so that different restriction enzymes can recognize different DNA sequences on a binding agent that is bindably distinguishable. Thus, by using a plurality of different restriction enzymes, different populations of capture agents and consequently different populations of targets, particularly cell adhesions, are complementary restriction enzymes specific to the sequence used to classify the cell type. Can be controlled individually. Released cells can be expanded in vivo by additional cell cultures, or analyzed mono- or multi-parameter genetically or proteinically (eg, PCR, Western blot, etc.) as shown herein.

ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で細くした標的の制御解放は、さらに、ＰＣＲ，質量スペクトル、ウェスタンブロットなどの他の従来の生物分析技術および当業者によって特定可能な他の技術によって標的をさらに分析することができる。 Controlled release of a target thinned with a polynucleotide-encoded capture agent can further analyze the target by other conventional bioanalytical techniques such as PCR, mass spectra, Western blots, and other techniques that can be identified by those skilled in the art. it can.

したがって、いくつかの実施形態において、ここで説明する解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、１個の標的およびとくに複数の標的を提供する方法に関連して用いることができ、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、基質上のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を形成することができる時間および条件で標的および基質ポリヌクレオチドに付着する基質に接触させる。解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の制限酵素部位に対する制限酵素は、その後、相補的な制限酵素部位を解裂することができる解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体に接触し、それによって、制限酵素に相互的な制限酵素部位を有する解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を選択的に解放することができる。いくつかの実施形態において、個々で説明する方法で行った解放は、制御された方法で（例えば異なる時間に）異なる解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を解放するように選択的に制御することができる。 Thus, in some embodiments, the releasable polynucleotide-encoded capture agents described herein can be used in connection with methods that provide a single target and particularly multiple targets. Is contacted with the substrate attached to the target and substrate polynucleotide for a time and under conditions that allow formation of a polynucleotide-encoded capture agent-target complex on the substrate. The restriction enzyme to the restriction enzyme site of the releasable polynucleotide-encoded capture agent then contacts the releasable polynucleotide-encoded capture agent-target complex that can cleave the complementary restriction enzyme site, thereby A releasable polynucleotide-encoded capture agent-target complex having a restriction enzyme site reciprocal to the restriction enzyme can be selectively released. In some embodiments, the release performed by the individually described methods is selectively performed to release different releasable polynucleotide-encoded capture agent-target complexes in a controlled manner (eg, at different times). Can be controlled.

いくつかの実施形態において、解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤である。とくに、いくつかの実施形態において、この方法に従った解放可能なモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、さらに、リンカー分子を有し、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の制御解放を可能にし、それによって捕捉剤がないときに標的の更なる分析を可能にする。 In some embodiments, the releasable polynucleotide encoded capture agent is a modular polynucleotide encoded capture agent described herein. In particular, in some embodiments, a releasable modular polynucleotide encoded capture agent according to this method further comprises a linker molecule, allowing controlled release of the modular polynucleotide encoded capture agent described herein. Thereby allowing further analysis of the target in the absence of a capture agent.

いくつかの実施形態において、アレイにおいて捕捉した標的、とくにアレイ上で捕捉した細胞も、さらなる分析に従うことができる。特異的には、免疫―ＰＣＲは、細胞表面受容体をプロファイルするのに用いることができる。さらに、または代案として、全体に参照して組み込むＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明したもの等の一連のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いることができ、実施例１６および図２０−２２において説明した手順に従って行うこの分析を行うことができる。とくに、図２０−２２の実施例において、標的表面バイオマーカーに対する抗体は、独特なＤＮＡ配列で標識化する。これらのポリヌクレオチドエンコード抗体は、その後、アレイ上で捕捉した細胞を染色するのに用いる。エンコード抗体上のＤＮＡタグをその後分析し、標的細胞バイオマーカーの存在または非存在は、細胞バイオマーカーに関連したＤＮＡタグの存在または非存在に相互に関連する。ＤＮＡタグは、ＰＣＲ，配列マイクロアレイ、および当業者によって特定可能なさらなる技術等の従来の技術で検出する。 In some embodiments, targets captured in the array, particularly cells captured on the array, can also be subject to further analysis. Specifically, immuno-PCR can be used to profile cell surface receptors. Additionally or alternatively, a series of polynucleotide encoded capture agents such as those described in WO 2008/016680, incorporated by reference in its entirety, can be used, following the procedures described in Example 16 and FIGS. 20-22. This analysis can be done. In particular, in the examples of FIGS. 20-22 , antibodies against the target surface biomarker are labeled with a unique DNA sequence. These polynucleotide-encoded antibodies are then used to stain the cells captured on the array. The DNA tag on the encoded antibody is then analyzed and the presence or absence of the target cell biomarker is correlated with the presence or absence of the DNA tag associated with the cell biomarker. The DNA tag is detected by conventional techniques such as PCR, sequence microarrays, and additional techniques identifiable by those skilled in the art.

したがって、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、標的を検出とくに分析する方法を組み合わせて使用し、少なくとも１個のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は標的および／もしくは基質上に付着した基質ポリヌクレオチドに接触させて、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体および／またはポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を形成する。さらなるポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／またはモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、さらにそれらの複合体と接触して、標的および／または標的上に存在する更なる標的に結合させて、さらなるポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を形成することができる。さらなる標的を有するさらなるポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／またはモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の複合体を検出できる。リンカー、およびとくに従来のリンカーを有する解放可能なポリヌクレオチ捕捉剤および／またはポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の使用に基づいた更なる変化は、当業者には既知である。 Thus, in some embodiments, the polynucleotide encoded capture agent and the modular polynucleotide encoded capture agent described herein use at least one modular polynucleotide encode using a combination of methods for detecting and specifically analyzing the target. The capture agent and the polynucleotide-encoded capture agent are contacted with a substrate polynucleotide attached to the target and / or the substrate to form a modular polynucleotide-encoded capture agent-target complex and / or a polynucleotide-encoded capture agent-target complex. Form. Additional polynucleotide encoded capture agents and / or modular polynucleotide encoded capture agents can be further contacted with the complexes to bind to the target and / or additional target present on the target to further capture the polynucleotide encoded capture. An agent can be formed. Additional polynucleotide-encoded capture agents and / or modular polynucleotide-encoded capture agent complexes with additional targets can be detected. Further variations based on the use of linkers, and particularly releasable polynucleotide capture agents and / or polynucleotide encoded capture agents with conventional linkers, are known to those skilled in the art.

さらなる実施形態において、ここで説明するいずれかの方法およびシステムの基質は、マイクロ流体成分に関連し、マイクロ流体を基にした分析を可能にする。マイクロ流体を基にした分析は、減少したサンプルおよび試薬体積、および短縮化した分析時間等の長所を必要とする［参考文献４９］。例えば、特定の操作条件下で、表面結合分析速度論は、拡散によってではなく、検体（タンパク質）濃度および検体／抗原結合親和性によって主に画定する［参考文献５０］。 In a further embodiment, the substrate of any method and system described herein is associated with a microfluidic component and allows microfluidic-based analysis. Microfluidic-based analysis requires advantages such as reduced sample and reagent volume and reduced analysis time [Ref 49]. For example, under certain operating conditions, surface binding analysis kinetics are primarily defined by analyte (protein) concentration and analyte / antigen binding affinity rather than by diffusion [Ref. 50].

ここで用いる用語「マイクロ流体」は、一般的にマイクロまたは準マイクロスケールで加工する例えばチャネルおよび／もしくはチャンバ等のマイクロ流体の特性を有する成分またはシスエムを示す。例えば、典型的なチャネルまたはチャンバは、約０．１ミクロン〜約１５００ミクロンの範囲、より典型的には約０．２ミクロン〜約１０００ミクロンの範囲、より典型的には約０．４ミクロン〜約５００ミクロンの範囲の少なくとも１断面の大きさを有する。個々のマイクロ流体の特徴は、典型的には、例えば約１０ナノリットル〜約５ミリリットル、より典型的には約１００ナノリットル〜約２ミリリットル、さらに典型的には約２００ナノリットル〜約５００マイクロリットル、さらに典型的には約５００ナノリットル〜約２００マイクロリットルの少量を有する。 As used herein, the term “microfluidic” refers to a component or system having microfluidic properties such as channels and / or chambers that are typically processed on a micro or sub-micro scale. For example, typical channels or chambers range from about 0.1 microns to about 1500 microns, more typically from about 0.2 microns to about 1000 microns, more typically from about 0.4 microns to It has a size of at least one cross section in the range of about 500 microns. Individual microfluidic characteristics typically include, for example, from about 10 nanoliters to about 5 milliliters, more typically from about 100 nanoliters to about 2 milliliters, and more typically from about 200 nanoliters to about 500 microliters. Liters, and typically a small amount of about 500 nanoliters to about 200 microliters.

マイクロ流体成分は、集積デバイスにおいて含まれる。ここで用いるように、「集積デバイス」は、物理的および操作的にともに組み込める２個（またはそれ以上）の成分を有するデバイスを示す。成分は、（全体的にまたは部分的に）互いに分離して加工する、または集積デバイスは、集積デバイスにおける異なる成分を含むように加工する。集積マイクロ流体アレイデバイスは、マイクロ流体成分に組み込んだアレイ成分を有し、マイクロ流体成分およびアレイ成分は互いに操作可能な関連を融資、アレイ成分のアレイ基質は、マイクロ流体成分のマイクロ流体特徴を有する流体連結する。マイクロ流体成分は、舞う黒流体特徴を有する成分であり、アレイ成分に関連して操作可能であるように適用する。アレイ成分は、基質を有する成分であり、マイクロ流体成分に関連して操作可能であるように適用する。 The microfluidic component is included in the integrated device. As used herein, “integrated device” refers to a device having two (or more) components that can be both physically and operatively incorporated. The components are processed separately (in whole or in part) or the integrated device is processed to include different components in the integrated device. An integrated microfluidic array device has an array component incorporated into the microfluidic component, the microfluidic component and the array component provide an operable relationship to each other, and the array substrate of the array component has the microfluidic features of the microfluidic component Fluid coupling. A microfluidic component is a component having black fluid characteristics that flutter and is applied to be operable in relation to the array component. The array component is a component having a substrate and is applied so as to be operable in relation to the microfluidic component.

マイクロ流体システムはまた、モジュール形式で提供する。「モジュール式」は、ともに用いる多重の標準化した成分を有するシステムまたはデバイスを示し、成分種類の多重の異なる実施例の一つは、システムもしくはデバイスの機能または能力を変化させる同じ種類の成分のほかのものに置換でき；このシステムまたはデバイスにおいて、それぞれの標準化した成分は「モジュール」である。 The microfluidic system is also provided in modular form. “Modular” refers to a system or device that has multiple standardized components used together, and one of the different embodiments of component type multiplexing is in addition to the same type of component changing the function or capability of the system or device. In this system or device, each standardized component is a “module”.

ここで説明する方法およびシステムのマイクロ流体の実施形態において、極端に小さいサンプル体積内および非常に小さい背景／生物付着のタンパク質バイオマーカーの大きなパネルの測定が可能である。 In the microfluidic embodiments of the methods and systems described herein, measurement of large panels of protein biomarkers in extremely small sample volumes and very small background / bioadhesion is possible.

個々で説明する方法およびシステムのマイクロ流体実施形態において、分析の感度も上げることができる。 In the microfluidic embodiments of the method and system described individually, the sensitivity of the analysis can also be increased.

さらに、ここで説明するマイクロ流体方法およびシステムは、（ｉ）モノステップ分析（ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、標的および標識化抗体が単一ステップにおいて接触する）および（ｉｉ）マルチステップ分析（基質は順にモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、標的および二次抗体に露呈する）の両方を、当該技術の関連するマイクロ流体方法およびシステムおよび分子検出の非マイクロ流体方法およびシステムと比較して短い時間、小さいサンプル、高感度で行うことができる。 Further, the microfluidic methods and systems described herein include (i) monostep analysis (polynucleotide-encoded capture agent, target and labeled antibody contact in a single step) and (ii) multi-step analysis (substrate in turn). Small time, small sample compared to related microfluidic methods and systems of the art and non-microfluidic methods and systems of molecular detection Can be done with high sensitivity.

ここで説明するマイクロ流体方法およびシステムに関連したさらなる利点には、基質−支持抗体を有するマイクロ流体環境においていずれかの分析を行うことができ、それまでの技術と組み合わせたマイクロ流体チップを有さない。 A further advantage associated with the microfluidic methods and systems described herein is that any analysis can be performed in a microfluidic environment with substrate-supported antibodies, and has a microfluidic chip combined with previous techniques. Absent.

ここで説明する方法およびシステムに関連するさらなる利点は；ガラス、およびプラスチック等の低コストの試薬を用いた高感度測定を行うことができる；およびサンプル前処理および精製のためのさらなる成分を組み合わせて用いることができる。 Additional advantages associated with the methods and systems described herein are; sensitive measurements can be performed using low cost reagents such as glass and plastic; and additional components for sample preparation and purification combined Can be used.

ここで説明する方法およびシステムは、対象および関連する診断分析のバイオマーカーの多重マルチパラメータ検出、分類ができる。診断分析に関するここで説明する方法およびシステムの用途の例示的な説明は、実施例９〜１０において説明し図１３−１５，２１，２２および本発明を読む当業者によって特定可能なさらなる分析において示す。 The methods and systems described herein are capable of multiple multiparameter detection and classification of subjects and associated diagnostic analysis biomarkers. An exemplary description of the use of the methods and systems described herein for diagnostic analysis is provided in Examples 9-10 and shown in FIGS . 13-15, 21, 22 and further analysis identifiable by those skilled in the art reading the present invention . .

とくに、図１３−１５の例示的な診断分析において、抗原特異性Ｔ細胞集団が、ヒトＰＢＭＣからのＮＡＣＳで検出した。これらのＴ細胞の検出は、それらが癌およびウィルス性病原菌に対する免疫反応を有するため診断目的に重要である。治療的分析の実施例は、代わりに図１３において与える。ここでヒトＨＭＢＣは、抗原に関連する癌に対して特異的なＴＣＲで形質導入する。これらのＴ細胞が、患者に点滴する前にＮＡＣＳアレイ上で検出する。 In particular, in the exemplary diagnostic analysis of FIGS. 13-15 , antigen-specific T cell populations were detected with NACS from human PBMC. The detection of these T cells is important for diagnostic purposes because they have an immune response against cancer and viral pathogens. An example of a therapeutic analysis is given instead in FIG . Here, human HMBC transduces with a TCR specific for the cancer associated with the antigen. These T cells are detected on the NACS array before instilling into the patient.

ここで説明するシステムは、部分のアレイまたはキットにおいて提供することができる。「マイクロアレイ」を時々示すアレイには、領域に関連した特定の分子を有するアドレス可能な領域の１，２または３次元の装備がある。通常、特徴的な大きさはマイクロメートルである。実施例３〜１１および図３−６，９−１３，１５−１７，１９，２１−２２は、例示的なマイクロアレイを提供する。 The systems described herein can be provided in an array of parts or a kit. An array, sometimes referred to as a “microarray”, has a 1, 2, or 3 dimensional arrangement of addressable regions with specific molecules associated with the region. Usually the characteristic size is a micrometer. Examples 3-11 and FIGS. 3-6 , 9-13 , 15-17 , 19 , 21-22 provide exemplary microarrays.

部品のキットにおいて、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／または関連する部品のいずれかは、基質を有するキットにおいて個々に含まれる。とくに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、１個またはそれ以上の成分において含まれ、各モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、適切な車両キャリアまたは助剤を有する１成分において含まれる。 In the kit of parts, any of the modular polynucleotide encoded capture agents and / or related parts are individually included in the kit with the substrate. In particular, the modular polynucleotide encoded capture agent is included in one or more components, and each modular polynucleotide encoded capture agent is included in one component with a suitable vehicle carrier or adjuvant.

システムにおいて提供した基質は、それに付着した基質ポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、基質ポリヌクレオチドは、さらにキットのさらなる成分として提供する。さらなる成分には、標識化ポリヌクレオチド、標識化抗体、標識、マイクロ流体チップ、参照基準、および本は明細書を読む当業者によって特定可能なさらなる成分を有する。とくに、キットの成分は、適切な説明書および必要な試薬とともに提供し、個々で説明した方法を行う。キットは、通常分かれた容器において構成物を有する。分析を行うための、例えば紙またはテープもしくはＣＤ−ＲＯＭ等の電子機器上に書かれたまたはオーディオの説明は、キットにおいて通常含まれる。このキットはまた、用いる特定の方法に依存して、他の包装の試薬および材料を有する（すなわち、洗浄緩衝液および同様のもの）。 The substrate provided in the system has a substrate polynucleotide attached thereto. In some embodiments, the substrate polynucleotide is further provided as an additional component of the kit. Additional components include labeled polynucleotides, labeled antibodies, labels, microfluidic chips, reference standards, and additional components that can be identified by those skilled in the art reading the specification. In particular, the components of the kit are provided with appropriate instructions and the necessary reagents to carry out the methods described individually. The kit usually has the components in separate containers. Descriptions of audio, for example written on electronic equipment such as paper or tape or CD-ROM, or audio for performing the analysis are usually included in the kit. The kit also has other packaging reagents and materials (ie, wash buffer and the like) depending on the particular method used.

成分の適切なキャリア剤または助剤の特定、およびキットの一般的な製造および包装に関連するさらなる詳細は、本明細書を読む当業者によって特定可能である。 Further details relating to the identification of suitable carriers or auxiliaries for the components and the general manufacture and packaging of the kit can be identified by those skilled in the art reading this specification.

ここで説明する方法およびシステムは、以下の実施例において説明し、説明によって与えられ、限定することはない。
実施例１：ポリヌクレオチドエンコードＳＡＣ骨格タンパク質の生成 The methods and systems described herein are described in the following examples, are given by way of illustration, and are not limiting.
Example 1 Generation of Polynucleotide Encoded SAC Skeletal Protein

ＳａＣの発現は、以前出版されたプロトコールに従って行った［参考文献３６］。簡単には、ｐＥＴ−３ａプラスミドにクローンしたストレプトアビジンーシステイン（ＳａＣ）遺伝子は、Ｄｒ．ＴａｋｅｓｈｉＳａｎｏ（ＨａｒｖａｒｄＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ）から送られた。その後、コロニー選択および一晩培養を開始し、プラスミドを含むＢＩ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＥを３７°ＣでＬＢ培養液およびｐＥＴ−３ａ−ＳａＣに対する選択抗生物質アンピシリン（５０Ｉｔｇ／ｍｌ）およびｐＬｙｓＥに対するクロロフェニコール（２５Ｉｔｇ／ｍｌ）において振動させながら成長させ、ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．４ｍＭになるまで加えた。その後細胞誘導を３７°Ｃで４時間行った。培養液をその後１６００ｇで１０分間遠心分離し、１００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８で洗浄した。細胞は、その後リシン緩衝液（２ｍＭＥＤＴＡ，３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ｐＨ８．０）で溶解した。 Expression of SaC was performed according to a previously published protocol [Ref. 36]. Briefly, the streptavidin-cysteine (SaC) gene cloned into the pET-3a plasmid is Dr. Sent from Takeshi Sano (Harvard Medical School). Thereafter, colony selection and overnight culture were started, and the plasmid-containing BI21 (DE3) -pLysE was incubated at 37 ° C with the LB medium and the antibiotics ampicillin (50 Itg / ml) and pLysE against pET-3a-SaC. Growing with shaking in Cole (25 Itg / ml), b-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.4 mM. Cell induction was then performed at 37 ° C for 4 hours. The culture was then centrifuged at 1600 g for 10 minutes and washed with 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8. The cells were then lysed with lysine buffer (2 mM EDTA, 30 mM Tris-HCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0).

溶液の粘度を下げるため、溶解物をＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ（それぞれＪ２ｍＭＭｇＳＯ４を有する１０Ｉｔｇ／ｍｌ）を用いて２０分間室温で処理した。不溶性物質含有体は、その後３９０００ｇで１５分間遠心分離することによって溶解物から分離し、その後、沈殿物を再び利新緩衝液で洗浄した。沈殿物を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ，ｐＨ１．５において溶解させて最初の培養物の体積にした。細胞ビオチンを除去するため、１００ｍＬの溶解した沈殿溶液を１Ｌの６Ｍグアニジン−ＨＣｌ，ｐＨ４．５において透析した。透析物を、０．２Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ６．０に移して、グアニジンを除去し、リフォールドＳａＣを処理した。ここで透析は、攪拌棒を除去することによってゆっくり行うことが重要である。透析物は、その後３０００ｇで１０分間回転させ、沈殿材料を除去し０．２Ｌｍｔｌｌｔｅｒ（ａｍｉｃｒｏｎ）を通して濾過した。リフォールドＳａＣは、５０ｍＭ重炭素酸塩、５００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ１１に対して最後に透析した。 To lower the viscosity of the solution, the lysate was treated with DNase and RNase (10 Itg / ml each with J2 mM MgSO4) for 20 minutes at room temperature. The insoluble material containing material was then separated from the lysate by centrifugation at 39000 g for 15 minutes, after which the precipitate was washed again with fresh buffer. The precipitate was dissolved in 6M guanidine-HCl, pH 1.5 to the original culture volume. To remove cellular biotin, 100 mL of the dissolved precipitation solution was dialyzed against 1 L of 6M guanidine-HCl, pH 4.5. The dialysate was transferred to 0.2M sodium acetate, pH 6.0 to remove guanidine and treat refolded SaC. Here, it is important that the dialysis is performed slowly by removing the stir bar. The dialysate was then spun at 3000 g for 10 minutes to remove the precipitated material and filtered through 0.2 Lmtlter (Amicron). The refolded SaC was finally dialyzed against 50 mM bicarbonate, 500 mM NaCl, pH 11.

ＳａＣは、以下のように生成した。リフォールドＳａＣを、結合緩衝液（５０ｍＭ重炭素ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭｂ−Ｍｅ，ｐＨ１１）と１：１で混合した。１．５ｍｌのイミノビオチアガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）で包装した重力カラムをその後カラムに取り付け、溶出フラクションを収集してカラムに再び着せて、ＳａＣ回復を最大化する。カラムを２０ｍｌ結合緩衝液で洗浄後、ＳａＣをｐＨ４溶出緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム，１０ｍＭ）で溶出した。ＳａＣを含むフラクションは、ＯＤ２８０によってモニタリングしたように、収集して、１０ｍＭのＰＢＳを含む緩衝液交換して１０Ｋｍｗｃｏフィルタ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて最終濃度１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。 SaC was generated as follows. Refolded SaC was mixed 1: 1 with binding buffer (50 mM sodium bicarbonate, 500 mM NaCl, 10 mM b-Me, pH 11). A gravity column packed with 1.5 ml of iminobiothiagarose resin (Pierce) is then attached to the column, and the elution fractions are collected and reattached to the column to maximize SaC recovery. After washing the column with 20 ml binding buffer, SaC was eluted with pH 4 elution buffer (50 mM sodium acetate, 10 mM). Fractions containing SaC were collected and concentrated to a final concentration of 1 mg / ml using a 10K mwco filter (Milipore) with buffer exchange containing 10 mM PBS as monitored by OD280.

ＳａＣオリゴヌクレオチド接合は以下のように行った。用いる前に、ストックＳａＣを、脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて５ｍＭＴＣＥＰを含むトリス緩衝液（ＴＢＳ）に緩衝液交換した。ＴＣＥＰは、接合の間ＳａＣから還元した状態を維持する還元剤を有するノンチオールである。ＤＭＦ内ＭＨＰＨ（３−Ｎ−マレイミドー６−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）をＳａＣに３００：１のモル過剰で加えた。平行して、ＤＭＦ内ＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸塩、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を５´アミン化オリゴ（ＩＤＴ）に４０：１のモル過剰で加えた。 SaC oligonucleotide conjugation was performed as follows. Prior to use, stock SaC was buffer exchanged into Tris buffer (TBS) containing 5 mM TCEP using a desalting column (Pierce). TCEP is a non-thiol with a reducing agent that maintains a reduced state from SaC during conjugation. MHPH in DMF (3-N-maleimido-6-hydrazinium pyridine hydrochloride, Solulink) was added to SaC in a 300: 1 molar excess. In parallel, SFB in DMF (succinimidyl 4-formyl benzoate, Solulink) was added to 5 'aminated oligo (IDT) in a 40: 1 molar excess.

混合物をその後、３〜４時間室温で反応させた。過剰なＭＨＰＨおよびＳＦＢを除去してサンプルを緩衝液交換して脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてクエン酸塩緩衝液（５０ｍＭクエン酸ナトリウム，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐｈ６．０）とした。ＳＦＢ−標識化オリゴをその後、誘導化ＳａＣと２０：１のモル過剰で組み合わせ、一晩４°Ｃで培養させる前に２〜３時間室温で反応させた。未反応のオリゴをＰｈａｒｎａｃｉａＡｕｐｅｒｄｅｘ２００ｇｅｌフィルタカラムを用いてＰＢＳ０．５ｍｌｌｍｉｎアイソクラチックフローで除去した。ＳａＣ−オリゴ接合体を有するフラクションは、１０Ｋｍｗｃｏ濃フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。ＳａＣ−オリゴ構成体の合成は、非還元８％トリスＨＣｌＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検証した。
実施例２：マイクロアレイ加工 The mixture was then allowed to react at room temperature for 3-4 hours. Excess MHPH and SFB were removed and the sample was buffer exchanged to a citrate buffer (50 mM sodium citrate, 150 mM NaCl, ph 6.0) using a desalting spin column (Pierce). SFB-labeled oligos were then combined with derivatized SaC in a 20: 1 molar excess and allowed to react at room temperature for 2-3 hours prior to overnight incubation at 4 ° C. Unreacted oligos were removed with a 0.5 ml lmin isocratic flow in PBS using a Phaniacia Superdex 200 gel filter column. Fractions with the SaC-oligo conjugate were concentrated using a 10 Kmwco concentration filter (Millipore). The synthesis of the SaC-oligo construct was verified by non-reducing 8% Tris HCl SDS-PAGE.
Example 2: Microarray processing

ＤＮＡマイクロアレイは、アミンコートされたガラススライド上でＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＳｙｓｔｅｍＢｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢ−Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）でのマイクロアレイ施設による標準的な方法を介してプリントした。典型的なスポットの大きさは、６００ｆｉｌｍ（ＳＭＰＸＢ１５ｐｉｎ，Ａｒｒａｙｉｔ）とした。すべてのＤＮＡ鎖は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、すべての相補体は５´アミン化した。すべての６個の３Ｄ−ｍｅｒおよびそれらのそれぞれの設計に対する配列は、以下の表１および表２において与えた。

実施例３：ＮＡＣＳを用いた検出および分類方法およびシステム DNA microarrays were printed via standard methods by the microarray facility at the Institute for System Biology (ISB-Seattle, WA) on amine-coated glass slides. A typical spot size was 600 film (SMPXB 15 pin, Arrayit). All DNA strands were purchased from Integrated DNA technologies and all complements were 5 'aminated. The sequences for all 6 3D-mers and their respective designs are given in Table 1 and Table 2 below.

Example 3: Detection and classification method and system using NACS

ｓｓＤＮＡ−オリゴマー標識かＳａＣ骨格上で組織化した抗原に存在するＭＨＣ分子抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞分類は、図３および図４において概略的に示すように行った。とくに、図３および４において概略的に示した分析は、細胞分類を目的とし、異なる細胞種類をガラス基板上で分類し従来の顕微鏡技術によって検出する。モジュール式ＤＮＡ−ＳＡＣ−ＭＨＣ構成体は、最初にアレイに組み込み、その後、対象の標的Ｔ細胞を有する複合体細胞サンプルを用いてアレイ上で分類する。 ssDNA- oligomer labeled or cell sorting of MHC molecules antigen-specific CD8 + T cells present in the tissue of antigen on SaC backbone was carried out as shown schematically in FIGS. In particular, the analysis schematically shown in FIGS. 3 and 4 is intended for cell classification, wherein different cell types are classified on a glass substrate and detected by conventional microscopy techniques. Modular DNA-SAC-MHC constructs are first incorporated into the array and then sorted on the array using complex cell samples with the target T cells of interest.

最初の実験に従って、タンパク質ＳａＣを発現させ、ｓｓＤＮＡオリゴマーは、実施例１に説明した手順に従ってチオールカップリングを用いてシステイン残基にカップリングした（図３参照）。 According to the first experiment, the protein SaC was expressed and the ssDNA oligomer was coupled to a cysteine residue using thiol coupling according to the procedure described in Example 1 (see FIG. 3 ).

ビオチン化した抗原に存在するＭＨＣは、ｐ／ＭＨＣモノマーをＳａＣ−オリゴに対してモル過剰で結合させることによってビオチン／ＳａＣ結合部位でＳａＣにカップリングさせ、３７°Ｃで２０分間培養した（図３参照）。 MHC present in the biotinylated antigen was coupled to SaC at the biotin / SaC binding site by binding p / MHC monomer to SaC-oligo in a molar excess and incubated at 37 ° C for 20 minutes (Fig. 3).

ＳａＣ／ＭＨＣ／ｓｓＤＮＡ骨格はその後、対象のＣＤ８＋細胞を含む溶液と結合させ、全ＳａＣ／ＭＨＣ／ｓｓＤＮＡ／ＣＤ８＋集合は、実施例３において説明した手順に従って（図３参照）、表面上の相補的ｓｓＤＮＡ´オリゴマー特定のスポットに位置づけた。 The SaC / MHC / ssDNA backbone is then combined with the solution containing the subject CD8 + cells and the entire SaC / MHC / ssDNA / CD8 + assembly is complemented on the surface according to the procedure described in Example 3 (see FIG. 3 ) . The ssDNA 'oligomer was positioned at a specific spot.

第２実験に従って、抗原特異細胞を多重分類する自己集合ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体アレイを準備した（図４）。ｓｓＤＮＡタグｐ／ＭＨＣ四量体は、モル過剰のビオチン化ｐ／ＭＨＣモノマーに露呈する前にＳＡＣにｓｓＤＮＡ部位を特異的に結合させることによって生成させた（図４）。ｐ／ＭＨＣ四量体アレイは、相補的にプリントしたｓｓＤＮＡマイクロアレイへ特異的に選択し組み込むｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体をプーリングすることによって形成する（図４）。類似のＴＣＲを発現するＴ細胞は、表面局限四量体に結合させることによって検出した。 According to the second experiment, a self-assembled ssDNA-p / MHC tetramer array was prepared ( FIG. 4 ). The ssDNA tag p / MHC tetramer was generated by specifically binding the ssDNA site to SAC before exposure to a molar excess of biotinylated p / MHC monomer ( FIG. 4 ). A p / MHC tetramer array is formed by pooling ssDNA-p / MHC tetramers that are specifically selected and incorporated into complementary printed ssDNA microarrays ( FIG. 4 ). T cells expressing similar TCRs were detected by binding to surface localized tetramers.

両方の実験を行うため、黒色腫抗原に特異的なＴＣＲを発現するように遺伝子的に加工した２個のＴ細胞株Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ＴＣＲトランスジェニックＪｕｒｋａｔおよびＭａｒｔ−Ｉ−ＴＣＲトランスジェニックＪｕｒｋａｔは、チロシナーゼ３６９−３７７（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ−配列番号９）およびＭａｒｔＩ２６−３５（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ−配列番号１０）ペプチドに関連するＨＬＡ−Ａ２制限クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）モノマーとともに用いた。 To perform both experiments, two T cell lines Tyrosinase-TCR transgenic Jurkat and Mart-I-TCR transgenic Jurkat that were genetically engineered to express a TCR specific for melanoma antigen were tyrosinase 369. Used with HLA-A2 restriction class I major histocompatibility complex (MHC) monomers related to -377 (YMDGTMSQV-SEQ ID NO: 9) and Mart I26-35 (ELAGIGILTV-SEQ ID NO: 10) peptides.

分類実験の前に、マイクロアレイスライドを遮断して、ＰＢＳにおいて溶解した１ｍｇ／ｍｌＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｓｕｎｂｉｏ）で非特異的な細胞吸収を２時間室温で妨げた。スライドは、その後、５回０．５ＰＢＳに浸し過剰なＰＥＧを除去し、その直後にｄＨ２０においてさらに５回浸けて塩を除去した。スライドは、窒素ガンで吹き飛ばして乾燥させた。スライドは、最長２週間デシケータにおいて保管し、効率的に劣化させないようにする。 Prior to the classification experiment, the microarray slides were blocked and nonspecific cell absorption was prevented with 1 mg / ml PEG-NHS ester (Sunbio) dissolved in PBS for 2 hours at room temperature. The slide was then soaked 5 times in 0.5 PBS to remove excess PEG and immediately thereafter dipped in dH20 5 more times to remove salt. Slides were blown dry with a nitrogen gun. Slides are stored in a desiccator for up to 2 weeks to prevent efficient degradation.

固体状態の分類は、最初のモル過剰ｐ／ＭＨＣモノマーをＳａＣ−オリゴに結合させることによって行い、３７°Ｃ２０分間培養した。四量体化後、１０％ＦＢＳで補足した２００μｌのＤＭＥＭを加えて、溶液をＤＮＡマイクロアレイの上部でピペッティングした。 Solid state classification was performed by coupling the initial molar excess of p / MHC monomer to SaC-oligo and incubating at 37 ° C for 20 minutes. After tetramerization, 200 μl DMEM supplemented with 10% FBS was added and the solution was pipetted on top of the DNA microarray.

四量体は、１時間３７°Ｃで相補的スポットに局限化させた。スライドをその後ＰＢＳ内３％ＦＢＳでリンスした。リンス後、１００ＩＩＩの新鮮ＤＭＥＭにおける１０６Ｔ細胞をアレイ上部上でスライドに加えた。スライドをその後、３７°Ｃのインキュベータに２０〜３０分間移して、細胞をｐ／ＭＨＣアレイと相互作用させた。培養後、スライドをＰＢＳ内３％ＦＢＳでおだやかに動かし、未結合の細胞を除去して明視野および蛍光顕微鏡を介して可視化した。同様に、溶液相の捕捉を１０^６個の細胞を０．５μｇの集合ＮＡＣＳ四量体と組み合わせることによって行い、捕捉剤が溶液相において細胞に結合できるようにした。２０分間３７°Ｃで培養後、細胞を５００ｇで５分間回転させ、過剰の四量体をアスピレートすることによって除去した。細胞は、１００μＬのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳにおいて再懸濁し、予めブロックしたマイクロアレイに直接用いた。スライドはさらに２０分間３７°Ｃで培養した。その後の洗浄および画像化のステップは、固体状態の分類と等しい。 The tetramer was localized to a complementary spot at 37 ° C for 1 hour. The slide was then rinsed with 3% FBS in PBS. After rinsing, 106T cells in 100III fresh DMEM were added to the slide on top of the array. The slide was then transferred to a 37 ° C. incubator for 20-30 minutes to allow the cells to interact with the p / MHC array. After incubation, the slide was gently moved with 3% FBS in PBS to remove unbound cells and visualized through bright field and fluorescence microscopy. Similarly, solution phase capture was performed by combining 10 ⁶ cells with 0.5 μg of aggregated NACS tetramer to allow the capture agent to bind to cells in the solution phase. After culturing for 20 minutes at 37 ° C., cells were removed by spinning at 500 g for 5 minutes and aspirating excess tetramer. Cells were resuspended in 100 μL DMEM, 10% FBS and used directly on pre-blocked microarrays. The slides were further incubated at 37 ° C for 20 minutes. Subsequent washing and imaging steps are equivalent to the solid state classification.

単一パラメータおよびマルチパラメータ細胞分類を得るために行った上述の手順の結果を図５において示す。とくに、図５の結果は、抗原特異ＣＤ８＋Ｔ細胞を分類する単一パラメータ（図５Ａ）およびマルチパラメータ（図５Ｂ）に対するＮＡＣＳの実用性を示す。当業者は、図５の詳細からＤＮＡハイブリダイゼーションの特異性および標的分類およびとくに細胞分類を最少の内部スポットノイズで行うことができる特別に局限化したｐ／ＭＨＣタンパク質を理解する。 The results of the above procedure performed to obtain single parameter and multiparameter cell classification are shown in FIG . In particular, the results of FIG. 5 show the utility of NACS for single parameters ( FIG. 5A ) and multiparameters ( FIG. 5B ) that classify antigen-specific CD8 + T cells. Those skilled in the art will understand from the details of FIG. 5 the specially localized p / MHC proteins that allow DNA hybridization specificity and target classification and in particular cell classification to be performed with minimal internal spot noise.

上述の手順を通して行った検出／分類の感度を評価するため、更なる実験を上述の手順を行って、他の細胞の混合物においてｓｓＤＮＡ−ＳＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体アレイで１０％，１％および０．１％の濃度で希釈した抗原特異ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に検出および分類した。 To evaluate the sensitivity of detection / classification performed through the above procedure, further experiments were performed using the above procedure to obtain 10%, 1% on ssDNA-SA-p / MHC tetramer arrays in other cell mixtures. And antigen-specific CD8 + T cells diluted at a concentration of 0.1% and were selectively detected and sorted.

図６において示した結果は、他の細胞の混合物における抗原特異性細胞を選択的に検出および／または分類するＮＡＣＳアプローチの実用性を示す。とくに、図６Ａの顕微鏡画像は、細胞分類の効率性を示し、標的Ｔ細胞集団は、各サブパネルの上左に示したパーセンテージで急上昇するが、図６Ｂのヒストグラムは、この実験を定量的に示す。短いバーは、分類実験の目的とは異なる抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を示し、背景のシグナルのレベルを示す。
実施例４：最適化骨格 The results shown in FIG. 6 demonstrate the utility of the NACS approach to selectively detect and / or sort antigen specific cells in a mixture of other cells. In particular, the microscopic image of FIG. 6A shows the efficiency of cell sorting, and the target T cell population spikes with the percentages shown at the top left of each subpanel, while the histogram of FIG. 6B shows this experiment quantitatively. . Short bars indicate antigen-specific CD8 + T cells that are different from the purpose of the classification experiment, indicating the level of background signal.
Example 4: Optimization skeleton

ストレプトアビジンの構造を図７Ａにおいて示し、最適化ストレプトアビジンＳＡＣの構造を図７Ｂにおいて示す。 The structure of streptavidin is shown in FIG. 7A and the structure of optimized streptavidin SAC is shown in FIG. 7B .

これは、最適化ストレプトアビジンーシステインタンパク質構成物の結晶構造である。ストレプトアビジンは、４個の異なるサブユニット（様々なグレー）から成る。タンパク質に対するビオチン結合ドメインを図において示し、ビオチン配位子が結合している（白）。これは、誘導化ＤＮＡの付着部位である。２個の領域は２０〜３０オングストロームの距離だけ離れていることに留意されたい。ｌｙｓ１２１（灰）によって示した、結晶構造における第３要素がある。これはまた、システイン残基に付着する代わりに誘導化ＤＮＡの付着部位として機能する（アミン−ＮＨＳカップリングを介する）。付着部位の問題は、ビオチンポケットへの接近が近すぎることであり（すなわち、ドメイン重複、７オングストローム）、これは最適でない骨格である。ｓｓＤＮＡの直径は、約１０オングストロームであり、ｄｓＤＮＡは約２０オングストロームである。したがって、ＤＮＡはリジン残基二付着すると、ビオチン結合領域に重複し（１０Å＞７Å）、ビオチン化結合タンパク質への特異的な相互作用を妨げる（例えばビオチン化ｐ／ＭＨＣ）。 This is the crystal structure of the optimized streptavidin-cysteine protein construct. Streptavidin consists of four different subunits (various gray). The biotin binding domain for the protein is shown in the figure, with the biotin ligand bound (white). This is the site of attachment of derivatized DNA. Note that the two regions are separated by a distance of 20-30 angstroms. There is a third element in the crystal structure, indicated by lys121 (ash). It also functions as an attachment site for derivatized DNA instead of attaching to a cysteine residue (via amine-NHS coupling). The problem with the attachment site is that it is too close to the biotin pocket (ie, domain overlap, 7 Å), which is a non-optimal scaffold. The diameter of ssDNA is about 10 angstroms, and dsDNA is about 20 angstroms. Thus, when DNA is attached to two lysine residues, it overlaps the biotin binding region (10Å> 7Å) and prevents specific interaction with the biotinylated binding protein (eg biotinylated p / MHC).

骨格設計における合成アプローチは、最適化骨格の様々なパラメータを正確に制御することができる。例えば、ペプチドを骨格として用いる場合、骨格最適化におけるいくつかのパラメータは制御でき、結合タンパク質およびエンコードポリヌクレオチド付着領域を分離するリンカー長さ、極性および価数がある。
実施例５：最適化および非最適化ｓｓＤＮＡ−エンコードｐ／ＭＨＣ四量体 Synthetic approaches in skeletal design can accurately control various parameters of the optimized skeleton. For example, when using a peptide as the backbone, several parameters in backbone optimization can be controlled, including the linker length, polarity and valence separating the binding protein and the encoded polynucleotide attachment region.
Example 5: Optimized and non-optimized ssDNA-encoded p / MHC tetramer

用途は、タンパク質を５´マレイミドｓｓＤＮＡをカップリングしたＳＡＣを発現し、接合形成を移動度シフトアッセイで検証する。 The application expresses SAC coupled with 5 ′ maleimide ssDNA protein and verifies the junction formation by mobility shift assay.

とくに、ｓｓＤＮＡ−ＳＡＣ接合の生成は、以下のように行った。ＳＡＣの発現は、ｐＥＴ３ａプラスミドから以前出版されたプロトコールに従って行った［参考文献３６］。接合する前に、ストックＳＡＣを、ｚａｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン酸塩酸塩（ＴＣＥＰ）を含むＰＢＳに緩衝液交換した。ＤＭＦ内ＭＨＰＨ（３−Ｎ−マレイミド−６−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）をＳａＣに３００：１のモル過剰で加えた。平行して、ＤＭＦ内ＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸塩、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を５´アミン化オリゴ（ＩＤＴ）に４０：１のモル過剰で加えた。混合物は、ｚｅｂａカラムを用いてクエン酸塩（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ６．０）に緩衝液交換する前に室温（ＲＴ）で３〜４時間反応させた。ＳＦＢ−標識オリゴは、誘導化ＳＡＣとの２０：１のモル過剰で結合させ、一晩ＲＴで培養した。未反応のオリゴは、ＰｈａｒｎａｃｉａＡｕｐｅｒｄｅｘ２００ｇｅｌフィルタカラムを用いてＰＢＳ０．５ｍｌｌｍｉｎアイソクラチックフローで除去した。ＳａＣ−オリゴ接合体を有するフラクションは、１０Ｋｍｗｃｏ濃度フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。平行して、ｓｓＤＮＡを直接比較するため天然のＳＡとカップリングさせた。 In particular, ssDNA-SAC junctions were generated as follows. SAC expression was performed according to a previously published protocol from the pET3a plasmid [Ref. 36]. Prior to conjugation, stock SAC was buffer exchanged into PBS containing 5 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) using a zaba desalting column (Pierce). MHPH in DMF (3-N-maleimido-6-hydrazinium pyridine hydrochloride, Solulink) was added to SaC in a 300: 1 molar excess. In parallel, SFB in DMF (succinimidyl 4-formyl benzoate, Solulink) was added to 5 'aminated oligo (IDT) in a 40: 1 molar excess. The mixture was reacted for 3-4 hours at room temperature (RT) before buffer exchange with citrate (50 mM sodium citrate, 150 mM NaCl, pH 6.0) using a zeba column. SFB-labeled oligos were coupled with a derivatized SAC in a 20: 1 molar excess and incubated overnight at RT. Unreacted oligos were removed with a 0.5 ml lmin isocratic flow in PBS using a Pharmacia Upperdex 200 gel filter column. Fractions with SaC-oligo conjugate were concentrated using a 10 Kmwco concentration filter (Millipore). In parallel, ssDNA was coupled with native SA for direct comparison.

図８において示したその結果は、Ｃ末端システイン残基を発現するストレプトアビジンの変形の加工は、天然のストレプトアビジンのｓｓＤＮＡとの接合と比較して優れたビオチン結合能を有することを示す。とくに、図８の結果は、ＳＡＣモノマーの分子量が〜１２ｋＤａであることを示し（図８Ａ）、１個のＤＮＡ鎖によって異なるＳＡＣ−オリゴ接合体を示すそれぞれのバンドを溶解することができ、また、下位ＳＡＣ−オリゴ接合体（タンパク質当たり１〜２オリゴ）は、核酸の電荷／質量密度において異なるために未修飾のＳＡＣと比較して「軽質」となる（図８Ｂ）。ＳＡ当たり３〜４ＤＮＡ鎖に関連する上位のＳＡＣ−オリゴ接合体に有利に働いた（図８Ｂ）。 The results shown in FIG. 8 indicate that the modification of streptavidin expressing a C-terminal cysteine residue has a superior biotin binding ability compared to the conjugation of natural streptavidin with ssDNA. In particular, the results in FIG. 8 show that the molecular weight of the SAC monomer is ˜12 kDa ( FIG. 8A ), each band showing different SAC-oligo conjugates can be dissolved by one DNA strand, and , The lower SAC-oligo conjugates (1-2 oligos per protein) are “light” compared to unmodified SAC due to differences in nucleic acid charge / mass density ( FIG. 8B ). It favored the top SAC-oligo conjugates associated with 3-4 DNA strands per SA ( FIG. 8B ).

ビオチン結合能を試験するため、ＳＡＣ−オリゴ接合体を２−（４´−ヒドロキシルアジベンゼン）安息香酸（ＨＡＢＡ）でプローブした［参考文献２８］。ビオチン分子模倣体をビオチンがＳＡに結合するかしないかによって異なる最適な密度係数でプローブした。分析において４未満の関連するビオチン：ＳＡのモル比は、ビオチン結合能における減少を示す。天然ＳＡから誘導した接合体は、期待値以下の全単位より大きく（２．８６対４．０）であったが、ＳＡＣで形成した接合体は、最適な結合能（３．７）の近くを維持した（図８Ｃ)。 To test for biotin binding ability, SAC-oligo conjugates were probed with 2- (4′-hydroxylazibenzene) benzoic acid (HABA) [Ref. 28]. Biotin molecular mimetics were probed with optimal density factors that differed depending on whether biotin bound to SA or not. A related biotin: SA molar ratio of less than 4 in the analysis indicates a decrease in biotin binding capacity. Conjugates derived from native SA were larger than the expected units (2.86 vs. 4.0), whereas zygotes formed with SAC were close to the optimal binding capacity (3.7). Was maintained ( FIG. 8C ).

とくに、図８に示すように、ＳＡモルに対して〜２．９モルのビオチンを結合した天然ＳＡ−オリゴ接合体は、４：１の比の未修飾ＳＡと比較して大きな減少を示す。ＳＡＣ−オリゴ接合体は、最適な結合能の近くを維持した（３．７：１）。 In particular, as shown in FIG. 8, native SA-oligo conjugates conjugated with ˜2.9 moles of biotin relative to the moles of SA show a significant reduction compared to a 4: 1 ratio of unmodified SA. SAC-oligo conjugates remained close to optimal binding capacity (3.7: 1).

これらの接合体は、４個の異なるモノクローナルＴ細胞集団（２個のヒトＴＣＲ形質導入した細胞株および２個のマウスＴＣＲトランスジェニック脾細胞懸濁液）を通して試験した。ｓｓＤＮＡ−タグＳＡＣ構成は、天然ＳＡで準備したｐ／ＭＨＣ四量体と比較して非常に高い細胞捕捉能を有した（図９）。とくに、図９Ａは、天然ストレプトアビジンを用いて行った細胞捕捉実験の結果を示し、図９Ａ内の各サブパネルは、異なる細胞種類を用いた別々の実験の結果を示す。図９Ｂにおいて、同じ細胞を用いたが、最適化したＳＡＣ骨格で細胞捕捉能を試験した。当業者は、図９Ａの実験の細胞捕捉能は高く変化するが、図９Ｂの実験の細胞捕捉能は、すべての細胞種類の中で均一であることを理解する。すべてのＮＡＣＳ四量体ＳＡ構成物は、ＳＡＣ変異体で準備した。 These conjugates were tested through four different monoclonal T cell populations (two human TCR transduced cell lines and two mouse TCR transgenic splenocyte suspensions). The ssDNA-tag SAC configuration had a much higher cell capture capacity compared to p / MHC tetramer prepared with native SA ( FIG. 9 ). In particular, FIG. 9A shows the results of cell capture experiments performed with natural streptavidin, and each subpanel in FIG. 9A shows the results of separate experiments using different cell types. In FIG. 9B , the same cells were used but tested for cell capture ability with an optimized SAC scaffold. Those skilled in the art will appreciate that while the cell capture capacity of the experiment of FIG. 9A varies highly, the cell capture capacity of the experiment of FIG. 9B is uniform among all cell types. All NACS tetramer SA constructs were prepared with SAC variants.

ここで、ＤＮＡ円コードドメインは、非最適化した骨格（ＳＡ）に付着したときビオチン結合能（結合タンパク質ドメイン）を減少させ、その結果、Ｔ細胞捕捉能が大きく減少する。最適化骨格（ＳＡＣ）は、２個の異なるモダリティ間の相互作用を最小化し、その結果Ｔ細胞分類の能力を高くする。 Here, the DNA circular coding domain reduces the biotin binding ability (binding protein domain) when attached to the non-optimized backbone (SA), and as a result, the T cell capture ability is greatly reduced. Optimized scaffold (SAC) minimizes the interaction between two different modalities and consequently increases the ability of T cell sorting.

この実施例において示した結果はさらに、１個の捕捉剤において含まれる結合分子の数を増加させることによって結合分子の親和性を増加させることを示す。それぞれのモノマーとしてのｐ／ＭＨＣタンパク質は、低い親和性（電離定数Ｋｄ〜１０^−５、［参考文献２］）によって特徴付けられる。しかし、４個のｐ／ＭＨＣタンパク質を束ねてｐ／ＭＨＣ四量体を形成するとき、複合体の親和性は大きく増加する（Ｋｄ〜１０^−９、［参考文献１］）。多価であるためのこの親和性の増加は、タンパク質結合剤、アパタマー、ペプチド、小分子のいずれかの族まで広がる。捕捉剤複合体の親和性上の価数の効果は、図８〜９において明らかに見える。ここで３ｐ／ＭＨＣタンパク質で形成した捕捉剤は、十分な親和性を有し、Ｔ細胞集団のサブセットを捕捉するが、完全に形成した四量体（４ｐ／ＭＨＣ）は、すべての４Ｔ細胞集団を捕捉および結合することができた。 The results shown in this example further show that the affinity of the binding molecule is increased by increasing the number of binding molecules contained in one capture agent. The p / MHC protein as the respective monomer is characterized by a low affinity (ionization constant Kd 10 ⁻⁵ , [reference 2]). However, when the four p / MHC proteins are bundled to form a p / MHC tetramer, the affinity of the complex is greatly increased (Kd-10 ⁻⁹ , [Reference 1]). This increase in affinity due to multivalency extends to any family of protein binders, apatamers, peptides, and small molecules. The effect of valence on the affinity of the capture agent complex is clearly visible in FIGS . Here, the capture agent formed with 3p / MHC protein has sufficient affinity and captures a subset of the T cell population, whereas the fully formed tetramer (4p / MHC) is present in all 4T cell populations. Could be captured and bound.

当業者は、この実験において示した目的が他の最適化骨格を理解するのに用いて、細く剤の価数が同じ理由で計算できることを理解する。とくに、当業者は、多価の骨格を用いて特異的に結合する分子は、モノマーと比較したときより貪欲であることを理解する。
実施例６：制限酵素部位を有するポリヌクレオチドでのマイクロアレイ製造 Those skilled in the art will appreciate that the objectives shown in this experiment can be used to understand other optimized scaffolds, and that the valency of the agent can be calculated for the same reason. In particular, those skilled in the art understand that molecules that specifically bind using a multivalent backbone are more greedy when compared to monomers.
Example 6: Microarray production using a polynucleotide having a restriction enzyme site

すべてのＤＮＡ鎖は、ＩＤＴから購入した。ＤＮＡマイクロアレイは、Ａ，ＢまたはＣスポットの代案の列を有する１２×１２アレイ、またはＳＭＰＸＢ１５ピン（Ａｒｒａｙｉｔ）を有するＡ_{ＥｃｏＲＩ}およびＢ_{ＢａｍＨＩ}同じように３倍したアミンコートしたガラススライド（ＧＡＰＳＩＩ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上でＳｙｓｔｅｍＢｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢ−Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）でマイクロアレイを製造することによってプリントした。すべてのらせんに対する配列を以下の表３において報告する。

All DNA strands were purchased from IDT. DNA microarrays, A, B or C spot 12 × 12 array having a row of alternatives _{A EcoRI} and _{B BamHI} just as 3 times the amine-coated glass slide or having SMPXB15 pin (Arrayit), (GAPSII, Corning ) The above was printed by making a microarray with System Biology (ISB-Seattle, WA). The sequences for all helices are reported in Table 3 below.

ＳＡＣに接合する表３のすべての配列（Ａ´，Ｂ´，Ｃ´，Ａ_{ＥｃｏＲＩ}´およびＢ_{ＢａｍＨＩ}´）は、ｐｏｌｙＡリンカーおよびその後２０ｍｅｒハイブリダイゼーション領域で設計した。５´アミンは、ヘテロ二機能マレイミド誘導化ＭＨＰＨの付着に必要である。ガラス基板上にプリントした配列（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ａ_{ＥｃｏＲＩ}およびＢ_{ＢａｍＨＩ}）は、ｐｏｌｙＡによって分離した２個のハイブリダイゼーション領域で設計した。これは、アミンガラス基板に静電吸着するように設計した。 All sequences in Table 3 (A ′, B ′, C ′, A _EcoRI ′ and B _BamHI ′) that join the SAC were designed with a polyA linker followed by a 20mer hybridization region. The 5 'amine is required for the attachment of heterobifunctional maleimide derivatized MHPH. The arrays (A, B, C, A _EcoRI and B _BamHI ) printed on the glass substrate were designed with two hybridization regions separated by polyA. This was designed to electrostatically adsorb to an amine glass substrate.

配列Ａ_{ＥｃｏＲＩ}およびＢ_{ＢａｍＨＩ}は、以下の実施例１１において説明するような手順に従って、標的を解放、とくに選択的に解放できるように示した制限酵素部位を含むように設計した。
実施例７：従来のタンパク質アレイと比較したＤＮＡ固定化および直接スポッティングを介して生成したｐ／ＭＨＣアレイの性能 The sequences A _EcoRI and B _BamHI were designed to contain restriction enzyme sites indicated to release the target, in particular selectively, according to the procedure as described in Example 11 below.
Example 7: Performance of p / MHC arrays generated via DNA immobilization and direct spotting compared to conventional protein arrays

用途は実施例６においてアレイ上のＮＡＣＳの性能を、様々なモデル基質上の従来の直接的なスポッティング技術と直接比較した。基質は、タンパク質を固定化するのに一般的に用いる表面化学物質のスペクトルを示すように選択した（共有結合、静電、疎水性、および親水性吸着）。蛍光ＭＡＲＴ−１ＳＡ−ＰＥ四量体の希釈液（ＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子上に載せた黒色腫ペプチドエピトープＭＡＲＴ−１_{２６−３５}）は、製造説明書にしたがって基質上にスポットした。 The application directly compared the performance of NACS on the array in Example 6 with conventional direct spotting techniques on various model substrates. The substrate was chosen to show a spectrum of surface chemicals commonly used to immobilize proteins (covalent bonding, electrostatic, hydrophobic, and hydrophilic adsorption). Dilutions of fluorescent MART-1 SA-PE tetramer (melanoma peptide epitope MART-1 _26-35 mounted on HLA-A2.1 MHC molecules) were spotted on the substrate according to the manufacturer's instructions.

Ｔ細胞は、以下の手順に従って準備した。チロシナーゼ_{３６８−３７６}に特異的なＴＣＲのアルファおよびベータ鎖を用いた。ＴＣＲ^Ｔｙｒｏアルファおよびベータ鎖は、説明するように両方のトランス遺伝子を２Ａ自己解裂配列によって結合させたレンチウイルスベクターにクローン化する［参考文献３７］。このレンチウイルスベクターからの濃縮した浮遊物は、Ｊｕｒｋｅｔ細胞を感染させるのに用いて、Ｊｕｒｋｅｔ^{α―Ｔｙｒｏ}細胞を生成した。ＭＳＧＶ１−Ｆ５ＡｆＴ２ＡＢレトロウィルスベクターを発現する初代ヒトＴリンパ球を生成するために、白血球除去輸血から得たＰＢＭＣは、４８時間５０ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ムロモナブ抗ヒトＣＤ３抗体、Ｏｒｔｈｏ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）および３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（アデスローキン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）で活性化させた。ＭＳＧＶ１−Ｆ５ＡｆＴ２ＡＢレトロウイルス浮遊物は、レトロネクチンコートしたウェル（ＴａｋａｒａＢｉｏＩｎｃ，Ｊａｐａｎ）に適用した。 T cells were prepared according to the following procedure. TCR alpha and beta chains specific for tyrosinase _368-376 were used. The TCR ^Tyro alpha and beta chains are cloned into a lentiviral vector in which both transgenes are joined by a 2A self-cleavage sequence as described [Ref 37]. The concentrated suspension from this lentiviral vector was used to infect Jurket cells to generate Jurket ^α-Tyro cells. To generate primary human T lymphocytes expressing the MSGV1-F5AfT2AB retroviral vector, PBMCs obtained from leukapheresis transfusions were 48 hours 50 mg / ml OKT3 (muromonab anti-human CD3 antibody, Ortho-Biotech, Bridgewater, NJ). ) And 300 U / ml IL-2 (Adesroquin, Novartis, Emeryville, CA). MSGV1-F5AfT2AB retroviral suspension was applied to retronectin-coated wells (Takara Bio Inc, Japan).

ＲＰＭＩプラス３００ＩＵのＩＬ−２で補足した５％ヒトＡＢ血清において活性化したＰＢＭＣをこれらのウェルに加え、３７°Ｃ一晩５％ＣＯ_２で培養した。その後日、ＰＢＭＣを第２セットの予めコートしたレトロネクチンレトロウイルスベクター組織培養プレートに移して、３７°Ｃ一晩５％ＣＯ_２で培養した。細胞はその後洗浄して上述の培養液において再懸濁させた。患者ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３（ＵＣＬＡＩＲＢ♯０３−１２−０２３）凍結白血球除去輸血フラクションを解かして、１０％ヒトＡＢ血清および１％ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンフォテリシン（ＯｍｅｇａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補足したＲＰＭＩにおいて一晩培養し、製造説明書に従ってＡｕｔｏＭＡＣＳ機械を用いてＣＤ８＋濃縮物（抗ＣＤ８マイクロビーズ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）の前にした。分離後、細胞を３０ＵＩＬ２／ｍＬを有するＲＰＭＩ−ヒトＡＢ培養液において保存した。 PBMC activated in 5% human AB serum supplemented with RPMI plus 300 IU IL-2 were added to these wells and incubated overnight at 37 ° C. with 5% CO ₂ . The next day, PBMCs were transferred to a second set of precoated retronectin retroviral vector tissue culture plates and cultured at 37 ° C. overnight with 5% CO ₂ . The cells were then washed and resuspended in the culture medium described above. Patients NRA11 and NRA13 (UCLA IRB # 03-12-023) frozen leukocyte-depleted transfusion fractions were cultured overnight in RPMI supplemented with 10% human AB serum and 1% penicillin, streptomycin and amphotericin (Omega Scientific) Prior to CD8 + concentrate (anti-CD8 microbeads, Miltenyi Biotech) using an AutoMACS machine according to the manufacturer's instructions. After separation, the cells were stored in RPMI-human AB medium with 30 U IL2 / mL.

Ｊｕｒｋｅｔ^{α―Ｔｙｒｏ}細胞（ペプチドエピトープＭＡＲＴ−１_{２６−３５}に特異的なＦ５ＭＡＲＴ−１ＴＣＲで形質導入したヒトＴ白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ［参考文献２９］）をその後実施例３において説明したように実施例６のアレイおよびタンパク質アレイに適用した。収集および定量化したアレイの画像は図１０において示した。 Jurket ^α-Tyro cells (human T leukemia cell line Jurkat [ref. 29] transduced with F5 MART-1 TCR specific for peptide epitope MART-1 _26-35 ) were then performed as described in Example 3. Applied to the array of Example 6 and the protein array. Images of the collected and quantified array are shown in FIG .

とくに、図１０Ａ（収集した画像）および図１０Ｂ（定量化した画像）において示した結果は、同じ濃度のｐ／ＭＨＣ四量体で固定化したＮＡＣＳアレイと比較して調査した表面の大部分上にはＴ細胞捕捉（静電、疎水性）または大きなノイズ（親水性）がほとんどないまたは全くない。とくに、図１０Ａの図面は、細胞結合はＳＡＣを用いて最適化した骨格に対して一定で均一であったが、細胞結合は一表面（共有結合）でのみ観察されたが、細胞捕捉は大きく変化した。図１０Ｂの図面は、図１０Ａの結果の定量化を示す。当業者が図１０の詳細から理解することには、等価の細胞捕捉密度を達成するために従来のアレイはＳＡＣ骨格より５倍以上のタンパク質材料を必要とする（とくに図１０Ｂの定量化参照） In particular, the results shown in FIG. 10A (collected images) and FIG. 10B (quantified images) show that most of the surface investigated compared to NACS arrays immobilized with the same concentration of p / MHC tetramer. Has little or no T cell capture (electrostatic, hydrophobic) or noisy (hydrophilic). In particular, in the drawing of FIG. 10A , cell binding was constant and uniform for the scaffold optimized using SAC, but cell binding was observed only on one surface (covalent bond), but cell capture was large. changed. The drawing of FIG. 10B shows quantification of the results of FIG. 10A . Those skilled in the art understand from the details of FIG. 10 that conventional arrays require more than 5 times more protein material than the SAC scaffold to achieve equivalent cell capture density (see in particular the quantification in FIG. 10B ).

さらなる実験において、ＮＡＣＳを行って結合するＴ細胞の構造安定性は、異なるスポッティングで行って結合するＴ細胞と比較して試験した。とくに、ｐ／ＭＨＣ四量体は、Ｔ細胞を捕捉するのに見られた（細胞を結合しない００１６４におけるほかの表面と比較して）誘導化表面（エポキシ官能基）上にスポットした。ｐ／ＭＨＣ四量体を製造説明書に従ってスポットし、同じ量の局在化したｐ／ＭＨＣタンパク質と組み込んだＮＡＣＳ分析と直接比較した。 In further experiments, the structural stability of T cells that bind by performing NACS was tested compared to T cells that bind by performing different spotting. In particular, the p / MHC tetramer was spotted on the derivatized surface (epoxy functional group) seen to capture T cells (compared to other surfaces in 00164 that do not bind cells). p / MHC tetramers were spotted according to the manufacturer's instructions and directly compared to NACS analysis incorporated with the same amount of localized p / MHC protein.

結果は、図１１においてＳＡＣ細胞捕捉プラットフォームの一貫性および構造安定性、および大きな内部スポット細胞捕捉異種によって示すような従来のアプローチの関連する矛盾を示す。 The results show the consistency and structural stability of the SAC cell capture platform in FIG. 11 and the related inconsistencies of the traditional approach as shown by the large internal spot cell capture heterogeneity.

とくに、直接スポットした表面上で結合する（共有結合）Ｔ細胞が観察されたが、細胞捕捉は、内スポットおよび間スポットの両方の異種および示した交雑実験変化によって示したように高く変化した（図１１Ｂ参照）。 In particular, T cells binding (covalently bound) on the directly spotted surface were observed, but cell capture was highly altered as shown by the heterogeneous and shown cross-experimental changes of both inner and interspots ( ( See FIG. 11B ).

逆に、Ｔ細胞のＮＡＣＳでの一貫性および構造安定性は、スポットしたアレイと直接比較したとき図１１Ａの画像空明らかであり、内スポット、間スポット、および内部実験異種の高さに困った（図１１Ｂ参照）。 Conversely, T cell NACS consistency and structural stability was evident in the image sky of FIG. 11A when directly compared to spotted arrays, and suffered from internal spots, interspots, and internal experimental heterogeneous heights. (See FIG. 11B ).

さらに、等価のＴ細胞捕捉密度を達成するため、ＮＡＣＳｐ／ＭＨＣアレイは共有結合固定化より５倍以上少ない材料を必要とした（最大値の半分のｐ／ＭＨＣモノマー＝Ｋ_１／２＝ＮＡＣＳで１．１ｎｇおよび共有結合固定化で５．７ｇ）。 Furthermore, to achieve an equivalent T cell capture density, the NACS p / MHC array required more than 5 times less material than covalent immobilization (half maximum p / MHC monomer = K _1/2 = NACS 1.1 ng and 5.7 g with covalent immobilization).

ＮＡＣＳｐ／ＭＨＣアレイの性能および再現性が大きく改善し、広い用途のアレイを基にしたＴ細胞検出機構を広げるための不可欠なステップを示す。これは少ない原因を有する。まず、表面拘束ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体は、表面に適合するのに必要な吸着タンパク質と比較した表面／溶液界面での方向性自由が大きい。この効果は、機能的タンパク質の密度を増やし、その結果アレイ製造に必要な材料の量を減少させる。第２に、タンパク質アレイの生成およびその後の保管の間の環境の水和状態は、アレイ再現性に必要な要素である［参考文献９，１２，１７］。この効果は、ＤＮＡチップが長い時間プリントされ保管され、またｓｓＤＮＡタグｐ／ＭＨＣ四量体アレイを実験の直前に溶液において自己集合するため、ＮＡＣＳで最小化する。
実施例８：ＮＡＣＳ検出特異性および検出感度 The performance and reproducibility of NACS p / MHC arrays is greatly improved and represents an essential step to expand the T cell detection mechanism based on a versatile array. This has few causes. First, the surface-constrained ssDNA-p / MHC tetramer is more directional free at the surface / solution interface compared to the adsorbed protein required to conform to the surface. This effect increases the density of functional proteins and consequently the amount of material required for array manufacturing. Second, the hydration state of the environment during protein array generation and subsequent storage is a necessary element for array reproducibility [Refs. 9, 12, 17]. This effect is minimized with NACS because the DNA chip is printed and stored for a long time and the ssDNA tag p / MHC tetramer array self-assembles in solution just prior to the experiment.
Example 8: NACS detection specificity and sensitivity

ｐ／ＭＨＣアレイ集合の特異性およびＴ細胞分類を評価するため、実施例６において説明した手順に従って、ＤＮＡマイクロアレイを２個のさらなる異なる配列（設計ＢおよびＣ）に沿って相補的ならせん鎖（Ａ）にプリントした。 In order to evaluate the specificity of the p / MHC array assembly and T cell classification, the DNA microarray was subjected to complementary helical strands along two additional different sequences (designs B and C) according to the procedure described in Example 6. Printed on A).

ＮＡＣＳｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体（ペンダントＤＮＡ配列Ａ´と共に黒色腫抗原ペプチドチロシナーゼ_{３６８−３７６}に載せたヒトＨＬＡ−Ａ*０２０１ＭＨＣ分子）をそのように準備したＤＮＡマイクロアレイに混成した。 NACS ssDNA-p / MHC tetramer (human HLA-A * 0201 MHC molecule mounted on melanoma antigen peptide tyrosinase _368-376 with pendant DNA sequence A ′) was hybridized to the DNA microarray so prepared.

Ｊｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}Ｔ細胞（チロシナーゼ_{３６８−３７６}に特異的なＴＣＲで形質導入したＪｕｒｋｅｔ細胞）［参考文献３０］の均一な集団を、その後実施例３に従ってアレイに混成した。 A homogenous population of Jurket ^α-Tyr T cells (Jurket cells transduced with a TCR specific for tyrosinase _368-376 ) [ref. 30] was then mixed into the array according to Example 3.

図１２において示す結果は、Ｊｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}Ｔ細胞が、非相補的な配列ＢおよびＣにプリントしたスポットではなく混成した同族のｐ／ＭＨＣを有する相補的なスポット（Ａ）に局限化していることを示す（図１２Ａ）。３個のスポットから計算した平均結合能（−６００μｍ）は、−１４６８±６２Ｊｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}Ｔ細胞であった。 The results shown in FIG. 12 show that Jurket ^α-Tyr T cells are localized to complementary spots (A) with hybrid cognate p / MHC rather than spots printed on non-complementary sequences B and C. ( FIG. 12A ). The average binding capacity (−600 μm) calculated from the three spots was −1468 ± 62 Jurket ^α-Tyr T cells.

ＮＡＣＳ，ＭＡＲＴ−１およびＤＮＡ配列ＡおよびＢにエンコードしたチロシナーゼｓｓＤＮＡｐ／ＭＨＣ四量体の多重化能を示すため、それぞれを結合して３個のＤＮＡマイクロアレイ（らせん鎖Ａ，ＢおよびＣ）に同時に集合させた。新油性色素で予め染色した（グレースケールで明るいグレーおよび暗いグレーで表した緑および赤）Ｊｕｒｋｅｔ^{ａ−ＭＡＲ−１}ＴおよびＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞の１：１の混合集団を、アレイに適用して代案のカラムに置いた（図１２Ｂ）。最小の交差反応性を観察した。スポットＡおよびＢの平均密度は、均一な分類よりも２個の因子が少なかった（６６１±１９Ｔ細胞／スポット）（図１２Ｂ）。検出限度を画定するため、Ｊｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞の標的集団を１０％，１％および０．１％で野生型（ｗ．ｔ．）Ｊｕｒｋｅｔ細胞に固定し分類した（図１２Ｃ）。各混合物に種類ごとのスポット当たりのＴ細胞捕捉密度を列挙し平均した（図１２Ｄ）。 In order to show the multiplexing ability of the tyrosinase ssDNA p / MHC tetramer encoded in NACS, MART-1 and DNA sequences A and B, each was combined into three DNA microarrays (helical strands A, B and C) I gathered together. A 1: 1 mixed population of Jurket ^a-MAR-1 T and Jurket ^α-Tyr cells pre-stained with a new oil pigment (green and red in light gray and dark gray on gray scale) was applied to the array. Placed in alternative column ( FIG. 12B ). Minimal cross-reactivity was observed. The average density of spots A and B was two factors less than the uniform classification (661 ± 19 T cells / spot) ( FIG. 12B ). To define the detection limit, target populations of Jurket ^α-Tyr cells were fixed and classified into wild type (wt) Jurket cells at 10%, 1% and 0.1% ( FIG. 12C ). Each mixture was listed and averaged for each type of T cell capture density per spot ( FIG. 12D ).

アレイに付着した非特異的なｗ．ｔ．Ｊｕｒｋｅｔ細胞の数は、すべての希釈で一定であったが、スポット当たりのＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞の数は、スポット当たりＩＩ捕捉できる全細胞数Ｊｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞に対応する制限−１０００細胞において１である検出限度を有するＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞の区画成分に対して線形的に減少した。したがって、このアプローチの感度は、不活性範囲にある抗原特異性のＴ細胞が同族ｐ／ＭＨＣ四量体をサンプリングおよび結合することができないため、正確に幾何制約となった。感度は、捕捉領域の大きさを大きくすることによって（すなわち、スポット直径および／または組み込んだスポット余剰を大きくする）または不活性領域を小さくすることによって（すなわちプリント密度を増加させる）改良する。 Non-specific w. Attached to the array. t. Although the number of Jurket cells was constant at all dilutions, the number of Jurket ^α-Tyr cells per spot was limited to the total number of Jurket ^α-Tyr cells that could be captured II per spot ^- 1 in 1000 cells. Linearly decreased with respect to the compartmental components of Jurket ^α-Tyr cells with a detection limit of. Thus, the sensitivity of this approach was precisely a geometric constraint because antigen-specific T cells in the inactive range could not sample and bind cognate p / MHC tetramers. Sensitivity is improved by increasing the size of the capture area (ie, increasing the spot diameter and / or incorporated spot surplus) or by reducing the inactive area (ie, increasing print density).

さらに、おだやかな撹拌またはマイクロ流体は、全Ｔ細胞集団が細胞分類間に全タンパク質アレイをサンプリングすることができる。アレイの幾何学的配置は、同時に調べることができる抗原特異性の数を画定する。現在の例において、６００μｍスポットを１２グリッド（−１ｉｎ^２）によって１２にプリントし、１０^６Ｔ細胞（概して１ｉｎ２領域を覆うのに必要な細胞の数）１４４個の異なる抗原特異性を潜在的に画定することができる。
実施例９：ＴＣＲ操作初代ヒトＴ細胞のＮＡＣＳ分類および検出 In addition, gentle agitation or microfluidics allows the entire T cell population to sample the entire protein array during cell sorting. The geometry of the array defines the number of antigen specificities that can be examined simultaneously. In the current example, a 600 μm spot is printed on 12 by 12 grids (−1 in ² ) and potentially has 144 different antigen specificities of 10 ⁶ T cells (generally the number of cells needed to cover the 1 in 2 region). Can be defined.
Example 9: NACS classification and detection of TCR engineered primary human T cells

末梢血単核細胞（ＰＢＭC)のＴＣＲ操作は、黒色腫および他の癌を有する患者における養子免疫伝達に対して多くの腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を敏速に生成する新たな臨床的アプローチである［参考文献３１，３２］。このアプローチにおいて、Ｔ細胞を患者から収集して、標的の癌抗原に対して特異的なＴＣＲで形質導入し、自己免疫点滴する。ＴＣＲ操作初代ヒトＴ細胞リンパ球の検出の実現可能性の実証は、ＮＡＣＳの臨床的アプローチに重要である。 TCR manipulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is a new clinical approach that rapidly generates many tumor antigen-specific T cells for adoptive transfer in patients with melanoma and other cancers [ References 31, 32]. In this approach, T cells are collected from the patient, transduced with a TCR specific for the target cancer antigen, and autoimmune instilled. Demonstration of the feasibility of detecting TCR engineered primary human T cell lymphocytes is important for the NACS clinical approach.

したがって、最初の実験において、ＣＤ８＋細胞を有するヒトＰＢＭＣを、白血球除去輸血を介して患者から得て、拡大してＦ５ＭＡＲＴ−１ＴＣＲを含むレトロウィルスベクターで形質導入する。 Thus, in the first experiment, human PBMC with CD8 + cells are obtained from the patient via leukapheresis and expanded and transduced with a retroviral vector containing the F5 MART-1 TCR.

図１３Ａにおいて示した結果は、フローサイトメトリによって画定したように９０％以上の形質導入効率を示す。 The results shown in FIG. 13A show a transduction efficiency of 90% or higher as defined by flow cytometry.

これらの細胞は、その後、ＭＡＲＴ−１（正のコントロール）およびＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶｐｐ６５_{４９５−５０３}／ＨＬＡ−Ａ２．１、負のコントロール）ｐ／ＭＨＣ四量体上に分類した。 These cells were then _{sorted on} MART-1 (positive control) and Cytomegalovirus (CMVpp65 _495-503 / _HLA- A2.1, negative control) p / MHC tetramer.

とくに、チロシナーゼ_{３６９−３７７}（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１（配列ＩＤ番号１０）およびＭＡＲＴ−１_{２６−３３}（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列ＩＤ番号１１）を載せたＨＬＡ−Ａ*０２０１限定ＭＨＣクラスＩモノマーを、以前出されたプロトコール（３８）に従ってハウスにおいて生成した。Ａ．２．１−限定ＥＢＶＢＭＬＦＩ_{２５９−２６７}（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）（配列ＩＤ番号１２），ＣＭＶｐｐ６５_{４９５−５０３}（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（配列ＩＤ番号２２）、ムリネＨ−Ｄｂ／−ｇｐ１００_{２５−３３}（ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ）（配列ＩＤ番号２４）およびＨＬＡ−Ａ*０２０１四量体をＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒから購入した。染料ＤｉＯ，ＤｉＤおよびＤｉＬで染色した親油性細胞膜をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。 In particular, the HLA-A * 0201 limited MHC class I monomer carrying tyrosinase _369-377 (YMDGTMSQV) HLA-A * 0201 (SEQ ID NO: 10) and MART-1 _26-33 (ELAGIGILTV) (SEQ ID NO: 11) Produced in house according to previously published protocol (38). A. 2.1-Limited EBV BMLFI _259-267 (GLCTLVAML) (SEQ ID NO: 12), CMVpp65 _495-503 (NLVPMVATV) (SEQ ID NO: 22), Murine H-Db / -gp100 _25-33 (KVPRNQDWL) (sequence ID) No. 24) and HLA-A * 0201 tetramer were purchased from Beckman Coulter. Lipophilic cell membranes stained with the dyes DiO, DiD and DiL were purchased from Invitrogen.

実験の前に、マイクロアレイスライドを遮断して非特異性細胞をＰＢＳ内１ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｓｕｎｂｉｏ）に２時間室温で結合させるのを防ぐ。４分の１倍のモル過剰量のｐ／ＭＨＣモノマーをｓｓＤＮＡ−ＳＡＣと３７°Ｃで２０分間結合させた。ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体を１時間３７°Ｃで２００μｌ培地においてＤＮＡアレイに混成し、ＰＢＳ内３％ＦＢＳでリンスした。Ｔ細胞（１０^６／１００μｌ培地）をアレイ上３７°Ｃで３０分間培養した。アレイをＰＢＳ内３％ＦＢＳでリンス氏、細胞捕捉を明視野（ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴＥ２０００）および／または共焦点顕微鏡（ＮｉｋｏｎＥ８００）を介して可視化した。ポストＴ細胞捕捉ｐ／ＭＨ四量体の染色を、蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体および蛍光ｃＤＮＡ（Ｃｙ５−Ａ´および／もしくはＣｙ３−Ｂ´）を含む２００μｌの培地とアレイを培養することによって行った。アレイを画像化の前にＰＢＳ内３％ＦＢＳでリンスした。選択的Ｔ細胞解放実験に対して、３個の別々のアレイは、細胞を固定化するために用いた。ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩまたはＤＮａｓｅと四量体を、ＲＰＭＩ培地において１〜２時間３７°Ｃにおいた。ＤＮａｓｅをシグマから、すべての他の酵素をＮＥｂｉｏｌａｂｓから購入した。 Prior to the experiment, the microarray slide is blocked to prevent non-specific cells from binding to 1 mg / ml PEG-NHS ester (Sunbio) in PBS for 2 hours at room temperature. A quarter-fold molar excess of p / MHC monomer was conjugated with ssDNA-SAC for 20 minutes at 37 ° C. The ssDNA-p / MHC tetramer was mixed with the DNA array in 200 μl medium at 37 ° C. for 1 hour and rinsed with 3% FBS in PBS. T cells ⁽¹⁰ 6/100 [mu] l medium) and incubated for 30 minutes in an array on a 37 ° C. Arrays were rinsed with 3% FBS in PBS and cell capture was visualized via bright field (Nikon Eclipse TE2000) and / or confocal microscope (Nikon E800). Post-T cell capture p / MH tetramer staining is performed by culturing the array with 200 μl medium containing fluorescent p / MHC tetramer and fluorescent cDNA (Cy5-A ′ and / or Cy3-B ′). It was. Arrays were rinsed with 3% FBS in PBS prior to imaging. For selective T cell release experiments, three separate arrays were used to immobilize cells. EcoRI, BamHI or DNase and tetramer were placed in RPMI medium for 1-2 hours at 37 ° C. DNase was purchased from Sigma and all other enzymes were purchased from NEbiolabs.

ｐ／ＭＨＣ比較研究に対して、ＳｕｐｅｒＥｐｏｘｙおよびＳｕｐｅｒＰｒｏｔｅｉｎ（それぞれ共有結合および疎水性表面を示す）をＡｒｒｙｉｔ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から購入した。ポリカルボン酸塩ヒドロゲル（親水性）スライドをＸａｎＴｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。蛍光ＭＡＲＴ−１四量体を、各スライドに対する製品説明書に従ってプリントした。細胞分類画像をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で定量化し、Ｏｒｉｇｉｎ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，ＭＡ）を有するＨｉｌｌＦｕｎｃｔｉｏｎ（ＮＡＣＳｎ＝２，Ｒ２＝０．９５，共有結合ｎ＝２．１，Ｒ２＝０．９７）に固定した。 SuperEpoxy and SuperProtein (representing covalent bonds and hydrophobic surfaces, respectively) were purchased from Aryit (Sunnyvale, CA) for p / MHC comparative studies. Polycarboxylate hydrogel (hydrophilic) slides were purchased from XanTec (Germany). Fluorescent MART-1 tetramer was printed according to the product instructions for each slide. Cell classification images were quantified with ImageJ (NIH) and transferred to Hill Function (NACS n = 2, R2 = 0.95, covalent bond n = 2.1, R2 = 0.97) with Origin (Origin Lab, MA). Fixed.

形質導入したＴ細胞をＭＡＲＴ−１領域のみに固定化した。捕捉した細胞の抗原特性を、細胞をアレイ上に固定した後に蛍光ＭＡＲＴ−１およびＣＭＶｐ／ＭＨＣ四量体（それぞれ赤および緑）で染色することによって二重に確認した。 Transduced T cells were immobilized only in the MART-1 region. The antigenic properties of the captured cells were double confirmed by staining the cells with the fluorescent MART-1 and CMV p / MHC tetramers (red and green, respectively) after fixing the cells on the array.

図１３Ｂおよび図１３Ｃにおいて示した結果は、細胞がＣＭＶに特異的に染色せず（図１３Ｂにおける点線の円）細胞捕捉が特異的であった（図１３Ｃの共焦点および明視野画像全体）ことを示す。
図１０：内因性初代ヒトＴ細胞のＮＡＣＳ分類および検出 The results shown in FIGS . 13B and 13C show that cells did not specifically stain for CMV (dotted circles in FIG. 13B ) and cell capture was specific (confocal and entire bright field image in FIG. 13C ). Indicates.
Figure 10: NACS classification and detection of endogenous primary human T cells

末梢血から単離した初代ヒトＴ細胞のＮＡＣＳ検出を行った。これは、末梢血から単離した初代ヒトＴ細胞の一般的な検出は、培養した細胞株よりも一般的に多くを要求するため、抗原特異性Ｔ細胞の単一集合は異なる血液細胞および様々な特異性のモノクローナルおよびポリクローナルＴＣＲを発現するＴ細胞の大きなバックグラウンド内に存在する。加えて、これらＴ細胞は、内因性のＴＣＲを発現する。上述の実施例において見られる同じ性質のＮＡＣＳを用いるかどうかを調査した明細書は、内因性初代ヒトＴ細胞に等しい。 NACS detection of primary human T cells isolated from peripheral blood was performed. This is because the general detection of primary human T cells isolated from peripheral blood generally requires more than cultured cell lines, so a single population of antigen-specific T cells is different from blood cells and various Exists within a large background of T cells expressing monoclonal and polyclonal TCRs of specific specificity. In addition, these T cells express an endogenous TCR. The specification investigating whether to use the same properties of NACS found in the above examples is equivalent to endogenous primary human T cells.

患者ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３からの凍結白血球除去輸血サンプルを、ＮＡＣＳ分類の前にＣＤ８＋で満たした。 Frozen leukocyte transfusion samples from patients NRA11 and NRA13 were filled with CD8 + prior to NACS classification.

患者ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３におけるＥＢＶ特異およびＣＭＶ特異Ｔ細胞の量および特異性を蛍光ＥＢＶおよびＣＭＶｐ／ＭＨＣ四量体で染色しフローサイトメトリによって分析した。 The amount and specificity of EBV-specific and CMV-specific T cells in patients NRA11 and NRA13 were stained with fluorescent EBV and CMV p / MHC tetramer and analyzed by flow cytometry.

図１４において示した結果は、ＮＲＡ１３から単離したリンパ球は高濃度のＥＢＶ特異性Ｔ細胞（４．９％）および最少ＣＭＶ特異性Ｔ細胞を有するが（図１４Ａ参照）、ＮＲＡ１１から単離したリンパ球は、高濃度のＣＭＶ特異性Ｔ細胞（９％）および低濃度のＥＢＶ特異性細胞の集団を有する（０．１２％）（図１４Ｂ参照）ことを示す。 The results shown in FIG. 14 show that lymphocytes isolated from NRA13 have high concentrations of EBV-specific T cells (4.9%) and minimal CMV-specific T cells (see FIG. 14A ), but isolated from NRA11 . The resulting lymphocytes have a high concentration of CMV-specific T cells (9%) and a low concentration of EBV-specific cell populations (0.12%) (see FIG. 14B ).

この画定後、患者ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３からのリンパ球を、一標的検出および多重検出実験におけるＮＡＣＳ技術を用いて分析した。 After this definition, lymphocytes from patients NRA11 and NRA13 were analyzed using NACS technology in single target detection and multiple detection experiments.

一標的検出実験に関して、患者ＮＲＡ１３からの凍結リンパ球サンプルをＣＤ８＋で増やして、実施例６の手順によって与えられたＣＭＶおよびＥｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶＢＭＬＦＩ_{２５９−２６７}／ＨＬＡ−Ａ２．１）ｐ／ＭＨＣアレイに塗布した。 For a single target detection experiment, frozen lymphocyte samples from patient NRA13 were augmented with CD8 + and CMV and Epstein-barr virus (EBV BMLFI _{259-267 /} HLA-A2.1) _p / given by the procedure of Example 6 It applied to the MHC array.

多重検出に関して、１：１のＥＢＶ特異およびＣＭＶ特異ＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、ＮＲＡ１３リンパ球を患者ＮＲＡ１１からのＣＭＶ特異Ｔ細胞と結合させることによって生成し、混合物を実施例６の手順によって与えられたＣＭＶおよびＥｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶＢＭＬＦＩ_{２５９−２６７}／ＨＬＡ−Ａ２．１）ｐ／ＭＨＣアレイに塗布した。 For multiplex detection, a 1: 1 mixture of EBV-specific and CMV-specific CD8 + T cells was generated by combining NRA13 lymphocytes with CMV-specific T cells from patient NRA11 and the mixture was given by the procedure of Example 6. CMV and Epstein-barr virus (EBV BMLFI _259-267 / HLA- _A2.1 ) were applied to p _/ MHC arrays.

図１５において示した結果は、両実験においてＴ細胞を選択的および定量的に検出したことを示す。とくに、患者ＮＲＡ１３のリンパ球で行った検出において、Ｔ細胞のみがＥＢＶ領域内で捕捉された（図１５Ａ参照）。ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３の１：１の混合物から検出したＴ細胞（左パネル）は、ＥＢＶおよびＣＭＶに特異的に変化した。とくに、ＮＡＣＳ細胞分類および蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体染色後、集団は適切な抗原特異性に対して相補的に染色した（図１５Ｂ）。 The results shown in FIG. 15 indicate that T cells were detected selectively and quantitatively in both experiments. In particular, in the detection performed on the lymphocytes of patient NRA13, only T cells were captured in the EBV region (see FIG. 15A ). T cells (left panel) detected from a 1: 1 mixture of NRA11 and NRA13 were specifically altered to EBV and CMV. In particular, after NACS cell sorting and fluorescent p / MHC tetramer staining, the populations were stained complementary to the appropriate antigen specificity ( FIG. 15B ).

患者ＮＲＡ１３からのＴ細胞は、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を有する細胞の混合物をつくるように連続的に希釈した（ＦＡＣＳによって〜０．４％，０．２％，および０．１％）（図１４Ｃ）。ＥＢＶ特異Ｔ細胞の３個の混合物を、ＥＢＶ／ＨＬＡ−Ａ２．１四量体でエンコードしたアレイ上で検出し、図１５Ｄにおいて示す。 T cells from patient NRA13 were serially diluted to produce a mixture of cells with EBV-specific T cells (˜0.4%, 0.2%, and 0.1% by FACS) (FIG. 14C). ). Three mixtures of EBV-specific T cells were detected on an array encoded with EBV / HLA-A2.1 tetramer and are shown in FIG. 15D .

図１５Ｃおよび図１５Ｄにおいて示す結果は、それぞれの一撃が〜０．１％程度低い頻度であったことを示す（図１５Ｄ、暗いグレーの矢印）。捕捉領域内の未染色細胞（黒色矢印）はすべての希釈で一定であり（−１−２細胞／スポット）、非特異的な相互作用からのバックグラウンドレベルを示す。Ｔ細胞を図示する目的で固定化した後蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体染色を組み込んだが、補足した細胞の特異性は、アレイの登録からそれぞれ画定することに留意されたい。
実施例１１：ＮＡＣＳアプローチを用いて固定化したＴ細胞の制限エンドヌクレアーゼを通した制御された選択的解放 The results shown in FIGS. 15C and 15D indicate that each blow was as low as ˜0.1% (FIG. 15D, dark gray arrows). Unstained cells (black arrows) in the capture area are constant at all dilutions (-1-2 cells / spot), indicating background levels from non-specific interactions. Note that the fluorescence p / MHC tetramer staining was incorporated after immobilization of the T cells for the purpose of illustration, but the specificity of the supplemented cells is defined from the array entries, respectively.
Example 11: Controlled selective release through restriction endonuclease of T cells immobilized using the NACS approach

ガラス上に固定した抗原特異Ｔ細胞は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびサイトカイン分泌アッセイ等の多くが［参考文献５，７］通常行われ基質に局在化した細胞に適合するため、第２分析にすぐに利用できる。しかし、いくつかの他の関連するアッセイは、それらをＴ細胞表現型またはゲノム／ｍＲＮＡ分析に用いるように設計した、または簡単に、表現型の培養が捕捉した細胞を解放する方法を必要とする。いずれかの解放機構は、理想的には与えられた細胞種類に対して選択的である。ＮＡＣＳに対して、ＤＮＡ限界かどうかを見極める出願は、制限エンドヌクレアーゼの配列特異性を用いることによって選択的に開裂する。 Antigen-specific T cells fixed on glass were localized in the substrate by performing many of immunohistochemistry (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH), cytokine secretion assay, etc. [Refs. 5, 7]. Since it is compatible with cells, it can be used immediately for the second analysis. However, some other related assays are designed to use them for T cell phenotype or genome / mRNA analysis, or simply require a method of releasing the cells captured by the phenotype culture . Either release mechanism is ideally selective for a given cell type. For NACS, applications that determine whether DNA limits are selectively cleaved by using the sequence specificity of restriction endonucleases.

独特の制限酵素部位を各ＤＮＡ配列に組み込んだ本明細書は、細胞分類のために使用し、抗原特異Ｔ細胞の異なる集団の接着は、事実、別々に制御されたことがわかった（図１６ｂ）。 This specification, which incorporated a unique restriction enzyme site into each DNA sequence, was used for cell sorting, and it was found that the adhesion of different populations of antigen-specific T cells was in fact controlled separately ( FIG. 16b ) . ).

とくに、実施例６のオリゴヌクレオチドＡおよびＢは、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩに対してそれぞれ特異的な６個のｂｐ制限酵素部位を組み込むことによって修飾し、図１６Ａにおいて概略的に示したアプローチにしたがってオリゴヌクレアーゼＡ_{ＥｃｏＲＩ}およびＢ_{ＢａｍＨＩ}を獲得した。 In particular, oligonucleotides A and B of Example 6 were modified by incorporating 6 bp restriction enzyme sites specific for the endonucleases EcoRI and BamHI, respectively, according to the approach outlined in FIG. 16A. Oligonuclease A _EcoRI and B _BamHI were obtained.

したがって、ＤＮＡマイクロアレイは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する直行する配列でプリントした。実施例７において説明したように準備したＪｕｒｋｅｔ^{ａ−ＭＡＲＴ−１}およびＪｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞および親油性染料で予め染色した（それぞれ赤および緑）を、その後実施例６において説明した手順に従ってＤＮＡ配列Ａ_{ＥｃｏＲＩ}およびＢ_{ＢａｍＨＩ}でプリントしたアレイ上で分類した。 Therefore, DNA microarrays were printed with orthogonal sequences with EcoRI and BamHI restriction enzyme sites. Jurket ^a-MART-1 and Jurket ^α-Tyr cells prepared as described in Example 7 and pre-stained with lipophilic dyes (red and green, respectively) were then DNA sequence A according to the procedure described in Example 6. _Sorted on arrays printed with _EcoRI and B _BamHI .

図１６Ｂにおいて示した結果は、Ａ_{ＥｃｏＲＩ}およびＢ_{ＢａｍＨＩ}の分類および対応する制限酵素でその後処理した選択した標的の正しい解放を示す。 The results shown in FIG. 16B show the correct release of selected targets subsequently treated with A _EcoRI and B _BamHI classification and corresponding restriction enzymes.

とくに、赤色染色を暗いグレーおよび緑色染色を明るいグレーで示した図１６Ｂｉにおいて示すように、細胞を最初にアレイ上に固定した。 In particular, cells were first fixed on the array, as shown in FIG. 16Bi , where red staining was shown in dark gray and green staining in light gray.

Ｔ細胞を固定後、アレイを、Ｂ_{ＢａｍＨＩ}スポットを開裂して結合Ｊｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞を選択的に解裂するＢａｍＨＩで処理した（図１６Ｂｉｉ）。反対に、別々のしかし同じアレイ上で、Ｊｕｒｋｅｔ^{α−Ｔｙｒ}細胞をＥｃｏＲｉで処理後に解放した（図１６Ｂｉｉｉ）。相補的なエンドヌクレアーゼ（ＥｃｏＲｉ対状態（ｉｉ）またはＢａｍＨＩ対状態（ｉｉｉ））で酵素処理する第２ラウンドは、残った接着細胞を除去した（図１６ｉｖ）。代案として、すべての捕捉細胞（ｉ）は、ＤＮａｓｅを付加する単一ステップにおいて非選択的に解放した。
実施例１２：溶液において捕捉した標的のＮＡＣＳ検出を行う手順 After fixing T cells, the array was treated with BamHI, which cleaves B _BamHI spots and selectively cleaves bound Jurket ^α-Tyr cells ( FIG. 16Bii ). Conversely, Jurket ^α-Tyr cells were released after treatment with EcoRi on separate but same arrays ( FIG. 16Biii ). The second round of enzymatic treatment with complementary endonucleases (EcoRi pair state (ii) or BamHI pair state (iii)) removed the remaining adherent cells ( FIG. 16iv ). As an alternative, all captured cells (i) were released non-selectively in a single step adding DNase.
Example 12: Procedure for performing NACS detection of targets captured in solution

細胞の標的集団を、エンコード捕捉剤を基質に結合する前に標的に接触させる手順に従って捕捉する。 The target population of cells is captured according to a procedure in which the encoded capture agent is contacted with the target prior to binding to the substrate.

このアプローチにしたがって行った一連の例示的な実験を図１７において示す。生体サンプルにおける対象のバイオマーカーを、溶液におけるポリヌクレオチドエンコード捕捉剤に結合させる。結合後、全サンプルをｃＤＮＡでプリントした基質に塗布する。生体サンプルは、基質に塗布するとき、ＤＮＡハイブリタイゼーションによって媒介した空間的に離れた場所におく。ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤に結合した積荷を、その後、当業者によって特定可能な従来の蛍光および他の可視化技術を用いて特定する。 A series of exemplary experiments performed according to this approach are shown in FIG . The biomarker of interest in the biological sample is bound to the polynucleotide-encoded capture agent in solution. After binding, all samples are applied to a substrate printed with cDNA. When the biological sample is applied to the substrate, it is placed in a spatially separated location mediated by DNA hybridization. The cargo bound to the polynucleotide-encoded capture agent is then identified using conventional fluorescence and other visualization techniques that can be identified by those skilled in the art.

図１７の実験において、エンコードポリヌクレオチド捕捉剤は、溶液における細胞表面上の生体標的に結合させるのに用いることができる。これは、パネルＡにおいて実証され、蛍光ポリヌクレオチドエンコードチロシナーゼ／ＨＬＡ−Ａ２．１ｐ／ＭＨＣ四量体をＪｕｒｋａｔ^{α―Ｔｙｒ}細胞を染色しフローサイトメトリで分析するのに用いた。これを、蛍光チロシナーゼ／ＨＬＡ−Ａ２．１ｐ／ＭＨＣ四量体と直接比較した。両方の試薬は同じ強度でＪｕｒｋａｔ^{α―Ｔｙｒ}細胞を染色した。ポリヌクレオチドエンコードチロシナーゼ／ＨＬＡ−Ａ２．１ｐ／ＭＨＣ四量体で予め染色したＪｕｒｋａｔ^{α―Ｔｙｒ}細胞を捕捉し、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって媒介したアレイ上で検出した（パネルＢ）。図を参照して結果の説明を与える。
実施例１３：タンパク質結合分子を有するさらなる最適化骨格捕捉剤 In the experiment of FIG. 17 , the encoded polynucleotide capture agent can be used to bind to a biological target on the cell surface in solution. This was demonstrated in panel A and fluorescent polynucleotide-encoded tyrosinase / HLA-A2.1p / MHC tetramer was used to stain Jurkat ^α-Tyr cells and analyze by flow cytometry. This was directly compared to the fluorescent tyrosinase / HLA-A2.1p / MHC tetramer. Both reagents stained Jurkat ^α-Tyr cells with the same intensity. Jurkat ^α-Tyr cells pre-stained with polynucleotide-encoded tyrosinase / HLA-A2.1p / MHC tetramer were captured and detected on an array mediated by DNA hybridization (panel B). An explanation of the results is given with reference to the figure.
Example 13: Further optimized backbone capture agent with protein binding molecules

さらなる最適化骨格を、すべてのサブクラスＩｇＧのＦｃドメインに結合する細菌再結合の族でありＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＭおよびＩｇＤにおいて限定されたタンパク質Ａ，タンパク質Ｇおよびタンパク質Ａ／Ｇによって与える。とくに、これらのタンパク質は、ＤＮＡをＮＨＳ−アミドカップリング化学を解してタンパク質表面上の遊離リジン残基にランダムに付着させる実施形態において非最適化骨格として機能する。結合タンパク質は、所定のバイオマーカーに対するＩｇＧ抗体である（例えばＴ細胞上に見られるＣＤ３）。モル過剰のＩｇＧ抗体をｓｓＤＮＡ−タンパク質Ａ／Ｇで培養し、対象の生体標的を分類および捕捉するのに用いる（例えば、抗−ＣＤ３−タンパク質Ａ／Ｇ−ｓｓＤＮＡ接合体は、細胞の複合体混合物からＴ細胞を分類するのに用いる）。 Further optimized scaffolds are provided by Protein A, Protein G and Protein A / G, a family of bacterial recombination that binds to the Fc domains of all subclass IgGs and restricted in IgA, IgE, IgM and IgD. In particular, these proteins function as non-optimized scaffolds in embodiments where DNA is attached randomly to free lysine residues on the protein surface through NHS-amide coupling chemistry. The binding protein is an IgG antibody against a given biomarker (eg, CD3 found on T cells). A molar excess of IgG antibody is cultured with ssDNA-protein A / G and used to classify and capture biological targets of interest (eg, anti-CD3-protein A / G-ssDNA conjugates are complex mixtures of cells Used to sort T cells from).

図１８において示したのは、分岐ペプチドの仮説の図である。ここで、ペプチドの長さは、Ｎ末端アラニンからＣ末端チロシン残基まで伸びた９個のアミノ酸である。Ｃ末端から位置４におけるリシン残基で分岐点を有し、この骨格を２価とする。Ｎ末端での反応性マレイミド基は、遊離を有する２個の結合タンパク質に付着し、エンコードポリヌクレオチドは、Ｃ末端のチロシン残基の隣の遊離地オールにＮＨＳ−アミドカップリングを解して付着する。結合タンパク質およびエンコードポリヌクレオチドに対する付着部位はこの分岐ペプチドアプローチで分離するため、その結果できた捕捉剤はすべて極性であり最適される。例示的な結合分子は、システイン残基（Ａｎａｓｐｅｃ，♯２９８９７）を有するＲＧＤペプチドである。検出する標的には、インテグリン受容体（ＡＴＣＣ，♯ＣＣＬ−９２）を発現する細胞がある。 FIG. 18 shows a hypothesis of a branched peptide. Here, the length of the peptide is 9 amino acids extending from the N-terminal alanine to the C-terminal tyrosine residue. The lysine residue at position 4 from the C-terminus has a branch point, and this skeleton is divalent. A reactive maleimide group at the N-terminus attaches to two binding proteins with liberation, and the encoded polynucleotide attaches via NHS-amide coupling to the free site all next to the C-terminal tyrosine residue. To do. Since the attachment sites for the binding protein and the encoded polynucleotide are separated by this branched peptide approach, all resulting capture agents are polar and optimized. An exemplary binding molecule is an RGD peptide with a cysteine residue (Anaspec, # 29897). Targets to be detected include cells that express the integrin receptor (ATCC, # CCL-92).

他の最適化したタンパク質骨格は、第１アミノ酸配列によって示したタンパク質ＳＡＣ３である。HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEAMNTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVGGSGCGGSGCGGSGCP（配列ＩＤ番号２５） Another optimized protein backbone is the protein SAC3 represented by the first amino acid sequence. HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEAMNTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVGGSGCGGSGCGGSGCP (sequence ID number 25)

この代案の最適化したストレプトアビジン骨格は、エンコードポリヌクレオチドが特異的に付着する部位に対するＣ末端での３システイン残基を有する。モル過剰のビオチン化ｐ／ＭＨＣ（チロシナーゼ／ＨＬＡ−Ａ２．１）にｓｓＤＮＡ−ＳＡＣ３を結合させることによって、その結果できた捕捉剤は、複合体混合物から標的Ｔ細胞を検出するのに用いる。図１９において、最適化骨格ＳＡＣ３のＴ細胞捕捉（Ｊｕｒｋａｔ^{α―Ｔｙｒ}細胞）効果（右パネル）を、最適化骨格ＳＡＣと直接比較する。細胞捕捉効果は同じである。 This alternative optimized streptavidin backbone has a 3 cysteine residue at the C-terminus to the site to which the encoded polynucleotide is specifically attached. By coupling ssDNA-SAC3 to a molar excess of biotinylated p / MHC (tyrosinase / HLA-A2.1), the resulting capture agent is used to detect target T cells from the complex mixture. In FIG. 19 , the T cell capture (Jurkat ^α-Tyr cell) effect (right panel) of the optimized scaffold SAC3 is directly compared to the optimized scaffold SAC. The cell trapping effect is the same.

いずれかの形のＳＡＣ最適化機構は、４：１の比のビオチンとの結合を保持する。明細書は、１個以上のＳＡ最適化および特定の標的と異なる最適化ＳＡの機能を提供する。骨格は、標的に結合する能力の観点から最終的に選択する。図１８において説明したような。分岐ペプチドは、ＳＡ結合の変わりに多重結合として使用し、実験設計によって一重結合もしくは二重結合またはｎ結合を有する。
実施例１４：タンパク質結合分子を有する捕捉剤 Either form of SAC optimization mechanism retains a 4: 1 ratio of binding to biotin. The specification provides one or more SA optimizations and optimized SA functions that differ from a particular target. The scaffold is ultimately selected in terms of its ability to bind to the target. As described in FIG . Branched peptides are used as multiple bonds instead of SA bonds and have single or double bonds or n bonds depending on the experimental design.
Example 14: Capture agent with protein binding molecule

代案の結合タンパク質および骨格を用いる。インテグリンは、概してペプチド様アルギニンーグリシン-−アスパラギン酸から成る細胞外マトリクスタンパク質に結合する二量体細胞表面受容体である。ＲＧＤ様を有するビオチン化ペプチドは、Ａｎａｓｐｅｃ（♯６２３４７）から購入する。これらのタンパク質結合分子は、ＳＡＣ−Ａのような最適化骨格に組み込み、３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＣＣ，＃ＣＣＬ−９２）等のインテグリンを発現する標的細胞を含む細胞集団を分類するのに用いる。
実施例１５：リンカーを有する捕捉剤 Alternative binding proteins and scaffolds are used. Integrins are dimeric cell surface receptors that bind to extracellular matrix proteins that are generally composed of peptide-like arginine-glycine-aspartate. A biotinylated peptide with RGD-like is purchased from Anaspec (# 62347). These protein binding molecules are incorporated into an optimized scaffold such as SAC-A and used to classify cell populations containing target cells that express integrins such as 3T3 fibroblasts (ATCC, # CCL-92).
Example 15: Capture agent with linker

リンカーは、結合タンパク質を骨格に接続させる機能を果たす。これは、ペプチド配列から成る。例えば、リンカーＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列ＩＤ番号２６）はＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子のＣ末端に付加する。ビオチン分子は、酵素ＢｉｒＡリガーゼを有するその結果できたリンカーに付着する。このビオチン化ｐ／ＭＨＣ構成物は、最適化Ａ−ＳＡＣ骨格と接合して、ｃＤＮＡプリント基質上の抗原特異細胞を分類するのに用いる。 The linker serves to connect the binding protein to the scaffold. This consists of a peptide sequence. For example, the linker GGGLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO: 26) is added to the C-terminus of the HLA-A2.1 MHC molecule. The biotin molecule is attached to the resulting linker with the enzyme BirA ligase. This biotinylated p / MHC construct is conjugated to an optimized A-SAC backbone and used to sort antigen specific cells on a cDNA print substrate.

他のリンカーは、ペプチドＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ（配列ＩＤ番号２７）から成り、これもＭＨＣ分子のような結合タンパク質のＣ末端に付加する。グリシン残基は、酵素ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）でアルデヒド基に修飾する。ヒドラジドを含む骨格（例えば、ＳＡＮＨ（スクシンイミド６−ヒドラジノニコチン酸酢酸ヒドラジン、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を骨格ＳＡと反応させる）は、アルデヒド−ＭＨＣ結合タンパク質に付着するのに用いることができる。 The other linker consists of the peptide LCTPSRGSLFFTGR (SEQ ID NO: 27), which is also added to the C-terminus of a binding protein such as an MHC molecule. Glycine residues are modified to aldehyde groups with the enzyme formylglycine synthase (FGE). A backbone containing hydrazide (eg, reacting SANH (succinimide 6-hydrazinonicotinate hydrazine acetate, Sollink) with backbone SA) can be used to attach to aldehyde-MHC binding proteins.

リンカーの例は、ポリウンアクリルＲＮＡ配列ＵＵＵＵＵＵＵＵＵ（配列ＩＤ番号２８）である。このリンカーは、ＲＮａｓｅの存在下で解裂し、エンドリボヌクレアーゼは非対（すなわち単一のらせん鎖）ＣおよびＵ残基の３´端を解裂する。
実施例１６：細胞捕捉の表面マーカーをＮＡＣＳでプロファイルする免疫ＰＣＲ An example of a linker is the polyacrylic RNA sequence UUUUUUUUU (SEQ ID NO: 28). This linker is cleaved in the presence of RNase and the endoribonuclease cleaves the 3 'end of unpaired (ie, single helix) C and U residues.
Example 16: ImmunoPCR profiling surface markers of cell capture with NACS

アレイ上で捕捉した細胞をさらに分析する。一つの分析アッセイは、免疫ＰＣＲである［参考文献５１］。ここで異なるＤＮＡタグで標識化した抗体（ＤＥＡＬ接合体）は、対象に標的に結合させるのに使用し、この実施例において、細胞表面上で発現するバイオマーカーである。結合後、抗体上のＤＮＡタグを拡大してＰＣＲを用いて検出した。これは、溶液からタンパク質を機能させることを示し、明細書は、この概念が、バイオメーカーは細胞表面に固定されているとき実現可能であることを示す。図２０（上部右パネル、フローサイトメトリによって実証した）に示したＥＧＦＲ（ＣＤ細胞）を発現する細胞株およびＥＧＦＲを発現しない細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞）は、ともにα−ＥＧＦＲ−ｓｓＤＮＡＤＥＡＬ接合体で染色する。染色後、ＥＧＦＲ抗体上のタグをＰＣＲおよびＱ−ＰＣＲを用いて詳しく説明した（下部パネル）。タグの存在は、１４．６サイクル（ＣＤ細胞）および２３．２サイクル（Ｊｕｒｋａｔ細胞）内に検出した。コレは４００：１のノイズに対するシグナルに関連する。 The cells captured on the array are further analyzed. One analytical assay is immuno-PCR [Ref. 51]. Here, an antibody (DEAL conjugate) labeled with a different DNA tag is used to bind a target to a target, and in this example is a biomarker expressed on the cell surface. After binding, the DNA tag on the antibody was expanded and detected using PCR. This indicates that the protein is functioning from solution and the specification shows that this concept is feasible when the biomaker is immobilized on the cell surface. The cell lines expressing EGFR (CD cells) and cell lines not expressing EGFR (Jurkat cells) shown in FIG. 20 (top right panel, demonstrated by flow cytometry) are both α-EGFR-ssDNA DEAL conjugates. Stain. After staining, the tag on the EGFR antibody was described in detail using PCR and Q-PCR (lower panel). The presence of the tag was detected within 14.6 cycles (CD cells) and 23.2 cycles (Jurkat cells). This is related to the signal for 400: 1 noise.

平行して、ＤＮＡでエンコードしたｐ／ＭＨＣ四量体をＴ細胞上のＴＣＲの存在を検出するのに用いた。２個の細胞株、一方はＭＡＲＴ−１抗原に特異的なＴＣＲを発現し（Ｊｕｒｋａｔ^{ａ―ＭＡＲＴ−１}細胞）もう片方はチロシナーゼ抗原に特異的なＴＣＲを発現する（Ｊｕｒｋａｔ^{α―Ｔｙｒ}細胞、両方の細胞株は蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体で染色することによって確認しフローサイトメトリによって分析した、図２０、上部左パネル）を、ＤＮＡでエンコードしたＭＡＲＴ−１／ＨＬＡ−Ａ２．１ｐ／ＭＨＣ四量体で染色した。ＤＮＡタグは、ＰＣＲによって拡大してゲル電気泳動で検出した。Ｊｕｒｋａｔ^{α−ＭＡＲＴ−１}細胞は、１５サイクル内で検出したが、接合ＴＣＲを発現しないＪｕｒｋａｔ^{α―Ｔｙｒ}細胞は、１０サイクル前後でゲル内に現れた。したがって、ＭＡＲＴ−１特異ＴＣＲの存在を特異的に検出した。
実施例１７：ＮＡＣＳおよびＤＥＡＬ接合を用いたＴ細胞の動的機能プロファイリング In parallel, DNA-encoded p / MHC tetramer was used to detect the presence of TCR on T cells. Two cell lines, one expresses a TCR specific for MART-1 antigen (Jurkat ^a-MART-1 cells) and the other expresses a TCR specific for tyrosinase antigen (Jurkat ^α-Tyr cells, both Cell line was confirmed by staining with fluorescent p / MHC tetramer and analyzed by flow cytometry, FIG. 20 , upper left panel), DNA encoded MART-1 / HLA-A2.1p / MHC tetra Stained with a polymer. The DNA tag was expanded by PCR and detected by gel electrophoresis. Jurkat ^α-MART-1 cells were detected within 15 cycles, whereas Jurkat ^α-Tyr cells that did not express conjugated TCR appeared in the gel around 10 cycles. Therefore, the presence of MART-1-specific TCR was specifically detected.
Example 17: Dynamic functional profiling of T cells using NACS and DEAL conjugation

本明細書は、ｐ／ＭＨＣＮＡＣＳでＥＬＩＳＰＯＴ型サンドウィッチアッセイを組み込むことによって捕捉したマウスＴＣＲトランスジェニック膵細胞「ｏｎ−ｔｈｅ−ｓｐｏｔ」によって生成したサイトカインを検出する。３個のマウス抗サイトカイン抗体（ＩＬ−２，ＩＦＮ−ｙおよびＴＮＦ−ａ）をそれぞれＤＮＡ鎖Ａ´，Ｂ´，およびＣ´でエンコードした。Ｈ−２Ｋｂ−ＯＶＡ２５７−２６４ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体をすべての３個のらせん鎖にエンコードした。ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体および抗体接合体をプールして、相補的ならせん鎖Ａ，ＢおよびＣにプリントしたマイクロアレイに組み込んだ。マウスＯＴ１リンパ球（ＴＣＲトランスジェニック由来で、ほとんどの膵細胞はモデル抗原ＯＶＡ２５７−２６４に特異的である）を、その後アレイ上に播種した。２，５、または１８時間培養した後、プールしたサイトカイン検出抗体を加えて共焦点顕微鏡でスライドを画像化した（図２２Ａ）。炎症性サイトカインＩＦＮ−ｙは、５および１８の時点で検出し、時間とともに平均径が増加し、分子拡散および持続分泌に寄与する拡散塊として現れた（５時間で直径５０〜１００μｍ）。各一撃の局所的近接の紙面は、各蛍光塊は単一細胞であったが、隣り合う細胞は比応答性であることがわかり（図２２Ｂ）、各ＩＦＮ−ｙ一撃が単一細胞由来であることが示唆される。ＩＦＮ−ｙ塊の数は、５および１８時間の間は３で一定であり、その時間は活性化Ｔ細胞の数が増加しなかったことを意味する。高濃度のマウスＩＬ−２およびＴＮＦ−ａはこれらの時点では検出されなかった。 The present specification detects cytokines produced by mouse TCR transgenic pancreatic cells “on-the-spot” captured by incorporating ELISPOT type sandwich assay with p / MHC NACS. Three mouse anti-cytokine antibodies (IL-2, IFN-y and TNF-a) were encoded with DNA strands A ′, B ′ and C ′, respectively. The H-2Kb-OVA257-264 ssDNA-p / MHC tetramer was encoded into all three helical strands. ssDNA-p / MHC tetramers and antibody conjugates were pooled and incorporated into microarrays printed on complementary helical strands A, B and C. Mouse OT1 lymphocytes (derived from TCR transgenics, most pancreatic cells are specific for the model antigen OVA257-264) were then seeded on the array. After culturing for 2, 5 or 18 hours, pooled cytokine detection antibodies were added and slides were imaged with a confocal microscope ( FIG. 22A ). The inflammatory cytokine IFN-y was detected at 5 and 18 time points and increased in mean diameter with time and appeared as a diffuse mass contributing to molecular diffusion and sustained secretion (50-100 μm in diameter at 5 hours). The local proximity of each blow reveals that each fluorescent mass was a single cell, but the neighboring cells were specific responsive ( Figure 22B ), and each IFN-y blow was derived from a single cell. It is suggested that there is. The number of IFN-y masses was constant at 3 between 5 and 18 hours, which means that the number of activated T cells did not increase. High concentrations of mouse IL-2 and TNF-a were not detected at these time points.

行った実施例において、本明細書は、Ｔ細胞にとくに関連して説明した、高効率な標的検出および分類のための強固なモジュール式ｐ／ＭＨＣアレイの生成方法を説明する。直行するＤＮＡ配列の大きなセット［参考文献１９，２４］は、Ｔ細胞スクリーニング実験に対する高次ｐ／ＭＨＣアレイのモジュール式組み立てを可能にする（例えば、一つのセットのＤＮＡ配列は、いずれかの組み合わせのｐ／ＭＨＣアレイを生成するために互換的に用いる）。これは、近年、新規の抗原ペプチドがマウスおよびヒトにおいて多色フローサイトメトリを用いたＣＤ８＋スクリーニング実験を通して高濃度で発見された［参考文献３３，３４］ＴＣＲペプチドエピトープの発見の分野ですぐに用いることができる（２０００もの異なるｐ／ＭＨＣ四量体を準備し試験した）。 In the examples performed, the present specification describes a method for generating a robust modular p / MHC array for highly efficient target detection and classification as described with particular reference to T cells. A large set of orthogonal DNA sequences [Refs. 19, 24] allows modular assembly of higher order p / MHC arrays for T cell screening experiments (eg, a set of DNA sequences can be combined in any combination) Used interchangeably to generate p / MHC arrays). This has recently been used in the field of discovery of TCR peptide epitopes where novel antigenic peptides have been discovered in high concentrations through CD8 + screening experiments using multicolor flow cytometry in mice and humans [Ref. 33, 34]. (As many as 2000 different p / MHC tetramers were prepared and tested).

ＮＡＣＳアレイは、この実験を簡素化することが期待される。単一のｐ／ＭＨＣモノマーを生成する特定の通常の方法は時間がかかり困難であるが、近年、従来のペプチド交換技術を用いて１０００エレメントｐ／ＭＨＣライブラリを比較的真っすぐに敏速に構築することができるようになった［参考文献３４〜３６］。これらのペプチド交換技術のＮＡＣＳへの組む込みは、現実的である。ＮＡＣＳアレイは、再現性および均一性等の重要な基準において評価した従来のスポット化アレイより優れている。細胞分類にＤＮＡ配列を用いる多用途は、プログラムすることができるように利用し、下流分析の制限エンドヌクレアーゼで固定化したＴ細胞の標的集団を選択的に解放できる。ｐ／ＭＨＣ四量体アレイの性能、容易さおよびモジュール式集合によって、ＮＡＣＳ多重のＴ細胞検出に対する多用途のプラットフォームとして約束される。 A NACS array is expected to simplify this experiment. Certain conventional methods of generating a single p / MHC monomer are time consuming and difficult, but in recent years, using conventional peptide exchange techniques, a 1000 element p / MHC library has been constructed relatively straightforwardly and quickly. [References 34-36]. Incorporation of these peptide exchange techniques into NACS is realistic. NACS arrays are superior to conventional spotted arrays evaluated on key criteria such as reproducibility and uniformity. Versatile use of DNA sequences for cell sorting can be used to be programmed to selectively release target populations of T cells immobilized with restriction endonucleases for downstream analysis. The performance, ease and modularity of p / MHC tetramer arrays promises a versatile platform for NACS-multiplexed T cell detection.

本明細書はまた、ＮＡＣＳプラットフォームの多くの利点も実証する。細胞を捕捉する表面結合ｐ／ＭＨＣ四量体を利用する特定の文献のアプローチよりも優れている。細胞分類は通常のＤＮＡプリント技術を介して準備したガラス基板上で行うため、組み込むのが簡単で安価である。加えて、分類した細胞は選択的に解放でき、ＮＡＣＳ分類した細胞上の生体分析方法を展開することができる。 This document also demonstrates the many advantages of the NACS platform. It is superior to certain literature approaches that utilize surface-bound p / MHC tetramers that trap cells. Cell sorting is performed on a glass substrate prepared through a normal DNA printing technique, so that it is easy and inexpensive to incorporate. In addition, the sorted cells can be selectively released, and bioanalytical methods on NACS sorted cells can be developed.

本明細書は、ＮＡＣＳがＴＣＲ特異性に基づいたＴ細胞の多重分類に及ぶ用途を発見することを期待する。前述した実施例において用いたプラットフォームの主な成分−ストレプトアビジンーシステイン核および直行する単一らせん鎖ＤＮＡ配列−は、配向したカップリングおよび空間的対処を可能にするように合理的に開発した。したがって、子オプラットフォームは、ビオチンで標識化した結合タンパク質または小分子のいずれかの族に入る。ＳＡの価数の結果としてモノマーよりもｐ／ＭＨＣ四量体の親和性の増加は、他の捕捉剤まで広がり、抗体、アパタマーまたはペプチド等の高い親和性から中程度の親和性までの範囲のプローブを有する細胞アレイを生成することを可能にする。 The present specification hopes to find applications where NACS extends to multiple classification of T cells based on TCR specificity. The main components of the platform used in the previous examples—streptavidin—the cysteine nucleus and the orthogonal single helix DNA sequence—has been reasonably developed to allow for oriented coupling and spatial handling. Thus, the child platform falls into either the family of binding proteins or small molecules labeled with biotin. As a result of the valence of SA, the increase in affinity of p / MHC tetramer over monomer extends to other capture agents, ranging from high to moderate affinity for antibodies, apatamers or peptides. It makes it possible to produce cell arrays with probes.

とくに、ＮＡＣＳアプローチは、ＭＨＣ複合体を含む治療および／または診断用途において用いる。ＭＨＣ複合体は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の溝内にある抗原（ペプチド）の断片から成る。ＴＣＲの一部は、ＭＨＣに対する親和性を有し、様々な部分がペプチド抗原に対して親和性を有する。このペプチドは、非常に短いフラグメントであり（＜１０アミノ酸長さ）、そのため、ＴＣＲおよびＭＨＣ／抗原間の親和性は弱い。それにもかかわらず、多くの基礎的および臨床目的に対して、それらの抗原特異性によるＴ細胞の分類が非常に重要である。この分類は、免疫システムが感染症または癌等のいくつかの疾患に反応するかどうかを画定するのに用いる。また、黒色腫等の特定の癌の治療における用途を見つける様々な免疫治療の重要な鍵である。この場合、患者からのＴ細胞を回収し、遺伝子的に修飾して、特定の癌細胞を特定し殺すようにエンコードした抗原特異Ｔ細胞とする。 In particular, the NACS approach is used in therapeutic and / or diagnostic applications involving MHC complexes. The MHC complex consists of a fragment of an antigen (peptide) that lies within the groove of a major histocompatibility gene complex (MHC) molecule. Some of the TCRs have affinity for MHC, and various parts have affinity for peptide antigens. This peptide is a very short fragment (<10 amino acids long), so the affinity between TCR and MHC / antigen is weak. Nevertheless, the classification of T cells by their antigen specificity is very important for many basic and clinical purposes. This classification is used to define whether the immune system responds to some disease such as infection or cancer. It is also an important key to various immunotherapy finding applications in the treatment of specific cancers such as melanoma. In this case, T cells from the patient are collected and genetically modified into antigen-specific T cells encoded to identify and kill specific cancer cells.

一度修飾して、それらのＴ細胞を患者に戻す。この治療におけるすべてのステップには、Ｔ細胞を分類するステップがあるが、最後のステップ−Ｔ細胞が抗原特異Ｔ細胞を有するかどうかを特定するステップ−は、抗原特異性によってＴ細胞を分類するステップを含む。複合体混合物から様々な抗原特異性Ｔ細胞を分類する高親和性の試薬は、この治療の中核を成す。 Once modified, those T cells are returned to the patient. All steps in this treatment include the step of classifying T cells, but the last step-identifying whether T cells have antigen-specific T cells-classifies T cells by antigen specificity. Includes steps. High-affinity reagents that sort different antigen-specific T cells from the complex mixture are central to this therapy.

他の実施例は、様々な巻くタンパク質によって細胞を分類するのが望ましいが、それらの巻くタンパク質は抗体ベースの分類方法の良い「操作」を提供しない。 While other embodiments desirably sort cells by various winding proteins, those winding proteins do not provide a good “manipulation” of antibody-based sorting methods.

例は、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩと呼ぶＥＧＦＲタンパク質の遺伝子的突然変異体を発現する癌細胞である。ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩは、発癌タンパク質であるー重要な遺伝子的突然変異が癌を導くことを意味する。しかし、それはまた膜タンパク質であり、タンパク質のほとんどの細胞外部位が解裂される。残りの部分は、小さな「操作」を示し、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩに対する抗体は、タンパク質に対して弱い親和性しか示さない。ＥＧＦＲ，ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩなどの様々な癌に関連するタンパク質による腫瘍内の細胞の多重分類は、癌に関する重要な診断情報を提供し、直接治療または組み合わせ治療に利用できる。 An example is a cancer cell that expresses a genetic mutant of the EGFR protein called EGFR-VIII. EGFR-VIII is an oncogenic protein-meaning that important genetic mutations lead to cancer. However, it is also a membrane protein and most extracellular sites of the protein are cleaved. The remaining part shows a small “manipulation” and the antibody against EGFR-VIII shows only a weak affinity for the protein. Multiple classification of cells within a tumor by various cancer-related proteins such as EGFR, EGFR-VIII provides important diagnostic information about the cancer and can be used for direct or combination therapy.

要約すると、いくつかの実施形態においてここで与えるのは、標的検出のためのポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびとくに標的結合成分、骨格成分および制御された方法でカップリングおよび分離できる標準化した分子単位によって形成したエンコード成分を有し、モジュール式ポリヌクレオチド捕捉剤および関連する構成方法およびシステムである。 In summary, in some embodiments, provided herein are polynucleotide encoded capture agents for target detection, and in particular target binding components, backbone components and standardized molecular units that can be coupled and separated in a controlled manner. A modular polynucleotide capture agent and associated construction methods and systems with encoding components formed.

上述した実施例は、当業者に本明細書の捕捉剤、装置、システムのおよび方法の実施形態のつくり方および用途を完全に開示し説明するが、発明の範囲を限定することはない。当業者に明らかである本発明を行うための上述の修正は、以下の請求項の範囲内で行う。明細書におけるすべての特許文献および文献は、当業者の指標となる。本明細書に示したすべての参考文献は、各参考文献をそれぞれ全体に参照して組み込むように、参照して組み込む。 The above-described examples fully disclose and describe how to make and use embodiments of the capture agents, devices, systems and methods herein, but do not limit the scope of the invention. The modifications described above for carrying out the invention which are obvious to a person skilled in the art are made within the scope of the following claims. All patent documents and documents in the specification are indicative of those skilled in the art. All references provided herein are incorporated by reference as if each reference was incorporated in its entirety.

背景、詳細な説明、および実施例において示した各文献（特許文献、特許明細書、雑誌文書、要旨、研究室マニュアル、本または他の明細書）のすベての説明は、参照して組み込む。さらに、提出した文書のハードコピーおよび関連するコンピュータ読み取りも共に参照して全体に組み込む。 The background, detailed description, and all descriptions of each document (patent document, patent specification, journal document, abstract, laboratory manual, book or other specification) given in the examples are incorporated by reference. . In addition, both the hard copy of the submitted document and the associated computer reading are referenced and incorporated in their entirety.

本発明は、特定の成分または生体システムに限定されず、もちろん変化することを理解されたい。また、ここで用いる技術は、特定の実施形態を説明する目的のみであり、限定することも理解されたい。本明細書および添付した請求項において用いたように、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明確に説明する内容がなければ単数有する。用語「複数の」は、明確に説明する内容がなければ２個またはそれ以上有する。断りのない限り、ここで用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。 It should be understood that the present invention is not limited to a particular component or biological system, but will of course vary. It should also be understood that the techniques used herein are for the purpose of describing particular embodiments only and are limited. As used in this specification and the appended claims, “a”, “an”, and “the” have the singular unless explicitly stated otherwise. The term “plurality” has two or more unless specifically stated otherwise. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art of the present invention.

特定の方法および材料を本発明において説明するが、ここで説明するのと類似した方法および材料は、ここで説明する特定の実施例を試験するのに用いることができる。 Although specific methods and materials are described in the present invention, methods and materials similar to those described herein can be used to test the specific embodiments described herein.

本発明の多くの実施形態を説明した。しかし、本発明の意味および範囲を逸脱することなく様々な修正をすることが可能である。したがって、他の実施形態は以下の請求項の範囲内とする。 A number of embodiments of the invention have been described. However, various modifications can be made without departing from the meaning and scope of the present invention. Accordingly, other embodiments are within the scope of the following claims.

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Hadrup, S.R.; van Esch, W.J.; Heemskerk, M.H.; Ovaa, H.; Schumacher, T.N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008,105,3825-3830.
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35) Bakker, AH; Hoppes, R .; Linnemann, C .; Toebes, M .; Rodenko, B .; Berkers, CR;
Hadrup, SR; van Esch, WJ; Heemskerk, MH; Ovaa, H .; Schumacher, TN Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105, 3825-3830.
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Claims

標的に特異的に結合するようにしたモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、
標的に特異的に結合するようにした少なくとも１個の結合分子と、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにしたエンコードポリヌクレオチドと、
少なくとも１個の結合分子および位置的に区別可能な骨格結合ドメインを有するエンコードポリヌクレオチドに結合するようにした骨格分子と、
を有し、
位置的に区別可能な骨格結合ドメインは、骨格分子上に準備して、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にするものとする、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 A modular polynucleotide encoded capture agent adapted to specifically bind to a target, the modular polynucleotide encoded capture agent comprising:
At least one binding molecule adapted to specifically bind to the target;
An encoding polynucleotide adapted to specifically bind to a substrate polynucleotide attached to the substrate;
A backbone molecule adapted to bind to an encoding polynucleotide having at least one binding molecule and a positionally distinguishable backbone binding domain;
Have
A positionally distinguishable scaffold binding domain is prepared on the scaffold molecule and, when attached to at least one binding molecule and the encoding polynucleotide, at least one binding molecule and substrate poly that specifically binds to a target. A modular polynucleotide-encoded capture agent that allows for the presence of an encoded polynucleotide that specifically binds to the nucleotide.

請求項１に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で、
骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子に結合する第１骨格結合ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドに結合する第２骨格結合ドメインを有し、
第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、直行する化学物質を通して少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するものとする、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 A modular polynucleotide-encoded capture agent according to claim 1,
The scaffold binding domain has a first scaffold binding domain that binds to at least one binding molecule and a second scaffold binding domain that binds to the encoding polynucleotide;
A modular polynucleotide-encoded capture agent, wherein the first and second backbone-binding domains bind to at least one binding molecule and encoding polynucleotide through an orthogonal chemical.

第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインを骨格結合分子上に準備して、骨格分子に結合した少なくとも１個の結合分子および骨格分子に結合したエンコードポリヌクレオチド間の相互作用を最小化するものとする、請求項２に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 A first skeletal binding domain and a second skeletal binding domain are provided on the skeletal binding molecule to minimize the interaction between at least one binding molecule bound to the skeletal molecule and the encoding polynucleotide bound to the skeletal molecule. The modular polynucleotide-encoded capture agent according to claim 2.

骨格分子は多くの第１骨格結合ドメインおよび／または多くの第２骨格結合ドメインを有するものとする、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 The modular polynucleotide-encoded capture agent according to any one of claims 1 to 3, wherein the backbone molecule has a number of first backbone binding domains and / or a number of second backbone binding domains.

骨格分子上の多くの第１結合ドメインはそれぞれ少なくとも１個の結合分子に結合し、骨格分子上の多くの第２結合ドメインはそれぞれエンコードポリヌクレオチドに結合するものとする、請求項４に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 The number of first binding domains on the scaffold molecule each bind to at least one binding molecule, and the number of second binding domains on the scaffold molecule each bind to an encoded polynucleotide. Modular polynucleotide encoding capture agent.

第２骨格結合ドメインは、ドメインを少なくとも１個の結合分子に結合する第１骨格結合を接続するリンカー分子を有する少なくとも１個の結合分子に結合するものとする、請求項２〜５のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 6. The second scaffold binding domain shall bind to at least one binding molecule having a linker molecule connecting the first scaffold bond that binds the domain to at least one binding molecule. A modular polynucleotide-encoded capture agent according to claim 1.

リンカー分子は従来のリンカーであるとする、請求項６に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 The modular polynucleotide encoded capture agent of claim 6, wherein the linker molecule is a conventional linker.

少なくとも１個の結合分子は、標的細胞に結合する多くの同じまたは異なる結合分子を有するものとする、請求項１〜７のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 The modular polynucleotide-encoded capture agent according to any one of claims 1 to 7, wherein the at least one binding molecule has a number of the same or different binding molecules that bind to the target cell.

エンコードポリヌクレオチドは、関連する制限酵素によって解裂するために存在するエンコードポリヌクレオチドにおいて準備した少なくとも１個の制限酵素部位を有するものとする、請求項１〜８のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 9. The encoding polynucleotide shall have at least one restriction enzyme site provided in the encoding polynucleotide present for cleavage by the relevant restriction enzyme. Modular polynucleotide encoding capture agent.

少なくとも１個の骨格分子および少なくとも１個の結合分子はタンパク質であるとする、請求項１〜９のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 The modular polynucleotide-encoded capture agent according to any one of claims 1 to 9, wherein at least one backbone molecule and at least one binding molecule are proteins.

骨格分子は、ストレプトアビジン、ＳＡＣ，ＳＡＣ３、抗体または最適化したそれらの変異体であるとする、請求項１０に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 The modular polynucleotide-encoded capture agent of claim 10, wherein the backbone molecule is streptavidin, SAC, SAC3, an antibody or an optimized variant thereof.

少なくとも１個の結合分子は、ＭＨＣ二量体、ＭＨＣ三量体、またはＭＨＣ四量体、アパタマー、小分子または抗体であるとする、請求項１０または１１に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 The modular polynucleotide-encoded capture agent according to claim 10 or 11, wherein the at least one binding molecule is an MHC dimer, MHC trimer, or MHC tetramer, aptamer, small molecule or antibody. .

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は極性モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤であるとする、請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。 The modular polynucleotide encoded capture agent according to any one of claims 1 to 12, wherein the modular polynucleotide encoded capture agent is a polar modular polynucleotide encoded capture agent.

サンプルにおける標的を検出する方法で、その方法は、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドをモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤に結合するステップで、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合する骨格分子を有し、少なくとも１個の結合分子は特異的に標的に結合し、エンコードポリヌクレオチドは基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するステップと、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドに結合したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を検出するステップと、
を有するものとする方法。 A method for detecting a target in a sample, the method comprising:
In the step of binding the substrate polynucleotide attached to the substrate to the modular polynucleotide encoded capture agent, the modular polynucleotide encoded capture agent has at least one binding molecule and a backbone molecule that binds to the encoded polynucleotide, and at least One binding molecule specifically binds to the target, and the encoding polynucleotide specifically binds to the substrate polynucleotide attached to the substrate;
Detecting a modular polynucleotide-encoded capture agent-target complex bound to a substrate polynucleotide attached to the substrate;
A method of having

基質に付着した基質ポリヌクレオチドのモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤との結合は、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドを提供し、
少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着する骨格分子を有するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を提供し、少なくとも１個の結合分子は標的に特異的に結合し、エンコードポリヌクレオチドは基質ポリヌクレオチドに特異的に結合し；また、
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を、結合分子をモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体における標的に結合させる時間および条件でサンプルおよび基質に接触させ、
エンコードポリヌクレオチドを基質ポリヌクレオチドに結合する
ことによって行うものとする請求項１４に記載の方法。 Binding of the substrate polynucleotide attached to the substrate to the modular polynucleotide-encoded capture agent is:
Providing a substrate polynucleotide attached to the substrate;
Provided is a modular polynucleotide encoded capture agent having at least one binding molecule and a backbone molecule attached to the encoded polynucleotide, wherein the at least one binding molecule specifically binds to a target, and the encoded polynucleotide is a substrate polynucleotide Specifically binding to; and
Contacting the sample and substrate with a modular polynucleotide encoded capture agent for a time and under conditions that allow the binding molecule to bind to the target in the modular polynucleotide encoded capture agent-target complex;
15. The method of claim 14, wherein the method is performed by binding an encoding polynucleotide to a substrate polynucleotide.

モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は請求項１〜１３のうち一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤であるとする、請求項１４に記載の方法。 15. The method of claim 14, wherein the modular polynucleotide encoded capture agent is the modular polynucleotide encoded capture agent of one of claims 1-13.

サンプルにおける標的分子を検出するシステムは、このシステムは、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドを有する基質と；
標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子と、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドと、
少なくとも１個の結合分子および位置的に区別可能な骨格結合ドメインを有するエンコードポリヌクレオチドに結合するようにする骨格分子と
を有するものとするシステム。 The system that detects the target molecule in the sample is
A substrate having a substrate polynucleotide attached to the substrate;
At least one binding molecule that specifically binds to the target;
An encoding polynucleotide that specifically binds to a substrate polynucleotide attached to the substrate;
A system comprising: at least one binding molecule and a backbone molecule adapted to bind to an encoded polynucleotide having a positionally distinguishable backbone binding domain.

骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子に結合する第１骨格結合ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドに結合する第２骨格結合ドメインを有するものとする、請求項１７に記載のシステム。 18. The system of claim 17, wherein the backbone binding domain comprises a first backbone binding domain that binds to at least one binding molecule and a second backbone binding domain that binds to an encoded polynucleotide.

第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、骨格結合分子上に準備して、骨格分子に結合した少なくとも１個の結合分子および骨格分子に結合した第２結合分子の間の相互作用を最小化するものとする、請求項１８に記載のシステム。 A first scaffold binding domain and a second scaffold binding domain are provided on the scaffold binding molecule to minimize interaction between at least one binding molecule bound to the scaffold molecule and the second binding molecule bound to the scaffold molecule. The system of claim 18, wherein:

複数の標的を分類する方法で、その方法は、
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤に付着した複数の基質ポリヌクレオチドに結合するステップで、各基質ポリヌクレオチドは配列特異性で互いに位置的に区別でき、複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の各モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は少なくとも１個の結合分子に付着する骨格分子およびエンコードポリヌクレオチドを有し、少なくとも１個の結合分子は、複数の標的のそれぞれに特異的に結合し、エンコードポリヌクレオチドは複数の基質ポリヌクレオチドの配列特異的および位置的に区別できる基質ポリヌクレオチドに特異的に結合し、各結合分子およびエンコードポリヌクレオチドは互いに結合的に区別可能であるステップと；および
基質に結合した複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体における複数の標的を分類するステップと
を有するものとする方法。 A method for classifying a plurality of targets, the method comprising:
In the step of binding to a plurality of substrate polynucleotides attached to a plurality of modular polynucleotide encoded capture agents, each substrate polynucleotide can be positionally distinguished from each other by sequence specificity, and each of the plurality of modular polynucleotide encoded capture agents can be The modular polynucleotide encoded capture agent has a backbone molecule and an encoding polynucleotide attached to at least one binding molecule, wherein the at least one binding molecule specifically binds to each of a plurality of targets, Specifically binds to a sequence-specific and positionally distinguishable substrate polynucleotide of a plurality of substrate polynucleotides, each binding molecule and the encoding polynucleotide being bindably distinguishable from each other; and bound to the substrate Multiple modular Classifying a plurality of targets in a polynucleotide-encoded capture agent-target complex.

複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は請求項１〜１３のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を有するものとする、請求項２０に記載の方法。 21. The method of claim 20, wherein the plurality of modular polynucleotide encoded capture agents comprises the modular polynucleotide encoded capture agent of any one of claims 1-13.

サンプルにおける複数の標的のうちの標的を分類する方法で、その方法は、
基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドを提供し、各基質ポリヌクレオチドは、配列特異的であり互いに位置的に区別可能であり、
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を提供し、各モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着する骨格分子を有し、少なくとも１個の結合分子は複数の標的のうち予め特定した標的に特異的に結合し、エンコードポリヌクレオチドは複数の基質ポリヌクレオチドの配列特異的で位置的に区別可能な基質ポリヌクレオチドに特異的に結合し、各結合分子およびエンコードポリヌクレオチドは互いに結合的に区別可能であり；
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を、少なくとも１個の結合分子を標的に結合させることができる時間および条件でサンプルに接触させ、それによって複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を提供するステップと；
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を、エンコードポリヌクレオチドを基質に付着した基質ポリヌクレオチドに結合させることができる時間および条件で複数の基質ポリヌクレオチドに接触させるステップと、
それによって、基質に結合した複数のポリヌクレオチドエンコードタンパク質標的―複合体における複数の標的を分類するステップと、
を有するものとする方法。 A method for classifying a target among a plurality of targets in a sample, the method comprising:
Providing a plurality of substrate polynucleotides attached to the substrate, each substrate polynucleotide being sequence specific and positionally distinguishable from each other;
A plurality of modular polynucleotide encoded capture agents are provided, each modular polynucleotide encoded capture agent having at least one binding molecule and a backbone molecule attached to the encoded polynucleotide, wherein the at least one binding molecule comprises a plurality of Specifically, the encoding polynucleotide binds to a sequence-specific and positionally distinguishable substrate polynucleotide of a plurality of substrate polynucleotides, and each binding molecule and encoding polynucleotide The nucleotides can be combined and distinguished from each other;
A plurality of modular polynucleotide encoded capture agents are contacted with the sample for a time and under conditions that allow at least one binding molecule to bind to the target, thereby allowing the plurality of modular polynucleotide encoded capture agents-target complexes to Providing steps;
Contacting a plurality of modular polynucleotide encoded capture agent-target complexes with the plurality of substrate polynucleotides for a time and under conditions that allow the encoded polynucleotide to bind to the substrate polynucleotide attached to the substrate;
Thereby classifying a plurality of polynucleotide-encoded protein target-complex targets bound to a substrate;
A method of having

複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は請求項１〜１３のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を有するものとする、請求項２２に記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the plurality of modular polynucleotide encoded capture agents comprises the modular polynucleotide encoded capture agent of any one of claims 1-13.

複数の標的を分類するシステムで、このシステムは、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドを有する基質で、基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは配列特異的および互いに区別可能である基質と、
複数の結合分子で、各結合分子は複数の標的の相補的な標的に特異的に結合する結合分子と、
複数のエンコードポリヌクレオチドで、各エンコードポリヌクレオチドは基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドと、
複数の結合分子の各結合分子および位置的に区別可能な骨格結合ドメインを有する複数のエンコードポリヌクレオチドの各エンコードポリヌクレオチドに結合するようにする少なくとも１個の骨格分子と、
少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するときに骨格分子上に準備した位置的に区別可能な骨格結合ドメインで、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドを提供する骨格結合ドメインと
を有するものとするシステム。 A system that classifies multiple targets,
A substrate having a substrate polynucleotide attached to the substrate, each polynucleotide of the plurality of substrate polynucleotides attached to the substrate being sequence specific and distinguishable from each other;
A plurality of binding molecules, each binding molecule specifically binding to a complementary target of the plurality of targets;
A plurality of encoding polynucleotides, wherein each encoding polynucleotide specifically binds to each polynucleotide of the plurality of substrate polynucleotides attached to the substrate; and
At least one backbone molecule adapted to bind to each binding polynucleotide of each of the plurality of binding molecules and each of the plurality of encoding polynucleotides having a positionally distinguishable backbone binding domain;
At least one binding molecule and substrate polynucleotide that specifically binds to a target with a positionally distinguishable backbone binding domain prepared on the backbone molecule when bound to at least one binding molecule and the encoding polynucleotide. A backbone binding domain that provides an encoding polynucleotide that specifically binds.

骨格分子は、
少なくとも１個の結合分子に付着するようにした第１骨格結合ドメインと、
エンコードポリヌクレオチドに付着するようにした第２骨格結合ドメインと
を有し、少なくとも１個の結合分子は標的に特異的に結合するようにし、エンコードポリヌクレオチドは基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにし、
第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、位置的に区別でき骨格分子において準備して、少なくとも１個の結合分子を第１結合ドメインにおよびエンコードポリヌクレオチドを第２結合ドメインに結合させるとき少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの相互作用を最小化するものとする骨格分子。 The skeletal molecule is
A first backbone binding domain adapted to be attached to at least one binding molecule;
A second backbone binding domain adapted to be attached to the encoding polynucleotide, wherein at least one binding molecule specifically binds to the target, the encoding polynucleotide being specific for the substrate polynucleotide attached to the substrate So that
When the first and second scaffold binding domains are positionally distinguishable and provided in the scaffold molecule to bind at least one binding molecule to the first binding domain and the encoded polynucleotide to the second binding domain A backbone molecule that minimizes the interaction of at least one binding molecule and the encoding polynucleotide.

骨格分子はＳＡＣまたはＳＡＣ３であるとする、請求項２５に記載の骨格分子。 26. The backbone molecule according to claim 25, wherein the backbone molecule is SAC or SAC3.

ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、
標的に特異的に結合する結合分子と、
結合分子に付着したエンコードポリヌクレオチドと
を有し、エンコードポリヌクレオチドは基質ポリヌクレオチドに特異的に結合する配列を有し、この配列は、エンコードポリヌクレオチドにおいて準備した少なくとも１個の制限酵素部位を有して、関連する制限酵素によって解裂するようにするポリヌクレオチド捕捉剤。 The polynucleotide encoded capture agent is:
A binding molecule that specifically binds to a target;
An encoding polynucleotide attached to the binding molecule, the encoding polynucleotide having a sequence that specifically binds to the substrate polynucleotide, the sequence having at least one restriction enzyme site provided in the encoding polynucleotide. A polynucleotide capture agent that is cleaved by the associated restriction enzyme.