JP2011205992A - β-GLUCOSIDASE INCREASING ACTIVITY IN PRESENCE OF GLUCOSE - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高濃度のグルコース存在下で活性を保持及び／又は増加するβ-グルコシダーゼ及び該β-グルコシダーゼを用いたセルロースの糖化方法に関する。 The present invention relates to β-glucosidase that retains and / or increases its activity in the presence of a high concentration of glucose and a method for saccharifying cellulose using the β-glucosidase.
植物の光合成によって生産されるセルロース及びヘミセルロースは、地上で最も豊富なバイオマスである。化石燃料等の非再生可能資源の限界が懸念される中で、セルロースやヘミセルロースは、人口増大による食糧、飼料及び燃料不足を解決し得る再生可能資源として期待されている。しかし、セルロースやヘミセルロースは、化学的に非常に安定であるため、食糧やバイオエタノールの原料となる単糖にまで糖化することは技術やコストの面で容易ではなく、エネルギー資源としての実用化に向けて解決すべき課題は多い。 Cellulose and hemicellulose produced by plant photosynthesis are the most abundant biomass on the ground. In the midst of concerns about the limitations of non-renewable resources such as fossil fuels, cellulose and hemicellulose are expected as renewable resources that can solve food, feed and fuel shortages due to population growth. However, since cellulose and hemicellulose are chemically very stable, saccharification to monosaccharides, which are the raw materials for food and bioethanol, is not easy in terms of technology and cost, and is practical for use as an energy resource. There are many issues to be solved.
一般にセルロースは、セルラーゼを合成できる微生物（細菌、真菌、粘菌、原生動物、昆虫等）によって分解される(非特許文献１)。セルラーゼは、セルロースのβ-1,4-グルカン又はβ D-グルコシド結合を加水分解して、セロオリゴ糖、セロビオース及びβ-D-グルコースを生成する酵素の総称であり、その作用形式により３つの型に大別されている。すなわち、エンドグルカナーゼ（EG；EC3.2.1.4）、エキソグルカナーゼ（セロビオハイドラーゼ；CBH；EC3.2.1.91）、及びβ-グルコシダーゼ（β-D-グルコシドグルハイドラーゼ；BG；EC3.2.1.21)（非特許文献２）である。エンドグルカナーゼは、主としてセルロース繊維の非結晶部分に作用してセルロース糖鎖の内部を切断する（非特許文献３）。また、エキソグルカナーゼは、結晶性セルロースに作用してセルロース糖鎖の末端を分解し、セロビオースを産生する(非特許文献４)。一方、β-グルコシダーゼは、エンドグルカナーゼ及び／又はエキソグルカナーゼの作用によって生じたセロビオース及び／又はセロオリゴ糖等から最終産物であるβ-D-グルコースを遊離させる働きをもつ（非特許文献５）。したがって、セルロースの糖化には、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ及びβ-グルコシダーゼの３つの酵素の存在とそれらの効率的な活性が必要となる。 In general, cellulose is degraded by microorganisms (such as bacteria, fungi, slime molds, protozoa, and insects) that can synthesize cellulase (Non-patent Document 1). Cellulase is a generic term for enzymes that hydrolyze β-1,4-glucan or β D-glucoside bonds of cellulose to produce cellooligosaccharides, cellobiose, and β-D-glucose. It is divided roughly. That is, endoglucanase (EG; EC3.2.1.4), exoglucanase (cellobiohydrase; CBH; EC3.2.1.91), and β-glucosidase (β-D-glucoside gluhydrase; BG; EC3.2.1 .21) (Non-Patent Document 2). Endoglucanase mainly acts on the non-crystalline part of the cellulose fiber to cut the inside of the cellulose sugar chain (Non-patent Document 3). Exoglucanase acts on crystalline cellulose to degrade the terminal ends of cellulose sugar chains and produce cellobiose (Non-patent Document 4). On the other hand, β-glucosidase has a function of releasing β-D-glucose, which is the final product, from cellobiose and / or cellooligosaccharide produced by the action of endoglucanase and / or exoglucanase (Non-patent Document 5). Therefore, the saccharification of cellulose requires the presence of three enzymes, endoglucanase, exoglucanase and β-glucosidase, and their efficient activities.
ところが、公知のβ-グルコシダーゼの多くは、1〜10mM程度の低濃度のグルコース存在下でその活性が阻害されるという性質をもつ。つまり、多くのβ-グルコシダーゼは、自身の活性によって生じるβ-D-グルコースの増加に伴い、その活性が低下してしまう。この性質は、セルラーゼによるセルロース分解反応系において、セロビオースの蓄積をもたらす原因となる。また、蓄積したセロビオースは、エキソグルカナーゼの活性を阻害するため、セルロース分解反応の更なる停滞を引き起こす。それ故、セルラーゼをグルコースへと完全に糖化するためには、グルコースによる活性阻害を受けないβ-グルコシダーゼの開発が必要であった。 However, many known β-glucosidases have the property that their activity is inhibited in the presence of glucose at a low concentration of about 1 to 10 mM. That is, the activity of many β-glucosidases decreases with an increase in β-D-glucose caused by its own activity. This property is a cause of cellobiose accumulation in a cellulose degradation reaction system using cellulase. In addition, the accumulated cellobiose inhibits the activity of exoglucanase, thus causing further stagnation of the cellulose degradation reaction. Therefore, in order to completely saccharify cellulase into glucose, it was necessary to develop β-glucosidase that is not subject to activity inhibition by glucose.
本発明の課題は、高濃度のグルコース存在下であっても、グルコースによる阻害作用を受けることなく酵素活性を保持することのできるβ‐グルコシダーゼを単離し、それを提供することである。 An object of the present invention is to isolate and provide β-glucosidase capable of retaining enzyme activity without being inhibited by glucose even in the presence of a high concentration of glucose.
また、本発明の課題は、前記グルコース耐性を有するβ‐グルコシダーゼ若しくはその活性ポリペプチド断片又はそれらをコードする核酸を導入した形質転換体若しくはその後代を用いて、セルロースを効率的に糖化する方法を開発し、それを提供することである。 Another object of the present invention is to provide a method for efficiently saccharifying cellulose using the above-mentioned β-glucosidase having glucose tolerance or an active polypeptide fragment thereof, or a transformant into which a nucleic acid encoding them is introduced, or a progeny thereof. Develop and deliver it.
前記課題を解決するために、本発明者は、メタゲノム解析法によって高濃度グルコースに対する酵素活性阻害耐性を有するβ‐グルコシダーゼのスクリーニングを行った。その結果、1Mという非常に高濃度なグルコース存在下であってもその酵素活性がグルコース非存在下における活性と比較して低減しないばかりか、逆にグルコースの存在によって活性が増大するという従来知られていなかった性質を有する全く新規β‐グルコシダーゼを堆肥から単離することに成功した。本発明は、上記知見に基づいて成されたものであり、すなわち以下を提供する。 In order to solve the above problems, the present inventor screened β-glucosidase having enzyme activity inhibition resistance against high concentrations of glucose by a metagenomic analysis method. As a result, even in the presence of a very high concentration of 1M glucose, the enzyme activity is not only reduced compared to the activity in the absence of glucose, but conversely the activity is increased by the presence of glucose. A completely new β-glucosidase with the properties that had not been successfully isolated from compost. The present invention has been made on the basis of the above findings, that is, provides the following.
（１）SDS-PAGEにおいて45〜55キロダルトンの分子量を示し、500mMよりも多く1M以下のグルコース存在下における酵素活性がグルコース非存在下における酵素活性に対して100％以上の相対活性を有するβ‐グルコシダーゼ。
（２）500mM以下のグルコース存在下における酵素活性がグルコース非存在下における酵素活性に対して100％以上の相対活性を有する、（１）に記載のβ‐グルコシダーゼ。
（３）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドからなる、（１）又は（２）に記載のβ‐グルコシダーゼ
（ａ）配列番号１〜５で示されるいずれか一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１〜５で示されるいずれか一のアミノ酸配列と少なくとも50%以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、又は
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたポリペプチド
（４）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる、前記（３）（ｂ）に記載のβ‐グルコシダーゼ。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のβ‐グルコシダーゼを構成するアミノ酸配列の一部を含み、かつその酵素活性を保持するポリペプチド断片。
（６）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のβ‐グルコシダーゼ又は前記（５）に記載のポリペプチド断片をコードする核酸。
(1) β-shows a molecular weight of 45 to 55 kilodaltons on SDS-PAGE, and the enzyme activity in the presence of glucose of more than 500 mM and less than 1 M has a relative activity of 100% or more relative to the enzyme activity in the absence of glucose. -Glucosidase.
(2) The β-glucosidase according to (1), wherein the enzyme activity in the presence of 500 mM or less of glucose has a relative activity of 100% or more with respect to the enzyme activity in the absence of glucose.
(3) β-glucosidase according to (1) or (2), comprising the polypeptide according to any one of the following (a) to (c): (a) any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 A polypeptide comprising the amino acid sequence of
(B) a polypeptide having at least 50% or more amino acid identity with any one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 5, or (c) an amino acid of the polypeptide according to (a) or (b) above A polypeptide in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the sequence (4) β-glucosidase according to (3) (b), comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 .
(5) A polypeptide fragment containing a part of the amino acid sequence constituting the β-glucosidase according to any one of (1) to (4) and retaining the enzyme activity.
(6) A nucleic acid encoding the β-glucosidase according to any one of (1) to (4) or the polypeptide fragment according to (5).
（７）前記（６）に記載の核酸を発現可能な状態で含む発現ベクター。
（８）前記（７）に記載の発現ベクターを宿主に導入した形質転換体又はその後代。
（９）前記（８）に記載の形質転換体又はその後代に発現誘導処理を行い、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のβ‐グルコシダーゼ又は前記（５）に記載のポリペプチド断片を製造する方法。
（１０）前記（１）〜（４）に記載のβ‐グルコシダーゼの少なくとも一つ、前記（５）に記載のポリペプチド断片の少なくとも一つ、好熱菌メイオサーマス ルバー（Meiothermus ruber）、及び／又は前記（８）に記載の形質転換体又はその後代を用いてセロビオース及び／又はセロオリゴ糖を加水分解する工程を含む、セルロース及び／又はヘミセルロースの糖化方法。
（１１）前記（１０）に記載の方法を用いた、セルロースからβ-D-グルコースを製造する方法。
(7) An expression vector containing the nucleic acid according to (6) in a state capable of being expressed.
(8) A transformant or a progeny thereof obtained by introducing the expression vector according to (7) above into a host.
(9) The transformant according to (8) or a progeny thereof is subjected to expression induction treatment, and β-glucosidase according to any of (1) to (4) or the polypeptide according to (5) A method for producing fragments.
(10) at least one of the β-glucosidases according to (1) to (4) above, at least one of the polypeptide fragments according to (5) above, a thermophile Meiothermus ruber, and / or A method for saccharifying cellulose and / or hemicellulose, comprising a step of hydrolyzing cellobiose and / or cellooligosaccharide using the transformant according to (8) or a progeny thereof.
(11) A method for producing β-D-glucose from cellulose using the method described in (10) above.
本発明のβ‐グルコシダーゼ又はそのポリペプチド断片によれば、1Mのグルコース存在下であっても、p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（以下、本明細書においては「pNPG」とする）、セロビオース及び／又はセロオリゴ糖をグルコース非存在下の活性に対して100％以上の相対活性で加水分解することができる。 According to β-glucosidase of the present invention or a polypeptide fragment thereof, even in the presence of 1M glucose, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (hereinafter referred to as “pNPG” in the present specification), Cellobiose and / or cellooligosaccharides can be hydrolyzed with a relative activity of 100% or more relative to the activity in the absence of glucose.
本発明の糖化方法によれば、1Mのグルコース存在下であってもpNPG、セルロース及び／又はヘミセルロースを効率的に糖化し、β-D-グルコースを得ることができる。 According to the saccharification method of the present invention, β-D-glucose can be obtained by efficiently saccharifying pNPG, cellulose and / or hemicellulose even in the presence of 1 M glucose.
１．β‐グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片
本発明の第１の実施形態は、β‐グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片である。
1. β-Glucosidase or an active polypeptide fragment thereof The first embodiment of the present invention is β-glucosidase or an active polypeptide fragment thereof.
１−１．β‐グルコシダーゼの特徴
本発明のβ‐グルコシダーゼは、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す物理的及び化学的性質を有する。
1-1. Characteristics of β-Glucosidase The β-glucosidase of the present invention has physical and chemical properties shown in the following (a) to (c).
（ａ）分子量
本発明のβ‐グルコシダーゼは、SDS-PAGE（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動）において、分子量マーカーとの相対的位置で45〜55キロダルトン（kDa）の分子量を示す。具体的には、例えば、形質転換体Td-2F2由来の配列番号１のアミノ酸配列を含むβ‐グルコシダーゼ（以下「2F2-β-Glu」とする）であれば約51.5kDaの分子量を、形質転換体Td-2H7由来の配列番号２のアミノ酸配列を含むβ‐グルコシダーゼ（以下「2H7-β-Glu」とする）であれば約54.0kDaの分子量を、形質転換体Td-4E5由来の配列番号３のアミノ酸配列を含むβ‐グルコシダーゼ（以下「4E5-β-Glu」とする）であれば約53.0kDaの分子量を、形質転換体Td-3A5由来の配列番号４のアミノ酸配列を含むβ‐グルコシダーゼ（以下「3A5-β-Glu」とする）であれば約50.6kDaの分子量を、形質転換体Td-2E3由来の配列番号５のアミノ酸配列を含むβ‐グルコシダーゼ（以下「2E3-β-Glu」とする）であれば約51.4kDaの分子量を、そして好熱菌Meiothermus ruber由来の配列番号６のアミノ酸配列を含むβ‐グルコシダーゼ（以下「Mru-β-Glu」とする）であれば約52.5kDaの分子量を示す。
(A) Molecular Weight The β-glucosidase of the present invention exhibits a molecular weight of 45 to 55 kilodalton (kDa) relative to the molecular weight marker in SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis). Specifically, for example, in the case of β-glucosidase (hereinafter referred to as “2F2-β-Glu”) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 derived from the transformant Td-2F2, the molecular weight of about 51.5 kDa is transformed. In the case of β-glucosidase (hereinafter referred to as “2H7-β-Glu”) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 derived from the Td-2H7 body, the molecular weight of about 54.0 kDa is determined as SEQ ID NO: 3 derived from the transformant Td-4E5. Β-glucosidase (hereinafter referred to as “4E5-β-Glu”) having a molecular weight of about 53.0 kDa, β-glucosidase containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 derived from transformant Td-3A5 ( (Hereinafter referred to as “3A5-β-Glu”), the molecular weight of about 50.6 kDa was changed to β-glucosidase (hereinafter referred to as “2E3-β-Glu”) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 derived from the transformant Td-2E3. The molecular weight of about 51.4 kDa, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 from the thermophilic bacterium Meiothermus ruber Β-glucosidase (hereinafter referred to as “Mru-β-Glu”) containing about 52.5 kDa.
（ｂ）活性基質特異性
本発明のβ‐グルコシダーゼは、pNPG及びセロビオース及びセロオリゴ等（例えば、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース等）を基質として、それらを加水分解することができる。特にセロビース又はセロオリゴ糖に対して、pNPG以上に高い加水分解活性を有する。
(B) Specificity of Active Substrate The β-glucosidase of the present invention can hydrolyze them using pNPG, cellobiose, celloligo and the like (for example, cellotriose, cellotetraose, cellopentaose, etc.) as a substrate. In particular, it has a hydrolytic activity higher than that of pNPG with respect to serobius or cellooligosaccharide.
（ｃ）グルコース耐性
本発明のβ‐グルコシダーゼは、高濃度のグルコースに対して高い活性阻害耐性を有し、基質を含む反応溶液中のグルコース濃度が100ｍM〜1Mの高濃度状態であっても基質をグルコース非存在下のときの活性に対して100％以上の相対活性で加水分解することができる。さらに、本発明のβ‐グルコシダーゼは、グルコース存在下で活性を増大する性質を有する。すなわち、本発明のβ‐グルコシダーゼにおいて、少なくとも1M以下のグルコースは、本酵素の活性阻害物質ではなく、活性促進物質として作用し得る。
(C) Glucose tolerance The β-glucosidase of the present invention has a high activity inhibition resistance against a high concentration of glucose, and is a substrate even if the glucose concentration in the reaction solution containing the substrate is in a high concentration state of 100 mM to 1 M. Can be hydrolyzed with a relative activity of 100% or more relative to the activity in the absence of glucose. Furthermore, the β-glucosidase of the present invention has the property of increasing the activity in the presence of glucose. That is, in the β-glucosidase of the present invention, at least 1 M or less of glucose can act as an activity promoting substance rather than an activity inhibiting substance of the present enzyme.
さらに本発明のβ−グルコシダーゼは、以下の（ｄ）〜（e）に示す一以上の化学的性質を有することができる。 Furthermore, the β-glucosidase of the present invention can have one or more chemical properties shown in the following (d) to (e).
（ｄ）至適pH
本発明のβ‐グルコシダーゼのpHに対する酵素活性に関しては、30℃において、最高活性値を100％としたときにpH3.5〜pH7.5の酸性〜弱アルカリ性領域で70％以上の高い活性を示す。例えば、2F2-β-GluであればpH4.5〜pH6.5、Mru-β-GluであればpH5.0〜pH6.5、2H7-β-GluであればpH4.0〜pH6.0、4E5-β-GluであればpH4.5〜pH6.0、3A5-β-GluであればpH5.5〜pH7.5、そして2E3-β-GluであればpH3.5〜pH6.0の範囲で70％以上の活性を示す。
(D) Optimum pH
Regarding the enzyme activity against pH of the β-glucosidase of the present invention, at 30 ° C., when the maximum activity value is 100%, it exhibits a high activity of 70% or more in an acidic to weakly alkaline region of pH 3.5 to pH 7.5. . For example, pH 4.5 to pH 6.5 for 2F2-β-Glu, pH 5.0 to pH 6.5 for Mru-β-Glu, pH 4.0 to pH 6.0 for 2H7-β-Glu, 4E5-β-Glu pH 4.5-pH 6.0, 3A5-β-Glu pH 5.5-pH 7.5, and 2E3-β-Glu pH 3.5-pH 6.0 Shows an activity of 70% or more.
さらに、本発明のβ‐グルコシダーゼのpHに対する安定性に関しては、30℃において、pH4.0〜pH8.5の範囲内で90％以上の活性を示す。例えば、pH8.5の活性を100％としたときに、2F2-β-GluであればpH4.0〜pH8.5の範囲で、Mru-β-GluであればpH7.0〜pH8.5の範囲で、2H7-β-GluであればpH4.0〜pH8.5の範囲で、4E5-β-GluであればpH7.0〜pH8.5の範囲で、3A5-β-GluであればpH5.5〜pH8.5の範囲で、そして2E3-β-GluであればpH5.0〜pH8.5の範囲で90％以上の活性を示す。
Furthermore, regarding the stability with respect to pH of the β-glucosidase of the present invention, it exhibits an activity of 90% or more at 30 ° C. within the range of pH 4.0 to pH 8.5. For example, assuming that the activity at pH 8.5 is 100%, 2F2-β-Glu has a pH range of 4.0 to 8.5, and Mru-β-Glu has a pH of 7.0 to 8.5. 2H7-β-Glu, pH 4.0 to pH 8.5, 4E5-β-Glu, pH 7.0 to pH 8.5, 3A5-β-Glu,
（ｅ）至適温度
本発明のβ‐グルコシダーゼの温度に対する活性に関しては、pH4.5〜pH 6.5の範囲において、最高活性値を100％としたときに30℃〜70℃の範囲で80％以上の高い活性を示す。例えば、2F2-β-GluであればpH5.5において70℃〜75℃の範囲で、Mru-β-GluであればpH5.5において50℃〜70℃の範囲で、2H7-β-GluであればpH4.5において50℃〜65℃の範囲で、4E5-β-GluであればpH5.0において45℃〜60℃の範囲で、3A5-β-GluであればpH6.5において30℃〜60℃の範囲で、及び2E3-β-GluであればpH5.0において40℃〜65℃の範囲で70％以上の活性を示す。
(E) Optimal temperature Regarding the activity of the β-glucosidase of the present invention with respect to the temperature, in the range of pH 4.5 to pH 6.5, 80% or more in the range of 30 ° C. to 70 ° C. when the maximum activity value is 100%. High activity. For example, 2F2-β-Glu is in the range of 70 ° C. to 75 ° C. at pH 5.5, and Mru-β-Glu is in the range of 50 ° C. to 70 ° C. at pH 5.5 in 2H7-β-Glu. If there is a pH range of 4.5 to 50 ° C, 4E5-β-Glu at a pH of 5.0 to 45 ° C to 60 ° C, and 3A5-β-Glu to a pH 6.5 of 30 ° C In the range of ˜60 ° C. and 2E3-β-Glu, 70% or more activity is exhibited in the range of 40 ° C. to 65 ° C. at pH 5.0.
さらに、本発明のβ‐グルコシダーゼの温度に対する安定性に関しては、20℃における活性値を100％としたときに、20℃〜70℃の範囲で80％以上の活性を示す。具体的には、例えば、2F2-β-GluであればpH5.5において20℃〜65℃の範囲で、Mru-β-GluであればpH5.5において20℃〜65℃の範囲で、2H7-β-GluであればpH4.5において20℃〜65℃の範囲で、4E5-β-GluであればpH5.0において20℃〜70℃の範囲で、3A5-β-GluであればpH6.5において20℃〜50℃の範囲で、及び2E3-β-GluであればpH5.0において20℃〜55℃の範囲で80％以上の活性を示す。
Furthermore, regarding the stability with respect to the temperature of the β-glucosidase of the present invention, when the activity value at 20 ° C. is 100%, the activity is 80% or more in the range of 20 ° C. to 70 ° C. Specifically, for example, 2F2-β-Glu is in the range of 20 ° C. to 65 ° C. at pH 5.5, and Mru-β-Glu is in the range of 20 ° C. to 65 ° C. at pH 5.5, 2H7 -β-Glu at 20 ° C to 65 ° C at pH 4.5, 4E5-β-Glu at 20 ° C to 70 ° C at pH 5.0, 3A5-β-Glu at
本発明のβ‐グルコシダーゼは、前記物理的性質及び化学的性質を有するポリペプチドであれば、それが由来する生物種は問わない。例えば、細菌（例えば、アクチノマイセス類）、真菌（例えば、酵母、糸状菌）、粘菌、原生動物、又は昆虫（例えば、シロアリ、ゴキブリ）等のいずれの由来であってもよい。 As long as the β-glucosidase of the present invention is a polypeptide having the above physical properties and chemical properties, the biological species from which it is derived does not matter. For example, any origin such as bacteria (for example, Actinomyces), fungi (for example, yeast, filamentous fungus), slime mold, protozoa, or insect (for example, termite, cockroach) may be used.
本発明のβ‐グルコシダーゼの具体例として、配列番号１〜５のいずれか一で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は配列番号１〜５のいずれか一で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加され、かつ前記物理的性質及び化学的性質を有するポリペプチドが挙げられる。ここで「数個」とは、２〜５個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２〜３個又は２個の整数をいう。前記置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、配列番号１〜５のいずれか一で示されるβ‐グルコシダーゼと実質的に同等な構造又は性質を有し得るからである。保存的アミノ酸置換とは、同一の保存的アミノ酸群に属するアミノ酸間の置換をいう。保存的アミノ酸群には、非極性アミノ酸群（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファンが属する）及び極性アミノ酸群（非極性アミノ酸以外のアミノ酸が属する）、荷電アミノ酸群（酸性アミノ酸群（アスパラギン酸、グルタミン酸が属する）及び塩基性アミノ酸群（アルギニン、ヒスチジン、リジンが属する）及び非荷電アミノ酸群（荷電アミノ酸以外のアミノ酸が属する）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンが属する）、分岐状アミノ酸群（ロイシン、イソロイシン、バリンが属する）、並びに脂肪族アミノ酸群（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンが属する）等が知られている。 As a specific example of β-glucosidase of the present invention, 1 to several polypeptides comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 or the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 And polypeptides having the above physical and chemical properties. Here, “several” means an integer of 2 to 5, preferably 2 to 4, more preferably 2 to 3 or 2. The substitution is preferably a conservative amino acid substitution. This is because a conservative amino acid substitution can have a structure or property substantially equivalent to β-glucosidase represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 5. A conservative amino acid substitution refers to a substitution between amino acids belonging to the same conservative amino acid group. Conservative amino acids include nonpolar amino acids (glycine, alanine, phenylalanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, tryptophan) and polar amino acids (amino acids other than nonpolar amino acids), charged amino acids (Acidic amino acid group (aspartic acid, glutamic acid belongs), basic amino acid group (arginine, histidine, lysine belongs) and uncharged amino acid group (amino acids other than charged amino acid belong), aromatic amino acid group (phenylalanine, tryptophan, Tyrosine belongs), branched amino acid group (leucine, isoleucine, valine belongs), aliphatic amino acid group (glycine, alanine, leucine, isoleucine, valine belong) and the like are known.
また、β‐グルコシダーゼは、配列番号１〜５のいずれか一で示されるアミノ酸配列と50％以上、好ましくは55％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の同一性を有し、かつ前記物理的性質及び化学的性質を有するポリペプチドであってもよい。このようなポリペプチドとしては、例えば、β‐グルコシダーゼホモログ（オルソログ及びパラログを含む）やβ‐グルコシダーゼ変異体が挙げられる。一具体例としては、配列番号１で示される2F2-β-Gluのアミノ酸配列と約60％のアミノ酸同一性を有する好熱菌Meiothermus ruberのホモログ（オルソログ）であって、配列番号６のアミノ酸配列を含むMru-β-Gluが挙げられる。ここで「同一性」とは、二つのアミノ酸配列にギャップを導入して、又は導入しないで、最も高い一致度となるように整列（アラインメント）させたときに、前記ギャップの数を含めた、一方のアミノ酸配列の全アミノ酸残基数に対する他方のアミノ酸配列の同一アミノ酸残基数の割合（％）をいう。このような同一性を有するポリペプチドは、例えば、配列番号１〜５のいずれか一で示されるβ‐グルコシダーゼアミノ酸配列をクエリーとして、ゲノムデータベース等をBLAST検索等を用いて検索することによって得ることができる。 In addition, β-glucosidase is 50% or more, preferably 55% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 5. The polypeptide having the identity of 98% or more or 99% or more and having the physical property and the chemical property may be used. Examples of such polypeptides include β-glucosidase homologs (including orthologs and paralogs) and β-glucosidase mutants. As a specific example, a homologue (ortholog) of a thermophilic bacterium Meiothermus ruber having about 60% amino acid identity with the amino acid sequence of 2F2-β-Glu represented by SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 Mru-β-Glu containing Here, the “identity” includes the number of gaps when aligned (aligned) with the highest degree of matching with or without introducing gaps between two amino acid sequences. The ratio (%) of the number of identical amino acid residues of the other amino acid sequence to the total number of amino acid residues of one amino acid sequence. A polypeptide having such identity can be obtained, for example, by searching a genomic database or the like using a BLAST search or the like using the β-glucosidase amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 as a query. Can do.
本発明のβ‐グルコシダーゼを構成するアミノ酸は、修飾されていてもよい。ここでいう「修飾」とは、例えば、本発明のβ‐グルコシダーゼがその活性を有する上で必要な機能上の修飾（例えば、グリコシル化のような糖鎖の付加）及び／又は本発明のβ‐グルコシダーゼを検出する上で必要な標識修飾のいずれも含む。標識には、例えば、蛍光色素（FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン）による標識が挙げられる。 The amino acid constituting the β-glucosidase of the present invention may be modified. The term “modification” as used herein means, for example, functional modifications necessary for the activity of the β-glucosidase of the present invention (for example, addition of a sugar chain such as glycosylation) and / or β of the present invention. -Includes any of the label modifications necessary to detect glucosidase. Examples of the label include a label with a fluorescent dye (FITC, rhodamine, Texas red, Cy3, Cy5), an enzyme (for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase), or biotin or (strept) avidin).
また、本発明の、βグルコシダーゼは必要に応じて、シグナルペプチドや標識ペプチドのような他の生物種由来のアミノ酸配列又はタグアミノ酸配列のような人工的アミノ酸配列と連結することができる。 In addition, the β-glucosidase of the present invention can be linked to an artificial amino acid sequence such as an amino acid sequence derived from another biological species such as a signal peptide or a labeled peptide or a tag amino acid sequence, if necessary.
１−２．活性ポリペプチド断片
本明細書において「活性ポリペプチド断片」とは、前記本発明のβ‐グルコシダーゼのアミノ酸配列の一部を含み、かつその酵素活性を有するポリペプチド断片をいう。本活性ポリペプチド断片のアミノ酸配列の長さは、本発明のβ‐グルコシダーゼの活性及びその化学的性質を有していれば特に限定はしない。具体的には、例えば、2H7-β-Gluであれば、配列番号１においてシグナル配列を除いたN末端から30番目〜C末端までのアミノ酸領域を含む断片が、本発明のβ‐グルコシダーゼの活性を有する断片として挙げられる。
1-2. Active polypeptide fragment In the present specification, the “active polypeptide fragment” refers to a polypeptide fragment that includes a part of the amino acid sequence of the β-glucosidase of the present invention and has the enzyme activity. The length of the amino acid sequence of the active polypeptide fragment is not particularly limited as long as it has the activity and chemical properties of the β-glucosidase of the present invention. Specifically, for example, in the case of 2H7-β-Glu, the fragment containing the amino acid region from the N-terminal to the 30th to C-terminal excluding the signal sequence in SEQ ID NO: 1 is the activity of the β-glucosidase of the present invention. As a fragment having
本発明の活性ポリペプチド断片も前記β‐グルコシダーゼと同様に、構成するアミノ酸が修飾されていてもよく、また、必要に応じて、シグナルペプチドや標識ペプチドのような他の生物種由来のアミノ酸配列又はタグアミノ酸配列のような人工的アミノ酸配列と連結することができる。 Similarly to the β-glucosidase, the active polypeptide fragment of the present invention may be modified in the constituent amino acids, and if necessary, an amino acid sequence derived from another species such as a signal peptide or a labeled peptide. Alternatively, it can be linked to an artificial amino acid sequence such as a tag amino acid sequence.
１−３．効果
本発明のβ−グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片によれば、従来知られていたβ‐グルコシダーゼよりも高濃度のグルコース存在下、具体的には100mM〜1Mのグルコース存在下においてグルコース非存在下におけるその酵素活性と同等の活性を保持することができる。それのみならず、本発明のβ−グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片はグルコースの存在により、さらに高い活性で基質を加水分解することができる。このように、グルコースによってその活性をさらに増加することのできるβ−グルコシダーゼは、これまで全く知られていなかった。本発明のβ-グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片を用いることにより、セロビオース及び／又はセロオリゴ糖等の分解によって生じるβ-D-グルコースの阻害を受けことがなくなるため、セルロースの糖化反応における課題を容易に解決できるだけでなく、産生されるβ-D-グルコースによって、反応をより一層促進することもできるという有利な点を有する。したがって、本発明のβ−グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片は、セルロース糖化の効率化、実用化に資する。
1-3. Effect According to the β-glucosidase or the active polypeptide fragment thereof of the present invention, in the presence of glucose at a higher concentration than the conventionally known β-glucosidase, specifically, in the presence of 100 mM to 1 M glucose, in the absence of glucose. The activity equivalent to that of the enzyme in can be maintained. In addition, the β-glucosidase of the present invention or an active polypeptide fragment thereof can hydrolyze a substrate with higher activity in the presence of glucose. Thus, β-glucosidase whose activity can be further increased by glucose has not been known at all. By using the β-glucosidase of the present invention or an active polypeptide fragment thereof, β-D-glucose inhibition caused by the degradation of cellobiose and / or cellooligosaccharide is eliminated, so that the problem in the saccharification reaction of cellulose can be easily achieved. This has the advantage that the reaction can be further accelerated by the β-D-glucose produced. Therefore, the β-glucosidase of the present invention or an active polypeptide fragment thereof contributes to efficient and practical use of cellulose saccharification.
２．β‐グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片をコードする核酸
２−１．β‐グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片をコードする核酸の特徴
本発明の第２の実施形態は、前記第１実施形態のβ‐グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片（以下、本明細書において「本発明のβ‐グルコシダーゼ等」とする）をコードする核酸である。
2. 2. Nucleic acid encoding β-glucosidase or an active polypeptide fragment thereof 2-1. Features of Nucleic Acid Encoding β-Glucosidase or an Active Polypeptide Fragment The second embodiment of the present invention is the β-glucosidase or the active polypeptide fragment of the first embodiment (hereinafter referred to as “the present invention”). A β-glucosidase or the like ”).
本明細書で「核酸」とは、原則として、DNA、RNA又はそれらの組合せをいうが、それ以外にも、PNA(Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid;登録商標)／BNA（Bridge Nucleic Acid）、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等の化学修飾核酸、擬似核酸又はそれらとDNA及びRNAの組み合わせも含む。好ましくは、DNAである。 In the present specification, the term “nucleic acid” refers to DNA, RNA, or a combination thereof in principle, but other than that, PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid; registered trademark) / BNA (Bridge Nucleic Acid), methylphosphonate-type DNA, phosphorothioate-type DNA, chemically modified nucleic acids such as 2′-O-methyl-type RNA, pseudo-nucleic acids, or combinations of these with DNA and RNA. Preferably, it is DNA.
本発明の核酸は、前記実施形態１で説明をした本発明のβ‐グルコシダーゼ又はその活性断片をコードする。例えば、配列番号１〜６のいずれか一で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは配列番号１〜６のいずれか一で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたポリペプチド、配列番号１〜５のいずれか一で示されるアミノ酸配列と50％以上の同一性を有し、かつ前記物理的性質及び化学的性質を有するポリペプチド、あるいは、それらのアミノ酸配列の一部を含み、かつ第１実施形態に記載の酵素活性を有するポリペプチド断片をコードする核酸が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号７〜１２で示されるいずれか一の塩基配列（それぞれ、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列に対応する）を含む核酸、あるいはSNP（一塩基多型）等の多型変異体、スプライス変異体又は遺伝暗号の縮重変異体のように配列番号７〜１２で示されるいずれか一の塩基配列において１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加した核酸が挙げられる。
The nucleic acid of the present invention encodes the β-glucosidase of the present invention described in
または、前記実施形態１で説明をした本発明のβ‐グルコシダーゼ又はその活性断片の塩基配列とそれぞれ95％以上、好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する核酸、又は配列番号７〜１２で示される塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列からなる核酸断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、それがコードするポリペプチドが第１実施形態に記載のβ‐グルコシダーゼのグルコース耐性を有する核酸である。ここで「同一性」とは、2つの塩基配列にギャップを導入して又は導入しないでアラインメントさせたときに、一方の塩基配列の全塩基数に対する他方の塩基配列の同一塩基数の割合（％）をいう。「数個」とは、2〜10個、2〜7個、2〜5個、2〜4個、2〜3個又は2個の整数をいう。また、「ストリンジェントな条件」とは、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。通常は低ストリンジェント〜高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1% SDSで洗浄する条件であり、好ましくは50℃、5×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。
Alternatively, a nucleic acid or sequence having 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity with the base sequence of the β-glucosidase or active fragment thereof of the present invention described in
２−２．β‐グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片をコードする核酸の調製
本発明の核酸は、例えば、配列番号７〜１２で示されるいずれか一の塩基配列に基づいて、PCR法を用いて合成したポリヌクレオチドを連結することによって得ることができる他、配列番号７〜１２で示されるいずれか一の塩基配列に基づいて、その一部配列又はそれに相補する一部配列をプローブ又はプライマーとして用いて、適当な生物種のcDNAライブラリ、好ましくはメタゲノム解析法によって調製される複数の微生物（細菌、糸状菌、原生動物等を含む）由来のcDNAライブラリ又はゲノムライブラリからサザンブロッティング又はPCR等の当該分野で公知の方法、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法によってそのオルソログを得ることができる。
2-2. Preparation of Nucleic Acid Encoding β-Glucosidase or an Active Polypeptide Fragment The nucleic acid of the present invention is, for example, a polynucleotide synthesized by PCR based on any one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 7-12 In addition, it can be obtained by ligating any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 to 12 and using a partial sequence or a partial sequence complementary thereto as a probe or primer. Known methods in the art such as Southern blotting or PCR from a cDNA library of a biological species, preferably a cDNA library or genomic library derived from a plurality of microorganisms (including bacteria, filamentous fungi, protozoa, etc.) prepared by metagenomic analysis For example, Sambrook, J. et.al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spr The ortholog can be obtained by the method described in ing Harbor, New York.
３．発現ベクター
３−１．発現ベクターの特徴
本発明の第３の実施形態は、第２実施形態の核酸を発現可能な状態で含む発現ベクターである。
3. Expression vector 3-1. Characteristics of Expression Vector A third embodiment of the present invention is an expression vector containing the nucleic acid of the second embodiment in a state capable of being expressed.
「発現ベクター」とは、一般に、内部にコードされた遺伝子を発現制御できるシステムを包含するベクターをいう。「第２実施形態の核酸」とは、本発明のβ‐グルコシダーゼ又はその活性ポリペプチド断片をコードする核酸をいう。「発現可能な状態」とは、発現ベクターに含まれる前記核酸が宿主内の所定条件下で転写され得る状態をいう。例えば、発現ベクターに含まれる宿主特異的なプロモーターの制御下に前記核酸を連結した状態が該当する。 An “expression vector” generally refers to a vector that includes a system capable of controlling the expression of a gene encoded therein. The “nucleic acid of the second embodiment” refers to a nucleic acid encoding the β-glucosidase of the present invention or an active polypeptide fragment thereof. “Expressable state” means a state in which the nucleic acid contained in the expression vector can be transcribed under predetermined conditions in the host. For example, a state in which the nucleic acid is linked under the control of a host-specific promoter contained in the expression vector is applicable.
本発明の発現ベクターにおけるベース部分、すなわち、ベクターの主要な骨格部分は、特に限定はしない。好ましくは、プラスミド又はウイルスである。プラスミドの場合、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系（stratagene社）プラスミド）、枯草菌由来のプラスミド（pUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド（Yep13、Yep24、YCp50等）等を使用することができる。ウイルスの場合、ファージ（λgt11、λZAP等のλファージ）、植物ウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメゴールデンモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV））、昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）等を使用することができる。これらは、導入する宿主に応じて適宜選択すればよい。 The base part in the expression vector of the present invention, that is, the main backbone part of the vector is not particularly limited. Preferably, it is a plasmid or a virus. In the case of a plasmid, for example, a plasmid derived from E. coli (pBI, pPZP, pSMA, pUC, pBR, pBluescript (stratagene) plasmid), a plasmid derived from Bacillus subtilis (pUB110, pTP5, etc.) Plasmids (Yep13, Yep24, YCp50 etc.) etc. can be used. In the case of viruses, phages (λ phage such as λgt11, λZAP), plant viruses (for example, cauliflower mosaic virus (CaMV), kidney bean golden mosaic virus (BGMV), tobacco mosaic virus (TMV)), insect viruses (for example, baculovirus) ) Etc. can be used. These may be appropriately selected according to the host to be introduced.
本発明の発現ベクターは、第２実施形態の核酸及びベース部分以外に、他の構成要素を含むことができる。例えば、プロモーター、エンハンサー若しくはターミネーター等の調節領域、又は選択マーカー遺伝子等の標識領域が挙げられる。また、宿主が真核生物である場合には、スプライシングシグナル（ドナー部位、アクセプター部位、ブランチポイント等）、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等の調節領域を連結することもできる。それぞれの構成要素の種類は、導入する宿主に応じて当該分野で公知のものを適宜選択すればよく、特に限定はしない。 The expression vector of the present invention can contain other components in addition to the nucleic acid and base portion of the second embodiment. For example, a regulatory region such as a promoter, enhancer or terminator, or a labeled region such as a selectable marker gene can be used. When the host is a eukaryote, regulatory regions such as a splicing signal (donor site, acceptor site, branch point, etc.), poly A addition signal, ribosome binding sequence (SD sequence), etc. can be linked. What is necessary is just to select what is well-known in the said field | area suitably according to the host to introduce | transduce each kind of component, and it does not specifically limit.
本発明の発現ベクターにおいて、前記プロモーターは、宿主特異的なプロモーター、すなわち、特定の宿主細胞内で作動可能なプロモーターを使用する。例えば、大腸菌中で作動可能なプロモーターとしては、lac、trp若しくはtacプロモーター又はファージ・ラムダ由来のPR若しくはPLプロモーター等が挙げられる。また、酵母で作動可能なプロモーターとしては、例えば、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、TPI1プロモーター、ADH2-4cプロモーター等が挙げられる。植物細胞で作動可能なプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。昆虫細胞で作動可能なプロモーターとしては、例えば、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモーター等が挙げられる。
In the expression vector of the present invention, the promoter is a host-specific promoter, that is, a promoter operable in a specific host cell. For example, promoters operable in E. coli include lac, trp or tac promoters or PR or PL promoters derived from phage lambda. Examples of promoters operable in yeast include promoters derived from yeast glycolytic genes, alcohol dehydrogenase gene promoters, TPI1 promoters, ADH2-4c promoters, and the like. Examples of promoters operable in plant cells include cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase gene promoter (Pnos), corn-derived ubiquitin promoter, rice-derived actin promoter, tobacco-derived PR protein promoter, and the like. Can be mentioned. Examples of promoters operable in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa calicornica polyhedrosic basic protein promoter, baculovirus immediate
エンハンサーとしては、例えば、CaMV 35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域及びCMVエンハンサー等が挙げられる。 Examples of the enhancer include an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV 35S promoter and a CMV enhancer.
ターミネーターとしては、例えば、大腸菌用のリポポリプロテインlppの３’ターミネーター、trpオペロンターミネーター、amyBターミネーター、酵母用のADH1遺伝子のターミネーター、ノパリン合成酵素（NOS）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（OCS）遺伝子のターミネーター、CaMV 35Sターミネーター等が挙げられる。 Examples of the terminators include lipopolyprotein lpp 3 'terminator for E. coli, trp operon terminator, amyB terminator, ADH1 gene terminator for yeast, nopaline synthase (NOS) gene terminator, octopine synthase (OCS) gene Terminator, CaMV 35S terminator and the like.
選択マーカー遺伝子としては、細菌用選択マーカーとしての薬剤耐性遺伝子（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子）、酵母用選択マーカーとしての栄養素遺伝子（例えば、ロイシン、ウラシル、アデニン、ヒスチジン、リジン又はトリプトファンの合成遺伝子）、蛍光又は発光レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニターゼ（GUS）、又は緑色蛍光タンパク質（GFP））、酵素遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPT II）、ジヒドロ葉酸還元酵素等）が挙げられる。 Selection marker genes include drug resistance genes as bacterial selection markers (eg, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, or neomycin resistance. Genes), nutrient genes as selectable markers for yeast (eg, synthetic genes for leucine, uracil, adenine, histidine, lysine or tryptophan), fluorescent or luminescent reporter genes (eg, luciferase, β-galactosidase, β-glucuronidase (GUS) Or green fluorescent protein (GFP)), enzyme genes (neomycin phosphotransferase II (NPT II), dihydrofolate reductase, etc.).
３−２．発現ベクターの調製
第２実施形態の核酸を前記本発明の発現ベクターの所定の部位に挿入する方法は、当該分野で公知の方法、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法に従って行えばよい。通常は、調製された第２実施形態の核酸の両端を適当な制限酵素で処理し、発現ベクター中のプロモーター制御下における対応する制限酵素部位に挿入して連結する方法、又はTaq DNAポリメラーゼ等による3'-A突出末端を有するPCR産物であれば発現ベクター中のプロモーター制御下における5'-T突出末端部位に挿入して連結する方法等が採用される。その他、市販のシステム又はキットを用いる場合であれば、それらに特異的な方法によって調製することもできる。
3-2. Preparation of Expression Vector A method for inserting the nucleic acid of the second embodiment into a predetermined site of the expression vector of the present invention is a method known in the art, for example, Sambrook, J. et. Al., (1989) Molecular Cloning. : a Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Usually, by treating both ends of the prepared nucleic acid of the second embodiment with an appropriate restriction enzyme and inserting and ligating it into the corresponding restriction enzyme site under the control of a promoter in the expression vector, or by Taq DNA polymerase or the like In the case of a PCR product having a 3′-A protruding end, a method of inserting and ligating to a 5′-T protruding end site under the control of a promoter in the expression vector is employed. In addition, if a commercially available system or kit is used, it can be prepared by a method specific to them.
３−３．発現ベクターの効果
本実施形態の発現ベクターによれば、適応する宿主に導入することで、次で説明する形質転換体を得ることができる。
3-3. Effect of Expression Vector According to the expression vector of the present embodiment, a transformant described below can be obtained by introducing it into a suitable host.
４．形質転換体又はその後代
４−１．形質転換体又はその後代の特徴
本発明の第４の実施形態は、第３実施形態の発現ベクターを宿主に導入した形質転換体又はその後代である。
4). Transformant or its progeny 4-1. Characteristics of Transformant or its Progeny A fourth embodiment of the present invention is a transformant or its progeny obtained by introducing the expression vector of the third embodiment into a host.
本明細書において「形質転換体」とは、第３実施形態の発現ベクターの導入により形質転換された宿主であり、形質転換体の第１世代をいう。宿主は、導入された発現ベクターの複製が可能で、かつその発現ベクターに含まれる第２実施形態の核酸を発現できれば特に限定されない。宿主の具体例を挙げると、細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli等）及び枯草菌(Bacillus subtilis)）、酵母（例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、***酵母(Schizosaccharomyces pombe)又はメタノール資化性酵母(Pichia pastoris)）、糸状菌（例えば、コウジカビ(Aspergillus)及びアカパンカビ(Neurospora)）、植物（植物体、その器官、組織、分化した細胞若しくは未分化状態の植物細胞（カルス）を含む）又は昆虫細胞（例えば、sf9又はsf21）が挙げられる。 In the present specification, the “transformant” is a host transformed by introducing the expression vector of the third embodiment, and refers to the first generation of the transformant. The host is not particularly limited as long as the introduced expression vector can be replicated and the nucleic acid of the second embodiment contained in the expression vector can be expressed. Specific examples of the host include bacteria (for example, Escherichia coli and Bacillus subtilis), yeast (for example, Saccharomyces cerevisiae), fission yeast (Schizosaccharomyces pombe), or methanol-assimilating yeast. (Pichia pastoris)), filamentous fungi (eg Aspergillus and Neurospora), plants (including plant bodies, their organs, tissues, differentiated cells or undifferentiated plant cells (callus)) or insects Examples include cells (for example, sf9 or sf21).
本明細書において「形質転換体の後代」とは、前記形質転換体（第１世代）から無性生殖又は有性生殖を介して得られる形質転換体第２世代以降であって、かつ第２実施形態の核酸を発現可能な状態で保持しているものを意味する。例えば、宿主が大腸菌や酵母等の無性生殖を行う単細胞微生物であれば、形質転換体第１世代以降から***又は出芽等によって新たに生じた細胞（クローン体）が該当する。また、形質転換される宿主が植物であれば、形質転換体第１世代以降から採取した植物体の一部から再生させた植物体、形質転換体第１世代以降から無性生殖で得られる栄養繁殖器官(例えば、根茎、塊根、球茎、ランナー等）より新たに生じた新たな植物体、又は形質転換体第１世代以降の実生が該当する。 In the present specification, the “progeny of the transformant” refers to the second generation or later of the transformant obtained from the transformant (first generation) through asexual reproduction or sexual reproduction, and the second The nucleic acid of the embodiment is held in an expressible state. For example, if the host is a single cell microorganism that performs asexual reproduction, such as Escherichia coli or yeast, a cell (clone) newly generated by division or budding from the first generation of the transformant is applicable. Moreover, if the host to be transformed is a plant, a plant regenerated from a part of the plant collected from the first generation of the transformant, or a nutrient obtained by asexual reproduction from the first generation of the transformant. A new plant newly generated from a breeding organ (for example, rhizome, tuberous root, corm, runner, etc.) or a seedling after the first generation of the transformant is applicable.
４−２．形質転換体の調製
第３実施形態の発現ベクターを宿主に導入して本発明の形質転換体又はその後代を調製する方法は、当該分野で公知の形質転換方法を使用することができる。
4-2. Preparation of Transformant As a method for preparing the transformant of the present invention or its progeny by introducing the expression vector of the third embodiment into a host, a transformation method known in the art can be used.
宿主が細菌であれば、例えば、ヒートショック法、カルシウムイオン法（例えば、リン酸カルシウム法）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、宿主が酵母であれば、例えば、リチウム法、エレクトロポレーション法等を用いればよい。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、Sambrook, J． et．al、1989、Molecular Cloning： A Laboratory Manual Second Ed．、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、Guthrie, C. & Fink. G.R., 1991, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biolog, Method in Enzymology, 194, Academic Pressを参照されたい。さらに、宿主が植物細胞であって、かつ前記発現ベクターがプラスミドベクターである場合には、形質転換方法としてプロトプラスト法、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）法等を利用することができる。いずれの方法も当該分野においては、公知の方法であり、詳細については植物代謝工学ハンドブック（2002年、NTS社）又は新版モデル植物の実験プロトコール：遺伝学的手法からゲノム解析まで（2001年秀潤社）等を参照すればよい。 If the host is a bacterium, examples thereof include a heat shock method, a calcium ion method (for example, a calcium phosphate method), an electroporation method, and the like. Further, when the host is yeast, for example, a lithium method, an electroporation method or the like may be used. These techniques are all known in the art and are described in various documents. For example, Sambrook, J. et al. et. al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed. See, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Guthrie, C. & Fink. G.R., 1991, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biolog, Method in Enzymology, 194, Academic Press. Furthermore, when the host is a plant cell and the expression vector is a plasmid vector, a protoplast method, a particle gun method, an Agrobacterium method, or the like can be used as a transformation method. Both methods are known methods in the field, and for details, see Plant Metabolism Engineering Handbook (2002, NTS) or Experimental Protocols for New Model Plants: From Genetic Methods to Genome Analysis (2001 Hidejun) Etc.).
また、宿主が植物細胞であって、かつ前記発現ベクターがウイルスベクターの場合には、そのウイルスベクターを植物細胞に感染させることによって導入することができる。ウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法も公知の方法であり、詳細については、Hohnらの方法（Molecular Biology of Plant Tumors（Academic Press、New York）1982、pp549）、米国特許第4,407,956号明細書等を参考にすればよい。 In addition, when the host is a plant cell and the expression vector is a viral vector, it can be introduced by infecting the plant cell with the viral vector. Gene transfer methods using viral vectors are also known methods. For details, see the method of Hohn et al. (Molecular Biology of Plant Tumors (Academic Press, New York) 1982, pp549), US Pat. No. 4,407,956, etc. You can refer to it.
４−３．後代取得法
本発明の形質転換体から後代を得る方法は、その形質転換体の宿主である生物種において後代を得るために用いられる通常の方法で行えばよい。例えば、形質転換体の宿主が大腸菌や酵母であれば、適当な公知培地で培養することによって容易に得ることができる。例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照すればよい。また、形質転換体の宿主が植物であれば、後代は、通常、種子、栄養繁殖器官又は植物体の一部（例えば、挿し木）の土耕栽培により得ることができる。
4-3. Progeny Acquisition Method A method for obtaining a progeny from the transformant of the present invention may be carried out by a conventional method used for obtaining a progeny in a biological species that is a host of the transformant. For example, if the host of the transformant is Escherichia coli or yeast, it can be easily obtained by culturing in an appropriate known medium. For example, see Sambrook, J. et. Al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Moreover, if the host of the transformant is a plant, the progeny can be usually obtained by soil cultivation of seeds, vegetative propagation organs, or a part of the plant body (for example, cuttings).
４−４．効果
本発明の形質転換体又はその後代によれば、適当な発現条件下で、本発明のβ‐グルコシダーゼ等を発現させることができる。
4-4. Effect According to the transformant of the present invention or its progeny, the β-glucosidase of the present invention can be expressed under appropriate expression conditions.
５．β‐グルコシダーゼ又は活性ポリペプチド断片の製造方法
本発明の第５の実施形態は、第４実施形態の形質転換体又はその後代（以下、本明細書においては「形質転換体等」とする）に発現誘導処理を行い、本発明のβ‐グルコシダーゼ等を製造する方法である。
5. Method for Producing β-Glucosidase or Active Polypeptide Fragment The fifth embodiment of the present invention relates to the transformant of the fourth embodiment or a progeny thereof (hereinafter referred to as “transformant etc.” in the present specification). This is a method for producing β-glucosidase and the like of the present invention by performing expression induction treatment.
本方法は、本発明の発現ベクターを包含する形質転換体等を培養する工程（培養工程）、培養した形質転換体等に発現誘導処理を行う工程（発現誘導工程）、及び培養液及び／又は形質転換体等から本発明のβ‐グルコシダーゼ等を回収する工程（回収工程）を含む。以下、それぞれの工程について説明をする。 This method comprises a step of culturing a transformant containing the expression vector of the present invention (cultivation step), a step of performing expression induction treatment on the cultured transformant (expression induction step), and a culture solution and / or A step (recovery step) of recovering the β-glucosidase of the present invention from the transformant or the like is included. Hereinafter, each process will be described.
５−１．培養工程
「培養工程」は、本発明の形質転換体等を適当な培地で培養する工程である。形質転換体等を培地で培養する方法は、形質転換体の宿主の培養に用いられる通常の方法に従えばよい。例えば、細菌を宿主とする場合、培地は、その微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、かつ生育、増殖可能なものであれば、天然培地、合成培地のいずれを用いることもでき、特に限定はしない。具体例としてLB培地が挙げられるが、これに限定はされない。また、形質転換体等を選択的に培養する場合にように、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加することもできる。培養は、通常、撹拌等の好気的条件下において37℃で対数増殖期まで行えばよい。また、酵母を宿主とする場合、培地は前記と同様にその酵母が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、かつ発現ベクターを保持しながら生育、増殖可能なものであれば、特に制限はしない。例えば、YPD培地や栄養素選択合成培地等を使用することができる。これらの培養方法は、当該分野で公知である。例えば、Sambrook, J． et．al、1989、Molecular Cloning： A Laboratory Manual Second Ed．、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、Guthrie, C. & Fink. G.R., 1991, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biolog, Method in Enzymology, 194, Academic Pressを参照することができる。さらに、植物を宿主とする場合、培地は公知の液体培地で公知の方法に従い、水耕栽培するか、又は圃場で栽培すればよい。
5-1. Culturing step The “culturing step” is a step of culturing the transformant of the present invention in an appropriate medium. A method for culturing a transformant or the like in a medium may be a normal method used for culturing a host of the transformant. For example, when a bacterium is used as a host, the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism, and can grow or proliferate. It can also be used and is not particularly limited. A specific example is LB medium, but is not limited thereto. Moreover, antibiotics, such as ampicillin and tetracycline, can be added to the medium as needed, as in the case of selectively culturing transformants and the like. The culture is usually performed at 37 ° C. under aerobic conditions such as stirring until the logarithmic growth phase. When yeast is used as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the yeast as described above, and can grow and proliferate while holding the expression vector. There are no particular restrictions. For example, a YPD medium or a nutrient selective synthetic medium can be used. These culture methods are known in the art. For example, Sambrook, J. et al. et. al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed. See, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Guthrie, C. & Fink. GR, 1991, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biolog, Method in Enzymology, 194, Academic Press. Furthermore, when a plant is used as a host, the medium may be a hydroponic culture according to a known method using a known liquid medium, or may be cultivated in a field.
５−２．発現誘導工程
「発現誘導工程」は、培養した前記形質転換体等に所定の発現誘導処理を行い、形質転換体等に包含される発現ベクター中の本発明のβ‐グルコシダーゼ等をコードする核酸の発現を誘導させる工程である。発現誘導の方法は、ベクターに含まれるタンパク質発現制御システムによって異なるため、そのシステムに適した誘導処理を行えばよい。例えば、細菌を宿主とするタンパク質発現誘導型ベクターにおいて最も一般的に利用されているタンパク質発現誘導システムは、lacリプレッサー遺伝子及びlacオペレーターからなるシステムである。本システムは、IPTG（isopropyl-1-thio-β-D-Galactoside）処理によって発現を誘導することが可能である。したがって、本発明の形質転換体等が包含する発現ベクターがこのlacシステムを有する場合には、目的とする本発明のβ‐グルコシダーゼ等を発現させるためには、適当量（例えば、終濃度で1mM）のIPTGを培地中に添加すればよい。これらの誘導処理は、当該分野では公知の技術である。例えば、大野茂男及び西村善文監修,1997,タンパク質実験プロトコール（１）機能解析編,細胞工学別冊,実験プロトコールシリーズ,秀潤社を参照されたい。また、形質転換体等に包含される発現ベクター中の本発明のβ‐グルコシダーゼ等をコードする核酸が、発現ベクターを宿主細胞内に導入することで恒常的に発現可能な場合には、特段の誘導処理を必要とすることなく、本発明のβ‐グルコシダーゼ等を発現させ、次の回収工程に供することができる。
5-2. Expression induction step "Expression induction step" is a step of subjecting a cultured transformant or the like to a predetermined expression induction treatment, and a nucleic acid encoding the β-glucosidase of the present invention in an expression vector included in the transformant or the like. It is a step of inducing expression. Since the expression induction method varies depending on the protein expression control system contained in the vector, an induction process suitable for the system may be performed. For example, the most commonly used protein expression induction system in a protein expression inducing vector using bacteria as a host is a system comprising a lac repressor gene and a lac operator. This system can induce expression by IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-Galactoside) treatment. Therefore, when the expression vector included in the transformant of the present invention has this lac system, an appropriate amount (for example, 1 mM at a final concentration) is used to express the target β-glucosidase of the present invention. IPTG) may be added to the medium. These induction processes are techniques known in the art. For example, see Supervision by Shigeo Ohno and Yoshifumi Nishimura, 1997, Protein Experiment Protocol (1) Functional Analysis, Cell Engineering Supplement, Experiment Protocol Series, Shujunsha. In addition, when the nucleic acid encoding the β-glucosidase of the present invention in the expression vector included in the transformant can be expressed constantly by introducing the expression vector into the host cell, a special Without requiring an induction treatment, the β-glucosidase of the present invention can be expressed and used for the next recovery step.
５−３．回収工程
「回収工程」は、発現誘導工程で誘導された本発明のβ‐グルコシダーゼ等を形質転換体等又はその培養液から回収する工程である。発現した本発明のβ‐グルコシダーゼ等が形質転換体の細胞内に生産される場合には、細胞を遠心等によって回収し、ソニケーター等の細胞破砕機を用いて破砕して本発明のβ‐グルコシダーゼ等を含む抽出液を調製する。また、発現した本発明のβ‐グルコシダーゼ等が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、又は遠心分離等により形質転換体等を除去し、上清を使用する。必要に応じて、得られた細胞抽出液又は上清を一般的なタンパク質の精製方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組合せて用いることにより、前記培養物中から本発明のβ‐グルコシダーゼ等を単離精製することができる。ポリペプチドの回収は、当該分野では公知の技術である。例えば、大野茂男及び西村善文監修,1997,タンパク質実験プロトコール（１）機能解析編,細胞工学別冊,実験プロトコールシリーズ,秀潤社を参照されたい。
5-3. Recovery Step The “recovery step” is a step of recovering the β-glucosidase of the present invention induced in the expression induction step from a transformant or the like or a culture solution thereof. When the expressed β-glucosidase or the like of the present invention is produced in the cells of the transformant, the cells are recovered by centrifugation or the like and disrupted using a cell crusher such as a sonicator or the like, and then the β-glucosidase of the present invention. An extract containing the above is prepared. In addition, when the expressed β-glucosidase or the like of the present invention is secreted outside the transformant, use the culture solution as it is or remove the transformant by centrifugation, etc. use. If necessary, the obtained cell extract or supernatant may be used in general protein purification methods such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination. Thus, the β-glucosidase of the present invention can be isolated and purified from the culture. Polypeptide recovery is a technique known in the art. For example, see Supervision by Shigeo Ohno and Yoshifumi Nishimura, 1997, Protein Experiment Protocol (1) Functional Analysis, Cell Engineering Supplement, Experiment Protocol Series, Shujunsha.
なお、本発明のβ‐グルコシダーゼ等が目的のポリペプチドであるか否かは、例えば、SDS-PAGEによる泳動距離がその塩基配列から予想される分子量サイズに合致するか否か、本発明のβ‐グルコシダーゼに対する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）があれば、その抗体により免疫反応が見られるか否か、又は後述するような高濃度のグルコース存在下でpNPGを加水分解する活性を有するか否かで確認すればよい。 Whether or not the β-glucosidase of the present invention is the target polypeptide, for example, whether or not the migration distance by SDS-PAGE matches the molecular weight size expected from the base sequence, -If there is an antibody against glucosidase (preferably a monoclonal antibody), whether or not an immune response is observed by the antibody, or whether it has an activity to hydrolyze pNPG in the presence of a high concentration of glucose as described below You can confirm with.
５−４．効果
本発明の製造方法によれば、本発明のβ‐グルコシダーゼ等を大量に製造することが可能となる。
5-4. Effect According to the production method of the present invention, it is possible to produce a large amount of the β-glucosidase of the present invention.
６．セルロース及び／又はヘミセルロースの糖化方法
本発明の第６の実施形態は、セルロース及び／又はヘミセルロースを分解し、糖化する方法である。本糖化方法は、本発明のβ‐グルコシダーゼ等及び／又は本発明の形質転換体等を用いてセロビオース及び／又はセロオリゴ糖を加水分解する工程を含むことを特徴とする。
6). Cellulose and / or hemicellulose saccharification method The sixth embodiment of the present invention is a method for decomposing and saccharifying cellulose and / or hemicellulose. The saccharification method includes a step of hydrolyzing cellobiose and / or cellooligosaccharide using the β-glucosidase of the present invention and / or the transformant of the present invention.
本明細書の「セルロース及び／又はヘミセルロース」（以下、「セルロース等」とする）は、セルロース等を含有するあらゆる資源を対象とすることができる。例えば、木本類（例えば、スギ又はカラマツのような針葉樹若しくはブナ、ナラ、カシ、ユーカリ又はポプラのような広葉樹の樹幹、根、枝、葉、花、種子及びそれらの落葉を含む）及び草本類（ススキ、タケ若しくはササ等の単子葉類、ヨモギ、セイタカアワダチソウ若しくはクズのような双子葉類の根、茎、葉、花、種子及びそれらの枯死体を含む）を含む種子植物又はシダ類等の利用度の低い植物資源のみならず、植物性農業廃棄物（例えば、イネ、ムギ、トウモロコシ等の茎、葉、籾殻）、農産物の加工処理で発生する残渣（例えば、果皮、オカラのような搾り粕）、紙資源（例えば、新聞紙、雑誌、廃棄OA紙、ダンボール）及び建築廃材が挙げられる。 The “cellulose and / or hemicellulose” (hereinafter referred to as “cellulose or the like”) in the present specification can be used for any resource containing cellulose or the like. For example, woody species (including conifers such as cedar or larch or broad-leaved tree trunks such as beech, oak, oak, eucalyptus or poplar, roots, branches, leaves, flowers, seeds and their deciduous) and herbs Plants (including monocots such as Japanese pampas grass, bamboo or Sasa, including roots, stems, leaves, flowers, seeds and their dead bodies of dicotyledons such as mugwort, scorpiona or kuzu) Not only plant resources with low utilization such as plant agricultural waste (eg, stems, leaves, rice husks of rice, wheat, corn etc.), residues generated by processing of agricultural products (eg, pericarp, okara etc. Squeezed rice cake), paper resources (for example, newspapers, magazines, waste OA paper, cardboard) and construction waste.
一般に、セルロース等の糖化は、セルロース等をセロオリゴ糖に加水分解する工程（セルロース分解工程）、セロオリゴ糖をセロビオースに加水分解する工程（セロオリゴ糖分解工程）及びセロビオースをβ-D-グルコースに加水分解する工程（セロビオース分解工程）を含む。本発明のβ‐グルコシダーゼ等を用いてセロビオース及び／又はセロオリゴ糖を加水分解する工程は、主として「セロビオース分解工程」に含まれる。以下、前記３つの工程について説明をする。 In general, saccharification of cellulose and the like is performed by hydrolyzing cellulose or the like into cellooligosaccharide (cellulose decomposition step), hydrolyzing cellooligosaccharide into cellobiose (cellooligosaccharide decomposition step), and hydrolyzing cellobiose into β-D-glucose. Including a step (cellobiose decomposition step). The step of hydrolyzing cellobiose and / or cellooligosaccharide using the β-glucosidase of the present invention is mainly included in the “cellobiose decomposition step”. Hereinafter, the three steps will be described.
６−１．セルロース分解工程
「セルロース分解工程」は、セルロース等を分解して主としてセロオリゴ糖、一部でセロビオースを生成する工程である。本工程は、通常、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼによる加水分解作用によって進行する。使用するエンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼは、セルロース等の加水分解活性を有するものであれば、細菌由来、真菌（酵母、糸状菌を含む）由来、粘菌由来、シロアリやゴキブリ等の昆虫又は原生動物由来のいずれであってもよく、その種類は問わない。例えば、糸状菌の一種であるトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のエンドグルカナーゼを使用することができる。本工程で使用するエンドグルカナーゼは、その活性を有していれば必ずしも精製されている必要はなく、例えば、トリコデルマ・リーゼイの培養上清のように各種セルラーゼ（エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ及びβ‐グルコシダーゼ）を包含する未精製（クルードな）溶液を使用することもできる。
6-1. Cellulose Decomposition Process The “cellulose decomposition process” is a process in which cellulose or the like is decomposed to mainly produce cellooligosaccharides and partly cellobiose. This step usually proceeds by hydrolysis with endoglucanase and cellobiohydrolase. The endoglucanase and cellobiohydrolase used are those derived from bacteria, fungi (including yeast and filamentous fungi), slime mold, insects or protozoa such as termites and cockroaches as long as they have hydrolytic activity such as cellulose. Any of origin may be sufficient, and the kind is not ask | required. For example, endoglucanase derived from Trichoderma reesei, which is a type of filamentous fungus, can be used. The endoglucanase used in this step is not necessarily purified as long as it has the activity. For example, various cellulases (endoglucanase, exoglucanase and β-glucosidase, such as Trichoderma reesei culture supernatant). It is also possible to use an unpurified solution including
本工程の具体的方法としては、例えば、エンドグルカナーゼを１ｇのセルロース等に対して1〜10mg、好ましくは2mgで添加し、pH4〜pH6、好ましくはpH4.5〜pH5.5の範囲内において、30℃〜60℃、好ましくは40℃〜50℃の温度下で、6時間〜48時間、好ましくは12〜24時間インキュベートすればよい。本工程で使用するセルロース及び／ヘミセルロースは、木質状態、すなわち、リグニンを含有する状態又は後述するリグニン分解除去処理工程を経た状態のいずれであってもよい。好ましくは、リグニン分解除去処理工程を経た状態である。また、トリコデルマ・リーゼイの培養上清のように各セルラーゼを混合状態で包含する未精製溶液を使用する場合、当該未精製溶液が、エキソグルカナーゼも含有するため、本工程と次のセロオリゴ糖分解工程を連続的に行うことができる。それ故、当該未精製溶液処理後は、次のセロオリゴ糖分解工程を別途行わず、連続的にセロビオース分解工程に進めてもよい。
As a specific method of this step, for example, endoglucanase is added in an amount of 1 to 10 mg, preferably 2 mg to 1 g of cellulose and the like, and within a range of
６−２．セロオリゴ糖分解工程
「セロオリゴ糖分解工程」は、セルロース分解工程等で生じたセロオリゴ糖を分解してセロビオースを生成する工程である。本工程は、通常、エキソグルカナーゼによる加水分解作用によって進行する。使用するエキソグルカナーゼは、セロオリゴ糖の加水分解活性を有するものであれば、由来する種類は問わない。したがって、前記セルロース分解工程で使用したエンドグルカナーゼの由来する種と異なる種に由来するものであってもよい。例えば、セルロース分解工程でトリコデルマ・リーゼイ由来のエンドグルカナーゼを使用し、本工程で黒コウジカビの一種であるアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）由来のエキソグルカナーゼを使用することもできる。
6-2. Cellooligosaccharide decomposition step The “cellooligosaccharide decomposition step” is a step of generating cellobiose by decomposing the cellooligosaccharide produced in the cellulose decomposition step or the like. This step usually proceeds by a hydrolysis action by exoglucanase. As long as the exoglucanase to be used has the hydrolyzing activity of cellooligosaccharide, the kind from which it originates will not be ask | required. Therefore, it may be derived from a species different from the species from which the endoglucanase used in the cellulose decomposition step is derived. For example, an endoglucanase derived from Trichoderma reesei can be used in the cellulose decomposition step, and an exoglucanase derived from Aspergillus niger, a kind of Aspergillus niger, can be used in this step.
前記セルロース分解工程後、エンドグルカナーゼを失活させてそれらを除去する処理は、特に必要はない。前記セルロース分解工程後、エキソグルカナーゼを添加することで、本工程の反応液中にセルロース又はヘミセルロースが残存していても、エンドグルカナーゼにより引き続きそれらを加水分解することができるからである。ただし、必要に応じて、失活・除去処理を行ってもよい。 After the cellulose decomposition step, treatment for inactivating endoglucanases and removing them is not particularly necessary. This is because, by adding exoglucanase after the cellulose decomposition step, even if cellulose or hemicellulose remains in the reaction solution of this step, they can be subsequently hydrolyzed by endoglucanase. However, a deactivation / removal process may be performed as necessary.
本工程で使用するエキソグルカナーゼも、前述のエンドグルカナーゼと同様に、その活性を有していれば必ずしも精製されている必要はなく、例えば、トリコデルマ・リーゼイの培養上清のように他のセルラーゼを包含する未精製状態であってもよい。 Similarly to the endoglucanase described above, the exoglucanase used in this step is not necessarily purified as long as it has the activity. For example, other cellulases such as Trichoderma reesei culture supernatant can be used. It may be in an unpurified state.
本工程の具体的方法としては、例えば、エキソグルカナーゼを1ｇのセロオリゴ糖に対して1〜10mg、好ましくは2mgで添加し、pH4〜pH6、好ましくはpH4.5〜pH5.5の範囲内において、30℃〜60℃、好ましくは40℃〜50℃の温度下で、6時間〜48時間、好ましくは12〜24時間インキュベートすればよい。
As a specific method of this step, for example, 1-10 mg, preferably 2 mg, of exoglucanase is added to 1 g of cellooligosaccharide, and within the range of pH 4-
本工程で、本発明のβ‐グルコシダーゼ等を用いてもよい。本発明のβ‐グルコシダーゼ等は、前述のようにセロオリゴ糖を加水分解する活性も有するからである。この場合、本発明のβ‐グルコシダーゼ等の作用により、次のセロビオース分解工程まで連続的に行うことができるため、別途セロビオース分解工程を行う必要がないという利点がある。一方、本工程において、本発明の形質転換体若しくはその後代又は本発明のβ‐グルコシダーゼの一つであるMru-β-Gluを生合成する好熱菌Meiothermus ruber（本明細書では、これらをまとめて以下「形質転換体及び細菌等」とする）を使用することもできる。この場合、反応液がその形質転換体及び細菌等の培養に適した状態であって、かつその形質転換体及び細菌等が細胞外に本発明のβ‐グルコシダーゼ等を分泌することができるのであれば、その形質転換体及び細菌等を当該反応液に直接投入すればよい。また、反応液はその形質転換体及び細菌等の培養に不適ではあるが、本発明の形質転換体及び細菌等が細胞外に本発明のβ‐グルコシダーゼ等を分泌することができるのであれば、その形質転換体及び細菌等を別途適当な条件下で培養し、その培養液上清を当該反応液に投入すればよい。一方、本発明の形質転換体及び細菌等が本発明のβ‐グルコシダーゼ等を内包し、分泌しない場合には、適当な培養条件で別途培養したその形質転換体及び細菌等から前記第５実施形態に記載の方法を用いて本発明のβ‐グルコシダーゼ等を回収し、それを反応液に添加する必要がある。これらは、当該分野で公知の技術に基づいて、適宜調節すればよい。 In this step, β-glucosidase of the present invention may be used. This is because the β-glucosidase of the present invention also has an activity of hydrolyzing cellooligosaccharide as described above. In this case, because of the action of the β-glucosidase of the present invention, it can be continuously performed until the next cellobiose decomposition step, and therefore there is an advantage that it is not necessary to separately perform the cellobiose decomposition step. On the other hand, in this step, the thermophile Meiothermus ruber that biosynthesizes Mru-β-Glu, which is one of the transformant of the present invention, its progeny, or the β-glucosidase of the present invention (in the present specification, these are summarized. Hereinafter referred to as “transformants and bacteria”). In this case, the reaction solution is in a state suitable for culturing the transformant and bacteria, and the transformant and bacteria can secrete the β-glucosidase of the present invention outside the cell. For example, the transformant, bacteria, and the like may be directly added to the reaction solution. Further, the reaction solution is unsuitable for culturing the transformant and bacteria, but if the transformant and bacteria of the present invention can secrete β-glucosidase of the present invention extracellularly, The transformant, bacteria, and the like are separately cultured under appropriate conditions, and the culture supernatant is added to the reaction solution. On the other hand, when the transformant and bacteria of the present invention contain the β-glucosidase of the present invention and do not secrete the transformant, bacteria, etc. separately cultured under appropriate culture conditions, the fifth embodiment. It is necessary to recover the β-glucosidase of the present invention using the method described in 1) and add it to the reaction solution. These may be adjusted as appropriate based on techniques known in the art.
６−３．セロビオース分解工程
「セロビオース分解工程」は、セロオリゴ糖分解工程等で生じたセロビオースを酵素によって加水分解し、最終産物であるβ-D-グルコースを生成する工程である。本工程は、通常、β-グルコシダーゼによる加水分解作用によって進行するが、一般的なβ-グルコシダーゼは、グルコースによりその活性が阻害されるため、本工程で生成したグルコース濃度が増加するにつれてはセロビオースの分解が停滞してしまう。それ故、従来のβ-グルコシダーゼでは、セロビオースが蓄積し、効率的な糖化反応を行えないという問題があった。本実施形態のセルロース等の糖化方法では、本発明のβ‐グルコシダーゼ等を本工程に使用し、この問題を解決することを特徴としている。すなわち、本発明のβ‐グルコシダーゼ等は、1Mの非常に高濃度のグルコース存在下であってもセロビオースを加水分解する活性を保持することができる。さらに、グルコースの存在により、その活性を増加する新規性質を有することから、グルコース濃度の増大に伴うセロビオース分解工程の停滞を回避し、より効率的に糖化反応を完了することが可能となる。
6-3. Cellobiose decomposition step The “cellobiose decomposition step” is a step of hydrolyzing cellobiose produced in the cellooligosaccharide decomposition step or the like with an enzyme to produce β-D-glucose as a final product. This process usually proceeds by the hydrolysis action of β-glucosidase, but the activity of general β-glucosidase is inhibited by glucose. Therefore, as the glucose concentration produced in this process increases, cellobiose Decomposition will stagnate. Therefore, the conventional β-glucosidase has a problem that cellobiose accumulates and an efficient saccharification reaction cannot be performed. The saccharification method for cellulose and the like according to this embodiment is characterized in that the β-glucosidase of the present invention is used in this step to solve this problem. That is, the β-glucosidase of the present invention can retain the activity of hydrolyzing cellobiose even in the presence of a very high concentration of 1M glucose. Furthermore, since it has a novel property of increasing its activity due to the presence of glucose, it is possible to avoid the stagnation of the cellobiose decomposition process accompanying an increase in glucose concentration and complete the saccharification reaction more efficiently.
前記セロオリゴ糖分解工程後、エキソグルカナーゼ等を失活させてそれらを除去する処理は、特に必要ではない。これは、前記セロオリゴ糖分解工程後、本発明のβ‐グルコシダーゼ等を添加することで、セロオリゴ糖分解工程後に残存するセロオリゴ糖をエキソグルカナーゼにより引き続き加水分解することができるからである。ただし、必要に応じて、失活・除去処理を行ってもよい。 After the cellooligosaccharide decomposition step, a treatment for inactivating exoglucanase or the like to remove them is not particularly necessary. This is because the cellooligosaccharide remaining after the cellooligosaccharide decomposition step can be subsequently hydrolyzed by the exoglucanase by adding the β-glucosidase of the present invention after the cellooligosaccharide decomposition step. However, a deactivation / removal process may be performed as necessary.
本工程の具体的方法として、例えば、本発明のβ‐グルコシダーゼ等を使用する場合であれば、それらを1ｇのセロビオースに対して0.1〜1mg、好ましくは0.5mgで添加し、pH3.5〜pH7.5の範囲内において、30℃〜70℃温度下で、6時間〜48時間、好ましくは12〜24時間インキュベートすればよい。
As a specific method of this step, for example, when β-glucosidase of the present invention is used, they are added at 0.1 to 1 mg, preferably 0.5 mg, with respect to 1 g of cellobiose, pH 3.5 to
また、本工程において、本発明の形質転換体及び細菌等を使用する場合、セロオリゴ糖分解工程で記載したように、反応液がその形質転換体及び細菌等の培養に適した状態であって、かつ形質転換体及び細菌等が細胞外に本発明のβ‐グルコシダーゼ等を分泌することができるのであれば、その形質転換体及び細菌等を当該反応液に直接投入すればよい。この場合、反応温度は、形質転換体及び細菌等の増殖に適した温度にするか、又はそれらを増殖させた後、本発明のβ‐グルコシダーゼの至適温度に上げればよい。また、反応液はその形質転換体及び細菌等の培養に不適ではあるが、形質転換体及び細菌等が細胞外に本発明のβ‐グルコシダーゼ等を分泌することができるのであれば、形質転換体及び細菌等を別途適当な条件下で培養し、その培養液上清を当該反応液に投入すればよい。この場合、反応温度は、本発明のβ‐グルコシダーゼの至適温度にすることができる。一方、形質転換体及び細菌等が本発明のβ‐グルコシダーゼ等を内包し、分泌しない場合には、適当な培養条件で別途培養した形質転換体及び細菌等から前記第５実施形態に記載の方法を用いてβ‐グルコシダーゼ等を回収し、それを反応液に添加する必要がある。その際、添加する量は本発明のβ‐グルコシダーゼ等を使用する場合に準ずればよい。 In this step, when using the transformant and bacteria of the present invention, as described in the cellooligosaccharide decomposition step, the reaction solution is in a state suitable for culturing the transformant and bacteria, If the transformant, bacteria, etc. can secrete the β-glucosidase of the present invention to the outside of the cell, the transformant, bacteria, etc. may be directly added to the reaction solution. In this case, the reaction temperature may be a temperature suitable for the growth of transformants and bacteria, or may be increased to the optimum temperature for the β-glucosidase of the present invention after they are grown. The reaction solution is unsuitable for culturing the transformant and bacteria, but if the transformant and bacteria can secrete the β-glucosidase of the present invention outside the cell, the transformant. In addition, bacteria and the like are separately cultured under appropriate conditions, and the culture supernatant is added to the reaction solution. In this case, the reaction temperature can be the optimum temperature of the β-glucosidase of the present invention. On the other hand, when the transformant, bacteria, etc. contain the β-glucosidase of the present invention and do not secrete it, the method described in the fifth embodiment from the transformant, bacteria, etc. separately cultured under appropriate culture conditions It is necessary to collect β-glucosidase and the like and add it to the reaction solution. In this case, the amount to be added may be the same as when using the β-glucosidase of the present invention.
一例として、形質転換体が酵母であった場合、本発明のβ‐グルコシダーゼの活性と酵母の生育の至適pHは、ほぼ一致する。また、本発明のβ‐グルコシダーゼの活性によってセロビオースから生じたβ-D-グルコースは、酵母の栄養源となり得る。それ故、反応温度を酵母の増殖に適した30℃前後にすれば、酵母形質転換体を反応液にそのまま投入することで、本工程を達成し得る。さらに、当該工程を嫌気的条件下で行った場合、酵母はエタノール発酵を行うが、本発明のβ‐グルコシダーゼは、エタノールが反応液に対する体積比で5〜20％のときにエタノール非存在下と比較して活性が20％〜50％向上するという利点もある。したがって、セルロールやヘミセルロースからバイオエタノールを生成する場合に酵母の使用は非常に有効である。 As an example, when the transformant is yeast, the activity of the β-glucosidase of the present invention and the optimum pH for yeast growth are almost the same. Further, β-D-glucose produced from cellobiose by the activity of β-glucosidase of the present invention can be a nutrient source for yeast. Therefore, if the reaction temperature is about 30 ° C. suitable for yeast growth, this step can be achieved by directly introducing the yeast transformant into the reaction solution. Furthermore, when the process is performed under anaerobic conditions, the yeast performs ethanol fermentation, but the β-glucosidase of the present invention is not present in the absence of ethanol when ethanol is 5 to 20% by volume with respect to the reaction solution. There is also an advantage that the activity is improved by 20% to 50%. Therefore, the use of yeast is very effective when bioethanol is produced from cellulose or hemicellulose.
本工程では、本発明のβ‐グルコシダーゼ等がその活性を失わない範囲で、他の生物種由来のβ‐グルコシダーゼと共存することもできる。例えば、トリコデルマ・リーゼイの培養上清のように各セルラーゼを混合状態で包含する未精製溶液をセルロース分解工程で使用する場合が該当する。 In this step, β-glucosidase of the present invention can coexist with β-glucosidase derived from other species as long as its activity is not lost. For example, the case where an unpurified solution containing each cellulase in a mixed state, such as Trichoderma reesei culture supernatant, is used in the cellulose decomposition step.
本工程後に、セルロースの糖化産物であるβ-D-グルコースを得ることができる。 After this step, β-D-glucose, which is a saccharified product of cellulose, can be obtained.
６−４．リグニン分解除去工程
一の実施形態において、木質バイオマスからセルロース等を糖化する場合、前記セルロース分解工程に先立ち、リグニンを分解除去する工程を含むことができる。この工程を含むことによって、効率的な木質バイオマスの糖化が可能となる。リグニン分解除去工程は、木質部においてセルロース及びヘミセルロースと結合するリグニンを除去する工程である。
6-4. Lignin decomposition and removal step In one embodiment, when saccharifying cellulose or the like from woody biomass, a step of decomposing and removing lignin can be included prior to the cellulose decomposition step. By including this step, efficient saccharification of woody biomass becomes possible. A lignin decomposition removal process is a process of removing the lignin couple | bonded with a cellulose and hemicellulose in a wood part.
６−５．セルロース等の糖化方法の具体例
以下で、本実施形態の具体的方法について、一例を挙げて説明する。ただし、本実施形態は、ここで説明する方法に限定するものではない。
6-5. Specific Example of Saccharification Method for Cellulose and the like Hereinafter, a specific method of this embodiment will be described with an example. However, the present embodiment is not limited to the method described here.
まず、スギの木質部を1g採取し、コンバージミルで30分間粉砕する。次に、粉砕した粒子を2mg〜20mgのタンパク質成分を含有するトリコデルマ・リーゼイの培養上清1ml、及び1ユニット〜10ユニットの本発明のβ‐グルコシダーゼを含む10ml反応溶液(50mM酢酸ナトリウム、pH5.0を含む)に加える。ここで、トリコデルマ・リーゼイの培養上清は、酵素製剤として市販されているものを使用すればよい。続いて、反応液を50℃で振とうしながら２４時間反応させることで、スギセルロースをβ-D-グルコースに糖化することができる。
First, 1 g of cedar wood is collected and ground in a convergence mill for 30 minutes. Next, 1 ml of Trichoderma reesei culture supernatant containing 2 mg to 20 mg of protein component, and 10 ml reaction solution (50 mM sodium acetate,
６−６．効果
本発明の糖化方法によれば、反応産物として生じるグルコースの濃度が500mM以下であれば、その阻害作用を受けることなく、セルロース等の糖化反応を進行させることができる。その結果、セルロース等の十分な糖化が可能となる。
6-6. Effect According to the saccharification method of the present invention, when the concentration of glucose produced as a reaction product is 500 mM or less, a saccharification reaction of cellulose or the like can proceed without being inhibited. As a result, sufficient saccharification of cellulose and the like becomes possible.
７．β-D-グルコース製造方法
本発明の第７の実施形態は、前記第６実施形態の糖化方法を用いてセルロース等からβ-D-グルコースを製造する方法である。
7). β-D-Glucose Production Method The seventh embodiment of the present invention is a method for producing β-D-glucose from cellulose or the like using the saccharification method of the sixth embodiment.
本製造方法は、前記第６実施形態の糖化方法に準じて行うことにより、その結果の生産物としてβ-D-グルコースを得ることができる。したがって、ここでは、その詳細な説明を省略する。 By performing this production method according to the saccharification method of the sixth embodiment, β-D-glucose can be obtained as the resulting product. Therefore, detailed description thereof is omitted here.
以下で本発明の実施例を説明するが、ここで挙げる実施例は単なる具体的例示に過ぎず、本発明の技術的範囲を何ら限定するものではない。 Examples of the present invention will be described below, but the examples given here are merely specific illustrations and do not limit the technical scope of the present invention.
＜実施例１＞グルコース耐性β-グルコシダーゼの単離
高濃度のグルコース存在下であっても、pNPGを加水分解できる活性を有するβーグルコシダーゼをメタゲノム解析法によって単離した。
<Example 1> Isolation of glucose-tolerant β-glucosidase β-glucosidase having an activity capable of hydrolyzing pNPG even in the presence of a high concentration of glucose was isolated by a metagenomic analysis method.
（１）堆肥由来の微生物ゲノムの抽出
木質を原料とする堆肥より微生物ゲノムを抽出した。まず、堆肥100gに対し、オートクレーブ滅菌した0.5M 硫酸アンモニウム水溶液（pH6.8） 500mlとオートクレーブ滅菌したスキムミルク水溶液（0.8 g/l）50mlを加え、サンプルに水が浸透するまでスターラーで撹拌した。次に、ワーリング社製ブレンダーにより、Hiのスイッチで5分間撹拌した。懸濁液を遠沈管に移し、遠心分離（1000rpm、10分間、4℃）を行った。上清を新しい遠沈管に移し、遠心分離（9000rpm、60分間、4℃）で集菌した。
(1) Extraction of microbial genome derived from compost The microbial genome was extracted from compost made from wood. First, to 100 g of compost, 500 ml of 0.5 M aqueous ammonium sulfate solution (pH 6.8) sterilized by autoclaving and 50 ml of skim milk aqueous solution (0.8 g / l) sterilized by autoclave were added and stirred with a stirrer until water penetrated into the sample. Next, the mixture was stirred for 5 minutes with a Hi switch using a Waring blender. The suspension was transferred to a centrifuge tube and centrifuged (1000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.). The supernatant was transferred to a new centrifuge tube and collected by centrifugation (9000 rpm, 60 minutes, 4 ° C.).
次に、上清を除き、得られた沈殿に10mlのDNA抽出バッファ（100mM Tris（Sigma社）−HCl（ナカライテスク社）バッファ(pH8.0)／100mM EDTA(pH8.0)（ナカライテスク社)／100mM リン酸ナトリウムバッファ(pH8.0)（ナカライテスク社）／1.5M NaCl（東京化成社）／1% ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（シグマ社））を加え、混合液を穏やかに撹拌した。 Next, the supernatant was removed, and 10 ml of DNA extraction buffer (100 mM Tris (Sigma) -HCl (Nacalai Tesque)) buffer (pH 8.0) / 100 mM EDTA (pH 8.0) (Nacalai Tesque) was added to the resulting precipitate. ) / 100 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) (Nacalai Tesque) /1.5 M NaCl (Tokyo Kasei) / 1% hexadecyltrimethylammonium bromide (Sigma)) was added and the mixture was gently stirred.
続いて、その混合液を-80℃のフリーザー内に一晩保存した後、60℃のインキュベータ（BR-40LF；タイテック社）内で溶解させた。溶解した溶液に20mg/mlのプロテイナーゼK（Sigma社）を200μl加え、37℃で１時間、インキュベータ（BR-40LF；タイテック社）を用いて200rpmで水平振とうしながら反応させた。その後、20% SDS溶液を1.5ml及び100mg/ml リゾチーム（ナカライテスク社）をそれぞれ1ml加え、65℃で３時間、インキュベータ（BR-40LF；タイテック社）を用いて200rpmで水平振とうさせた。 Subsequently, the mixed solution was stored in a freezer at −80 ° C. overnight and then dissolved in an incubator at 60 ° C. (BR-40LF; Taitec). 200 μl of 20 mg / ml proteinase K (Sigma) was added to the dissolved solution, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour using an incubator (BR-40LF; Taitec) with horizontal shaking at 200 rpm. Thereafter, 1.5 ml of 20% SDS solution and 1 ml of 100 mg / ml lysozyme (Nacalai Tesque) were added, respectively, and shaken horizontally at 200 rpm for 3 hours at 65 ° C. using an incubator (BR-40LF; Taitec).
続いて、反応後の溶液を、25℃で8000gにて30分間遠心分離し、水層と有機層に分離した後、水層を回収した。その水層と等量のTE飽和フェノール（ニッポンジーン社）を加え、一晩転倒混和させた。この工程を計3回繰り返した。ただし、2回目の転倒混和時間は、3時間とした。回収した水相にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（PCI）溶液（Nippon gene社）を等量加え、インキュベータ（BR-40LF；タイテック社）を用いて室温で３時間転倒混和した。再び、25℃で8000gにて30分間遠心分離を行い、水層を回収した。 Subsequently, the solution after the reaction was centrifuged at 25 ° C. and 8000 g for 30 minutes to separate into an aqueous layer and an organic layer, and then the aqueous layer was recovered. An amount of TE-saturated phenol (Nippon Gene) equivalent to the aqueous layer was added and mixed by inversion overnight. This process was repeated a total of 3 times. However, the second inversion mixing time was 3 hours. An equal amount of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol (PCI) solution (Nippon gene) was added to the recovered aqueous phase, and the mixture was mixed by inverting at room temperature for 3 hours using an incubator (BR-40LF; Taitec). Again, centrifugation was performed at 8000 g for 30 minutes at 25 ° C., and the aqueous layer was recovered.
得られた水層に1/10容量の3M 酢酸ナトリウム（ナカライテスク社）を加えて穏やかに撹拌した後、2.5倍容量のエタノール（キシダ化学社）を追加し、穏やかに撹拌した。溶液中に生じた糸状のDNA（メタゲノムDNA）を取りこぼさないように注意しながらデカンテーションにより上清を除き、その後、DNAを70％エタノールで2回洗浄した。DNAを風乾後、5mlのTEバッファを加え、インキュベータ（BR-40LF；タイテック社）内で一晩穏やかに水平に震盪させてメタゲノムDNAを溶解させた。 1/10 volume of 3M sodium acetate (Nacalai Tesque) was added to the obtained aqueous layer and gently stirred, and then 2.5 times volume of ethanol (Kishida Chemical Co., Ltd.) was added and gently stirred. The supernatant was removed by decantation taking care not to miss the filamentous DNA (metagenomic DNA) generated in the solution, and then the DNA was washed twice with 70% ethanol. After the DNA was air-dried, 5 ml of TE buffer was added, and the metagenomic DNA was dissolved by shaking gently and horizontally overnight in an incubator (BR-40LF; Taitec).
（２）メタゲノムライブラリの構築
上記で得られたメタゲノムDNAをハイドロシェアー（ジーンマシーンズ社）によって物理的に剪断し、アガロースゲル（ニッポンジーン社）で電気泳動して分画した。5〜10kbのDNA断片をMinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いてゲルから抽出し、T4 DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いてDNA断片の平滑化を行った。BamHI（NEB社）で切断後、T4 DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社)による平滑末端化し、アルカリホスファターゼ(タカラバイオ社)による脱リン酸化処理を行ったp18GFPベクターに、DNA Ligation Kit Mighty Mix (タカラバイオ社)を用いて、前記調製したDNA断片を4℃、１６時間で連結させた。反応後、反応液をフェノール（ニッポンジーン社）抽出し、エタノール沈殿を行って、30μlの0.1×TEに溶解した。作製したメタゲノムライブラリを、エレクトロポレーション法（ジーンパルサー；バイオラッド社）を用いて以下の条件にて大腸菌に導入した。25μlの大腸菌DH10B株(ElectroMAX DH10B cells,インビトロジェン社)、1μlのライゲーション溶液（組成）を混合し、エレクトロポレーションキュベット Gap 0.1 cm (Bio rad)に入れた後、1.8kV、200Ω、25μFでパルス処理し、直ちに1mlのSOC培地を加えて37℃で１時間振とう培養した。その後、培養液全量を100μg/ml アンピシリン及び100μM IPTGを含有するLBプレート（9cm）1枚に播種し、37℃で一晩培養した。翌日、プレートに1mlのLB培地を加え、スプレッダーを用いてプレートから形質転換体コロニーを回収した。得られた形質転換体の集団をメタゲノムライブラリとした。
(2) Construction of metagenomic library The metagenomic DNA obtained above was physically sheared by hydroshear (Gene Machines) and electrophoresed on an agarose gel (Nippon Gene) for fractionation. A 5 to 10 kb DNA fragment was extracted from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN), and the DNA fragment was smoothed using T4 DNA polymerase (Takara Bio). After cleaving with BamHI (NEB), blunt-ended with T4 DNA polymerase (Takara Bio Inc.) and dephosphorylated with alkaline phosphatase (Takara Bio Inc.), the DNA Ligation Kit Mighty Mix (Takara Bio Inc.) The DNA fragments prepared above were ligated at 4 ° C. for 16 hours. After the reaction, the reaction solution was extracted with phenol (Nippon Gene), ethanol precipitated, and dissolved in 30 μl of 0.1 × TE. The prepared metagenomic library was introduced into Escherichia coli under the following conditions using an electroporation method (Gen Pulser; Bio-Rad). 25 μl of E. coli DH10B strain (ElectroMAX DH10B cells, Invitrogen) and 1 μl of ligation solution (composition) were mixed and placed in an electroporation cuvette Gap 0.1 cm (Bio rad), then pulsed with 1.8 kV, 200Ω, 25 μF Immediately after that, 1 ml of SOC medium was added and cultured at 37 ° C. with shaking for 1 hour. Thereafter, the entire culture was seeded on one LB plate (9 cm) containing 100 μg / ml ampicillin and 100 μM IPTG, and cultured overnight at 37 ° C. The next day, 1 ml of LB medium was added to the plate, and transformant colonies were recovered from the plate using a spreader. The obtained population of transformants was used as a metagenomic library.
（３）βーグルコシダーゼ陽性クローンのスクリーニング
次に、得られたメタゲノムライブラリを、10μM IPTG（ナカライテスク社）、40μg/ml X-Glc（5-ブルモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-グルコピラノシド;シグマ社）を含むLBプレート上に播種し、β‐グルコシダーゼ活性を有するクローンのスクリーニングを行った。X-Glcは、β‐グルコシダーゼによって分解されると青色色素を発生する。そこで、青色を呈する形質転換体をβーグルコシダーゼ陽性クローンとして回収した。359クローンを解析した結果、13クローンのβーグルコシダーゼ陽性クローンを得ることができた。
(3) Screening for β-glucosidase positive clones Next, the obtained metagenomic library was prepared by using 10 μM IPTG (Nacalai Tesque), 40 μg / ml X-Glc (5-Brumo-4-chloro-3-indoyl-β-D). -Glucopyranoside (Sigma)) was seeded on a LB plate, and clones having β-glucosidase activity were screened. X-Glc generates a blue pigment when it is degraded by β-glucosidase. Therefore, a transformant exhibiting a blue color was recovered as a β-glucosidase positive clone. As a result of analyzing 359 clones, 13 β-glucosidase positive clones could be obtained.
（４）グルコース耐性β-グルコシダーゼのスクリーニング
メタゲノムライブラリより得られた13クローンのβーグルコシダーゼ陽性クローンについてグルコース耐性のスクリーニングを行った。寒天培地上に生育させた各クローンを、1mlのLB-アンピシリン（ナカライテスク社）液体培地を含む96穴マイクロプレートに接種した。当該プレートをシェーカー（タイテック社M BR-024）で37℃、1000rpmにて一晩振とう培養した。培養液から200μlを分取し、100μlずつグルコース非存在下（0％）及び10％(v/v)グルコース存在下における活性測定に供した。具体的に説明すると、分取した培養液を、まず、遠心分離器（5810R；エッペンドルフ社）を用いて4℃にて4000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去した。次に、ペレット（菌体）を、1mM pNPG（シグマ社）／及び0％又は10％グルコース（ナカライテスク社）を含む100mMリン酸バッファ（pH6.0）に懸濁した。シェーカー（M BR-024；タイテック社）で、37℃、1000rpmにて48時間振とうして反応させた後、遠心分離器（5810R；エッペンドルフ社）を用いて4℃にて4000rpmで10分間遠心分離し、上清50μlを分取して100μlの炭酸ナトリウム（ナカライテスク社）を添加し、反応を停止させた。反応のモニターは、405nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（VersaMax；モレキュラーデバイス社）の上で測定した。
(4) Screening for glucose-tolerant β-glucosidase Glucose tolerance was screened for 13 clones of β-glucosidase positive clones obtained from the metagenomic library. Each clone grown on the agar medium was inoculated into a 96-well microplate containing 1 ml of LB-ampicillin (Nacalai Tesque) liquid medium. The plate was cultured overnight in a shaker (Tytec M BR-024) at 37 ° C. and 1000 rpm. 200 μl was fractionated from the culture solution and subjected to activity measurement in the absence of glucose (0%) and in the presence of 10% (v / v) glucose, 100 μl each. Specifically, the collected culture solution was first centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. using a centrifuge (5810R; Eppendorf), and the supernatant was removed. Next, the pellet (bacteria) was suspended in 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing 1 mM pNPG (Sigma) / and 0% or 10% glucose (Nacalai Tesque). Shake for 48 hours at 37 ° C and 1000rpm in a shaker (M BR-024; Taitec), then centrifuge at 4000rpm for 10 minutes at 4 ° C using a centrifuge (5810R; Eppendorf). After separation, 50 μl of the supernatant was collected and 100 μl of sodium carbonate (Nacalai Tesque) was added to stop the reaction. The reaction was monitored by measuring the absorbance at 405 nm on a microplate reader (VersaMax; Molecular Devices).
その結果、10％(v/v)グルコース存在下で活性低下を確認できない5クローン（Td-2F2、Td-2H7、Td-4E5、Td-3A5とTd-2E3）をグルコース耐性β-グルコシダーゼの遺伝子を有する形質転換体として単離した。それぞれのクローン由来のグルコース耐性β-グルコシダーゼを2F2-β-Glu、2H7-β-Glu、4E5-β-Glu、3A5-β-Glu及び2E3-β-Gluと便宜的に命名した。 As a result, 5 clones (Td-2F2, Td-2H7, Td-4E5, Td-3A5 and Td-2E3) whose activity was not confirmed in the presence of 10% (v / v) glucose were transformed into the glucose-tolerant β-glucosidase gene. It was isolated as a transformant having The glucose-tolerant β-glucosidase from each clone was named for convenience as 2F2-β-Glu, 2H7-β-Glu, 4E5-β-Glu, 3A5-β-Glu and 2E3-β-Glu.
＜実施例２＞グルコース耐性β-グルコシダーゼの同定
実施例１で得られた5クローン由来の各β-グルコシダーゼをコードする遺伝子について、その塩基配列情報を得るため、プラスミドのショットガン解析を行った。プラスミドの抽出は、大腸菌からプラスミドを抽出する常法に従った。抽出した約1μgのプラスミドをそれぞれ1ユニットのSau3AI（タカラバイオ社）を用いて室温で5分間の反応により切断し、アガロースゲル（ニッポンジーン社）電気泳動により分画した後、1〜3kbのDNA断片をMinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いてゲルから抽出した。一方、1μgのpTDCm-ccdBamを5ユニットのBamHI（NEB社）で37℃にて4時間の反応により完全消化した。pTDCm-ccdBamは、pUC系プラスミドにアンバーコドン（停止コドン）を含むccdB遺伝子をクローン化したプラスミドである。また、ccdB遺伝子は、通常の大腸菌では致死的に作用するため、この遺伝子内に目的のDNA断片が挿入されていない形質転換体はコロニーを形成できない。
<Example 2> Identification of glucose-tolerant β-glucosidase In order to obtain the base sequence information of the genes encoding each β-glucosidase derived from the 5 clones obtained in Example 1, a shotgun analysis of the plasmid was performed. Extraction of the plasmid followed the usual method of extracting a plasmid from E. coli. About 1 μg of the extracted plasmid was cleaved with 1 unit of Sau3AI (Takara Bio) at room temperature for 5 minutes, fractionated by agarose gel (Nippon Gene) electrophoresis, and then a 1 to 3 kb DNA fragment Was extracted from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN). On the other hand, 1 μg of pTDCm-ccdBam was completely digested with 5 units of BamHI (NEB) at 37 ° C. for 4 hours. pTDCm-ccdBam is a plasmid obtained by cloning a ccdB gene containing an amber codon (stop codon) into a pUC plasmid. In addition, since the ccdB gene acts lethally in normal E. coli, a transformant in which the target DNA fragment is not inserted into this gene cannot form a colony.
続いて、BamHI切断したpTDCm-ccdBamの末端をアルカリホスファターゼ(タカラバイオ社)で脱リン酸化処理し、得られた開裂pTDCm-ccdBamと前記ゲル抽出したDNA断片とをT4 DNAリガーゼ（NEB社）により連結した。反応液を大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ社）に導入し、34μg/mlクロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に播種した。37℃で一晩培養した後、生育した形質転換体をランダムに96個選択し、34μg/mlクロラムフェニコール含有LB培地を入れた96穴マイクロプレートに接種した。37℃にて一晩培養し、菌体の一部を鋳型とし、GEヘルスケア社鋳型増幅キットTempliPhiを用いて添付マニュアルに従い塩基配列用の鋳型を調製した。シーケンシング反応は、BigDye（登録商標）Terminator V3.1キット（ABI社）を用いてDNAシーケンサー（PRISM 310;ABI社）により行った。 Subsequently, BamHI-cleaved pTDCm-ccdBam ends were dephosphorylated with alkaline phosphatase (Takara Bio), and the resulting cleaved pTDCm-ccdBam and the gel-extracted DNA fragment were subjected to T4 DNA ligase (NEB). Connected. The reaction solution was introduced into E. coli JM109 competent cell (Takara Bio Inc.) and seeded on an LB agar medium containing 34 μg / ml chloramphenicol. After overnight culture at 37 ° C., 96 grown transformants were randomly selected and inoculated into a 96-well microplate containing LB medium containing 34 μg / ml chloramphenicol. Cultured overnight at 37 ° C., a part of the cells was used as a template, and a template for base sequence was prepared using a template amplification kit TempliPhi from GE Healthcare according to the attached manual. The sequencing reaction was performed with a DNA sequencer (PRISM 310; ABI) using BigDye (registered trademark) Terminator V3.1 kit (ABI).
配列決定後の塩基配列をBLAST検索にかけて、既知のβ-グルコシダーゼ遺伝子と相同性の比較的高い（50%程度の相同性）ORFを推定β-グルコシダーゼとして選択した。続いて、その推定遺伝子のサブクローニングを行った。遺伝子の増幅は、2F2-β-Glu遺伝子については、Td-2F2 Fwd（配列番号１３）及びTd-2F2 Rev（配列番号１４）の組み合わせで、2H7-β-Glu遺伝子については、Td-2H7 Fwd（配列番号１５）及びTd-2H7 Rev（配列番号１７）、あるいはTd-2H7 Fwd2（配列番号１６）及びTd-2H7 Rev（配列番号１７）の組み合わせで、4E5-β-Glu遺伝子については、Td-4E5 Fwd（配列番号１８）及びTd-4E5 Rev（配列番号１９）の組み合わせで、3A5-β-Glu遺伝子については、Td-3A5 Fwd（配列番号２０）及びTd-3A5 Rev（配列番号２１）の組み合わせで、そして2E3-β-Glu遺伝子については、Td-2E3 Fwd（配列番号２２）及びTd-2E3 Rev（配列番号２３）の組み合わせで行った。プライマーは、すべてオペロン社製である。増幅された断片をアガロースゲル（ニッポンジーン社）電気泳動により分画後、それぞれについて約1.5kbのDNA断片をMinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いてゲルから抽出し、30μlの水に溶解した。得られたDNA溶液を5μl分取し、断片それぞれを、2F2-β-Glu遺伝子についてはNdeI／HindIIIにより、2H7-β-Glu遺伝子についてはNdeI／EcoRIにより、4E5-β-Glu遺伝子についてはNdeI／HindIIIにより、3A5-β-Glu遺伝子についてはNdeI／XhoIにより、そして2E3-β-Glu遺伝子についてはNdeI／XhoIにより切断した。ついで、各制限酵素断片を、2F2-β-Glu遺伝子についてはNdeI／HindIII切断したpJ28aに、2H7-β-Glu遺伝子についてはNdeI／EcoRI切断したpJ28aに、4E5-β-Glu遺伝子についてはNdeI／HindIII切断したpJ29bに、3A5-β-Glu遺伝子についてはNdeI／XhoI切断したpJ29bに、そして2E3-β-Glu遺伝子についてはNdeI／XhoI切断したpJ28aに、T4 DNAリガーゼ（NEB社）を用いて連結させた。 The base sequence after sequencing was subjected to BLAST search, and an ORF having a relatively high homology with a known β-glucosidase gene (about 50% homology) was selected as a putative β-glucosidase. Subsequently, subcloning of the putative gene was performed. Amplification of the gene is a combination of Td-2F2 Fwd (SEQ ID NO: 13) and Td-2F2 Rev (SEQ ID NO: 14) for the 2F2-β-Glu gene, and Td-2H7 Fwd for the 2H7-β-Glu gene. (SEQ ID NO: 15) and Td-2H7 Rev (SEQ ID NO: 17), or a combination of Td-2H7 Fwd2 (SEQ ID NO: 16) and Td-2H7 Rev (SEQ ID NO: 17). For the 4E5-β-Glu gene, -4E5 Fwd (SEQ ID NO: 18) and Td-4E5 Rev (SEQ ID NO: 19). For 3A5-β-Glu gene, Td-3A5 Fwd (SEQ ID NO: 20) and Td-3A5 Rev (SEQ ID NO: 21) For the 2E3-β-Glu gene, Td-2E3 Fwd (SEQ ID NO: 22) and Td-2E3 Rev (SEQ ID NO: 23) were used. All primers are manufactured by Operon. The amplified fragments were fractionated by agarose gel (Nippon Gene) electrophoresis, and about 1.5 kb DNA fragments were extracted from the gel using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN) and dissolved in 30 μl of water. 5 μl of the obtained DNA solution was collected, and each of the fragments was subjected to NdeI / HindIII for the 2F2-β-Glu gene, NdeI / EcoRI for the 2H7-β-Glu gene, and NdeI for the 4E5-β-Glu gene. / HindIII, 3A5-β-Glu gene was cleaved with NdeI / XhoI, and 2E3-β-Glu gene was cleaved with NdeI / XhoI. Next, each restriction enzyme fragment was added to pJ28a cut with NdeI / HindIII for the 2F2-β-Glu gene, pJ28a cut with NdeI / EcoRI for the 2H7-β-Glu gene, and NdeI / H for the 4E5-β-Glu gene. Ligated to HindIII cleaved pJ29b with NdeI / XhoI cleaved pJ29b for 3A5-β-Glu gene and NdeI / XhoI cleaved pJ28a for 2E3-β-Glu gene using T4 DNA ligase (NEB) I let you.
なお、NdeI、EcoRI、HindIII、XhoI制限酵素はすべてNEB社製である。また、pJ28a、pJ29bは、pJExpress404（DNA2.0社製）ベクターのマルチクローニング部位を、pET28a（メルク社製）、pET29b（メルク社製）製のそれと交換したものである。大腸菌BL21(DE3)株（ニッポンジーン社）を反溶液で常法により形質転換した後、100μM IPTG（ナカライテスク社）／40μg/ml X-Glc（シグマ社）／100μg/mlアンピシリン（シグマ社）を含有するLBプレート上に塗布し、βーグルコシダーゼ活性を有するクローンのスクリーニングを行った。活性の見られたクローンを培養後、プラスミドを調製し、BigDye（登録商標）Terminator V3.１キット（ABI社）を用いてDNAシーケンサー（PRISM 310;ABI社）により塩基配列を確認した。こうして得られたプラスミドをそれぞれ「pJ28 Td-2F2 Bgl1」、「pJ28 Td-2H7 Bgl1」、「pJ28 Td-2H7 Bglmat」、「pJ29 Td-4E5 Bgl1」、「pJ29 Td-3A5 Bgl1」及び「pJ29 Td-2E3 Bgl1」と名付けた。 NdeI, EcoRI, HindIII, and XhoI restriction enzymes are all manufactured by NEB. PJ28a and pJ29b are obtained by replacing the multicloning site of the pJExpress404 (DNA2.0) vector with that of pET28a (Merck) and pET29b (Merck). After transforming Escherichia coli BL21 (DE3) strain (Nippon Gene) with an anti-solution by a conventional method, 100 μM IPTG (Nacalai Tesque) / 40 μg / ml X-Glc (Sigma) / 100 μg / ml ampicillin (Sigma) The resultant was coated on the contained LB plate, and a clone having β-glucosidase activity was screened. After culturing clones showing activity, a plasmid was prepared, and the base sequence was confirmed with a DNA sequencer (PRISM 310; ABI) using BigDye (registered trademark) Terminator V3.1 kit (ABI). The plasmids thus obtained were `` pJ28 Td-2F2 Bgl1 '', `` pJ28 Td-2H7 Bgl1 '', `` pJ28 Td-2H7 Bglmat '', `` pJ29 Td-4E5 Bgl1 '', `` pJ29 Td-3A5 Bgl1 '' and `` pJ29 Td '' -2E3 Bgl1 ".
＜実施例３＞ゲノムデータベース検索による2F2-β-Gluの好熱菌メイオサーマス ルバー（Meiothermus ruber）ホモログMru-β-Gluの同定
実施例２で決定したβ-グルコシダーゼの一つである2F2-β-Gluのアミノ酸配列をクエリーとして、NCBIゲノムデータベースをBLAST検索した。その結果、60％のアミノ酸同一性を示す配列が好熱菌Meiothermus ruberゲノム上に同定された。本遺伝子の機能は、未同定であったが、クエリーとして用いた2F2-β-Gluがβ-グルコシダーゼであることから、β-グルコシダーゼ機能を有すると推察し、Mru-β-Glu遺伝子の合成を行った。
<Example 3> Identification of 2F2-β-Glu thermophile Meiothermus ruber homolog Mru-β-Glu by genome database search 2F2-β-, one of the β-glucosidases determined in Example 2 The NCBI genome database was BLAST searched using the amino acid sequence of Glu as a query. As a result, a sequence showing 60% amino acid identity was identified on the thermophilic bacterium Meiothermus ruber genome. Although the function of this gene was unidentified, the 2F2-β-Glu used as a query was β-glucosidase, so it was assumed that it had β-glucosidase function, and synthesis of the Mru-β-Glu gene was performed. went.
＜実施例４＞Mru-β-Glu遺伝子の合成
Mru-β-Glu遺伝子については、前記BLAST検索で得られたアミノ酸配列を元に大腸菌のコドン使用頻度に合わせた塩基配列の設計を行い、それを元に遺伝子の全合成を行った。配列の最適化と全合成はGeneArt社により行われた。得られた遺伝子をNdeI、EcoRIの制限酵素で切断し、T5プロモーターにより発現誘導されるpJ28aベクターのNdeI、EcoRI部位にライゲーション法により挿入した。反応液の一部を大腸菌コンピテントセルBL21（バイオダイナミクスラボラトリー社）に導入し、100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に塗布した後、37℃で18時間培養した。生育した青色の単一コロニーから得られたプラスミドを「pJ28 Mru Bgl」と名付けた。
<Example 4> Synthesis of Mru-β-Glu gene
For the Mru-β-Glu gene, a base sequence was designed according to the codon usage frequency of E. coli based on the amino acid sequence obtained by the BLAST search, and the gene was totally synthesized based on it. Sequence optimization and total synthesis were performed by GeneArt. The obtained gene was cleaved with NdeI and EcoRI restriction enzymes, and inserted into the NdeI and EcoRI sites of the pJ28a vector induced by the T5 promoter by the ligation method. A part of the reaction solution was introduced into Escherichia coli competent cell BL21 (Biodynamics Laboratories), coated on an LB agar plate containing 100 μg / ml ampicillin, and cultured at 37 ° C. for 18 hours. The plasmid obtained from the grown blue single colony was named “pJ28 Mru Bgl”.
＜実施例５＞β-グルコシダーゼの製造
他の実施例２及び４で調製したプラスミドを、2F2-β-Glu遺伝子については大腸菌コンピテントセルJM109（ニッポンジーン社）、Mru-β-Glu、2H7-β-Glu、4E5-β-Glu、3A5-β-Glu、2E3-β-Gluについては大腸菌コンピテントセルBL21（バイオダイナミクスラボラトリー社）にそれぞれ導入し、100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に塗布した後、37℃で18時間培養した。生育した単一コロニーを、Overnight Express溶液（ノバジェン社）、100μg/mlのアンピシリンを含む100mLのLB液体培地に植菌し、37℃で17時間振とう培養した（大量培養）。培養後の菌体を5000g、10分間の遠心で回収し、湿菌体重量で1gを10mlの20mM Tris-HCl（pH8.0）に懸濁した。次に0.75mlの10×BugBuster溶液（ノバジェン社）を加え、室温で20分間穏やかに混和した。4℃にて20000gで20分間遠心（トミー精工社）した後、上清を回収した。
<Example 5> Production of β-glucosidase For the 2F2-β-Glu gene, the plasmids prepared in other Examples 2 and 4 were used for Escherichia coli competent cell JM109 (Nippon Gene), Mru-β-Glu, 2H7-β. -Glu, 4E5-β-Glu, 3A5-β-Glu, and 2E3-β-Glu were introduced into E. coli competent cell BL21 (Biodynamics Laboratory) and placed on an LB agar plate containing 100 μg / ml ampicillin. After application, the cells were cultured at 37 ° C. for 18 hours. The grown single colony was inoculated into 100 mL of LB liquid medium containing Overnight Express solution (Novagen) and 100 μg / ml ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. for 17 hours (mass culture). The cultured cells were collected by centrifugation at 5000 g for 10 minutes, and 1 g by wet cell weight was suspended in 10 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 8.0). Next, 0.75 ml of 10 × BugBuster solution (Novagen) was added and gently mixed for 20 minutes at room temperature. After centrifugation at 20000 g for 20 minutes at 4 ° C. (Tomy Seiko), the supernatant was recovered.
His-Trapカラム（1ml）（キアゲン社）を20mMリン酸ナトリウム（pH7.4）/0.5M塩化ナトリウム/20mMイミダゾール（いずれもナカライデスク社）で平衡化した後、前記上清をカラムに通した。平衡化に用いた溶液10mlでカラム内を洗浄し、イミダゾールの濃度勾配（20mM〜0.5M，20ml）をかけて、吸着蛋白質を溶出した。各画分の一部を取り出して、β-グルコシダーゼの活性を確認した。活性は、5μlの20mM pNPG/50μlのMcIlvaineバッファ（pH4.5）/20μlのddw（deionaized disti11ed water）からなる溶液に前記各画分25μl加えた計100μlの反応液について、プレートリーダー（VersaMax；モレキュラーデバイス社）により405nmにおける吸光度を測定した。これにより各プラスミドを保持する大腸菌について、以下の結果が得られた。 After equilibrating a His-Trap column (1 ml) (Qiagen) with 20 mM sodium phosphate (pH 7.4) /0.5 M sodium chloride / 20 mM imidazole (both from Nakarai Desk), the supernatant was passed through the column. . The column was washed with 10 ml of the solution used for equilibration, and an imidazole concentration gradient (20 mM to 0.5 M, 20 ml) was applied to elute the adsorbed protein. A part of each fraction was taken out and the activity of β-glucosidase was confirmed. The activity was determined using a plate reader (VersaMax; Molecular) for a total of 100 μl of the reaction mixture in which 25 μl of each fraction was added to 5 μl of 20 mM pNPG / 50 μl of McIlvaine buffer (pH 4.5) / 20 μl of ddw (deionaized disti11ed water). Absorbance at 405 nm was measured by Device Corporation. As a result, the following results were obtained for Escherichia coli carrying each plasmid.
すなわち、pJ28 Td-2H7 Bgl1を有する大腸菌からは、カラム吸着画分に全く活性が検出されず、非吸着画分にのみ活性が検出された。一方、pJ28 Td-2H7 Bglmatを保持する大腸菌からは、カラム吸着画分に活性が検出された。このことより、pJ28 Td-2H7 Bgl1はシグナルペプチドを有し、プロセッシングによりN末端のヒスチジンタグを含む領域が、酵素本体から除去されたと考えられた。これに対して、遺伝子配列から予測されたシグナルペプチド切断部位から下流の配列に対しN末端にヒスチジンタグを配したpJ28 Td-2H7 Bglmatについては、プロセッシングを受けないため、カラムに吸着したと考えられた。このことから、2H7-β-Gluの活性に必要な領域は配列番号２の30番目のアミノ酸からC末端までの配列であると結論された。さらに、pJ28 Td-2F2 Bgl1を有する大腸菌、pJ29 Td-4E5 Bgl1を有する大腸菌、pJ29 Td-3A5 Bgl1を有する大腸菌、pJ29 Td-2E3Bgl1を有する大腸菌、及びpJ29 MruBgl1を有する大腸菌からは、いずれもカラム吸着画分に活性が検出された。 That is, from E. coli having pJ28 Td-2H7 Bgl1, no activity was detected in the column-adsorbed fraction, and activity was detected only in the non-adsorbed fraction. On the other hand, activity was detected in the column-adsorbed fraction from E. coli harboring pJ28 Td-2H7 Bglmat. From this, it was considered that pJ28 Td-2H7 Bgl1 has a signal peptide, and the region containing the N-terminal histidine tag was removed from the enzyme body by processing. In contrast, pJ28 Td-2H7 Bglmat with a histidine tag at the N-terminus of the sequence downstream from the signal peptide cleavage site predicted from the gene sequence was considered to have adsorbed to the column because it was not processed. It was. From this, it was concluded that the region necessary for the activity of 2H7-β-Glu was the sequence from the 30th amino acid of SEQ ID NO: 2 to the C-terminus. Further, column adsorption from E. coli with pJ28 Td-2F2 Bgl1, E. coli with pJ29 Td-4E5 Bgl1, E. coli with pJ29 Td-3A5 Bgl1, E. coli with pJ29 Td-2E3Bgl1, and E. coli with pJ29 MruBgl1 Activity was detected in the fraction.
以後の実験では、pJ28 Td-2F2 Bgl1、pJ28 Mru Bgl、pJ28 Td-2H7 Bglmat、pJ29 Td-4E5 Bgl1、pJ29 Td-3A5 Bgl1及びpJ29 Td-2E3 Bgl1より生産された活性画分を回収し、20mM Tris-HCl（pH7.0）（ナカライテスク社）溶液とアミコンウルトラ-15限外濾過キットを用いて、5000g、15分間の遠心濃縮を3回繰り返した。その結果、20mM Tris-HCl溶液に含まれる本発明のβ‐グルコシダーゼ溶液を得た。本酵素溶液を用いて、以下の酵素学的解析を行った。 In the subsequent experiments, the active fractions produced from pJ28 Td-2F2 Bgl1, pJ28 Mru Bgl, pJ28 Td-2H7 Bglmat, pJ29 Td-4E5 Bgl1, pJ29 Td-3A5 Bgl1 and pJ29 Td-2E3 Bgl1 were recovered and 20 mM. Centrifugation at 5000 g for 15 minutes was repeated three times using a Tris-HCl (pH 7.0) (Nacalai Tesque) solution and Amicon Ultra-15 ultrafiltration kit. As a result, a β-glucosidase solution of the present invention contained in a 20 mM Tris-HCl solution was obtained. The following enzymological analysis was performed using this enzyme solution.
＜実施例６＞グルコース耐性組換え型β-グルコシダーゼの分子量の測定
前記実施例５で得られた本発明のβ‐グルコシダーゼの分子量をSDS-PAGEにより測定した。
<Example 6> Measurement of molecular weight of glucose-resistant recombinant β-glucosidase The molecular weight of β-glucosidase of the present invention obtained in Example 5 was measured by SDS-PAGE.
1μlの実施例５の酵素溶液（約2μgのタンパク質含有）、5μlの分子量マーカー（バイオラッド社）及び10μlの濃縮前の活性可溶画分を、SDS-PAGE（7.5-15%グラジエントゲル；DRC社）の各ウェルにアプライし、常法により電機泳動を行った。泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルー（CBB）で約30分間染色し、脱色液で30分間脱色した。 1 μl of the enzyme solution of Example 5 (containing about 2 μg of protein), 5 μl of the molecular weight marker (BioRad) and 10 μl of the active soluble fraction before concentration were subjected to SDS-PAGE (7.5-15% gradient gel; DRC Were applied to each well, and electrophoresis was performed by a conventional method. After electrophoresis, the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB) for about 30 minutes and decolorized with a decolorizing solution for 30 minutes.
組換え型β‐グルコシダーゼのマーカーに対する相対的な移動度は、2F2-β-Gluについては51.5kDa付近、2H7-β-Gluについては54.0kDa付近、4E5-β-Gluについては53.0kDa付近、3A5-β-Gluについては50.6kDa付近、及び2E3-β-Gluについては51.5kDa付近であった。これは、ヒスチジンタグの付加した酵素のアミノ酸配列から計算される分子量とほぼ一致していた。したがって、本発明のβ‐グルコシダーゼの分子量は、50kDa前後であることが明らかとなった。 The relative mobility of the recombinant β-glucosidase to the markers is around 51.5 kDa for 2F2-β-Glu, around 54.0 kDa for 2H7-β-Glu, around 53.0 kDa for 4E5-β-Glu, 3A5 It was around 50.6 kDa for -β-Glu and around 51.5 kDa for 2E3-β-Glu. This almost coincided with the molecular weight calculated from the amino acid sequence of the enzyme to which the histidine tag was added. Therefore, it was revealed that the β-glucosidase of the present invention has a molecular weight of around 50 kDa.
＜実施例７＞グルコース存在下におけるβ-グルコシダーゼの活性
異なるグルコース濃度下における実施例５で得られた本発明のβ‐グルコシダーゼの活性を、pNPGを基質として検証した。
<Example 7> Activity of β-glucosidase in the presence of glucose The activity of β-glucosidase of the present invention obtained in Example 5 under different glucose concentrations was verified using pNPG as a substrate.
β‐グルコシダーゼがpNPGを加水分解した際に生じるp-ニトロフェノール（pNP；4−ニトロフェノール）の遊離量を測定し、これを本酵素のグルコース生成（基質分解）活性とした。活性反応速度は、反応液の405nmにおける吸光度の変化をプレートリーダー（VersaMax；モレキュラーデバイス社）上でモニターすることによって測定した。なお、本系では、総量を170μlとした。これは、この量における光路長が0.5cmとなるため吸収の値を1cm光路に換算し易いからである。 The release amount of p-nitrophenol (pNP; 4-nitrophenol) generated when β-glucosidase hydrolyzes pNPG was measured, and this was defined as the glucose production (substrate decomposition) activity of this enzyme. The active reaction rate was measured by monitoring the change in absorbance of the reaction solution at 405 nm on a plate reader (VersaMax; Molecular Devices). In this system, the total amount was 170 μl. This is because the optical path length in this amount is 0.5 cm, and the absorption value can be easily converted to a 1 cm optical path.
反応液は、0.1μgのβ‐グルコシダーゼを含む25μlの20mM Tris-HCl(pH7.0)（酵素溶液）に50μlのMcIlvaineバッファ（2F2-β-Glu用pH5.5、Mru-β-Glu用pH5.5、2H7-β-Glu用pH4.5、4E5-β-Glu用pH5.0、3A5-β-Glu用pH6.5、2E3-β-Glu用pH5.0）を加え、これに20mMのpNPG溶液と0ｍM、62.5ｍM、125ｍM、250ｍM、500ｍM及び1M（1000ｍM）のグルコース溶液をそれぞれ組み合わせて添加し、ddwで100μlに調製した。これを、30℃で5分間反応させた後、95℃で3分間処理した。続いて、85μlの反応液を取り出し、等量のNa2CO3と混合して、総量170μlとした。この溶液の405nmにおける吸光度を上記プレートリーダーにより測定した。
The reaction solution was 25 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) containing 0.1 μg of β-glucosidase (enzyme solution) and 50 μl of McIlvaine buffer (pH 5.5 for 2F2-β-Glu,
結果を図１ａ〜図１ｆに示す。これらの図は、20ｍM pNPGにおける0ｍMグルコース、すなわちグルコース非存在下での反応速度を100％としたときの各グルコース濃度の相対活性値を示している。この結果から、本発明のβ‐グルコシダーゼは、のグルコース濃度まで、0mMのときとほぼ変わらぬ活性を保持するだけでなく、逆にグルコース存在下の方がグルコース非存在下の活性と比較して活性が増大することが明らかとなった。具体的には、20ｍM pNPGにおいて2F2-β-Gluで約9倍（比活性892％：1Mグルコース）、Mru-β-Gluで約2.5倍（比活性246％：1Mグルコース）、2H7-β-Gluで約2.2倍（比活性215％：1Mグルコース）、4E5-β-Gluで約4.7倍（比活性466％：250ｍMグルコース）、3A5-β-Gluで約1.4倍（比活性140％：500ｍMグルコース）、及び2E3-β-Gluで最大約1.2倍（比活性115％：1Mグルコース）の高い活性を有する。このように、従来活性阻害物質とされてきたグルコースによって、逆に活性が促進されるβ‐グルコシダーゼはこれまで知られておらず、これらが新規の性質を有するβ‐グルコシダーゼであることが明らかとなった。
The results are shown in FIGS. These figures show the relative activity value of each glucose concentration when the reaction rate in 0 mM glucose in 20 mM pNPG, that is, in the absence of glucose is 100%. From this result, the β-glucosidase of the present invention not only retains the activity almost the same as that at 0 mM up to the glucose concentration, but conversely in the presence of glucose compared to the activity in the absence of glucose. It became clear that activity increased. Specifically, in 20 mM pNPG, 2F2-β-Glu is about 9 times (specific activity 892%: 1M glucose), Mru-β-Glu is about 2.5 times (specific activity 246%: 1M glucose), 2H7-β- About 2.2 times with Glu (specific activity 215%: 1M glucose), about 4.7 times with 4E5-β-Glu (specific activity 466%: 250 mM glucose), about 1.4 times with 3A5-β-Glu (
＜実施例８＞pNPGを基質としたときのβ-グルコシダーゼのカイネティクス
pNPGを基質としたときの本発明のβ‐グルコシダーゼの最大初速度（Vmax）及びミカエリス定数（Km）を算出した。
Example 8 β-Glucosidase Kinetics Using pNPG as a Substrate
The maximum initial velocity (Vmax) and Michaelis constant (Km) of β-glucosidase of the present invention when pNPG was used as a substrate were calculated.
反応液は、0.01μgのβ‐グルコシダーゼを含む25μlの20mM Tris-HCl(pH7.0)（酵素溶液）に50μlのMcIlvaineバッファ（2F2-β-Glu用pH5.5、Mru-β-Glu用pH5.5、2H7-β-Glu用pH4.5、4E5-β-Glu用pH5.0、3A5-β-Glu用pH6.5、2E3-β-Glu用pH5.0）を加え、これに0.015625mM、0.03125mM、0.0625mM、0.125mM、0.25mM、0.5mMのpNPG溶液を添加し、ddwで100μlに調製した。これを、30℃で5分間反応させた後、95℃で2分間処理した。続いて、85μlの反応液を取り出し、等量のNa2CO3と混合して、総量170μlとした。この溶液の405nmにおける吸光度を上記プレートリーダーにより測定した。上記実験を3回行い、平均をとった。また、より高温でのカイネティクスを解析するため、2F2-β-Gluでは75℃で5分間、Mru-β-Gluでは65℃で5分間、2H7-β-Gluでは60℃で5分間、4E5-β-Gluでは55℃で5分間、3A5-β-Gluでは50℃で5分間、2E3-β-Gluでは60℃で5分間それぞれ反応させた後、前記30℃での方法と同様に処理をし、吸光度を測定した。
The reaction solution was 25 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) (enzyme solution) containing 0.01 μg of β-glucosidase, 50 μl of McIlvaine buffer (pH 5.5 for 2F2-β-Glu,
結果を図２ａ〜図２ｆに示す。この図から算出されるVmaxは、2F2-β-Gluで7.1±0.5 U/mg、Mru-β-Gluで11.3±0.7 U/mg、2H7-β-Gluで11.6±0.5 Unit/mg、4E5-β-Gluで34.2±1.0 U/mg、3A53A5-β-Gluで18.2±0.8 U/mg、2E3-β-Gluで33.5±1.2 U/mg、Kmは、2F2-β-Gluで193±22μM、Mru-β-Gluで112±9μM、2H7-β-Gluで84.7±6.7μM、4E5-β-Gluで423±15μM、3A5-β-Gluで140±8μM、2E3-β-Gluで269±8μMであった。 The results are shown in FIGS. 2a to 2f. Vmax calculated from this figure is 7.1 ± 0.5 U / mg for 2F2-β-Glu, 11.3 ± 0.7 U / mg for Mru-β-Glu, 11.6 ± 0.5 Unit / mg for 2H7-β-Glu, 4E5- β-Glu 34.2 ± 1.0 U / mg, 3A53A5-β-Glu 18.2 ± 0.8 U / mg, 2E3-β-Glu 33.5 ± 1.2 U / mg, Km 193 ± 22 μM with 2F2-β-Glu, 112 ± 9 μM for Mru-β-Glu, 84.7 ± 6.7 μM for 2H7-β-Glu, 423 ± 15 μM for 4E5-β-Glu, 140 ± 8 μM for 3A5-β-Glu, 269 ± 8 μM for 2E3-β-Glu Met.
＜実施例９＞セロビオース及びセロオリゴ糖を基質としたときのβ-グルコシダーゼのカイネティクス
セロビオースを基質としたとき2F2-β-Glu、Mru-β-Glu、2H7-β-Glu、4E5-β-Glu、3A5-β-Glu及び2E3-β-GluのVmax及びKmを算出した。
反応液は、0.01μgの前記各β‐グルコシダーゼを含む50μlのMcIlvaineバッファ（2F2-β-Glu用pH5.5、Mru-β-Glu用pH5.5、2H7-β-Glu用pH4.5、4E5-β-Glu用pH5.0、3A5-β-Glu用pH6.5、2E3-β-Glu用pH5.0）溶液（酵素溶液）に、50μlの基質溶液（0.15625mM、0.3125mM、0.625mM、1.25mM、2.5mM、1mM、5mM、10mMのセロビオース、又はセロオリゴ糖、すなわち、セロトリオース、セロテトラオース、若しくはセロペンタオース）を添加した。これを、2F2-β-Gluでは75℃で、Mru-β-Gluでは65℃で、2H7-β-Gluでは60℃で、4E5-β-Gluでは55℃で、3A5-β-Gluでは50℃で、2E3-β-Gluでは60℃でそれぞれ5分間反応させた後、95℃で2分間処理した。続いて酵素反応により生成された反応溶液中のグルコース量をインビトロジェン社製Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kitキットにより定量した。5μlの酵素反応液を取り出し、25μlのddwに加え、キット中の検出用反応溶液（working solution） 30μlに混合し、総量60μlとした。室温で30分間放置した後、グルコースとworking solutionとの反応により生じた蛍光を、蛍光プレートリーダー（SPECTRA max GEMINI XS ；モレキュラーデバイス社）を用いて、励起波長550nm、蛍光波長590nmの条件で測定した。上記実験を3回行い、平均をとった。
<Example 9> Kinetics of β-glucosidase using cellobiose and cellooligosaccharide as substrate 2F2-β-Glu, Mru-β-Glu, 2H7-β-Glu, 4E5-β-Glu when cellobiose is used as a substrate Vmax and Km of 3A5-β-Glu and 2E3-β-Glu were calculated.
The reaction solution was 50 μl of McIlvaine buffer containing 0.01 μg of each β-glucosidase (pH 5.5 for 2F2-β-Glu, pH 5.5 for Mru-β-Glu, pH 4.5 for 2H7-β-Glu, 4E5 -pH 5.0 for β-Glu, pH 6.5 for 3A5-β-Glu, pH 5.0 for 2E3-β-Glu) (enzyme solution), 50 μl of substrate solution (0.15625 mM, 0.3125 mM, 0.625 mM, 1.25 mM, 2.5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM cellobiose or cellooligosaccharide, ie cellotriose, cellotetraose, or cellopentaose) was added. This is 75 ° C for 2F2-β-Glu, 65 ° C for Mru-β-Glu, 60 ° C for 2H7-β-Glu, 55 ° C for 4E5-β-Glu, 50 for 3A5-β-Glu. At 2 ° C., 2E3-β-Glu was reacted at 60 ° C. for 5 minutes, and then treated at 95 ° C. for 2 minutes. Subsequently, the amount of glucose in the reaction solution produced by the enzyme reaction was quantified using an Amplex Red Glucose / Glucose Oxidase Assay Kit kit manufactured by Invitrogen. 5 μl of the enzyme reaction solution was taken out, added to 25 μl of ddw, and mixed with 30 μl of the detection reaction solution in the kit to make a total amount of 60 μl. After standing at room temperature for 30 minutes, the fluorescence generated by the reaction between glucose and the working solution was measured using a fluorescence plate reader (SPECTRA max GEMINI XS; Molecular Devices) under conditions of an excitation wavelength of 550 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm. . The above experiment was performed three times and the average was taken.
2F2-β-Glu、Mru-β-Glu、2H7-β-Glu、4E5-β-Glu、3A5-β-Glu及び2E3-β-Gluの結果をそれぞれ表１〜６に示す。 The results of 2F2-β-Glu, Mru-β-Glu, 2H7-β-Glu, 4E5-β-Glu, 3A5-β-Glu and 2E3-β-Glu are shown in Tables 1 to 6, respectively.
表１〜６に示すように本発明の前記６つのβ‐グルコシダーゼ（2F2-β-Glu、Mru-β-Glu、2H7-β-Glu、4E5-β-Glu、3A5-β-Glu及び2E3-β-Glu）は、既知の多くのβ‐グルコシダーゼで見られる性質、すなわちpNGPに対して高い活性を有するが、セロビオースやセロオリゴ糖に対しては活性が低いという性質は見られず、むしろpNGPよりもセロビオースやセロオリゴ糖に対して同等あるいはそれ以上の活性を示すという性質を示すことが明らかとなった。 As shown in Tables 1 to 6, the six β-glucosidases of the present invention (2F2-β-Glu, Mru-β-Glu, 2H7-β-Glu, 4E5-β-Glu, 3A5-β-Glu and 2E3- β-Glu) has a property that is seen in many known β-glucosidases, that is, it has a high activity against pNGP, but it does not have a property that it has low activity against cellobiose and cellooligosaccharide, rather than pNGP. It has also been revealed that it exhibits the same or higher activity against cellobiose and cellooligosaccharide.
既知のβ-グルコシダーゼの中には、高濃度の基質により阻害を受けることが知られているものがある。そこで、一例として、2H7-β-Gluを用いて高濃度のセロビオース存在下における酵素活性の基質依存性を検証した。その結果、セロビオース濃度が100mMであっても、基質阻害の影響を受けないことが判明した。このように、本願記載の酵素は、基質、生成物のいずれにも阻害を受けない特異な性質を有する酵素である。 Some known β-glucosidases are known to be inhibited by high concentrations of substrates. As an example, 2H7-β-Glu was used to verify the substrate dependence of enzyme activity in the presence of high concentrations of cellobiose. As a result, it was found that even if the cellobiose concentration was 100 mM, it was not affected by substrate inhibition. Thus, the enzyme described in the present application is an enzyme having a unique property that is not inhibited by any of the substrate and the product.
また、表７に、本発明のβ‐グルコシダーゼ及び既知高濃度グルコース耐性β‐グルコシダーゼの各特性を示す。 Table 7 shows the characteristics of β-glucosidase of the present invention and known high-concentration glucose-resistant β-glucosidase.
表７で示すように、本願発明のβ‐グルコシダーゼ以外にも高濃度のグルコース存在下でその活性を有するβグルコシダーゼは既にいくつか知られていた。しかし、本発明のβ‐グルコシダーゼは、少なくとも表７において最も高いグルコース濃度存在下で100％の残存活性を有することが明らかとなった。すなわち、本発明のβ‐グルコシダーゼは、既知の高濃度のグルコース耐性β‐グルコシダーゼよりもその耐性が高い。また、本発明のβ‐グルコシダーゼは、従来のいずれの高濃度グルコース耐性β‐グルコシダーゼには見られない新規性質、すなわちグルコースによる活性向上という特異な性質を有することが判明した。 As shown in Table 7, in addition to the β-glucosidase of the present invention, several β-glucosidases having the activity in the presence of a high concentration of glucose have already been known. However, the β-glucosidase of the present invention was found to have a residual activity of 100% in the presence of at least the highest glucose concentration in Table 7. That is, the β-glucosidase of the present invention is more resistant than known high concentrations of glucose-tolerant β-glucosidase. Further, it has been found that the β-glucosidase of the present invention has a novel property that is not found in any conventional high-concentration glucose-tolerant β-glucosidase, that is, a unique property of improving activity by glucose.
＜実施例１０＞β-グルコシダーゼ活性のpH依存性
実施例５で得られた本発明の各β‐グルコシダーゼにおける酵素活性のpH依存性について検証した。
<Example 10> pH dependency of β-glucosidase activity The pH dependency of enzyme activity in each β-glucosidase of the present invention obtained in Example 5 was verified.
活性測定の方法は、実施例７に準じた。反応液は、0.1μgのβ‐グルコシダーゼを含む25μlの20mM Tris-HCl(pH7.0)／50mM NaCl溶液（酵素溶液）に50μlのMcIlvaineバッファ及び5μlの20mM pNPG溶液(最終濃度1mM)を混合し、ddwで100μlに調製した。前記McIlvaineバッファは、pH3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8及び8.5を調製し、各反応液に加えた。反応液を30℃で５分間反応させた後、95℃で2分間処理した。続いて、85μlの反応液を取り出し、等量のNa2CO3と混合して、総量170μlとした。この溶液の405nmにおける吸光度を上記プレートリーダーにより測定した。
The method for measuring the activity was in accordance with Example 7. The reaction solution is a mixture of 25 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) / 50 mM NaCl solution (enzyme solution) containing 0.1 μg of β-glucosidase with 50 μl of McIlvaine buffer and 5 μl of 20 mM pNPG solution (
結果を図３ａ〜ｆに示す。この図は、405nmにおける吸光度が最高値を示したpH(2F2-β-GluでpH5.5、Mru-β-GluでpH5.5、2H7-β-GluでpH4.5、4E5-β-GluでpH5.0、3A5-β-GluでpH6.5及び2E3-β-GluでpH5.0)の測定値を100％としたときの各pHにおける相対値を示している。 The results are shown in FIGS. This figure shows the highest absorbance at 405 nm (pH 5.5 for 2F2-β-Glu, pH 5.5 for Mru-β-Glu, pH 4.5 for 2H7-β-Glu, 4E5-β-Glu And pH 5.0, 3A5-β-Glu, pH 6.5 and 2E3-β-Glu, pH 5.0) are shown as relative values at each pH.
＜実施例１１＞β-グルコシダーゼ活性のpH安定性
実施例５で得られた本発明の各β‐グルコシダーゼにおける酵素活性のpH安定性、すなわちpHの影響により酵素が失活しない範囲について検証した。
<Example 11> pH stability of β-glucosidase activity The pH stability of enzyme activity in each β-glucosidase of the present invention obtained in Example 5, that is, the range in which the enzyme is not inactivated due to the influence of pH was examined.
活性測定の方法は、実施例７に準じた。まず、各pH下で酵素を前処理するため0.1mgのβ‐グルコシダーゼを含む20μlの20mM Tris-HC(pH7.0)（酵素溶液）に80μlの各pHのMcIlvaineバッファ（すなわち、pH3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8及び8.5）を加えて混合し、室温で30分間処理した。続いて、10μlの処理後の溶液を取り出し、20mM Tris-HCl(pH7.0)で10倍希釈した後、これを酵素溶液として活性測定に用いた。反応液は、0.1μgのβ‐グルコシダーゼを含む25μlの前記酵素溶液に50μlの対応するpHのMcIlvaineバッファ及び5μlの20mM pNPG溶液(最終濃度1mM)を混合し、ddwで100μlに調製した。反応液を30℃で５分間反応させた後、95℃で2分間処理した。続いて、85μlの反応液を取り出し、等量のNa2CO3と混合して、総量170μlとした。この溶液の405nmにおける吸光度を上記プレートリーダーにより測定した。
The method for measuring the activity was in accordance with Example 7. First, 20 μl of 20 mM Tris-HC (pH 7.0) (enzyme solution) containing 0.1 mg of β-glucosidase to pretreat the enzyme under each pH, 80 μl of each pH of McIlvaine buffer (ie,
結果を図４ａ〜ｆに示す。この図は、pH8.5の測定値を100％としたときの各pHにおける相対値を示している。 The results are shown in FIGS. This figure shows the relative value at each pH when the measured value at pH 8.5 is 100%.
＜実施例１２＞β-グルコシダーゼ活性の温度依存性
実施例５で得られた本発明の各β‐グルコシダーゼにおける酵素活性の温度依存性について検証した。
<Example 12> Temperature dependency of β-glucosidase activity The temperature dependency of enzyme activity in each β-glucosidase of the present invention obtained in Example 5 was verified.
活性測定の方法は、実施例７に準じた。反応液は、0.1μgのβ‐グルコシダーゼを含む25μlの20mM Tris-HCl(pH7.0)（酵素溶液）に50μlのMcIlvaineバッファ(2F2-β-GluでpH5.5、Mru-β-GluでpH5.5、2H7-β-GluでpH4.5、4E5-β-GluでpH5.0、3A5-β-GluでpH6.5及び2E3-β-GluでpH5.0)及び5μlの20mM pNPG溶液(最終濃度1mM)を混合し、ddwで100μlに調製した。反応液を20℃、25℃、30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃又は75℃の各温度で5分間反応させた後、95℃で2分間処理した。続いて、85μlの反応液を取り出し、等量のNa2CO3と混合して、総量170μlとした。この溶液の405nmにおける吸光度を上記プレートリーダーにより測定した。
The method for measuring the activity was in accordance with Example 7. The reaction solution was 25 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) (enzyme solution) containing 0.1 μg of β-glucosidase, 50 μl of McIlvaine buffer (pH 5.5 with 2F2-β-Glu,
結果を図５ａ〜ｆに示す。この図は、405nmにおける吸光度が最高値を示した温度（2F2-β-Gluで75℃、Mru-β-Gluで65℃、2H7-β-Gluで55℃、4E5-β-Gluで55℃、3A5-β-Gluで50℃及び2E3-β-Gluで60℃）の測定値を100％としたときの各温度における相対値を示している。 The results are shown in FIGS. This figure shows the highest absorbance at 405 nm (75 ° C for 2F2-β-Glu, 65 ° C for Mru-β-Glu, 55 ° C for 2H7-β-Glu, 55 ° C for 4E5-β-Glu 3A5-β-Glu, 50 ° C. and 2E3-β-Glu, 60 ° C.), the relative values at each temperature are shown as 100%.
＜実施例１３＞β-グルコシダーゼ活性の温度安定性
実施例５で得られた本発明の各β‐グルコシダーゼにおける酵素活性の温度安定性、すなわち温度の影響により酵素が失活しない範囲について検証した。
<Example 13> Temperature stability of β-glucosidase activity The temperature stability of enzyme activity in each β-glucosidase of the present invention obtained in Example 5, that is, the range in which the enzyme is not inactivated due to the influence of temperature was examined.
活性測定の方法は、実施例７に準じた。まず、各温度下で酵素を前処理するため0.1mg/mlのβ‐グルコシダーゼをそれぞれ含む100μlの20mM Tris-HCl（酵素溶液）を20℃〜75℃まで5℃刻みの各温度で10分間処理し、その後、氷中に保存した。続いて、処理後の酵素溶液1μl（1μgのβ‐グルコシダーゼを含む）に24μlの20mM Tris-HCl(pH7.0)／50mM NaCl溶液、50μlのMcIlvaineバッファ(2F2-β-GluでpH5.5、Mru-β-GluでpH5.5、2H7-β-GluでpH4.5、4E5-β-GluでpH5.0、3A5-β-GluでpH6.5及び2E3-β-GluでpH5.0)及び5μlの20mM pNPG溶液(最終濃度1mM)を加えて混合し、ddwで100μlに調製した。反応液を30℃で5分間反応させた後、95℃で2分間処理した。続いて、85μlの反応液を取り出し、等量のNa2CO3と混合して、総量170μlとした。この溶液の405nmにおける吸光度を上記プレートリーダーにより測定した。
The method for measuring the activity was in accordance with Example 7. First, in order to pre-treat the enzyme at each temperature, 100 μl of 20 mM Tris-HCl (enzyme solution) each containing 0.1 mg / ml β-glucosidase was treated at 20 ° C. to 75 ° C. in 5 ° C. increments for 10 minutes. And then stored in ice. Subsequently, 1 μl of the enzyme solution after treatment (containing 1 μg β-glucosidase), 24 μl of 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) / 50 mM NaCl solution, 50 μl of McIlvaine buffer (pH 5.5 with 2F2-β-Glu, (Mru-β-Glu pH 5.5, 2H7-β-Glu pH 4.5, 4E5-β-Glu pH 5.0, 3A5-β-Glu pH 6.5 and 2E3-β-Glu pH 5.0) And 5 μl of 20 mM pNPG solution (
結果を６ａ〜ｆに示す。この図は、20℃における測定値を100％としたときの各温度における相対値を示している。 The results are shown in 6a-f. This figure shows the relative value at each temperature when the measured value at 20 ° C. is taken as 100%.
本発明のβ‐グルコシダーゼ等を用いたセルロース及び／又はヘミセルロースの糖化方法によれば、セルロース及び／又はヘミセルロースを効率的に、かつ有効に糖化することができるため、未利用物を含む自然界に存在する多種多様なセルロース資源を食糧、飼料又はバイオエタノール等のエネルギー資源に変換することが可能となる。それ故、セルロース資源のエネルギー変換方法として、食品産業、畜産産業、エネルギー産業等の様々な分野に貢献し得る。 According to the method for saccharification of cellulose and / or hemicellulose using β-glucosidase or the like of the present invention, cellulose and / or hemicellulose can be efficiently and effectively saccharified, so that it exists in nature including unused substances. It is possible to convert a wide variety of cellulose resources into energy resources such as food, feed or bioethanol. Therefore, it can contribute to various fields such as food industry, livestock industry and energy industry as an energy conversion method for cellulose resources.
Claims (11)
（ａ）配列番号１〜５で示されるいずれか一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１〜５で示されるいずれか一のアミノ酸配列と少なくとも50%以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、又は
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたポリペプチド The β-glucosidase according to claim 1 or 2, comprising the polypeptide according to any one of the following (a) to (c).
(A) a polypeptide comprising any one amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 5,
(B) a polypeptide having at least 50% or more amino acid identity with any one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 5, or (c) an amino acid of the polypeptide according to (a) or (b) above A polypeptide in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the sequence
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| WO2014070856A3 (en) * | 2012-11-02 | 2014-07-17 | Bp Corporation North America Inc. | Thermotolerant beta-glucosidase variants |
| JP2017184722A (en) * | 2016-04-05 | 2017-10-12 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | β-GLUCOSIDASE HAVING PRODUCT INHIBITION RESISTANCE AND SUBSTRATE INHIBITION RESISTANCE, AND GENE ENCODING THE SAME |
| EP3224356A4 (en) * | 2014-11-27 | 2018-05-09 | Wilmar (shanghai) Biotechnology Research & Development Center Co., Ltd. | Methods for recombinant expression of beta-glucosidase gene |
| WO2019044887A1 (en) * | 2017-08-30 | 2019-03-07 | 国立研究開発法人理化学研究所 | NOVEL β-GLUCOSIDASE, ENZYME COMPOSITION INCLUDING SAME, AND METHOD FOR MANUFACTURING SUGAR SOLUTION USING SAME |
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2010
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