JP2011195491A - Measuring method of gtp-bonded arf6 protein and application thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、GTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチドを含むGTP結合型ARF6タンパク質の検出用試薬に関する。さらに、本発明は、前記試薬を用いたGTP結合型ARF6タンパク質の検出方法、腫瘍の性質の検査方法及び腫瘍の治療薬のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、GTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチドを含むGTP結合型ARF6タンパク質の検出用キットに関する。 The present invention relates to a reagent for detection of GTP-bound ARF6 protein comprising a peptide that specifically binds to GTP-bound ARF6 protein. Furthermore, the present invention relates to a method for detecting GTP-bound ARF6 protein using the reagent, a method for examining tumor properties, and a method for screening tumor therapeutic agents. The present invention also relates to a kit for detecting GTP-bound ARF6 protein comprising a peptide that specifically binds to GTP-bound ARF6 protein.
癌（悪性新生物）は日本人の死因としては最大のものであり、2008年の死亡原因の30%を占める。しかもこの死因率は未だ上昇傾向にあり、癌に苦しむ患者の数が増え続けることが予測される。従って、有効な癌の治療法、特に抗腫瘍剤の開発は現代医学の責務の一つであると考えられる。しかし、癌遺伝子または癌抑制遺伝子が数多く同定されているように、癌の成因は単一でなく、それぞれの腫瘍細胞の性質は多様である。そのため、抗腫瘍剤の効果は個々の腫瘍細胞の性質に大きく依存する。従って、癌の克服を目指す上では、多様なメカニズムで作用を発揮する抗腫瘍剤の幅広いレパートリーを得ることが重要である。 Cancer (malignant neoplasm) is the largest cause of death among Japanese people, accounting for 30% of the causes of death in 2008. Moreover, this cause of death is still on the rise, and it is predicted that the number of patients suffering from cancer will continue to increase. Therefore, the development of effective cancer treatments, especially the development of antitumor agents, is considered to be one of the duties of modern medicine. However, as many oncogenes or tumor suppressor genes have been identified, the cause of cancer is not single, and the nature of each tumor cell varies. Therefore, the effect of an antitumor agent is largely dependent on the nature of individual tumor cells. Therefore, in order to overcome cancer, it is important to obtain a wide repertoire of antitumor agents that exert their actions by various mechanisms.
近年、腫瘍細胞の移動、すなわち転移能に低分子量Gタンパク質であるARF6 が重要な働きを担っていることが報告されている(非特許文献1及び2)。ヒト乳癌でも、転移能の高い癌で高頻度にARF6の活性化因子の発現上昇がみられることが報告されている(非特許文献2)。またマウスを用いた実験において、ARF6が腫瘍細胞の増殖に重要であることが報告されている(非特許文献3)。 In recent years, it has been reported that ARF6, which is a low molecular weight G protein, plays an important role in tumor cell migration, that is, metastatic ability (Non-patent Documents 1 and 2). Even in human breast cancer, it has been reported that increased expression of an activator of ARF6 is frequently observed in cancer with high metastatic potential (Non-patent Document 2). In experiments using mice, it has been reported that ARF6 is important for the growth of tumor cells (Non-patent Document 3).
ARF6は細胞内情報伝達タンパク質であり、通常の細胞内ではguanosine diphosphate (GDP)と結合して休止状態（不活性型）にあるが、細胞に適当な刺激が加わると、GDPが解離してguanosine triphosphate (GTP)が結合することにより活性型になる。活性型のGTP結合型ARF6タンパク質は、様々なタンパク質と結合することにより下流に情報を伝達する。本願発明者らを含む多くの研究者が現在までに、肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor, HGF）がARF6 を活性化する（GTP結合型ARF6の量を増加させる）ことを明らかにしている(非特許文献4、5及び6)。HGFは強力な血管新生作用を有しており、一定の割合の癌組織において血管新生を担うことにより癌の増悪化を引き起こすことが知られている(非特許文献7、8及び9)。このためHGF若しくはHGF 受容体をターゲットとした抗腫瘍剤の開発が進んでおり、前臨床段階の薬物が幾つか存在する(非特許文献10)。しかし、薬物選択の幅を広げるためにも、さらに多様なHGF シグナルを阻害する候補化合物の発見が期待されている。 ARF6 is an intracellular signal transduction protein that binds to guanosine diphosphate (GDP) in normal cells and is in a dormant state (inactive form). However, when a suitable stimulus is applied to the cell, GDP dissociates and guanosine It becomes active when triphosphate (GTP) binds. The active GTP-binding ARF6 protein transmits information downstream by binding to various proteins. To date, many researchers, including the present inventors, have shown that hepatocyte growth factor (HGF) activates ARF6 (increases the amount of GTP-bound ARF6) ( Non-patent documents 4, 5 and 6). HGF has a strong angiogenic action, and is known to cause cancer progression by being responsible for angiogenesis in a certain proportion of cancer tissues (Non-Patent Documents 7, 8 and 9). For this reason, development of antitumor agents targeting HGF or HGF receptors is progressing, and there are several preclinical drugs (Non-patent Document 10). However, in order to expand the range of drug selection, discovery of candidate compounds that inhibit more diverse HGF signals is expected.
本発明者らはARF6の生理機能を解析するなかで、これらの報告とは独立に、腫瘍増殖時の血管新生にARF6が重要であることを、マウスを用いた実験系により見出した。これらの知見から、ARF6をターゲットとした化合物は、癌の増殖や転移を抑える抗腫瘍剤として有効である可能性が考えられる。従って、腫瘍発達との関連性が示唆されるGTP結合型ARF6の定量方法が重要になると考えられる。
GTP 結合型ARF6の測定法としては、現在のところGST-GGA3を用いた沈降法が知られており(非特許文献11) 、既にThermoScientific 社より製品化されている。しかし、この方法では、GST-GGA3 とARF6との結合力が比較的弱く、さらに、GGA3は他のARFファミリータンパク質と交差反応を起こすため、測定の信頼性が低いことが報告されている(非特許文献12)。
In analyzing the physiological function of ARF6, the present inventors found that ARF6 is important for angiogenesis during tumor growth independently of these reports by an experimental system using mice. Based on these findings, compounds targeting ARF6 may be effective as antitumor agents that suppress cancer growth and metastasis. Therefore, it is considered that a method for quantifying GTP-bound ARF6, which is suggested to be related to tumor development, is important.
As a method for measuring GTP-bound ARF6, a precipitation method using GST-GGA3 is currently known (Non-patent Document 11), and has already been commercialized by Thermo Scientific. However, in this method, the binding strength between GST-GGA3 and ARF6 is relatively weak, and GGA3 cross-reacts with other ARF family proteins. Patent Document 12).
このような状況から、他のARFファミリータンパク質と交差反応を起こさず、GTP結合型ARF6のみを特異的に測定する方法の開発が待たれている。そこで、本発明は、GTP結合型ARF6のみを特異的に測定する方法を提供することを目的とする。 Under such circumstances, development of a method that specifically measures only GTP-bound ARF6 without a cross-reaction with other ARF family proteins is awaited. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for specifically measuring only GTP-bound ARF6.
本発明者らは生化学的解析によりGDP 結合型ARF6又は他のARF ファミリータンパク質のいずれとも結合せず、GTP 結合型ARF6タンパク質に選択的に結合するタンパク質JIP3及びJIP4を発見した。なお、JIP3, JIP4とARF6との結合については、さらにX線結晶構造解析と表面プラズモン共鳴により、JIP4の2番目のロイシンジッパー領域（LZII；ヒトのタンパク質で392-462番目のアミノ酸）がARF6との結合に重要であることも示された(Isabet et al., EMBO J 28, 2835-2845 (2009); Montagnac et al., Curr Biol 19, 184-195 (2009))。
さらに、本発明者らは独自にJIP3のLZ領域及びJIP4のLZII領域がGTP結合型ARF6との結合に重要であり、さらに、これらの領域からなるペプチドが、GTP結合型ARF6タンパク質と非常に高い特異性を以て結合することを初めて見出した。この知見に基づき、本発明者らは、JIP3のLZ領域及びJIP4のLZII領域を用いてGTP結合型ARF6を定量する方法を開発した。
The present inventors have discovered proteins JIP3 and JIP4 that do not bind to either GDP-bound ARF6 or other ARF family proteins but selectively bind to GTP-bound ARF6 protein by biochemical analysis. As for the binding of JIP3, JIP4 and ARF6, the second leucine zipper region of JIP4 (LZII; amino acids 392-462 in human protein) is further linked to ARF6 by X-ray crystal structure analysis and surface plasmon resonance. It has also been shown to be important for binding (Isabet et al., EMBO J 28, 2835-2845 (2009); Montagnac et al., Curr Biol 19, 184-195 (2009)).
Furthermore, the present inventors independently have a JIP3 LZ region and a JIP4 LZII region that are important for binding to GTP-bound ARF6, and peptides composed of these regions are very high in GTP-bound ARF6 protein. We found for the first time to bind with specificity. Based on this finding, the present inventors have developed a method for quantifying GTP-bound ARF6 using the LIP region of JIP3 and the LZII region of JIP4.
すなわち、本発明は以下に関する。
［1］ 以下の（a）、（b）又は（c）のペプチドを含むGTP結合型ARF6タンパク質の検出用試薬。
（a）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（b）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド
（c）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド［2］ 以下の工程を含む、GTP結合型ARF6タンパク質の検出方法。
（a）被検試料と前記［1］に記載の試薬とを混合する工程
（b）混合物からGTP結合型ARF6タンパク質を検出する工程
［3］ 前記ペプチドが、不溶性の担体に結合されたものである、前記［2］に記載の方法。
［4］ GTP結合型ARF6タンパク質は、抗ARF6抗体を用いて検出される、前記［2］又は［3］に記載の方法。
［5］ 以下の工程を含む、腫瘍の性質の検査方法。
（a）患者から採取された腫瘍組織の細胞抽出物を調製する工程
（b）前記細胞抽出物と前記［1］に記載の試薬とを混合する工程
（c）混合物中のGTP結合型ARF6タンパク質の濃度を測定し、基準値と比較する工程
［6］ 前記ペプチドが、不溶性の担体に結合されたものである、前記［5］に記載の方法。
［7］ GTP結合型ARF6タンパク質は、抗ARF6抗体を用いて検出される、前記［5］又は［6］に記載の方法。
［8］ 前記腫瘍組織が、GTP結合型ARF6発現細胞を含むものである、前記［5］〜［7］のいずれか1項に記載の方法。
［9］ 前記腫瘍組織が、乳癌組織である、前記［5］〜［7］のいずれか1項に記載の方法。
［10］ 以下の工程を含む、腫瘍の治療薬のスクリーニング方法。
（a）腫瘍細胞と候補化合物とを接触させた後、前記腫瘍細胞の細胞抽出物を調製する工程
（b）前記細胞抽出物と前記［1］に記載の試薬とを混合する工程
（c）混合物中のGTP結合型ARF6タンパク質の濃度を測定し、基準値と比較する工程
［11］ 前記ペプチドが、不溶性の担体に結合されたものである、前記［10］に記載の方法。
［12］ GTP結合型ARF6タンパク質は、抗ARF6抗体を用いて検出される、前記［10］又は［11］に記載の方法。
［13］ 前記腫瘍細胞が、GTP結合型ARF6発現細胞である、前記［10］〜［12］のいずれか1項に記載の方法。
［14］ 前記腫瘍細胞が、乳癌細胞である、前記［10］〜［12］のいずれか1項に記載の方法。
［15］ 以下の（a）、（b）又は（c）のペプチドを含む、GTP結合型ARF6タンパク質の検出用キット。
（a）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（b）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド
（c）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド
That is, the present invention relates to the following.
[1] A reagent for detecting a GTP-bound ARF6 protein comprising the following peptide (a), (b) or (c):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 A peptide that specifically binds to a GTP-binding ARF6 protein (c) an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, and a GTP-binding type Peptide that specifically binds to ARF6 protein [2] A method for detecting GTP-bound ARF6 protein, comprising the following steps.
(A) A step of mixing a test sample and the reagent described in [1] (b) A step of detecting GTP-bound ARF6 protein from the mixture [3] The peptide is bound to an insoluble carrier. The method according to [2] above.
[4] The method according to [2] or [3] above, wherein the GTP-bound ARF6 protein is detected using an anti-ARF6 antibody.
[5] A method for examining the nature of a tumor, comprising the following steps.
(A) a step of preparing a cell extract of a tumor tissue collected from a patient (b) a step of mixing the cell extract with the reagent according to [1] (c) a GTP-binding ARF6 protein in the mixture [6] The method according to [5] above, wherein the peptide is bound to an insoluble carrier.
[7] The method according to [5] or [6] above, wherein the GTP-bound ARF6 protein is detected using an anti-ARF6 antibody.
[8] The method according to any one of [5] to [7], wherein the tumor tissue contains GTP-bound ARF6-expressing cells.
[9] The method according to any one of [5] to [7], wherein the tumor tissue is a breast cancer tissue.
[10] A screening method for a therapeutic agent for a tumor, comprising the following steps.
(A) a step of contacting a tumor cell with a candidate compound and then preparing a cell extract of the tumor cell (b) a step of mixing the cell extract with the reagent according to [1] (c) The step of measuring the concentration of GTP-bound ARF6 protein in the mixture and comparing it with a reference value [11] The method according to [10] above, wherein the peptide is bound to an insoluble carrier.
[12] The method according to [10] or [11] above, wherein the GTP-bound ARF6 protein is detected using an anti-ARF6 antibody.
[13] The method according to any one of [10] to [12], wherein the tumor cell is a GTP-bound ARF6-expressing cell.
[14] The method according to any one of [10] to [12], wherein the tumor cell is a breast cancer cell.
[15] A kit for detecting a GTP-bound ARF6 protein comprising the following peptide (a), (b) or (c):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 A peptide that specifically binds to a GTP-binding ARF6 protein (c) an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, and a GTP-binding type Peptides that specifically bind to ARF6 protein
本発明の試薬により、GTP結合型ARF6タンパク質を高感度に検出することができる。また、本発明の試薬を用いることにより、簡便に腫瘍の性質を検査することが可能である。さらに、本発明の試薬を用いることにより、腫瘍の治療剤を効果的にスクリーニングすることができる。 With the reagent of the present invention, GTP-bound ARF6 protein can be detected with high sensitivity. In addition, by using the reagent of the present invention, it is possible to easily examine the nature of the tumor. Furthermore, tumor therapeutic agents can be effectively screened by using the reagent of the present invention.
本発明者らは、JNK-interacting protein（JIP）であるJIP3及びJIP4のロイシンジッパー領域（それぞれLZ領域及びLZII領域）からなるペプチドが、活性型のARF6タンパク質、即ち、GTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合することを初めて見い出し、さらに、前記ペプチドを用いてGTP結合型ARF6タンパク質を高感度に検出する方法を完成させた。 The present inventors have identified a peptide consisting of leucine zipper regions (LZ region and LZII region) of JIP3 and JIP4, which are JNK-interacting proteins (JIP), as active ARF6 protein, ie, GTP-binding ARF6 protein. In addition, a method for detecting GTP-bound ARF6 protein with high sensitivity using the peptide was completed.
マウスJip3遺伝子のヌクレオチド配列（GenBank Accessoion No: AF178637）及びJIP3タンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accessoion No: AAF26843）をそれぞれ配列番号1及び2に示す。JIP3のLZ領域は、配列番号2の第424〜485番目のアミノ酸からなる領域であり、該領域をコードするヌクレオチド配列及び該領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号3及び4に示す。また、ヒトのJip3遺伝子のヌクレオチド配列（GenBank Accessoion No: BC144486）及びJIP3タンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accessoion No: AAI44487）は、配列番号5及び6に示す通りである。 The nucleotide sequence of the mouse Jip3 gene (GenBank Accessoion No: AF178637) and the amino acid sequence of the JIP3 protein (GenBank Accessoion No: AAF26843) are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. The LZ region of JIP3 is a region consisting of amino acids 424 to 485 of SEQ ID NO: 2, and the nucleotide sequence encoding the region and the amino acid sequence of the region are shown in SEQ ID NOS: 3 and 4, respectively. The nucleotide sequence of the human Jip3 gene (GenBank Accessoion No: BC144486) and the amino acid sequence of the JIP3 protein (GenBank Accessoion No: AAI44487) are as shown in SEQ ID NOs: 5 and 6.
マウスJip4遺伝子のヌクレオチド配列（GenBank Accessoion No: AF327451）及びJIP4タンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accessoion No: AAN61564）をそれぞれ配列番号7及び8に示す。JIP4のLZII領域は、配列番号10の第399〜460番目のアミノ酸からなる領域であり、該領域をコードするヌクレオチド配列及び該領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号8及び10に示す。また、ヒトのJip4遺伝子のヌクレオチド配列（GenBank Accessoion No: AY850123）及びJIP4タンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accessoion No: AAX47276）は、配列番号11及び12に示す通りである。
一方、マウスのArf6遺伝子のヌクレオチド配列（GenBank Accessoion No: NM_007481)及びARF6タンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accessoion No: NP_031507)は、それぞれ配列番号13及び14に示す通りであり、ヒトのArf6遺伝子のヌクレオチド配列（GenBank Accessoion No: NM_001663)及びARF6タンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accessoion No: NP_001654)は、それぞれ配列番号15及び16に示す通りである。
上記のポリヌクレオチド及びペプチドは、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
The nucleotide sequence of the mouse Jip4 gene (GenBank Accessoion No: AF327451) and the amino acid sequence of the JIP4 protein (GenBank Accessoion No: AAN61564) are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively. The LZII region of JIP4 is a region consisting of the 399th to 460th amino acids of SEQ ID NO: 10, and the nucleotide sequence encoding the region and the amino acid sequence of the region are shown in SEQ ID NOs: 8 and 10, respectively. The nucleotide sequence of the human Jip4 gene (GenBank Accessoion No: AY850123) and the amino acid sequence of the JIP4 protein (GenBank Accessoion No: AAX47276) are as shown in SEQ ID NOs: 11 and 12.
On the other hand, the nucleotide sequence of the mouse Arf6 gene (GenBank Accessoion No: NM_007481) and the amino acid sequence of the ARF6 protein (GenBank Accessoion No: NP_031507) are as shown in SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively. The nucleotide sequence of the human Arf6 gene The amino acid sequences of (GenBank Accessoion No: NM_001663) and ARF6 protein (GenBank Accessoion No: NP_001654) are as shown in SEQ ID NOs: 15 and 16, respectively.
The above-described polynucleotides and peptides can be obtained by the methods described in the examples below, known genetic engineering methods, known synthetic methods, and the like.
1．GTP結合型ARF6タンパク質の検出用試薬
本発明は、以下の（a）、（b）又は（c）のペプチド（以下、「本発明のペプチド」）を含むGTP結合型ARF6タンパク質の検出用試薬（以下、「本発明の試薬」）を提供する。
（a）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（b）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド（c）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド
1． Reagent for detection of GTP-bound ARF6 protein The present invention is a reagent for detection of GTP-bound ARF6 protein comprising the following peptide (a), (b) or (c) (hereinafter referred to as “the peptide of the present invention”) ( Hereinafter, “the reagent of the present invention”) is provided.
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 A peptide that specifically binds to a GTP-binding ARF6 protein (c) an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, and a GTP-binding type Peptides that specifically bind to ARF6 protein
本発明において、「ARF6タンパク質」とは、adenosine diphosphate (ADP)-ribosylation factor 6を意味する。ARF6タンパク質は、各種細胞でユビキタスに発現するグアノシン三リン酸（GTP）結合タンパク質であり、膜輸送及びアクチン細胞骨格の構成を制御する（D’Saura-Schorey C and Chavrier P, Nat Rev Mol Cell Biol 7: 347-358 (2008)、Myers KR and Casanova JE, Trends Cell Biol 18: 184-192 (2008)）。また、ARF6タンパク質は、GDP又はGTPに結合することでその立体構造が変化し、それぞれ不活性型（GDP結合型）又は活性型（GTP結合型）の形態となることが知られている。 In the present invention, “ARF6 protein” means adenosine diphosphate (ADP) -ribosylation factor 6. ARF6 protein is a guanosine triphosphate (GTP) -binding protein that is ubiquitously expressed in various cells and controls membrane transport and actin cytoskeleton organization (D'Saura-Schorey C and Chavrier P, Nat Rev Mol Cell Biol) 7: 347-358 (2008), Myers KR and Casanova JE, Trends Cell Biol 18: 184-192 (2008)). In addition, it is known that the ARF6 protein changes its three-dimensional structure by binding to GDP or GTP, and becomes inactive (GDP binding type) or active type (GTP binding type), respectively.
ARF6タンパク質をコードするARF6遺伝子は、広範囲の動物種において保存されており、複数の動物種のARF6遺伝子については既に塩基配列が解析され、その配列情報がデータベースに登録されている（表1参照）。 The ARF6 gene encoding ARF6 protein is conserved in a wide range of animal species, and the nucleotide sequences of ARF6 genes of multiple animal species have already been analyzed and their sequence information is registered in the database (see Table 1). .
従って、本発明において「ARF6遺伝子」とは、各種哺乳動物のARF6遺伝子のオーソログを含むものであり、さらに、ゲノム遺伝子だけではなく、メッセンジャーRNA（mRNA）及びcDNAも含むものである。 Accordingly, the “ARF6 gene” in the present invention includes orthologs of various mammalian ARF6 genes, and further includes not only genomic genes but also messenger RNA (mRNA) and cDNA.
本発明の試薬は、以下の以下の（a）、（b）又は（c）のペプチドを含む。
（a）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（b）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド（c）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド
The reagent of the present invention comprises the following peptide (a), (b) or (c) below.
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 A peptide that specifically binds to a GTP-binding ARF6 protein (c) an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, and a GTP-binding type Peptides that specifically bind to ARF6 protein
上記（b）又は（c）に記載のペプチドは、代表的には、野生型JIP3のLZ領域又はJIP4のLZII領域の変異アミノ酸配列を含むペプチドであるが、例えば、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487（1982）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409（1982）"、"Gene, 34, 315 （1985）"、"Nuc. Acids. Res., 13, 4431（1985）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488（1985）"等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。 The peptide described in (b) or (c) above is typically a peptide containing a mutant amino acid sequence of the LZ region of wild-type JIP3 or the LZII region of JIP4. For example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 "," Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 "," Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982) ", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)", "Gene, 34, 315 (1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)", "Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) "and the like can also be obtained artificially using the site-directed mutagenesis method.
本明細書中、「配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド」としては、配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチドが挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加の数は、一般的には小さい程好ましい。 In the present specification, “inclusive of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, and specifically binds to a GTP-binding ARF6 protein” As the `` peptide '', in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50 1-40, 1-39, 1-38, 1-37, 1-36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31 , 1-30, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21 1-20 pieces, 1-19 pieces, 1-18 pieces, 1-17 pieces, 1-16 pieces, 1-15 pieces, 1-14 pieces, 1-13 pieces, 1-12 pieces, 1-11 pieces , 1-10, 1-9 (1-several), 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 Or one amino acid residue is deleted, substituted or It includes a pressurized amino acid sequence, and include peptides that bind to GTP-bound ARF6 protein specifically. In general, the smaller the number of amino acid residue deletions, substitutions or additions, the better.
また、このようなペプチドとしては、配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列と60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチドが挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。 Such peptides include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, and 60% or more, 61% or more, 62% or more, 63% or more, 64% or more, 65% or more, 66% or more, 67 %, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 77%, 78%, 79% 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% or more 99.6% or higher, 99.7% or higher, 99.8% or higher, or 99.9% or higher, and a peptide that specifically binds to a GTP-binding ARF6 protein. In general, the larger the numerical value of identity, the better.
アミノ酸配列の同一性は、FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTN、BLASTXやBLASTPと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。アミノ酸配列の解析には、一般的にBLASTPが用いられ、アミノ酸配列の同一性を解析する場合であって、60％以上の同一性を有するアミノ酸を検索するときには、パラメーターは、例えばscore = 60、wordlength = 3とする。 The identity of the amino acid sequence is determined by FASTA (Science 227 (4693): 1435-1441, (1985)) or the algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) by Carlin and Arthur (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264). -2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993). Programs called BLASTN, BLASTX and BLASTP based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). For the analysis of amino acid sequences, BLASTP is generally used, and when analyzing amino acid sequence identity, when searching for amino acids having 60% or more identity, the parameters are, for example, score = 60, Let wordlength = 3.
なお、GTP結合型ARF6タンパク質との特異的な結合能は、GTP結合型ARF6タンパク質、GDP結合型ARF6タンパク質、及びARF6タンパク質と相同性の高いARFタンパク質ファミリーのいずれか（例えば、ARF1又はARF5）を発現する細胞の細胞抽出物と本発明のペプチドとを混合し、プルダウンアッセイを行うことにより確認することができる。プルダウンアッセイの結果、前記ペプチドが、GDP結合型ARF6タンパク質又はARF6以外のARFファミリータンパク質と交差反応を起こさず、本発明のペプチドの結合パートナーとしてGTP結合型ARF6タンパク質のみが検出されれば、本発明のペプチドは、GTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するものと判断することができる。 The specific binding ability to GTP-bound ARF6 protein is selected from GTP-bound ARF6 protein, GDP-bound ARF6 protein, and ARF protein family having high homology with ARF6 protein (for example, ARF1 or ARF5). It can be confirmed by mixing the cell extract of the cells to be expressed with the peptide of the present invention and conducting a pull-down assay. As a result of the pull-down assay, if the peptide does not cross-react with GDP-bound ARF6 protein or ARF family protein other than ARF6, and only GTP-bound ARF6 protein is detected as the binding partner of the peptide of the present invention, the present invention This peptide can be judged to specifically bind to the GTP-bound ARF6 protein.
マウスARF6タンパク質の第67番目のグルタミンがロイシンで置換された変異体ARF6Q67L（配列番号18）は、GTPを加水分解する能力が喪失しているため、恒常的にGTPと結合した活性状態にある（D’Souza-Schorey C et al., Science 267: 1175-1178 (1995); Peters PJ et al., J Cell Biol 128: 1003-1017 (1995)）。従って、ARF6Q67Lをコードする遺伝子（配列番号17）を適切な発現ベクター（例えば、Invitrogen社のpcDNA3ベクター）に挿入してARF6Q67L発現ベクターを作製し、該ベクターを適切な宿主細胞（例えば、HEK293T細胞等）に導入することで、GTP結合型ARF6タンパク質を発現する細胞を得ることができる。本願の実施例では、ARF6Q67LにFlagタグを付加した融合タンパク質Flag- ARF6Q67Lを用いて実験を行った。Flag-ARF6Q67LのCDS配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号19及び20に示す。 Mutant ARF6Q67L (SEQ ID NO: 18) in which the 67th glutamine of the mouse ARF6 protein is replaced with leucine has lost its ability to hydrolyze GTP, and is therefore in an active state constitutively bound to GTP ( D'Souza-Schorey C et al., Science 267: 1175-1178 (1995); Peters PJ et al., J Cell Biol 128: 1003-1017 (1995)). Accordingly, a gene encoding ARF6Q67L (SEQ ID NO: 17) is inserted into an appropriate expression vector (for example, pcDNA3 vector of Invitrogen) to prepare an ARF6Q67L expression vector, and the vector is inserted into an appropriate host cell (for example, HEK293T cell etc. ), A cell expressing GTP-bound ARF6 protein can be obtained. In the examples of the present application, experiments were performed using the fusion protein Flag-ARF6Q67L in which a Flag tag was added to ARF6Q67L. The CDS sequence and amino acid sequence of Flag-ARF6Q67L are shown in SEQ ID NOs: 19 and 20, respectively.
また、マウスARF6タンパク質の第27番目のトレオニンがアスパラギンで置換された変異体ARF6T27N（配列番号22）は、GTPと結合することができず、恒常的にGDPと結合した不活性状態にある（Macia E et al., J Cell Sci 117 (2004): 2389-2398, Peters PJ et al., J Cell Biol 128: 1003-1017 (1995)）。従って、ARF6T27Nをコードする遺伝子（配列番号21）を用いて、上記と同様にしてGDP結合型ARF6タンパク質を発現する細胞を得ることができる。本願の実施例では、ARF6T27NにFlagタグを付加した融合タンパク質Flag- ARF6T27Nを用いて実験を行った。Flag- ARF6T27NのCDS配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号23及び24に示す。 In addition, the mutant ARF6T27N (SEQ ID NO: 22) in which the 27th threonine of the mouse ARF6 protein is replaced with asparagine cannot bind to GTP, and is in an inactive state constitutively binding to GDP (Macia E et al., J Cell Sci 117 (2004): 2389-2398, Peters PJ et al., J Cell Biol 128: 1003-1017 (1995)). Therefore, using the gene encoding ARF6T27N (SEQ ID NO: 21), cells expressing the GDP-bound ARF6 protein can be obtained in the same manner as described above. In the examples of the present application, experiments were performed using the fusion protein Flag-ARF6T27N in which a Flag tag was added to ARF6T27N. The CDS sequence and amino acid sequence of Flag-ARF6T27N are shown in SEQ ID NOs: 23 and 24, respectively.
さらに、ARF6以外のARFタンパク質（例えば、ARF1〜5）のいずれかをコードする遺伝子を用いて、上記と同様にして、ARF6以外のARFタンパク質を発現する細胞を得ることができる。ARF6以外のARFタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列情報は、GenBank等の配列データベースから入手することが可能であり、例えば、マウスのArf1及びArf5遺伝子（それぞれ配列番号25及び26）は、それぞれGenBankにD87898及びD87902のAccession Numberで登録されている。また、マウスのARF1及びARF 5タンパク質のアミノ酸配列（それぞれ配列番号27及び28）の第71番目の グルタミンがロイシンで置換された変異体ARF1Q71L及びARF5Q71L（アミノ酸配列は、それぞれ配列番号30及び32）は、それぞれARF1及びARF5タンパク質の活性型変異体である。従って、本発明のペプチドのGTP結合型ARF6タンパク質との特異的な結合能を確認するためには、本発明のペプチドが、GDP結合型ARF6タンパク質だけではなく、ARF1Q71L及びARF5Q71Lのいずれとも交差反応を示さないことも確認しておくことが好ましい。ARF1Q71L及びARF5Q71Lは、それぞれ配列番号29及び31に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて、組換え発現させることができる。本願の実施例では、Flagタグを付加した融合タンパク質Flag-ARF1Q71L（CDS配列：配列番号33、アミノ酸配列：配列番号34）及びFlag-ARF5Q71L（CDS配列：配列番号35、アミノ酸配列：配列番号36）を用いた。 Furthermore, cells expressing an ARF protein other than ARF6 can be obtained in the same manner as described above using a gene encoding any of ARF proteins other than ARF6 (for example, ARF1 to 5). Nucleotide sequence information of genes encoding ARF proteins other than ARF6 can be obtained from sequence databases such as GenBank. For example, mouse Arf1 and Arf5 genes (SEQ ID NOs: 25 and 26, respectively) are available in GenBank. It is registered with the Accession Number of D87898 and D87902. In addition, mutants ARF1Q71L and ARF5Q71L in which the 71st glutamine of the mouse ARF1 and ARF5 protein amino acid sequences (SEQ ID NOs: 27 and 28, respectively) are substituted with leucine (amino acid sequences are SEQ ID NOS: 30 and 32, respectively) are Are active variants of the ARF1 and ARF5 proteins, respectively. Therefore, in order to confirm the specific binding ability of the peptide of the present invention to the GTP-bound ARF6 protein, the peptide of the present invention cross-reacts not only with the GDP-bound ARF6 protein but also with any of ARF1Q71L and ARF5Q71L. It is preferable to confirm that it is not shown. ARF1Q71L and ARF5Q71L can be recombinantly expressed using polynucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 29 and 31, respectively. In the examples of the present application, the fusion proteins Flag-ARF1Q71L (CDS sequence: SEQ ID NO: 33, amino acid sequence: SEQ ID NO: 34) and Flag-ARF5Q71L (CDS sequence: SEQ ID NO: 35, amino acid sequence: SEQ ID NO: 36) to which a Flag tag is added. Was used.
プルダウンアッセイは公知の方法に基づいて行うことができ、その詳細については、本願の実施例を参照してもよく、あるいは、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487（1982）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409（1982）"、"Gene, 34, 315 （1985）"、"Nuc. Acids. Res., 13, 4431（1985）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488（1985）"に記載の方法を参照してもよい。 The pull-down assay can be performed based on a known method, and details thereof may be referred to the examples of the present application, or “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor” Laboratory Press 2001 "," Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 "," Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982) "," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, " 79, 6409 (1982) "," Gene, 34, 315 (1985) "," Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) "," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 ( 1985) ".
GTP結合型ARF6タンパク質との特異的な結合能は、上記のプルダウンアッセイ以外にも、Yeast Two Hybrid法、Mammalian Two Hybrid法、Biacore法、ELISA法等によって確認することができる。 The specific binding ability to the GTP-bound ARF6 protein can be confirmed by the Yeast Two Hybrid method, the Mammalian Two Hybrid method, the Biacore method, the ELISA method, etc. in addition to the pull-down assay described above.
本発明において、1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加された形態としては、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加が生じていてもよく、欠失、置換及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。また、アミノ酸残基の付加が生じている場合、該アミノ酸残基は、アミノ酸配列中に挿入される態様で付加されていてもよく、あるいはアミノ酸配列のN末端又はC末端に付加されていてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸；C群：アスパラギン、グルタミン；D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2，4−ジアミノブタン酸、2，3−ジアミノプロピオン酸；E群：プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン；F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；G群：フェニルアラニン、チロシン。
In the present invention, the form in which one or more amino acid residues are deleted, substituted or added is the absence of one or several amino acid residues at any position in one or a plurality of amino acid sequences in the same sequence. Loss, substitution, or addition may occur, and two or more of deletion, substitution, and addition may occur simultaneously. Further, when an amino acid residue is added, the amino acid residue may be added in such a manner that it is inserted into the amino acid sequence, or may be added to the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence. Good.
Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other. Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine; Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid; group C: asparagine, glutamine; group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid; group E : Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline; Group F: serine, threonine, homoserine; Group G: phenylalanine, tyrosine.
また、本発明のペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。 The peptide of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Alternatively, chemical synthesis can be performed using a peptide synthesizer such as Advanced Automation Peptide Protein Technologies, Perkin Elmer, Protein Technologies, PerSeptive, Applied Biosystems, or SHIMADZU.
また、本発明のペプチドは、プロテインタグを含んでいてもよい。プロテインタグは、上記（a）、（b）又は（c）に記載のアミノ酸配列のN’末端又はC’末端側のいずれに存在していてもよい。また、プロテインタグは、上記（a）、（b）又は（c）に記載のアミノ酸配列に隣接していてもよく、あるいは上記ペプチドとプロテインタグとの間に1若しくは複数個、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が介在していてもよい。プロテインタグは、被検試料が由来する動物に天然状態で存在しないアミノ酸配列を含むものであれば特に限定されないが、具体例としては、ヒスチジン、Flagペプチド、ヘマグルチニン、チオレドキシン（Trx）、可溶性促進ペプチド（Nus）、ビオチン、ペルオキシダーゼ、c-myc、ローダミングルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）及びマルトース結合タンパク質（MBP）等のアフィニティータグ、並びに、Sirius、EBFP、ECFP、CyPet、EYFP、Venus、YPet、EGFP、Azami Green、DsRed、JRed及びルシフェラーゼ等の蛍光タグが挙げられる。 The peptide of the present invention may contain a protein tag. The protein tag may be present on either the N ′ terminus or the C ′ terminus of the amino acid sequence described in (a), (b) or (c) above. The protein tag may be adjacent to the amino acid sequence described in the above (a), (b) or (c), or one or a plurality of, for example, 1 to 100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-39, 1-38, 1-37, 1-3 36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31, 1-30, 1-29, 1-28, 1-27, 1-2 26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1- 16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9 (1 to several), 1-8, 1 -7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1 amino acid residue may be interposed. The protein tag is not particularly limited as long as it contains an amino acid sequence that does not exist in a natural state in the animal from which the test sample is derived. Specific examples include histidine, Flag peptide, hemagglutinin, thioredoxin (Trx), and a solubility promoting peptide. Affinity tags such as (Nus), biotin, peroxidase, c-myc, rhodamine glutathione-S-transferase (GST) and maltose binding protein (MBP), and Sirius, EBFP, ECFP, CyPet, EYFP, Venus, YPet, EGFP , Fluorescent tags such as Azami Green, DsRed, JRed, and luciferase.
上記プロテインタグを、本発明のペプチドに付加する方法としては、上記プロテインタグをコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの5’側又は3’側に本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドとを、融合タンパク質として発現可能な配置（in frame）で適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適切な宿主細胞に導入して前記プロテインタグと本発明のペプチドを含む融合タンパク質を発現させる方法が挙げられる。あるいは、上記プロテインタグが付加された本発明のペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法、又は、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用した化学合成によっても製造可能である。 As a method for adding the protein tag to the peptide of the present invention, a polynucleotide encoding the protein tag and a polynucleotide encoding the peptide of the present invention on the 5 ′ side or 3 ′ side of the polynucleotide, Examples include a method in which a fusion protein containing the above-described protein tag and the peptide of the present invention is expressed by inserting the vector into an appropriate host cell in an appropriate frame so that the fusion protein can be expressed (in frame). . Alternatively, the peptide of the present invention to which the above protein tag is added may be obtained by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), or Advanced Automation Peptide Protein Technologies. It can also be produced by chemical synthesis using a peptide synthesizer such as the company, Perkin Elmer, Protein Technologies, PerSeptive, Applied Biosystems, or SHIMADZU.
2．GTP結合型ARF6タンパク質の検出方法
本発明の試薬に含まれるペプチド（本発明のペプチド）は、GTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するので、該ペプチドを用いることにより、GTP結合型ARF6タンパク質を特異的に検出することができる。
従って、本発明は、以下の工程を含む、GTP結合型ARF6タンパク質の検出方法を提供する。
（a）被検試料と本発明の試薬とを混合する工程
（b）混合物からGTP結合型ARF6タンパク質を検出する工程
2． Method for detecting GTP-bound ARF6 protein The peptide (the peptide of the present invention) contained in the reagent of the present invention specifically binds to the GTP-bound ARF6 protein. It can be specifically detected.
Accordingly, the present invention provides a method for detecting GTP-bound ARF6 protein, which comprises the following steps.
(A) A step of mixing the test sample and the reagent of the present invention (b) A step of detecting GTP-binding ARF6 protein from the mixture
上記工程（a）は、具体的には、被検試料に本発明の試薬を添加することにより実施することができる。本発明のペプチドは、GTP結合型ARF6タンパク質に特異的に結合することを特徴とする。ゆえに、被検試料にGTP結合型ARF6タンパク質が含まれている場合、本発明の試薬に含まれるペプチドが、GTP結合型ARF6タンパク質と接触すれば、前記タンパク質と本発明のペプチドとの複合体が形成される。従って、形成された複合体から、容易にGTP結合型ARF6タンパク質を検出することができる。前記複合体は、検出に先立って、被検試料及び本発明の試薬を含む混合物から回収されていることが好ましい。 Specifically, the step (a) can be carried out by adding the reagent of the present invention to a test sample. The peptide of the present invention is characterized by specifically binding to GTP-bound ARF6 protein. Therefore, when the test sample contains a GTP-bound ARF6 protein, if the peptide contained in the reagent of the present invention comes into contact with the GTP-bound ARF6 protein, a complex of the protein and the peptide of the present invention is formed. It is formed. Therefore, GTP-bound ARF6 protein can be easily detected from the formed complex. Prior to detection, the complex is preferably recovered from a mixture containing the test sample and the reagent of the present invention.
本発明の方法は、GTP結合型ARF6タンパク質及び本発明のペプチドの分解を防ぐ観点から、常温（25℃前後）以下、好ましくは、15℃、10℃、8℃、5℃以下で行われ、最も好ましくは4±1℃で行われる。 The method of the present invention is performed at room temperature (around 25 ° C.) or less, preferably 15 ° C., 10 ° C., 8 ° C., 5 ° C. or less from the viewpoint of preventing degradation of the GTP-bound ARF6 protein and the peptide of the present invention. Most preferably, it is performed at 4 ± 1 ° C.
また、工程（a）の混合に先立って、本発明のペプチドをブロッキング剤（種々のタンパク質を含む混合物：例えば、血清、スキムミルク等）と混合してブロッキング処理してもよい。あるいは、被検試料、本発明のペプチド及びブロッキング剤を全て混合した混合物中で工程（b）を行ってもよい。 Prior to mixing in the step (a), the peptide of the present invention may be mixed with a blocking agent (mixture containing various proteins: for example, serum, skim milk, etc.) for blocking treatment. Or you may perform a process (b) in the mixture which mixed all the test samples, the peptide of this invention, and the blocking agent.
本発明において、「被検試料」とは、組織、細胞、粘膜、血液成分（血清、血漿、血球細胞）、唾液、尿、糞便、汗、体毛、乳汁等の生体に由来するサンプルであってもよく、又は培養組織若しくは細胞、培養細胞の抽出物、培養上清等の培養組織若しくは細胞に由来するサンプルであってもよい。 In the present invention, the “test sample” is a sample derived from a living body such as tissue, cells, mucous membranes, blood components (serum, plasma, blood cells), saliva, urine, feces, sweat, body hair, milk and the like. Alternatively, it may be a sample derived from a cultured tissue or cell such as a cultured tissue or cell, an extract of a cultured cell, or a culture supernatant.
本発明のペプチドは、好ましくは、不溶性の担体に結合されている。本発明のペプチドが不溶性の担体に結合されている場合、前記担体及び本発明のペプチド及びGTP結合型ARF6タンパク質からなる複合体を、洗浄によって液体混合物から容易に回収することができる。不溶性の担体としては、例えば、培養プレート、樹脂ビーズ（セファロースビーズ又はアガロースビーズ等）、カラム樹脂等が挙げられる。 The peptide of the present invention is preferably bound to an insoluble carrier. When the peptide of the present invention is bound to an insoluble carrier, the complex consisting of the carrier and the peptide of the present invention and the GTP-bound ARF6 protein can be easily recovered from the liquid mixture by washing. Examples of insoluble carriers include culture plates, resin beads (sepharose beads or agarose beads), column resins, and the like.
上記担体は、プロテインタグを介することにより、より容易に本発明のペプチドに結合させることができる。プロテインタグの具体例は先に述べた通りである。このようなタグのアミノ酸配列は、サンプルが由来する動物の体内には存在しないものであるから、該タグを認識する抗体であって、不溶性担体と結合した抗体を用いて、タグと抗体との間で抗原抗体反応を起こさせれば、タグを介して本発明のペプチドを間接的に不溶性担体に結合させることができる。あるいは、前述のタグの具体例のうち、GST及びMBP等を用いた場合には、抗体を用いることなく、直接本発明のペプチドと不溶性担体（グルタチオン・セファロース、デキストリン・セファロース又はアミロース樹脂等）とを結合させることができる。 The carrier can be more easily bound to the peptide of the present invention via a protein tag. Specific examples of protein tags are as described above. Since the amino acid sequence of such a tag does not exist in the body of the animal from which the sample is derived, an antibody that recognizes the tag and that binds to an insoluble carrier is used. If an antigen-antibody reaction is caused between them, the peptide of the present invention can be indirectly bound to an insoluble carrier via a tag. Alternatively, among the specific examples of the aforementioned tags, when GST, MBP, or the like is used, the peptide of the present invention and an insoluble carrier (glutathione / sepharose, dextrin / sepharose, amylose resin, etc.) can be directly used without using an antibody. Can be combined.
前記担体と前記複合体との結合体の洗浄に適切な洗浄液の例としては、中性領域の緩衝能を持つバッファー（例えば、Tris-HCl（pH7.5）、HEPES（pH7.2））と適切な界面活性剤（例えば、SDS、SCS等）とを混合した混合液が挙げられる。 Examples of washing solutions suitable for washing the conjugate of the carrier and the complex include buffers having a buffer capacity in the neutral region (for example, Tris-HCl (pH 7.5), HEPES (pH 7.2)) Examples thereof include a mixed solution in which an appropriate surfactant (for example, SDS, SCS, etc.) is mixed.
本発明において、「検出」は、質量分析、各種クロマトグラフィー又は各種免疫化学アッセイ等により行うことが可能であるが、好ましくは、抗ARF6抗体を用いた免疫化学アッセイにより検出される。免疫化学アッセイの具体例としては、Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)、ウェスタンブロッティング、プロテインチップアッセイ等が挙げられる。 In the present invention, “detection” can be performed by mass spectrometry, various chromatographies, various immunochemical assays, or the like, but is preferably detected by an immunochemical assay using an anti-ARF6 antibody. Specific examples of the immunochemical assay include Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Western blotting, protein chip assay and the like.
3．腫瘍の性質の検査方法
ARF6タンパク質は、腫瘍細胞の転移能において重要な働きを担っていることが示唆されており（Hashimoto et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 6647-6652 (2004); Sabe et al., Traffic 10, 982-993 (2009)）、ヒト乳癌でも、転移能の高い癌で高頻度にARF6の活性化因子の発現上昇が観察されている（Sabe et al., Traffic 10, 982-993 (2009)）。また、本発明者らはARF6 の生理機能を解析するなかで、これらの報告とは独立に、腫瘍増殖時の血管新生にARF6 が重要であることを見い出している。以上の知見は、腫瘍の発生、増殖性、転移能を含む様々な性質とARF6タンパク質の活性が、密接に関連していることを示すものである。ゆえに、腫瘍に含まれるGTP結合型ARF6タンパク質を定量することにより、悪性度及び転移能等といった腫瘍の性質を検査することができる。
3． Tumor characterization method
ARF6 protein has been suggested to play an important role in the metastatic potential of tumor cells (Hashimoto et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 6647-6652 (2004); Sabe et al., Traffic 10 , 982-993 (2009)), even in human breast cancer, increased expression of ARF6 activator has been observed frequently in highly metastatic cancers (Sabe et al., Traffic 10, 982-993 (2009)). ). Furthermore, the present inventors have found that ARF6 is important for angiogenesis during tumor growth independently of these reports in analyzing the physiological function of ARF6. These findings indicate that various properties including tumor development, proliferative ability, and metastatic potential are closely related to the activity of ARF6 protein. Therefore, by quantifying the GTP-binding ARF6 protein contained in the tumor, the properties of the tumor such as malignancy and metastatic potential can be examined.
従って、本発明は、以下の工程を含む、腫瘍の性質の検査方法を提供する。
（a）患者から採取された腫瘍組織の細胞抽出物を調製する工程
（b）前記細胞抽出物と本発明の試薬とを混合する工程
（c）混合物中のGTP結合型ARF6タンパク質の濃度を測定し、基準値と比較する工程
Therefore, the present invention provides a method for examining tumor properties, which comprises the following steps.
(A) a step of preparing a cell extract of a tumor tissue collected from a patient (b) a step of mixing the cell extract with the reagent of the present invention (c) measuring the concentration of GTP-binding ARF6 protein in the mixture And comparing with the reference value
本発明において、検査の対象となる腫瘍の種類は、特に限定されず、良性腫瘍又は悪性腫瘍のいずれでもよい。このような腫瘍の例としては、（1）骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫、（2）乳癌腫、肺癌腫、膀胱癌腫、甲状腺癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、結腸直腸癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、肝臓癌腫、子宮癌腫、子宮頸癌腫、卵巣癌腫等の癌腫、（3）ホジキンや非ホジキンリンパ腫等のリンパ腫、（4）神経芽細胞腫、（5）メラノーマ、（6）ミエローマ、（7）ウィルムス腫瘍、（8）急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性リンパ性白血病（ALL）及び慢性リンパ性白血病（CLL）等の白血病、（9）グリオーマ、（10）網膜芽細胞腫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、腫瘍は、血管新生を伴う腫瘍であり、最も好ましくは、ARF6を発現している腫瘍である。ヒト乳癌では、転移能とARF6の活性化因子の発現上昇との関連性が報告されており（Sabe et al., Traffic 10, 982-993 (2009)）、本発明の方法は、ヒト乳癌の性質の検査に特に有用である。 In the present invention, the type of tumor to be examined is not particularly limited and may be a benign tumor or a malignant tumor. Examples of such tumors include (1) sarcomas such as osteosarcoma and soft tissue sarcomas, (2) breast cancer, lung carcinoma, bladder carcinoma, thyroid carcinoma, prostate carcinoma, colon carcinoma, colorectal carcinoma, pancreatic carcinoma, Gastric carcinoma, liver carcinoma, uterine carcinoma, cervical carcinoma, ovarian carcinoma, etc., (3) lymphoma such as Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma, (4) neuroblastoma, (5) melanoma, (6) myeloma, ( 7) Wilms tumor, (8) Leukemia such as acute myeloid leukemia (AML), chronic myeloid leukemia (CML), acute lymphocytic leukemia (ALL) and chronic lymphocytic leukemia (CLL), (9) glioma, (10 ) Retinoblastoma and the like, but not limited thereto. Preferably, the tumor is a tumor with angiogenesis, most preferably a tumor expressing ARF6. In human breast cancer, an association between metastatic potential and increased expression of an activator of ARF6 has been reported (Sabe et al., Traffic 10, 982-993 (2009)). It is particularly useful for property inspection.
本発明の方法により検査される「腫瘍の性質」とは、上記腫瘍の増殖率、進行度、悪性度、転移能、再発能といった腫瘍細胞の各種性質を意味する。好ましくは、腫瘍の性質は、悪性度、転移能及び再発能であり、さらに好ましくは転移能である。 “Tumor properties” examined by the method of the present invention means various properties of tumor cells such as the growth rate, progression, malignancy, metastatic potential, and recurrence potential of the tumor. Preferably, the nature of the tumor is malignancy, metastatic potential and recurrence potential, more preferably metastatic potential.
本発明において、患者は、腫瘍を有する哺乳動物であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。 In the present invention, the patient is not particularly limited as long as it is a mammal having a tumor, but is preferably a human.
患者から腫瘍組織を採取する方法は、腫瘍の種類に応じて変化するが、一般的には、採血、バイオプシー、採尿、採便又は腫瘍の外科的切除が挙げられる。このように採取された腫瘍組織から、細胞抽出物を調製するが、細胞抽出物は、採取した腫瘍に含まれる細胞（初代腫瘍細胞）から直接調製してもよく、あるいは、採取した腫瘍に含まれる細胞を適切な条件で培養した後に、初代腫瘍細胞から1又は複数回の細胞***によって生じた細胞から調製してもよい。初代腫瘍細胞又は初代腫瘍細胞から細胞***によって生じた細胞を回収し、超音波破砕、細胞溶解剤の添加、ホモジェナイジング等によって細胞抽出物を得ることができる。細胞抽出物には、タンパク質の分解を防ぐために、プロテアーゼインヒビターが添加されていてもよい。また、細胞抽出物は、冷凍保存（好ましくは、-80℃以下の温度で）した後に、本発明の方法に用いてもよい。細胞抽出物の調製方法の詳細については、以下を参照できる。"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997" The method of collecting tumor tissue from a patient varies depending on the type of tumor, and generally includes blood collection, biopsy, urine collection, stool collection, or surgical excision of a tumor. A cell extract is prepared from the tumor tissue collected in this way, but the cell extract may be prepared directly from the cells contained in the collected tumor (primary tumor cells) or contained in the collected tumor. Cells may be prepared from cells produced by one or more cell divisions from primary tumor cells after culturing the cells to be cultured under appropriate conditions. Primary tumor cells or cells produced by cell division from primary tumor cells can be collected, and cell extracts can be obtained by ultrasonic disruption, addition of cell lysing agents, homogenizing, and the like. A protease inhibitor may be added to the cell extract in order to prevent protein degradation. In addition, the cell extract may be stored in a frozen state (preferably at a temperature of −80 ° C. or lower) and then used in the method of the present invention. For details of the method for preparing the cell extract, reference can be made to the following. "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"
本発明の方法は、GTP結合型ARF6タンパク質及び本発明のペプチドの分解を防ぐ観点から、常温（25℃前後）以下、好ましくは、15℃、10℃、8℃、5℃以下で行われ、最も好ましくは4±1℃で行われる。 The method of the present invention is performed at room temperature (around 25 ° C.) or less, preferably 15 ° C., 10 ° C., 8 ° C., 5 ° C. or less from the viewpoint of preventing degradation of the GTP-bound ARF6 protein and the peptide of the present invention. Most preferably, it is performed at 4 ± 1 ° C.
また、工程（b）の混合に先立って、本発明のペプチドをブロッキング剤と混合してブロッキング処理してもよい。あるいは、細胞抽出物、本発明のペプチド及びブロッキング剤を全て混合した混合物中で工程（c）を行ってもよい。 Further, prior to mixing in the step (b), the peptide of the present invention may be mixed with a blocking agent for blocking treatment. Or you may perform a process (c) in the mixture which mixed all the cell extracts, the peptide of this invention, and the blocking agent.
工程（c）における、GTP結合型ARF6タンパク質の濃度の測定は、上記「2．GTP結合型ARF6タンパク質の検出方法」の項目で述べたGTP結合型ARF6タンパク質の検出方法と同様の方法で行うことができる。 The concentration of the GTP-bound ARF6 protein in step (c) should be measured by the same method as the method for detecting the GTP-bound ARF6 protein described in the section “2. Detection method for GTP-bound ARF6 protein” above. Can do.
このようにして測定したGTP結合型ARF6タンパク質の濃度を、基準値と比較することにより、腫瘍の性質を検査することができる。具体的には、測定されたGTP結合型ARF6タンパク質の濃度が基準値よりも高い場合には、前記腫瘍は、増殖率、進行度、悪性度、転移能若しくは再発能又はこれらの組合せが高く、症状が深刻であると判断することができる。反対に、測定されたGTP結合型ARF6タンパク質の濃度が基準値以下である場合には、前記腫瘍は、増殖率、進行度、悪性度、転移能若しくは再発能又はこれらの組合せが低く、高い治療効果が得られると判断することができる。 By comparing the concentration of GTP-bound ARF6 protein thus measured with a reference value, the nature of the tumor can be examined. Specifically, when the measured concentration of GTP-bound ARF6 protein is higher than a reference value, the tumor has a high growth rate, degree of progression, malignancy, metastatic or recurrent ability, or a combination thereof, It can be judged that the symptom is serious. On the other hand, if the measured concentration of GTP-conjugated ARF6 protein is below the reference value, the tumor has a low growth rate, progression, malignancy, metastatic or recurrent ability, or a combination thereof and high treatment. It can be determined that an effect can be obtained.
本発明において、「基準値」は、同一の患者の腫瘍と同一組織に含まれる正常細胞中のGTP結合型ARF6タンパク質濃度であってもよく、又は同一患者から過去に採取した同一組織腫瘍組織中のGTP結合型ARF6タンパク質濃度であってもよい。あるいは、検査対象の腫瘍と同一種類の腫瘍に含まれるGTP結合型ARF6タンパク質の濃度について複数のデータが存在する場合には、それらのデータを統計処理して得られる平均値、標準偏差等から導き出される濃度であってもよい。
腫瘍組織中のGTP結合型ARF6タンパク質濃度の平均値、標準偏差等は、種々の統計方法によって得ることができるが、具体的には、患者の年齢、腫瘍の体積等をパラメーターとして、IBM SSPS Statistics 18（SSPS）等の統計解析ソフトでtwo-way ANOVA解析することにより求めることができる。本発明の方法の実施により得られた腫瘍組織中のGTP結合型ARF6タンパク質濃度を新たなデータとして統計解析用の母集団に加えて母数を大きくすることにより、さらに解析の精度を向上させることができる。
In the present invention, the “reference value” may be the concentration of GTP-binding ARF6 protein in normal cells contained in the same tissue as the tumor of the same patient, or in the same tissue tumor tissue collected in the past from the same patient. The concentration of GTP-bound ARF6 protein may be used. Alternatively, if there are multiple data on the concentration of GTP-binding ARF6 protein contained in the same type of tumor as the tumor to be examined, it is derived from the average value, standard deviation, etc. obtained by statistically processing these data. It may be a concentration.
The average value, standard deviation, etc. of GTP-binding ARF6 protein concentration in tumor tissue can be obtained by various statistical methods. Specifically, using the patient age, tumor volume, etc. as parameters, IBM SSPS Statistics It can be obtained by two-way ANOVA analysis using statistical analysis software such as 18 (SSPS). To further improve the accuracy of analysis by enlarging the population in addition to the population for statistical analysis as new data on the concentration of GTP-binding ARF6 protein in the tumor tissue obtained by carrying out the method of the present invention Can do.
4．腫瘍治療薬のスクリーニング方法
本発明者らは、ARF6遺伝子をノックアウトした動物を作製し、該動物の表現型を詳細に観察した結果、ARF6遺伝子の機能を阻害することにより、該動物体内の腫瘍細胞の増殖率を低下させることができることを見い出した。この知見から、ARF6遺伝子の機能阻害だけではなく、ARF6タンパク質の活性化を阻害した場合にも、該動物体内の腫瘍の増加率が低下することが予測される。このため、ARF6タンパク質の活性化を阻害する化合物、即ち、GTP結合型ARF6タンパク質の発現量を低下させる化合物は、腫瘍の増加率を低下させる作用を有するものと判断することができる。
Four. Method for screening tumor therapeutic agent The present inventors prepared an animal in which the ARF6 gene was knocked out, and observed the phenotype of the animal in detail. As a result, the function of the ARF6 gene was inhibited, thereby inhibiting tumor cells in the animal body. It has been found that the growth rate of can be reduced. From this finding, it is predicted that not only the function inhibition of the ARF6 gene but also the activation of the ARF6 protein will inhibit the increase rate of the tumor in the animal body. Therefore, a compound that inhibits the activation of ARF6 protein, that is, a compound that decreases the expression level of GTP-bound ARF6 protein can be determined to have an effect of decreasing the rate of increase in tumor.
従って、本発明は、以下の工程を含む、腫瘍の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
（a）腫瘍細胞と候補化合物とを接触させた後、前記腫瘍細胞の細胞抽出物を調製する工程
（b）前記細胞抽出物と本発明の試薬とを混合する工程
（c）混合物中のGTP結合型ARF6タンパク質の濃度を測定し、基準値と比較する工程
Therefore, the present invention provides a screening method for a therapeutic agent for tumor, which comprises the following steps.
(A) Step of preparing a cell extract of the tumor cell after contacting the tumor cell with the candidate compound (b) Step of mixing the cell extract and the reagent of the present invention (c) GTP in the mixture Measuring the concentration of bound ARF6 protein and comparing it to a reference value
本発明において、「腫瘍」は、上記「3．腫瘍の性質の検査方法」の項で述べた通りであり、「腫瘍細胞」とは、前記腫瘍に含まれる細胞を意味する。本発明においては、腫瘍細胞は、動物体内に存在する腫瘍細胞であってもよく、又はセルライン化された培養細胞であってもよい。前記動物は、腫瘍を発生する腫瘍モデル動物であってもよく、又は患者から採取した腫瘍を移植した移植モデル動物であってもよい。腫瘍モデル動物の例としては、例えば、WO2006/063182に記載の乳癌モデル動物が挙げられる。また、移植モデル動物の例としては、ヌードマウス等が挙げられる。セルライン化された培養細胞としては、例えば、ヒト肝ガン由来細胞株 のHepG2 細胞及びヒト乳腺ガン細胞株のMCF7細胞等が挙げられる。細胞腫瘍細胞は、ARF6遺伝子が発現されているものが好ましい。特に好ましくは、前記腫瘍細胞は、乳癌細胞である。 In the present invention, “tumor” is as described in the above section “3. Method for Examining Tumor Properties”, and “tumor cell” means a cell contained in the tumor. In the present invention, the tumor cell may be a tumor cell present in an animal body or may be a cell lined cultured cell. The animal may be a tumor model animal that develops a tumor, or may be a transplant model animal transplanted with a tumor collected from a patient. Examples of tumor model animals include, for example, breast cancer model animals described in WO2006 / 063182. Examples of transplant model animals include nude mice. Examples of cell-lined cultured cells include human liver cancer-derived cell line HepG2 cells and human breast cancer cell line MCF7 cells. The cell tumor cells are preferably those in which the ARF6 gene is expressed. Particularly preferably, the tumor cell is a breast cancer cell.
候補化合物は、特に限定されないが、具体例としては、ARF6の活性低下と関連性が示唆されている化合物、例えば、ARF6タンパク質のGDP/GTPサイクルのメディエーター等が考えられる。候補化合物は、ペプチド、低分子化合物、高分子化合物、これらの塩又は前駆体等のあらゆる形態にあってもよい。 Candidate compounds are not particularly limited, and specific examples include compounds that have been suggested to be associated with decreased activity of ARF6, such as mediators of the GDP / GTP cycle of ARF6 protein. Candidate compounds may be in any form such as peptides, low molecular compounds, high molecular compounds, salts or precursors thereof.
本発明において、「腫瘍細胞と候補化合物とを接触させる」とは、該候補化合物が、腫瘍細胞表面の分子と相互作用を生じさせる程度に接近するか、該分子と結合するか、又は該腫瘍細胞内に取り込まれる条件を作り出すことを意味する。腫瘍細胞が、培養細胞である場合、該細胞が接している培養培地に該候補化合物を一定濃度以上で添加することにより、該細胞と候補化合物とを接触させることができる。一方、腫瘍細胞が動物体内に存在する場合、該動物に候補化合物を一定量で投与することにより、該腫瘍細胞と候補化合物とを接触させることができる。投与経路は、特に限定はされないが、具体例としては、経口、舌下、経鼻、経肺、経消化管、経皮、点眼、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、局所注射、外科的移殖が挙げられ、好ましくは静脈内注射である。 In the present invention, “contacting a tumor cell with a candidate compound” means that the candidate compound is close enough to cause an interaction with a molecule on the surface of the tumor cell, binds to the molecule, or the tumor. It means creating conditions that are taken up into cells. When the tumor cells are cultured cells, the cells can be brought into contact with the candidate compound by adding the candidate compound at a certain concentration or higher to the culture medium in contact with the cell. On the other hand, when tumor cells are present in an animal body, the tumor cells can be brought into contact with the candidate compound by administering the animal to the animal in a certain amount. The route of administration is not particularly limited, and specific examples include oral, sublingual, nasal, pulmonary, gastrointestinal tract, transdermal, eye drop, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, Examples include local injection and surgical transplantation, preferably intravenous injection.
次に、候補化合物と接触させた腫瘍細胞の細胞抽出物を調製するが、調製方法は、上記「3．腫瘍の性質の検査方法」の項目で述べた通りである。また、腫瘍細胞が、モデル動物体内に移植されていた場合、細胞抽出物の調製に先立って、該腫瘍細胞をモデル動物から採取する必要があるが、採取方法は、上記「3．腫瘍の性質の検査方法」の項目で述べた通りである。 Next, a cell extract of tumor cells brought into contact with the candidate compound is prepared, and the preparation method is as described in the above item “3. Method for examining tumor properties”. In addition, when tumor cells have been transplanted into the model animal body, it is necessary to collect the tumor cells from the model animal prior to the preparation of the cell extract. This is as described in the item of “Inspection Method”.
本発明の方法は、GTP結合型ARF6タンパク質及び本発明のペプチドの分解を防ぐ観点から、常温（25℃前後）以下、好ましくは、15℃、10℃、8℃、5℃以下で行われ、最も好ましくは4±1℃で行われる。 The method of the present invention is performed at room temperature (around 25 ° C.) or less, preferably 15 ° C., 10 ° C., 8 ° C., 5 ° C. or less from the viewpoint of preventing degradation of the GTP-bound ARF6 protein and the peptide of the present invention. Most preferably, it is performed at 4 ± 1 ° C.
また、工程（b）の混合に先立って、本発明のペプチドをブロッキング剤と混合してブロッキング処理してもよい。あるいは、細胞抽出物、本発明のペプチド及びブロッキング剤を全て混合した混合物中で工程（c）を行ってもよい。 Further, prior to mixing in the step (b), the peptide of the present invention may be mixed with a blocking agent for blocking treatment. Or you may perform a process (c) in the mixture which mixed all the cell extracts, the peptide of this invention, and the blocking agent.
工程（c）における、GTP結合型ARF6タンパク質の濃度の測定は、上記「2．GTP結合型ARF6タンパク質の検出方法」の項目で述べたGTP結合型ARF6タンパク質の検出方法と同様の方法で行うことができる。 The concentration of the GTP-bound ARF6 protein in step (c) should be measured by the same method as the method for detecting the GTP-bound ARF6 protein described in the section “2. Detection method for GTP-bound ARF6 protein” above. Can do.
このようにして測定した複合体の濃度を、基準値と比較することにより、腫瘍の性質を検査することができる。具体的には、測定された複合体の濃度が基準値以上である場合には、候補化合物は、抗腫瘍作用を有しないものと判断することができる。反対に、測定された複合体の濃度が基準値よりも低い場合には、候補化合物は、抗腫瘍作用を有するものであり、該候補化合物の投与によって腫瘍治療効果が得られると判断することができる。 By comparing the concentration of the complex thus measured with a reference value, the nature of the tumor can be examined. Specifically, when the measured concentration of the complex is greater than or equal to a reference value, it can be determined that the candidate compound does not have an antitumor effect. On the other hand, when the measured concentration of the complex is lower than the reference value, the candidate compound has an antitumor action, and it can be determined that administration of the candidate compound can provide a tumor therapeutic effect. it can.
本発明において、「基準値」は、本発明の方法に用いた腫瘍細胞と同一株の細胞であって、候補化合物と接触させていない細胞中のGTP結合型ARF6タンパク質の濃度であってもよい。あるいは、本発明の方法に用いた腫瘍細胞と同一株の腫瘍に含まれるGTP結合型ARF6タンパク質の濃度について複数のデータが存在する場合には、そのデータを統計処理して得られる平均値、標準偏差等から導き出される濃度であってもよい。
腫瘍細胞中のGTP結合型ARF6タンパク質濃度の平均値、標準偏差等は、種々の統計方法によって得ることができるが、具体的には、候補化合物の濃度、腫瘍細胞数等をパラメーターとして、IBM SSPS Statistics 18（SSPS）等の統計解析ソフトでtwo-way ANOVA解析することにより求めることができる。本発明の方法の実施により得られた腫瘍細胞中のGTP結合型ARF6タンパク質濃度を新たなデータとして統計解析用の母集団に加えて母数を大きくすることにより、さらに解析の精度を向上させることができる。
In the present invention, the “reference value” may be the concentration of GTP-binding ARF6 protein in cells of the same strain as the tumor cells used in the method of the present invention and not in contact with the candidate compound. . Alternatively, when there are a plurality of data on the concentration of GTP-binding ARF6 protein contained in a tumor of the same strain as the tumor cell used in the method of the present invention, an average value obtained by statistically processing the data, a standard The concentration may be derived from deviation or the like.
The average value, standard deviation, etc. of the concentration of GTP-binding ARF6 protein in tumor cells can be obtained by various statistical methods. Specifically, the concentration of candidate compounds, the number of tumor cells, etc. are used as parameters, and IBM SSPS It can be obtained by two-way ANOVA analysis with statistical analysis software such as Statistics 18 (SSPS). To further improve the accuracy of the analysis by increasing the population in addition to the statistical analysis population as new data on the concentration of GTP-bound ARF6 protein in the tumor cells obtained by the implementation of the method of the present invention Can do.
本発明の具体的な態様の一例を図4に示す。最初に、ARF6の活性化を抑える（GTP結合型ARF6の産生を抑える）と考えられる候補化合物で細胞を処理する。次に、これらの細胞をウシ胎児血清又はHGF等の適切な刺激物質で刺激した後、細胞抽出液を調製する。図4Aの方法では、GSTタグとJIP-4のLZIIペプチドとのGST-LZII融合タンパク質を発現させ、GST-LZII及びグルタチオンセファロースの複合体を調製する。該複合体と細胞抽出液を混和し、インキュベーションする。GTP結合型ARF6は特異的にLZIIに結合するので、セファロースを洗浄したのち、結合したARF6の量を抗ARF6抗体を用いたWestern blot法にて検出する。図4Bの方法では、LZIIペプチドを予めマイクロプレートに固定しておき、これに、上記で調製した細胞抽出液を滴下する。インキュベーションと洗浄の後、プレートに結合したARF6の量を、抗ARF6抗体を用いた酵素抗体法にて検出する。 An example of a specific embodiment of the present invention is shown in FIG. First, the cells are treated with a candidate compound that is thought to suppress ARF6 activation (suppress production of GTP-bound ARF6). Next, after stimulating these cells with an appropriate stimulating substance such as fetal bovine serum or HGF, a cell extract is prepared. In the method of FIG. 4A, a GST-LZII fusion protein of a GST tag and a JIP-4 LZII peptide is expressed, and a complex of GST-LZII and glutathione sepharose is prepared. The complex and cell extract are mixed and incubated. Since GTP-bound ARF6 specifically binds to LZII, after the sepharose is washed, the amount of bound ARF6 is detected by Western blotting using an anti-ARF6 antibody. In the method of FIG. 4B, the LZII peptide is immobilized on a microplate in advance, and the cell extract prepared above is added dropwise thereto. After incubation and washing, the amount of ARF6 bound to the plate is detected by an enzyme antibody method using an anti-ARF6 antibody.
5．GTP結合型ARF6タンパク質の検出用キット
本発明は、本発明のペプチドを含むGTP結合型ARF6タンパク質の検出用キットを提供する。
Five. GTP-binding ARF6 Protein Detection Kit The present invention provides a GTP-binding ARF6 protein detection kit containing the peptide of the present invention.
本発明のキットにおいて、本発明のペプチドは、上記「2．GTP結合型ARF6タンパク質の検出方法」の項目で述べた不溶性の担体に結合されていてもよい。あるいは、本発明のペプチドは、上記不溶性の担体に結合されていない状態でキットに含まれていてもよく、この場合、本発明のキットは、好ましくは、上記不溶性の担体との結合を容易化するタグを含む融合タンパク質の形態で本発明のペプチドを含み、さらに好ましくは、前記ペプチドに加えて、前記タグと選択的に結合する不溶性の担体又は前記タグを特異的に認識する抗体であって、不溶性の担体と結合した抗体を含む。 In the kit of the present invention, the peptide of the present invention may be bound to an insoluble carrier described in the above item “2. Method for detecting GTP-bound ARF6 protein”. Alternatively, the peptide of the present invention may be included in the kit in a state in which it is not bound to the insoluble carrier. In this case, the kit of the present invention preferably facilitates binding to the insoluble carrier. An insoluble carrier that selectively binds to the tag or an antibody that specifically recognizes the tag, in addition to the peptide, comprising a peptide of the present invention in the form of a fusion protein comprising the tag An antibody bound to an insoluble carrier.
本発明のキットは、好ましくは、抗ARF6抗体も含み、さらに好ましくは、該抗ARF6抗体を認識する二次抗体を含む。抗ARF6抗体又は二次抗体は、検出可能なように放射性同位体、蛍光物質、発光物質又は磁気ビーズ等で修飾されていることが好ましい。 The kit of the present invention preferably also contains an anti-ARF6 antibody, more preferably a secondary antibody that recognizes the anti-ARF6 antibody. The anti-ARF6 antibody or the secondary antibody is preferably modified with a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, a magnetic bead or the like so as to be detectable.
本発明のキットは、上記の他に、ブロッキング剤、洗浄用バッファー、検出用バッファー、プロテアーゼ阻害剤、抗ARF6抗体又は二次抗体の検出用試薬、使用説明書等が含まれていてもよい。また、前記使用説明書には、特定の腫瘍細胞中のGTP結合型ARF6タンパク質濃度の基準値が記載されていてもよい。本発明のキットは、さらに、ポジティブコントロール及び/又はネガティブコントロールとして、それぞれARF6Q67L及び/又はARF6T27Nタンパク質を含んでいてもよい。 In addition to the above, the kit of the present invention may contain a blocking agent, a washing buffer, a detection buffer, a protease inhibitor, an anti-ARF6 antibody or secondary antibody detection reagent, instructions for use, and the like. Moreover, the said instruction manual may describe the reference value of the concentration of GTP-binding ARF6 protein in a specific tumor cell. The kit of the present invention may further contain ARF6Q67L and / or ARF6T27N protein as a positive control and / or a negative control, respectively.
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
方法
プラスミド
完全長JIP3及びJIP4の発現ベクターの作製
JIP3及びJIP4のcDNAは、マウス脳からそれぞれ以下のプライマーを用いてRT-PCRにより増幅した。JIP3は制限酵素EcoRIとSalIで、JIP4はBamHIとXhoIで処理した。これらをEcoRIもしくはBamHIとSalIで処理したpEGFP-C1ベクター（Invitrogen）にそれぞれ挿入し、発現ベクターpEGFP-JIP3及びpEGFP-JIP4を作製した。
JIP3：全長cDNA増幅用プライマー
フォワード：5’-CTGAATTCGCTCGAGTTATGATGGAGATCCAGATGGACGAGGGA-3’（配列番号37：下線部はBamHI認識部位）
リバース：5’-GCAGTCGACTCACTCAGGGGTGTAGGACACCTGCC-3’ （配列番号38：下線部はXhoI認識部位）
JIP4：全長cDNA増幅用プライマー
フォワード：5’-GCGGATCCGAATTCACCATGGAGCTGGAGGACGGTGT-3’（配列番号39：下線部はBamHI認識部位）
リバース：5’-ATCTCGAGTCACTCATTGCCACACATCAC-3’ （配列番号40：下線部はXhoI認識部位）
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, this invention is not limited to the aspect described in the Example.
Preparation of expression vectors for plasmid full-length JIP3 and JIP4
JIP3 and JIP4 cDNAs were amplified from mouse brain by RT-PCR using the following primers, respectively. JIP3 was treated with restriction enzymes EcoRI and SalI, and JIP4 was treated with BamHI and XhoI. These were inserted into pEGFP-C1 vector (Invitrogen) treated with EcoRI or BamHI and SalI, respectively, to produce expression vectors pEGFP-JIP3 and pEGFP-JIP4.
JIP3: Primer forward for full-length cDNA amplification: 5'-CT GAATTC GCTCGAGTTATGATGGAGATCCAGATGGACGAGGGA-3 '(SEQ ID NO: 37: underlined BamHI recognition site)
Reverse: 5'-GCA GTCGAC TCACTCAGGGGTGTAGGACACCTGCC-3 '(SEQ ID NO: 38: underlined XhoI recognition site)
JIP4: Primer forward for full-length cDNA amplification: 5'-GC GGATCC GAATTCACCATGGAGCTGGAGGACGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 39: underlined BamHI recognition site)
Reverse: 5'-AT CTCGAG TCACTCATTGCCACACATCAC-3 '(SEQ ID NO: 40: underlined portion is XhoI recognition site)
JIP4欠損変異体の発現ベクターの作製
JIP4タンパク質の欠損変異体（図2A）は、pEGFP-JIP4ベクターを鋳型とし、以下のプライマーを用いてPCR増幅した。増幅された断片を制限酵素EcoRIとXhoI、又はBamHIとXhoIで切断し、EcoRIとSalI、又はBamHIとSalIで処理したpEGFP-C2ベクターに挿入することにより各欠損変異体の発現ベクターを作製した。
JIP4：N-termフラグメント
フォワード：5’-GCGGATCCGAATTCACCATGGAGCTGGAGGACGGTGT-3’（配列番号41：下線部はBamHI認識部位）
リバース：5’-ATCTCGAGTCAGGCCCGGATCATCTCCGTCC-3’ （配列番号42：下線部はXhoI認識部位）
JIP4：C-termフラグメント
フォワード：5’-GCGGATCCGAATTCACCATGTCACGAGAGAACCCAGCTAT-3’（配列番号43：下線部はBamHI認識部位）
リバース：5’-ATCTCGAGTCACTCATTGCCACACATCAC-3’ （配列番号44：下線部はXhoI認識部位）
JIP4：N1フラグメント
フォワード：5’-GCGGATCCGAATTCACCATGGAGCTGGAGGACGGTGT-3’（配列番号45：下線部はBamHI認識部位）
リバース：5’-ATCTCGAGTCAAATTCTACTATGAGCTGTAGCC-3’ （配列番号46：下線部はXhoI認識部位）
JIP4：N2フラグメント
フォワード：5’-GCGAATTCACCATGAGAAAAGAACGTCCTATATCATTAG-3’（配列番号47：下線部はEcoRI認識部位）
リバース：5’-ATCTCGAGTCATCCTAGTAAATCCGCTCCTTC-3’ （配列番号48：下線部はXhoI認識部位）
JIP4：N3（LZII）フラグメント
フォワード：5’-GCGAATTCACCATGGGTCGTGAGGTGGAGAA-3’（配列番号49：下線部はEcoRI認識部位）
リバース：5’-ATCTCGAGTCAGTCCTCCAGCTTCAGCTTGG-3’ （配列番号50：下線部はXhoI認識部位）
JIP4：N4フラグメント
フォワード：5’-GCGAATTCACCATGAAGAACAGAGAGCTGGAGGA-3’（配列番号51：下線部はEcoRI認識部位）
リバース：5’-ATCTCGAGTCAGGCCCGGATCATCTCCGTCC-3’ （配列番号52：下線部はXhoI認識部位）
Construction of expression vector for JIP4 deletion mutant
A defective mutant of JIP4 protein (FIG. 2A) was PCR-amplified using pEGFP-JIP4 vector as a template and the following primers. The amplified fragment was cleaved with restriction enzymes EcoRI and XhoI, or BamHI and XhoI, and inserted into a pEGFP-C2 vector treated with EcoRI and SalI or BamHI and SalI to prepare an expression vector for each deletion mutant.
JIP4: N-term fragment forward: 5'-GC GGATCC GAATTCACCATGGAGCTGGAGGACGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 41: underlined BamHI recognition site)
Reverse: 5'-AT CTCGAG TCAGGCCCGGATCATCTCCGTCC-3 '(SEQ ID NO: 42: underlined XhoI recognition site)
JIP4: C-term fragment forward: 5'-GC GGATCC GAATTCACCATGTCACGAGAGAACCCAGCTAT-3 '(SEQ ID NO: 43: underlined BamHI recognition site)
Reverse: 5'-AT CTCGAG TCACTCATTGCCACACATCAC-3 '(SEQ ID NO: 44: underlined XhoI recognition site)
JIP4: N1 fragment forward: 5'-GC GGATCC GAATTCACCATGGAGCTGGAGGACGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 45: underlined BamHI recognition site)
Reverse: 5'-AT CTCGAG TCAAATTCTACTATGAGCTGTAGCC-3 '(SEQ ID NO: 46: underlined XhoI recognition site)
JIP4: N2 fragment forward: 5'-GC GAATTC ACCATGAGAAAAGAACGTCCTATATCATTAG-3 '(SEQ ID NO: 47: underlined portion is EcoRI recognition site)
Reverse: 5'-AT CTCGAG TCATCCTAGTAAATCCGCTCCTTC-3 '(SEQ ID NO: 48: underlined part is XhoI recognition site)
JIP4: N3 (LZII) fragment forward: 5'-GC GAATTC ACCATGGGTCGTGAGGTGGAGAA-3 '(SEQ ID NO: 49: underlined portion is EcoRI recognition site)
Reverse: 5'-AT CTCGAG TCAGTCCTCCAGCTTCAGCTTGG-3 '(SEQ ID NO: 50: underlined portion is XhoI recognition site)
JIP4: N4 fragment forward: 5'-GC GAATTC ACCATGAAGAACAGAGAGCTGGAGGA-3 '(SEQ ID NO: 51: underlined portion is EcoRI recognition site)
Reverse: 5'-AT CTCGAG TCAGGCCCGGATCATCTCCGTCC-3 '(SEQ ID NO: 52: underlined XhoI recognition site)
JIP3-LZ領域の発現ベクターの作製
JIP3のLZ領域は、pEGFP-JIP3を鋳型として、以下のプライマーを用いてPCR増幅した。増幅された断片を制限酵素EcoRIとSalIで処理したのち、同じくEcoRIとSalIで処理したpEGFP-C2ベクターに挿入することで、JIP3-LZ領域の発現ベクターを作製した。
JIP3-LZフラグメント
フォワード：5’-GCGAATTCATGGGCAAAGAAGTGGGGAA-3’（配列番号53：下線部はEcoRI認識部位）
リバース：5’-ATGTCGACTCACTTCAGTTCTTCTTCAAGCTCTTTG-3’ （配列番号54：下線部はSalI認識部位）
Preparation of expression vector for JIP3-LZ region
The LZ region of JIP3 was PCR amplified using pEGFP-JIP3 as a template and the following primers. The amplified fragment was treated with restriction enzymes EcoRI and SalI, and then inserted into a pEGFP-C2 vector similarly treated with EcoRI and SalI to prepare an expression vector for the JIP3-LZ region.
JIP3-LZ fragment forward: 5'-GC GAATTC ATGGGCAAAGAAGTGGGGAA-3 '(SEQ ID NO: 53: underlined EcoRI recognition site)
Reverse: 5'-AT GTCGAC TCACTTCAGTTCTTCTTCAAGCTCTTTG-3 '(SEQ ID NO: 54: underlined SalI recognition site)
上記の各PCR増幅に用いたPCR反応液の組成及びPCR反応条件は以下の通りである。
PCR反応条件
反応液組成：
鋳型DNA 適当量
dATP 0.2 mM
dGTP 0.2 mM
dTTP 0.2 mM
dCTP 0.2 mM
Sense Primer 1 μM
Antisense Primer 1 μM
PrimeSTAR Buffer (タカラバイオ) 1x Conc
PrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ) 1 unit/40μL
反応サイクル：
95℃ 30秒
60℃ 30秒
72℃ 30秒
を1サイクルとし、30サイクル。
The composition of the PCR reaction solution used for each PCR amplification and the PCR reaction conditions are as follows.
PCR reaction conditions Reaction solution composition:
Appropriate amount of template DNA
dATP 0.2 mM
dGTP 0.2 mM
dTTP 0.2 mM
dCTP 0.2 mM
Sense Primer 1 μM
Antisense Primer 1 μM
PrimeSTAR Buffer (Takara Bio) 1x Conc
PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara Bio) 1 unit / 40μL
Reaction cycle:
95 ° C 30 seconds
60 ℃ 30 seconds
72 ° C 30 seconds
30 cycles.
Arf6Q67L、Arf6Q27N、Arf1Q67L及びArf5Q71Lの発現ベクターの作製
本実施例で使用したArf6Q67L、Arf6Q27N、Arf1Q67L、Arf5Q71LをコードするcDNA（それぞれ配列番号19、23、33及び35）については、中山和久教授（京都大学）より譲り受けたものを使用した（これらのcDNAの詳細については、以下の文献を参照できる：Hosaka M et al., J Biochem (Tokyo) 120: 813-819 (1996)）。これらのcDNAを制限酵素HindIIIとXhoIで処理し、同様にHindIIIとXhoIで処理したpcDNA3-Flag（Honda et al., Cell 99, 521-532 (1999)）に挿入することにより作製した。
Preparation of expression vectors for Arf6Q67L, Arf6Q27N, Arf1Q67L, and Arf5Q71L The cDNAs encoding Arf6Q67L, Arf6Q27N, Arf1Q67L, and Arf5Q71L used in this example (SEQ ID NOs: 19, 23, 33, and 35, respectively) (The details of these cDNAs can be found in the following literature: Hosaka M et al., J Biochem (Tokyo) 120: 813-819 (1996)). These cDNAs were prepared by treating with restriction enzymes HindIII and XhoI, and inserting them into pcDNA3-Flag (Honda et al., Cell 99, 521-532 (1999)) treated with HindIII and XhoI in the same manner.
pGEX6P-LZIIベクターの作製
JIP4のLeucine zipper II（LZII）領域（アミノ酸399-460 番目）は、上記N3（LZII）フラグメントを制限酵素EcoRIとXhoIで処理し、同様にEcoRIとXhoIで処理したpGEX6P-2ベクター（GE ヘルスケア）に挿入することで、GSTプルダウン用のpGEX6P-LZIIベクターを作製した。
Construction of pGEX6P-LZII vector
Leucine zipper II (LZII) region (amino acids 399-460) of JIP4 is a pGEX6P-2 vector (GE Healthcare) treated with the above-mentioned N3 (LZII) fragment with restriction enzymes EcoRI and XhoI, and similarly with EcoRI and XhoI. ) To produce a pGEX6P-LZII vector for GST pull-down.
pGEX6P-Flag-Arf6ベクターの作製
Arf6 のcDNA 断片は、プラスミドpcDNA3-Arf6-Flag（Honda et al., Cell 99, 521-532 (1999)）を鋳型として以下のプライマーを用いてPCR を行い、増幅された断片を用いた。
Arf6のcDNAのPCRに用いたプライマー
フォワード：5’-AGGAATTCCCACTACCATGGGGAAGGTGCTATCCAAGATCTTCG-3’（配列番号55：下線部はEcoRI認識部位）
フォワード：5’-GAGGGGCAAACAACAGATGG-3’（配列番号56）
このArf6 断片は制限酵素EcoRI及びSalIで処理したpGEX6P-2 ベクターに挿入した。新たに作製した全てのプラスミドに関して、改変した部分の配列をダイターミネーター法（310 DNA シークエンサーもしくは3130 DNA シークエンサー；Applied Biosystems）にて確認した。
Construction of pGEX6P-Flag-Arf6 vector
The Arf6 cDNA fragment was subjected to PCR using the following primers with the plasmid pcDNA3-Arf6-Flag (Honda et al., Cell 99, 521-532 (1999)) as a template, and the amplified fragment was used.
Primer forward used for PCR of Arf6 cDNA: 5'-AG GAATTC CCACTACCATGGGGAAGGTGCTATCCAAGATCTTCG-3 '(SEQ ID NO: 55: underlined EcoRI recognition site)
Forward: 5'-GAGGGGCAAACAACAGATGG-3 '(SEQ ID NO: 56)
This Arf6 fragment was inserted into the pGEX6P-2 vector treated with restriction enzymes EcoRI and SalI. The sequence of the modified portion of all newly prepared plasmids was confirmed by the dye terminator method (310 DNA sequencer or 3130 DNA sequencer; Applied Biosystems).
ARF6と特異的に結合するペプチド（GST-LZII）の作製
pGEX6P-LZII により形質転換された大腸菌（E. coli）をLB培地中、37℃で一晩振盪培養した。大腸菌溶液をさらに多量のLB 培地中で、37℃、2時間培養した。Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)（ナカライテスク）を最終濃度0.1 mMで加え、30℃で3時間振盪培養した。培養後の大腸菌は遠心（6,000 x g）により回収し、超音波処理により破砕した。破砕後の大腸菌溶液を170,000 x gで遠心し、上精をペプチド溶液として用いた。
Preparation of peptide (GST-LZII) that specifically binds to ARF6
E. coli transformed with pGEX6P-LZII was cultured overnight in LB medium at 37 ° C. with shaking. The E. coli solution was further cultured in a large amount of LB medium at 37 ° C. for 2 hours. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Nacalai Tesque) was added at a final concentration of 0.1 mM and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 hours. The cultured Escherichia coli was recovered by centrifugation (6,000 xg) and disrupted by sonication. The disrupted Escherichia coli solution was centrifuged at 170,000 × g, and the supernatant was used as a peptide solution.
細胞培養
ヒト肝ガン由来細胞株HepG2細胞及びヒト胎児腎臓由来上皮細胞株HEK293T細胞は、定法に従い、10%ウシ胎児血清、50 μg/mlストレプトマイシン、50 units/mlペニシリン（以上、Invitrogen）を含むダルベッコ変法イーグル培地中（Invitrogen）で培養した。マウス由来培養血管内皮細胞は10% ウシ胎児血清、1mM ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、100 μM 非必須アミノ酸（Invitrogen）、55 μM 2-メルカプトエタノール（ナカライテスク）、50 μg/ml ストレプトマイシン、50 units/ml ペニシリン、50 μg/ml ヘパリン、20 μg/ml Endothelial cell growth factor (Roche) を含むダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。
Cell culture Human hepatoma-derived cell line HepG2 cell and human fetal kidney-derived epithelial cell line HEK293T cell are dulbecco containing 10% fetal bovine serum, 50 μg / ml streptomycin, 50 units / ml penicillin (above, Invitrogen) according to a conventional method. Cultured in modified Eagle medium (Invitrogen). Mouse-derived cultured vascular endothelial cells are 10% fetal bovine serum, 1 mM sodium pyruvate (Invitrogen), 100 μM non-essential amino acid (Invitrogen), 55 μM 2-mercaptoethanol (Nacalai Tesque), 50 μg / ml streptomycin, 50 units / The cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium containing ml penicillin, 50 μg / ml heparin, and 20 μg / ml Endothelial cell growth factor (Roche).
免疫沈降
HEK293T にLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて、各種プラスミドをトランスフェクションした。24 時間後に細胞を回収し、細胞溶解バッファー（25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1% TritonX-100, プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク））中で溶解した。30,000 x g で遠心後した上清に抗Flag 抗体（Sigma）を加え、免疫沈降した。沈降物をWestern blot 法により解析した。
Immunoprecipitation
Various plasmids were transfected into HEK293T using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 24 hours, cells were collected and cell lysis buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1% TritonX-100, protease inhibitor cocktail (Nacalai Tesque) ). Anti-Flag antibody (Sigma) was added to the supernatant after centrifugation at 30,000 xg and immunoprecipitated. The sediment was analyzed by Western blot method.
GST-LZII 融合タンパク質とARF6 の結合の解析
大腸菌を用いて調製した GST-LZII のペプチド溶液と、同じく大腸菌を用いて調製したFlag-ARF6 を結合バッファー（20 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 1% Triton X-100, and 1 mM PMSF）でインキュベートし、グルタチオンセファロースビーズ（GE ヘルスケア）で沈降した。沈降したタンパク質をSDS サンプルバッファー（30 mM Tris-HCl, pH6.8, 2% SDS, 0.1 mg/mL BPB, 5% 2-メルカプトエタノール, 10%グリセロール）で溶出し、抗Flag 抗体を用いたWestern blot 法により解析した。
Analysis of binding between GST-LZII fusion protein and ARF6 A peptide solution of GST-LZII prepared using E. coli and Flag-ARF6 prepared using E. coli were combined with a binding buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 Incubation with mM EGTA, 2 mM MgCl2, 1% Triton X-100, and 1 mM PMSF) and precipitation with glutathione sepharose beads (GE Healthcare). The precipitated protein was eluted with SDS sample buffer (30 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 0.1 mg / mL BPB, 5% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol) and Western with anti-Flag antibody Analysis was performed by blot method.
GTP 結合型ARF6 の定量
pEGFP-Arf6Q67L（QL）又はpEGFP-Arf6T27N（TN）発現ベクターをトランスフェクションしたHepG2 細胞又は培養血管内皮細胞をPull down バッファー（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.5%デオキシコール酸ナトリウム, 1% TritonX-100, 10%グリセロール, プロテアーゼインヒビターカクテル）中で溶解した。大腸菌を用いて調製したGST-LZII のペプチド溶液とともにインキュベートし、グルタチオンセファロースビーズで沈降した。沈降したタンパク質をSDS サンプルバッファーで溶出し、抗ARF6 抗体を用いたWestern blot 法により解析した。
Quantification of GTP-conjugated ARF6
Pull down buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.5%) from HepG2 cells or cultured vascular endothelial cells transfected with pEGFP-Arf6Q67L (QL) or pEGFP-Arf6T27N (TN) expression vector Dissolved in sodium deoxycholate, 1% TritonX-100, 10% glycerol, protease inhibitor cocktail). The mixture was incubated with a peptide solution of GST-LZII prepared using E. coli and precipitated with glutathione sepharose beads. The precipitated protein was eluted with SDS sample buffer and analyzed by Western blot using anti-ARF6 antibody.
結果
ARF6とJIP3又はJIP4 との結合の解析
大腸菌より精製した ARF6とHEK293T細胞に発現させたJIP3及びJIP4 との結合を解析した。具体的には、pEGFP-JIP1、pEGFP-JIP2、pEGFP-JIP3若しくはpEGFP-JIP4を、pcDNA3-Arf6Q67L若しくはpcDNA3-Arf6T27NとともにHEK293細胞にco-transfectionした。24時間後、細胞を溶解し、抗Flag抗体で免疫沈降したのち、抗GFP抗体若しくは抗Flag抗体でWestern blotを行った。JIP3及びJIP4 は、GTP 結合型ARF6 変異体（ARF6Q67L）には結合したが、GDP 結合型ARF6 変異体（ARF6T27N）には結合しなかった（図1A）。一方、同じJIP ファミリーのJIP1及びJIP2は、GTP 結合型ARF6 変異体又はGDP 結合型ARF6 変異体のいずれにも結合しなかった（図1A）。このことから、JIP3及びJIP4 のARF6 への結合は、ARF6 に結合しているguanosine ヌクレオチドに依存し、GTP 結合型に選択的であることが分かった。
result
Analysis of binding between ARF6 and JIP3 or JIP4 The binding between ARF6 purified from E. coli and JIP3 and JIP4 expressed in HEK293T cells was analyzed. Specifically, pEGFP-JIP1, pEGFP-JIP2, pEGFP-JIP3 or pEGFP-JIP4 was co-transfected into HEK293 cells together with pcDNA3-Arf6Q67L or pcDNA3-Arf6T27N. After 24 hours, cells were lysed and immunoprecipitated with anti-Flag antibody, and then Western blotting was performed with anti-GFP antibody or anti-Flag antibody. JIP3 and JIP4 bound to the GTP-bound ARF6 mutant (ARF6Q67L) but did not bind to the GDP-bound ARF6 mutant (ARF6T27N) (FIG. 1A). On the other hand, JIP1 and JIP2 of the same JIP family did not bind to either GTP-bound ARF6 mutant or GDP-bound ARF6 mutant (FIG. 1A). This indicates that the binding of JIP3 and JIP4 to ARF6 depends on the guanosine nucleotide bound to ARF6 and is selective for GTP binding.
他のARF ファミリータンパク質との結合 ARF1 及びARF5の活性型変異体であるARF1Q71L及びARF5Q71Lを用いて同様の結合実験を行った。具体的には、pEGFP-JIP3 若しくはpEGFP-JIP4 を、pcDNA3-Arf1Q71L, pcDNA3-Arf5Q71L 若しくはpcDNA3-Arf6Q67LとともにHEK293細胞にco-transfectionした。24時間後、細胞を溶解し、抗Flag抗体で免疫沈降したのち、抗GFP抗体もしくは抗Flag抗体でWestern blotを行った。その結果、JIP3及びJIP4 は、ARF1Q71L及びARF5Q71Lには結合しなかった（図1B）。従って、JIP3及びJIP4 は、GTP 結合型ARF6 に高い特異性で結合することが確認された。 Binding to other ARF family proteins Similar binding experiments were performed using ARF1Q71L and ARF5Q71L, which are active mutants of ARF1 and ARF5. Specifically, pEGFP-JIP3 or pEGFP-JIP4 was co-transfected into HEK293 cells together with pcDNA3-Arf1Q71L, pcDNA3-Arf5Q71L or pcDNA3-Arf6Q67L. After 24 hours, the cells were lysed, immunoprecipitated with anti-Flag antibody, and then Western blotted with anti-GFP antibody or anti-Flag antibody. As a result, JIP3 and JIP4 did not bind to ARF1Q71L and ARF5Q71L (FIG. 1B). Therefore, it was confirmed that JIP3 and JIP4 bind with high specificity to GTP-bound ARF6.
ARF6 と結合するJIP4の領域の検討 JIP4 の各種欠損変異体（緑色蛍光タンパク質GFP との融合タンパク質）を作製し（図2A）、pEGFP-JIP4の各変異体を、pcDNA3-Arf6Q67L若しくはpcDNA3-Arf6T27NとともにHEK293細胞にco-transfectionし、24時間後、細胞を溶解して、抗Flag抗体で免疫沈降したのち、抗GFP抗体若しくは抗Flag抗体でWestern blotを行った。その結果、LZII 領域がGTP 結合型ARF6 と選択的に結合することが分かった（図2B, C）。 Examination of the region of JIP4 that binds to ARF6 Various defective mutants of JIP4 (fusion protein with green fluorescent protein GFP) were prepared (Fig. 2A), and each mutant of pEGFP-JIP4 was combined with pcDNA3-Arf6Q67L or pcDNA3-Arf6T27N After co-transfection into HEK293 cells, 24 hours later, the cells were lysed, immunoprecipitated with anti-Flag antibody, and then Western blotted with anti-GFP antibody or anti-Flag antibody. As a result, it was found that the LZII region selectively binds to GTP-bound ARF6 (Fig. 2B, C).
また、JIP3のLZ領域およびJIP4のLZII領域をGST融合タンパク質として大腸菌より精製し（それぞれGST-LZ、GST-LZII）、同じく大腸菌から精製したFlag-ARF6Q67Lもしくは
Flag-ARF6T27Nとインキュベートし、抗Flag抗体で免疫沈降した。沈降物を、抗GST抗体もしくは抗Flag抗体を用いたWestern blot法にて解析したところ、JIP4 のLZII 領域に相当するJIP3 のLZ 領域もGTP 結合型ARF6 と結合することが分かった（図2D）。
Moreover, the LZ region of JIP3 and the LZII region of JIP4 were purified from E. coli as GST fusion proteins (GST-LZ and GST-LZII, respectively) and Flag-ARF6Q67L or the same purified from E. coli or
Incubated with Flag-ARF6T27N and immunoprecipitated with anti-Flag antibody. The precipitate was analyzed by Western blot using anti-GST antibody or anti-Flag antibody, and it was found that the JIP3 LZ region corresponding to JIP4 LZII region also bound to GTP-bound ARF6 (Fig. 2D). .
GST-LZIIを用いたGTP結合型ARF6の定量
以上の結果を踏まえ、我々はGST-LZII ペプチドを用いたGTP 結合型ARF6 の定量法の開発を試みた。
一例として、大腸菌より調整したGST-LZII を用いて、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）やHGF で刺激をしたHepG2 細胞、培養血管内皮細胞に含まれるGTP 結合型ARF6 をGST-プルダウンアッセイにより定量した（方法の項を参照）。最初に、陽性および陰性コントロールとして、pEGFP-Arf6Q67L（QL）もしくはpEGFP-Arf6T27N（TN）発現ベクターをトランスフェクションしたHepG2 細胞もしくは培養血管内皮細胞の細胞溶解液を調製した。次に、細胞溶解液に大腸菌より精製したGST-LZIIとインキュベーションし、glutathione-sepharoseを用いて沈降した。沈降物を、抗ARF6抗体を用いたWestern blot法にて解析した。コントロールとして細胞溶解液中のtotal ARF6とactinの量を、それぞれの抗体を用いたWestern blot法にて解析した。その結果、HepG2 細胞においてはHGF 刺激後、5 分よりGTP 結合型ARF6 の量が上昇し、6-12 時間で最大となり、48 時間程度後に基底状態に戻った（図3A）。培養血管内皮細胞を用いても、ほぼ同様の時間経過を示した（図3B）。一方、培養血管内皮細胞をVEGF で処理した場合には、刺激後1 分程度でGTP結合型ARF6 の量が上昇し、約30 分後までに基底状態に戻った（図3C）。従って、HGF とVEGF は両者ともARF6 を活性化するが、その活性化は異なる時間経過を経ることが明らかとなった。またこれらの結果から、GST-LZII がGTP 結合型ARF6 の定量に有効であることが分かった。
Quantification of GTP-bound ARF6 using GST-LZII Based on the above results, we attempted to develop a quantitative method for GTP-bound ARF6 using GST-LZII peptide.
As an example, GST-LZII prepared from E. coli was used to quantify GTP-bound ARF6 contained in HepG2 cells stimulated with vascular endothelial growth factor (VEGF) or HGF and cultured vascular endothelial cells by GST-pulldown assay. (See method section). First, as positive and negative controls, cell lysates of HepG2 cells or cultured vascular endothelial cells transfected with pEGFP-Arf6Q67L (QL) or pEGFP-Arf6T27N (TN) expression vector were prepared. Next, the cell lysate was incubated with GST-LZII purified from E. coli and precipitated using glutathione-sepharose. The sediment was analyzed by Western blot using an anti-ARF6 antibody. As controls, the amounts of total ARF6 and actin in the cell lysate were analyzed by Western blotting using the respective antibodies. As a result, in HepG2 cells, the amount of GTP-bound ARF6 increased from 5 minutes after HGF stimulation, reached a maximum in 6-12 hours, and returned to the ground state after about 48 hours (FIG. 3A). Even when cultured vascular endothelial cells were used, almost the same time course was shown (FIG. 3B). On the other hand, when cultured vascular endothelial cells were treated with VEGF, the amount of GTP-bound ARF6 increased approximately 1 minute after stimulation, and returned to the basal state by approximately 30 minutes (FIG. 3C). Thus, both HGF and VEGF activate ARF6, but it has been shown that the activation goes through different time courses. These results also indicate that GST-LZII is effective for the quantification of GTP-bound ARF6.
JIP3及びJIP4のLZ及びLZIIペプチドは、活性型ARF6と特異的に結合し、不活性型ARF6 や他のARF ファミリータンパク質には結合しない高い選択性を持つため、LZ及びLZIIペプチドを用いれば高い信頼性のもとでGTP 結合型ARF6 の定量を行うことができる。
先に述べたように、ARF6 は腫瘍の増殖、転移に重要な働きをしている。従って、ARF6 の活性化（すなわちGTP 結合型ARF6 の産生）を抑える化合物は抗腫瘍剤としての可能性を秘めている。このようなGTP 結合型ARF6 の量を抑制する化合物のスクリーニングに本システムが有効であると考えられる。
また、上記の実験システムを癌組織抽出液に適用することにより、各癌組織内での GTP 結合型ARF6の定量が可能となる。これによりそれぞれの癌が抗ARF6 薬に適用であるかを検査することができると考えられる。
JIP3 and JIP4 LZ and LZII peptides bind to active ARF6 specifically and do not bind to inactive ARF6 or other ARF family proteins, so they are highly reliable when using LZ and LZII peptides. GTP-bound ARF6 can be quantified based on sex.
As mentioned earlier, ARF6 plays an important role in tumor growth and metastasis. Therefore, compounds that suppress ARF6 activation (i.e., production of GTP-bound ARF6) have potential as antitumor agents. This system is considered to be effective in screening for compounds that suppress the amount of GTP-bound ARF6.
In addition, by applying the above experimental system to a cancer tissue extract, it is possible to quantify GTP-bound ARF6 in each cancer tissue. In this way, it is considered possible to test whether each cancer is applicable to anti-ARF6 drugs.
配列番号19: レコンビナント
配列番号23: レコンビナント
配列番号33: レコンビナント
配列番号35: レコンビナント
配列番号37: 合成DNA
配列番号38: 合成DNA
配列番号39: 合成DNA
配列番号40: 合成DNA
配列番号41: 合成DNA
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配列番号44: 合成DNA
配列番号45: 合成DNA
配列番号46: 合成DNA
配列番号47: 合成DNA
配列番号48: 合成DNA
配列番号49: 合成DNA
配列番号50: 合成DNA
配列番号51: 合成DNA
配列番号52: 合成DNA
配列番号53: 合成DNA
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配列番号55: 合成DNA
配列番号56: 合成DNA
SEQ ID NO: 19: Recombinant SEQ ID NO: 23: Recombinant SEQ ID NO: 33: Recombinant SEQ ID NO: 35: Recombinant SEQ ID NO: 37: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 38: Synthetic DNA
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SEQ ID NO: 54: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 55: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 56: Synthetic DNA
Claims (15)
（a）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（b）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド
（c）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド A reagent for detecting GTP-bound ARF6 protein comprising the following peptide (a), (b) or (c):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 A peptide that specifically binds to a GTP-binding ARF6 protein (c) an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, and a GTP-binding type Peptides that specifically bind to ARF6 protein
（a）被検試料と請求項1に記載の試薬とを混合する工程
（b）混合物からGTP結合型ARF6タンパク質を検出する工程 A method for detecting a GTP-bound ARF6 protein, comprising the following steps.
(A) a step of mixing the test sample and the reagent according to claim 1 (b) a step of detecting GTP-bound ARF6 protein from the mixture
（a）患者から採取された腫瘍組織の細胞抽出物を調製する工程
（b）前記細胞抽出物と請求項1に記載の試薬とを混合する工程
（c）混合物中のGTP結合型ARF6タンパク質の濃度を測定し、基準値と比較する工程 A method for examining the nature of a tumor, comprising the following steps.
(A) a step of preparing a cell extract of a tumor tissue collected from a patient (b) a step of mixing the cell extract with the reagent according to claim 1 (c) of the GTP-binding ARF6 protein in the mixture The process of measuring the concentration and comparing it with the reference value
（a）腫瘍細胞と候補化合物とを接触させた後、前記腫瘍細胞の細胞抽出物を調製する工程
（b）前記細胞抽出物と請求項1に記載の試薬とを混合する工程
（c）混合物中のGTP結合型ARF6タンパク質の濃度を測定し、基準値と比較する工程 A screening method for a therapeutic agent for a tumor, comprising the following steps.
(A) a step of preparing a cell extract of the tumor cell after contacting the tumor cell with the candidate compound (b) a step of mixing the cell extract with the reagent according to claim 1 (c) a mixture Of measuring the concentration of GTP-bound ARF6 protein in the sample and comparing it to a reference value
（a）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
（b）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド
（c）配列番号4若しくは10で表されるアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつGTP結合型ARF6タンパク質と特異的に結合するペプチド A kit for detecting a GTP-bound ARF6 protein comprising the following peptide (a), (b), or (c):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10 A peptide that specifically binds to a GTP-binding ARF6 protein (c) an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 10, and a GTP-binding type Peptides that specifically bind to ARF6 protein
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|---|---|---|---|---|
| EP2568026A1 (en) | 2011-09-07 | 2013-03-13 | Nitto Denko Corporation | Aqueous dispersion pressure-sensitive adhesive composition and pressure-sensitive adhesive sheet |
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