JP2011232056A - 膜電位変化検出装置および膜電位変化検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】膜電位変化検出装置1は、反射干渉計測用光源106と、細胞101が載置された透明部材102aを保持する保持部103と、反射干渉計測用光源106から放射され、透明部材102aを介して細胞101から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉検出用カメラ110と、反射干渉画像から細胞101と透明部材102aとの接着に関するパラメータdIを算出し、当該パラメータdIの変化に基づいて細胞101の膜電位の変化を検出する解析部202と、を備えている。
【選択図】図1
Description
(膜電位変化検出装置1の全体構成)
まず、本発明の実施形態に係る膜電位変化検出装置1の全体構成について、図1を参照しながら説明する。図1は、膜電位変化検出装置1の全体構成を示す概要図である。図1に示すように、膜電位変化検出装置1は、画像取得部10および処理部20から構成されている。
(画像取得部10の説明)
再び、図1を参照しながら説明する。保持部103は、計測中の細胞101の状態を維持するために、細胞101の状態に適した温度に維持することが望ましい。また、細胞101の測定が長時間に及ぶ場合には、保持部103は、細胞101の生育、状態維持に適した温度、湿度、炭酸ガス濃度などが整った環境に維持することが望ましい。
図7のフローチャートを更に参照しながら、処理部20の機能および動作について説明する。最初に、反射干渉検出用カメラ110にて細胞101の接着面の反射干渉画像が得られる(ステップS101、特許請求の範囲の「反射干渉撮像ステップ」に相当)。容器102の底面の基板上に接着している細胞101の容器102の底面の基板からの距離に応じて干渉光の振幅が異なり、反射干渉画像は明暗のコントラストとして撮影される。次に、反射干渉画像の視野内の反射光のシェーディングを補正する。あわせて細胞101のない背景の値が時間的に変動しないように、時間ごとに背景部のオフセット補正を行う。これらの画像演算補正によって、空間的、時間的に変動の少ない反射干渉画像を得ることができる。
I(t)=反射干渉の平均輝度(背景補正された値)
I(base)=薬液投与前のI(t)の平均値
ここでは、CHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞)が収容された容器102を保持部103にセットし、当該CHO細胞に脱分極を引き起こすKCl(薬品:塩化カリウム)を投与した場合に、反射干渉検出用カメラ110により取得される反射干渉画像と、解析部202により算出される平均輝度の変化率dI(パラメータ)とについて検証を行った。
ここでは、MIN−6膵β細胞株(マウス由来膵β細胞株)を用いたカルシウムイオン依存性カリウムチャンネル(以下、「試料細胞」と示す)に作動性化合物を投与した場合に、反射干渉検出用カメラ110により取得される反射干渉画像と、解析部202により算出される平均輝度の変化率dI(パラメータ)とについて検証を行った。
続いて、以上まで説明した第1実施形態に係る膜電位変化検出装置1の作用及び効果について説明する。本実施形態の膜電位変化検出装置1によれば、反射干渉計測用光源106、保持部103、反射干渉検出用カメラ110、および解析部202を備えることにより、細胞101からの反射光をもとに細胞101と透明部材102aとの接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞101の膜電位の変化を検出している。発明者らは、細胞が載置された透明部材と細胞との接着度合と、細胞の膜電位の変化との間に相関関係があることを発見した。本発明は、発見されたこのような相関関係を利用して、細胞の膜電位の変化を、細胞と透明部材との接着距離(接着度合)の変化として捉えていることに特徴がある。当該接着距離に基づく細胞101と透明部材102aとの接着に関するパラメータは非侵襲的な方法で得られるので、細胞101の膜電位の変化をラベルすることなく非侵襲的に検出することが可能となる。
上記実施形態においては、細胞101の膜電位変化を評価するための解析対象となる計測領域として、細胞101の接着している領域を「計測領域」とする例を挙げて説明したがこれに限定されるものではない。例えば細胞101をコンフルエント(容器の面積に対して約80%)に培養した被検体を用意し、測定開始時に得られた反射干渉画像の視野全体を計測領域として定めてもよい。また、測定開始時に得られた反射干渉画像から一定の輝度のしきい値や画像処理を用いて抽出した細胞101の存在する領域を計測領域として定めてもよい。
A(t)=反射干渉の各時間の接着領域の画素数
A(base)=薬液投与前のA(t)の平均値
本発明の第2実施形態について説明する。第2実施形態では、第1実施形態にはない構成についてのみ詳細な説明を行い、第1実施形態と同じ構成については同じ参照番号を付して詳細な説明を省略する。
まず、本発明の実施形態に係る膜電位変化検出装置41の全体構成について、図15を参照しながら説明する。図15は、膜電位変化検出装置41の全体構成を示す概要図である。図15に示すように、膜電位変化検出装置41は、画像取得部10および処理部20から構成されている。
I(t)=反射干渉の平均輝度(背景補正した値)
I(base)=薬液投与前のI(t)の平均値
第2実施形態に係る膜電位変化検出装置41では、定量位相計測用光源121、反射干渉計測用光源106、反射干渉検出用カメラ110、定量位相検出用カメラ125、および解析部202を備えることにより、細胞101の接着に関する情報、また細胞101の面積、光学的厚さに関する情報を同時に取得することができるので、細胞101と透明部材102aとの接着に関するパラメータのバリエーションを増やすことができる。また、自動化された処理により細胞101のセグメンテーションが実行されるので、個々の細胞101に対してデータを取得することが容易に可能となる。また、薬液分注後の細胞の反応が早く、できるだけ短いインタバルで計測を行いたい場合には、本実施形態に係る膜電位変化検出装置41のような反射干渉画像と定量位相画像を同時に取得する構成が有効である。
上記第2実施形態においては、定量位相画像から取得できる細胞の輪郭を反射干渉画像にコピー(セグメンテーション)する例を挙げて説明したがこれに限定されるものではない。例えば、セグメンテーションの工程を経なくても、細胞101の膜電位の変化を検出することが可能である。すなわち、定量位相画像から一定のしきい値にて得られる細胞101の存在を示す領域全体を計測領域とし、この計測領域における平均的な輝度を用いて細胞101の膜電位の変化を検出してもよい。なお、計測領域の平均輝度に対する変化率dIを算出することについては上述したとおりなので、ここではその説明を省略する。
本発明の第3実施形態について説明する。第3実施形態では、第1実施形態にはない構成についてのみ詳細な説明を行い、第1実施形態と同じ構成については同じ参照番号を付して詳細な説明を省略する。
まず、本発明の実施形態に係る膜電位変化検出装置61の全体構成について、図19を参照しながら説明する。図19は、膜電位変化検出装置61の全体構成を示す概要図である。図19に示すように、膜電位変化検出装置61は、画像取得部10および処理部20から構成されている。
第3実施形態に係る膜電位変化検出装置61では、定量位相計測用光源121、定量位相シャッタ121A、反射干渉計測用光源106、反射干渉シャッタ106A、およびカメラ134備えることにより、細胞101の接着に関する情報、また細胞101の面積、光学的厚さに関する情報を同時に取得することができるので、細胞101と透明部材102aとの接着に関するパラメータのバリエーションを増やすことができる。また、自動化された処理により細胞101のセグメンテーションが実行されるので、個々の細胞101に対してデータを取得することが容易に可能となる。
Claims (14)
- 反射干渉計測用光源と、
細胞が載置された透明部材を保持する保持手段と、
前記反射干渉計測用光源から放射され、前記透明部材を介して前記細胞から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉撮像手段と、
前記反射干渉画像から前記細胞と前記透明部材との接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて前記細胞の膜電位の変化を検出する解析手段と、
を備えている膜電位変化検出装置。 - 前記解析手段は、脱分極になると前記細胞が前記透明部材から離れ、過分極になると前記細胞が前記透明部材に近づくという相関関係に基づいて、前記細胞の前記膜電位の変化を検出する、
請求項1に記載の膜電位変化検出装置。 - 前記反射干渉計測用光源から放射され前記細胞から反射される光が集光される対物レンズを更に備えており、
前記対物レンズと前記透明部材とは空気層を介して配置されている、
請求項1または2に記載の膜電位変化検出装置。 - 前記透明部材の前記載置面とは反対側の面は、反射防止コートが施されている、
請求項3に記載の膜電位変化検出装置。 - 前記対物レンズの前記反射干渉計測用光源側の開口絞りと共役な位置に配置されているリング状のスリットを更に備えている、
請求項3または4に記載の膜電位変化検出装置。 - 定量位相計測用光源と、
前記定量位相計測用光源から放射され前記細胞を透過する光を撮像することにより、定量位相画像を生成する定量位相撮像手段と、
を更に備えている、請求項1〜5の何れか1項に記載の膜電位変化検出装置。 - 前記反射干渉画像と前記定量位相画像との間で、空間的な位置を一致させることにより、両画像の位置合わせを行う画像位置合わせ手段と、
前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出手段と、
前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用手段と、
を更に備えており、
前記解析手段は、前記輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、前記細胞と前記透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する、
請求項6に記載の膜電位変化検出装置。 - 前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整する反射干渉光量調整手段と、
定量位相計測用光源と、
前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整する定量位相光量調整手段と、
を更に備えており、
前記反射干渉撮像手段は、前記反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、前記定量位相計測用光源から放射され、前記細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成し、
前記反射干渉画像を生成する際に、前記定量位相光量調整手段が前記定量位相計測用光源からの光を遮光し、前記反射干渉撮像手段が前記反射光を撮像し、
前記定量位相画像を生成する際に、前記反射干渉光量調整手段が前記反射干渉計測用光源からの光を遮光し、前記反射干渉撮像手段が前記透過光を撮像する、
請求項1〜5の何れか1項に記載の膜電位変化検出装置。 - 前記反射干渉光量調整手段は、前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタであり、
前記定量位相光量調整手段は、前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタである、
ことを特徴とする請求項8に記載の膜電位変化検出装置。 - 前記反射干渉光量調整手段は、前記反射干渉計測用光源のON/OFFによる切り替えにより、前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整し、
前記定量位相光量調整手段は、前記定量位相計測用光源のON/OFFによる切り替えにより、前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整する、
ことを特徴とする請求項8に記載の膜電位変化検出装置。 - 前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出手段と、
前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用手段と、
を更に備えており、
前記解析手段は、前記輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、前記細胞と前記透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する、
請求項8〜10の何れか1項に記載の膜電位変化検出装置。 - 反射干渉撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞が載置された透明部材を介して前記細胞から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉撮像ステップと、
解析手段が、前記反射干渉画像から前記細胞と前記透明部材との接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて、前記細胞の膜電位の変化を検出する解析ステップと、
を含んでいる膜電位変化検出方法。 - 反射干渉撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞が載置された透明部材を介して前記細胞から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉撮像ステップと、
定量位相撮像手段が、定量位相計測用光源から放射され、細胞を透過する光を撮像することにより、定量位相画像を生成する定量位相撮像ステップと、
画像位置合わせ手段が、前記反射干渉画像と前記定量位相画像との間で、空間的な位置を一致させることにより、両画像の位置合わせを行う画像位置合わせステップと、
輪郭抽出手段が、前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出ステップと、
輪郭適用手段が、前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用ステップと、
前記解析手段が、前記輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、前記細胞と前記透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する解析ステップと、
を含んでいる膜電位変化検出方法。 - 撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、定量位相計測用光源から放射され、前記細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成する撮像ステップと、
輪郭抽出手段が、前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出ステップと、
輪郭適用手段が、前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用ステップと、
前記解析手段が、前記輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、前記細胞と前記透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する解析ステップと、
を含んでおり、
前記反射干渉画像を生成する際に、定量位相光量調整手段が前記定量位相計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記反射光を撮像し、
前記定量位相画像を生成する際に、反射干渉光量調整手段が前記反射干渉計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記透過光を撮像する、
ことを特徴とする膜電位変化検出方法。
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