JP2011510658A - 幹細胞由来心筋細胞を培養するための合成表面 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年1月30日出願の米国仮出願番号61/062921の優先権を主張するものであって、出典明記によってその全体が援用される。
本開示内容は、細胞培養物品及びその使用方法、特に幹細胞由来心筋細胞の培養を支援するために適する物品に関する。
以下の詳細な説明では、この一部となる添付の図を参照されたい。これらの図は、装置、システム及び方法のいくつかの具体的な実施態様を例として示す。他の実施態様が考慮され、本開示内容の権利範囲又は要旨を逸脱しないで実施されうることは理解されるであろう。したがって、以下の詳細な説明は限定的に捉えられるものではない。
本明細書中で用いられるように、「有する」、「有している」、「含有する」、「含有している」、「含む」、「含んでいる」などはオープンエンドな趣旨で用いられ、一般に「含むがこれらに限定しない」ことを意味する。
図1に関して、細胞を培養するための物品(100)の略図を示す。物品(100)は、表面(15)を有する基材物質(10)を具備する。合成ポリマーコーティング層(20)は基材物質(10)の表面(15)上に配置される。図示していないが、合成ポリマーコーティング(20)は基材物質(10)の一部の上に配置されてもよい。基材物質(10)は、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーないしはコポリマー、これらいずれかの組み合わせ、又は他のものの上にある物質のコーティングといった、細胞を培養するために適する任意の物質でよい。このような基材物質(10)には、ソーダ石灰ガラス、パイレックスガラス、バイコールガラス、シリカガラスといったガラス物質;シリコン;樹枝状ポリマー類を含むプラスチック類ないしはポリマー類、例えばポリ(ビニルクロライド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアセテート-無水マレイン酸)、ポリ(ジメチルシロキサン)モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー類、フッ素樹脂類、ポリスチレン類、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン;コポリマー、例えばポリ(ビニルアセテート-コ無水マレイン酸)、ポリ(スチレン-コ無水マレイン酸)、ポリ(エチレン-コアクリル酸)ないしはこれらの誘導体などが含まれる。
合成ポリマー層は、公知又は将来開発される工程により細胞培養物品の表面に配置されてよい。好ましくは、合成ポリマー層は、典型的な細胞培養状態の間に剥離しない均一層を提供する。合成ポリマー表面は、共有結合性又は非共有結合性の相互作用により基材物質と結合してもよい。合成ポリマー表面を基体と結合させうる非共有結合性の相互作用の例には、化学的吸着、水素結合、表面相互浸透、イオン的結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用、双極子相互作用、力学的連動、及びこれらの組み合わせが含まれる。
幹細胞由来の心筋細胞は、任意の好適なプロトコールに従って、上記のような合成ポリマー層上で培養されてよい。ここで使用しているように、「幹細胞由来の心筋細胞」とは、幹細胞の分化から得られる心筋細胞を意味する。いくつかの実施態様では、幹細胞は、多分化能、分化全能性、又は多能性の幹細胞である。いくつかの実施態様では、幹細胞は被検体の臓器又は組織に存在しうる。多数の実施態様では、幹細胞は、胚性幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞である。
1.コーティング調整物
アクリルコーティング表面は、様々なアクリレートおよびメタクリレートのモノマーのホモモノマー又はコポリマーから調製した。コポリマーのために、2つの異なるアクリレート又はメタクリレートのモノマーを使用した。簡単にいうと、モノマーを、1%w/wの光発動因子Irgacure819 (チバスペシャルティケミカルズ社)と混合し、70:30の容量比にて他のモノマー製剤(1%w/wの光発動因子を有するモノマー)とともに用いたか又は混合した。次いで、製剤を、2.5μLの容量で、真空プラズマ処理した環状オレフィンコポリマープレート (コーニングライフサイエンス開発グループにより提供)のウェルに置いた。製剤を拡散するために、プレートを30分間水平にした。コーティングは、N2浄化ボックス(溶融シリカ窓を有する)中で1分間、13mW/cm2パルス(100Hz)紫外光(Xenon RC−700)にて硬化した。すべてのプレートを、細胞培養の前に25−35kGyガンマ放射線によって滅菌した。
実験の前に、H7 hES細胞を、SR培地(KO-DMEM、20%KO-血清置換、1mM L-グルタミン、0.1mM β-メルカプトエタノール、1%非−必須アミノ酸、80ng/mlのhbFGFおよび0.5ng/mlのTGFb1)中、マトリゲルコートプレート上で未分化状態に維持した。hESC由来の心筋細胞は直接分化プロトコールを使用して生成した。簡単にいうと、未分化H7細胞を、200U/mlのコラゲナーゼIVにて回収し、SR培地中100000細胞/cm2の密度でマトリゲルコートプレートに播種した。細胞は、毎日培地を交換しながら6日間培養した。SR培地を100ng/mlのヒト組み換えアクチビンAを添加したRPMI-B27培地に置き換えておよそ24時間置き、その後10ng/mlのヒト組み換えBMP4を添加して4日間置いて、心臓分化を開始させた。この時点で、細胞をAccutase処理にて脱離させ、RPMI-B27培地w/o増殖因子に再懸濁し、アクリレートの異なる2成分混合物又はポジティブコントロールとしてのマトリゲルにてコートした、コーニング社のCB/TOPAS96ウェルプレートに100000細胞/cm2の密度で播いた。細胞は、2−3日ごとに同じ培地に交換しながらさらに2−3週間培養した。ウェルを顕微鏡にて調べ、自然に生じる鼓動活動を記録した。
試験したごく一部の表面のみが、いくつかの重要な特徴及び機能を維持しながら細胞増殖を支持したことが明らかとなった。合成培地において分化したヒト胚性心筋細胞の増殖を支持したコーティング表面の例を表2に挙げる。ここで、モノマー(2)に対するモノマー(1)の容量比は70:30である。これらの表面を特徴付けし、細胞の形態と表面への接着の定性的評価を基に「グレード」を付けた。アクリレート表面評点は、以下の判定基準の考慮に基づいて実行した。1) 総細胞数、2) 総CM数、3) CM収率、4) 鼓動領域の存在、5) マトリゲル由来のCM形態に対する類似性。観察された分化した胚性筋細胞の質に関する注意書き並びに評価されたグレードを表2に示す。例えば、「Sim MA」は、その表面上で増殖している細胞がマトリゲルTM上で増殖している細胞と類似していたことを示す注意書きである。「Sim TOP」は、その表面上で増殖している細胞が、ケンタッキー州フローレンスのTOPAS社によりTOPAS(登録商標)表面として市販される、プラズマ処理した環状オレフィンコポリマー表面上で増殖する細胞に類似していたことを示す注意書きである。また、注意書きは、いくつかの表面が培養中で鼓動し始めた分化した胚性筋細胞を支持したことを示す。
Claims (22)
- 合成培地中で幹細胞由来の心筋細胞を培養するための細胞培養物品であって、
表面を有する基体と、
該表面上に配置されるポリマー物質とを具備し、このとき該ポリマー物質が、
(i) テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、グリセロールジメタクリレート、トリエチレングリコール ジメタクリレート、 1,4- ブタンジオール ジメタクリレート又はポリ(エチレングリコール) ジアクリレートから形成されるホモポリマー、又は、
(ii)
テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレート と テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、
グリセロールジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレート と ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート、
トリエチレングリコール ジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート と テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と テトラエチレングリコール ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と トリメチロールプロパン トリアクリレート、
トリメチロールプロパン トリアクリレート と ネオペンチル グリコールエトキシレート ジアクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と ネオペンチル グリコール ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジメタクリレート と 1,6-ヘキサンジオール エトキシレート ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と トリメチロールプロパン ベンゾエート ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と トリメチロールプロパン エトキシレート (1 EO/OH) メチル ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と 1,6-ヘキサンジオール エトキシレート ジアクリレート、
ネオペンチル グリコール ジアクリレート と トリメチロールプロパン エトキシレート (1 EO/OH) メチル ジアクリレート、又は、
ネオペンチル グリコール ジアクリレート と 1,6-ヘキサンジオール エトキシレート ジアクリレート
から形成されるコポリマーを含むものである、細胞培養物品。 - ポリマー物質が、テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート又はグリセロールジメタクリレートから形成されるホモポリマーか又は、(i) ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と ネオペンチル グリコール ジメタクリレート、 (ii) グリセロールジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、 (iii) グリセロールジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、 (iv) テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と トリメチロールプロパン トリアクリレートから形成されるコポリマーを含む、請求項1に記載の物品。
- ポリマー物質が、テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート又はグリセロール ジメタクリレートから形成されるホモポリマーか又は、(i) ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と ネオペンチル グリコール ジメタクリレート、 (ii) グリセロールジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、 (iii) グリセロールジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、 (iv) テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と トリメチロールプロパン トリアクリレートから形成されるコポリマーから基本的になる、請求項1に記載の物品。
- 物品の表面上に配置されたポリマー物質がおよそ5mm2より大きな表面領域を有する、請求項1に記載の物品。
- 揮発性有機溶媒に一ないし複数のモノマーを希釈し、
希釈したモノマーを物品の基体表面上に沈着させ、
実質的にすべての溶媒を蒸発させ、そして、
モノマーを重合化させて、表面に接着したポリマー層を形成させる
といった工程によって製造される、請求項1に記載の物品。 - 揮発性溶媒がエタノールである、請求項6に記載の物品。
- さらにウェルを具備し、このとき該ウェルにポリマー物質が配置される基体の表面がある、請求項1に記載の物品。
- 物品がマルチウェルプレート、シャーレ、ビーカー、チューブ及びフラスコからなる群から選択される、請求項1に記載の物品。
- 幹細胞由来の心筋細胞の培養物であって、
表面上に配置されたポリマー物質を含む物品と、
ポリマー物質上に配置された幹細胞由来の心筋細胞と、
該幹細胞由来の心筋細胞が培養される培養培地とを具備し、このとき該ポリマー物質が、
(i) テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、 グリセロールジメタクリレート、 トリエチレングリコール ジメタクリレート、 1,4- ブタンジオール ジメタクリレート又はポリ(エチレングリコール) ジアクリレートから形成されるホモポリマー、又は、
(ii)
テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレート と テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、
グリセロールジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、 グリセロールジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレート と ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート、
トリエチレングリコール ジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、 ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート と テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と テトラエチレングリコール ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と トリメチロールプロパン トリアクリレート、
トリメチロールプロパン トリアクリレート と ネオペンチル グリコールエトキシレート ジアクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と ネオペンチル グリコール ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジメタクリレート と 1,6-ヘキサンジオール エトキシレート ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と トリメチロールプロパン ベンゾエート ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と トリメチロールプロパン エトキシレート (1 EO/OH) メチル ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と 1,6-ヘキサンジオール エトキシレート ジアクリレート、
ネオペンチル グリコール ジアクリレート と トリメチロールプロパン エトキシレート (1 EO/OH) メチル ジアクリレート、又は、
ネオペンチル グリコール ジアクリレート と 1,6-ヘキサンジオール エトキシレート ジアクリレート
から形成されるコポリマーを含むものである、培養物。 - ポリマー物質が、テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート又はグリセロールジメタクリレートから形成されるホモポリマーか又は、(i) ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と ネオペンチル グリコール ジメタクリレート、 (ii) グリセロールジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、 (iii) グリセロールジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、 (iv) テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と トリメチロールプロパン トリアクリレートから形成されるコポリマーを含む、請求項9に記載の培養物。
- ポリマー物質が、テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート又はグリセロール ジメタクリレートから形成されるホモポリマーか又は、(i) ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と ネオペンチル グリコール ジメタクリレート、 (ii) グリセロールジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、 (iii) グリセロールジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、 (iv) テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と トリメチロールプロパン トリアクリレートから形成されるコポリマーから基本的になる、請求項9に記載の培養物。
- 培養培地が合成培地である、請求項9に記載の培養物。
- 幹細胞由来の心筋細胞がヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞である、請求項9に記載の培養物。
- 幹細胞由来の心筋細胞の培養方法であって、
幹細胞由来の心筋細胞を含む懸濁物をポリマー物質上に沈着させ、そして、
沈着させた幹細胞由来の心筋細胞を細胞培養培地中で培養することを含み、このとき該ポリマー物質が、
(i) テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、 グリセロールジメタクリレート、 トリエチレングリコール ジメタクリレート、 1,4- ブタンジオール ジメタクリレート又はポリ(エチレングリコール) ジアクリレートから形成されるホモポリマー、又は、
(ii)
テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレート と テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、
グリセロールジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレート と ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート、
トリエチレングリコール ジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、 ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート と テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と テトラエチレングリコール ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と トリメチロールプロパン トリアクリレート、
トリメチロールプロパン トリアクリレート と ネオペンチル グリコールエトキシレート ジアクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、
ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と ネオペンチル グリコール ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール) ジメタクリレート と 1,6-ヘキサンジオール エトキシレート ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と トリメチロールプロパン ベンゾエート ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と トリメチロールプロパン エトキシレート (1 EO/OH) メチル ジアクリレート、
1,6-ヘキサンジオール プロポキシレート ジアクリレート と 1,6-ヘキサンジオール エトキシレート ジアクリレート、
ネオペンチル グリコール ジアクリレート と トリメチロールプロパン エトキシレート (1 EO/OH) メチル ジアクリレート、又は、
ネオペンチル グリコール ジアクリレート と 1,6-ヘキサンジオール エトキシレート ジアクリレート
から形成されるコポリマーを含むものである、方法。 - 細胞培養培地において沈着した幹細胞由来の心筋細胞を培養することが、合成培地において心筋細胞を培養することを含む、請求項14に記載の方法。
- ポリマー物質が、テトラ(エチレングリコール) ジアクリレートから形成されるホモポリマーを含む、請求項14に記載の方法。
- ポリマー物質が、ジ(エチレングリコール) ジメタクリレート と ネオペンチル グリコール ジメタクリレートから形成されるコポリマーを含む、請求項14に記載の方法。
- ポリマー物質が、グリセロールジメタクリレートから形成されるホモポリマーを含む、請求項14に記載の方法。
- ポリマー物質が、グリセロールジメタクリレート と トリ(エチレングリコール) ジメタクリレートから形成されるコポリマーを含む、請求項14に記載の方法。
- ポリマー物質が、グリセロールジメタクリレート と 1,4-ブタンジオール ジメタクリレートから形成されるコポリマーを含む、請求項14に記載の方法。
- ポリマー物質が、テトラ(エチレングリコール) ジアクリレート と トリメチロールプロパン トリアクリレートから形成されるコポリマーを含む、請求項14に記載の方法。
- 幹細胞由来の心筋細胞がヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞である、請求項14に記載の方法。
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