JP2011213697A - Anthracycline compound - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、医薬組成物、殊に腎線維症、肺線維症などの組織線維化が関与する疾患の予防若しくは治療用医薬組成物の有効成分として有用なアントラサイクリン化合物に関する。 The present invention relates to an anthracycline compound useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition, in particular, a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases involving tissue fibrosis such as renal fibrosis and pulmonary fibrosis.
正常細胞の形質転換は、組織線維症、関節リウマチ、動脈硬化、癌などの疾患で認められる現象であり、また癌転移にも深く関与している（非特許文献１）。高血糖、低酸素状態、活性酸素、形質転換増殖因子β（TGFβ）をはじめとする各種サイトカイン、成長因子などに長期間曝されることにより、腎尿細管上皮細胞、メサンギウム細胞（非特許文献２）、肺胞上皮細胞（非特許文献３）、関節滑膜細胞（非特許文献４）、肝星細胞（非特許文献５）、血管内皮細胞（非特許文献６）などが形質転換を起こすことが知られている。形質転換を起こした細胞は、α平滑筋アクチン（α smooth muscle actin; αSMA）の発現と細胞形態の変化などによって特徴づけられる。最も良く研究されているのは、上皮間葉移行（epithelial- mesenchymal transition; EMT）として知られている上皮細胞の形質転換であり、上記のような病的刺激のもとで、上皮細胞のマーカーであるE-カドヘリンが消失し、αSMAを発現する筋線維芽細胞に分化することが知られている。
組織線維症は、腎線維症、肺線維症、心線維症、腎疾患、糖尿病性腎症、肝硬変、動脈硬化、強皮症などに代表される難治性の慢性疾患である。組織線維症に対する効果的な予防・治療剤は未だ存在しない状況であり、ピルフェニドン（Pirfenidone）が上市されているものの、より強力な薬効を示す組織線維症予防・治療剤が切望されている。
Normal cell transformation is a phenomenon observed in diseases such as tissue fibrosis, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, and cancer, and is also deeply involved in cancer metastasis (Non-patent Document 1). Renal tubular epithelial cells, mesangial cells (Non-patent Document 2) by long-term exposure to high blood glucose, hypoxia, active oxygen, various growth factors such as transforming growth factor β (TGFβ), and growth factors ), Alveolar epithelial cells (Non-patent document 3), synovial synovial cells (Non-patent document 4), hepatic stellate cells (Non-patent document 5), vascular endothelial cells (Non-patent document 6), etc. It has been known. The transformed cells are characterized by the expression of α smooth muscle actin (αSMA) and the change in cell morphology. The best studied is the transformation of epithelial cells known as epithelial-mesenchymal transition (EMT), which is a marker of epithelial cells under pathological stimuli as described above. It is known that E-cadherin disappears and differentiates into myofibroblasts expressing αSMA.
Tissue fibrosis is an intractable chronic disease represented by renal fibrosis, pulmonary fibrosis, cardiac fibrosis, renal disease, diabetic nephropathy, cirrhosis, arteriosclerosis, scleroderma and the like. Although there is no effective preventive / therapeutic agent for tissue fibrosis, Pirfenidone has been put on the market, but a prophylactic / therapeutic agent for tissue fibrosis having a stronger drug effect is eagerly desired.
組織線維症は、慢性的に炎症・傷害を受けた組織において過剰な修復反応が起こった結果、組織内に線維芽細胞、及びコラーゲンをはじめとする各種細胞外マトリクスが蓄積した状態と考えられている（非特許文献７）。線維化が軽微である場合には、臓器は正常に回復し機能するようになる。しかし組織の障害の程度が大きい、或いは慢性的に持続する場合には、線維化が組織の本来の機能に障害を与える。さらに、それが原因となって新たな線維化を生じるといった悪循環が形成され、上述のような疾患を発症し、臓器の機能低下が生じる（非特許文献８）。
組織線維症の発症には複雑なシグナル経路が関与し、未だ詳細な発症メカニズムは不明であるが、一つの特徴的な現象として上述の形質転換（非特許文献１）が知られている。即ち、正常な腎尿細管上皮細胞、肺胞上皮細胞、肝星細胞などが、高血糖、低酸素状態、活性酸素、TGFβをはじめとする各種サイトカインなどにより刺激を受け、αSMAを発現する筋線維芽細胞に形質転換する。分化した筋線維芽細胞は、CTGF、フィブロネクチン、I型コラーゲン、III型コラーゲンなどの細胞外マトリクスを過剰発現・産生し、これらが組織内に蓄積することが組織線維症の発症に重要な役割を果たしていると考えられている。
従って、形質転換を阻害することにより筋線維芽細胞などの病態細胞の出現を抑制する化合物及び／又は筋線維芽細胞からの細胞外マトリクス産生を抑制する化合物は、組織線維症治療剤として有用であることが期待される。
Tissue fibrosis is considered to be the accumulation of fibroblasts and various extracellular matrices such as collagen in the tissue as a result of excessive repair reactions in chronically inflamed and injured tissues. (Non-Patent Document 7). If the fibrosis is minor, the organ will recover and function normally. However, when the degree of tissue damage is large or chronically sustained, fibrosis can damage the original function of the tissue. In addition, a vicious circle is formed that causes new fibrosis, which causes the above-described diseases, resulting in a decrease in organ function (Non-patent Document 8).
Complex signal pathways are involved in the onset of tissue fibrosis, and the detailed onset mechanism is still unknown, but the above-described transformation (Non-patent Document 1) is known as one characteristic phenomenon. That is, normal renal tubular epithelial cells, alveolar epithelial cells, hepatic stellate cells are stimulated by hyperglycemia, hypoxia, active oxygen, various cytokines such as TGFβ, etc., and muscle fibers that express αSMA Transform into blasts. Differentiated myofibroblasts overexpress and produce extracellular matrices such as CTGF, fibronectin, type I collagen, and type III collagen, and their accumulation in tissues plays an important role in the development of tissue fibrosis It is thought to have played.
Therefore, a compound that suppresses the appearance of pathological cells such as myofibroblasts by inhibiting transformation and / or a compound that suppresses extracellular matrix production from myofibroblasts is useful as a therapeutic agent for tissue fibrosis. It is expected to be.
形質転換抑制作用及び／又は細胞外マトリクス産生抑制作用に基づく強力な組織線維症治療剤を提供する。 The present invention provides a powerful therapeutic agent for tissue fibrosis based on a transformation inhibitory action and / or an extracellular matrix production inhibitory action.
本発明者らは、腎尿細管上皮細胞を用いて、TGFβ/終末糖化産物（advanced glycated endoproducts; AGE）共刺激による形質転換及び／又は細胞外マトリクス産生を抑制する化合物について鋭意検討した。その結果、アクチノアロムルス（Actinoallomurus）属に属する微生物の培養物から得られた化合物、及び当該化合物から誘導された化合物が、腎尿細管上皮細胞における形質転換及び／又は細胞外マトリクス産生を良好に抑制すること、並びに、実際に腎線維症モデル及び肺線維症モデルで有効であることを見出し、本発明を完成した。 The present inventors have intensively investigated compounds that suppress transformation and / or extracellular matrix production by TGFβ / advanced glycated endoproducts (AGE) costimulation using renal tubular epithelial cells. As a result, a compound obtained from a culture of a microorganism belonging to the genus Actinoallomurus and a compound derived from the compound can improve transformation and / or extracellular matrix production in renal tubular epithelial cells. The present invention was completed by finding out that it is effective and effective in renal fibrosis model and pulmonary fibrosis model.
即ち、本発明は式(A)の化合物又はその塩、並びに、式(A)の化合物又はその塩、及び賦形剤を含有する医薬組成物に関する。 That is, the present invention relates to a compound of formula (A) or a salt thereof, and a pharmaceutical composition containing a compound of formula (A) or a salt thereof, and an excipient.
式(A)の化合物とは上記の４化合物を意味するが、本明細書中、化合物I、化合物II、化合物III、化合物IVとして個別に説明する場合もある。 The compound of the formula (A) means the above four compounds, but may be individually described as compound I, compound II, compound III, and compound IV in the present specification.
また、本発明は、式(A)の化合物又はその塩を含有する組織線維化が関与する疾患の予防用若しくは治療用医薬組成物、即ち、式(A)の化合物又はその塩を含有する組織線維化が関与する疾患の予防若しくは治療剤に関する。
また、本発明は、組織線維化が関与する疾患の予防用若しくは治療用医薬組成物の製造のための式(A)の化合物又はその塩の使用、並びに、式(A)の化合物又はその塩の有効量を患者に投与することからなる組織線維化が関与する疾患の予防若しくは治療方法に関する。
更に、本発明は、化合物Iを生産する能力を有する微生物を用いる化合物Iの製造方法、及び化合物Iを用いる化合物II、化合物III及び／又は化合物IVの製造方法にも関する。
The present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease involving tissue fibrosis containing a compound of formula (A) or a salt thereof, that is, a tissue containing a compound of formula (A) or a salt thereof. The present invention relates to a preventive or therapeutic agent for diseases involving fibrosis.
The present invention also relates to the use of a compound of formula (A) or a salt thereof for the manufacture of a pharmaceutical composition for prevention or treatment of a disease involving tissue fibrosis, and a compound of formula (A) or a salt thereof. The present invention relates to a method for preventing or treating a disease involving tissue fibrosis, comprising administering an effective amount of
Furthermore, the present invention also relates to a method for producing Compound I using a microorganism having the ability to produce Compound I, and a method for producing Compound II, Compound III and / or Compound IV using Compound I.
式(A)の化合物又はその塩は、良好な形質転換抑制作用及び／又は細胞外マトリクス産生抑制作用を有し、組織線維化が関与する疾患の予防及び／又は治療剤として使用できる。組織線維化が関与する疾患としては、腎線維症、肺線維症、心線維症、腎疾患、肺疾患、糖尿病性腎症、肝硬変、動脈硬化、強皮症などが挙げられる。 The compound of formula (A) or a salt thereof has a good transformation inhibitory action and / or extracellular matrix production inhibitory action, and can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases involving tissue fibrosis. Examples of diseases involving tissue fibrosis include renal fibrosis, pulmonary fibrosis, cardiac fibrosis, renal disease, pulmonary disease, diabetic nephropathy, cirrhosis, arteriosclerosis, scleroderma and the like.
以下、本発明を詳細に説明する。
化合物Iは、アクチノアロムルス属に属する当該化合物生産菌を栄養培地にて培養し、当該化合物を蓄積させた培養物から常法によって得られる。当該化合物の製造方法において使用する微生物は、アクチノアロムルス属に属し当該化合物の生産能を有する微生物であればいずれも用いることができる。このような微生物としては、例えばマレーシア国で採集されたアクチノアロムルス属に属する微生物アクチノアロムルス エスピー(Actinoallomurus sp.) No.645122株を挙げることができる。また、化合物II、化合物III及び／又は化合物IVは、後述の実施例に記載のように、化合物Iを酸で処理することによって得られる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Compound I is obtained by a conventional method from a culture in which the compound-producing bacterium belonging to the genus Actinoallomulus is cultured in a nutrient medium and the compound is accumulated. Any microorganism can be used as long as it belongs to the genus Actinoallomulus and has the ability to produce the compound. Examples of such microorganisms include the microorganism Actinoallomurus sp. No. 645122, which belongs to the genus Actinoallomulus collected in Malaysia. In addition, Compound II, Compound III and / or Compound IV can be obtained by treating Compound I with an acid as described in Examples below.
アクチノアロムルス エスピー(Actinoallomurus sp.) No.645122株の菌学的性質
アクチノアロムルス エスピー No.645122株はマレーシアで採集された落葉サンプルから分離された。本菌株の形態、培養性状、生理的性質を調べるための培地、方法は、主にシャーリングとゴットリーブ(引用文献1)、ワックスマン(引用文献2)に従った。それぞれの培養は30℃で14日間行った後、観察した。形態観察は、オートミール寒天で培養後、光学及び走査型電子顕微鏡で観察した。生育温度の判定には、酵母エキス・デンプン寒天を用いた。酵母エキス・デンプン寒天は粉末酵母エキスS(和光純薬、大阪)2.0g、可溶性デンプン10g、寒天16gを水道水1Lに溶解し、1mol/L 水酸化ナトリウム水溶液でpH 7.2に修正した後、オートクレーブ滅菌を行い作製した。炭素源の利用性の判定にはプリドハム・ゴットリーブの培地(引用文献3)を用いた。色名は"メシューエン・ハンドブック・オブ・カラー"(引用文献4)から引用した。細胞壁のアミノ酸の分析はベッカーらの方法(引用文献5)に従った。16SrDNAの塩基配列決定法は中川らの方法(引用文献6)に従った。相同性検索は国立遺伝学研究所のウェブサイト(http://www.ddbj.nig.ac.jp)のFASTA検索(引用文献7、引用文献8)を用い、基準株の16SrDNA塩基配列は国立遺伝学研究所のデータベース(http://www.ddbj.nig.ac.jp)より入手した。系統樹作成はClustal X(引用文献9)を用いた。
Mycological properties of Actinoallomurus sp. No.645122 Actinoallomurus sp. No.645122 was isolated from a deciduous sample collected in Malaysia. The culture medium and method for investigating the morphology, culture properties, and physiological properties of this strain mainly followed Shirring and Gottlieb (Cited document 1) and Waxman (cited document 2). Each culture was performed at 30 ° C. for 14 days and then observed. Morphological observation was performed with an optical and scanning electron microscope after culturing on oatmeal agar. For the determination of the growth temperature, yeast extract / starch agar was used. Yeast extract / starch agar is prepared by dissolving 2.0 g of powdered yeast extract S (Wako Pure Chemicals, Osaka), 10 g of soluble starch and 16 g of agar in 1 L of tap water, and adjusting to pH 7.2 with 1 mol / L sodium hydroxide aqueous solution. It was prepared by sterilization. To determine the availability of the carbon source, the medium of Prideham Gottlieb (Cited document 3) was used. The color name is taken from "Methuen Handbook of Color" (Cited document 4). The analysis of the cell wall amino acids followed the method of Becker et al. (Reference 5). The method for determining the base sequence of 16S rDNA followed the method of Nakagawa et al. (Cited document 6). Homology search uses FASTA search (Cited document 7, Cited document 8) on the National Institute of Genetics website (http://www.ddbj.nig.ac.jp), and the 16S rDNA base sequence of the reference strain is national Obtained from the Genetics Research Institute database (http://www.ddbj.nig.ac.jp). Clustal X (Cited document 9) was used to create the phylogenetic tree.
（１）形態的特徴
基生菌糸はよく発達し、不規則に分枝する。胞子連鎖は気菌糸上に着生し、胞子10個程度の密ならせん状となる。胞子の表面は平滑、形状は楕円状、サイズは1.2×0.7μmであった。菌核、胞子嚢、基生菌糸の断裂、遊走子は観察されなかった。
(1) Morphological features The basic mycelium develops well and branches irregularly. The spore chain grows on the aerial hyphae and forms a dense spiral of about 10 spores. The surface of the spore was smooth, the shape was elliptical, and the size was 1.2 × 0.7 μm. No sclerotia, sporangia, rupture of mycelial hyphae, or zoospores were observed.
（２）培養性状
結果を表２に示す。気菌糸はオートミール寒天上で中程度の着生、酵母エキス・麦芽エキス寒天、無機塩・デンプン寒天、チロシン寒天上ではまばらな着生、グリセリン・アスパラギン寒天上ではうっすらとした着生が認められた。ペプトン・酵母エキス・鉄寒天上では気菌糸着生は認められなかった。気菌糸の色は白色であった。生育裏面の色は橙色味赤色、濃橙色、橙色味白色、橙色、淡黄色を呈する。トリプトン・酵母エキス培地及びペプトン・酵母エキス・鉄寒天上で、メラノイド色素の産生は認められない。可溶性色素の産生は酵母エキス・麦芽エキス寒天、オートミール寒天、グリセリン・アスパラギン寒天チロシン寒天上で認められ、褐色、橙色、赤褐色であった。菌体内色素はpHにより変化しない。
(2) Culture properties Table 2 shows the results. Aerial hyphae showed moderate growth on oatmeal agar, yeast extract / malt extract agar, mineral salt / starch agar, sparse growth on tyrosine agar, and slight growth on glycerin / asparagine agar . No aerial mycelium formation was observed on peptone, yeast extract or iron agar. The color of the aerial hyphae was white. The color of the growth back surface is orange-red, dark orange, orange-white, orange, and pale yellow. Melanoid pigment production is not observed on tryptone / yeast extract medium and peptone / yeast extract / iron agar. Soluble pigment production was observed on yeast extract / malt extract agar, oatmeal agar, glycerin / asparagine agar tyrosine agar, brown, orange and reddish brown. The intracellular pigment does not change with pH.
（３）細胞壁タイプ
全菌体分解物の分析の結果、アミノ酸ではmeso-ジアミノピメリン酸が検出された。特徴となる糖としてマジュロースが検出され、全菌体糖パターンのBタイプと判定された。
(3) Cell wall type As a result of analysis of the whole cell degradation product, meso-diaminopimelic acid was detected as an amino acid. Majurose was detected as a characteristic sugar, and it was determined to be B type of the whole cell sugar pattern.
（４）生理的性質
表３に示すようにD-グルコース、シュークロース、D-キシロース、D-フルクトース、L-ラムノース、ラフィノース、D-マンニトールの利用性は陽性、L-アラビノース、イノシトールの利用性は陰性であった。
(4) Physiological properties As shown in Table 3, the availability of D-glucose, sucrose, D-xylose, D-fructose, L-rhamnose, raffinose, D-mannitol is positive, the availability of L-arabinose, inositol Was negative.
（５）16SrDNA塩基配列による解析
アクチノアロムルス エスピー No.645122株の16SrDNA部分塩基配列（配列番号１）を用いた相同性検索の結果、もっとも近縁な種はアクチノアロムルス イリオモテンシス TT 02-47株(Accession No: AB364586)で、相同値は99.6%であった。また、アクチノアロムルス属の基準種であるアクチノアロムルス スパディックス IMSNU20015株(Accession No: AJ293712)との相同値は96.8％であり、アクチノアロムルス属の各種との相同値は96.8-99.6%であった。また、16SrDNA部分塩基配列により作成した系統樹では、アクチノアロムルス属の各種と同一のクラスターを形成した。
(5) Analysis by 16SrDNA nucleotide sequence As a result of homology search using 16SrDNA partial nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of Actinoallomulus sp. No.645122, the closest species is Actinoallomulus iriomotensis TT 02- For 47 strains (Accession No: AB364586), the homology was 99.6%. In addition, the homologous value with Actinoallomulus spadix IMSNU20015 strain (Accession No: AJ293712), which is the standard species of Actinoallomulus, is 96.8%, and the homologous value with various Actinoallomulus is 96.8-99.6% there were. In addition, in the phylogenetic tree prepared from the 16S rDNA partial nucleotide sequence, the same clusters as those of the genus Actinoallomulus were formed.
（６）同定
形態観察、化学分析及び16SrDNA塩基配列による解析の結果からNo.645122株はアクチノアロムルス属に属すると考えられる(引用文献10)。そこで本菌株をアクチノアロムルス エスピー(Actinoallomurus sp.) No.645122株と命名した。本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-11008（受託日2008年9月3日）として寄託されている。
(6) Identification From the results of morphological observation, chemical analysis and analysis by 16S rDNA base sequence, the No.645122 strain is considered to belong to the genus Actinoallomulus (Cited document 10). Therefore, this strain was named Actinoallomurus sp. No.645122. This strain is registered with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (address: 1st, 1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 305-8566). (December 3).
なお、微生物は人工的に又は自然に変異を起こしやすいので、本発明において用いられるアクチノアロムルス エスピー(Actinoallomurus sp.) No.645122株は、天然から分離された微生物の他に、これに紫外線、放射線、化学薬剤などで人工的に変異させたもの及びそれらの天然変異株についても包含する。 In addition, since microorganisms are susceptible to mutation artificially or naturally, Actinoallomurus sp. No. 645122 strain used in the present invention includes ultraviolet rays, Also included are those artificially mutated with radiation, chemical agents, etc. and their natural mutants.
（引用文献）
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（製造方法）
化合物Iはアクチノアロムルス属に属し、化合物Iの生産能を有する微生物を培養することによって得られる。培養は一般微生物の培養方法に準じて行われる。
培養に用いられる培地としては、アクチノアロムルス エスピー(Actinoallomurus sp.) No.645122株等の、化合物Iの生産能を有するアクチノアロムルス属の微生物が利用する栄養源を含有する培地であればよく、合成培地、半合成培地または天然培地が用いられる。培地に添加する栄養物として公知のものを使用できる。培地の組成は、例えば炭素源としては、D-グルコース、L-アラビノース、D-キシロース、D-フルクトース、シュークロース、L-ラムノース、ラフィノース、イノシトール、D-マンニトール、ガラクトース、D-マンノース、マルトース、トレハロース、デンプン、ブドウ糖、デキストリン、グリセリン、植物油等が挙げられる。窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、酵母エキス、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿酸その他の有機、無機の窒素源が用いられる。また、金属塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、コバルトなどの硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩などが必要に応じて添加される。さらに、必要に応じてメチオニン、システイン、シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤などの生成促進物質または消泡剤を添加することもできる。
(Production method)
Compound I belongs to the genus Actinoallomulus and can be obtained by culturing a microorganism capable of producing Compound I. Culturing is performed according to the culture method of general microorganisms.
The medium used for the culture may be any medium containing a nutrient source used by a microorganism belonging to the genus Actinoallomurus having the ability to produce Compound I, such as Actinoallomurus sp. No.645122 strain. Synthetic media, semi-synthetic media or natural media are used. Known nutrients to be added to the medium can be used. The composition of the medium includes, for example, carbon sources such as D-glucose, L-arabinose, D-xylose, D-fructose, sucrose, L-rhamnose, raffinose, inositol, D-mannitol, galactose, D-mannose, maltose, Examples include trehalose, starch, glucose, dextrin, glycerin, vegetable oil and the like. Nitrogen sources include meat extract, peptone, gluten meal, cottonseed meal, soybean meal, peanut meal, fish meal, corn steep liquor, dry yeast, yeast extract, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, uric acid and other organic and inorganic nitrogen sources Is used. As metal salts, sulfates such as sodium, potassium, magnesium, calcium, zinc, iron and cobalt, nitrates, carbonates, phosphates and the like are added as necessary. Further, if necessary, a production promoting substance or an antifoaming agent such as methionine, cysteine, cystine, thiosulfate, methyl oleate, lard oil, silicon oil, and surfactant can be added.
培養条件としては好気的条件下で培養するのが一般的に有利で、培養温度は２０〜３９℃の範囲、好ましくは２５〜３７℃付近で行われる。培地のｐＨは約４〜９、好ましくは約６〜７の範囲に調整すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、温度条件に応じて適宜設定されるが、通常１〜１４日程度、好ましくは２〜５日程度である。 As the culture conditions, it is generally advantageous to perform the culture under aerobic conditions, and the culture temperature is in the range of 20 to 39 ° C, preferably in the vicinity of 25 to 37 ° C. Good results are obtained when the pH of the medium is adjusted to a range of about 4-9, preferably about 6-7. The culture period is appropriately set according to the composition of the medium and the temperature conditions, but is usually about 1 to 14 days, preferably about 2 to 5 days.
培養物より目的とする化合物Iを単離するには、微生物が産生する代謝産物に用いる通常の抽出、精製の手段が適宣利用できる。例えば培養物中の該物質は培養液をそのままか、又は遠心分離あるいは培養物に濾過助剤を加えて濾過して得られた培養液に酢酸エチル等の水と混和しない有機溶媒を加えて抽出する。また、培養液を適宜の坦体に接触させて濾液中の生産物質を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより該物質を抽出することができる。例えば、アンバーライトXAD-2、ダイヤイオンHP-20、ダイヤイオンCHP-20、又はダイヤイオンSP-900のような多孔性吸着樹脂に接触させて該物質を吸着させ、次いでメタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル等の有機溶媒と水の混合液を用いて該物質を溶出させる。このときの有機溶媒の混合比率を段階的に又は連続的に変化させることが有利である。酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶媒で抽出する場合には、培養濾液にこれらの溶媒を加え、良く振とうし、該物質を抽出する。次に、上記の各操作法を用いて得た該物質含有画分は、シリカゲル、ODS（octadecylsilyl）等を用いたカラムクロマトグラフィー、遠心液々分配クロマトグラフィー、ODSを用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等の定法により、さらに純粋に分離精製することができる。すなわち、活性を指標として、適当な溶媒に対する溶解性及び溶解度の差等を利用する一般の生理活性物質の製造に用いられる手段によって、分離、精製される。これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、又は任意の順序に組合せ、反復して適用できる。 In order to isolate the target compound I from the culture, conventional extraction and purification means used for metabolites produced by microorganisms can be used appropriately. For example, the substance in the culture can be extracted by adding the organic solution that is not miscible with water, such as ethyl acetate, to the culture solution obtained by filtering the culture solution as it is or by adding a filter aid to the culture. To do. Further, the substance can be extracted by bringing the culture solution into contact with an appropriate carrier to adsorb the produced substance in the filtrate and then eluting with a suitable solvent. For example, the substance is adsorbed by contacting with a porous adsorption resin such as Amberlite XAD-2, Diaion HP-20, Diaion CHP-20, or Diaion SP-900, and then methanol, ethanol, acetone, The substance is eluted using a mixed solution of an organic solvent such as butanol or acetonitrile and water. In this case, it is advantageous to change the mixing ratio of the organic solvent stepwise or continuously. When extracting with an organic solvent such as ethyl acetate or chloroform, these solvents are added to the culture filtrate and shaken well to extract the substance. Next, the substance-containing fraction obtained by using each of the above operating methods was subjected to column chromatography using silica gel, ODS (octadecylsilyl), etc., centrifugal liquid-liquid partition chromatography, high performance liquid chromatography using ODS ( It can be further purified and purified by a conventional method such as HPLC). That is, it is separated and purified by means used for the production of a general physiologically active substance using the difference in solubility and solubility in an appropriate solvent using the activity as an index. These methods can be used alone as necessary, or can be combined and repeated in any order.
また、化合物II、化合物III及び／又は化合物IVは、化合物Iを酸で加水分解することによって得られる。かかる酸としては塩酸、硫酸、硝酸等の鉱酸、あるいは酢酸、フマル酸、トリフルオロ酢酸の有機酸等があげられるが、これらに限定されない。 Compound II, compound III and / or compound IV can be obtained by hydrolyzing compound I with an acid. Such acids include, but are not limited to, mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid and nitric acid, or organic acids such as acetic acid, fumaric acid and trifluoroacetic acid.
式(A)の化合物には、不斉炭素原子が存在するので、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、式(A)の化合物の光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。 Since the compound of formula (A) has an asymmetric carbon atom, optical isomers based on this may exist. The present invention also includes separated optical isomers of the compound of formula (A) or a mixture thereof.
本発明は、式(A)の化合物の製薬学的に許容されるプロドラッグも包含する。製薬学的に許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解により又は生理学的条件下で、アミノ基、水酸基等に変換されうる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Prog. Med., 5, 2157-2161(1985)や、「医薬品の開発」（廣川書店、1990年）第7巻 分子設計163-198に記載の基が挙げられる。 The present invention also encompasses pharmaceutically acceptable prodrugs of the compound of formula (A). Pharmaceutically acceptable prodrugs are compounds having groups that can be converted to amino groups, hydroxyl groups, etc. by solvolysis or under physiological conditions. Examples of groups that form prodrugs include those described in Prog. Med., 5, 2157-2161 (1985) and “Development of Pharmaceuticals” (Yodogawa Shoten, 1990), Volume 7, Molecular Design 163-198. Is mentioned.
また、式(A)の化合物の塩とは、式(A)の化合物の製薬学的に許容される塩であり、置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合がある。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。 The salt of the compound of the formula (A) is a pharmaceutically acceptable salt of the compound of the formula (A), and may form an acid addition salt or a salt with a base depending on the type of substituent. is there. Specifically, inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid Acid addition with organic acids such as lactic acid, malic acid, mandelic acid, tartaric acid, dibenzoyl tartaric acid, ditoluoyl tartaric acid, citric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, aspartic acid, glutamic acid Salts, salts with inorganic bases such as sodium, potassium, magnesium, calcium and aluminum, salts with organic bases such as methylamine, ethylamine, ethanolamine, lysine and ornithine, salts with various amino acids and amino acid derivatives such as acetylleucine and ammonium salts Etc.
さらに、本発明は、式(A)の化合物、並びにその塩の各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形の物質も包含する。また、本発明は、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物も包含する。 Furthermore, the present invention also includes various hydrates and solvates of the compound of the formula (A) and salts thereof, and polymorphic substances. The present invention also includes compounds labeled with various radioactive or non-radioactive isotopes.
式(A)の化合物は、遊離化合物、その塩、水和物、溶媒和物、あるいは結晶多形の物質として単離され、精製される。式(A)の化合物の塩は、常法の造塩反応に付すことにより製造することもできる。
単離、精製は、抽出、分別結晶化、各種分画クロマトグラフィー等、通常の化学操作を適用して行なわれる。
The compound of formula (A) is isolated and purified as a free compound, its salt, hydrate, solvate, or crystalline polymorphic substance. The salt of the compound of the formula (A) can also be produced by subjecting it to a conventional salt formation reaction.
Isolation and purification are performed by applying ordinary chemical operations such as extraction, fractional crystallization, and various fractional chromatography.
後述の試験例１〜５に示すように、式(A)の化合物は組織の形質転換や細胞外マトリクスの蓄積を強力に抑制する作用を有し、動物実験において優れた病態改善作用を示す。したがって、式(A)の化合物又はその塩は、腎線維症、肺線維症、心線維症、腎疾患、肺疾患、糖尿病性腎症、肝硬変、動脈硬化、強皮症などの組織線維化が関与する疾患の治療等に使用できる。
さらに、式(A)の化合物は、強力な形質転換抑制作用を有するので、関節リウマチ、癌などの形質転換が関与する疾患の治療等にも有用であることが期待できる。
As shown in Test Examples 1 to 5 described later, the compound of the formula (A) has an action of strongly suppressing tissue transformation and extracellular matrix accumulation, and exhibits an excellent pathological condition improving action in animal experiments. Therefore, the compound of the formula (A) or a salt thereof can cause tissue fibrosis such as renal fibrosis, pulmonary fibrosis, cardiac fibrosis, renal disease, lung disease, diabetic nephropathy, cirrhosis, arteriosclerosis, scleroderma, etc. It can be used to treat related diseases.
Furthermore, since the compound of formula (A) has a strong transformation-inhibiting action, it can be expected to be useful for the treatment of diseases involving transformation such as rheumatoid arthritis and cancer.
式(A)の化合物又はその塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
A pharmaceutical composition containing one or more compounds of the compound of formula (A) or a salt thereof as an active ingredient is an excipient usually used in the art, that is, a pharmaceutical excipient or a pharmaceutical carrier. Can be prepared by a commonly used method.
Administration is orally by tablets, pills, capsules, granules, powders, solutions, etc., or injections such as intra-articular, intravenous, intramuscular, suppositories, eye drops, ophthalmic ointments, transdermal solutions, Any form of parenteral administration such as an ointment, a transdermal patch, a transmucosal liquid, a transmucosal patch, and an inhalant may be used.
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、１種又は２種以上の有効成分を、少なくとも１種の不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、及び／又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等のような崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
As a solid composition for oral administration, tablets, powders, granules and the like are used. In such solid compositions, one or more active ingredients are combined with at least one inert excipient such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone. And / or mixed with magnesium aluminate metasilicate. The composition may contain an inert additive, for example, a lubricant such as magnesium stearate, a disintegrant such as sodium carboxymethyl starch, a stabilizer, or a solubilizing agent according to a conventional method. . If necessary, tablets or pills may be coated with a sugar coating or a film of a gastric or enteric substance.
Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups or elixirs and the like, and commonly used inert diluents such as purified water. Or it contains ethanol. In addition to the inert diluent, the liquid composition may contain solubilizers, wetting agents, auxiliaries such as suspending agents, sweeteners, flavors, fragrances, and preservatives.
非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、又はポリソルベート８０（局方名）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。 Injections for parenteral administration contain sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. Examples of the aqueous solvent include distilled water for injection or physiological saline. Examples of non-aqueous solvents include propylene glycol, polyethylene glycol or vegetable oil such as olive oil, alcohols such as ethanol, or polysorbate 80 (a pharmacopeia name). Such compositions may further contain isotonic agents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, or solubilizing agents. These are sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending with a bactericide or irradiation. These can also be used by producing a sterile solid composition and dissolving or suspending it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.
外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。例えば、軟膏又はローション基剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、サラシミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウロマクロゴール、セスキオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。 External preparations include ointments, plasters, creams, jellies, poultices, sprays, lotions, eye drops, eye ointments and the like. Contains commonly used ointment bases, lotion bases, aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like. For example, ointment or lotion bases include polyethylene glycol, propylene glycol, white petrolatum, white beeswax, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, glyceryl monostearate, stearyl alcohol, cetyl alcohol, lauromacrogol, sorbitan sesquioleate, etc. Can be mentioned.
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体又は半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば公知の賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。 Transmucosal agents such as inhalants and nasal agents are used in solid, liquid or semi-solid form and can be produced according to conventionally known methods. For example, known excipients, and further pH adjusters, preservatives, surfactants, lubricants, stabilizers, thickeners and the like may be appropriately added. For administration, an appropriate device for inhalation or insufflation can be used. For example, using a known device such as a metered dose inhalation device or a nebulizer, the compound is administered alone or as a powder in a formulated mixture or as a solution or suspension in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. be able to. The dry powder inhaler or the like may be for single or multiple administration, and a dry powder or a powder-containing capsule can be used. Alternatively, it may be in the form of a pressurized aerosol spray using a suitable propellant, for example, a suitable gas such as chlorofluoroalkane, hydrofluoroalkane or carbon dioxide.
投与量は病気の種類、症状、年齢、性別など個々の患者によって異なるが、通常、経口投与の場合、成人１日あたり0.001mg/kg〜500mg/kg程度であり、これを１回、あるいは２回から４回に分けて投与する。注射で投与する場合は、成人１日あたり0.0001mg/kg〜10mg/kg程度を１回乃至２回、急速静注するかあるいは点滴静注する。吸入の場合は成人１日あたり0.0001mg/kg〜10mg/kg程度を１回、または複数回投与する。経皮剤の場合は成人１日あたり0.01mg/kg〜10mg/kg程度を１日１回乃至２回貼付する。 The dose varies depending on the individual patient, such as the type of disease, symptoms, age, and sex, but is usually about 0.001 mg / kg to 500 mg / kg per day for oral administration. The dose is divided into 4 doses. In the case of administration by injection, about 0.0001 mg / kg to 10 mg / kg per day for adults is rapidly or once or twice intravenously or intravenously administered. In the case of inhalation, about 0.0001 mg / kg to 10 mg / kg for adults is administered once or multiple times. In the case of a transdermal agent, about 0.01 mg / kg to 10 mg / kg per adult is applied once or twice a day.
式(A)の化合物又はその塩は、前述の式(A)の化合物又はその塩が有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療剤又は予防剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。 The compound of the formula (A) or a salt thereof can be used in combination with various therapeutic agents or preventive agents for diseases for which the compound of the formula (A) or a salt thereof is considered to be effective. The combination may be administered simultaneously, separately separately, or at desired time intervals. The simultaneous administration preparation may be a compounding agent or may be separately formulated.
以下、実施例にて具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
（試験例）
式(A)の化合物の薬理活性は、以下の試験により確認した。
試験例１ フィブロネクチン分泌抑制効果、及び細胞毒性
後述の実施例１〜３で取得した化合物I〜IVのラット由来腎尿細管上皮細胞（NRK-52E；ATCC番号 CRL-1571）に対する、フィブロネクチン分泌抑制効果、及び細胞毒性を以下のように評価した。なお、NRK-52E細胞は10％牛胎児血清（FBS）を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中、37℃、5% CO2存在下で培養した。
（1）4×104 cells/mLの細胞を、200μLずつ96穴マイクロプレートに播種した。
（2）コンフルエントに至るまで3日間培養後、1% FBS、TGFβ 8ng/mL、及びAGE 600μg/mL含有DMEM培地を150μLずつ各ウェルに添加することで形質転換の誘導を開始した。同時に、希釈した化合物I〜IVを各ウェルに添加した。
（3）96時間インキュベーション後、培養上清を新しい96穴マイクロプレートに回収し、ELISA法により培地中に放出されたフィブロネクチンを定量した。
（4）また、細胞には、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホナトフェニル）−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（MTS, 0.4mg/mL）を含む1% FBS含有DMEM を各ウェルに100μLずつ添加し、さらに1時間培養後、マイクロプレートリーダーにて450nmにおける吸光度を求め、細胞増殖阻害を観察した。
(Test example)
The pharmacological activity of the compound of formula (A) was confirmed by the following test.
Test Example 1 Fibronectin secretion inhibitory effect and cytotoxicity Compounds I to IV obtained in Examples 1 to 3 described later on fibronectin secretion inhibitory effect on rat renal tubular epithelial cells (NRK-52E; ATCC No. CRL-1571) And cytotoxicity was evaluated as follows. NRK-52E cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
(1) 4 × 10 4 cells / mL of cells were seeded on a 96-well microplate in an amount of 200 μL.
(2) After culturing for 3 days until confluence, transformation induction was initiated by adding 150 μL each of DMEM medium containing 1% FBS, TGFβ 8 ng / mL, and AGE 600 μg / mL to each well. At the same time, diluted compounds I-IV were added to each well.
(3) After incubation for 96 hours, the culture supernatant was collected in a new 96-well microplate, and fibronectin released into the medium was quantified by ELISA.
(4) The cells also contain 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfonatophenyl) -2H-tetrazole-3- 100 μL of 1% FBS-containing DMEM containing Ium (MTS, 0.4 mg / mL) was added to each well. After further incubation for 1 hour, the absorbance at 450 nm was determined with a microplate reader, and cell growth inhibition was observed.
その結果、化合物I〜IVは細胞毒性の認められない濃度域で用量依存的にTGFβ/AGE共刺激によるフィブロネクチン分泌を抑制し、中でも化合物Ｉが最も強い抑制作用を示した。化合物I〜IVのフィブロネクチン分泌阻害曲線及び細胞増殖阻害曲線を図１の(a)〜(d)にそれぞれ示す。 As a result, compounds I to IV suppressed fibronectin secretion by TGFβ / AGE costimulation in a dose-dependent manner in a concentration range where cytotoxicity was not observed, and compound I exhibited the strongest inhibitory action. The fibronectin secretion inhibition curves and cell growth inhibition curves of Compounds I to IV are shown in (a) to (d) of FIG.
試験例２ NRK-52E細胞に対する、形質転換抑制効果、及びフィブロネクチン蓄積抑制効果
化合物IのNRK-52E細胞に対する、形質転換抑制効果、及びフィブロネクチン蓄積抑制効果を以下のように評価した。
（1）4×104 cells/mLの細胞を、1mLずつ24穴プレートに播種した。
（2）コンフルエントに至るまで3日間培養後、1% FBS 、TGFβ 8ng/mL、及びAGE 600μg/mL含有DMEM培地を1mLずつ各ウェルに添加することで形質転換の誘導を開始した。同時に、希釈した化合物Iを各ウェルに添加した。
（3）96時間インキュベーション後、培養上清を除去、細胞をPBS（−）で洗浄し、100μLのRIPAバッファー（組成：20mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 2mmol/L EDTA, 1% Nonidet P-40, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, コンプリート プロテアーゼインヒビターカクテル（ロッシュ・アプライド・サイエンス））で細胞を溶解した。
（4）BCA protein assayキット（PIERCE社）を用いて上記細胞溶解液の総タンパク質量を定量後、還元条件下にて2.5μgタンパク質量相当の細胞溶解液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動した。その後、常法に従ってウエスタンブロットを行い、細胞内に蓄積したフィブロネクチン（220 KDa）、及び筋線維芽細胞マーカーであるαSMA（42 KDa）の発現量を定量した。
Test Example 2 Transformation Inhibition Effect and Fibronectin Accumulation Suppression Effect on NRK-52E Cells The transformation inhibition effect and fibronectin accumulation inhibition effect of Compound I on NRK-52E cells were evaluated as follows.
(1) 4 × 10 4 cells / mL of cells were seeded 1 mL each in a 24-well plate.
(2) After culturing for 3 days until confluence, 1 mL of DMEM medium containing 1% FBS, TGFβ 8 ng / mL, and AGE 600 μg / mL was added to each well to initiate transformation. At the same time, diluted Compound I was added to each well.
(3) After 96 hours of incubation, the culture supernatant was removed, the cells were washed with PBS (−), and 100 μL of RIPA buffer (composition: 20 mmol / L Tris-HCl, 150 mmol / L NaCl, 2 mmol / L EDTA, 1% Cells were lysed with Nonidet P-40, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, complete protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science).
(4) After quantifying the total amount of protein in the cell lysate using a BCA protein assay kit (PIERCE), the cell lysate equivalent to 2.5 μg protein was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions. Thereafter, Western blotting was performed according to a conventional method, and the expression levels of fibronectin (220 KDa) accumulated in the cells and αSMA (42 KDa), which is a myofibroblast marker, were quantified.
その結果、化合物Iは、細胞毒性の認められない濃度域で用量依存的にTGFβ/AGE共刺激による細胞内フィブロネクチン蓄積、及びαSMAの発現（形質転換）を抑制し、IC50値は100nmol/Lであった。化合物Iの細胞内フィブロネクチン蓄積抑制効果及びαSMA発現抑制作用を図２に示す。 As a result, Compound I suppressed intracellular fibronectin accumulation and αSMA expression (transformation) by TGFβ / AGE costimulation in a dose-dependent manner in a concentration range where cytotoxicity was not observed, and the IC 50 value was 100 nmol / L Met. FIG. 2 shows the inhibitory effect of Compound I on intracellular fibronectin accumulation and αSMA expression.
試験例３ UUOマウスモデルを用いた腎疾患及び腎線維症の治療効果
化合物Iの腎疾患及び腎線維症の治療効果を、一側尿管結紮(Unilateral Ureteral Obstruction；UUO)マウスモデルを用いて、以下のように評価した。
（1）６週齢C57-BL6系雄性マウス（チャールズリバー社）をペントバルビタール麻酔下、左腎の尿管を結紮した。
（2）化合物IをUUO処置直後から１日１回、10日間皮下投与した。対照群としては生理食塩水を皮下投与した。実験群は、（a）Sham（偽処置）＋生理食塩水皮下投与、（b）UUO処置のみ、（c）UUO処置＋ピルフェニドン（Pirfenidone）混餌投与（陽性対照群）、（d）UUO処置＋生理食塩水皮下投与、及び（e）UUO処置＋化合物I皮下投与で、各群につき10匹のマウスを用いた。
（3）UUO処置10日後に採血、腎摘出を行なった。
（4）摘出した腎組織を10％ホルマリン中性緩衝溶液で固定後、尿細管間質線維化の評価を実施するために、病理組織標本を作製した。また、また、摘出した腎臓皮質の一部をホルマリン固定する前に採取しmRNA発現定量のために液体窒素で凍結保存した。
（5）尿細管間質線維化の程度は、アザン染色後、デジタル画像としてコンピュータに取り込み、アザン染色により青く染まった線維化領域をピクセル数として定量した。
（6）凍結保存した腎臓皮質組織からRNAを抽出し、常法に従ってリアルタイムPCRを行い、Ｉ型、III型コラーゲン、及びαSMA mRNA発現量を測定した。
Test Example 3 Therapeutic Effect of Renal Disease and Renal Fibrosis Using UUO Mouse Model The therapeutic effect of Compound I on renal disease and renal fibrosis was determined using a unilateral Ureteral Obstruction (UUO) mouse model. Evaluation was performed as follows.
(1) A 6-week-old male C57-BL6 mouse (Charles River) was ligated with the ureter of the left kidney under anesthesia with pentobarbital.
(2) Compound I was subcutaneously administered once a day immediately after UUO treatment for 10 days. As a control group, physiological saline was administered subcutaneously. The experimental groups were: (a) Sham (sham treatment) + subcutaneous saline administration, (b) UUO treatment only, (c) UUO treatment + Pirfenidone mixed diet (positive control group), (d) UUO treatment + Ten mice were used for each group with saline subcutaneous administration and (e) UUO treatment + Compound I subcutaneous administration.
(3) Ten days after UUO treatment, blood was collected and nephrectomy was performed.
(4) After the excised kidney tissue was fixed with a 10% formalin neutral buffer solution, a pathological tissue specimen was prepared in order to evaluate tubulointerstitial fibrosis. In addition, a part of the excised kidney cortex was collected before formalin fixation and frozen and stored in liquid nitrogen for mRNA expression quantification.
(5) The degree of tubulointerstitial fibrosis was quantified as the number of pixels of the fibrosis area stained in blue by Azan staining after being captured by Azan in a computer after staining with Azan.
(6) RNA was extracted from cryopreserved kidney cortex tissue, and real-time PCR was performed according to a conventional method to measure the expression levels of type I, type III collagen, and αSMA mRNA.
その結果、化合物Iは、対照に比べ、I型、III型コラーゲン、及びαSMAのmRNA発現を有意に抑制した。また、アザン染色においても化合物Iは間質の線維化を有意に抑制していた。これらの作用は、陽性対照であるピルフェニドンの効果よりも高いものであった。腎αSMA mRNA発現抑制作用及びアザン染色による化合物Iの腎線維化抑制作用の結果を図３及び図４に示す。 As a result, Compound I significantly suppressed mRNA expression of type I, type III collagen, and αSMA as compared to the control. In addition, Compound I significantly suppressed interstitial fibrosis in Azan staining. These effects were higher than those of the positive control pirfenidone. FIG. 3 and FIG. 4 show the results of the renal αSMA mRNA expression inhibitory effect and the renal fibrosis inhibitory effect of Compound I by Azan staining.
試験例４ ラット5/6腎臓摘出モデルを用いた腎疾患及び慢性腎不全の治療効果
化合物Iの腎疾患及び慢性腎不全の治療効果を、腎不全の一般的なモデルとして汎用されるラット5/6腎臓摘出モデルを用いて、以下のように評価した。
（1）雄性SDラット（チャールズリバー社、7週齢）をペントバルビタール麻酔下にて、左腎を2/3摘出した。その翌週に同麻酔下にて右腎を全摘出し、5/6腎摘ラットモデル（5/6 Nx）を作成した。
（2）モデル作成後2週目から、化合物Iを１日１回、10週間皮下投与した。対照群として生理食塩水を皮下投与、陽性対照群としてエナラプリル(Ena)を5mg/kgの投与量で経口投与した。実験群は、（a）Sham（偽処置）＋生理食塩水皮下投与、（b）5/6Nx処置＋生理食塩水皮下投与、（c）5/6Nx＋エナラプリル経口投与（陽性対照群）、及び（d）5/6Nx処置＋化合物I皮下投与で、各群につき12匹のラットを用いた。
（3）10週間の投与期間中、2週ごとに採血、採尿を行い、血清クレアチニン（sCr）、血清尿素窒素（SUN）、尿中クレアチニン（uCr）、及び尿中タンパク質***量を求めた。
（4）10週間投与後、ペントバルビタール麻酔下にて解剖し、採血、腎臓採取を行った。
（5）摘出した腎組織を10％ホルマリン中性緩衝溶液で固定後、尿細管間質線維化の評価を実施するために、病理組織標本を作製した。また、摘出した腎臓皮質の一部をホルマリン固定する前に採取しmRNA発現定量のために液体窒素で凍結保存した。
（6）尿細管間質線維化の程度は、アザン染色後、デジタル画像としてコンピュータに取り込み、アザン染色により青く染まった線維化領域をピクセル数として定量した。
（7）凍結保存した腎臓皮質組織からRNAを抽出し、常法に従ってリアルタイムPCRを行い、Ｉ型、III型コラーゲン、及びαSMA mRNA発現量を測定した。
Test Example 4 Therapeutic Effect of Renal Disease and Chronic Renal Failure Using Rat 5/6 Nephrectomy Model The therapeutic effect of Compound I on renal disease and chronic renal failure is widely used as a general model of renal failure. Evaluation was carried out as follows using a 6 nephrectomy model.
(1) Male SD rats (Charles River, 7 weeks old) were excised with 2/3 of the left kidney under anesthesia with pentobarbital. The next week, the right kidney was completely removed under the same anesthesia, and a 5/6 nephrectomy rat model (5/6 Nx) was prepared.
(2) From the second week after model creation, Compound I was subcutaneously administered once a day for 10 weeks. As a control group, physiological saline was subcutaneously administered, and as a positive control group, enalapril (Ena) was orally administered at a dose of 5 mg / kg. The experimental groups were: (a) Sham (sham treatment) + saline subcutaneous administration, (b) 5 / 6Nx treatment + saline subcutaneous administration, (c) 5 / 6Nx + enalapril oral administration (positive control group), and ( d) 12 rats per group with 5 / 6Nx treatment + Compound I subcutaneous administration.
(3) During the 10-week administration period, blood was collected and collected every 2 weeks, and serum creatinine (sCr), serum urea nitrogen (SUN), urinary creatinine (uCr), and urinary protein excretion were determined.
(4) After administration for 10 weeks, dissection was performed under pentobarbital anesthesia, and blood collection and kidney collection were performed.
(5) The fixed renal tissue was fixed with a 10% formalin neutral buffer solution, and then a pathological tissue specimen was prepared in order to evaluate tubulointerstitial fibrosis. In addition, a part of the excised kidney cortex was collected before formalin fixation and stored frozen in liquid nitrogen for mRNA expression quantification.
(6) The degree of tubulointerstitial fibrosis was quantified as the number of pixels of the fibrosis area stained in blue by Azan staining after being captured in a computer after Azan staining.
(7) RNA was extracted from cryopreserved kidney cortex tissue, and real-time PCR was performed according to a conventional method to measure the expression levels of type I, type III collagen, and αSMA mRNA.
その結果、化合物Iは、対照に比べ、III型コラーゲン、αSMAのmRNA発現を有意に抑制した。また、糸球体構成タンパク質であるポドシン、ネフリンの発現低下の有意な抑制作用、及び、アザン染色における間質の線維化の有意な抑制作用を示した。さらにクレアチニンクリアランス（CCr）改善作用、用量依存的な尿中タンパク質***抑制作用を示した。以上のように化合物Iは形質転換抑制作用に基づき腎線維化を抑制し、腎保護作用を有することが示された。αSMA mRNA発現抑制作用、アザン染色による腎線維化抑制作用、尿中タンパク質***抑制作用及びクレアチニンクリアランス改善作用の結果を図５〜８に示す。 As a result, Compound I significantly suppressed mRNA expression of type III collagen and αSMA as compared with the control. In addition, it showed a significant inhibitory action on the decrease in the expression of glomerular constituent proteins podocine and nephrin, and a significant inhibitory action on interstitial fibrosis in Azan staining. Furthermore, creatinine clearance (CCr) was improved and dose-dependent urinary protein excretion was suppressed. As described above, it was shown that Compound I suppresses renal fibrosis based on a transformation inhibitory action and has a renal protective action. The results of αSMA mRNA expression inhibitory action, renal fibrosis inhibitory action by Azan staining, urinary protein excretion inhibitory action, and creatinine clearance improving action are shown in FIGS.
試験例５ 肺疾患及び肺線維症の治療効果
化合物Iの肺疾患及び肺線維症の治療効果を、ブレオマイシン惹起肺線維症モデルを用いて、以下のように評価した。
（1）６週齢C57-BL6系雄性マウス（チャールズリバー社）にブレオマイシン(BLM)15μg/匹を150μL/匹の容量で経肺投与し病態惹起動物を作製した。
（2）化合物IをBLM投与直後から１日１回、21日間皮下へ連続投与した。対照群としては生理食塩水を皮下投与した。実験群は、（a）Intact群(肺無処置＋生理食塩水皮下投与）、(b)Ｎ.Ｃ群（肺へ生理食塩水投与＋生理食塩水皮下投与）、(c)Ｄ.Ｃ群（肺へBLM投与＋生理食塩水皮下投与）、及び(d)化合物I投与群（肺へBLM投与＋化合物I皮下投与(３doses)）で、Intact群はn=6、その他は各群n=12の試験を行った。（ただし(b)及び(d)の中用量群で各1例測定不能動物がおりn=11とした。）
（3）BLM処置21日後に肺組織採取、肺機能評価を行なった。
（4）組織摘出前に肺機能測定システム（Pulmonary Maneuvers System; Buxco Electronics）にて肺機能の解析を行った。
（5）摘出した肺組織(右中葉を除く全肺)はヒドロキシプロリン量測定用および右中葉はmRNA発現定量のために液体窒素で凍結保存した。
（6）凍結保存した肺組織を加水分解処理し組織中のヒドロキシプロリン量(線維化指標)の測定を行った。
Test Example 5 Therapeutic Effect of Lung Disease and Pulmonary Fibrosis The therapeutic effect of Compound I on pulmonary disease and pulmonary fibrosis was evaluated using a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model as follows.
(1) Bleomycin (BLM) 15 μg / mouse was administered by pulmonary administration to a 6-week-old C57-BL6 male mouse (Charles River) in a volume of 150 μL / mouse to produce a pathophysiological trigger.
(2) Compound I was administered subcutaneously once a day immediately after BLM administration for 21 days. As a control group, physiological saline was administered subcutaneously. The experimental groups are: (a) Intact group (lung untreated + physiological saline subcutaneous administration), (b) N.C group (physiological saline administration + physiological saline subcutaneous administration), (c) D.C group (BLM administration to the lung + subcutaneous administration of physiological saline) and (d) Compound I administration group (BLM administration to the lung + Compound I subcutaneous administration (3 doses)), Intact group is n = 6, others are n = Twelve tests were conducted. (However, there was one animal that could not be measured each in the middle dose group of (b) and (d), and n = 11.)
(3) Lung tissue collection and lung function evaluation were performed 21 days after BLM treatment.
(4) Lung function was analyzed with a pulmonary function measurement system (Pulmonary Maneuvers System; Buxco Electronics) before tissue extraction.
(5) The excised lung tissue (all lungs except the right middle lobe) was frozen and stored in liquid nitrogen for measurement of hydroxyproline content and the right middle lobe for mRNA expression quantification.
(6) The frozen lung tissue was hydrolyzed and the amount of hydroxyproline (fibrosis index) in the tissue was measured.
その結果、化合物Iは、対照に比べ、肺機能の指標である努力肺活量（Forced Vital Capacity(FVC)）を用量依存的に改善した。また、肺組織中においても線維化形成の指標であるヒドロキシプロリン(Hydroxyproline)の産生を抑制する傾向が認められた。化合物Iの肺機能改善効果と肺組織中のヒドロキシプロリン産生抑制作用の結果を図９及び図１０に示す。 As a result, Compound I improved the forced vital capacity (FVC), which is an index of lung function, in a dose-dependent manner as compared with the control. Moreover, the tendency which suppresses the production | generation of the hydroxyproline (Hydroxyproline) which is a parameter | index of fibrosis formation was recognized also in the lung tissue. 9 and 10 show the results of the effect of Compound I on improving lung function and the effect of suppressing the production of hydroxyproline in lung tissue.
上記試験例１〜５の結果、式(A)の化合物は組織の形質転換や細胞外マトリクスの蓄積を強力に抑制する作用を有し、動物実験において優れた病態改善作用を示すことが確認された。 As a result of the above Test Examples 1 to 5, it was confirmed that the compound of the formula (A) has an action of strongly suppressing tissue transformation and extracellular matrix accumulation, and exhibits an excellent pathological condition improving action in animal experiments. It was.
試験例６ 好気性菌に対する抗細菌活性
化合物Iのグラム陽性細菌、グラム陰性細菌に対する抗細菌活性を日本化学療法学会寒天平板希釈法に準じて測定した。化合物Iの最小生育阻害濃度MIC（μg/mL）を表４に示す。化合物Iにはグラム陽性細菌特異的な抗細菌活性が認められた。
Test Example 6 Antibacterial activity against aerobic bacteria The antibacterial activity of Compound I against Gram-positive and Gram-negative bacteria was measured according to the Japanese Society of Chemotherapy agar plate dilution method. Table 4 shows the minimum growth inhibitory concentration MIC (μg / mL) of Compound I. Compound I showed antibacterial activity specific to Gram-positive bacteria.
実施例１
可溶性デンプン2％、グルコース1%、酵母エキス0.5%、ポリペプトン0.5%、β-サイクロデキストリン1%、寒天0.3%よりなる培地（滅菌前pH 6.6）を30mLずつ100mL容の三角フラスコに分注し、121℃で20分間滅菌した。この培地に、SY寒天培地によく生育させたアクチノアロムルス エスピー No.645122株をかきとって接種し、30℃、220回転/分の条件で7日間振とう培養し、種培養液とした。次に、グルコース1%、Pinedex#3（松谷化学工業） 6%、きな粉1%、乾燥酵母3%、コーンスティープリカー1%、硫酸マグネシウム７水和物 0.05%、炭酸カルシウム 0.2%、アデカノールLG-109（ADEKA）0.1%、シリコンKM70（信越化学工業） 0.1%よりなる培地（滅菌前pH 6.5）を30L容ジャーファーメンターに20L作製し、121℃で30分滅菌した。この培地に種培養液を400mL接種し、30℃で12日間培養した。
Example 1
Dispense 30 mL of a medium consisting of 2% soluble starch, 1% glucose, 0.5% yeast extract, 0.5% polypeptone, 1% β-cyclodextrin, and 0.3% agar into a 100 mL Erlenmeyer flask. Sterilized at 121 ° C for 20 minutes. This medium was inoculated with the Actinoallomulus sp. No. 645122 strain well grown on the SY agar medium, and cultured with shaking at 30 ° C. and 220 rpm for 7 days to obtain a seed culture solution. Next, glucose 1%, Pinedex # 3 (Matsutani Chemical Industry) 6%, Kinako flour 1%, dry yeast 3%, corn steep liquor 1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, calcium carbonate 0.2%, Adecanol LG- 20 L of medium (pH 6.5 before sterilization) consisting of 109 (ADEKA) 0.1% and silicon KM70 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) 0.1% was prepared in a 30 L jar fermenter and sterilized at 121 ° C. for 30 minutes. This medium was inoculated with 400 mL of the seed culture and cultured at 30 ° C. for 12 days.
培養液（30L）に等量のアセトンを加えて活性物質を抽出した。抽出液に等量の水を添加し、HP-20カラム（1.5L）に吸着させた。カラムを25%アセトンで洗浄した後、活性成分をアセトンで溶出した。溶出液に4倍量の水を加えて希釈し、ODSカラム（DAISOGEL SP-120-40/60-ODS-B, 1L）に吸着させ、40%アセトニトリルで活性成分を溶出した。活性成分を含むフラクションを減圧濃縮、凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末を1Lの20%アセトニトリルに溶解し、ODSカラム（YMC-ODS-AM120-S50, 0.5L）に吸着させ、活性成分を37%アセトニトリルで溶出後、減圧濃縮、凍結乾燥し、化合物Iの橙色粉末412mgを得た。 An active substance was extracted by adding an equal volume of acetone to the culture solution (30 L). An equal amount of water was added to the extract and adsorbed on an HP-20 column (1.5 L). After washing the column with 25% acetone, the active ingredient was eluted with acetone. The eluate was diluted with 4 times the amount of water, adsorbed on an ODS column (DAISOGEL SP-120-40 / 60-ODS-B, 1 L), and the active ingredient was eluted with 40% acetonitrile. The fraction containing the active ingredient was concentrated under reduced pressure and lyophilized. This lyophilized powder is dissolved in 1 L of 20% acetonitrile, adsorbed onto an ODS column (YMC-ODS-AM120-S50, 0.5 L), the active ingredient is eluted with 37% acetonitrile, concentrated under reduced pressure, and lyophilized to form a compound. 412 mg of orange powder of I was obtained.
化合物Iは下記の物理化学的性状を示した。
色及び形状：橙色粉末
旋光度 ［α］D 23：+72°（c 0.2, メタノール）
分子式：C69H105NO32
高分解能ESIマススペククトル：
実測値：1459.65817（M+）
計算値：1459.66198
赤外吸収スペクトル νmax(KBr)cm-1：3430, 2980, 2940, 2830, 1590, 1430, 1340, 1300, 1210, 1140, 1090, 1040, 910
紫外吸収スペクトル λmax nm (ε)：メタノール 238 (35,600), 259 (28,800), 300 (7,100), 494 (15,800)
1H-NMRスペクトル（500MHz、重ピリジン中）：図１１の通り
13C-NMRスペクトル（125MHz、重ピリジン中）：図１２の通り
Compound I exhibited the following physicochemical properties.
Color and shape: Orange powder optical rotation [α] D 23 : + 72 ° (c 0.2, methanol)
Molecular formula: C 69 H 105 NO 32
High resolution ESI mass spectrum:
Actual value: 1459.65817 (M + )
Calculated value: 1449.66198
Infrared absorption spectrum ν max (KBr) cm -1 : 3430, 2980, 2940, 2830, 1590, 1430, 1340, 1300, 1210, 1140, 1090, 1040, 910
UV absorption spectrum λ max nm (ε): Methanol 238 (35,600), 259 (28,800), 300 (7,100), 494 (15,800)
1 H-NMR spectrum (500 MHz, in heavy pyridine): as shown in FIG.
13 C-NMR spectrum (125 MHz, in heavy pyridine): as shown in FIG.
実施例２
100mgの化合物Iに2mol/L塩酸10mLを加えた。室温にて5日間攪拌し、得られた反応液を10mLの2mol/L水酸化ナトリウム水溶液で中和し、酢酸エチル30mLで2回抽出した。酢酸エチル層を濃縮乾固後、HPLCで精製し（分取条件は表５の通り）、溶出時間が7.55分のピークを分取して40mgの化合物IIを得た。
Example 2
To 100 mg of Compound I, 10 mL of 2 mol / L hydrochloric acid was added. The mixture was stirred at room temperature for 5 days, and the resulting reaction solution was neutralized with 10 mL of a 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution and extracted twice with 30 mL of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was concentrated to dryness and then purified by HPLC (preparative conditions are as shown in Table 5). A peak with an elution time of 7.55 minutes was collected to obtain 40 mg of Compound II.
化合物IIは下記の物理化学的性状を示した。
高分解能TOFマススペクトル：
実測値：631.2387（M-H）
計算値：632.2469
1H-NMRスペクトル（400MHz、重クロロホルム中）：図１３の通り
Compound II exhibited the following physicochemical properties.
High resolution TOF mass spectrum:
Actual value: 631.2387 (MH)
Calculated value: 632.2469
1 H-NMR spectrum (400 MHz, in deuterated chloroform): as shown in FIG.
実施例３
50mgの化合物Iに2mol/L塩酸5mLを加えた。室温にて1日攪拌し、得られた反応液を5mLの2mol/L水酸化ナトリウム水溶液で中和し、20mLの酢酸エチルで2回抽出した。酢酸エチル層を濃縮乾固後、HPLCで精製し（分取条件は実施例２と同様）、溶出時間が6.86分のピークを分取して9.6mgの化合物IIIを、また溶出時間が7.29分のピークを分取して5.1mgの化合物IVを得た。
Example 3
To 50 mg of Compound I, 5 mL of 2 mol / L hydrochloric acid was added. The mixture was stirred at room temperature for 1 day, and the resulting reaction solution was neutralized with 5 mL of a 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution and extracted twice with 20 mL of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was concentrated to dryness and purified by HPLC (preparative conditions were the same as in Example 2). A peak with an elution time of 6.86 minutes was collected to obtain 9.6 mg of Compound III, and an elution time of 7.29 minutes. The peak was fractionated to obtain 5.1 mg of compound IV.
化合物III及び化合物IVは下記の物理化学的性状を示した。
（化合物III）
高分解能TOFマススペクトル：
実測値：951.3860（M-H）
計算値：952.3940
1H-NMRスペクトル（400MHz、重クロロホルム中）：図１４の通り
（化合物IV）
高分解能TOFマススペクトル：
実測値：791.3128（M-H）
計算値：792.3205
1H-NMRスペクトル（400MHz、重ピリジン中）：図１５の通り
13C-NMRスペクトル（100MHz、重ピリジン中）：図１６の通り
Compound III and Compound IV exhibited the following physicochemical properties.
(Compound III)
High resolution TOF mass spectrum:
Actual value: 951.3860 (MH)
Calculated value: 952.3940
1 H-NMR spectrum (400 MHz, in deuterated chloroform): As shown in FIG. 14 (Compound IV)
High resolution TOF mass spectrum:
Actual value: 791.3128 (MH)
Calculated value: 792.3205
1 H-NMR spectrum (400 MHz, in heavy pyridine): as shown in FIG.
13 C-NMR spectrum (100 MHz, in heavy pyridine): as shown in FIG.
上記物理化学的性状から実施例１〜３の化合物（化合物I〜IV）はアントラサイクリン系化合物であると考えられた。各種2次元NMRスペクトルの結果を含めて解析し、化合物I〜IVの構造を前記の構造式のように決定した。 From the above physicochemical properties, the compounds of Examples 1 to 3 (Compounds I to IV) were considered to be anthracycline compounds. Analysis was performed including the results of various two-dimensional NMR spectra, and the structures of Compounds I to IV were determined as in the above structural formula.
式(A)の化合物又はその塩は、良好な形質転換抑制作用及び／又は細胞外マトリクス産生抑制作用を有し、組織線維化が関与する疾患の予防及び／又は治療剤として使用できる。 The compound of formula (A) or a salt thereof has a good transformation inhibitory action and / or extracellular matrix production inhibitory action, and can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases involving tissue fibrosis.
アクチノアロムルス エスピー(Actinoallomurus sp.) No.645122株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-11008（受託日2008年9月3日）として寄託されている。 Actinoallomurus sp. No.645122 shares are registered in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (Address: 1st, 1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan) Deposited under the deposit number FERM BP-11008 (date of deposit September 3, 2008).
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