JP2011501124A - マイクロプレート画像解析のためのシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「走査」、「走査する」等の用語は、例えば、ラスタ画像データサンプルに関する。
ここに記載されているのは、バイオセンサ基質画像解析のためのシステム及び方法である。このシステム及び方法は、ラベル非依存検出の走査等のための診断的または治療的アッセイ等を行うのに有用である。実施例において、1または複数のバイオセンサが、マイクロプレートのウェル内に配され、開示されたシステム及び方法は、1または複数のバイオセンサをインタロゲーションして、固定された細胞等のバイオセンサ表面と結合標的またはパートナー(partner)との結合情報を提供する。
広範な角度許容範囲が、再アラインメント無しで行われ得るプレートの高速走査を提供すること;
画像ベース走査が、ウェルの特定の領域に関して選択的に取得されて処理されるスペクトル及び波長情報を提供し、同一ウェル内の共通の自己基準領域及び信号(結合)領域を可能とし、熱の影響が最小化されること;
広範な領域が一連のピクセルにとって構成され(平均化され)得、効率的に大きなサイズのビームが形成され得るので、スポットサイズの小さいシステムに比べてシステムの移動過敏性が低減され得るかまたは少なくとも軽減され得、センサのマイクロスケールの波長粗さの影響が減少すること;
が含まれる。
特に、低いプレートZ’(Z’Plates)に関するZ’値の改善;
異常値の数の減少;
所定の閾値レベルに対する偽陰性及び偽陽性の可能性の減少(この特徴は、およそ2以上の因子による測定の感度を著しく向上させる);
基準パッドの位置に対する感度の減少;及び、
結合計算において使用されるピクセルの数の最大化、を含む。
一次元(1D)デュアル走査法 Epic(登録商標)においてデータを走査及び解析する比較例の方法は、下位の1Dデュアル走査アルゴリズムを使用する。この方法は、信号領域内の短い直線領域(例えば、672μm)を走査し、かつ基準領域を横切る同一の短い距離の直線走査を行う。図1を参照すると、図1は、マイクロプレート内のウェルの二次元Δλマップを示しており、上部の基準部(110)及び下部の信号部(120)に対応する2本の直線を示している。これらの直線経路は、各々計5回走査され、各々の結果が平均化される。信号領域内のポイントの各々のΔ波長(Δλ)値は、基準領域内の全てのΔ波長(Δλ)値と同様に平均化される。これらの各々の領域内の平均化されたΔλの間の差異は、ウェルの結合値となる。ウェル内の領域(130)は、欠陥によって生ずる。例示の欠陥は、例えば、ウェル内の気泡、非特異性結合物質の塊、プレート表面の物理的欠陥(ひっかき傷等)、または同様の物理的欠陥もしくは変形を含み得、これらは、基準領域変動性とは異なっている異常なΔλ値(例えば、高いΔλ値)もしくは統計的に有意なΔλ値(異常値等)、または基準領域の残りの部分もしくは通常に応答する基準領域よりも大きい標準偏差を含む。Δλマップによって提供される他の測定値は、マイクロプレートウェル内の表面凸凹の画像あり、カラーまたは対応するグレースケール(図示せず)で表示され、この画像において、例えば、−40の値が大きな負の凸凹差(1または複数)を有する領域を表し得、+40の値が大きな正の凸凹差(1または複数)を有する領域を表す。Δλマップは、マイクロプレート発現後に測定された波長からマイクロプレート発現前に測定された波長を引いた波長変化または遷移、すなわち波長差(Δλ)の図画表示を提供する。欠陥領域130から得られたΔλ値は、基準パッドの残りの部分の値を示しているものではなく、判定される結合値に悪影響を与え得る。
2D掃引法 開示の2D掃引法において、マイクロプレートの二次元領域は、2つの異なった時刻において走査される。これらの2つの異なった時刻の各々のポイントの波長差は、ポイントΔλを生成する。すなわち、ここにおいてΔλ=λt2−λt1であり、λt2及びλt1は、第2及び第1の時刻の各々で測定された波長を示す。これらのポイントΔλの2Dデータ収集の後、2つの「限定」矩形領域が画定される。これらの領域は、1つが信号領域であり、もう1つが基準領域である。これらの領域は、図2において単一ウェルに関して示されている。図2を参照すると、矩形領域(210)が限定信号領域に対応し、限定矩形領域(200)が基準領域に対応する。次に、「掃引」矩形領域の寸法が、当該基準領域及び信号領域に関して画定される。基準掃引矩形領域に関して定められたサイズは、例えば、全体として基準限定矩形領域のサイズよりも小さくかつ信号掃引矩形領域のサイズと同等である。掃引矩形領域の例は、図2にも示されている。基準掃引矩形領域(220)及び信号掃引矩形領域(260)が示されている。図2内の掃引矩形領域は、おおよそ同一のサイズを有する様に示されている。しかし、矩形領域は、同一もしくは近似寸法、または同一形状である必要は無く、例えば、任意の適切な寸法もしくはサイズ、または正方形、長方形、平行四辺形、台形等の形状もしくはこれらの組み合わせであってもよい。従って、本明細書において用いられている「矩形」には、一般的もしくは特定の矩形形状、及び追加的もしくは代替的に他の適切な形状の領域を含む。掃引矩形領域は、境界が限定矩形領域の境界を越えていなければ、その限定矩形領域の各々内の全ての可能性のある位置を占有することが可能である。掃引矩形位置の各々に関し、そこに含まれる全てのポイントΔλの標準偏差が計算される。最小の標準偏差を有する掃引矩形領域は、最も均一な領域と見なされる。基準掃引矩形領域のこの最も均一な領域は、結合の計算に使用される基準領域として選択される。同様に、信号掃引領域の最も均一な領域も、結合の計算に使用される信号領域として選択される。結合計算は、信号領域内の全てのポイントΔλの中央値を取得し、この値を基準領域内の全てのポイントΔλの中央値から引き算する。この例において、基準限定領域の最良の矩形領域(230)は、欠陥領域(250)を全く含まないように表されている。本開示の2D掃引ルーチンは、最も低い標準偏差を有する領域を探索することによってこのような欠陥を避けることが可能である。信号領域及び基準領域の中央値(平均値ではない)の間の差と定義された結合値の中央値は、欠陥の一部が領域(230)に含まれることを許容し、欠陥がこの領域(230)の半分または半分よりも多い部分を専有しない限り、結合値の中央値に影響を与えない。
2D掃引法の結果が、1Dデュアル走査法と比較される。例えば、比較対象の1Dデュアル走査法において、各々の測定に対して10回の走査がされる故に、2D掃引法に対して10回の走査が使用された。このことは、比較に関して、両方の方法の全データ収集時間が同一であることを保証する。1D測定に関しては、信号領域及び基準領域において、各々672μmの長さの5回の走査が行われた。2D測定に関しては、回折格子全体をカバーする29本の走査線からなるプレートマップが使用され、これらの走査線の内の3本は、信号領域に対して使用され、7本は基準領域に対して使用される。このようにして、10回の走査の実際の測定がシミュレーションされた。従って、この方法で取得されるデータは、まさに2Dの10回走査測定において収集されるだろうものである。掃引矩形領域は、信号領域において960μmの長さの3本の走査線であり、基準領域において960μmの長さの5本の走査線であった。
σ+は、陽性対照の標準偏差であり、
σ−は、陰性対照の標準偏差であり、
μ+は、陽性対照の測定された結合値であり、
μ−は、陰性対照の測定された結合値である。
J.Zhang氏等による「A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays」(Journal of Biomolecular Screening、第4巻、第2号、67−73ページ(1999年))を参照のこと(Z’の定義を提供する71ページの式(5)を参照のこと)。
基準パッドの位置は、パッドが走査された際に正確な読み取り値が得られるように、十分に精度よく位置合わせされなければならない。この節では、(正確な読み取り値を取得するために)基準パッドの中央部によって占有され得る許容領域を1Dデュアル走査法と2D掃引法との間で比較する。図6は、2×2mmのセンサ領域内の1つの位置における例示の基準パッドを示している。この解析に関して、基準パッドは、x座標において1,100ミクロン、y座標において650ミクロンの(Δλが)完全に均一な矩形領域と仮定される。走査ビームが基準パッドのエッジに配されると、読み取りが信号値と基準値との中間であるだろうと仮定される。走査ビームの直径が100ミクロンなので、走査ビームの中心がパッドの内部にありかつ最も近接したエッジから少なくとも50ミクロン離れている場合に、正確な基準値が取得されるだろう。従って、正確な基準読み取り値を得るためには、物理基準パッド上の中央に配された、例えば、x座標において1,000μm、y座標において550μmの寸法を有する矩形内にビームが無ければならない。走査ビームのサイズの故に、基準パッドの応答は、図6に示されたように、基準値(610)から信号値(630)まで徐々に遷移する。
Claims (20)
- バイオセンサ結合を検出する方法であって、
前記バイオセンサの領域を走査するステップと、
当該走査された領域内での第1限定信号領域及び第2限定基準領域を選択するステップと、
前記第1限定信号領域内の少なくとも1つの部分領域及び前記第2限定基準領域内の少なくとも1つの部分領域を走査するステップと、
各々の部分領域内の全てのポイントΔλの標準偏差を計算するステップと、
最小の標準偏差を有する当該走査された各々の部分領域内のサンプリングされた全てのポイントを信号部分領域及び基準部分領域として選択するステップと、
Msig、Mref及びBmedを計算するステップと、を含み、
ポイントΔλは、Δλ=λt2−λt1に従った2つの異なった時刻のあるポイントにおける波長の差であり、λt2及びλt1は、それぞれ第2の時刻及び第1の時刻で測定された波長を示し、
Msigは、当該選択された最小信号部分領域における全てのポイントΔλの中央値であり、
Mrefは、当該選択された最小基準部分領域における全てのポイントΔλの中央値であり、
Bmedは、式(1)に従ったバイオセンサ結合値の中央値であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記バイオセンサの接触表面が、発現させられていないか、発現させられているか、またはその両方であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、少なくとも1つの前記信号部分領域及び少なくとも1つの前記基準部分領域は、最小標準偏差を各々有していることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、当該走査された領域内の当該選択された第1限定信号領域と第2限定基準領域とが相互排他的であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第1限定信号領域及び前記第2限定基準領域内の部分領域の走査が、前記第1限定信号領域及び前記第2限定基準領域の各々の内部の複数の部分領域を含むことを特徴とする方法。
- 請求項5に記載の方法であって、前記第1限定信号領域及び前記第2限定基準領域内の複数の部分領域が、約1から約1000の部分領域を各々含むことを特徴とする方法。
- 請求項5に記載の方法であって、前記第1限定信号領域及び前記第2限定基準領域内の複数の部分領域が、約10から約100の部分領域を各々含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記バイオセンサがマイクロプレート内の複数のバイオセンサを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、異常値が除外された場合に、前記方法のZ’統計値が約0.6から約0.9であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記第1限定信号領域及び前記第2限定基準領域の寸法の各々が、前記信号部分領域及び前記基準部分領域の各々の寸法と同一の広がりを有するかまたはそれよりも大きいことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記信号部分領域及び前記基準部分領域の各々が、少なくとも、前記信号領域及び前記基準領域の各々の寸法よりも大きいか、小さいか、または当該寸法と同一であるかのいずれかであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記限定信号領域及び前記限定基準領域の各々が、少なくとも、前記信号領域及び前記基準領域の各々の寸法よりも大きいか、小さいか、または当該寸法と同一であるかのいずれかであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、当該選択された信号部分領域及び当該選択された基準部分領域が前記限定信号領域及び前記限定基準領域の各々よりも小さいかまたはこれらと等しい場合に、前記限定信号領域及び前記限定基準領域の寸法の各々が高さ0であることを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法であって、前記限定領域、前記部分領域またはこれらの両方が、x軸走査線まで減少させられることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、当該選択された信号部分領域及び当該選択された基準部分領域が前記限定信号領域及び前記限定基準領域の各々よりも小さいかまたはこれらと等しい場合に、個別の信号部分領域及び個別の基準部分領域の寸法が、高さ0であることを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記限定領域、前記部分領域またはこれらの両方が、x軸走査線まで減少させられることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法であって、少なくとも1つの信号部分領域及び少なくとも1つの基準部分領域が、最小標準偏差を各々有していることを特徴とする方法。
- バイオセンサ結合を判定する方法であって、
前記バイオセンサの領域を走査するステップと、
当該走査された領域内での第1限定信号領域及び第2限定基準領域を選択するステップと、
前記第1限定信号領域内の少なくとも1つの部分領域及び前記第2限定基準領域内の少なくとも1つの部分領域を走査するステップと、
各々の部分領域内の全てのポイントΔλに対する標準偏差を計算するステップと、
最小の標準偏差を有する当該走査された各々部分領域内のサンプリングされた全てのポイントを信号部分領域及び基準部分領域として選択するステップと、
Asig、Aref及びBmedを計算するステップと、を含み、
Δλは、Δλ=λt2−λt1に従った2つの異なった時刻のあるポイントにおける波長の差であり、λt2及びλt1は、それぞれ第2の時刻及び第1の時刻で測定された波長を示し、
Asigは、当該選択された最小標準偏差信号部分領域における全てのポイントΔλの平均値であり、
Mrefは、当該選択された最小標準偏差基準部分領域における全てのポイントΔλの平均値であり、
Bmedは、式(2)に従った平均化されたバイオセンサ結合値であることを特徴とする方法。
- 請求項17に記載の方法であって、少なくとも1つの信号部分領域及び少なくとも1つの基準部分領域が、最小標準偏差を各々有していることを特徴とする方法。
- バイオセンサ結合を判定するシステムであって、
内部に複数のウェルを含むフレームを備えるマイクロプレートであって、ウェルの各々が基準領域及びサンプリング領域を備える表面を有するバイオセンサを包含しているマイクロプレートと、
前記バイオセンサの一部を照明する光ビーム及び光学系、当該照明されたバイオセンサからの反射光を受光する画像化光学系、並びに当該照明されたバイオセンサから一連の画像をキャプチャする2D画像化デバイスを含む光学リーダインタロゲータと、
請求項1記載の方法に従って一連の画像を処理してバイオセンサ結合値を取得するプロセッサと、
を含むことを特徴とするシステム。
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