JP2011168533A - Anti-influenza virus agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、インフルエンザウイルスに対して感染抑制効果を有する抗インフルエンザウイルス剤に関し、詳しくは、従来は利用されずに廃棄されていたコンブ仮根部、特に養殖コンブ仮根部を用い、これから抽出した有効成分を抗インフルエンザウイルス剤として利用するものである。 The present invention relates to an anti-influenza virus agent having an infection-suppressing effect against influenza virus, and in particular, an active ingredient extracted from a kombu temporary root part that has been conventionally discarded without being used, particularly a cultured kombu temporary root part Is used as an anti-influenza virus agent.
インフルエンザは、インフルエンザウイルスにより引き起こされるウイルス性呼吸器感染症である。このウイルスは主に気道上皮細胞に感染し、急性の呼吸器障害をもたらし、突然の発熱、頭痛、関節痛などの症状を伴う。下気道にまで感染が広がると重篤な肺炎を引き起こすことがあり、また、高齢者や妊婦、基礎疾患を有する患者などのハイリスク患者においては死亡に至る場合がある。 Influenza is a viral respiratory infection caused by influenza virus. The virus primarily infects respiratory epithelial cells, causing acute respiratory damage, with symptoms such as sudden fever, headache, and joint pain. Infection that spreads to the lower respiratory tract can cause severe pneumonia and can lead to death in high-risk patients such as the elderly, pregnant women, and patients with underlying diseases.
インフルエンザウイルスはオルソミクソ科に属する、エンペロープをもつＲＮＡウイルスであり、その抗原性の違いからＡ、ＢおよびＣ型に分類されるが、主にＡ型およびＢ型、特にＡ型において新しい血清型が出現し、抗原性が異なるウイルスにより毎年のように流行を繰り返す。インフルエンザウイルスの流行を抑えるにはワクチン接種が有効な手段であるが、このようにウイルスの抗原性の変化が頻繁であるため、ワクチンだけで予防するのは難しい。 Influenza viruses are enveloped RNA viruses belonging to the Orthomyxo family, and are classified into A, B, and C types due to their antigenic differences, but there are mainly new serotypes in A and B types, particularly A type. The epidemic is repeated every year by viruses that appear and have different antigenicity. Vaccination is an effective means to suppress the epidemic of influenza viruses, but it is difficult to prevent with vaccines alone because of the frequent changes in the antigenicity of the virus.
インフルエンザは、飛沫により放出されたウイルスがヒトの上気道の粘膜上皮細胞に感染し増殖することにより生じるため、感染の抑制には、細胞への吸着、膜融合、ウイルスゲノム RNAの転写・複製、ウイルス粒子の出芽などの増殖過程を標的として抗ウイルス薬が開発されている。現在、インフルエンザに罹患した患者に対しては、ウイルスの出芽時のノイラミニダーゼの機能を阻害する、オセルタミビル（タミフル）やザナミビル（リレンザ）などの抗ウイルス剤が治療に用いられているが、これらの抗ウイルス薬には副作用や耐性ウイルス株の出現の問題がある。 Influenza occurs when the virus released by the droplets infects and proliferates in the mucosal epithelial cells of the human upper respiratory tract. To control infection, cell adsorption, membrane fusion, transcription and replication of viral genomic RNA, Antiviral drugs have been developed targeting growth processes such as budding of virus particles. Currently, antiviral drugs such as oseltamivir (Tamiflu) and zanamivir (Relenza), which inhibit the function of neuraminidase during virus emergence, are used for treatment of patients suffering from influenza. Viral drugs have problems with side effects and the emergence of resistant virus strains.
また、安全性の点から天然物由来の物質を用いた各種抗インフルエンザウイルス薬が報告されている。例えば、センダンの抽出物を含有するインフルエンザ予防・治療剤（特許文献１）、各種植物の抽出物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤（特許文献２）などがある。 In addition, various anti-influenza virus drugs using substances derived from natural products have been reported from the viewpoint of safety. For example, there are an influenza preventive / therapeutic agent containing a Sendan extract (Patent Document 1), an anti-influenza virus agent (Patent Document 2) containing various plant extracts as active ingredients, and the like.
一方、本発明者らは、先に、養殖昆布において、それまで費用をかけて廃棄していた仮根部の利用法を検討し、食品素材として利用できることを見出した（特許文献３）。即ち、養殖コンブの仮根部は、古くから食品として利用されてきたコンブ葉状体とは異なり、カリウムと食物繊維を多量に含んでいることを見出し、減塩や食物繊維補給のために有用な食品素材を提供したものである。また、養殖コンブの仮根部が有効な抗腫瘍成分を含有していることも見出している（特許文献４）。しかし、コンブ仮根部から抽出したフコイダンのアディポネクチン産生促進作用についてはこれまで全く知られていない。 On the other hand, the inventors of the present invention have previously studied a method for using a temporary root portion that has been previously costly discarded in cultured kelp, and found that it can be used as a food material (Patent Document 3). That is, the temporary root part of the cultured kombu, unlike the kombu leaf that has been used as a food for a long time, has been found to contain a large amount of potassium and dietary fiber, food useful for reducing salt and dietary fiber supplementation The material is provided. Further, it has also been found that the temporary root portion of the cultured comb contains an effective antitumor component (Patent Document 4). However, the adiponectin production promoting action of fucoidan extracted from the kombu temporary root has not been known so far.
コンブは褐藻類コンブ科コンブ属の海藻の葉状体を乾燥したものであり、通常、葉状体の先端部と下端部および仮根部は除いて製品化される。また、根昆布と称して販売されているものは、コンブの仮根ではなく、コンブ仮根部に近い葉状体の下端部である。天然のコンブでは、仮根部は岩盤に強く付着しており、採取の際に岩石、土砂との分離が難しい。養殖昆布では、受精した幼胞子体を付着させたロープを、太いロープに結び付けて海中に入れて栽培するため採取が容易である。上記の本発明者等による発明前は、養殖昆布の仮根部の海への投棄は汚染の問題を生じるため、陸揚げして埋め立てなどの手段で廃棄処分していた。 The kombu is a dried product of the leafy bodies of the seaweed belonging to the genus Kombu in the family of the brown algae, and is usually commercialized except for the tip, lower end and temporary root of the leafy body. Moreover, what is sold as a root kelp is not the root of the kombu but the lower end of the frond close to the kombu temporary root. In natural kombu, the temporary root part is strongly attached to the bedrock, and it is difficult to separate it from rocks and earth and sand during collection. In cultured kelp, the rope with fertilized fertilized spores is tied to a thick rope and cultivated in the sea for easy collection. Prior to the invention by the present inventors, dumping of the cultivated kelp into the sea caused the problem of contamination, so it was landed and disposed of by landfill.
本発明の目的は、安全性の高い天然物由来の成分を用いて、有効な抗インフルエンザウイルス剤を提供することである。また、コンブの仮根部、特に養殖コンブ仮根部のさらなる利用法を提供するものである。 An object of the present invention is to provide an effective anti-influenza virus agent using a highly safe component derived from a natural product. Moreover, the further usage method of the temporary root part of a kombu, especially a cultured kombu temporary root part is provided.
本発明者らは、養殖コンブ仮根の利用を検討する過程で、養殖コンブ仮根由来の成分の中でフコイダンに着目し、これを投与したマウスにおいて抗インフルエンザウイルス効果を確認し、本発明を完成させた。 In the process of studying the use of cultured kombu temporary roots, the present inventors focused on fucoidan among the components derived from cultured kombu temporary roots, confirmed the anti-influenza virus effect in mice administered this, and Completed.
即ち、本発明は以下の通りである。
１．コンブ仮根部由来のフコイダンを有効成分とする、抗インフルエンザウイルス剤。
２．フコイダンが、コンブ仮根部からの抽出により得られたものである、上記１記載の抗インフルエンザウイルス剤。
３．コンブが養殖コンブである、上記１または２記載の抗インフルエンザウイルス剤。
That is, the present invention is as follows.
1. An anti-influenza virus agent comprising fucoidan derived from a kombu temporary root part as an active ingredient.
2. 2. The anti-influenza virus agent according to 1 above, wherein fucoidan is obtained by extraction from a kombu temporary root.
3. 3. The anti-influenza virus agent according to 1 or 2 above, wherein the comb is a cultured comb.
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、抗インフルエンザウイルス作用に優れていると共に、安全性の確認された食品素材由来の成分を利用するので、安全性の面でも優れている。また、本発明はコンブ仮根、特に養殖コンブ仮根の別の利用方法を見出した点でも有用な発明である。 The anti-influenza virus agent of the present invention is excellent in anti-influenza virus action, and is excellent in safety because it uses ingredients derived from food materials whose safety has been confirmed. In addition, the present invention is also useful in that it has found another method of using a kombu temporary root, particularly a cultured kombu temporary root.
本発明で使用するフコイダンは、コンブ仮根部、特に好ましくは養殖コンブ仮根部由来のフコイダンである。フコイダンは海藻などに含まれる、フコースを主成分とした硫酸化多糖類の総称であり、原料の違いにより成分や構造に違いがみられる。コンブ仮根部から得られるフコイダンは、Ｌ−フコイダンおよびＧａ−フコイダンからなる。Ｌ−フコイダンは葉状体にも含まれているフコイダンであり、フコースおよびガラクトースを構成糖として含む。Ｇａ−フコイダンは仮根部特有のフコイダンであり、糖としてはフコースを主体とし、その他にマンノース、ガラクトース、キシロース、グルコースで構成されている。コンブ仮根部由来フコイダンにはＬ−フコイダンとＧａ−フコイダンが１：１〜２：１の割合で含まれる。 The fucoidan used in the present invention is a fucoidan derived from a kombu temporary root, particularly preferably a cultured kombu temporary root. Fucoidan is a general term for sulfated polysaccharides mainly composed of fucose contained in seaweed and the like, and there are differences in components and structures depending on the raw materials. Fucoidan obtained from the kombu temporary root portion is composed of L-fucoidan and Ga-fucoidan. L-fucoidan is a fucoidan also contained in the frond, and contains fucose and galactose as constituent sugars. Ga-fucoidan is a fucoidan peculiar to a temporary root part, and is mainly composed of fucose as a sugar, and is composed of mannose, galactose, xylose, and glucose. The kombu temporary root-derived fucoidan contains L-fucoidan and Ga-fucoidan in a ratio of 1: 1 to 2: 1.
本発明で使用するコンブ仮根部由来のフコイダンは、メカブ、オキナワモズクなどの他の海藻由来のフコイダン、また葉状体由来のフコイダンとは、構成糖の点で異なる。特にＧａフコイダンは、他の海藻や葉状体には存在せず、コンブ仮根部のみに存在するという特徴を有する。 The fucoidan derived from the kombu temporary root used in the present invention is different from fucoidan derived from other seaweeds such as mekabu and Okinawa mozuku, and fucoidan derived from a frond in terms of constituent sugar. In particular, Ga fucoidan is not present in other seaweeds or foliar bodies, and is characterized by being present only in the kombu temporary root.
メカブから得られるフコイダンについては、Ｆｒ−ＩおよびＦｒ−ＩＩの２種類が分離されており、微量成分を除く構成糖は、Ｆｒ−Ｉではフコース、ガラクトース、アラビノース、キシロースであり、Ｆｒ−ＩＩではフコースおよびガラクトースである。オキナワモズクから得られるフコイダンは、フコースおよびグルクロン酸から構成されている。ガゴメコンブ（葉状体）から得られるフコイダンは、フコースから構成されるＦ−フコイダン、フコース、マンノースおよびグルクロン酸から構成されるＵ−フコイダン、ガラクトースとフコースから構成されるＧフコイダンを含む。 As for fucoidan obtained from mekabu, two types of Fr-I and Fr-II are separated, and the constituent sugars excluding trace components are fucose, galactose, arabinose and xylose in Fr-I, and in Fr-II Fucose and galactose. Fucoidan obtained from Okinawa mozuku is composed of fucose and glucuronic acid. Fucoidan obtained from gagome kombu (foliate) includes F-fucoidan composed of fucose, U-fucoidan composed of fucose, mannose and glucuronic acid, and G fucoidan composed of galactose and fucose.
本発明においてフコイダンを得るために用いるコンブ仮根とは、図１に示したコンブの部位のうち、仮根 (holdfast) を主とし、葉柄 (stipe)を含んでいてもよい部分を指し、以前は食用として利用されず廃棄されていた部分である。通常のコンブ製品は葉状体 (frond)の先端部と下端部を除いた部分から製造され、葉状体の下端部は根昆布と称されて利用されている。本発明で仮根を使用するコンブの種類には、マコンブ、ミツイシコンブ、リシリコンブなどがあり、特に限定されないが、採取が容易であることなどから養殖コンブであるのが好ましい。 The kombu temporary root used to obtain fucoidan in the present invention refers to a portion of the kombu portion shown in FIG. 1 that mainly includes temporary root (holdfast) and may contain a stipe (previously referred to as stipe). Is the part that was discarded without being used for food. Ordinary kombu products are manufactured from the part excluding the tip and bottom of the frond, and the bottom of the frond is called root kelp. In the present invention, the type of the comb that uses the temporary root includes macomb, honey comb, resilib, and the like, and is not particularly limited, but is preferably a cultured comb because it is easy to collect.
本発明で用いるコンブ仮根部由来のフコイダンとしては、コンブ仮根部より抽出した粗フコイダンでも、それを精製したフコイダンでもよい。
コンブ仮根からフコイダンを得る方法は、既知のフコイダン調製方法が使用でき特に限定されないが、例えば、コンブ仮根やその粉末に、熱水抽出、無機酸による抽出、有機酸による抽出などの抽出操作、あるいは、塩化カルシウム等の２価の陽イオンを含む水溶液による抽出操作、およびこれらを組み合わせた方法を適用する。また、抽出液から粗フコイダンを得るために、エタノール等の低級アルコールによる凝集、あるいは限外ろ過器を用いることによる、ナトリウム等の無機塩類の除去を行う。
The fucoidan derived from the kombu temporary root part used in the present invention may be a crude fucoidan extracted from the kombu temporary root part or a purified fucoidan.
The method for obtaining fucoidan from the kombu temporary root is not particularly limited, and known fucoidan preparation methods can be used. Alternatively, an extraction operation using an aqueous solution containing a divalent cation such as calcium chloride, and a method combining these are applied. Further, in order to obtain crude fucoidan from the extract, inorganic salts such as sodium are removed by aggregation with a lower alcohol such as ethanol or by using an ultrafilter.
さらに、クロマトグラフィーなどの精製手段により粗フコイダンを精製してもよい。また、得られるフコイダンをイオン交換やゲルろ過クロマトグラフなどの方法でＧａ−フコイダンやＬ−フコイダンに分離してもよい。 Further, the crude fucoidan may be purified by a purification means such as chromatography. Further, the obtained fucoidan may be separated into Ga-fucoidan or L-fucoidan by a method such as ion exchange or gel filtration chromatography.
好ましくは、コンブ仮根を乾燥後、粉砕機で粉砕する等の通常の粉末化手段を用いて粉末化し、得られるコンブ仮根粉末より塩酸などの無機酸によりフコイダンを抽出する。フコイダン抽出および精製方法の好適な一態様は以下の通りである。
（水溶性成分の抽出）
養殖コンブ仮根を乾燥して粉砕して得られる粉末に、塩酸等の酸でpH2.0 〜2.5 に調整した水を10〜13倍量加え、70〜80℃で２〜３時間程度抽出を行う。抽出操作を２〜３回繰り返し、上澄を採取し遠心分離を行う。得られた上清をろ紙等で濾過し清澄液を得る。その後の操作を容易にするために、清澄液をエバポレーターを用い減圧濃縮する。濃縮の際は、沈澱が析出すると沈澱に粗フコイダンが含まれてしまうため、なるべく沈澱が析出しないようにするのが望ましい。濃縮後の溶液を遠心分離し、沈澱を除去する。
（粗フコイダンの抽出）
上で得られた清澄液にエタノール等の低級アルコールを２〜３倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離により得られる沈澱を回収・乾燥し、これを約７〜10倍量の塩酸等の酸でpH2.0 〜2.5 に調整した水に溶解し、６〜12時間程度静置する。吸引ろ過により得られた溶液を濃縮し、エタノール等の低級アルコールを２〜３倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離により得られる沈澱を回収・乾燥させる。この操作を１〜２回程度繰り返して粗フコイダンを得る。
Preferably, after drying the kombu temporary root, it is pulverized using ordinary powdering means such as pulverizing with a pulverizer, and fucoidan is extracted from the resulting kombu temporary root powder with an inorganic acid such as hydrochloric acid. A preferred embodiment of the fucoidan extraction and purification method is as follows.
(Extraction of water-soluble components)
Add 10 to 13 times the amount of water adjusted to pH 2.0 to 2.5 with acid such as hydrochloric acid to the powder obtained by drying and crushing cultured kombu temporary roots, and extract at 70 to 80 ° C for about 2 to 3 hours. Do. The extraction operation is repeated 2-3 times, and the supernatant is collected and centrifuged. The obtained supernatant is filtered with a filter paper or the like to obtain a clarified liquid. In order to facilitate the subsequent operation, the clarified liquid is concentrated under reduced pressure using an evaporator. When concentrating, since precipitation will contain crude fucoidan, it is desirable to prevent precipitation as much as possible. The concentrated solution is centrifuged to remove the precipitate.
(Extraction of crude fucoidan)
2 to 3 times the amount of lower alcohol such as ethanol is added to the clarified liquid obtained above to cause precipitation, and the precipitate obtained by centrifugation is recovered and dried. This is about 7 to 10 times the amount of hydrochloric acid or the like. Dissolve in water adjusted to pH 2.0-2.5 with acid and let stand for about 6-12 hours. The solution obtained by suction filtration is concentrated, and 2 to 3 times the amount of lower alcohol such as ethanol is added to cause precipitation, and the precipitate obtained by centrifugation is collected and dried. This operation is repeated about 1 to 2 times to obtain a crude fucoidan.
また、別法として、上記で得られた清澄液を分角分子量10,000の限外ろ過器を用いて、清澄液に存在するナトリウム等を排除して、粗フコイダンを得る方法が挙げられる。
（フコイダンの精製）
乾燥させた沈澱（粗フコイダン）を、クロマトグラフィーなどの方法により精製する。好ましくは、陰イオン樹脂を用いた液体クロマトグラフにより、コンブ仮根部由来の精製フコイダンを得ることができる。
Another method is to obtain crude fucoidan by removing sodium and the like present in the clarified liquid from the clarified liquid obtained above using an ultrafilter having a molecular weight of 10,000.
(Purification of fucoidan)
The dried precipitate (crude fucoidan) is purified by a method such as chromatography. Preferably, purified fucoidan derived from a kombu temporary root can be obtained by liquid chromatography using an anion resin.
上述のようにして得られるフコイダンは、後出の試験例において実証するように、インフルエンザウイルスを接種したマウスに対して生存率を向上させることができた。具体的には、コンブ仮根部由来のフコイダンを、ウイルス接種前から経口投与してマウスの生存率を調べた結果、対象群と比較して有意差が見られた。従って、本発明のコンブ仮根部由来フコイダンを投与することにより、インフルエンザウイルス感染に対して予防効果や重症化を防ぐ効果が期待できる。 The fucoidan obtained as described above was able to improve the survival rate for mice inoculated with influenza virus, as demonstrated in the following test examples. Specifically, fucoidan derived from the kombu temporary root was orally administered before virus inoculation, and the survival rate of the mice was examined. As a result, a significant difference was found compared to the subject group. Therefore, by administering the kombu temporary root part-derived fucoidan of the present invention, it can be expected to have a preventive effect or prevent aggravation against influenza virus infection.
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、有効成分としてコンブ仮根部由来フコイダンを含み、必要に応じ、製剤化の際に慣用される物質、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、矯味剤、着香剤などの補助剤を添加して、錠剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤などの適宜形態に製剤化すればよい。投与方法としては、経口投与が好ましく、投与量は、フコイダン量として成人で体重１kg当たり10〜100mg ／日程度が好ましい。 The anti-influenza virus agent of the present invention contains fucoidan derived from kombu temporary root as an active ingredient, and if necessary, a substance commonly used in formulation, such as excipients, binders, disintegrants, diluents, suspensions. Adjuvants such as turbidizers, emulsifiers, stabilizers, flavoring agents, and flavoring agents may be added and formulated into appropriate forms such as tablets, granules, powders, and troches. As an administration method, oral administration is preferable, and the dose is preferably about 10 to 100 mg / day of body weight per kg of an adult as fucoidan.
また、本発明の抗インフルエンザ剤の有効成分は天然物由来であり、安全性が高いので、食品に添加して用いても、または栄養補助食品や健康食品などの経口組成物として利用することもできる。 In addition, since the active ingredient of the anti-influenza agent of the present invention is derived from natural products and has high safety, it can be used by adding to foods or as oral compositions such as nutritional supplements and health foods. it can.
経口組成物とする場合、上述のようにして得たフコイダンに、必要に応じて食品分野で慣用の賦形剤、甘味料、香料、着色剤などの添加剤を配合することにより製造できる。この組成物は、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、ゼリーなどの各種形態に常法により製剤化して、例えば栄養補助食品や健康食品などとして経口摂取することができる。また、本発明経口組成物は、フコイダンを、通常の飲食品に配合したものであってもよい。 When it is set as an oral composition, it can manufacture by mix | blending additives, such as an excipient | filler conventionally used in the foodstuff field, a sweetener, a fragrance | flavor, and a coloring agent, with the fucoidan obtained as mentioned above. This composition can be formulated into various forms such as powders, granules, tablets, capsules, drinks, jelly and the like by conventional methods, and can be taken orally, for example, as a dietary supplement or health food. Moreover, this invention oral composition may mix | blend fucoidan with normal food-drinks.
以下に本発明をさらに詳しく説明するため実施例を示すが、本発明はそれらによって限定されるものではない。以下では、コンブ仮根部として養殖コンブ仮根部を用いた場合について具体的に説明する。 In order to describe the present invention in more detail below, examples are shown, but the present invention is not limited thereto. Below, the case where a cultured kombu temporary root part is used as a kombu temporary root part is demonstrated concretely.
（参考例１）
(養殖コンブ仮根からのフコイダンの抽出)
乾燥した養殖コンブ仮根を粗砕機（カッターミル）で粗く粉砕した後、微砕機（サンプルミル）で微粉末にして、養殖コンブ仮根粉末を得た。養殖コンブ仮根粉末500gに、水5000mLを加え、塩酸でpH３に調整して、75℃で３時間抽出した。この操作を３回繰り返した後、固形分を取り除き、遠心分離 (3000rpm 、20分) を行った。得られた上清をろ過し、清澄液を得た。後の操作を容易にするために、清澄液をなるべく沈澱が析出しないように、約10分の１の液量となるまで減圧濃縮した。濃縮後の液を遠心分離し沈澱を除いた。
（粗フコイダンの抽出）
上で得られた清澄な液にエタノールを２倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離後、沈澱を乾燥し、これを約７倍量の水に溶解し、塩酸でpHを２に調整して約１時間静置した。吸引ろ過により得られた溶液を濃縮し、再度エタノールを２倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離後沈澱を乾燥した。この操作を２回程度繰り返して粗フコイダン16.3ｇを得た。
（参考例２）
養殖コンブ仮根由来フコイダンの分析
(1) Ga- フコイダン、L-フコイダンの分離
上記のようにして得た粗フコイダン4.5 ｇを水500mL に溶解し、DEAE-TOYOPEARL 650M を500mL 充填したカラムにマウントした。500mL の水で洗浄した後、0.5M NaCl 500mL (Ga-フコイダンが抽出される) 、さらに1.0M NaCl 500mL (L- フコイダンが抽出される) でフコイダンを溶離した。上記溶離液を流すとき、カラム出口から溶出する液をフラクションコレクターで20mLずつ分取し、各フラクションの一部をサンプリングし、HPLCで分析した。HPLC分析条件は次の通りである。カラム：Asahipak GS-520H、検出器：示差屈折、溶離液：0.3M NaNO3、流速：1.0mL ／分、カラム温度：60℃。各フコイダンのピークのあるフラクションを回収し、エバポレーターで濃縮後、分画分子量1000の透析膜で透析を25時間行った後、さらに濃縮した。得られた濃縮液を凍結乾燥した。
(2) フコイダン中の構成糖
各フコイダン30mgに１mol/L 硫酸10mLを加えて溶解し、オートクレーブ中で加水分解 (110 ℃、2.5 時間) した。炭酸バリウムで中和後 (pH試験紙で中和を確認) 、遠心分離 (3000rpm 、20分) を行った。上澄みを濾過し、エパポレーターで溶媒を留去した後、さらに55℃の電気乾燥機で３時間乾燥した。その後、水を加えて４mLに定容し、これを試料溶液とした。
(Reference Example 1)
(Extraction of fucoidan from cultured kombu temporary root)
The dried cultured kombu temporary root was coarsely pulverized with a crusher (cutter mill), and then finely powdered with a fine crusher (sample mill) to obtain a cultured kombu temporary root powder. To 500 g of the cultured kombu temporary root powder, 5000 mL of water was added, adjusted to
(Extraction of crude fucoidan)
Two times the amount of ethanol was added to the clear liquid obtained above to cause precipitation. After centrifugation, the precipitate was dried, dissolved in about seven times the amount of water, and adjusted to
(Reference Example 2)
Analysis of fucoidan derived from cultured kombu temporary roots
(1) Separation of Ga-fucoidan and L-fucoidan 4.5 g of the crude fucoidan obtained as described above was dissolved in 500 mL of water and mounted on a column packed with 500 mL of DEAE-TOYOPEARL 650M. After washing with 500 mL of water, fucoidan was eluted with 500 mL of 0.5 M NaCl (Ga-fucoidan was extracted) and further with 500 mL of 1.0 M NaCl (L-fucoidan was extracted). When flowing the eluent, 20 mL of the liquid eluted from the column outlet was collected by a fraction collector, and a part of each fraction was sampled and analyzed by HPLC. The HPLC analysis conditions are as follows. Column: Asahipak GS-520H, detector: differential refraction, eluent: 0.3 M NaNO 3 , flow rate: 1.0 mL / min, column temperature: 60 ° C. Fractions having peaks of each fucoidan were collected, concentrated with an evaporator, dialyzed with a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 1000 for 25 hours, and further concentrated. The resulting concentrated solution was lyophilized.
(2) Constituent sugars in fucoidan Each fucoidan (30 mg) was dissolved by adding 10 mL of 1 mol / L sulfuric acid and hydrolyzed (110 ° C., 2.5 hours) in an autoclave. After neutralization with barium carbonate (neutralization was confirmed with pH test paper), centrifugation (3000 rpm, 20 minutes) was performed. The supernatant was filtered, the solvent was distilled off with an evaporator, and further dried with an electric dryer at 55 ° C. for 3 hours. Thereafter, water was added to make a constant volume of 4 mL, and this was used as a sample solution.
別に、グルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、マンノースを各々10mg量り、水を加えて８mLに定容し標準溶液とした。
標準溶液および試料溶液20μL につき、次の条件で高速液体クロマトグラフィーにて各糖のピーク高さを測定し、標準溶液および試料溶液のピーク比から各糖の濃度を算出した。
Separately, 10 mg each of glucose, xylose, galactose, fucose and mannose was weighed, and water was added to make up a constant volume of 8 mL to obtain a standard solution.
For 20 μL of the standard solution and the sample solution, the peak height of each sugar was measured by high performance liquid chromatography under the following conditions, and the concentration of each sugar was calculated from the peak ratio of the standard solution and the sample solution.
カラム：ポリスフェア CHPB
検出器：示差屈折
カラム温度：80℃
流速：0.4 mL／分
溶離液：H2O
各フコイダンの構成糖の分析結果を表１に示す。
(3) フコイダン中のウロン酸
Ga- フコイダン、L-フコイダンをそれぞれ10mg量り水に溶解後、Ga- フコイダン溶液は50mLに、L-フコイダン溶液は10mLに定容する。
Column: Polysphere CHPB
Detector: Differential refraction Column temperature: 80 ° C
Flow rate: 0.4 mL / min Eluent: H 2 O
Table 1 shows the analysis results of the constituent sugars of each fucoidan.
(3) Uronic acid in fucoidan
Dissolve 10 mg each of Ga-fucoidan and L-fucoidan in water, and then adjust the volume of Ga-fucoidan solution to 50 mL and L-fucoidan solution to 10 mL.
試料溶液１mLを９mLスクリュー管に入れ、冷却しながら試薬１ (濃硫酸60mLに四ホウ化ナトリウム0.57ｇを溶解) を５mL加え沸騰水浴中で10分間加熱する。室温に冷却後、試薬２( 99.5％エタノール20mLにカルバゾール0.025 ｇを溶解) を0.2mL 加え、再び沸騰水浴中で15分間加熱する。室温に冷却後、吸光度を530nm で測定しグルクロン酸ナトリウムで作成した検量線から定量する。 Add 1 mL of the sample solution to a 9 mL screw tube, add 5 mL of Reagent 1 (0.57 g of sodium tetraboride dissolved in 60 mL of concentrated sulfuric acid) while cooling, and heat in a boiling water bath for 10 minutes. After cooling to room temperature, 0.2 mL of Reagent 2 (0.025 g of carbazole dissolved in 20 mL of 99.5% ethanol) is added and heated again in a boiling water bath for 15 minutes. After cooling to room temperature, the absorbance is measured at 530 nm and quantified from a calibration curve prepared with sodium glucuronate.
各フコイダンのウロン酸の測定結果を表１に示す。
(4)Ga-フコイダン、L-フコイダン中の硫酸基
各フコイダン10mgに１mol/L 塩酸10mLを加えて溶解し、オートクレーブ中で加水分解 (105 ℃、５時間) した。冷却後、水を加えて100mL に定容し試料溶液とした。別に硫酸ナトリウムを147.9mg 量り水を加えて正確に100mL とした (1000ppm SO4 標準液) 。調製した標準液を１mL、３mLおよび５mL採り、水を加えて正確に100mL とし、それぞれ10ppm 、30ppm および50ppm のSO4 標準溶液とした。
Table 1 shows the measurement results of uronic acid of each fucoidan.
(4) Sulfate groups in Ga-fucoidan and L-
試料溶液および標準溶液10μL につき、下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにて硫酸基のピーク高さを測定した。
標準溶液のピーク高さから検量線を作成し、試料溶液のピーク高さと検量線から試料溶液中の硫酸基の濃度を求め硫酸基の含有量を算出した。
For 10 μL of the sample solution and standard solution, the peak height of sulfate groups was measured by high performance liquid chromatography under the following conditions.
A calibration curve was created from the peak height of the standard solution, and the concentration of sulfate groups in the sample solution was determined from the peak height of the sample solution and the calibration curve, and the sulfate group content was calculated.
カラム：Shodex IC I-525A
カラム温度：40℃
溶離液：2.3mM フタル酸＋2.5mM トリス混合溶液
流速：1.5mL ／分
検出器：電気伝導度
各フコイダンの硫酸基の分析結果を表１に示す。
Column: Shodex IC I-525A
Column temperature: 40 ° C
Eluent: 2.3 mM phthalic acid + 2.5 mM Tris mixed solution Flow rate: 1.5 mL / min Detector: Electric conductivity Table 1 shows the analysis results of sulfate groups of each fucoidan.
(5) コンブ仮根部由来フコイダンの組成
表１に示す結果から、コンブ仮根部由来のフコイダンに特有のGaフコイダンは、構成糖としてフコース以外にガラクトース、キシロース、マンノースおよびグルコースを含むことが分かる。
（参考例３）
(養殖コンブ仮根からのフコイダン抽出)
乾燥した養殖コンブ仮根を粗砕機（カッターミル）で粗く粉砕した後、微砕機（サンプルミル）で微粉末にして、養殖コンブ仮根粉末を得た。試料360 ｇを0.25w/v ％クエン酸−水和物溶液4680mLに加え攪拌した。75℃の水浴に浸し、懸濁液が70℃に達してから３時間加熱した。冷却後、4500rpm で20分間遠心分離を行い、上清を吸引ろ過した。
（粗フコイダンの抽出）
上で得られた清澄な液を分画分子量10,000のフィルターを取り付けた限外ろ過機で10倍濃縮した。次いで、濃縮液と同量の水を加え２倍濃縮し、さらにこの操作を２回行った後、濃縮液を90℃で20分間加熱した。冷却後、凍結乾燥を行い、その重量を測定し粗フコイダンを11.7ｇ得た。
(5) Composition of Kombu temporary root-derived fucoidan From the results shown in Table 1, it can be seen that Ga fucoidan specific to fucoidan derived from Kombu temporary root includes galactose, xylose, mannose and glucose as constituent sugars in addition to fucose.
(Reference Example 3)
(Fucoidan extraction from farmed kombu temporary roots)
The dried cultured kombu temporary root was coarsely pulverized with a crusher (cutter mill), and then finely powdered with a fine crusher (sample mill) to obtain a cultured kombu temporary root powder. A sample of 360 g was added to 4680 mL of a 0.25 w / v% citric acid-hydrate solution and stirred. It was immersed in a 75 ° C. water bath and heated for 3 hours after the suspension reached 70 ° C. After cooling, the mixture was centrifuged at 4500 rpm for 20 minutes, and the supernatant was suction filtered.
(Extraction of crude fucoidan)
The clear liquid obtained above was concentrated 10 times with an ultrafilter equipped with a filter having a molecular weight cut off of 10,000. Next, the same amount of water as the concentrated solution was added to concentrate twice, and this operation was performed twice, and then the concentrated solution was heated at 90 ° C. for 20 minutes. After cooling, lyophilization was performed and the weight was measured to obtain 11.7 g of crude fucoidan.
（錠剤）
成分 １錠当たりの含有量
コンブ仮根部由来フコイダン ２５０mg
ソルビトール ２００mg
ステアリン酸Ｍｇ ８mg
サッカリンＮａ ２mg
合計 ４６０mg
(tablet)
Sorbitol 200mg
Stearic acid Mg 8mg
Saccharin Na 2mg
460mg total
（顆粒剤）
成分 １包当たりの含有量
コンブ仮根部由来フコイダン １０００mg
Ｄ−マンニトール ８００mg
マクロゴール ２００mg
ポリビニルピロリドン ５０mg
サッカリンＮａ ５mg
香料 適量
合計 ２０５５mg
(Granule)
Ingredients Content per pack Fucoidan derived from kombu temporary root 1000mg
D-mannitol 800mg
Macrogol 200mg
Polyvinylpyrrolidone 50mg
Saccharin Na 5mg
Perfume
Total 2055mg
（液剤）
成分 １回分当たりの含有量
コンブ仮根部由来フコイダン １０００mg
パラオキシ安息香酸エチル １０mg
パラオキシ安息香酸メチル ５mg
サッカリンＮａ １０mg
香料 適量
水 適量
合計 ５０mL
（試験例１）
(1) 予備試験
本試験の前に、予備試験として以下のようにして、インフルエンザウイルス接種後14日間にわたりマウスの死亡状況を確認し、本試験で使用するウイルス価を確認した。
(Liquid)
Ingredients per serving Fucoidan derived from kombu temporary root 1000mg
10 mg ethyl paraoxybenzoate
Methyl paraoxybenzoate 5mg
Saccharin Na 10mg
Perfume
Appropriate amount of water
50mL total
(Test Example 1)
(1) Preliminary test Before this test, as a preliminary test, the mouse death status was confirmed for 14 days after influenza virus inoculation, and the virus titer used in this test was confirmed.
６週齢のBALB/c(SPF) 雌マウス30匹に対し、インフルエンザウイルスA/PR/8/34(HINI) をそれぞれ10PFU 、100PFUおよび1000PFU/25μL で、エーテル麻酔下において点鼻接種し、14日間生死を観察した。 Thirty 6-week-old BALB / c (SPF) female mice were inoculated nasally with etheric anesthesia at 10 PFU, 100 PFU, and 1000 PFU / 25 μL of influenza virus A / PR / 8/34 (HINI). Observed daily for life and death.
図２に示す結果を得たので、本試験では1000PFU (LD50 値) で行う。
(2) コンブ仮根部由来フコイダンの抗インフルエンザウイルス効果試験
使用した動物は、４週齢のBALB/c(SPF) 雌マウス75匹であり、使用ウイルスは、インフルエンザウイルスA/PR/8/34(HINI) であった。
Since the result shown in FIG. 2 was obtained, 1000 PFU (LD 50 value) is used in this test.
(2) Anti-influenza virus effect test of fucoidan derived from kombu temporary root part The animals used were 75 4-week-old BALB / c (SPF) female mice, and the virus used was influenza virus A / PR / 8/34 ( HINI).
被験物質としては、上記参考例３で製造したフコイダンを用い、各被検物質を注射用蒸留水で至適濃度に溶解した。投与液量は10mL／kgとし、注射器および胃ゾンデを用いて強制経口投与した。用量は25、50、100mg ／kg／日の３用量で行った。被験物質の投与回数はウイルス接種の２週間前から接種後３日目まで１日１回、計18回であった。 As the test substance, the fucoidan produced in Reference Example 3 was used, and each test substance was dissolved to the optimum concentration with distilled water for injection. The administration liquid volume was 10 mL / kg, and oral gavage was performed using a syringe and a stomach tube. The dose was 25, 50, 100 mg / kg / day, 3 doses. The test substance was administered once a day from 2 weeks before virus inoculation to 3 days after inoculation, a total of 18 times.
ウイルスの接種は、予備試験で得られたLD50値 (1000PFU)で点鼻接種により行った。群の構成は以下の５群であった。
１群：感染なしかつ非投与 (陰性対照) ；n ＝15、
２群：感染ありかつ非投与 (陽性対照) ；n ＝15、
３群：感染ありかつ被験物質25mg／kg／日投与；n ＝16、
４群：感染ありかつ被験物質50mg／kg／日投与；n ＝16、
５群：感染ありかつ被験物質100mg ／kg／日投与；n ＝16、
ウイルス投与の２週間前から被験物質を１日１回投与し、その後ウイルスを１回接種し、さらに前に被験物質を１日１回、３日間投与し、ウイルス感染後の10日間の生存状況を確認した。なお、ウイルス感染４日後にマウスが衰弱したため、投与を中止したが、これは全群一斉に行われたので、生存率には影響しないと判断した。
The virus was inoculated by nasal inoculation with the LD 50 value (1000 PFU) obtained in the preliminary test. The group composition was as follows.
Group 1: no infection and no treatment (negative control); n = 15
Group 2: Infected and untreated (positive control); n = 15
Group 3: Infected and administered test substance 25 mg / kg / day; n = 16
Group 4: Infected and administered
Group 5: Infected and administered
Test substance is administered once a day for 2 weeks before the virus administration, then the virus is inoculated once, then the test substance is administered once a day for 3 days, and the survival situation for 10 days after virus infection. It was confirmed. In addition, the administration was stopped because the mice were weakened 4 days after the virus infection, but since this was performed simultaneously for all the groups, it was judged that the survival rate was not affected.
全症例について一般状態を毎日１回観察した。体重は全生存例について入荷時、被験物質投与開始時および１週間に２回の割合で測定した。
結果
・体重変化
各群の体重変化を図３に示した。図３に示すように、投与開始からウイルス接種の日までは、各群間に有意な差は認められなかった。ウイルス接種群 (２〜５群) では、陰性対照 (１群) と比較して体重が激減したが、ウイルス接種群の各群間には有意な差は認められなかった。なお、ウイルス接種後のデータは、生存例のみのデータである。
・生存率
各群の生存曲線を図４に示した。図４に示すように、ウイルス接種後５日目から８日目までにマウスは死亡した。ウイルス接種10日後の生存率は、対照群で26.7％、25mg／kg投与群で37.5％、50mg／kg投与群で56.3％、100 mg／kg投与群で62.5％であり、100 mg／kg投与群は対照群と比較して有意差が認められた (χ2 検定、Ｐ値0.0451) 。
（試験例２）
試験例１において、コンブ仮根部由来フコイダンの抗インフルエンザウイルス効果について、マウスの生存率を指標に効果を確認したところ、用量依存的に生存率を高める効果が認められた。本試験例では、この効果の機序解明の一環として、ウイルス力価およびサイトカイン産生について検討した。
General conditions were observed once daily for all cases. Body weight was measured at the time of arrival, the start of administration of the test substance, and twice a week for all surviving cases.
Results and body weight changes The body weight changes of each group are shown in FIG. As shown in FIG. 3, there was no significant difference between the groups from the start of administration to the day of virus inoculation. In the virus inoculated group (
-Survival rate The survival curve of each group was shown in FIG. As shown in FIG. 4, the mice died from the 5th day to the 8th day after the virus inoculation.
(Test Example 2)
In Test Example 1, the anti-influenza virus effect of the kombu temporary root-derived fucoidan was confirmed using the survival rate of mice as an index, and the effect of increasing the survival rate in a dose-dependent manner was observed. In this test example, virus titer and cytokine production were examined as part of the elucidation of the mechanism of this effect.
試験例１と同様の被験物質およびマウス (ただし94匹) を用いた。被験物質の投与はウイルス接種の２週間前から接種後２日目まで１日１回であった。各被検物質を注射用蒸留水で至適濃度に溶解した。投与液量は10mL／kgとし、注射器および胃ゾンデを用いて強制経口投与した。用量は50および100 mg／kg／日とした。 The same test substance and mice as those in Test Example 1 (94 mice) were used. The test substance was administered once a day from 2 weeks before virus inoculation to 2 days after inoculation. Each test substance was dissolved to the optimum concentration with distilled water for injection. The administration liquid volume was 10 mL / kg, and oral gavage was performed using a syringe and a stomach tube. The dose was 50 and 100 mg / kg / day.
ウイルス接種の２週間前から被験物質を経口投与し、ウイルス (A/PR/8/34(HINI))接種を行い、接種２日目まで被験物質の投与を継続した。陰性対照および陽性対照群には溶媒を投与した。接種３日目に採血を行い、肺を摘出した。
血液は血清を分画し、INF-γ、IL-4、IL-12 およびIL-6濃度を測定した。肺については、ウイルス力価およびサイトカインを測定した。さらに、肺の病理組織的観察を行った。試験進行および群構成は以下の通りとした。
The test substance was orally administered from 2 weeks before the virus inoculation, the virus (A / PR / 8/34 (HINI)) was inoculated, and the test substance was continuously administered until the second day of the inoculation. A solvent was administered to the negative control group and the positive control group. On the third day of inoculation, blood was collected and the lungs were removed.
Blood fractionated serum and measured INF-γ, IL-4, IL-12 and IL-6 concentrations. For lungs, virus titers and cytokines were measured. In addition, histopathological observation of the lung was performed. The test progress and group composition were as follows.
結果
・肺内ウイルス価
肺ホモジネート中のウイルス力価を測定するために、MDCK細胞を用いてプラークアッセイを行った。実験１では、高用量群において有意にウイルス価が減少していた (表３) 。
Results-Intrapulmonary virus titer To measure the virus titer in lung homogenate, a plaque assay was performed using MDCK cells. In
実験２においては高用量群で感染２日後のウイルス力価が70％減少していた (図５) 。
・病理学的観察
感染１、２、３日後に肺の摘出を行って切片を作製し、インフルエンザ感染による肺の組織像の変化を観察した。対照群では、感染１日後の肺胞壁の肥厚および肺胞腔への白血球の浸潤が見られた。感染２日後では肺胞壁の肥厚および肺胞腔への白血球の浸潤がより顕著に見られるようになり、感染３日後では激しい炎症像を認められる部分が存在していた。フコイダン投与群では、炎症の軽減が認められた。
・サイトカイン
血清および肺ホモジネート中に含まれるTNF-α,INF- β, INF-γ, IL-6, IL-4, IL-12, IL-18をELISA よって定量した。血清中のINF-γ, IL-6, IL-4, IL-12 の量には違いは認められなかった (データ示さず) が、肺ホモジネート中では感染１日後のTNF-αと感染３日後のIL-12 、INF-γはフコイダン投与により有意に減少しており、IL-6および IL-18にも減少傾向が見られた。また、INF-βは対照群の感染２日後でのみ検出された (図６) 。
In
-Pathological observation Lungs were removed 1, 2 and 3 days after infection to prepare sections, and changes in lung tissue images due to influenza infection were observed. In the control group, thickening of the
Cytokines TNF-α, INF-β, INF-γ, IL-6, IL-4, IL-12, and IL-18 contained in serum and lung homogenate were quantified by ELISA. There was no difference in the amounts of serum INF-γ, IL-6, IL-4, IL-12 (data not shown), but in lung homogenates, TNF-
インフルエンザウイルスは主に気道上皮細胞に感染し、急性の呼吸器障害をもたらす。下気道にまで感染が広がると、重篤な肺炎になる。ウイルス感染初期の防御応答としては、好中球による感染細胞の障害、感染細胞からのI 型IFN の産生などが起こり、感染後期ではCTL による細胞障害、形質細胞によるIgG2a などが起こる。 Influenza viruses primarily infect respiratory epithelial cells and cause acute respiratory damage. When infection spreads to the lower respiratory tract, it becomes severe pneumonia. The protective response at the early stage of viral infection includes damage of infected cells by neutrophils, production of type I IFN from infected cells, and late damage of cells by CTLs and IgG2a by plasma cells.
フコイダンの抗インフルエンザウイルス効果を確かめるために行ったウイルス力価の測定の結果から、フコイダンは抗インフルエンザ効果を有することが分かった。肺内サイトカインを定量したところ、フコイダン投与群ではTNF-α,INF- γ, IL-12 に有意な減少が見られた。フコイダン投与群では対照群と比較して感染１日後のウイルス力価が減少していたため、サイトカイン産生量も減少したと考えられる。 From the result of the measurement of the virus titer performed to confirm the anti-influenza virus effect of fucoidan, it was found that fucoidan has an anti-influenza effect. As a result of quantification of pulmonary cytokines, there was a significant decrease in TNF-α, INF-γ, and IL-12 in the fucoidan administration group. In the fucoidan-administered group, the virus titer one day after the infection was reduced as compared to the control group, and it is considered that the amount of cytokine production also decreased.
このように、コンブ仮根部由来フコイダンの投与によりマウスの免疫が賦活化され、インフルエンザウイルスに対する免疫力が向上したと考えられる。 Thus, it is considered that the immunity of mice was activated by the administration of the kombu temporary root-derived fucoidan, and the immunity against influenza virus was improved.
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