JP2011247656A - Fluorescence detection device and fluorescence microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、蛍光検出装置および蛍光顕微鏡に関し、詳しくは、蛍光染色された試料の褪色補正に関するものである。 The present invention relates to a fluorescence detection device and a fluorescence microscope, and more particularly to a fading correction of a fluorescently stained sample.
たとえば細胞を顕微鏡で撮影する有力な手法として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ:Green Fluorescent Proteins）による細胞の染色などのように試料の特定部位を蛍光指示薬で蛍光染色し、蛍光染色した試料にレーザ光などの励起光を照射して励起し、試料が発生する蛍光の２次元の強度情報を画像として検出する方法が確立されている。 For example, as a powerful technique for photographing cells with a microscope, a specific portion of a sample is fluorescently stained with a fluorescent indicator, such as staining of cells with GFP (Green Fluorescent Proteins), and laser light is applied to the fluorescently stained sample. A method has been established in which two-dimensional intensity information of fluorescence generated by a sample is detected as an image.
ところが、この手法の弱点の一つとして、蛍光褪色という現象がある。これは、蛍光物質を励起するレーザの強度が強いと、蛍光物質の構造が改変されて、蛍光強度が弱まり色褪せてしまう現象で、褪色と呼ばれている。 However, one of the weak points of this method is a phenomenon called fluorescent fading. This is a phenomenon in which when the intensity of a laser that excites a fluorescent substance is high, the structure of the fluorescent substance is modified, the fluorescent intensity is weakened, and the color fades.
蛍光顕微鏡による観察では、試料の蛍光の量を正確に測光することが重要である。これは、蛍光物質が細胞内のどの部位にどれだけ分布しているかを定量化したいからである。しかし、褪色現象があると、蛍光の量が減少し、本来の計測量よりも低い測定値しか得られなくなってしまう。 In observation with a fluorescence microscope, it is important to accurately measure the amount of fluorescence of a sample. This is because it is desired to quantify how much the fluorescent substance is distributed in which part of the cell. However, when there is a fading phenomenon, the amount of fluorescence decreases, and only a measurement value lower than the original measurement amount can be obtained.
一般に褪色量はレーザの照射量に依存し、強度に対して非線形な性質を示し、同一の積分量でも、強い光を短時間当てるほうが、弱い光を長時間当てるよりも褪色が大きいという性質を持つ。 In general, the amount of fading depends on the amount of laser irradiation and shows a non-linear property with respect to the intensity. Even with the same integral amount, the fading is stronger when the strong light is applied for a short time than when the weak light is applied for a long time. Have.
正確な測光を行うため、たとえば特許文献１に記載されているように、褪色を定量化して補正するという考えがある。図６は、特許文献１に記載されている蛍光色素の褪色特性例図である。図６において、Ｔｌは試料をスキャン開始波長からスキャン終了波長までスキャンするのに要する時間であり、Ｔｉはｉ回目のスキャン時の時刻であってその時の輝度値をＦ（Ｔｉ）と表す。また、Δｔは試料を１回スキャンするのに要する時間とする。
In order to perform accurate photometry, for example, as described in
特許文献１では、レーザ照射による褪色を測定し、この測定結果を元に積算照射量に依存した補正を行うという技術を提案している。特許文献１に記載されている技術では、褪色を積算照射量（照射時間の積算）の関数として取り扱っている。
しかし、２次元的あるいは３次元的な画像を撮影する場合、空間的には、視野内の基準点になるある一定位置での照射しか考慮しておらず、視野内の位置によって照射量が異なる効果は考慮していない。 However, when taking a two-dimensional or three-dimensional image, spatially, only irradiation at a certain fixed position serving as a reference point in the field of view is considered, and the amount of irradiation varies depending on the position in the field of view. The effect is not considered.
実際には、照明の光源や、照明光学系の周辺減光（シェーディング）などにより、視野内の光軸付近と視野の端では照射量が異なるため、褪色の程度も異なるが、従来技術ではこの効果を考慮していないため、画像を形成する視野内の位置ごとに異なる褪色が生じる効果を補正することができないという問題がある。 Actually, the amount of fading differs depending on the illumination light source and the peripheral light reduction (shading) of the illumination optical system, because the amount of irradiation differs near the optical axis in the field of view and at the edge of the field of view. Since the effect is not taken into account, there is a problem in that the effect of causing a different fading at each position in the field of view forming the image cannot be corrected.
本発明は、このような問題点を解決するものであって、その目的は、蛍光の褪色を、視野内の空間的な位置に関連する関数として扱うことにより、視野内の空間位置に基づいて褪色補正を行うことができる蛍光検出装置および蛍光顕微鏡を実現することにある。 The present invention solves these problems, and its purpose is to treat the fading of fluorescence as a function related to the spatial position in the field of view, thereby to be based on the spatial position in the field of view. An object is to realize a fluorescence detection apparatus and a fluorescence microscope capable of performing fading correction.
このような課題を達成する請求項１の発明は、
蛍光染色した試料に励起光を照射することにより前記試料が発生する蛍光画像を画像検出器で検出するように構成された蛍光検出装置において、
前記画像検出器で検出される前記試料画像の位置別に蛍光褪色を定量化して補正する手段を設けたことを特徴とする。
The invention of
In a fluorescence detection apparatus configured to detect a fluorescence image generated by the sample by irradiating excitation light to the fluorescently stained sample with an image detector,
Means is provided for quantifying and correcting fluorescence fading according to the position of the sample image detected by the image detector.
請求項２の発明は、
蛍光染色した試料にレーザ光を照射することにより前記試料が発生する蛍光画像を画像検出器で検出するように構成された蛍光顕微鏡において、
前記画像検出器で検出される前記試料画像の位置別に蛍光褪色を定量化して補正する手段を設けたことを特徴とする。
The invention of claim 2
In a fluorescence microscope configured to detect a fluorescent image generated by the sample by irradiating the fluorescently stained sample with a laser beam with an image detector,
Means is provided for quantifying and correcting fluorescence fading according to the position of the sample image detected by the image detector.
請求項３の発明は、請求項２に記載の蛍光顕微鏡において、
前記蛍光顕微鏡は共焦点顕微鏡として構成されていることを特徴とする。
The invention of claim 3 is the fluorescence microscope according to claim 2,
The fluorescence microscope is configured as a confocal microscope.
このように構成される蛍光検出装置および蛍光顕微鏡によれば、照射量および空間位置に基づき蛍光の褪色補正を行うことができる。 According to the fluorescence detection device and the fluorescence microscope configured as described above, the fluorescence fading correction can be performed based on the irradiation amount and the spatial position.
以下、本発明について、図面を用いて説明する。図１は本発明の一実施例の主要部分を示すブロック図である。図１において、蛍光情報検出部１０は、ＣＣＤやＣＭＯＳなどの画像検出器２０で検出される試料３０の画像の位置別に、蛍光に関連した各種の情報を検出し、蛍光褪色を補正する情報を生成するものであり、視野内位置情報格納部１１、位置別蛍光強度情報取得部１２、位置別蛍光強度情報格納部１３、位置別褪色量演算部１４、褪色係数格納部１５、位置別蛍光強度情報補正部１６などで構成されている。
Hereinafter, the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a block diagram showing the main part of one embodiment of the present invention. In FIG. 1, a fluorescence
視野内位置情報格納部１１には、画像検出器２０の画素に対応した視野内の位置情報が格納されている。実際の装置における蛍光褪色は、光軸に対称な関数として記述できる場合が多い。したがって、画像検出器２０のすべての画素に対して褪色の係数を持つ必要はなく、たとえば光軸の位置と光軸からの距離の関数として褪色係数を持っても構わない。つまり、半径Ｒ,角度θの極座標で半径Ｒのみの関数として視野内の位置情報を持つようにしてもよい。
The in-view position information storage unit 11 stores position information in the view corresponding to the pixels of the
位置別蛍光強度情報取得部１２は、視野内位置情報格納部１１に格納されている視野内の位置情報および画像検出器２０で検出される試料３０の表面画像に基づいて２次元の画像データの形式で蛍光強度情報を取得し、取得した蛍光強度情報を位置別蛍光強度情報格納部１３に格納する。
The position-specific fluorescence intensity
位置別褪色量演算部１４は、位置別蛍光強度情報取得部１２で取得した２次元データの位置（画素）ごとに蛍光の褪色量を演算する。なお、これらの演算結果をまとめて、光軸からの距離に対する褪色量として半径Ｒのみの関数にしてもよい。
The position-specific fade
褪色係数格納部１５には、位置別褪色量演算部１４の演算結果に基づく褪色に関する係数が２次元の画像データの形式で格納される。褪色係数を格納するのにあたり、場合によっては複数の係数を持ってもよいし、前述のように極座標で半径Ｒの関数としてもよい。
The fading coefficient storage unit 15 stores a fading coefficient based on the calculation result of the position-specific fading
位置別蛍光強度情報補正部１６は、求めた係数を用いて位置と時間（過去の露光量）の関数として褪色の割合を求め、その褪色の割合で補正することにより褪色前の蛍光強度を求める。
The position-specific fluorescence intensity
図１の動作について、詳しく説明する。
蛍光を発光可能な有効な蛍光物質の量をｇ(r)と表す。ここで、ｇはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を表し、変数ｒは視野内の光軸を原点とする２次元極座標の動径方向を表す。一般には角度方向θも変数であるが、ここでは簡単のためｒのみ記している。なお、２次元直交座標で記述してもよいが、ここでは概念を説明するため、極座標で示す。褪色は光を発する能力を持つ蛍光物質の減少なので、次式（１）で表すことができる。
The operation of FIG. 1 will be described in detail.
The amount of effective fluorescent substance capable of emitting fluorescence is expressed as g (r). Here, g represents GFP (green fluorescent protein), and the variable r represents the radial direction of two-dimensional polar coordinates with the optical axis in the field of view as the origin. In general, the angle direction θ is also a variable, but only r is shown here for simplicity. In addition, although you may describe by a two-dimensional orthogonal coordinate, in order to demonstrate a concept here, it shows with a polar coordinate. The amber color is a decrease in fluorescent material having the ability to emit light, and can be expressed by the following equation (1).
ここで、ａは蛍光物質に依存する正の定数、Ｂは入射光量の強度、ｆｉ（ｒ）は照明（励起）光学系の周辺減光を表す規格化された（光軸で値が１となる）関数である。入射光量に対する非線形な褪色を表すため、ここでは簡単に「べき」がｎのべき関数型と仮定して、ｎ＞＝１と考える。一般には異なる関数形でもよい。関数ｆｉ（ｒ）の「ｆｉ」は、flat-field of incoming ray を表している。この（１）式から分かることは、励起光強度の空間分布があるため、褪色も空間の位置ｒによって異なることである。 Here, a is a positive constant depending on the fluorescent material, B is the intensity of the incident light quantity, and fi (r) is normalized to represent the peripheral dimming of the illumination (excitation) optical system (the value is 1 on the optical axis). It is a function. In order to represent a non-linear fading with respect to the amount of incident light, it is assumed here that n> = 1 assuming that “power” is a power function type of n. In general, different functional forms are possible. "Fi" of the function fi (r) represents the f lat-field of i ncoming ray . What is understood from this equation (1) is that since there is a spatial distribution of excitation light intensity, the fading also varies depending on the position r of the space.
（１）式を解くと、Ａを積分定数として（２）式のようになる。 Solving equation (1) gives equation (2) with A as the integration constant.
簡単のため、照明光学系の周辺減光ｆｉ（ｒ）が２次元ガウス関数で表されるとする。本発明の考え方を説明するため、解析的に演算可能な関数で説明を行うが、実際には任意の関数形に対して数値的に演算を行えばよい。 For simplicity, it is assumed that the peripheral dimming fi (r) of the illumination optical system is represented by a two-dimensional Gaussian function. In order to explain the concept of the present invention, a function that can be calculated analytically will be described. However, in practice, an arbitrary function form may be numerically calculated.
蛍光物質が（３）式のような分布になっているとき、実際に観察される画像は、照明光学系の周辺減光ｆｉ(ｒ)と撮像光学系の周辺減光ｆｏ(ｒ)を積算したものであり、撮像光学系の周辺減光ｆｏ(ｒ)も２次元ガウス関数で表されるものとすると次式（４）のようになる。なお、関数ｆｏ（ｒ）の「ｆｏ」は、flat-field of outgoing ray を表している。 When the fluorescent substance has a distribution as shown in Equation (3), the actually observed image is obtained by integrating the peripheral light reduction fi (r) of the illumination optical system and the peripheral light reduction fo (r) of the imaging optical system. If the peripheral attenuation fo (r) of the imaging optical system is also expressed by a two-dimensional Gaussian function, the following equation (4) is obtained. It should be noted that, "fo" of the function fo (r) represents the f lat-field of o utgoing ray .
図２は、画像検出器２０の撮像面における光量変化特性例図であり、横軸は撮像面の位置（任意単位）を示し、縦軸は観察される光量（任意単位）を示している。１０００×１０００画素の２次元画像で、ｎ＝１、観察光学系の周辺減光σi＝５００で励起光学系の周辺減光σo＝５００、ｒ＝０の光軸上における１回の露光による褪色が３％（ａ＝０．０３）として（４）式をプロットしたものである。
FIG. 2 is an example of a light quantity change characteristic on the imaging surface of the
４本のグラフＡ〜Ｄは、撮影回数に応じた光量の変化を示し、上から順にグラフＡは０回目、グラフＢは１０回目、グラフＣは１００回目、グラフＤは２００回目の撮影で観察される光量変化を表している。グラフＡやＢでは光軸付近の光量が周辺よりも高いが、この部分では褪色も大きく、撮影回数とともに急速に褪色してやがて周辺部のほうが明るく見える状態になる。すなわち、グラフＣの１００回目の露光では周辺のほうが明るくなり始め、グラフＤの２００回目の露光では周辺のほうが光軸付近よりも明るくなる。 The four graphs A to D show changes in the amount of light according to the number of times of shooting. From the top, graph A is observed at the 0th time, graph B is at the 10th time, graph C is at the 100th time, and graph D is observed at the 200th time. Represents the change in the amount of light emitted. In graphs A and B, the amount of light in the vicinity of the optical axis is higher than that in the vicinity, but in this portion, the color is also fading, fading rapidly with the number of shootings, and eventually the surrounding portion appears brighter. That is, in the 100th exposure of the graph C, the periphery starts to become brighter, and in the 200th exposure of the graph D, the periphery becomes brighter than the vicinity of the optical axis.
フラットフィールドは位置と時間の関数となっていて、このような褪色を補正するためには、時間（積分照射量）だけでなく、照明や光学系に依存した位置の関数として補正する必要があることは明らかである。 The flat field is a function of position and time. In order to correct such fading, it is necessary to correct not only time (integrated dose) but also as a function of position depending on the illumination and optical system. It is clear.
実際の撮影にあたっては、撮影された生の画像に対して、（４）式を用いてフラットフィールド補正を行えばよい。 In actual photographing, flat field correction may be performed on the photographed raw image using equation (4).
図３は、本発明に基づく褪色補正の動作の流れを示すフローチャートである。
はじめに、補正前の画像データを読込む（ステップＳ１）。
続いて、読込んだ画像について、過去の照射量データを取得する（ステップＳ２）。過去の照射量データは、計算したり、記録されているデータベースから読み出す。
FIG. 3 is a flowchart showing the flow of the operation for fading correction according to the present invention.
First, image data before correction is read (step S1).
Subsequently, the past irradiation amount data is acquired for the read image (step S2). Past dose data is calculated or read from a recorded database.
次に、画像の各画素を走査する（ステップＳ３）。
そして、画像の位置（画素）ごとに、ステップＳ２で取得した過去の照射量データと画像内の位置の関数として、フラットフィールド（減光量）を演算する（ステップＳ４）。
Next, each pixel of the image is scanned (step S3).
Then, for each position (pixel) of the image, a flat field (amount of light reduction) is calculated as a function of the past irradiation amount data acquired in step S2 and the position in the image (step S4).
該当する画素の蛍光光度を、ステップＳ４で演算したフラットフィールド（減光量）で除算し、褪色補正を行う（ステップＳ５）。
画像の各画素について走査が終了すると（ステップＳ６）、補正済み画像データを所定の格納部に格納し、次の演算に利用する（ステップＳ７）。
The fluorescence intensity of the corresponding pixel is divided by the flat field (light reduction amount) calculated in step S4, and fading correction is performed (step S5).
When scanning for each pixel of the image is completed (step S6), the corrected image data is stored in a predetermined storage unit and used for the next calculation (step S7).
ここで、（４）式のａ，ｎ，σｉ，σｏなどのパラメータは、細胞の種類、蛍光物質の種類、染色方法、観察波長、光学系の性質（設定）などによって決まるものであり、予め同一条件で基準となるデータを取得し、減光の様子からこれらのパラメータを最小２乗法などによるフィッティングで決定できる。前もって基準となるデータの取得が困難な場合は、実データから推定してもよい。 Here, parameters such as a, n, σi, and σo in equation (4) are determined by the cell type, fluorescent material type, staining method, observation wavelength, optical system properties (settings), and the like. The reference data is acquired under the same conditions, and these parameters can be determined by fitting by the least square method or the like from the state of dimming. If it is difficult to obtain reference data in advance, it may be estimated from actual data.
図４は、本発明に基づく褪色補正を用いた画像処理システムの具体例を示すブロック図である。図４において、画像検出器２０として用いるカメラは、共焦点顕微鏡４０を介して試料３０の蛍光染色画像を撮影し、その画像出力データを画像取得用のＰＣ５０に入力する。
FIG. 4 is a block diagram showing a specific example of an image processing system using fading correction based on the present invention. In FIG. 4, the camera used as the
画像取得用のＰＣ５０には、スイッチ６０およびネットワークＮＷを介して、蛍光情報検出部１０を含むクライアントとしての複数のＰＣ、サーバー７０、ストレージ８０などが接続されている。
A plurality of PCs as a client including the fluorescence
このような構成において、カメラ２０で撮影されてＰＣ５０に取り込まれた試料３０の蛍光染色画像データは、サーバー７０を経由してストレージ８０に逐次格納される。
In such a configuration, the fluorescence-stained image data of the
クライアントとしてのＰＣ１０は、画像処理すべき所望の画像データをサーバー７０を介してストレージ８０から読み出すとともに、必要に応じて画像処理結果をサーバー７０を介してストレージ８０に格納する。
The
これにより、ストレージ８０に格納されている画像データをクライアントとしての複数のＰＣ１０で共有でき、システム全体として画像処理の効率を高めることができる。
As a result, the image data stored in the
図５は本発明に基づく褪色補正機能を備えた蛍光顕微鏡としての共焦点顕微鏡の具体例を示すブロック図である。図５において、レーザ光源４１の出力光は、共焦点スキャナ４２および対物レンズ４３を介して蛍光指示薬で蛍光染色された試料３０に照射される。
FIG. 5 is a block diagram showing a specific example of a confocal microscope as a fluorescence microscope having a fading correction function based on the present invention. In FIG. 5, the output light of the
試料３０は、レーザ光が照射されることにより、蛍光を発生する。試料３０が発生する蛍光画像は、対物レンズ４３および共焦点スキャナ４２を介して分光光学系４４に入力されて分光される。
The
分光光学系４４の分光出力は２次元画像検出器４５に入力されて電気信号に変換され、電気信号はＡ／Ｄ変換器４６に入力されてデジタルデータに変換され、デジタルデータはＰＣ４７に入力されて褪色補正処理が施される。
The spectral output of the spectroscopic
ＰＣ４７には、ＣＰＵ４７ａ、データメモリ４７ｂ、視野内の位置ごとの褪色量を演算する位置別褪色量演算プログラム４７ｃ、視野内の位置ごとの褪色量を補正する位置別褪色量補正プログラム４７ｄなどが設けられている。
The
ＰＣ４７は、位置別褪色量演算プログラム４７ｃに基づいてＡ／Ｄ変換器４６から変換入力されるデジタルデータの視野内の位置ごとの褪色量を演算し、位置別褪色量補正プログラム４７ｄに基づいてＡ／Ｄ変換器４６から変換入力されるデジタルデータの視野内の位置ごとの褪色量を補正する。
The
そして、表示装置４８は、このようにしてＰＣ４７で視野内の位置ごとの褪色量が補正された２次元画像を表示する。
Then, the display device 48 displays a two-dimensional image in which the fading amount for each position in the field of view is corrected by the
たとえば生きている細胞（ライブセル）を長時間観察する場合においては、時間とともに細胞が視野内を移動する。すなわち、ある時刻でのある細胞の褪色は、その細胞が過去に移動を行った位置での照明の周辺減光に依存する。 For example, when observing a living cell (live cell) for a long time, the cell moves in the field of view with time. That is, the discoloration of a certain cell at a certain time depends on the peripheral dimming of illumination at the position where the cell has moved in the past.
したがって、図５に示すように構成された共焦点顕微鏡を用いて、細胞の移動位置を時刻とともに追跡して履歴に応じた褪色を積分することで、細胞の褪色をより正確に推定でき、より正確な観察が行える。 Therefore, by using the confocal microscope configured as shown in FIG. 5, by tracking the cell movement position with time and integrating the fading according to the history, the fading of the cell can be estimated more accurately, and more Accurate observation is possible.
なお、上記実施例では、撮影した画像を一旦保存し、その後のデータ解析の段階で褪色量の補正を行うようにしているが、褪色量補正は撮影と同時に行ってもよい。たとえば、カメラの筐体内や画像取得ボードに設けられているＣＰＵ，ＤＳＰ,ＦＰＧＡなどの演算ブロックを用いて撮影直後に褪色量の補正演算を行い、これら撮影直後に補正された画像を保存するとともに表示装置に表示するようにしてもよい。 In the above-described embodiment, the photographed image is temporarily stored, and the fading amount correction is performed at the subsequent data analysis stage. However, the fading amount correction may be performed simultaneously with photographing. For example, using a calculation block such as a CPU, DSP, FPGA or the like provided in a camera casing or an image acquisition board, a fading amount correction calculation is performed immediately after shooting, and the corrected image is stored immediately after shooting. You may make it display on a display apparatus.
また、上記実施例では、蛍光指示薬で蛍光染色された試料を励起する照明の強度は一定としているが、時間の経過（撮影枚数）に応じて変化させてもよい。その場合、（４）式に対応する適切な補正関数の関数形は、解析的または数値的に求めればよい。 In the above embodiment, the intensity of illumination for exciting the sample fluorescently stained with the fluorescent indicator is constant, but it may be changed according to the passage of time (number of shots). In that case, the function form of an appropriate correction function corresponding to the equation (4) may be obtained analytically or numerically.
また、励起光はレーザ光に限るものではなく、たとえば水銀ランプなどと単色用のフィルタを組み合わせたものであってもよい。 The excitation light is not limited to laser light, and may be a combination of a mercury lamp and a monochromatic filter, for example.
さらに、上記実施例では、蛍光顕微鏡として共焦点顕微鏡を用い、撮影対象を細胞とする例について説明したが、これに限るものではなく、撮影のための照射によって撮影対象に褪色が発生する各種の撮影対象の撮影にも適用できる。 Furthermore, in the above-described embodiment, an example in which a confocal microscope is used as a fluorescence microscope and a photographing target is a cell has been described. However, the present invention is not limited to this, and various types of discoloration may occur in a photographing target due to irradiation for photographing. It can also be applied to shooting of a shooting target.
以上説明したように、本発明によれば、照射量および空間位置に基づき褪色補正が行える蛍光検出装置および蛍光顕微鏡を実現できる。 As described above, according to the present invention, it is possible to realize a fluorescence detection apparatus and a fluorescence microscope that can perform fading correction based on an irradiation amount and a spatial position.
１０ 蛍光情報検出部
１１ 視野内位置情報格納部
１２ 位置別蛍光強度情報取得部
１３ 位置別蛍光強度情報格納部
１４ 位置別褪色量演算部
１５ 褪色係数格納部
１６ 位置別蛍光強度情報補正部
２０ 画像検出器（カメラ）
３０ 試料
４０ 共焦点顕微鏡
４１ レーザ光源
４２ 共焦点スキャナ
４３ 対物レンズ
４４ 分光光学系
４５ ２次元画像検出器
４６ Ａ／Ｄ変換器
４７ ＰＣ
４７ａ ＣＰＵ
４７ｂ データメモリ
４７ｃ 位置別褪色量演算プログラム
４７ｄ 位置別褪色量補正プログラム
４８ 表示装置
DESCRIPTION OF
30
47a CPU
Claims (3)
前記画像検出器で検出される前記試料画像の位置別に蛍光褪色を定量化して補正する手段を設けたことを特徴とする蛍光検出装置。 In a fluorescence detection apparatus configured to detect a fluorescence image generated by the sample by irradiating excitation light to the fluorescently stained sample with an image detector,
A fluorescence detection apparatus comprising means for quantifying and correcting fluorescence discoloration for each position of the sample image detected by the image detector.
前記画像検出器で検出される前記試料画像の位置別に蛍光褪色を定量化して補正する手段を設けたことを特徴とする蛍光顕微鏡。 In a fluorescence microscope configured to detect a fluorescent image generated by the sample by irradiating the fluorescently stained sample with a laser beam with an image detector,
A fluorescence microscope comprising means for quantifying and correcting fluorescence discoloration for each position of the sample image detected by the image detector.
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