JP2011211970A - Method, kit, and marker gene for predicting sensitivity or responsiveness to interferon - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、インターフェロンに対する感受性又は応答性を予測する方法、キット及びマーカー遺伝子に関する。 The present invention relates to a method, kit, and marker gene for predicting sensitivity or responsiveness to interferon.
近年、患者の個人差を考慮した医療、すなわち個別化医療が重要視されており、患者に対する薬剤の効果を予測する方法が積極的に探索されている。患者の薬剤に対する感受性又は応答性を薬剤の投与前や投与初期に予測してから薬剤を投与していくことは、薬剤の有効性や有用性を高めるだけでなく、無意味な薬剤投与を控えて治療費用を節減し、さらには副作用を回避する面からも重要である。 In recent years, medical care that takes into account individual differences among patients, that is, individualized medical care, has been regarded as important, and methods for predicting the effects of drugs on patients have been actively searched. Predicting the sensitivity or responsiveness of a patient to a drug before or at the beginning of the drug administration will not only increase the effectiveness and usefulness of the drug, but also refrain from meaningless drug administration. This is important in terms of saving treatment costs and avoiding side effects.
肝癌とは、肝内に発生する悪性腫瘍をいい、肝臓で原発性に発生する肝細胞癌と、肝外臓器で発生して肝内に転移した肝転移肝癌とに大別される。肝癌患者の９０％以上は肝炎ウィルスの感染者であり、肝癌の発症リスクを有するウィルス性肝炎患者の数は、日本全国で３００万人ともいわれている。 Liver cancer refers to a malignant tumor that develops in the liver, and is broadly divided into hepatocellular carcinoma that occurs primarily in the liver and liver metastasis liver metastasis that has developed in the liver and metastasized to the liver. Over 90% of liver cancer patients are infected with hepatitis virus, and the number of viral hepatitis patients at risk of developing liver cancer is said to be 3 million nationwide.
インターフェロン（以下、ＩＦＮ）は、Ｃ型慢性肝炎や肝硬変に対するウィルス駆除剤として使用されている。ＩＦＮ投与によるウィルス駆除療法は、ウィルス駆除又は肝機能改善効果を示すばかりか、結果的にＣ型慢性肝炎・肝硬変から肝癌への移行を抑制することが明らかとなっているため、Ｃ型慢性肝炎及び肝硬変に対してＩＦＮを積極的に使用することが推奨されている。このＩＦＮ投与による肝癌発生の抑制メカニズムとしては、極初期の不顕性な段階にある肝癌細胞に対してＩＦＮが直接的に増殖抑制作用を示すことが寄与すると考えられている。実際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、ＩＦＮは肝癌細胞の増殖を抑制することが知られており、肝癌の発生又は進行を抑える治療剤としての効果も認められつつある。 Interferon (hereinafter referred to as IFN) is used as a virus control agent for chronic hepatitis C and cirrhosis. Viral control therapy by IFN administration not only shows virus control or liver function improving effect, but also has been shown to suppress the transition from chronic hepatitis C / cirrhosis to liver cancer. It is recommended to use IFN actively for cirrhosis. As a mechanism for suppressing the occurrence of liver cancer by administration of IFN, it is considered that IFN directly exerts a growth-inhibiting action on liver cancer cells that are in an extremely indistinct stage. Actually, in an in vitro test, IFN is known to suppress the growth of liver cancer cells, and an effect as a therapeutic agent for suppressing the occurrence or progression of liver cancer is also being recognized.
ＩＦＮの投与前に患者のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法としては、Ｃ型肝炎患者から採取した肝細胞におけるＪＡＫ結合タンパク質遺伝子又はＣＩＳ３遺伝子の発現量を測定する方法（特許文献１）が報告され、肝癌におけるＩＦＮ及び５−ＦＵの併用療法に対する感受性又は応答性を予測する方法としては、ＩＦＮＡＲ２遺伝子の発現を解析対象とする方法（非特許文献１）が報告されている。 As a method for predicting the sensitivity or responsiveness of a patient to IFN before administration of IFN, there is a method of measuring the expression level of a JAK-binding protein gene or CIS3 gene in hepatocytes collected from a hepatitis C patient (Patent Document 1). As a method for predicting the sensitivity or responsiveness to the combination therapy of IFN and 5-FU in liver cancer, a method (Non-patent Document 1) that reports expression of IFNAR2 gene has been reported.
一方、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４（ＫＬＦ４と略される。）は、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ（ＫＬＦと略される。）ファミリーに属する転写因子であり、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＺＦと略される。）やＧｕｔ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ Ｆａｃｔｏｒ（ＧＫＬＦと略される。）とも呼ばれるタンパク質である。ＫＬＦ４は、細胞の成長、増殖、分化及び胚発生において様々な制御を行っていることが知られ（非特許文献２）、消化管癌及び白血病では腫瘍抑制因子として働くことを示唆する報告（非特許文献３〜５）、乳癌（非特許文献６）及び口腔扁平上皮細胞癌（非特許文献７）では癌の進行期に発現量が増加することを示す報告、早期浸潤乳管癌においては悪性表現型のマーカー遺伝子であるとする報告（非特許文献８）がなされているが、その機能の詳細や癌の増殖における役割については未だ明らかになっていない。 On the other hand, Kruppel-like factor 4 (abbreviated as KLF4) is a transcription factor belonging to the Kruppel-like factor (abbreviated as KLF) family, and is referred to as Endothelial Kruppel-like Zinc Finger Protein (EZ). ) And Gut-enriched Kruppel-like Factor (abbreviated as GKLF). KLF4 is known to perform various controls on cell growth, proliferation, differentiation and embryogenesis (Non-patent Document 2), and reports suggesting that it acts as a tumor suppressor in gastrointestinal cancer and leukemia (non-patent document 2) Patents 3 to 5), breast cancer (Non-patent document 6), and oral squamous cell carcinoma (Non-patent document 7) report that the expression level increases in the advanced stage of cancer, malignant in early invasion ductal carcinoma Although it has been reported that it is a phenotypic marker gene (Non-Patent Document 8), details of its function and role in cancer growth have not yet been clarified.
Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＦ２ＢＰと略される。）は、熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を制御する転写因子であるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２に結合して相互作用をするタンパク質であるが、その機能の詳細については明らかになっていない（非特許文献９）。 Heat shock transcription factor 2-binding protein (abbreviated as HSF2BP) is a protein that interacts with Heat shock transcription 2 that is a transcription factor that regulates the expression of heat shock protein (Heat shock protein). However, details of the function have not been clarified (Non-Patent Document 9).
Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２（ＡＮＫＲＤ１２と略される。）は、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｆａｃｔｏｒ ２（ＡＮＣＯ２と略される。）又はＫＩＡＡ０８７４とも呼ばれるタンパク質であるが、その機能についてはほとんど明らかになっていない（非特許文献１０）。 Ankyrin repeat domain 12 (abbreviated as ANKRD12) is a protein also called Ankyrin repeat-containing factor 2 (abbreviated as ANCO2) or KIAA0874, but its function is hardly clarified (non-patent) Reference 10).
しかしながら、ＩＦＮの投与はすべてのＣ型慢性肝炎患者、肝硬変患者及び肝癌患者に対してその効果を示すわけではなく、重篤な副作用を伴う可能性もあることから、ＩＦＮに対する感受性又は応答性の低い患者、すなわちＩＮＦ非感受性又は非応答性の患者に対するＩＦＮの投与は慎重にすべきであると考えられる。 However, administration of IFN is not effective for all chronic hepatitis C patients, cirrhosis patients and liver cancer patients, and may have serious side effects. Administration of IFN to low patients, ie patients who are INF insensitive or non-responsive, should be cautious.
また、現在、ＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法で明確な判定基準のある方法はないため、臨床の現場において、患者へのＩＦＮの投与前に適用可能な新たな方法の開発が必要であると考えられる。 In addition, there is currently no method for predicting sensitivity or responsiveness to IFN, and there is no method with a clear criterion. Therefore, it is necessary to develop a new method that can be applied before clinical administration of IFN to patients in clinical settings. It is believed that there is.
そこで本発明は、ＩＦＮの投与を必要としている患者及び被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for predicting the sensitivity or responsiveness of IFN administration to patients and test cells to IFN.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、肝癌細胞におけるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２の発現量と、ＩＦＮによる肝癌細胞の増殖抑制効果に相関があることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that the expression amount of Kruppel-like factor 4, Heat shock transcription factor 2-binding protein or hepatic repeat domain 12N in liver cancer cells, It was found that there is a correlation between the growth inhibitory effects of and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）に記載した、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法を提供する。
（１） 被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法であって、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と上記被検細胞とにおける、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４（以下、ＫＬＦ４）遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＨＳＦ２ＢＰ）遺伝子及びＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２（以下、ＡＮＫＲＤ１２）遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、上記被検細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と、上記対照細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であると予測し、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測する予測ステップと、を備える方法。
（ａ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｂ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｃ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｄ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して４倍以上である場合
（ｅ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（ｆ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（２） 上記被検細胞は、ヒト由来の癌細胞である、上記（１）に記載の方法。
（３） 上記癌細胞は、肝癌細胞である、上記（２）に記載の方法。
（４） 上記ＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 上記Ｉ型ＩＦＮは、ＩＦＮβ又はＩＦＮαである、上記（４）に記載の方法。
（６） 下記の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかを含む、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測するキット。
（ｇ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子をＰＣＲで増幅するためのＰＣＲプライマーセット
（ｈ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ
（ｉ） 上記ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
（ｊ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体
（７） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択され、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測するマーカー遺伝子。
That is, the present invention provides a method for predicting the sensitivity or responsiveness of a test cell to IFN described in the following (1) to (7).
(1) A method for predicting the sensitivity or responsiveness of a test cell to IFN, which is selected from the group consisting of HepG2 cells, SK-HEP-1 cells, HLE cells, and Hep3B cells, and the above A group consisting of a Kruppel-like factor 4 (hereinafter referred to as KLF4) gene, a heat shock transcription factor 2-binding protein (hereinafter referred to as an HSF2BP) gene, and an Ankyrin repeat group 12 domain, and an Amyrin repeat group 12 A measuring step for measuring the expression level of the marker gene or its translation product, the expression level of the marker gene or its translation product in the test cell, and the marker gene or its level in the control cell. The comparison cell that compares the expression level of the translation product and any of the following (a) to (c) predicts that the test cell is an IFN-insensitive or IFN-unresponsive cell. And a prediction step of predicting that the test cell is an IFN-sensitive or IFN-responsive cell when it is any of the following (d) to (f).
(A) When the expression level of the KLF4 gene or its translation product in the test cell is 0.5 times or less compared to the expression level in the control cell (b) The HSF2BP gene or translation thereof in the test cell When the expression level of the product is 0.5 times or less compared with the expression level in the control cell (c) The expression level of the ANKRD12 gene or its translation product in the test cell is the same as the expression level in the control cell When compared with 0.5 times or less (d) When the expression level of the KLF4 gene or its translation product in the test cell is 4 times or more compared with the expression level in the control cell (e) When the expression level of the HSF2BP gene or its translation product in the test cell is more than twice the expression level in the control cell (f) (2) In the above (1), the test cell is a human-derived cancer cell, wherein the expression level of the ANKRD12 gene or its translation product is at least twice that of the control cell. The method described.
(3) The method according to (2) above, wherein the cancer cell is a liver cancer cell.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the IFN is a type I IFN.
(5) The method according to (4), wherein the type I IFN is IFNβ or IFNα.
(6) A kit for predicting the sensitivity or responsiveness of a test cell to IFN, comprising any of the following (g) to (j).
(G) PCR primer set for amplifying KLF4 gene, HSF2BP gene and / or ANKRD12 gene by PCR (h) Polynucleotide probe hybridizing to KLF4 gene, HSF2BP gene and / or ANKRD12 gene (i) The above polynucleotide probe (J) an antibody that specifically binds to a translation product of the KLF4 gene, the HSF2BP gene and / or the ANKRD12 gene (7) selected from the group consisting of the KLF4 gene, the HSF2BP gene and the ANKRD12 gene, A marker gene that predicts the sensitivity or responsiveness of a test cell to IFN.
本発明の方法によれば、患者から採取した被検細胞におけるマーカー遺伝子であるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量を測定し、対照細胞におけるそれらの発現量と比較することによって、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測することができる。 According to the method of the present invention, the expression level of KLF4 gene, HSF2BP gene or ANKRD12 gene, which is a marker gene in a test cell collected from a patient, or any translation product thereof is measured, and the expression level in a control cell Can be used to predict the sensitivity or responsiveness of the test cells to IFN.
本発明の被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法は、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と上記被検細胞とにおける、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、上記被検細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と、上記対照細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であると予測し、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測する予測ステップと、を備えることを特徴としている。
（ａ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｂ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｃ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｄ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して４倍以上である場合
（ｅ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（ｆ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
The method for predicting the sensitivity or responsiveness of the test cells of the present invention to IFN includes any one of the control cells selected from the group consisting of HepG2 cells, SK-HEP-1 cells, HLE cells, and Hep3B cells and the above test. A measurement step of measuring an expression level of a marker gene selected from the group consisting of a KLF4 gene, an HSF2BP gene and an ANKRD12 gene or a translation product thereof, and an expression level of the marker gene or the translation product in the test cell And the comparison step of comparing the expression level of the marker gene or the translation product thereof in the control cell, and the following (a) to (c), the test cell is insensitive to IFN Or when it is predicted that the cell is non-IFN responsive and any of the following (d) to (f): Serial test cell is characterized by comprising: a prediction step of predicting that the IFN-sensitive or IFN-responsive cells, a.
(A) When the expression level of the KLF4 gene or its translation product in the test cell is 0.5 times or less compared to the expression level in the control cell (b) The HSF2BP gene or translation thereof in the test cell When the expression level of the product is 0.5 times or less compared with the expression level in the control cell (c) The expression level of the ANKRD12 gene or its translation product in the test cell is the same as the expression level in the control cell When compared with 0.5 times or less (d) When the expression level of the KLF4 gene or its translation product in the test cell is 4 times or more compared with the expression level in the control cell (e) When the expression level of the HSF2BP gene or its translation product in the test cell is more than twice the expression level in the control cell (f) If ANKRD12 gene or the expression level of the translation product, at least 2-fold compared to the expression level in the control cells
「ＩＦＮに対する感受性又は応答性」とは、細胞においてＩＦＮの刺激又は作用により反応又は効果が誘発され得る性質や、細胞のＩＦＮ受容性をいう。ＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞とは、ＩＦＮ受容性が高く、ＩＦＮにより反応又は効果が誘発される細胞のことをいい、ＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞とは、ＩＦＮ受容性がないか又は低く、ＩＦＮにより反応又は効果が誘発されない又は誘発されても十分ではない細胞のことをいう。 “Sensitivity or responsiveness to IFN” refers to the property that a response or effect can be induced by stimulation or action of IFN in a cell, or the IFN receptivity of a cell. An IFN-sensitive or IFN-responsive cell is a cell that is highly IFN-receptive and induces a response or effect by IFN, and an IFN-insensitive or non-IFN-responsive cell is not IFN-receptive Refers to a cell that is low or low and does not elicit or is sufficient to elicit a response or effect by IFN.
ＩＦＮの刺激又は作用により誘発される反応又は効果としては、例えば、抗ウィルス効果や癌細胞の増殖抑制効果が挙げられる。 Examples of the reaction or effect induced by the stimulation or action of IFN include an antiviral effect and a cancer cell growth inhibitory effect.
「被検細胞」とは、患者の罹患部位から採取した細胞をいうが、癌患者から採取した癌細胞、すなわちヒト由来の癌細胞であることが好ましく、肝癌患者から採取した肝癌細胞であることがより好ましい。 “Test cell” refers to a cell collected from a diseased site of a patient, preferably a cancer cell collected from a cancer patient, that is, a human-derived cancer cell, and a liver cancer cell collected from a liver cancer patient. Is more preferable.
被検細胞としては、例えば癌細胞のような病巣となる細胞が、正常細胞の一部に含まれる状態のものであってもよいが、できるだけ正常細胞を除去した細胞であることが好ましい。 The test cell may be in a state where a lesion cell such as a cancer cell is included in a part of normal cells, but is preferably a cell from which normal cells are removed as much as possible.
「対照細胞」とは、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量と、ＩＦＮに対する感受性又は応答性の関係が既知である細胞をいい、ＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であるヒト肝癌細胞株のＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞又はＨｅｐ３Ｂ細胞から選択されるのが好ましい。 “Control cell” refers to a cell having a known relationship between the expression level of the KLF4 gene, HSF2BP gene, ANKRD12 gene or any of their translation products, and sensitivity or responsiveness to IFN. It is preferably selected from HepG2 cells, SK-HEP-1 cells, HLE cells or Hep3B cells of human hepatoma cell lines which are responsive cells.
一方で、ＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞を対照細胞とするのであれば、ヒト肝癌細胞株であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が好ましい。 On the other hand, if IFN-sensitive or IFN-responsive cells are used as control cells, human hepatoma cell lines, PLC / PRF / 5 cells are preferred.
被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量の測定としては、被検細胞における該ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定すればよいが、該ｍＲＮＡの発現量を測定することが好ましい。 As the measurement of the expression level of the KLF4 gene, HSF2BP gene, ANKRD12 gene or any translation product thereof in the test cell, the expression level of the mRNA or protein in the test cell may be measured. It is preferred to measure the amount.
細胞におけるｍＲＮＡの発現量の測定は、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる方法等、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）で測定することができるが、ＲＴ−ＰＣＲ法で測定することが好ましい。 The expression level of mRNA in cells is measured by a known method (for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring) such as a RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerization Chain Reaction) method or a method of hybridizing with a polynucleotide probe. (Harbor Lab. Press, 1989), but is preferably measured by the RT-PCR method.
ＲＴ−ＰＣＲ法とは、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出し、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）する方法をいうが、ＰＣＲとしてはリアルタイムＰＣＲが好ましい。また、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２のＤＮＡ塩基配列は既に公知であるため、ＰＣＲする場合は、該ＤＮＡ塩基配列に基づいてプライマーを適宜設定することができる。このプライマーとしては、該ＤＮＡ塩基配列に特異的な配列を増幅するものが好ましい。 The RT-PCR method is a method in which RNA (total RNA or mRNA) is extracted from cells, cDNA is synthesized from the RNA, and then PCR (Polymerase Chain Reaction) is used. Real-time PCR is preferable as the PCR. Moreover, since the DNA base sequences of KLF4, HSF2BP, and ANKRD12 are already known, when PCR is performed, primers can be appropriately set based on the DNA base sequences. This primer is preferably one that amplifies a sequence specific to the DNA base sequence.
ＰＣＲについては、ＰＣＲ増幅産物の収率及び特異性が最適化された反応条件を選択可能であるが、重要な反応パラメータとしては、例えば、プライマーの長さ及び塩基配列、アニーリング及び伸長工程の温度並びに反応時間、Ｍｇイオン濃度又は塩濃度が挙げられる。 For PCR, it is possible to select reaction conditions that optimize the yield and specificity of the PCR amplification product, but important reaction parameters include, for example, primer length and nucleotide sequence, annealing and extension step temperature. And reaction time, Mg ion concentration or salt concentration.
ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる方法としては、例えば、サザンブロット法、ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料を用いるＤＮＡマイクロアレイ法、又は、細胞からＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡをポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせるノーザンブロット法若しくはＲＮａｓｅプロテクションアッセイが挙げられるが、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ又はＡＮＫＲＤ１２のＤＮＡ塩基配列に特異的な配列をポリヌクレオチドプローブとして設計する必要がある。ここで、該ＤＮＡ塩基配列に特異的な配列かどうかは、ＢＬＡＳＴ解析により確認することができる。 Examples of a method for hybridizing with a polynucleotide probe include a Southern blot method, a DNA microarray method using a solid phase-immobilized sample to which a polynucleotide probe is immobilized, or RNA extracted from a cell and the mRNA is used as a polynucleotide probe. Examples include Northern blotting or RNase protection assay for hybridization, and it is necessary to design a sequence specific to the DNA base sequence of KLF4, HSF2BP or ANKRD12 as a polynucleotide probe. Here, whether the sequence is specific to the DNA base sequence can be confirmed by BLAST analysis.
また、ｍＲＮＡの発現量の測定において標準化のために用いるハウスキーピング遺伝子としては、例えば、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ又はＧ３ＰＤＨと略される。）、β−アクチン又はβ２−マイクログロブリンあるいはこれらの組み合わせが挙げられる。 In addition, examples of housekeeping genes used for standardization in the measurement of mRNA expression levels include Glyceraldaldehyde-3-phosphate dehydrogenase (abbreviated as GAPDH or G3PDH), β-actin, β2-microglobulin, or these. Combinations are listed.
タンパク質の発現量の測定は、細胞をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで溶解後、抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）又はウェスタンブロッティング等、公知の方法で測定することが出来る。 The protein expression level can be measured by a known method such as ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), RIA (Radioimmunoassay) or Western blotting using an antibody after lysing the cells with Lysis Buffer.
タンパク質の発現量の測定には特異的抗体が必要であるが、特異的抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでも構わない。ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２のＤＮＡ塩基配列は既に公知であるため、これらのタンパク質の特異的抗体は、これらのタンパク質を抗原として用い、公知の抗体又は抗血清の製造方法で製造することができる。以下に、これらの製造方法を例示する。 A specific antibody is required to measure the expression level of the protein, and the specific antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Since the DNA base sequences of KLF4, HSF2BP and ANKRD12 are already known, specific antibodies for these proteins can be produced by using these proteins as antigens and using known methods for producing antibodies or antisera. Below, these manufacturing methods are illustrated.
モノクローナル抗体産生細胞の製造においては、まず、抗原で免疫された温血動物を準備する。抗原で免疫された温血動物は、抗原となるタンパク質を、温血動物の抗体産生が可能な部位に投与することで得られる。抗原となるタンパク質は単独で投与してもよいし、担体又は希釈剤とともに投与しても構わない。また、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバント等のアジュバントを同時に投与してもよい。 In the production of monoclonal antibody-producing cells, first, a warm-blooded animal immunized with an antigen is prepared. A warm-blooded animal immunized with an antigen can be obtained by administering a protein serving as an antigen to a site where antibody production of the warm-blooded animal is possible. The protein serving as the antigen may be administered alone, or may be administered together with a carrier or diluent. In order to enhance antibody production ability, adjuvants such as complete Freund's adjuvant and incomplete Freund's adjuvant may be administered simultaneously.
抗原となるタンパク質は、通常、２〜６週毎に１回ずつの頻度で、計２〜１０回程度投与する。抗原となるタンパク質を投与する温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ又はニワトリが挙げられるが、マウス又はラットが好ましい。 The protein serving as the antigen is usually administered about 2 to 10 times in total at a frequency of once every 2 to 6 weeks. Examples of warm-blooded animals to which a protein serving as an antigen is administered include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens, and mice or rats are preferred.
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、すなわちモノクローナル抗体産生細胞は、抗原で免疫された温血動物、すなわち抗体価の認められた温血動物から、抗原となるタンパク質の最終投与より２〜５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることによって製造することができる。なお、温血動物の抗血清中の抗体価の測定方法としては、例えば、標識化ペプチドと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識化ペプチドの活性を測定する方法が挙げられる。 A monoclonal antibody-producing hybridoma, that is, a monoclonal antibody-producing cell, is obtained from a warm-blooded animal immunized with an antigen, that is, a warm-blooded animal with an antibody titer, 2 to 5 days after the final administration of the antigen protein. And the antibody-producing cells contained therein are fused with myeloma cells of the same or different animals. In addition, as a measuring method of the antibody titer in the antiserum of a warm-blooded animal, the method of measuring the activity of the labeled peptide couple | bonded with the antibody after reacting a labeled peptide and antiserum is mentioned, for example.
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、公知の方法（ケーラーら、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、ｐ．２５６−４９５）で融合させることができる。融合に用いる融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）又はセンダイウィルスなどが挙げられるが、ＰＥＧが好ましく、ＰＥＧ１０００又はＰＥＧ６０００がより好ましい。また、融合促進剤は１０〜８０％の濃度で添加されることが好ましい。 Antibody-producing cells and myeloma cells can be fused by known methods (Kehler et al., Nature, 1975, p. 256-495). Examples of the fusion promoter used for the fusion include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG) or Sendai virus, and PEG is preferable, and PEG1000 or PEG6000 is more preferable. The fusion promoter is preferably added at a concentration of 10 to 80%.
異種動物の骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、ＳＰ２／０細胞、ＡＰ−１細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１細胞が好ましい。融合に用いる抗体産生細胞の数と骨髄腫細胞の数の比率は、１：１〜２０：１が好ましい。インキュベート温度は、２０〜４０℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。また、インキュベート時間は、１〜１０分間が好ましい。 Examples of the myeloma cells from different animals include NS-1 cells, P3U1 cells, SP2 / 0 cells, and AP-1 cells, with P3U1 cells being preferred. The ratio of the number of antibody-producing cells and the number of myeloma cells used for fusion is preferably 1: 1 to 20: 1. The incubation temperature is preferably 20 to 40 ° C, more preferably 30 to 37 ° C. The incubation time is preferably 1 to 10 minutes.
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング方法としては、例えば、ペプチド抗原を吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、さらに放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを加えて、マイクロプレートに結合したモノクローナル抗体を検出する方法、又は、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、さらに放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、マイクロプレートに結合したモノクローナル抗体を検出する方法が挙げられる。 As a screening method for a monoclonal antibody-producing hybridoma, for example, a hybridoma culture supernatant is added to a microplate to which a peptide antigen is adsorbed, and an anti-immunoglobulin antibody or protein A labeled with a radioactive substance or an enzyme is added to the microplate. Method of detecting monoclonal antibody bound to plate, or adding hybridoma culture supernatant to microplate adsorbed with anti-immunoglobulin antibody or protein A, and then adding protein labeled with radioactive substance or enzyme, microplate And a method for detecting a monoclonal antibody bound to.
モノクローナル抗体は、自体公知又はそれに準じる方法で選別できるが、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）を添加した動物細胞用培地が用いられる。動物細胞用培地としては、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマが生育できれば特に限定はないが、例えば、牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地又はハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１；日水製薬（株））が挙げられる。ＲＰＭＩ １６４０培地に含まれる牛胎児血清は、１〜２０％が好ましく、１０〜２０％がより好ましい。 Monoclonal antibodies can be selected by a method known per se or a method analogous thereto, but usually an animal cell medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin and thymidine) is used. The medium for animal cells is not particularly limited as long as a monoclonal antibody-producing hybridoma can grow. Can be mentioned. Fetal bovine serum contained in RPMI 1640 medium is preferably 1 to 20%, more preferably 10 to 20%.
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養は、通常、５％炭酸ガス下で行われるが、その培養温度は、２０〜４０℃が好ましく、約３７℃がより好ましい。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養期間は、５日〜３週間が好ましく、１〜２週間がより好ましい。また、ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価と同様に測定できる。 The monoclonal antibody-producing hybridoma is usually cultured under 5% carbon dioxide gas, and the culture temperature is preferably 20 to 40 ° C, more preferably about 37 ° C. The culture period of the monoclonal antibody-producing hybridoma is preferably 5 days to 3 weeks, more preferably 1 to 2 weeks. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum.
モノクローナル抗体の分離精製方法としては、例えば、免疫グロブリンの分離精製方法が挙げられる。ここで、免疫グロブリンの分離精製方法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、ＤＥＡＥ等のイオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインＡ若しくはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取する特異的精製法が挙げられる。 Examples of the method for separating and purifying monoclonal antibodies include a method for separating and purifying immunoglobulins. Here, as a method for separating and purifying immunoglobulin, for example, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method by ion exchanger such as DEAE, ultracentrifugation method, gel filtration method And a specific purification method in which only the antibody is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G.
ポリクローナル抗体は、例えば、免疫抗原となるタンパク質又は免疫抗原となるタンパク質とキャリアータンパク質との複合体を、上記のモノクローナル抗体産生細胞の製造と同様に温血動物に投与し、免疫された温血動物から抗体含有物を採取して製造することができる。 The polyclonal antibody is, for example, a protein that serves as an immune antigen or a complex of a protein that serves as an immune antigen and a carrier protein, which is administered to a warm-blooded animal in the same manner as in the production of the monoclonal antibody-producing cells, and is immunized. The antibody-containing material can be collected from the product.
キャリアータンパク質との複合体を形成して免疫抗原となるタンパク質、すなわちハプテンの種類としては、ハプテンがキャリアータンパク質と結合することによりポリクローナル抗体が効率良く産生されるものであれば、特に限定はない。一方、キャリアータンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はヘモシアニンが挙げられる。 The type of hapten that forms a complex with a carrier protein and serves as an immunizing antigen, that is, a hapten, is not particularly limited as long as a polyclonal antibody is efficiently produced by binding the hapten to the carrier protein. On the other hand, examples of the carrier protein include bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, and hemocyanin.
複合体形成におけるハプテンとキャリアータンパク質との重量比としては、ハプテン１に対し、キャリアータンパク質が０．１〜２０が好ましく、１〜５がより好ましい。また、ハプテンとキャリアータンパク質との結合に用いる縮合剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル又はチオール基若しくはジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬が挙げられる。 As a weight ratio of the hapten and the carrier protein in forming the complex, the carrier protein is preferably 0.1 to 20 and more preferably 1 to 5 with respect to the hapten 1. Moreover, as a condensing agent used for the coupling | bonding of a hapten and carrier protein, the active ester reagent containing a glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, or a thiol group or a dithiobilidyl group is mentioned, for example.
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水等から採取することができるが、血液から採取することが好ましい。 Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc. of warm-blooded animals immunized by the above method, but are preferably collected from blood.
ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と同様に分離精製することができる。 Polyclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as monoclonal antibodies.
「発現量」とは、絶対量である必要はなく、相対量であってもよい。また、必ずしも数値的に表現される必要はなく、例えば、色素や蛍光標識等の可視的な標識を用い、目視により判定する場合も、発現量の測定に含まれる。 The “expression amount” does not need to be an absolute amount, but may be a relative amount. Moreover, it is not always necessary to express numerically. For example, a case where visual determination is made using a visible label such as a dye or a fluorescent label is also included in the measurement of the expression level.
対照細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量は、被検細胞におけるそれらの発現量と同時に測定してもよいし、事前に測定しておいてもよい。事前の測定をしておく場合には、予め対照細胞における該ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の絶対量又はある標準物質に換算した相対量を求めておき、それを被検細胞における発現量と比較してもよいし、対照細胞における絶対量に相当する量の該ＤＮＡ又はタンパク質を対照として、被検細胞における発現量と同時に測定してもよい。 The expression level of the KLF4 gene, HSF2BP gene, ANKRD12 gene or any translation product thereof in the control cell may be measured simultaneously with their expression level in the test cell, or may be measured in advance. Good. When measuring in advance, an absolute amount of the mRNA or protein in the control cell or a relative amount converted to a standard substance may be obtained in advance and compared with the expression level in the test cell. Then, the amount of the DNA or protein corresponding to the absolute amount in the control cell may be used as a control and measured simultaneously with the expression level in the test cell.
被検細胞及び対照細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量の比較は、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量が、対照細胞におけるそれと比較して何倍であるかを指標にすることもできる。 The comparison of the expression level of the KLF4 gene, HSF2BP gene or ANKRD12 gene or any of their translation products in the test cell and the control cell is the same as that of the KLF4 gene, HSF2BP gene or ANKRD12 gene in the test cell or any translation product thereof. It can also be used as an index how many times the expression level of is compared with that in the control cells.
対照細胞がＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であるＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞又はＨｅｐ３Ｂ細胞の場合には、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量のうち、１以上が対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下であることを指標として、被検細胞がＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であると予測することが好ましい。また、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、対照細胞における発現量と比較して４倍以上であることを指標として、被検細胞がＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測することも好ましい。さらには、被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量が、対照細胞における発現量と比較して２倍以上であることを指標として、被検細胞がＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測することも好ましい。 When the control cells are HepG2 cells, SK-HEP-1 cells, HLE cells, or Hep3B cells, which are IFN-insensitive or IFN-unresponsive cells, the KLF4 gene, HSF2BP gene or ANKRD12 gene in the test cells or their Among the expression levels of any of the translation products, the test cell is an IFN-insensitive or non-IFN-responsive cell with an index that one or more is 0.5 times or less compared to the expression level in the control cell. It is preferable to predict that there will be. In addition, the test cell is an IFN-sensitive or IFN-responsive cell, using as an index that the expression level of the KLF4 gene or its translation product in the test cell is 4 times or more that of the control cell. It is also preferable to predict. Furthermore, the test cell is expressed as IFN-sensitive by using as an index that the expression level of the HSF2BP gene or ANKRD12 gene or any translation product thereof in the test cell is twice or more that of the control cell. It is also preferable to predict that the cell is an IFN-responsive cell.
上記の指標以外にも、対照細胞としてＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞及びＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞の両方を用い、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量がＩＦＮ感受性若しくはＩＦＮ応答性の細胞又はＩＦＮ非感受性若しくはＩＦＮ非応答性の細胞のどちらに近いかを指標とすることも可能である。 In addition to the above indicators, both IFN-sensitive or IFN-responsive cells and IFN-insensitive or IFN-unresponsive cells are used as control cells, and the KLF4 gene, HSF2BP gene, ANKRD12 gene or any of them in the test cell It is also possible to use as an index whether the expression level of the translation product is close to IFN-sensitive or IFN-responsive cells or IFN-insensitive or IFN-unresponsive cells.
被検細胞の感受性又は応答性を予測するＩＦＮは、α型、β型、γ型、τ型、ω型、λ型、コンセンサス型又はハイブリット型のいずれでもよく、また由来も天然型、遺伝子組換え型又は化学合成型のいずれでもよいが、Ｉ型ＩＦＮが好ましく、α型ＩＦＮ又はβ型ＩＦＮすなわちＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βがより好ましく、ＩＦＮ−βがさらに好ましい。なお、ＩＦＮは高分子等により修飾されていてもよく、例えば、ＰＥＧと結合したＰＥＧ−ＩＦＮであってもよい。 The IFN for predicting the sensitivity or responsiveness of a test cell may be any of α-type, β-type, γ-type, τ-type, ω-type, λ-type, consensus type or hybrid type, and its origin is natural type, gene set Although it may be either a modified type or a chemically synthesized type, type I IFN is preferable, α type IFN or β type IFN, that is, IFN-α or IFN-β is more preferable, and IFN-β is more preferable. The IFN may be modified with a polymer or the like, for example, PEG-IFN bonded to PEG.
患者にＩＦＮを投与する方法としては、例えば、製剤化したＩＦＮを投与する方法又はＩＦＮ遺伝子を直接患部に投与する方法が挙げられる。 Examples of the method of administering IFN to a patient include a method of administering a formulated IFN or a method of directly administering an IFN gene to an affected area.
また、本発明の被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測するキットは、下記の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかを含むことを特徴としている。
（ｇ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子をＰＣＲで増幅するためのＰＣＲプライマーセット
（ｈ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ
（ｉ） 上記ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
（ｊ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体
The kit for predicting the sensitivity or responsiveness of the test cells of the present invention to IFN includes any of the following (g) to (j).
(G) PCR primer set for amplifying KLF4 gene, HSF2BP gene and / or ANKRD12 gene by PCR (h) Polynucleotide probe hybridizing to KLF4 gene, HSF2BP gene and / or ANKRD12 gene (i) The above polynucleotide probe (J) an antibody that specifically binds to a translation product of the KLF4 gene, the HSF2BP gene and / or the ANKRD12 gene
上記キットは、ＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の診断をするために必要な試薬や器材を含むものである。これらの試薬の中には、各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液なども含まれる。さらに、反応条件を最適化したプロトコルなどを含んでいてもよい。また、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートや蛍光／発光強度の測定に必要な器材等の一式を含んでいるとさらに好ましい。 The kit includes reagents and equipment necessary for diagnosing IFN sensitivity or IFN response. These reagents include various enzymes, buffers, washing solutions, lysis solutions, and the like. Further, a protocol optimized for reaction conditions may be included. Further, it is more preferable to include a set of equipment such as a microtiter plate capable of simultaneous processing of a large number of specimens and measurement of fluorescence / luminescence intensity.
例えば、上記（ｇ）のＰＣＲプライマーセットを含むキットの構成品としては、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出する試薬、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素や試薬、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子を増幅するプライマー、ハウスキーピング遺伝子を増幅するプライマー及びＰＣＲ関連試薬が挙げられる。ＰＣＲを実施するために必要な上記試薬やプライマーは、予めマイクロチューブに添加された状態であってもよく、ＰＣＲのアニーリング及び伸長工程の温度及び反応時間を最適化したプロトコルがキットに含まれていればより好ましい。 For example, the components of the kit including the PCR primer set of (g) above include reagents for extracting RNA (total RNA or mRNA) from cells, reverse transcriptases and reagents for synthesizing cDNA from RNA, KLF4 gene, HSF2BP gene And / or primers that amplify the ANKRD12 gene, primers that amplify the housekeeping gene, and PCR-related reagents. The reagents and primers necessary for carrying out the PCR may be added to the microtube in advance, and the kit includes a protocol that optimizes the temperature and reaction time of the PCR annealing and extension steps. More preferable.
上記（ｈ）のポリヌクレオチドプローブ又は上記（ｉ）のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料を含むキットの構成品としては、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出する試薬、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素や試薬、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ、ハウスキーピング遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズ関連試薬が挙げられる。ポリヌクレオチドプローブは固相化試料に固定された状態で提供されてもよい。 The component of the kit including the polynucleotide probe of (h) or the immobilized sample on which the polynucleotide probe of (i) is immobilized includes a reagent for extracting RNA (total RNA or mRNA) from cells, RNA a reverse transcriptase or reagent that synthesizes cDNA, a polynucleotide probe that specifically hybridizes with the KLF4 gene, HSF2BP gene and / or ANKRD12 gene, a polynucleotide probe that specifically hybridizes with a housekeeping gene, and a hybridization-related reagent Can be mentioned. The polynucleotide probe may be provided in a state of being immobilized on the immobilized sample.
上記（ｊ）の抗体を含むキットの構成品としては、細胞を溶解するＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及び／又はＡＮＫＲＤ１２タンパク質と特異的に結合する抗体及びその関連試薬が挙げられる。ＥＬＩＳＡやＲＩＡのより正確な実施のためには、検量線作成のための標準物質がキットに含まれていればより好ましい。 Examples of the components of the kit containing the antibody (j) include antibodies that specifically bind to Lysis Buffer, KLF4, HSF2BP, and / or ANKRD12 protein that lyse cells, and related reagents. In order to perform ELISA and RIA more accurately, it is more preferable that a standard material for preparing a calibration curve is included in the kit.
また本発明のマーカー遺伝子は、上記の被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法やキットで使用され、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択され、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する用途を提供することを特徴としている。 In addition, the marker gene of the present invention is used in the method or kit for predicting the sensitivity or responsiveness of the test cell to IFN, selected from the group consisting of the KLF4 gene, the HSF2BP gene, and the ANKRD12 gene, and the IFN of the test cell. It is characterized by providing a use for predicting sensitivity or responsiveness to.
ＫＬＦ４遺伝子は、亜鉛フィンガードメインを有する転写因子をコードするＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子であり、塩基配列及びアミノ酸配列の情報はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションＮｏ．ＢＣ０３０８１１）から入手することができる。 The KLF4 gene is a Kruppel-like factor 4 gene that encodes a transcription factor having a zinc finger domain, and information on its nucleotide sequence and amino acid sequence can be obtained from GenBank (Accession No. BC030811).
ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子は、熱ショックタンパク質の発現を制御する転写因子の１つであるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２に結合して相互作用をするＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子であり、塩基配列及びアミノ酸配列の情報はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションＮｏ．ＢＣ０００１５３）から入手することができる。 The HSF2BP gene is a heat shock transcription factor 2 binding protein gene that binds to and interacts with heat shock transcription factor 2, which is one of the transcription factors that control the expression of heat shock proteins. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the HSF2BP gene Information can be obtained from GenBank (Accession No. BC000153).
ＡＮＫＲＤ１２遺伝子は、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｆａｃｔｏｒ ２（ＡＮＣＯ２と略される。）又はＫＩＡＡ０８７４とも呼ばれるＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子であり、塩基配列及びアミノ酸配列の情報はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションＮｏ．ＢＣ０５７２２５）から入手することができる。 The ANKRD12 gene is the Ankyrin repeat-domaining factor 2 (abbreviated as ANCO2) or KIAA0874 gene, which is also referred to as Ankyrin repeat-domaining factor 2, and information on the base sequence and amino acid sequence is obtained from GenBank (Accession No. 25, BC72). Can do.
なお、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子のクローニング及び翻訳産物の調製は、常法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）に記載の分子生物学手法及びそれらを基にした改良法に従って行なうことができる。 In addition, cloning of KLF4 gene, HSF2BP gene and ANKRD12 gene and preparation of translation products are conventional methods, for example, molecular biology methods described in Molecular cloning (J. Sambrook et al., 1989) and improved methods based on them. Can be done according to
（実施例１）ＩＦＮ感受性肝癌細胞及びＩＦＮ非感受性肝癌細胞の同定：
ヒト肝癌由来株化細胞として、ＨｕＨ−７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の６種の細胞を使用した。ＨｕＨ−７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐＧ２細胞はヒューマンサイエンス振興財団から、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞は大日本製薬株式会社から購入した。ＨｕＨ−７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐＧ２細胞は１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞は１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＭＥＭ培地を用いて、Ｈｅｐ３Ｂ細胞は１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡを含むＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下の細胞培養器内で培養した。
(Example 1) Identification of IFN-sensitive liver cancer cells and IFN-insensitive liver cancer cells:
As human hepatoma-derived cell lines, six types of cells were used: HuH-7 cells, PLC / PRF / 5 cells, SK-HEP-1 cells, HLE cells, HepG2 cells, and Hep3B cells. HuH-7 cells, PLC / PRF / 5 cells, HLE cells and HepG2 cells were purchased from the Human Science Foundation, and SK-HEP-1 cells and Hep3B cells were purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. HuH-7 cells, PLC / PRF / 5 cells, HLE cells and HepG2 cells use D-MEM medium containing 10% FBS. SK-HEP-1 cells use 10% FBS, 1% NEAA (non-essential amino acid). Using MEM medium containing 1 mM sodium pyruvate, Hep3B cells were cultured in a cell incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 using MEM medium containing 10% FBS and 1% NEAA.
細胞増殖抑制試験は、以下の手順で実施した。まず、サブコンフルエント状態の細胞をフラスコから剥離し、培養培地で細胞を一定密度となるよう調製した。検量線作成用９６穴プレートには、１００、３００、１０００、３０００、１００００、１５０００ｃｅｌｌｓ／穴となるように、また、評価用９６穴プレートには、細胞を３０００ｃｅｌｌｓ／穴となるように、細胞懸濁液を１００μＬ／穴でそれぞれ播種した。 The cell growth inhibition test was performed according to the following procedure. First, the subconfluent cells were detached from the flask, and the cells were prepared to a constant density using a culture medium. The 96-well plate for preparing a calibration curve has cell suspensions of 100, 300, 1000, 3000, 10000, 15000 cells / hole, and the evaluation 96-well plate has cells of 3000 cells / hole. The suspension was seeded at 100 μL / well.
播種した細胞を一晩培養後、評価用プレートの培養培地を除去し、コントロール用に培養培地１００μＬ／穴を、また、ＩＦＮ処置用に調製したＩＦＮ溶液を１００μＬ／穴で添加した。ＩＦＮ処置後は、評価用プレートを細胞培養器内に入れて培養した。ＩＦＮ溶液は、天然型ＩＦＮ−β製剤であるフエロン（登録商標；東レ株式会社）を培養培地にて濃度範囲１０−１０００００国際単位（以下、ＩＵ）／ｍＬの１０倍希釈系列にて調製した。 After the seeded cells were cultured overnight, the culture medium on the evaluation plate was removed, and 100 μL / well of culture medium was added for control, and IFN solution prepared for IFN treatment was added at 100 μL / well. After the IFN treatment, the evaluation plate was placed in a cell culture vessel and cultured. The IFN solution was prepared by ferrule (registered trademark; Toray Industries, Inc.), a natural type IFN-β preparation, in a culture medium in a 10-fold dilution series having a concentration range of 10-100,000 international units (hereinafter, IU) / mL.
検量線作成用プレートに関しては、播種した細胞を一晩培養後、評価用プレートに関してはＩＦＮ処置した細胞をさらに３日間培養後、細胞増殖抑制試験を行った。各測定ポイントにおいて、プレートの培養培地を除去し、新しい培地を５０μＬ／穴で添加した。その後、ＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；プロメガ株式会社）をプレートの各ウェルに１０μＬ／穴ずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下の細胞培養器内で培養した。各細胞の評価用プレートは１時間後又は３時間後にプレートリーダーで吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。検量線から評価用プレートの各穴の細胞数を算出し、コントロールの細胞数を１００％とした時の、ＩＦＮ処理時の細胞増殖率を濃度別に求め、そのＩＣ３０値（３０％増殖阻害濃度）を算出した。 For the calibration curve preparation plate, the seeded cells were cultured overnight, and for the evaluation plate, IFN-treated cells were further cultured for 3 days, and then a cell proliferation suppression test was performed. At each measurement point, the plate's culture medium was removed and fresh medium was added at 50 μL / well. Thereafter, 10 μL / well of MTS reagent (Cell Titer96 (registered trademark) AQueous One Solution Reagent; Promega Corporation) was added to each well of the plate and cultured in a cell incubator under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . . The plate for evaluation of each cell was measured for absorbance (490 nm) with a plate reader after 1 hour or 3 hours. The number of cells in each hole of the evaluation plate is calculated from the calibration curve, and the cell growth rate at the time of IFN treatment when the number of control cells is 100% is determined for each concentration. The IC 30 value (30% growth inhibitory concentration) ) Was calculated.
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞及びＨｕＨ−７細胞の増殖は、それぞれ１８．７ ＩＵ／ｍＬ及び２９１ ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−β濃度によって３０％抑制されたが、ＨｅｐＧ２細胞のＩＣ３０値はＨｕＨ−７細胞の１０倍以上高い濃度である３９００ ＩＵ／ｍＬであった。ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞においては１００００ ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−β濃度でもほとんどＩＦＮによる細胞増殖抑制作用は認められなかった。これらの結果、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞及びＨｕＨ−７細胞はＩＦＮ感受性肝癌細胞であり、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞はＩＦＮ非感受性肝癌細胞であることが確認された。 The proliferation of PLC / PRF / 5 cells and HuH-7 cells was suppressed by 30% by IFN-β concentrations of 18.7 IU / mL and 291 IU / mL, respectively, whereas the IC 30 value of HepG2 cells was HuH-7. The concentration was 3900 IU / mL, which was 10 times higher than that of cells. In SK-HEP-1 cells, HLE cells, and Hep3B cells, IFN-β concentration of 10,000 IU / mL showed almost no inhibitory effect on cell proliferation by IFN. As a result, it was confirmed that PLC / PRF / 5 cells and HuH-7 cells are IFN-sensitive liver cancer cells, and HepG2 cells, SK-HEP-1 cells, HLE cells, and Hep3B cells are IFN-insensitive liver cancer cells. It was.
（実施例２）ヒト肝癌細胞におけるＫＬＦ４、ＨＳＢＰ２及びＡＮＫＲＤ１２の発現量の解析：
通常の培養条件（ＩＦＮ無刺激）で培養した肝癌細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。細胞（２５ｃｍ２フラスコ）にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン） １．０ｍＬを加え、さらにクロロホルム０．２ｍＬを加え混合、室温で３分間静置したのち、１２０００×ｇ、１５分間遠心した。得られた水相に０．５ｍＬのイソプロパノールを加えて混合、室温で１０分間静置したのち、さらに１２０００×ｇ、１５分間遠心した。上清を除き、沈渣を７０％エタノールで洗浄後、ＤＥＰＣ処理水に溶解し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液を得た。そのＲＮＡ溶液について、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定してｔｏｔａｌ ＲＮＡ量を算出した。続いて、得られたＲＮＡから、常法に従って、ｃＤＮＡ合成を行った。すなわち５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡを、１μＬのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー：Ｒａｎｄｏｍプライマー（５：１）ＤＥＰＣ処理水溶液と混和し、７０℃で５分間加温後、氷上で１０分間冷却した。その後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン）を用いて逆転写を行った。逆転写反応条件は、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間反応後４℃保持とした。このようにして得られたｃＤＮＡを用いて各遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ法にて定量した。
(Example 2) Analysis of expression levels of KLF4, HSBP2 and ANKRD12 in human liver cancer cells:
Total RNA was extracted from hepatoma cells cultured under normal culture conditions (no IFN stimulation). 1.0 mL of TRIzol (registered trademark) Reagent (Invitrogen) was added to the cells (25 cm 2 flask), 0.2 mL of chloroform was further added and mixed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 3 minutes, and then centrifuged at 12000 × g for 15 minutes. The obtained aqueous phase was mixed with 0.5 mL of isopropanol, allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then centrifuged at 12000 × g for 15 minutes. The supernatant was removed, and the precipitate was washed with 70% ethanol and then dissolved in DEPC-treated water to obtain a total RNA solution. About the RNA solution, the light absorbency in wavelength 260nm was measured, and total RNA amount was computed. Subsequently, cDNA synthesis was performed from the obtained RNA according to a conventional method. That is, 5 μg of total RNA was mixed with 1 μL of Oligo (dT) primer: Random primer (5: 1) DEPC-treated aqueous solution, heated at 70 ° C. for 5 minutes, and then cooled on ice for 10 minutes. Thereafter, reverse transcription was performed using Superscript (registered trademark) II reverse transcriptase (Invitrogen). The reverse transcription reaction was performed at 42 ° C. for 50 minutes, at 70 ° C. for 15 minutes, and then kept at 4 ° C. Using the cDNA thus obtained, the expression level of each gene was quantified by a real-time PCR method.
リアルタイムＰＣＲ法による測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標；ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５；ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた。ＰＣＲ増幅産物の検出には二本鎖ＤＮＡに結合することにより蛍光を発する色素であるＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いた（インターカレーター法）。測定にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用い、常法に従って実施した。なお、上記のＰＣＲにおいて、遺伝子の増幅のために用いたプライマーセットは、表１に示す通りである。また、上記ＰＣＲの温度サイクル条件は、９５℃で１０秒、６２℃で１０秒、７２℃で１０秒を１サイクルとし、４０サイクルを実施した。なお、ＰＣＲプログラムはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５を用い設定した。目的遺伝子のｍＲＮＡ発現量解析は、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＤＰＨ）の発現量により標準化し、相対定量した。標準化した発現量比（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は下記式で表される。下記式中の、ＣｔとはＣｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを表す。
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ＝２（Ｃｔ（ＧＡＤＰＨ）−Ｃｔ（Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）
For measurement by the real-time PCR method, LightCycler (registered trademark; LightCycler Software Ver. 3.5; Roche Diagnostics) was used. For detection of the PCR amplification product, SYBR (registered trademark) Green I, which is a dye that emits fluorescence by binding to double-stranded DNA, was used (intercalator method). For the measurement, LightCycler (registered trademark) FastStart DNA Master SYBR Green I was used according to a conventional method. In the above PCR, the primer sets used for gene amplification are as shown in Table 1. The PCR temperature cycle conditions were 95 ° C. for 10 seconds, 62 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 10 seconds, and 40 cycles. Note that the PCR program is LightCycler Software Ver. 3.5 was set. The mRNA expression level analysis of the target gene was standardized by the expression level of the housekeeping gene (GADPH), and relative quantified. The standardized expression ratio (Expression ratio) is expressed by the following equation. In the following formulae, Ct represents cycle threshold.
Expression ratio = 2 (Ct (GADPH) −Ct (Target gene)
（実施例３）ヒト肝癌細胞におけるＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２の発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果の相関及び比較：
実施例２の方法で測定したヒト肝癌細胞のＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ又はＡＮＫＲＤ１２のｍＲＮＡ発現量及び実施例１で測定した肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）との相関を検討した。その結果、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２のｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる増殖抑制効果の相関は、図１〜３に示すように、決定係数（Ｒ２乗値）でそれぞれ０．９１、０．９３及び０．７６であった。なお、図１〜３の縦軸は、ＨｅｐＧ２細胞の該ｍＲＮＡ発現量を１としたときの相対値を表し、横軸はＩＦＮの肝癌細胞増殖抑制効果のＩＣ３０値（ＩＵ／ｍＬ）を表す。
(Example 3) Correlation and comparison of the expression level of KLF4, HSF2BP and ANKRD12 in human liver cancer cells and the liver cancer cell proliferation inhibitory effect by IFN:
The correlation between the mRNA expression level of KLF4, HSF2BP or ANKRD12 in human liver cancer cells measured by the method of Example 2 and the liver cancer cell proliferation inhibitory effect (IC 30 value) measured in Example 1 was examined. As a result, the correlation between the mRNA expression level of KLF4, HSF2BP and ANKRD12 and the growth inhibitory effect by IFN is 0.91, 0.93 and 0. 76. 1-3, the vertical axis represents the relative value when the mRNA expression level of HepG2 cells is 1, and the horizontal axis represents the IC 30 value (IU / mL) of the IFN hepatocarcinoma cell growth inhibitory effect. .
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞をＩＦＮ非感受性細胞群として、ＩＦＮ非感受性細胞群とＩＦＮ感受性細胞であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の各遺伝子の発現量の比較を行ったところ、ＩＦＮ感受性細胞であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞のＫＬＦ４発現量は３．９〜２９．７倍、ＨＳＦ２ＢＰ発現量は２．２〜９．６倍、ＡＮＫＲＤ１２発現量は２．２〜８．２倍であった。さらに、ＩＦＮ非感受性細胞群をＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞及びＨｅｐＧ２細胞として、この細胞間で各遺伝子の発現量の比較を行ったところ、最低発現比の平均値は、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２の遺伝子でそれぞれ０．５６倍、０．５８倍及び０．５８倍であった。 When SK-HEP-1 cells, HLE cells, and Hep3B cells were used as IFN-insensitive cell groups, the expression levels of each gene in IFN-insensitive cell groups and PLC / PRF / 5 cells that were IFN-sensitive cells were compared. PLC / PRF / 5 cells that are IFN-sensitive cells have a KLF4 expression level of 3.9 to 29.7 times, an HSF2BP expression level of 2.2 to 9.6 times, and an ANKRD12 expression level of 2.2 to 8.2 times Met. Furthermore, when the expression level of each gene was compared between the IFN-insensitive cell groups as SK-HEP-1 cells, HLE cells, Hep3B cells, and HepG2 cells, the average value of the minimum expression ratio was KLF4. , HSF2BP and ANKRD12 genes were 0.56 times, 0.58 times and 0.58 times, respectively.
（実施例４）ヒト肝癌細胞におけるその他の遺伝子の発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果の相関：
実施例２の方法でリアルタイムＰＣＲにおいて、プライマーセットを変えて、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２以外の目的遺伝子２０種類の遺伝子（ＨＡＳ２、ＳＤＣ、ＴＧＦＢＲ３などを含む）の発現量をＧＡＤＰＨの発現量で標準化し相対定量した。測定したヒト肝癌細胞における２０種類の遺伝子の発現量及び、実施例１で測定した肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）との相関を検討した結果、いずれもｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる増殖抑制効果の相関は認められなかった。
(Example 4) Correlation between the expression level of other genes in human hepatoma cells and the effect of inhibiting the proliferation of hepatoma cells by IFN:
In real-time PCR by the method of Example 2, the expression level of 20 types of genes (including HAS2, SDC, TGFBR3, etc.) other than KLF4, HSF2BP, and ANKRD12 is standardized by changing the primer set and the expression level of GADPH. Relative quantification was performed. As a result of examining the correlation between the expression levels of 20 kinds of genes in the measured human hepatoma cells and the liver cancer cell proliferation inhibitory effect (IC 30 value) measured in Example 1, both of them showed the mRNA expression level and the growth inhibitory effect by IFN. No correlation was found.
本発明は、医薬医療分野において、患者又は被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性の予測に用いることができる。 The present invention can be used for predicting the sensitivity or responsiveness of a patient or a test cell to IFN in the pharmaceutical medical field.
Claims (7)
ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と前記被検細胞とにおける、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及びＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、
前記被検細胞における前記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と、前記対照細胞における前記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである場合に、前記被検細胞はインターフェロン非感受性又はインターフェロン非応答性の細胞であると予測し、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである場合に、前記被検細胞はインターフェロン感受性又はインターフェロン応答性の細胞であると予測する予測ステップと、
を備える、方法。
（ａ） 前記被検細胞におけるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｂ） 前記被検細胞におけるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｃ） 前記被検細胞におけるＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｄ） 前記被検細胞におけるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して４倍以上である場合
（ｅ） 前記被検細胞におけるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（ｆ） 前記被検細胞におけるＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合 A method for predicting the sensitivity or responsiveness of a test cell to interferon, comprising:
Kruppel-like factor 4 gene, Heat shock transcription factor 2-binding protein in any of the control cells selected from the group consisting of HepG2 cells, SK-HEP-1 cells, HLE cells and Hep3B cells and the test cells. A measurement step of measuring the expression level of a marker gene selected from the group consisting of a gene and an Ankyrin repeat domain 12 gene or a translation product thereof;
A comparison step of comparing the expression level of the marker gene or its translation product in the test cell with the expression level of the marker gene or its translation product in the control cell, respectively.
When any of the following (a) to (c), the test cell is predicted to be an interferon-insensitive or non-interferon-responsive cell, and any of the following (d) to (f) Predicting that the test cell is an interferon-sensitive or interferon-responsive cell;
A method comprising:
(A) When the expression level of the Kruppel-like factor 4 gene or its translation product in the test cell is 0.5 times or less compared to the expression level in the control cell (b) Heat in the test cell When the expression level of the shock transcription factor 2-binding protein gene or its translation product is 0.5 times or less compared to the expression level in the control cell (c) the Ankyrin repeat domain 12 gene or its gene in the test cell When the expression level of the translation product is 0.5 times or less compared to the expression level in the control cell (d) The expression level of the Kruppel-like factor 4 gene or its translation product in the test cell is Compared to the expression level in cells When it is 4 times or more (e) When the expression level of the heat shock transcription factor 2-binding protein gene or its translation product in the test cell is 2 times or more compared to the expression level in the control cell (f ) When the expression level of the Ankyrin repeat domain 12 gene or its translation product in the test cell is twice or more compared to the expression level in the control cell
（ｇ） Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及び／又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子をＰＣＲで増幅するためのＰＣＲプライマーセット
（ｈ） Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及び／又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ
（ｉ） 前記ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
（ｊ） Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及び／又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体 A kit for predicting the sensitivity or responsiveness of a test cell to interferon, comprising any of the following (g) to (j).
(G) PCR primer set for amplification of Kruppel-like factor 4 gene, Heat shock transcription factor 2-binding protein gene and / or Ankyrin repeat domein 12 gene by PCR (h) a polynucleotide probe that hybridizes to the factor 2-binding protein gene and / or the Ankyrin repeat domain 12 gene (i) a solid-phased sample on which the polynucleotide probe is immobilized (j) a Kruppel-like factor 4 gene, a heat shock transcription molecule An antibody that specifically binds to the translation product of the n factor 2-binding protein gene and / or the Ankyrin repeat domain 12 gene
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|---|---|---|---|---|
| CN111562394A (en) * | 2020-06-02 | 2020-08-21 | 西安交通大学医学院第一附属医院 | Application of heat shock factor 2binding protein in liver ischemia reperfusion injury and drug-induced liver injury |
| JP2021048854A (en) * | 2015-03-31 | 2021-04-01 | イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー | Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carcinoma (rcc) and other cancers |
-
2010
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021048854A (en) * | 2015-03-31 | 2021-04-01 | イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー | Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carcinoma (rcc) and other cancers |
| CN111562394A (en) * | 2020-06-02 | 2020-08-21 | 西安交通大学医学院第一附属医院 | Application of heat shock factor 2binding protein in liver ischemia reperfusion injury and drug-induced liver injury |
| WO2021244010A1 (en) * | 2020-06-02 | 2021-12-09 | 西安交通大学医学院第一附属医院 | Use of heat shock factor 2 binding protein in liver ischemia reperfusion injuries and drug-induced liver injuries |
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