JP2011155913A - APTAMER MOLECULE BINDING TO TNF-alpha - Google Patents

APTAMER MOLECULE BINDING TO TNF-alpha Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an RNA aptamer molecule having binding ability to human TNF-α. <P>SOLUTION: The RNA aptamer molecule having binding ability to human TNF-α, for example TNF-130: 5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGGUCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGGCUAGUAUCCGGAACGUGAC-3', comprises an internal loop-like core structure featured by two motifs, Motif 1: 5'-UUUUCACCGG-3' and Motif 2: 5'-CUAGACAGG-3', and can form a specific complex with human TNF-α by using the internal loop-like core structure portion. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、腫瘍壊死因子−α（Tumor Necrosis Factor−α：ＴＮＦ−α）に結合するアプタマー分子に関する。特には、本発明は、ヒトＴＮＦ−αに結合するＲＮＡアプタマー分子に関する。   The present invention relates to an aptamer molecule that binds to tumor necrosis factor-α (TNF-α). In particular, the present invention relates to RNA aptamer molecules that bind to human TNF-α.

ヒトＴＮＦ−αは、１５７アミノ酸残基、分子量１７ｋＤａのタンパク質であり、一般に、ヒトＴＮＦ−αはホモ３量体を形成し、血液中を循環する。ＴＮＦ−αは、細胞外サイトカインであり、サイトカインや免疫調節分子の産生、細胞増殖および分化、アポトーシスなどを誘起する生物作用を示す。その他に、ヒトＴＮＦ−αが関与する生理作用として、胸腺細胞の増殖促進、Ｂ細胞の抗体産生促進、マクロファージの活性化、破骨細胞の活性化などが知られている。   Human TNF-α is a protein having 157 amino acid residues and a molecular weight of 17 kDa. Generally, human TNF-α forms a homotrimer and circulates in the blood. TNF-α is an extracellular cytokine and exhibits biological actions that induce the production of cytokines and immunoregulatory molecules, cell proliferation and differentiation, apoptosis, and the like. Other known physiological actions involving human TNF-α include thymocyte proliferation promotion, B cell antibody production promotion, macrophage activation, and osteoclast activation.

ＴＮＦ−αは、細胞表面にあるＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）への結合を介して、その生物活性を発揮する。ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）には、分子量５５ｋＤのＴＮＦ−ＲＩと、分子量が７５ｋＤのＴＮＦ−ＲIIの二種が存在している。ＴＮＦ−ＲＩとＴＮＦ−ＲIIの二種の受容体は、いずれも、ＴＮＦ−αに対する高い親和性を有している。   TNF-α exerts its biological activity through binding to a TNF receptor (TNF-R) on the cell surface. There are two types of TNF receptors (TNF-R): TNF-RI with a molecular weight of 55 kD and TNF-RII with a molecular weight of 75 kD. Both of the two receptors, TNF-RI and TNF-RII, have a high affinity for TNF-α.

ＴＮＦ−αと構造的な類似性を有する、ＴＮＦファミリーに含まれるタンパク質として、ＴＮＦ−βが存在している。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βファミリー内の配列同一性は、それぞれ７１％および６１％である。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β間の配列同一性は２９％であり、類似性は低いが、ＴＮＦ−βは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）に、ＴＮＦ−αと同等の親和性で結合する。従って、ＴＮＦ−βは、ＴＮＦ−αと類似した生物活性を発揮できる。   TNF-β exists as a protein included in the TNF family that has structural similarity to TNF-α. The sequence identity within the TNF-α and TNF-β families is 71% and 61%, respectively. Although the sequence identity between TNF-α and TNF-β is 29% and the similarity is low, TNF-β binds to the TNF receptor (TNF-R) with the same affinity as TNF-α. . Therefore, TNF-β can exert a biological activity similar to TNF-α.

免疫応答や炎症反応が生じていない、健康な個体では、ＴＮＦ−αの血液中濃度は、５ｐｇ／ｍｌ未満である。ＴＮＦ−αホモ３量体の過剰発現は、敗血症ショック、リウマチ関節炎などの疾患の発症を引き起こす。クローン病に関連した、炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎、デュシュンヌ型筋ジストロフィーなどの病態では、低濃度のＴＮＦ−αホモの上昇が起こる。その他、ＴＮＦ−αは、破骨細胞の活性化に関与することから、骨粗鬆症との関連が示唆されている。   In healthy individuals who have not developed an immune or inflammatory response, the blood concentration of TNF-α is less than 5 pg / ml. Overexpression of TNF-α homotrimer causes the onset of diseases such as septic shock and rheumatoid arthritis. In conditions such as inflammatory colitis, ulcerative colitis, and Duchenne muscular dystrophy associated with Crohn's disease, elevated low levels of TNF-α homozygote occur. In addition, TNF-α is involved in osteoclast activation, suggesting an association with osteoporosis.

ＴＮＦ−αは、敗血症ショック、リウマチ関節炎、移植拒絶反応、ＡＩＤＳ、カヘキシー（悪液質）、パーキンソン病などの病態に深く関与することが知られている。すなわち、ＴＮＦ−αが深く関与する各種の病態について、その診断を進める際、ＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度の測定が不可欠である。一方、クローン病に関連した、炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎、デュシュンヌ型筋ジストロフィーなどの病態では、ＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度の上昇は起こるが、その濃度上昇は、通常、低濃度領域に留まっている。具体的には、敗血症ショックを誘起するＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度レベルと比較し、有意に低い濃度レベルに留まっている。従って、各種の病態について、その診断を進める際、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度を、５ｐｇ／ｍｌ（ホモ３量体換算濃度０．１ｐＭ）程度の低い濃度でも高い定量性で測定可能な、高感度の測定手段が望まれている。   TNF-α is known to be deeply involved in pathological conditions such as septic shock, rheumatoid arthritis, transplant rejection, AIDS, cachexia, and Parkinson's disease. That is, for various pathological conditions in which TNF-α is deeply involved, measurement of the blood concentration of a homotrimer of TNF-α is indispensable. On the other hand, in the pathological conditions related to Crohn's disease such as inflammatory colitis, ulcerative colitis, Duchenne muscular dystrophy, an increase in the blood concentration of the homotrimer of TNF-α occurs. It remains in the low concentration region. Specifically, compared to the blood concentration level of TNF-α homotrimer that induces septic shock, the concentration level is significantly lower. Therefore, when proceeding with the diagnosis of various pathological conditions, the blood concentration of human TNF-α homotrimer is highly quantitative even at a low concentration of about 5 pg / ml (concentration equivalent to homotrimer 0.1 pM). A highly sensitive measuring means that can be measured by the above is desired.

ヒトＴＮＦ−αは、ホモ３量体の形状で産生細胞から放出される。このヒトＴＮＦ−αホモ３量体は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）に結合可能であるが、ヒトＴＮＦ−αの単量体は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）に結合することができない。従って、血液中に含有されている、ヒトＴＮＦ−αの単量体とホモ３量体を合計したタンパク質濃度ではなく、ヒトＴＮＦ−αホモ３量体の濃度を高い定量性で測定可能な、高感度の測定手段が望まれている。   Human TNF-α is released from production cells in homotrimeric form. The human TNF-α homotrimer can bind to the TNF receptor (TNF-R), but the monomer of human TNF-α cannot bind to the TNF receptor (TNF-R). . Therefore, it is possible to measure the concentration of human TNF-α homotrimer with high quantitativeness, not the protein concentration of the total of human TNF-α monomer and homotrimer contained in blood. A highly sensitive measuring means is desired.

例えば、敗血症ショックを引き起こす、ヒトＴＮＦ−αホモ３量体の過剰発現が生じると、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度は、少なくとも、１０００ｐｇ／ｍｌの水準（ホモ３量体換算濃度２０ｐＭ）に達する。従って、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体の血液中濃度に関して、少なくとも、５ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲（ホモ３量体換算濃度 ０．１ｐＭ〜２０ｐＭの範囲）において、高い定量性で濃度の測定可能な、高感度の測定手段が望まれている。   For example, when overexpression of human TNF-α homotrimer causing septic shock occurs, the blood concentration of human TNF-α homotrimer is at least at a level of 1000 pg / ml (in terms of homotrimer). The concentration reaches 20 pM). Therefore, with regard to the blood concentration of human TNF-α homotrimer, at least in the range of 5 pg / ml to 1000 pg / ml (in the range of homotrimer equivalent concentration 0.1 pM to 20 pM), the concentration is highly quantitative. Therefore, there is a demand for a high-sensitivity measuring means capable of measuring the above.

各種のタンパク質分子の高感度測定は、検出対象のタンパク質分子に対して、特異的で高い結合能を有する分子を利用することで達成できる。例えば、検出対象のタンパク質分子に対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を利用して、アプタマー分子と検出対象のタンパク質分子の複合体を形成させ、検出対象のタンパク質分子の濃度を測定する手段が望まれている。すなわち、前記の目的に利用可能な、ＴＮＦ−αに対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子の提供が望まれている。   High-sensitivity measurement of various protein molecules can be achieved by using molecules that are specific and have high binding ability for the protein molecule to be detected. For example, by using an aptamer molecule that has a specific and high binding ability to a protein molecule to be detected, a complex of the aptamer molecule and the protein molecule to be detected is formed, and the concentration of the protein molecule to be detected is measured. A means to do this is desired. That is, it is desired to provide an aptamer molecule having a specific and high binding ability to TNF-α that can be used for the above purpose.

特に、上述のＴＮＦ−αが発揮する生理作用は、ＴＮＦ−αのホモ３量体のＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）への結合を介して発揮されるため、血液中に存在するＴＮＦ−αのホモ３量体の濃度の検出に利用可能な、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子の提供が望まれている。   In particular, the physiological action exerted by TNF-α described above is exerted through the binding of TNF-α homotrimer to the TNF receptor (TNF-R), and thus TNF-α present in blood. It is desired to provide an aptamer molecule having a specific and high binding ability, which can be used for detecting the concentration of homotrimers.

例えば、血液試料から調製される血漿試料中には、ホモ３量体型のＴＮＦ−α以外に、種々の可溶性タンパク質や脂質分子が含まれている。その際、ホモ３量体型のＴＮＦ−α以外の、種々の可溶性タンパク質や脂質分子に対しては、実質的に結合能を有さず、ホモ３量体型のＴＮＦ−αに対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を利用することで、ホモ３量体型のＴＮＦ−αを高感度で測定することが可能となる。   For example, plasma samples prepared from blood samples contain various soluble proteins and lipid molecules in addition to homotrimeric TNF-α. At that time, it has no binding ability to various soluble proteins and lipid molecules other than the homotrimeric TNF-α, and is specific to the homotrimeric TNF-α. By using an aptamer molecule having a high binding ability, homotrimeric TNF-α can be measured with high sensitivity.

具体的には、ホモ３量体型のＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子とを組み合わせることで、所謂、ＥＬＩＳＡ法と同様なホモ３量体型のＴＮＦ−αの定量的な検出系を構成することができる。例えば、ホモ３量体型のＴＮＦ−αに対する、平衡解離定数ＫD≦１ｐＭの特異的なモノクローナル抗体を利用して、ホモ３量体型のＴＮＦ−αを固定化した上で、固定化されたホモ３量体型のＴＮＦ−αに、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を結合させる。固定化されたホモ３量体型のＴＮＦ−αと結合しているアプタマー分子の量を測定することで、固定化されたホモ３量体型のＴＮＦ−αの量の定量が可能となる。 Specifically, by combining a monoclonal antibody having a specific reactivity with homotrimeric TNF-α and an aptamer molecule having a specific and high binding ability, it is the same as the so-called ELISA method. A quantitative detection system for homotrimeric TNF-α can be constructed. For example, using a specific monoclonal antibody with an equilibrium dissociation constant K D ≦ 1 pM for homotrimeric TNF-α, the homotrimeric TNF-α is immobilized, An aptamer molecule having specific and high binding ability is bound to the trimeric TNF-α. By measuring the amount of aptamer molecules bound to the immobilized homotrimeric TNF-α, the amount of the immobilized homotrimeric TNF-α can be quantified.

さらには、ホモ３量体型のＴＮＦ−αに対して、結合部位が相違する、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子二種を組み合わせることで、所謂、ＥＬＩＳＡ法と同様なホモ３量体型のＴＮＦ−αの定量的な検出系を構成することもできる。   Furthermore, the homotrimeric type TNF-α is combined with two types of aptamer molecules having different binding sites and specific high binding ability, so that the homotrimeric type similar to the so-called ELISA method is used. A quantitative detection system of TNF-α can also be configured.

本発明は、上記の課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、検出対象のＴＮＦ−αの濃度、特には、ヒトＴＮＦ−αホモ３量体の濃度を高い感度で測定する際に利用可能な、ＴＮＦ−α、なかでも、ヒトＴＮＦ−αに対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を提供することにある。特には、本発明の目的は、ヒトＴＮＦ−αホモ３量体に対して、特異的で高い結合能を有するアプタマー分子を提供することにある。   The present invention solves the above problems. That is, the object of the present invention is to provide TNF-α, particularly human, which can be used for measuring the concentration of TNF-α to be detected, particularly the concentration of human TNF-α homotrimer with high sensitivity. An object of the present invention is to provide an aptamer molecule having a specific and high binding ability to TNF-α. In particular, an object of the present invention is to provide an aptamer molecule having a specific and high binding ability to human TNF-α homotrimer.

本発明者らは、前記の課題を解決すべく、まず、ヒトＴＮＦ−αに対して、一定水準以上の結合能を示す「ヒトＴＮＦ−αに対するＲＮＡアプタマー分子」が実際に存在するか否かに関して、選別を行った。さらに、仮に、一定水準以上の結合能を示す「ヒトＴＮＦ−αに対するＲＮＡアプタマー分子」が存在する際には、その「ヒトＴＮＦ−αに対するＲＮＡアプタマー分子」を構成する一本鎖核酸分子の塩基配列を特定することを試みた。   In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors firstly determined whether or not “an RNA aptamer molecule against human TNF-α” that exhibits a binding ability to human TNF-α at a certain level or higher actually exists. With regard to Furthermore, if there exists an “RNA aptamer molecule for human TNF-α” that exhibits a binding ability of a certain level or more, the base of the single-stranded nucleic acid molecule constituting the “RNA aptamer molecule for human TNF-α” An attempt was made to identify the sequence.

一般に、対象分子に対する「ＲＮＡアプタマー分子」の探索には、「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」を作製し、対象分子に対する結合能に関して、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングが利用される。   In general, for the search for “RNA aptamer molecule” for a target molecule, screening using a SELEX method for producing a “random single-stranded nucleic acid molecule library” and binding ability to the target molecule is used.

ヒトＴＮＦ−αは、１５７アミノ酸残基からなるタンパク質であり、そのホモ３量体と複合体を形成可能な「ＲＮＡアプタマー分子」は、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、５１塩基長の部分（Ｎ51）が挿入されている形態の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」中に存在していると予測した。 Human TNF-α is a protein consisting of 157 amino acid residues, and an “RNA aptamer molecule” capable of forming a complex with its homotrimer has a fixed region at the 5 ′ end and a fixed region at the 3 ′ end. It was predicted that a random base sequence (N 51 ) having a random base sequence was inserted in a “random single-stranded RNA molecule library”.

本発明者らは、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングに利用する、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、５１塩基長の部分（Ｎ51）が挿入されている形態の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」として、
５’末端の固定領域：GGAAGACCAG CCUUAAGAGGG；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGUAUCCG GAACGUGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
を具える、全長９０塩基長の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を選択した。 The present inventors use a 51-base length portion (N 51) having a random base sequence between a 5′-terminal fixed region and a 3′-terminal fixed region, which is used for screening to which the SELEX method is applied. ) Is inserted as a "random single-stranded RNA molecule library"
5 'terminal fixed region: GGAAGACCAG CCUUAAGAGGG; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
3 'terminal fixed region: CUAGUAUCCG GAACGUGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
A “random single-stranded RNA molecule library” having a total length of 90 bases was selected.

対象タンパク質として、市販のRecombinant Human TNF-α(PeproTech #300-01A)を利用して、該タンパク質に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を探索した。   As a target protein, commercially available Recombinant Human TNF-α (PeproTech # 300-01A) was used to search for an “RNA aptamer molecule” having binding ability to the protein.

ＳＥＬＥＸ・スクリーニング・ラウンドを延べ１０ラウンド繰り返し、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。   The SELEX screening round was repeated a total of 10 rounds to select “RNA aptamer molecules” capable of binding to Recombinant Human TNF-α (homotrimer).

各ラウンドでは、バインディング・バッファ溶液として、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClを用いて、該タンパク質・ＲＮＡ分子の複合体形成を行っている。タンパク質ならびに形成された複合体の回収は、ニトロセルロースフィルターを用いたＦｉｌｔｅｒ分離法を利用した。ニトロセルロースフィルター上に回収されているタンパク質・ＲＮＡ分子の複合体から、一本鎖ＲＮＡ分子を、次の溶出条件で溶出させる。該ニトロセルロースフィルターを組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 7M Ureaの溶出バッファ溶液中に浸漬し、９０℃で５分間加熱し、一本鎖ＲＮＡ分子の“unfolding”処理を施す。該“unfolding”処理によって、一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造、ならびに三次構造は解消される結果、該一本鎖ＲＮＡ分子は、変性剤の尿素の高濃度溶液中に溶出される。 In each round, HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl is used as a binding buffer solution to form a complex of the protein / RNA molecule. The protein and the formed complex were collected using a filter separation method using a nitrocellulose filter. From the protein / RNA molecule complex recovered on the nitrocellulose filter, single-stranded RNA molecules are eluted under the following elution conditions. The nitrocellulose filter is immersed in an elution buffer solution of composition: HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 7M Urea and heated at 90 ° C. for 5 minutes to “unfold” the single-stranded RNA molecule. Apply. The “unfolding” treatment eliminates the secondary structure and tertiary structure of the single-stranded RNA molecule, and as a result, the single-stranded RNA molecule is eluted in a high concentration solution of the denaturing urea.

前記１０ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群から、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った。取得した各クローンについて、前記ｃＤＮＡの塩基配列を特定した。各クローンについて、導入されているｃＤＮＡを鋳型として「ＲＮＡアプタマー分子」を調製し、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能の評価を行った。少なくとも、前記バインディング・バッファ溶液中における解離定数ＫDが、ＫD≦１０ｎＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」を選択した。さらに、前記の選択条件を満足する「ＲＮＡアプタマー分子」について、その塩基配列を解析した。 From the group of “RNA aptamer molecules” collected in the 10th round, cDNAs prepared by reverse transcription were each introduced into Escherichia coli and cloned. For each obtained clone, the base sequence of the cDNA was specified. For each clone, an “RNA aptamer molecule” was prepared using the introduced cDNA as a template, and the binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) was evaluated using a surface plasmon resonance measuring apparatus. . At least “RNA aptamer molecule” having a dissociation constant K D in the binding buffer solution satisfying K D ≦ 10 nM was selected. Furthermore, the base sequence of the “RNA aptamer molecule” that satisfies the above selection conditions was analyzed.

その結果、ＫD≦１０ｎＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」として、選別された一群の「ＲＮＡアプタマー分子」中には、ＫD≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」も存在することが判明した。 As a result, it was found that, as “RNA aptamer molecules” satisfying the condition of K D ≦ 10 nM, “RNA aptamer molecules” estimated to have K D ≦ 10 pM exist in the selected group of “RNA aptamer molecules”. did.

前記１０ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群から、作製した一群のクローンにおいて、その「ランダムな塩基配列」部分が一致しているクローン数が２以上存在する、クローン・ファミリーを選別した。選別されたクローン・ファミリー中には、ＫD≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」から作製されたクローンのファミリーも含まれている。このＫD≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」から作製されたクローンのファミリーの一つは、下記の塩基配列を有しており、そのｃＤＮＡを保持するクローンに、識別のための名称をTNF-130と付した。 From a group of “RNA aptamer molecules” collected in the 10 rounds, a clone family in which the number of clones having the same “random base sequence” portion in the group of prepared clones was 2 or more was selected. . Among the selected clone family, a family of clones made from “RNA aptamer molecules” estimated to have K D ≦ 10 pM is also included. One of the families of clones prepared from the “RNA aptamer molecule” estimated to have K D ≦ 10 pM has the following base sequence, and the clone for holding the cDNA has a name for identification as TNF: -130.

Clone：TNF-130中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TCCCATATGGATCCCTTTTCACCGGTACCAATAGCAAATACCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号：１３）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-130：
5’−GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC−3’ （配列番号：１）
さらに、前記１０ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群に対して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能に関して、追加の２ラウンドのスクリーニングを行った。その際、ＲＮＡ鎖を構成する各リボ核酸の２'−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型のアプタマー分子を作製した。追加の２ラウンドでは、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型のアプタマー分子の一群をスクリーニングの対象としている。この追加の２ラウンドを含め、合計１２ラウンドの選別を行った、Recombinant Human TNF-αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の群を回収した。 Clone: nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-130:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TCCCATATGGATCCCTTTTCACCGGTACCAATAGCAAATACCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 13)
“RNA aptamer molecule” TNF-130:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 1)
Furthermore, with respect to a group of “RNA aptamer molecules” collected in the 10 rounds, two additional rounds of binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) are obtained using a surface plasmon resonance measuring apparatus. Was screened. At that time, a 2′F modified RNA strand type aptamer molecule that has been modified to replace the 2′-position hydroxyl group (—OH) of each ribonucleic acid constituting the RNA strand with a fluorine atom (—F) is used. Produced. In the additional two rounds, a group of 2′F modified RNA strand aptamer molecules are targeted for screening. A group of “RNA aptamer molecules” having the ability to bind to Recombinant Human TNF-α was collected, including a total of 12 rounds, including these two additional rounds.

前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群についても、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った。取得した各クローンについて、前記ｃＤＮＡの塩基配列を特定した。各クローンについて、導入されているｃＤＮＡを鋳型として「ＲＮＡアプタマー分子」を調製し、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能の評価を行った。   For the group of “RNA aptamer molecules” for which a total of 12 rounds of selection were completed, cDNA prepared by reverse transcription was introduced into Escherichia coli and cloned. For each obtained clone, the base sequence of the cDNA was specified. For each clone, an “RNA aptamer molecule” was prepared using the introduced cDNA as a template, and the binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) was evaluated using a surface plasmon resonance measuring apparatus. .

その結果、前記合計１２ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群から、作製した一群のクローンにおいても、その「ランダムな塩基配列」部分が一致しているクローン数が２以上存在する、クローン・ファミリーを選別した。選別されたクローン・ファミリー中には、ＫD≦１０ｎＭと見積もられる、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型「ＲＮＡアプタマー分子」の鋳型のｃＤＮＡを保持するクローンのファミリーも含まれている。このＫD≦１０ｎＭと見積もられる、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型「ＲＮＡアプタマー分子」の鋳型のｃＤＮＡを保持するクローンのファミリーは、下記の塩基配列を有しており、そのｃＤＮＡを保持するクローンに、それぞれ、識別のための名称を、TNF-458、TNF-505、TNF-508、TNF-510と付した。 As a result, in a group of clones prepared from a group of “RNA aptamer molecules” collected in a total of 12 rounds, there are two or more clones in which the “random base sequence” part matches.・ Selected families. The selected clone family includes a family of clones that hold the template cDNA of the 2′F-modified RNA strand type “RNA aptamer molecule” estimated to be K D ≦ 10 nM. The family of clones that hold the template cDNA of the 2′F modified RNA strand type “RNA aptamer molecule” estimated as K D ≦ 10 nM has the following base sequence. The names for identification are given as TNF-458, TNF-505, TNF-508, and TNF-510, respectively.

Clone：TNF-458中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TGAGATATCGCTCCATTTTCAAATTTATCTATACAAACACTTTGATTCG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１４）
TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
Clone：TNF-505中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TACAATATCTATCACCTTTTACTGGCTACGAGGAGCAAGTACCCAGACATG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１５）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
Clone：TNF-508中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
CTCCATATGGATCTCTGTTCCCCGCACCTGAGAGCCAATACCTTGACATC
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１６）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
Clone：TNF-510中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TCACATATGGATCCCTTTTCAACGGTACCAATAGCTTGCAGTTAAATACA
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１７）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
なお、前記の各クローンのファミリーを鋳型として作製される「ＲＮＡアプタマー分子」も、合計１０ラウンドの選別を経ており、前記２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型「ＲＮＡアプタマー分子」と同様に、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有すると、判断される。 Clone: nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-458:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TGAGATATCGCTCCATTTTCAAATTTATCTATACAAACACTTTGATTCG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 14)
TNF-485 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
Clone: nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-505:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TACAATATCTATCACCTTTTACTGGCTACGAGGAGCAAGTACCCAGACATG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 15)
"RNA aptamer molecule" TNF-505 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
Clone: nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-508:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
CTCCATATGGATCTCTGTTCCCCGCACCTGAGAGCCAATACCTTGACATC
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 16)
"RNA aptamer molecule" TNF-508 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
Clone: nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-510:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TCACATATGGATCCCTTTTCAACGGTACCAATAGCTTGCAGTTAAATACA
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 17)
"RNA aptamer molecule" TNF-510 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
The “RNA aptamer molecule” prepared using the above-mentioned family of each clone as a template has also been subjected to a total of 10 rounds of selection, and similarly to the 2′F modified RNA strand type “RNA aptamer molecule”, Recombinant Human TNF It is judged to have binding ability to -α (homotrimer).

「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-458：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:２）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-505：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:３）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-508：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:４）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-510：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:５）
前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群について、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った際、TNF-130と、上記のTNF-458、TNF-505、TNF-508、TNF-510は、いずれも、複数個のクローンを与えている。換言すると、前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群中に、相当の比率で、これらの「ＲＮＡアプタマー分子」が含まれていることを示している。 “RNA aptamer molecule” TNF-458:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
“RNA aptamer molecule” TNF-505:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
"RNA aptamer molecule" TNF-508:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
"RNA aptamer molecule" TNF-510:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
With respect to the group of “RNA aptamer molecules” after the selection of 12 rounds in total, when cDNA prepared by reverse transcription was introduced into Escherichia coli and cloned, TNF-130 and the above TNF- 458, TNF-505, TNF-508, and TNF-510 all give a plurality of clones. In other words, it is shown that these “RNA aptamer molecules” are contained in a considerable ratio in the group of “RNA aptamer molecules” after the 12 rounds of selection.

本発明者らは、ＫD≦１０ｎＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」である、TNF-130において、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成に関与する立体構造上の特徴を推定するため、先ず、その二次構造の推定を行った。図２に示す、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に、内部ループ様の構造が構成されている点に着目した。TNF-130の「ランダム配列」領域において、この内部ループ様の構造の構成に関与している部分として、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域に着目した。 In the TNF-130, which is an “RNA aptamer molecule” that satisfies the condition of K D ≦ 10 nM, the present inventors have a three-dimensional structure involved in complex formation with Recombinant Human TNF-α (homotrimer). In order to estimate the characteristics, first, the secondary structure was estimated. In the estimated secondary structure of TNF-130 shown in FIG. 2, attention was paid to the fact that an inner loop-like structure is formed at the center. In the “random sequence” region of TNF-130, two regions of “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” are involved in the structure of this internal loop-like structure. Focused on.

一方、本発明者らは、選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群中に、相当の比率で含有されている「ＲＮＡアプタマー分子」は、そのRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能は、一定水準を超えたものであると判断した。本発明者らは、選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群について、そのｃＤＮＡの群を調製し、その塩基配列解析の結果に基づき、相当の比率で含有されている「ＲＮＡアプタマー分子」の有無を調べた。前記ｃＤＮＡの群を対象とする、塩基配列解析は、Genome sequencer FLX systemを応用した、高速シークエンス解析を利用している。   On the other hand, the present inventors have selected “RNA aptamer molecules” contained in a considerable ratio in the group of “RNA aptamer molecules” that have been selected, and the Recombinant Human TNF-α (homotrimer). The binding ability was judged to exceed a certain level. The present inventors prepared the cDNA group for the group of “RNA aptamer molecules” that have been selected, and based on the results of the base sequence analysis, the “RNA aptamer molecules” contained in a considerable ratio. The presence or absence was examined. Base sequence analysis for the cDNA group uses high-speed sequence analysis using the Genome sequencer FLX system.

その結果、実際に、上記の選別条件を満たす「クローン・ファミリー」を構成していたTNF-130は、解析されたｃＤＮＡの群中に、「28／3153」程度の頻度で含有されていることが確認された。   As a result, TNF-130 that actually constituted the “clone family” that satisfies the above selection conditions was contained in the analyzed cDNA group at a frequency of about “28/3153”. Was confirmed.

前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群中に、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えている「ＲＮＡアプタマー分子」が、他にも含まれているか、否かを調査した。その結果、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を具え、解析されたｃＤＮＡの群中に、「32／3153」の頻度で含有されている「ｃＤＮＡ」として、下記の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のｃＤＮＡが見出された。この「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のｃＤＮＡを、大腸菌に導入して、クローン化を行った。   In the group of “RNA aptamer molecules” that have been selected for a total of 12 rounds, partial sequences showing similarity to “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” in TNF-130 Whether or not other “RNA aptamer molecules” having similar relative positions are included. As a result, it has a partial sequence similar to “5′-TTTTCACCGG-3 ′” and “5′-CTAGACAGG-3 ′” and is contained in the analyzed cDNA group at a frequency of “32/3153”. As the "cDNA", the following "RNA aptamer molecule" TNF-100 cDNA was found. The cDNA of this “RNA aptamer molecule” TNF-100 was introduced into E. coli and cloned.

Clone：TNF-100中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
ATAAGTTCGGATCACCGGCCCAAAGCCTAGACCTAGGGGCTATAAATAC
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:２１）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-100：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:９）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100は、上記バインディング・バッファ溶液中における解離定数ＫDが、ＫD≦１０ｎＭの条件は満たしていないが、その解離定数ＫDが、ＫD≦２０ｎＭの範囲である。 Clone: nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-100:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
ATAAGTTCGGATCACCGGCCCAAAGCCTAGACCTAGGGGCTATAAATAC
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 21)
"RNA aptamer molecule" TNF-100:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 9)
The “RNA aptamer molecule” TNF-100 does not satisfy the condition of K D ≦ 10 nM in the dissociation constant K D in the binding buffer solution, but the dissociation constant K D is in the range of K D ≦ 20 nM. .

二種の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100について、その推定される二次構造を比較すると、図３に示すように、中心部に、内部ループ様の構造が構成されているという共通性が見出された。この内部ループ様の構造の構成に関与する部分塩基配列を対比したところ、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と、TNF-100中の「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」との間で、明確な類似性が見出された。   Comparing the presumed secondary structures of the two types of “RNA aptamer molecules” TNF-130 and TNF-100, an internal loop-like structure is formed in the center as shown in FIG. A commonality was found. When the partial base sequences involved in the structure of this internal loop-like structure were compared, “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” in TNF-130 and TNF-100 A clear similarity was found between “5′-UCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGAC-3 ′”.

前記合計１２ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」の群中に、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えている「ＲＮＡアプタマー分子」が、他にも含まれていた。   In the group of “RNA aptamer molecules” that have been selected for 12 rounds in total, a partial sequence showing similarity to “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” in TNF-130 In addition, “RNA aptamer molecule” having a similar relative position was also included.

また、先の高速シークエンス解析を行ったｃＤＮＡの群中に、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えているものが、TNF-100のｃＤＮＡ以外にも、下記の三種：TNF-673,TNF-674,TNF-675が見出された。解析されたｃＤＮＡの群中に、それぞれ、TNF-673は、「4/3153」の頻度で、TNF-674は、「2/3153」の頻度で、TNF-675は、「1/3153」の頻度で含まれていた。この三種のｃＤＮＡも、大腸菌に導入して、クローン化を行った。   In addition, a partial sequence having similarity to “5′-TTTTCACCGG-3 ′” and “5′-CTAGACAGG-3 ′” is included in the same relative position in the group of cDNAs subjected to the above high-speed sequence analysis. In addition to TNF-100 cDNA, the following three types were found: TNF-673, TNF-674, and TNF-675. Among the analyzed cDNA groups, TNF-673 has a frequency of “4/3153”, TNF-674 has a frequency of “2/3153”, and TNF-675 has a frequency of “1/3153”. Was included in the frequency. These three kinds of cDNAs were also introduced into E. coli and cloned.

Clone：TNF-673中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
CCGACATCCGGTCTTCTTCACCGGTAGAGTATATATAACCGCCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１８）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-673：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CCGACAUCCGGTCTTCUUCACCGGUAGAGUAUAUAUAACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:６）
Clone：TNF-674中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
CGTTAAATCCTAAGCGGATGGCCCCTTCACCGATCATAGGATCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:１９）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-674：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:７）
Clone：TNF-675中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TCGAAATATTACCCTTTTCACCGGCGAAAGTCGCATGACCGCCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号:２０）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-675：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号:８）
本発明者らは、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100の推定される二次構造において、共通して見出される、中心部に形成される、内部ループ様の構造が、実際に、Recombinant Human TNF-αとの複合体形成に関与することの検証を行った。すなわち、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100に基づき、その中心部に形成される、内部ループ様の構造の構成が可能な部分塩基配列からなる、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013を設計し、該TNF-m013のRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を測定した。図４に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013の推定される二次構造を、TNF-100の推定される二次構造と対比して示す。 Clone: nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-673:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
CCGACATCCGGTCTTCTTCACCGGTAGAGTATATATAACCGCCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 18)
"RNA aptamer molecule" TNF-673:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CCGACAUCCGGTCTTCUUCACCGGUAGAGUAUAUAUAACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 6)
Clone: Nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-674:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
CGTTAAATCCTAAGCGGATGGCCCCTTCACCGATCATAGGATCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 19)
"RNA aptamer molecule" TNF-674:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
Clone: nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-675:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
TCGAAATATTACCCTTTTCACCGGCGAAAGTCGCATGACCGCCTAGACAGG
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 20)
“RNA aptamer molecule” TNF-675:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 8)
The inventors have found that the inner loop-like structure formed in the central part, which is commonly found in the putative secondary structure of “RNA aptamer molecule” TNF-130 and TNF-100, It was verified that it was involved in complex formation with Recombinant Human TNF-α. That is, based on the “RNA aptamer molecule” TNF-100, a single-stranded RNA molecule: TNF-m013 consisting of a partial base sequence that is formed at the center and is capable of constituting an internal loop-like structure is designed. The binding ability of the TNF-m013 to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) was measured. FIG. 4 shows the predicted secondary structure of the single-stranded RNA molecule: TNF-m013 in comparison with the predicted secondary structure of TNF-100.

実際には、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013の３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)24を作製した。ビオチン化PolydUを、SAセンサ・チップ上に固定化されているStreptavidinタンパク質との結合を介してチップ上に固定化し、このビオチン化PolydUに、作製されたTNF-m013+(A)24のPolyA鎖をハイブリダイズさせ、固定化する。この固定化されたTNF-m013+(A)24と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成・解離過程における、平衡解離定数ＫDの測定を行った。また、TNF-100の３’末端に、ビオチン化PolydU鎖とハイブリダイズ可能なPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)24を作製した。ビオチン化PolydUを、SAセンサ・チップ上に固定化されているStreptavidinタンパク質との結合を介してチップ上に固定化し、このビオチン化PolydUに、作製されたTNF-100+(A)24をのPolyA鎖をハイブリダイズさせ、固定化する。この固定化されたTNF-100+(A)24と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成・解離過程における、平衡解離定数ＫDの測定を行った。 Actually, a 3'-end polyA chain-added RNA molecule: TNF-m013 + (A) 24 was prepared by adding a PolyA chain to the 3 'end of a single-stranded RNA molecule: TNF-m013. Biotinylated PolydU was immobilized on the chip via binding to the Streptavidin protein immobilized on the SA sensor chip, and the prepared PolyNF chain of TNF-m013 + (A) 24 was added to this biotinylated PolydU. Hybridize and immobilize. This immobilized TNF-m013 + (A) 24 , in Recombinant Human TNF-α (homotrimer) complexed and dissociation process of, was measured equilibrium dissociation constant K D. In addition, a 3′-end PolyA chain-added RNA molecule: TNF-100 + (A) 24 was prepared by adding a PolyA chain capable of hybridizing with a biotinylated PolydU chain to the 3 ′ end of TNF-100. Biotinylated PolydU was immobilized on the chip via binding to the Streptavidin protein immobilized on the SA sensor chip, and the prepared TNF-100 + (A) 24 was added to PolyA on this biotinylated PolydU. The strands are hybridized and immobilized. This immobilized TNF-100 + (A) 24 , in Recombinant Human TNF-α (homotrimer) complexed and dissociation process of, was measured equilibrium dissociation constant K D.

その結果、TNF-m013+(A)24と、TNF-100+(A)24で測定された、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成・解離過程における、結合速度定数ｋa、解離速度定数ｋd、平衡解離定数ＫD＝ｋd/ｋaは、ほぼ等しい値であることが確認される。従って、TNF-m013と、TNF-100は、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成に関与する立体構造は、本質的に同じであると判断される。すなわち、TNF-m013と、TNF-100は、図４に示す推定二次構造、特には、その中心部に形成される、内部ループ様の構造を形成することで、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成を可能としていると、判断される。また、図３に示す推定二次構造を考慮すると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100においては、共通して見出される、中心部に形成される、内部ループ様の構造を構成することで、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成を可能としていると、推断された。 As a result, the association rate constant k in the complex formation / dissociation process between TNF-m013 + (A) 24 and Recombinant Human TNF-α (homotrimer) measured by TNF-100 + (A) 24 a, dissociation rate constants k d, the equilibrium dissociation constant K D = k d / k a is confirmed to be approximately equal. Therefore, it is judged that TNF-m013 and TNF-100 have essentially the same steric structure involved in complex formation with Recombinant Human TNF-α (homotrimer). That is, TNF-m013 and TNF-100 form a predicted secondary structure shown in FIG. 4, in particular, an internal loop-like structure formed at the center thereof, so that Recombinant Human TNF-α (homologous) It is judged that complex formation with a trimer) is possible. In addition, considering the presumed secondary structure shown in FIG. 3, “RNA aptamer molecules” TNF-130 and TNF-100 constitute an internal loop-like structure formed in the central portion, which is commonly found. Thus, it was presumed that complex formation with Recombinant Human TNF-α (homotrimer) is possible.

本発明者らは、以上に述べた一連の検討の結果に基づき、本発明を完成するに至った。   Based on the results of the series of studies described above, the present inventors have completed the present invention.

本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のI-1〜I-5の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
(I-1) TNF-130
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
(I-2) TNF-485
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
ことを特徴とするアプタマーである。 The aptamer having the binding ability to human TNF-α according to the first aspect of the present invention,
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences I-1 to I-5:
(I-1) TNF-130
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
It is an aptamer characterized by this.

さらには、本発明の第一の形態は、ＲＮＡ鎖を構成する各リボ核酸の２’−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型のアプタマーをも包含している。   Furthermore, in the first embodiment of the present invention, the 2′-position hydroxyl group (—OH) of each ribonucleic acid constituting the RNA strand is modified with a fluorine atom (—F). F-modified RNA strand aptamers are also included.

本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型のアプタマーは、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、各リボ核酸の２’−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、下記のI-2〜I-5の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖修飾ＲＮＡ分子である
(I-2) TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
ことを特徴とするアプタマーである。 An aptamer of 2′F modified RNA strand type having a binding ability to human TNF-α according to the first aspect of the present invention,
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is composed of the following base sequences I-2 to I-5 which are modified to replace the 2′-position hydroxyl group (—OH) of each ribonucleic acid with a fluorine atom (—F). A single-stranded modified RNA molecule with a base sequence selected from the group
(I-2) TNF-485 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
It is an aptamer characterized by this.

本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーの一例は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のII-2〜II-4の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
(II-2) TNF-674
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：７）
(II-3) TNF-675
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
(II-4) TNF-100
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
ことを特徴とするアプタマーである。 An example of an aptamer having binding ability to human TNF-α according to the second aspect of the present invention is as follows:
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences II-2 to II-4:
(II-2) TNF-674
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 9)
It is an aptamer characterized by this.

また、本発明の第二の形態は、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子に対して、その３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型のアプタマーをも包含している。すなわち、付加されている３’末端PolyA鎖と、固相表面に固定化されている、PolydU鎖との間でハイブリッド体を形成した状態で、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子も包含している。   The second form of the present invention is a 3'-end polyA chain-added type obtained by adding a PolyA chain to the 3 'end of a single-stranded RNA molecule capable of binding to human TNF-α. It also includes aptamers. That is, a single-stranded RNA having a binding ability to human TNF-α in a state where a hybrid is formed between the added 3′-end PolyA chain and the PolydU chain immobilized on the solid surface. It also includes molecules.

本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、３’末端PolyA鎖付加型のアプタマーの一例は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、3’−末端にPolyA配列が付加された、下記のII-4’の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
(II-4’) TNF-100+(A)24
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3’ （配列番号：１１）
ことを特徴とするアプタマーである。 An example of a 3′-terminal polyA chain-added aptamer having binding ability to human TNF-α according to the second aspect of the present invention is as follows:
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule consisting of the following II-4 ′ base sequence with a PolyA sequence added to the 3′-end:
(II-4 ') TNF-100 + (A) 24
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3 '(SEQ ID NO: 11)
It is an aptamer characterized by this.

本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーの一例は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のIIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
(III) TNF-m013
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
ことを特徴とするアプタマーである。 An example of an aptamer having binding ability to human TNF-α according to the third aspect of the present invention is as follows:
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule consisting of the following base sequence III:
(III) TNF-m013
5'-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3 '(SEQ ID NO: 10)
It is an aptamer characterized by this.

また、本発明の第三の形態は、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子に対して、その３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型のアプタマーをも包含している。すなわち、付加されている３’末端PolyA鎖と、固相表面に固定化されている、PolydU鎖との間でハイブリッド体を形成した状態で、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子も包含している。   The third aspect of the present invention is a 3'-end polyA chain addition type, wherein a polyA chain is added to the 3 'end of a single-stranded RNA molecule capable of binding to human TNF-α. It also includes aptamers. That is, a single-stranded RNA having a binding ability to human TNF-α in a state where a hybrid is formed between the added 3′-end PolyA chain and the PolydU chain immobilized on the solid surface. It also includes molecules.

本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、３’末端PolyA鎖付加型のアプタマーの一例は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、3’−末端にPolyA配列が付加された、下記のIII’の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
(III’) TNF-m013+(A)24
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3’ （配列番号：１２）
ことを特徴とするアプタマーである。 An example of a 3′-terminal polyA chain-added aptamer having binding ability to human TNF-α according to the third aspect of the present invention is as follows:
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule consisting of the following III ′ base sequence with a PolyA sequence added to the 3′-end:
(III ') TNF-m013 + (A) 24
5'-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3 '(SEQ ID NO: 12)
It is an aptamer characterized by this.

加えて、本発明は、上記の本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用する方法の発明を提供している。   In addition, the present invention provides an aptamer having binding ability to human TNF-α according to the first aspect of the present invention, an aptamer having binding ability to human TNF-α according to the second aspect of the present invention, The invention of the method of using the aptamer which has the binding ability with respect to human TNF- (alpha) concerning the 3rd form of invention is provided.

本発明にかかる、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用する方法の発明の一例は、下記のヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法である。   One example of the invention of the method of using the aptamer having the binding ability to human TNF-α according to the present invention is to have the binding ability to human TNF-α in order to prepare the following human TNF-α detection kit. It is a method using the RNA aptamer which has.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第一の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法であって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを具えており、
前記モノクローナル抗体を利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
(I-2) TNF-485
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：７）
(II-3) TNF-675
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
(II-4) TNF-100
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する
ことを特徴とするアプタマーの使用方法である。 The first aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention includes:
A method of using an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit,
The detection kit for human TNF-α is:
A monoclonal antibody having a specific reactivity with human TNF-α and an RNA aptamer with a binding ability to human TNF-α,
Immobilizing human TNF-α using the monoclonal antibody,
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α is bound to the immobilized human TNF-α;
It is a detection kit for detecting human TNF-α by detecting an RNA aptamer that binds to immobilized human TNF-α and has a binding ability to human TNF-α.
As an RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, comprising the detection kit for human TNF-α,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013
5'-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3 '(SEQ ID NO: 10)
Use of an aptamer characterized in that an aptamer selected from the group consisting of:

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。 that time,
The RNA aptamer capable of binding to human TNF-α is
A form in which a label is attached to the end of the single-stranded nucleic acid constituting the RNA aptamer can be selected.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第二の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法であって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを具えており、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記モノクローナル抗体を反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと反応し、抗原抗体複合体を形成した、前記モノクローナル抗体を検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する
ことを特徴とするアプタマーの使用方法である。 According to the second aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention,
A method of using an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit,
The detection kit for human TNF-α is:
A monoclonal antibody having a specific reactivity with human TNF-α and an RNA aptamer with a binding ability to human TNF-α,
Using the RNA aptamer capable of binding to human TNF-α, human TNF-α is immobilized,
Reacting the monoclonal antibody with immobilized human TNF-α,
A detection kit that detects human TNF-α by detecting the monoclonal antibody that has reacted with the immobilized human TNF-α to form an antigen-antibody complex,
As an RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, comprising the detection kit for human TNF-α,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130 (SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485 (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F) (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F) (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F) (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F) (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674 (SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675 (SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100 (SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013 (SEQ ID NO: 10)
Use of an aptamer characterized in that an aptamer selected from the group consisting of:

その際、例えば、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。 In that case, for example, the RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α,
A 3'-terminal PolyA chain-added RNA aptamer, which is used to immobilize the aptamer molecule on a carrier, and is formed by linking a PolyA chain to the 3'-end of a single-stranded nucleic acid constituting the RNA aptamer. It is preferable to select a certain form.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第三の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法であって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αの固定化に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第一のＲＮＡアプタマーと、
固定化されたヒトＴＮＦ−αの検出に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第二のＲＮＡアプタマーを具えており、
前記第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記第二のＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、前記第二のＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する
ことを特徴とするアプタマーの使用方法である。 The third aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention includes:
A method of using an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit,
The detection kit for human TNF-α is:
A first RNA aptamer used for immobilization of human TNF-α and capable of binding to human TNF-α;
A second RNA aptamer capable of binding to human TNF-α and used for detection of immobilized human TNF-α,
Immobilizing human TNF-α using the first RNA aptamer,
Binding the second RNA aptamer to immobilized human TNF-α,
A detection kit for detecting human TNF-α by detecting the second RNA aptamer bound to immobilized human TNF-α,
As the second RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, comprising the human TNF-α detection kit,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130 (SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485 (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F) (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F) (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F) (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F) (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674 (SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675 (SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100 (SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013 (SEQ ID NO: 10)
Use of an aptamer characterized in that an aptamer selected from the group consisting of:

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第二のＲＮＡアプタマーは、
該第二のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。 that time,
The second RNA aptamer having the binding ability to the human TNF-α,
A form in which a label is attached to the end of the single-stranded nucleic acid constituting the second RNA aptamer can be selected.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第四の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法であって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αの固定化に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第一のＲＮＡアプタマーと、
固定化されたヒトＴＮＦ−αの検出に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第二のＲＮＡアプタマーを具えており、
前記第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記第二のＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、前記第一のＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する
ことを特徴とするアプタマーの使用方法である。 The fourth aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention is:
A method of using an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit,
The detection kit for human TNF-α is:
A first RNA aptamer used for immobilization of human TNF-α and capable of binding to human TNF-α;
A second RNA aptamer capable of binding to human TNF-α and used for detection of immobilized human TNF-α,
Immobilizing human TNF-α using the first RNA aptamer,
Binding the second RNA aptamer to immobilized human TNF-α,
A detection kit for detecting human TNF-α by detecting the second RNA aptamer bound to immobilized human TNF-α,
As the first RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, comprising the kit for detecting human TNF-α,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130 (SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485 (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F) (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F) (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F) (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F) (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674 (SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675 (SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100 (SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013 (SEQ ID NO: 10)
Use of an aptamer characterized in that an aptamer selected from the group consisting of:

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第一のＲＮＡアプタマーは、
該第一のアプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該第一のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。 that time,
The first RNA aptamer capable of binding to human TNF-α is:
3'-end formed by linking PolyA strand used for immobilizing the first aptamer molecule to a carrier to 3'-end of a single-stranded nucleic acid constituting the first RNA aptamer It is preferable to select a form that is a polyA chain-added RNA aptamer.

また、本発明にかかる、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用する方法の発明の他の一例は、上記の本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットの発明である。   Another example of the invention of the method of using the aptamer having the binding ability to human TNF-α according to the present invention has the binding ability to human TNF-α according to the first aspect of the present invention. Aptamer, aptamer having binding ability to human TNF-α according to the second form of the present invention, aptamer having binding ability to human TNF-α according to the third form of the present invention, It is an invention of a kit for detecting human TNF-α.

本発明にかかる、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットの発明の一例として、下記のヒトＴＮＦ−αの検出用キットを例示することができる。   As an example of the invention of a detection kit for human TNF-α produced by using the aptamer having the binding ability to human TNF-α according to the present invention, the following detection kit for human TNF-α is provided. It can be illustrated.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第一の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットであって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを具えており、
前記モノクローナル抗体を利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
(I-2) TNF-485
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：７）
(II-3) TNF-675
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
(II-4) TNF-100
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーである
ことを特徴とする検出用キットである。 The first aspect of the “kit for detecting human TNF-α produced by using an aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention,
A detection kit for human TNF-α,
The detection kit for human TNF-α is:
A monoclonal antibody having specific reactivity with human TNF-α;
Comprising an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
Immobilizing human TNF-α using the monoclonal antibody,
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α is bound to the immobilized human TNF-α;
It is a detection kit for detecting human TNF-α by detecting an RNA aptamer that binds to immobilized human TNF-α and has a binding ability to human TNF-α.
The RNA aptamer having the ability to bind to human TNF-α, comprising the kit for detecting human TNF-α,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013
5'-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3 '(SEQ ID NO: 10)
A detection kit characterized by being an aptamer selected from the group consisting of:

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。 that time,
The RNA aptamer capable of binding to human TNF-α is
A form in which a label is attached to the end of the single-stranded nucleic acid constituting the RNA aptamer can be selected.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第二の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットであって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを具えており、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記モノクローナル抗体を反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと反応し、抗原抗体複合体を形成した、前記モノクローナル抗体を検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーである
ことを特徴とする検出用キットである。 The second aspect of the “kit for detecting human TNF-α produced by using an aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention,
A detection kit for human TNF-α,
The detection kit for human TNF-α is:
A monoclonal antibody having specific reactivity with human TNF-α;
Comprising an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
Using the RNA aptamer capable of binding to human TNF-α, human TNF-α is immobilized,
Reacting the monoclonal antibody with immobilized human TNF-α,
A detection kit that detects human TNF-α by detecting the monoclonal antibody that has reacted with the immobilized human TNF-α to form an antigen-antibody complex,
The RNA aptamer having the ability to bind to human TNF-α, comprising the kit for detecting human TNF-α,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130 (SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485 (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F) (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F) (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F) (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F) (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674 (SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675 (SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100 (SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013 (SEQ ID NO: 10)
A detection kit characterized by being an aptamer selected from the group consisting of:

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。 that time,
The RNA aptamer capable of binding to human TNF-α is
A 3'-terminal PolyA chain-added RNA aptamer, which is used to immobilize the aptamer molecule on a carrier, and is formed by linking a PolyA chain to the 3'-end of a single-stranded nucleic acid constituting the RNA aptamer. It is preferable to select a certain form.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第三の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットであって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αの固定化に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第一のＲＮＡアプタマーと、
固定化されたヒトＴＮＦ−αの検出に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第二のＲＮＡアプタマーを具えており、
前記第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記第二のＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、前記第二のＲＮＡアプタマーは、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーである
ことを特徴とする検出用キットである。 The third aspect of the “kit for detecting human TNF-α produced by using an aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention,
A detection kit for human TNF-α,
The detection kit for human TNF-α is:
A first RNA aptamer used for immobilization of human TNF-α and capable of binding to human TNF-α;
A second RNA aptamer capable of binding to human TNF-α and used for detection of immobilized human TNF-α,
Immobilizing human TNF-α using the first RNA aptamer,
Binding the second RNA aptamer to immobilized human TNF-α,
A detection kit for detecting human TNF-α by detecting the second RNA aptamer bound to immobilized human TNF-α,
The second RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α, comprising the kit for detecting human TNF-α,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130 (SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485 (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F) (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F) (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F) (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F) (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674 (SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675 (SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100 (SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013 (SEQ ID NO: 10)
A detection kit characterized by being an aptamer selected from the group consisting of:

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第二のＲＮＡアプタマーは、
該第二のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。 that time,
The second RNA aptamer having the binding ability to the human TNF-α,
A form in which a label is attached to the end of the single-stranded nucleic acid constituting the second RNA aptamer can be selected.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第四の態様は、
ヒトＴＮＦ−αの検出用キットであって、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、
ヒトＴＮＦ−αの固定化に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第一のＲＮＡアプタマーと、
固定化されたヒトＴＮＦ−αの検出に利用される、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する第二のＲＮＡアプタマーを具えており、
前記第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記第二のＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う検出用キットであり、
該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットが具える、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、前記第一のＲＮＡアプタマーは、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーである
ことを特徴とする検出用キットである。 The fourth aspect of the “kit for detecting human TNF-α produced by using an aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention is:
A detection kit for human TNF-α,
The detection kit for human TNF-α is:
A first RNA aptamer used for immobilization of human TNF-α and capable of binding to human TNF-α;
A second RNA aptamer capable of binding to human TNF-α and used for detection of immobilized human TNF-α,
Immobilizing human TNF-α using the first RNA aptamer,
Binding the second RNA aptamer to immobilized human TNF-α,
A detection kit for detecting human TNF-α by detecting the second RNA aptamer bound to immobilized human TNF-α,
The first RNA aptamer having the ability to bind to human TNF-α, comprising the kit for detecting human TNF-α,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130 (SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485 (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F) (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F) (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F) (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F) (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674 (SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675 (SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100 (SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013 (SEQ ID NO: 10)
A detection kit characterized by being an aptamer selected from the group consisting of:

その際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第一のＲＮＡアプタマーは、
該第一のアプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該第一のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。 that time,
The first RNA aptamer capable of binding to human TNF-α is:
3'-end formed by linking PolyA strand used for immobilizing the first aptamer molecule to a carrier to 3'-end of a single-stranded nucleic acid constituting the first RNA aptamer It is preferable to select a form that is a polyA chain-added RNA aptamer.

本発明者らは、図２に示す、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に、内部ループ様の構造が構成されている点に着目した。TNF-130の「ランダム配列」領域において、この内部ループ様の構造の構成に関与している部分として、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域に着目した。   The present inventors paid attention to the fact that an inner loop-like structure is formed at the center in the estimated secondary structure of TNF-130 shown in FIG. In the “random sequence” region of TNF-130, two regions of “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” are involved in the structure of this internal loop-like structure. Focused on.

さらに、本発明者らは、上述の二種の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100について、その推定される二次構造を比較すると、図３に示すように、中心部に、内部ループ様の構造が構成されているという共通性が見出されることに着目した。この内部ループ様の構造の構成に関与する部分塩基配列を対比したところ、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と、TNF-100中の「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」との間で、明確な類似性が見出されることに着目した。   Furthermore, the present inventors compared the presumed secondary structures of the above-mentioned two “RNA aptamer molecules” TNF-130 and TNF-100. As shown in FIG. We paid attention to the commonality of loop-like structures. When the partial base sequences involved in the structure of this internal loop-like structure were compared, “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” in TNF-130 and TNF-100 It was noted that a clear similarity was found between “5′-UCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGAC-3 ′”.

本発明者らは、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングに利用する、
５’末端の固定領域：GGAAGACCAG CCUUAAGAGGG；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGUAUCCG GAACGUGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
を具える、全長９０塩基長の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」中から、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製し、この第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーに対して、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、スクリーニングを行うことで、より効率的に、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされることに想到した。 The present inventors use it for screening to which the SELEX method is applied.
5 'terminal fixed region: GGAAGACCAG CCUUAAGAGGG; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
3 'terminal fixed region: CUAGUAUCCG GAACGUGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
From the "random single-stranded RNA molecule library" with a total length of 90 bases,
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), a first partial base sequence and a second motif sequence: 5 ′ corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, respectively. A single-stranded RNA molecule containing a second partial base sequence corresponding to -CUAGACAGG-3 'is selected to create a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules. By screening the partial library of candidate single-stranded RNA molecules of, based on the ability to bind to human TNF-α, it corresponds to the first motif sequence and the second motif sequence more efficiently. Thus, it was conceived that an RNA aptamer having two partial base sequences and capable of binding to human TNF-α could be selected.

すなわち、上記の第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’を利用することで、予めスクリーニング対象の絞り込みを行うことで、より効率的なスクリーニングを行うことが可能となることに想到した。   That is, by using the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ as described above, screening targets can be narrowed down in advance for more efficient operation. I came to realize that it would be possible to perform simple screening.

あるいは、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製し、この第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーに対して、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、スクリーニングを行うことで、より効率的に、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされることに想到した。 Alternatively, in the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), the third partial base sequence and the fourth motif sequence: 5 are the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, respectively. A single-stranded RNA molecule containing the fourth partial base sequence, the same as '-CUAGAC-3', is selected to create a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules. The partial library of candidate single-stranded RNA molecules is screened based on the ability to bind to human TNF-α, so that it is more efficiently the same as the third motif sequence and the fourth motif sequence. Thus, it was conceived that an RNA aptamer having two partial base sequences and capable of binding to human TNF-α was selected.

すなわち、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の形態は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法であって、
該選別方法は、下記の工程１と工程２とを具えており、
（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法によって、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる
ことを特徴とするアプタマーの選別方法である。 That is, the first form of the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention is as follows:
A method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α, comprising:
The screening method includes the following step 1 and step 2,
(Process 1)
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), a first partial base sequence and a second motif sequence: 5 ′ corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, respectively. -Selecting a single-stranded RNA molecule comprising a second partial base sequence corresponding to CUAGACAGG-3 'to create a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules, Sorting process;
(Process 2)
From the partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule, comprising two partial base sequences corresponding to the first motif sequence and the second motif sequence based on the binding ability to human TNF-α, A second selection step of selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α;
According to the selection method, an RNA aptamer having two partial base sequences corresponding to the first motif sequence and the second motif sequence and capable of binding to human TNF-α is selected. This is a method for selecting aptamers.

その際、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。 At that time, in the step 1,
At least 8 bases, for example, 8 bases or more and 25 bases or less, between the first partial base sequence and the second partial base sequence contained in the 51 base long random sequence part (N 51 ) The form in which the partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule is prepared can be selected by selecting the single-stranded RNA molecule in which the region exists.

また、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。 In the step 1,
The first partial base sequence contained in the 51-base-long random sequence portion (N 51 ) is present on the 5 ′ end side of the second partial base sequence, single-stranded RNA A molecule can be selected to select a form of generating a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の形態は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法であって、
該選別方法は、下記の工程１と工程２とを具えており、
（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法によって、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる
ことを特徴とするアプタマーの選別方法である。 The second form of the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention is:
A method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α, comprising:
The screening method includes the following step 1 and step 2,
(Process 1)
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), the third partial base sequence and the fourth motif sequence: 5′-, which are the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, respectively. A first selection step of selecting a single-stranded RNA molecule containing the fourth partial base sequence, which is the same as CUAGAC-3 ′, and creating a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules ;
(Process 2)
From the partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule, based on the binding ability to human TNF-α, comprising two partial base sequences that are the same as the third motif sequence and the fourth motif sequence, A second selection step of selecting RNA aptamers capable of binding to TNF-α;
An aptamer characterized in that, by the selection method, an RNA aptamer having two partial base sequences, which are the same as the third motif sequence and the fourth motif sequence, and capable of binding to human TNF-α is selected. This is a sorting method.

その際、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。 At that time, in the step 1,
Between the third partial base sequence and the fourth partial base sequence contained in the 51 base long random sequence portion (N 51 ), at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases The form in which the partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule is prepared can be selected by selecting the single-stranded RNA molecule in which the region exists.

また、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。 In the step 1,
Single-stranded RNA in which the third partial base sequence contained in the 51 base-long random sequence portion (N 51 ) is present on the 5 ′ end side of the fourth partial base sequence A molecule can be selected to select a form of generating a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules.

加えて、本発明は、上述する「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」において利用される、「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の発明を提供している。   In addition, the present invention provides the invention of “a partial library of candidate single-stranded RNA molecules” used in the above-mentioned “method for selecting RNA aptamers capable of binding to human TNF-α”. .

すなわち、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第一の形態は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別に利用される、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーであって、
該部分ライブラリーは、
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである
ことを特徴とする候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーである。 That is, the first form of the “partial library of candidate single-stranded RNA molecules” according to the present invention is:
A partial library of candidate single-stranded RNA molecules used to select RNA aptamers capable of binding to human TNF-α,
The partial library is
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), a first partial base sequence and a second motif sequence: 5 ′ corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, respectively. -A candidate single-stranded RNA molecule characterized in that it is a partial library prepared by selecting a single-stranded RNA molecule containing a second partial base sequence corresponding to CUAGACAGG-3 ' It is a partial library.

その際、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである形態を選択することができる。 that time,
The first partial base sequence contained in the 51-base-long random sequence portion (N 51 ) is present on the 5 ′ end side of the second partial base sequence, single-stranded RNA A molecule can be selected to select a form that is a partial library to be created.

本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第二の形態は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別に利用される、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーであって、
該部分ライブラリーは、
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである
ことを特徴とする候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーである。 The second form of the “partial library of candidate single-stranded RNA molecules” according to the present invention is:
A partial library of candidate single-stranded RNA molecules used to select RNA aptamers capable of binding to human TNF-α,
The partial library is
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), the third partial base sequence and the fourth motif sequence: 5′-, which are the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, respectively. A partial live of a candidate single-stranded RNA molecule, which is a partial library prepared by selecting a single-stranded RNA molecule containing the fourth partial base sequence, the same as CUAGAC-3 ′ Rally.

その際、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである形態を選択することができる。 that time,
Single-stranded RNA in which the third partial base sequence contained in the 51-base-long random sequence portion (N 51 ) is present on the 5 ′ end side of the fourth partial base sequence A molecule can be selected to select a form that is a partial library to be created.

さらに、本発明者らは、上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」を適用することで、下記の「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」を選別することは可能であることに想到した。   Furthermore, the present inventors applied the “method for selecting an RNA aptamer having the ability to bind to human TNF-α” according to the present invention described above, whereby the following “RNA having the ability to bind to human TNF-α”. It came to mind that it is possible to select “aptamers”.

すなわち、本発明は、その塩基配列中に含まれる、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成され、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの発明をも提供する。また、本発明は、その塩基配列中に含まれる、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成され、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの発明をも提供する。   That is, the present invention includes a first partial base sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, and a second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-, contained in the base sequence. The invention also provides an invention of an RNA aptamer having an internal loop structure constituted by the second partial base sequence corresponding to 3 ′ and having a binding ability to human TNF-α. The present invention also includes a third partial base sequence and a fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3, which are the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, contained in the base sequence. The invention also provides an invention of an RNA aptamer having an internal loop structure constituted by the same fourth partial base sequence as that of ′ and having a binding ability to human TNF-α.

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第一の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。 That is, an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α, characterized by “first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′” and second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ according to the present invention. The first aspect of
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a 51-base sequence portion sandwiched between the 5′-end and 3′-end fixed regions,
In the 51 base-length sequence portion, the first motif sequence: corresponding to 5′-UUUUCACCGG-3 ′, the second partial motif sequence: corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ Including a second partial base sequence,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the first partial base sequence and the second partial base sequence are aptamers that exist as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
The first partial base sequence contained in the 51 base-length sequence portion can be selected in a form existing on the 5 ′ end side with respect to the second partial base sequence.

さらに、前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases is present between the first partial base sequence and the second partial base sequence, which are included in the 51 base length sequence portion. Can be selected.

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第一の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。 Further, an RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, characterized by “third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′” and fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′ according to the present invention. The first aspect of
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a 51-base sequence portion sandwiched between the 5′-end and 3′-end fixed regions,
In the 51 base-length sequence portion, the third motif sequence: the same as 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence, and the fourth motif sequence: the same as 5′-CUAGAC-3 ′, Containing the fourth partial base sequence,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the third partial base sequence and the fourth partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
A form in which the third partial base sequence contained in the 51 base-length sequence portion is present on the 5 ′ end side with respect to the fourth partial base sequence can be selected.

さらに、前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases is present between the third partial base sequence and the fourth partial base sequence, which are included in the 51 base length sequence portion. Can be selected.

さらには、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第二の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。 Furthermore, RNA having the binding ability to human TNF-α, characterized by “first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′” and second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ according to the present invention. The second aspect of the “aptamer”
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a sequence portion of an intermediate region sandwiched between the fixed region at the 5 ′ end and the fixed region at the 3 ′ end;
In the sequence part of the intermediate region, the first partial nucleotide sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second motif sequence: corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ A second partial base sequence,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the first partial base sequence and the second partial base sequence are aptamers that exist as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
The first partial base sequence contained in the sequence portion of the intermediate region can be selected in a form existing on the 5 ′ end side with respect to the second partial base sequence.

さらに、前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, there is a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases, between the first partial base sequence and the second partial base sequence contained in the sequence part of the intermediate region. Can be selected.

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第二の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。 Further, an RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, characterized by “third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′” and fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′ according to the present invention. The second embodiment of
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a sequence portion of an intermediate region sandwiched between the fixed region at the 5 ′ end and the fixed region at the 3 ′ end;
In the sequence portion of the intermediate region, the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence, the same as the fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′, Contains four partial base sequences,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the third partial base sequence and the fourth partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
The third partial base sequence contained in the sequence portion of the intermediate region can be selected in a form existing on the 5 ′ end side with respect to the fourth partial base sequence.

さらに、前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases is present between the third partial base sequence and the fourth partial base sequence contained in the sequence part of the intermediate region. Can be selected.

さらに、本発明者らは、後述する、図４に示すRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−ｍ０１３と「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１００の推定される二次構造の対比結果に着目した。具体的には、その塩基配列中に含まれる、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成されると、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を発揮できることに想到した。また、その塩基配列中に含まれる、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成されると、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を発揮できることに想到した。   Furthermore, the present inventors estimated “RNA aptamer molecule” TNF-m013 and “RNA aptamer molecule” TNF-100 having the binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) shown in FIG. We focused on the comparison results of secondary structures. Specifically, the first partial base sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ contained in the base sequence and the second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 It was conceived that when an internal loop structure is constituted by the second partial base sequence corresponding to ', the binding ability to human TNF-α can be exhibited. Also, the third motif sequence included in the base sequence: the same as 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence, and the fourth motif sequence: the same as 5′-CUAGAC-3 ′, It was conceived that the ability to bind to human TNF-α can be exhibited when an internal loop structure is constituted by the fourth partial base sequence.

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第三の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。 That is, an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α, characterized by “first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′” and second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ according to the present invention. The third aspect of
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
First motif sequence: includes a first partial base sequence corresponding to 5′-UUUUCACCGG-3 ′, and a second motif sequence: second partial base sequence corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ A single-stranded RNA molecule consisting of a base sequence consisting of
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the first partial base sequence and the second partial base sequence are aptamers that exist as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
A form in which the first partial base sequence contained in the single-stranded RNA molecule is present on the 5 ′ end side with respect to the second partial base sequence can be selected.

さらに、前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, there is a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases, between the first partial base sequence and the second partial base sequence contained in the single-stranded RNA molecule. Can be selected.

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第三の態様は、
ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマーである。 The RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, characterized by the “third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′” and the fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′ according to the present invention. The third aspect of
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
Third motif sequence: same as 5′-UCACCGG-3 ′, third partial base sequence, and fourth motif sequence: same as 5′-CUACCAC-3 ′, fourth partial base sequence A single-stranded RNA molecule consisting of a base sequence,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the third partial base sequence and the fourth partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
The third partial base sequence contained in the single-stranded RNA molecule can be selected to be present on the 5 ′ end side with respect to the fourth partial base sequence.

さらに、前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, there is a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases, between the third partial base sequence and the fourth partial base sequence contained in the single-stranded RNA molecule. Can be selected.

本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、循環血液中に含まれる、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体と特異的な複合体形成が可能である。従って、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、ホモ３量体型のヒトＴＮＦ−αが関与する各種の疾患の診断を進める際、該疾患の病態の指標となる、ヒトＴＮＦ−αのホモ３量体の循環血液中の濃度について、特異的な複合体形成を利用して、高い感度で定量する目的に応用可能である。   The “RNA aptamer molecule” capable of binding to human TNF-α according to the present invention is capable of forming a specific complex with a human TNF-α homotrimer contained in circulating blood. Therefore, the “RNA aptamer molecule” having the ability to bind to human TNF-α according to the present invention can be used as an indicator of the pathology of the disease when proceeding with the diagnosis of various diseases involving homotrimeric human TNF-α. The concentration of human TNF-α homotrimer in circulating blood can be applied for the purpose of quantifying with high sensitivity using specific complex formation.

図１は、本発明の第一の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１３０に関して、Recombinant Human TNF-αとの複合体形成過程の速度定数ｋａ、該複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。FIG. 1 shows a complex with Recombinant Human TNF-α regarding “RNA aptamer molecule” TNF-130 capable of binding to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) according to the first embodiment of the present invention. It is a figure which shows an example of the result of having evaluated the rate constant ka of the formation process, the rate constant kd of the dissociation process of this composite_body | complex, and dissociation constant KD = kd / ka using the surface plasmon resonance measuring apparatus. 図２は、本発明の第一の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１３０に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。FIG. 2 shows the predicted secondary structure of the “RNA aptamer molecule” TNF-130 having the binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) according to the first embodiment of the present invention. FIG. 図３は、本発明の第二の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１００の推定される二次構造と、図２に示す「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１３０の推定される二次構造を対比して示す図である。FIG. 3 shows a predicted secondary structure of “RNA aptamer molecule” TNF-100 having binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) according to the second embodiment of the present invention, and FIG. It is a figure which compares and shows the estimated secondary structure of "RNA aptamer molecule | numerator" TNF-130 shown in. 図４は、本発明の第三の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−ｍ０１３の推定される二次構造と、図３に示す「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１００の推定される二次構造を対比して示す図である。FIG. 4 shows a predicted secondary structure of “RNA aptamer molecule” TNF-m013 having binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) according to the third embodiment of the present invention, and FIG. It is a figure which compares and shows the estimated secondary structure of "RNA aptamer molecule" TNF-100 shown in. 図５は、本発明の第三の実施態様にかかる、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−ｍ０１３に関して、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程の速度定数ｋａ、該複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数ＫD＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。FIG. 5 shows Recombinant Human TNF-α (homotrimer) regarding “RNA aptamer molecule” TNF-m013 having binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) according to the third embodiment of the present invention. The rate constant ka of the complex formation process with the body), the rate constant kd of the dissociation process of the complex, and the dissociation constant K D = kd / ka were evaluated using a surface plasmon resonance measuring apparatus. It is a figure which shows an example.

本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」に関して、より詳細に説明する。   The “RNA aptamer molecule” having binding ability to human TNF-α according to the present invention will be described in more detail.

（第一の形態）
本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、水溶液中において、ホモ３量体を構成していると報告されている、Recombinant Human TNF-αを利用して、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子として、選別されたものである。 (First form)
The aptamer having the ability to bind to human TNF-α according to the first aspect of the present invention utilizes Recombinant Human TNF-α, which is reported to constitute a homotrimer in an aqueous solution, The recombinant human TNF-α homotrimer was selected as a single-stranded RNA molecule that can form a complex.

具体的には、下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長の「ランダム配列部分（Ｎ51）」を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成される「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」から、ＳＥＬＥＸ法を適用して、前記Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子として、選択されたものである。 Specifically, it is composed of a single-stranded RNA molecule comprising a 5′-terminal fixed region and a 3′-terminal fixed region described below, and a 51-base long “random sequence portion (N 51 )” sandwiched between the fixed region. Selected from the “random single-stranded RNA molecule library (RNA pool)” as a single-stranded RNA molecule capable of forming a complex with the homotrimer of Recombinant Human TNF-α by applying the SELEX method. Is.

５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
ＳＥＬＥＸ法を適用した、前記Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との複合体形成能に基づく、スクリーニング工程では、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との複合体形成、ならびに、形成された複合体の解離は、下記の条件を採用している。 5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the screening step based on the ability to form a complex with the Recombinant Human TNF-α homotrimer using the SELEX method, the complex formation with the Recombinant Human TNF-α homotrimer and the formation The following conditions are used for dissociation of the complex.

（ｉ） 「初回ラウンド」用の「ＲＮＡプール」の調製
上記の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」を構成する一本鎖ＲＮＡ分子は、下記の「ランダム二本鎖ＤＮＡ分子ライブライー」を構成する、二本鎖ＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。 (I) Preparation of “RNA Pool” for “First Round” Single-stranded RNA molecules constituting the above “random single-stranded RNA molecule library (RNA pool)” are the following “random double-stranded DNA molecules” It is prepared by in vitro transcription using T7 RNA polymerase, using the double-stranded DNA molecule constituting the library as a transcription template.

「ランダム二本鎖ＤＮＡ分子ライブライー」を構成する、各二本鎖ＤＮＡ分子は、下記の「Ｔ７プロモーター領域」、５’末端の固定領域、３０塩基長のランダム配列部分、３’末端の固定領域からなる塩基配列Ｒcandidate0を有している。 Each double-stranded DNA molecule constituting the “random double-stranded DNA molecule library” is composed of the following “T7 promoter region”, a 5′-end fixed region, a 30-base-long random sequence portion, and a 3′-end fixed. It has a base sequence R candidate0 consisting of a region.

５’末端の「Ｔ７プロモーター領域」：GATAATACGACTCACTATA；（１９塩基） （配列番号：２６）
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２４）
Ｎ51ランダム配列部分：NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN N；
３’末端の固定領域：CTAGT ATCCG GAACG TGAC；（１９塩基） （配列番号：２５）
そのＮ51ランダム配列部分は、ＧＣの含有比率は、５０％に選択されている。 “T7 promoter region” at the 5 ′ end: GATAATACGACTCACTATA; (19 bases) (SEQ ID NO: 26)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 24)
N 51 random array part: NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN N;
Fixed region at the 3 ′ end: CTAGT ATCCG GAACG TGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 25)
The N 51 random sequence portion is selected to have a GC content ratio of 50%.

（ii） Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との複合体形成条件
フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、下記の組成のバインディング・バッファ溶液中において、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に一本鎖ＲＮＡ分子を作用させ、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と一本鎖ＲＮＡ分子との複合体を形成させる。この複合体形成反応で使用されるバインディング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClである。また、液温度は、通常、２５℃（室温）に選択されている。 (Ii) Recombinant Human TNF-α homotrimer complex formation conditions In a SELEX selection round using a filter separation method, Recombinant Human TNF-α homotrimer in a binding buffer solution having the following composition: A single-stranded RNA molecule is allowed to act on the body to form a complex of the recombinant human TNF-α homotrimer and the single-stranded RNA molecule. The composition of the binding buffer solution used in this complex formation reaction is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl. The liquid temperature is usually selected to be 25 ° C. (room temperature).

前記バインディング・バッファ溶液中では、対象タンパク質のRecombinant Human TNF-αは、含有濃度が１０ｎＭ（１７０ｎｇ/ｍｌ）以上である場合、２５℃（室温）では、通常、ホモ３量体を形成した状態で、溶解している。   In the binding buffer solution, Recombinant Human TNF-α of the target protein is usually in a state where a homotrimer is formed at 25 ° C. (room temperature) when the concentration is 10 nM (170 ng / ml) or more. Is dissolved.

なお、Recombinant Human TNF-αでも、ホモ３量体とモノマーの間には、解離平衡が存在している。その解離平衡によって、Recombinant Human TNF-αの含有濃度が１ｎＭ（１７ｎｇ/ｍｌ）未満になると、含有濃度の低下とともに、ホモ３量体の解離が進む傾向があるという報告もある。   In Recombinant Human TNF-α, a dissociation equilibrium exists between the homotrimer and the monomer. There is also a report that when the content concentration of Recombinant Human TNF-α becomes less than 1 nM (17 ng / ml) due to the dissociation equilibrium, the dissociation of homotrimers tends to proceed as the content concentration decreases.

一方、該バインディング・バッファ溶液中に溶解している、一本鎖ＲＮＡ分子は、作製後、一旦、加熱処理を施し、分子内の二本鎖構造を解消する“denaturing”処理を行い、その後、冷却して、三次構造を形成させる、“folding”処理を施す。すなわち、各一本鎖ＲＮＡ分子は、その塩基配列に従って、内在する「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造を含む、二次構造の形成、ならびに、全体として、三次構造の形成がなされた状態とする。通常、“folding”処理を施すことにより、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。   On the other hand, the single-stranded RNA molecules dissolved in the binding buffer solution are once subjected to heat treatment after the production, and a “denaturing” treatment for eliminating the double-stranded structure in the molecules is performed. A “folding” process is performed to cool and form a tertiary structure. That is, each single-stranded RNA molecule has, according to its base sequence, a secondary structure including a double-stranded structure comprised between the underlying “complementary partial base sequences”, and a tertiary structure as a whole. Is formed. Usually, by performing the “folding” process, the double-stranded structure composed of “complementary partial base sequences” between the strands of the single-stranded RNA molecule is eliminated, and each single-stranded RNA molecule is Each of them has a tertiary structure containing only a double-stranded structure formed in the chain.

なお、“folding”処理中、三次構造を形成する過程において、一本鎖ＲＮＡ分子は、場合によっては、該バインディング・バッファ溶液中に存在する二価の金属カチオン種：Ｍｇ2+に対して、「ヌクレオチド錯体」型の配位結合を形成することもある。すなわち、“folding”処理で形成される一本鎖ＲＮＡ分子の三次構造中に、二価の金属カチオン種：Ｍｇ2+に対して、「ヌクレオチド錯体」型の配位結合が形成されている部位が内在されていることもある。 In the process of forming the tertiary structure during the “folding” process, the single-stranded RNA molecule may, in some cases, against the divalent metal cation species: Mg 2+ present in the binding buffer solution. It may form a “nucleotide complex” type of coordination bond. That is, a site where a “nucleotide complex” type coordinate bond is formed to the divalent metal cation species: Mg 2+ in the tertiary structure of the single-stranded RNA molecule formed by the “folding” treatment. May be inherent.

“folding”処理を施した一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体を含む反応溶液を、所定の時間Incubation処理することで、複合体形成を行わせる。   A complex solution is formed by subjecting a reaction solution containing a single-stranded RNA molecule subjected to “folding” treatment and a homotrimer of Recombinant Human TNF-α to incubation for a predetermined time.

複合体形成反応を行った後、該反応溶液中に含まれる、対象タンパク質のRecombinant Human TNF-αのホモ３量体、ならびに、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と一本鎖ＲＮＡ分子との複合体は、ニトロセルロースフィルターにより濾別する。濾別後、ニトロセルロースフィルターは、前記バインディング・バッファ溶液所定量で洗浄することにより、該ニトロセルロースフィルターの表面に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子を除去する。   After the complex formation reaction, the target protein Recombinant Human TNF-α homotrimer, and the Recombinant Human TNF-α homotrimer and single-stranded RNA molecules contained in the reaction solution The complex with is filtered off with a nitrocellulose filter. After separation, the nitrocellulose filter is washed with a predetermined amount of the binding buffer solution to remove single-stranded RNA molecules that are non-selectively attached to the surface of the nitrocellulose filter.

（iii） Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との複合体の解離条件
フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、該ニトロセルロースフィルターにより濾別されている、該Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体を形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を回収するため、下記の条件で、該複合体の解離を行う。 (Iii) In a SELEX selection round using a filter separation method of dissociation conditions of the complex with the homotrimer of Recombinant Human TNF-α, the homolog of Recombinant Human TNF-α that has been filtered by the nitrocellulose filter In order to recover single-stranded RNA molecules forming a complex with the trimer, the complex is dissociated under the following conditions.

該ニトロセルロースフィルター上に濾別されている、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体を形成している一本鎖ＲＮＡ分子が“denaturing”する条件を採用する。具体的には、下記の加熱処理を施すことで、一本鎖ＲＮＡ分子の有する二次構造、ならびに三次構造を解消することで、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と一本鎖ＲＮＡ分子との複合体の解離を行っている。   Conditions under which “denaturing” single-stranded RNA molecules forming a complex with Recombinant Human TNF-α homotrimer, which has been separated on the nitrocellulose filter, are employed. Specifically, by applying the following heat treatment, the secondary structure and the tertiary structure of the single-stranded RNA molecule are eliminated, so that the homotrimer of Recombinant Human TNF-α and the single-stranded RNA molecule And dissociation of the complex.

前記洗浄処理を終えたニトロセルロースフィルターを、組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 7M Ureaの溶出バッファ溶液の所定量中の浸漬し、９０℃で５分間加熱し、一本鎖ＲＮＡ分子の“denaturing”処理を施す。該“denaturing”処理によって、一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造、ならびに三次構造は解消される結果、該一本鎖ＲＮＡ分子は、変性剤の尿素の高濃度溶液中に溶出される。   The washed nitrocellulose filter is immersed in a predetermined amount of an elution buffer solution of composition: HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 7M Urea, heated at 90 ° C. for 5 minutes, Perform “denaturing” treatment of the stranded RNA molecules. The “denaturing” treatment eliminates the secondary structure as well as the tertiary structure of the single-stranded RNA molecule, so that the single-stranded RNA molecule is eluted in a high concentration solution of the denaturing urea.

溶出された、一本鎖ＲＮＡ分子を含有する溶出バッファ溶液は、ニトロセルロースフィルターと固液分離され、回収される。この回収された溶出バッファ溶液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。   The eluted elution buffer solution containing single-stranded RNA molecules is solid-liquid separated from the nitrocellulose filter and collected. The single-stranded RNA molecules contained in the recovered elution buffer solution are subjected to, for example, ethanol precipitation, centrifuged, and separated and recovered as a precipitate fraction.

（iv） 表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の分離条件
フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを繰り返した後、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」が濃縮されたＲＮＡプールから、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、センサ・チップ上に固定化されている、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を下記の条件で分離する。 (Iv) After repeating the SELEX selection round using the separation method filter separation method of “RNA aptamer molecule” having binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) using a surface plasmon resonance measurement apparatus , Recombinant Recombinant immobilized on a sensor chip using a surface plasmon resonance measurement device from an RNA pool enriched with “RNA aptamer molecules” capable of binding to homotrimers of Recombinant Human TNF-α An “RNA aptamer molecule” capable of binding to human TNF-α homotrimer is separated under the following conditions.

使用した表面プラズモン共鳴装置は、BIACORE 3000（Biacore）である。該表面プラズモン共鳴装置用のセンサ・チップ ＣＭ４（Biacore）表面に予め固定化されている、カルボキシルメチル基置換デキストランを利用して、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体を固定化する。   The surface plasmon resonance apparatus used is BIACORE 3000 (Biacore). Recombinant Human TNF-α homotrimer is immobilized using carboxymethyl group-substituted dextran previously immobilized on the surface of the sensor chip CM4 (Biacore) for the surface plasmon resonance device.

このセンサ・チップ上に固定化された、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」が濃縮されたＲＮＡプールを作用させる。その結果、該ＲＮＡプール中に含まれる、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体を形成する。該ＲＮＡプール自体は、前記バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を溶解したものであり、前記「ＲＮＡアプタマー分子」と、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成は、該バインディング・バッファ溶液中において進行する。   Recombinant Human TNF-α homotrimer immobilized on this sensor chip is an RNA pool that is enriched with “RNA aptamer molecules” capable of binding to Recombinant Human TNF-α homotrimer. Make it work. As a result, the “RNA aptamer molecule” having binding ability to the Recombinant Human TNF-α homotrimer contained in the RNA pool is complexed with the immobilized Recombinant Human TNF-α homotrimer. Form the body. The RNA pool itself is obtained by dissolving a single-stranded RNA molecule in the binding buffer solution, and is complexed with the “RNA aptamer molecule” and the immobilized homotrimer of Recombinant Human TNF-α. Body formation proceeds in the binding buffer solution.

複合体形成過程を終えた後、ＲＮＡを含まないバインディング・バッファ溶液をセンサ・チップ上に流し、ＲＮＡプール液を流し出す。このＲＮＡを含まないバインディング・バッファ溶液を用いた洗浄過程の間に、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成している、前記「ＲＮＡアプタマー分子」の一部も解離するが、大部分の「ＲＮＡアプタマー分子」は、複合体を形成した状態を維持している。   After completing the complex formation process, a binding buffer solution containing no RNA is flowed on the sensor chip, and the RNA pool solution is poured out. Part of the “RNA aptamer molecule” complexed with the immobilized recombinant human TNF-α homotrimer during the washing process using the binding buffer solution that does not contain RNA. However, most of the “RNA aptamer molecules” maintain a complexed state.

洗浄過程の終了後、下記の組成の溶出液をセンサ・チップ上に流し、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と複合体形成している、前記「ＲＮＡアプタマー分子」を溶出させる。この溶出過程で使用されるＥＤＴＡ溶出液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAである。   After completion of the washing process, the eluate having the following composition is flowed on the sensor chip, and the above-mentioned “RNA aptamer molecule” complexed with the immobilized homotrimer of Recombinant Human TNF-α is added. Elute. The composition of the EDTA eluate used in this elution process is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTA.

該ＥＤＴＡ溶出液は、キレート剤ＥＤＴＡを含んでいるため、固定化されているRecombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡアプタマー分子」との複合体中に含まれる、Ｍｇ2+カチオンの除去がなされる。Ｍｇ2+カチオンの除去に伴って、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体との結合能が低下する一本鎖ＲＮＡ分子は、該ＥＤＴＡ溶出液中に溶出される。すなわち、Ｍｇ2+カチオン依存的な複合体形成を行っている、「ＲＮＡアプタマー分子」が選択的に溶出される。一方、Ｍｇ2+カチオン非依存的な複合体形成を行っている、「ＲＮＡアプタマー分子」は、ＥＤＴＡ溶出液中に極く僅かに溶出するが、実質的には、該ＥＤＴＡ溶出液中には回収されない。 Since the EDTA eluate contains the chelating agent EDTA, the Mg 2+ cation contained in the complex of immobilized Recombinant Human TNF-α homotrimer and “RNA aptamer molecule” Removal is done. As the Mg 2+ cation is removed, the single-stranded RNA molecule whose binding ability with the homotrimer of Recombinant Human TNF-α decreases is eluted in the EDTA eluate. That is, the “RNA aptamer molecule” that forms a Mg 2+ cation-dependent complex is selectively eluted. On the other hand, the “RNA aptamer molecule”, which is performing Mg 2+ cation-independent complex formation, elutes very slightly in the EDTA eluate. Not collected.

センサ・チップ上から該ＥＤＴＡ溶出液を回収し、該回収されたＥＤＴＡ溶出液から、含有されている「ＲＮＡアプタマー分子」は、例えば、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。   The EDTA eluate is recovered from the sensor chip, and the contained “RNA aptamer molecule” is subjected to, for example, ethanol precipitation treatment, centrifuged, and separated and recovered as a precipitate fraction. To do.

（v） ニトロセルロースフィルターに対して、非選択的な結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の除去条件
フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、濾別に利用するニトロセルロースフィルターに対する、非選択的な結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮も、不可避的に進行する。 (V) Removal conditions of “single-stranded RNA molecules” having non-selective binding ability for nitrocellulose filters In the SELEX selection round using the filter separation method, non-selection for nitrocellulose filters used for filtration Concentration of “single-stranded RNA molecules” having a specific binding ability also inevitably proceeds.

Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の濃縮を行う際、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を回避するため、「Pre-selection操作」を利用する。   When concentrating “RNA aptamer molecules” capable of binding to Recombinant Human TNF-α homotrimers, in order to avoid concentrating “single-stranded RNA molecules” capable of binding to nitrocellulose filters, -selection operation "is used.

該「Pre-selection操作」は、フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドで利用するＲＮＡプール溶液を、ニトロセルロースフィルターに予め作用させる操作である。ニトロセルロースフィルターに作用させると、該ＲＮＡプール溶液中に含まれる、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、該ニトロセルロースフィルター自体に結合される。その結果、該ニトロセルロースフィルターと固液分離され、回収される、ＲＮＡプール溶液中に残余する、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃度は、大幅に低減されている。   The “Pre-selection operation” is an operation in which an RNA pool solution used in a SELEX selection round using a filter separation method is previously applied to a nitrocellulose filter. When acting on a nitrocellulose filter, the “single-stranded RNA molecule” contained in the RNA pool solution and capable of binding to the nitrocellulose filter is bound to the nitrocellulose filter itself. As a result, the concentration of the “single-stranded RNA molecule” that has the ability to bind to the nitrocellulose filter remaining in the RNA pool solution that is solid-liquid separated and recovered from the nitrocellulose filter is greatly reduced. .

該「Pre-selection操作」を予め施した、ＲＮＡプール溶液を利用して、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを行うと、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は濃縮を受けるが、予め、ＲＮＡプール溶液中の含有濃度を低減している結果、回収される溶出バッファ溶液中に含まれる「一本鎖ＲＮＡ分子」中における、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の比率は、相対的に低い水準となっている。   When a SELEX selection round is performed using an RNA pool solution that has been subjected to the “Pre-selection operation” in advance, “single-stranded RNA molecules” that have binding ability to a nitrocellulose filter are subjected to concentration. As a result of reducing the concentration in the RNA pool solution, the “single-stranded RNA molecule” having binding ability to the nitrocellulose filter in the “single-stranded RNA molecule” contained in the recovered elution buffer solution The ratio is relatively low.

従って、該「Pre-selection操作」を利用することで、フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを繰り返しても、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を実質的に回避することが可能となる。   Therefore, by using the “Pre-selection operation”, the concentration of “single-stranded RNA molecules” having binding ability to the nitrocellulose filter can be substantially increased even when the SELEX selection round using the filter separation method is repeated. It can be avoided.

（vi） 「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」の調製
「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」より調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。 (Vi) Preparation of “RNA pool” to be used after “2nd round” “RNA pool” to be used after “2nd round” is prepared from “single-stranded RNA molecules” collected in the previous round. This is prepared by in vitro transcription using T7 RNA polymerase using a double-stranded cDNA molecule as a transcription template.

回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程では、下記のForward Primer とReverse Primerを利用して、RT-PCR法を適用する。   In the step of preparing a double-stranded cDNA molecule using the recovered “single-stranded RNA molecule” as a template, the RT-PCR method is applied using the following Forward Primer and Reverse Primer.

Forward Primer：（配列番号：２２）
5'- GATAATACGACTCACTATA GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G -3'
Reverse Primer：（配列番号：２３）
5'- GTCA CGTTC CGGAT ACTAG-3'
前記Reverse Primerは、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の３’末端の固定領域と相補的な塩基配列である。 Forward Primer: (SEQ ID NO: 22)
5'- GATAATACGACTCACTATA GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G -3 '
Reverse Primer: (SEQ ID NO: 23)
5'- GTCA CGTTC CGGAT ACTAG-3 '
The Reverse Primer is a base sequence complementary to the fixed region at the 3 ′ end of the “single-stranded RNA molecule” to be recovered.

5'- CUAGU AUCCG GAACG UGAC -3' （配列番号：３０）
3'- GATCA TAGGC CTTGC ACTG -5' （配列番号：２３）
前記Forward Primerは、「Ｔ７プロモーター領域」として利用可能な塩基配列と、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の５’末端の固定領域に相当する部分とで構成されている。 5'- CUAGU AUCCG GAACG UGAC -3 '(SEQ ID NO: 30)
3'-GATCA TAGGC CTTGC ACTG -5 '(SEQ ID NO: 23)
The Forward Primer is composed of a base sequence that can be used as a “T7 promoter region” and a portion corresponding to the fixed region at the 5 ′ end of the “single-stranded RNA molecule” to be recovered.

「Ｔ７プロモーター領域」：5'- GATAATACGACTCACTATA -3' （配列番号：２６）
５’末端の固定領域に相当する部分：5'- GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G -3' （配列番号：２４）
その結果、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子の塩基配列は、５’末端にForward Primerに起因する領域、３’末端にReverse Primerに相補的な領域、その間に、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」の５’末端の固定領域の一部：AUUCと「ランダム配列部分」に由来する領域とで構成されている。 “T7 promoter region”: 5′-GATAATACGACTCACTATA-3 ′ (SEQ ID NO: 26)
Portion corresponding to the fixed region at the 5 ′ end: 5′-GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G-3 ′ (SEQ ID NO: 24)
As a result, the base sequence of the double-stranded cDNA molecule prepared using the recovered “single-stranded RNA molecule” as a template is a region originating from the forward primer at the 5 ′ end and complementary to the reverse primer at the 3 ′ end. A part of the fixed region at the 5 ′ end of the recovered “single-stranded RNA molecule”: AUUC and a region derived from the “random sequence portion”.

Forward Primerに起因する領域：（配列番号：２２）
GATAATACGACTCACTATA GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G
「ランダム配列部分(Ｎ51)」に由来する領域：
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN N
Reverse Primerに相補的な領域：（配列番号：２５）
CTAGT ATCCG GAACG TGAC
調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製される「一本鎖ＲＮＡ分子」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」とは、その「ランダム配列部分」の頻度分布は、本質的に同じ分布を示すものとなっている。 Area resulting from Forward Primer: (SEQ ID NO: 22)
GATAATACGACTCACTATA GGAAG ACCAG CCTTA AGAGG G
Region derived from “random sequence portion (N 51 )”:
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN N
Region complementary to Reverse Primer: (SEQ ID NO: 25)
CTAGT ATCCG GAACG TGAC
The “single stranded RNA molecule” prepared by in vitro transcription using T7 RNA polymerase using the prepared double stranded cDNA molecule as a transcription template is the “single stranded RNA” recovered in the previous round. “Molecules” have essentially the same frequency distribution of “random sequence portions”.

調製された「一本鎖ＲＮＡ分子」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応溶液から回収し、上記のバインディング・バッファ溶液中に、所定の濃度で溶解して、次段ラウンドで利用する「ＲＮＡプール」とする。なお、「一本鎖ＲＮＡ分子」に対して、“folding”処理を施す。その結果、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。   The prepared “single-stranded RNA molecule” is recovered from the in vitro transcription reaction solution, dissolved in the above binding buffer solution at a predetermined concentration, and used as the “RNA pool” used in the next round. . The “single-stranded RNA molecule” is subjected to “folding” treatment. As a result, the double-stranded structure formed between “complementary partial base sequences” between the strands of the single-stranded RNA molecule is eliminated, and each single-stranded RNA molecule is formed within the strand. It has a tertiary structure that contains only a double-stranded structure.

（vii） 表面プラズモン共鳴装置用のセンサ・チップに対して、非選択的な結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の除去条件
表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、センサ・チップ上に固定化されている、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を選別する際、センサ・チップ ＣＭ４の表面に非選択的に結合する一本鎖ＲＮＡ分子も不可避的に分取される。 (Vii) Removal conditions of “single-stranded RNA molecules” that have non-selective binding ability to the sensor chip for the surface plasmon resonance device Fixed on the sensor chip using the surface plasmon resonance measurement device When selecting “RNA aptamer molecules” that have the ability to bind Recombinant Human TNF-α homotrimers, single-stranded RNA molecules that bind non-selectively to the surface of the sensor chip CM4 are inevitable. Are sorted out.

このセンサ・チップ ＣＭ４の表面に非選択的に結合する一本鎖ＲＮＡ分子の混入比率を低減するため、「Pre-selection操作」を利用する。   In order to reduce the mixing ratio of single-stranded RNA molecules that non-selectively bind to the surface of the sensor chip CM4, a “Pre-selection operation” is used.

該「Pre-selection操作」は、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する選択ラウンドで利用するＲＮＡプール溶液を、センサ・チップ ＣＭ４に予め作用させる操作である。センサ・チップ ＣＭ４に作用させると、該ＲＮＡプール溶液中に含まれる、センサ・チップ ＣＭ４の表面に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、該センサ・チップ ＣＭ４の表面自体に結合される。その結果、該センサ・チップ ＣＭ４と固液分離され、回収される、ＲＮＡプール溶液中に残余する、センサ・チップ ＣＭ４自体に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃度は、大幅に低減されている。   The “Pre-selection operation” is an operation in which an RNA pool solution used in a selection round using a surface plasmon resonance measuring apparatus is caused to act on the sensor chip CM4 in advance. When acting on the sensor chip CM4, the “single-stranded RNA molecule” having the binding ability to the surface of the sensor chip CM4 contained in the RNA pool solution is bound to the surface of the sensor chip CM4 itself. . As a result, the concentration of the “single-stranded RNA molecule” having the binding ability to the sensor chip CM4 itself, which is solid-liquid separated from the sensor chip CM4 and collected and remains in the RNA pool solution, is greatly reduced. Has been.

該「Pre-selection操作」を予め施した、ＲＮＡプール溶液を利用して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する選択ラウンドを行うと、センサ・チップ ＣＭ４に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は濃縮を受けるが、予め、ＲＮＡプール溶液中の含有濃度を低減している結果、回収される溶出バッファ溶液中に含まれる「一本鎖ＲＮＡ分子」中における、センサ・チップ ＣＭ４に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の比率は、相対的に低い水準となっている。   When a selection round using a surface plasmon resonance measuring apparatus is performed using an RNA pool solution that has been subjected to the “Pre-selection operation” in advance, a “single-stranded RNA molecule” having binding ability to the sensor chip CM4 However, as a result of reducing the concentration in the RNA pool solution in advance, the binding ability to the sensor chip CM4 in the “single-stranded RNA molecule” contained in the recovered elution buffer solution is reduced. The ratio of the “single-stranded RNA molecule” is relatively low.

従って、該「Pre-selection操作」を利用することで、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する選択ラウンドを繰り返しても、センサ・チップ ＣＭ４に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を実質的に回避することが可能となる。   Therefore, by using the “Pre-selection operation”, even if the selection round using the surface plasmon resonance measuring apparatus is repeated, the concentration of “single-stranded RNA molecules” having the binding ability to the sensor chip CM4 is substantially increased. Can be avoided.

（第一の実施態様）
第一の実施態様では、本発明の第一の形態にかかるRecombinant Human TNF-αに対する結合能を有するアプタマーを選別する一連の工程の一例を以下に説明する。 (First embodiment)
In the first embodiment, an example of a series of steps for selecting an aptamer having binding ability to Recombinant Human TNF-α according to the first aspect of the present invention will be described below.

第一の実施態様では、フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ法を適用し、下記の表１に記載する条件を採用して、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有するアプタマーの選別を行っている。   In the first embodiment, an SELEX method using a filter separation method is applied, and the conditions described in Table 1 below are adopted to select aptamers having the ability to bind to a homotrimer of Recombinant Human TNF-α. It is carried out.

表１に示す選択条件では、フィルター分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを１０ラウンド繰り返し、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子の濃縮を行っている。なお、第一の実施態様では、市販されているRecombinant Human TNF-α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，３００−０１Ａ）を使用している。 Under the selection conditions shown in Table 1, the SELEX selection round using the filter separation method is repeated 10 rounds to concentrate the single-stranded RNA molecules having the binding ability to the homotrimer of Recombinant Human TNF-α. . In the first embodiment, commercially available Recombinant Human TNF-α (PeproTech, 300-01A) is used.

各ラウンドにおいて、回収された溶出液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、RT-PCR法を応用して、次段のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」の作製に利用される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写用テンプレートとなる、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。   In each round, single-stranded RNA molecules contained in the recovered eluate are subjected to ethanol precipitation, centrifuged, and separated and recovered as a precipitated fraction. Using the separated and single-stranded RNA molecule as a template, the RT-PCR method is applied to become an in vitro transcription template used in the creation of an “RNA pool” to be used in the next round. A double-stranded cDNA molecule is prepared.

従って、各ラウンドにおいて、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程では、上記のForward Primer とReverse Primerを利用して、RT-PCR法を適用する。   Therefore, in each round, the RT-PCR method is applied using the above-mentioned Forward Primer and Reverse Primer in the step of preparing a double-stranded cDNA molecule using the recovered “single-stranded RNA molecule” as a template. .

２回目のラウンド以降では、利用するニトロセルロースフィルターを用いる「Pre-selection操作」を実施することで、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を回避している。   From the second round onward, concentration of “single-stranded RNA molecules” having binding ability to the nitrocellulose filter is avoided by performing a “Pre-selection operation” using the nitrocellulose filter to be used.

ラウンドが進むとともに、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、徐々に濃縮される傾向がある。従って、３回目のラウンド以降では、「Pre-selection操作」の回数を３回として、ニトロセルロースフィルターに対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の除去効率を高く設定している。   As the round progresses, “single-stranded RNA molecules” that have the ability to bind to nitrocellulose filters tend to be gradually concentrated. Therefore, after the third round, the number of “Pre-selection operations” is set to 3, and the removal efficiency of “single-stranded RNA molecules” having binding ability to the nitrocellulose filter is set high.

なお、「Pre-selection操作」を実施する際も、その液温度は、２５℃とし、各回の「ＲＮＡプール」とニトロセルロースフィルターの接触時間は、前記「Incubation Time」と等しい時間を選択している。   When performing the “Pre-selection operation”, the liquid temperature is 25 ° C., and the contact time between each “RNA pool” and the nitrocellulose filter is selected to be equal to the “Incubation Time”. Yes.

各回のラウンドにおける、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡプール」を接触させる際、その液温度は、２５℃とし、その時間：「Incubation Time」は、表１に示す。表１に示すように、Recombinant Human TNF-αの濃度は１０ｎＭ以上の範囲に選択されており、Recombinant Human TNF-αは、ホモ３量体として存在している。   In each round, when the Recombinant Human TNF-α homotrimer and the “RNA pool” are brought into contact with each other, the liquid temperature is 25 ° C., and the time: “Incubation Time” is shown in Table 1. As shown in Table 1, the concentration of Recombinant Human TNF-α is selected in the range of 10 nM or more, and Recombinant Human TNF-α exists as a homotrimer.

４回目のラウンド以降では、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡプール」を接触させる際、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対して、選択的な結合能を有していない「tRNA」を、反応溶液中に添加している。該「tRNA」は、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着する機能を有するので、「ＲＮＡプール」中に含まれる、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着可能な一本鎖ＲＮＡ分子と競合する。すなわち、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着可能な一本鎖ＲＮＡ分子の、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面への付着は、添加されている「tRNA」によって、競争的に阻害される。結果的に、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対して、選択的な結合能を示す「一本鎖ＲＮＡ分子」の回収効率が相対的に増す。換言するならば、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に存在する、非選択的な付着が可能な領域を、添加されている「tRNA」を利用して、blockingすることに相当している。   From the 4th round onwards, when the Recombinant Human TNF-α homotrimer is brought into contact with the “RNA pool”, it has a selective binding ability to the Recombinant Human TNF-α homotrimer. There is no “tRNA” added to the reaction solution. Since the “tRNA” has a function of non-selectively attaching to the surface of the Recombinant Human TNF-α homotrimer, the Recombinant Human TNF-α homotrimer contained in the “RNA pool” Competes with single-stranded RNA molecules that can adhere non-selectively to the surface. That is, a single-stranded RNA molecule that can be non-selectively attached to the surface of the Recombinant Human TNF-α homotrimer is added to the surface of the Recombinant Human TNF-α homotrimer. It is competitively inhibited by “tRNA”. As a result, the recovery efficiency of “single-stranded RNA molecules” exhibiting a selective binding ability with respect to Recombinant Human TNF-α homotrimer is relatively increased. In other words, this corresponds to blocking the region capable of non-selective attachment existing on the surface of the Recombinant Human TNF-α homotrimer using the added “tRNA”. ing.

一方、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対して、選択的、かつ、高い結合能を示す「一本鎖ＲＮＡ分子」は、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に存在する、該「一本鎖ＲＮＡ分子」の結合部位に対して、安定な複合体形成するため、添加されている「tRNA」に因って、その複合体形成過程は、実質的な影響を受けない。   On the other hand, a “single-stranded RNA molecule” that is selective and highly binding to the Recombinant Human TNF-α homotrimer exists on the surface of the Recombinant Human TNF-α homotrimer. In order to form a stable complex with the binding site of the “single-stranded RNA molecule”, the complex formation process is not substantially affected by the added “tRNA”. .

各回のラウンドでは、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡプール」を接触させ、インキュベーションした後、濾過マニフォールド（ミリポア社）を使用して、１３ｍｍφニトロセルロースフィルターにより、反応溶液中に含まれる、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体、ならびに一本鎖ＲＮＡ分子／Recombinant Human TNF-αのホモ３量体複合体を濾別する。次いで、該ニトロセルロースフィルター上に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子を洗浄除去するため、洗浄工程を設けている。該洗浄工程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を利用して、その液温度は、２５℃としている。表１に記載する、液量を用いて、洗浄を行っている。該洗浄工程では、ニトロセルロースフィルター上に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子の脱着に加えて、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子の脱着も進行する。従って、該洗浄工程が終了した時点では、ニトロセルロースフィルター上に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の表面に非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子の大半が除去される。   In each round, Recombinant Human TNF-α homotrimer was brought into contact with the “RNA pool”, incubated, and then included in the reaction solution with a 13 mmφ nitrocellulose filter using a filtration manifold (Millipore). Recombinant Human TNF-α homotrimer and single-stranded RNA molecule / Recombinant Human TNF-α homotrimer complex are filtered off. Next, a washing step is provided to wash away single-stranded RNA molecules that are non-selectively attached on the nitrocellulose filter. In the washing step, a binding buffer solution not containing RNA molecules is used, and the solution temperature is set to 25 ° C. Washing is performed using the liquid amounts described in Table 1. In the washing step, in addition to the desorption of the single-stranded RNA molecules non-selectively attached on the nitrocellulose filter, they are non-selectively attached to the surface of the Recombinant Human TNF-α homotrimer. Desorption of single-stranded RNA molecules also proceeds. Therefore, at the time when the washing step is completed, the single-stranded RNA molecule non-selectively attached on the nitrocellulose filter and the surface of the Recombinant Human TNF-α homotrimer are non-selectively attached. Most of the single-stranded RNA molecules that are present are removed.

さらに、４回目のラウンド以降では、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と「ＲＮＡプール」を接触させる際、反応溶液中に含有される、「ＲＮＡプール」のＲＮＡ濃度の総和に対する、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の濃度の比率を段階的に低下させている。４回目のラウンドでは、「ＲＮＡプール」のＲＮＡ濃度の総和：Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の濃度の比率は、１：０．６２であるが、１０回目のラウンドでは、１：０２０まで低下させている。その結果、ラウンドを重ねる毎に、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体と選択的に複合体形成して、フィルターにより濾別される、「一本鎖ＲＮＡ分子」中において、その複合体の解離定数ＫDがより小さな値を示すものの比率が増す。すなわち、複合体の解離定数ＫDがより小さな値を示すものがより効率的に濃縮される。 Furthermore, after the fourth round, when the Recombinant Human TNF-α homotrimer is brought into contact with the “RNA pool”, the Recombinant Human relative to the total RNA concentration of the “RNA pool” contained in the reaction solution. The ratio of the TNF-α homotrimer concentration is gradually reduced. In the fourth round, the ratio of the total RNA concentration of the “RNA pool”: Recombinant Human TNF-α homotrimer concentration is 1: 0.62, whereas in the tenth round, 1: 020 Has been reduced to. As a result, in each “round stranded RNA molecule” that selectively forms a complex with Recombinant Human TNF-α homotrimer and is filtered by a filter in each round, The proportion of the dissociation constants K D showing smaller values increases. I.e., dissociation constant, K D, of the complex shows a smaller value is more efficiently concentrated.

１０回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。   In the tenth round, double-stranded cDNA molecules are similarly prepared using the single-stranded RNA molecules separated and recovered as a template and the RT-PCR method.

調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を溶解する液の一部を使用して、含有される二本鎖ｃＤＮＡ分子を、市販のＴＡクローニング・キット（プロメガ株式会社）を利用して、クローニングする。具体的には、当該キットに添付される標準プロトコルに従って、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物（二本鎖ＤＮＡ分子）群を、クローニングベクター；ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ へ、ライゲーションする。このライゲーション後、クローニングベクターにより、大腸菌株Ｍａｃｈ１（インビトロジェン）を形質転換させる。   Using a part of the solution for dissolving the prepared double-stranded cDNA molecule, the contained double-stranded cDNA molecule is cloned using a commercially available TA cloning kit (Promega Corporation). Specifically, according to a standard protocol attached to the kit, a group of amplification products (double-stranded DNA molecules) by RT-PCR is ligated to a cloning vector; pGEM-T Easy. After this ligation, E. coli strain Mach1 (Invitrogen) is transformed with the cloning vector.

次いで、前記クローニングベクター由来の選択マーカーを利用し、定法に従って、クローニングベクターを保持する形質転換株をコロニー選別する。コロニー選別された、多数の形質転換株中から、３４株を無作為に選択し、当該クローン株が保持する、ｃＤＮＡ分子の塩基配列を解析した。その結果、前記３４株のクローン中、同じｃＤＮＡを保持するクローンが複数存在する、クローン・ファミリーが含まれることが確認された。   Next, using the selection marker derived from the cloning vector, a transformant carrying the cloning vector is colony selected according to a conventional method. 34 clones were randomly selected from a large number of transformed strains selected for colony, and the base sequence of the cDNA molecule held by the clone strain was analyzed. As a result, it was confirmed that among the clones of the 34 strains, a clone family in which a plurality of clones having the same cDNA exist was included.

具体的には、下記の表２に示す、一本鎖ＲＮＡ分子をコードする部分の塩基配列を有するｃＤＮＡを保持するクローン：TNF-130は、前記３４株のクローン中、３クローン存在している。   Specifically, clones having a cDNA having a base sequence of a portion encoding a single-stranded RNA molecule shown in Table 2 below: TNF-130 is present in 3 clones among the 34 clones. .

該クローン：TNF-130が保持するｃＤＮＡがコードしている、一本鎖ＲＮＡ分子について、実際に、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体に対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。

具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ：Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＡチップ上のStreptavidinタンパク質による結合を介して、ｂｉｏｔｉｎ修飾したポリｄＵを１０００ＲＵ固定化する。３’末端にポリＡが付加されている、一本鎖ＲＮＡ分子を、該ポリＡ部分をチップ上に固定化されているポリｄＵとハイブリダイズさせ、２０００ＲＵ固定化する。 The clone: A single-stranded RNA molecule encoded by the cDNA held by TNF-130 actually has a binding ability to a homotrimer of Recombinant Human TNF-α. Used and verified.

Specifically, using a surface plasmon resonance measuring apparatus: BIACORE 3000, biotin-modified poly dU is immobilized at 1000 RU through binding by Streptavidin protein on its sensor chip: Biacore SA chip. A single-stranded RNA molecule having poly A added to the 3 ′ end is hybridized with poly dU having the poly A moiety immobilized on the chip to immobilize 2000 RU.

バインディング・バッファ溶液中にRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を、３７．５ｎＭ、１８．８ｎＭ、２５．０ｎＭ、１２．５ｎＭ含有している、４種類のRecombinant Human TNF-α溶液を調製する。センサ・チップ上に、このRecombinant Human TNF-α溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されている一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-αのホモ３量体の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上にRecombinant Human TNF-α溶液を流通させる時間は、２ｍｉｎとしている。   Four types of Recombinant Human TNF-α solutions containing 37.5nM, 18.8nM, 25.0nM, and 12.5nM Recombinant Human TNF-α (homotrimer) in the binding buffer solution are prepared. To do. This Recombinant Human TNF-α solution is allowed to flow on the sensor chip at a flow rate of 20 μL / min to form a complex of the immobilized single-stranded RNA molecule and the homotrimer of Recombinant Human TNF-α. . In this complex formation process, the liquid temperature is 25 ° C., and the time for circulating the Recombinant Human TNF-α solution on the sensor chip is 2 min.

次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、３ｍｉｎ流し、センサ・チップ上のRecombinant Human TNF-α溶液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。 Next, in the dissociation process of the complex, a running buffer solution containing the following composition and not containing Recombinant Human TNF-α (homotrimer) is allowed to flow for 3 min at a flow rate of 20 μL / min, and the Recombinant Human on the sensor chip is flowed. Remove TNF-α solution and proceed with dissociation of complex. In the dissociation process of the complex, the liquid temperature is 25 ° C. The composition of the running buffer solution without Recombinant Human TNF-α (homotrimer) is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl + 0.005% Tween20.

図１に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130について、センサ・チップ上に固定化されている３’末端ポリＡ鎖付加型の一本鎖ＲＮＡ分子とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した結果の一例を示す。液温度２５℃における、該一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130に対する測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、固定化された一本鎖ＲＮＡ分子とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫD＝ｋd／ｋaを算出した。算出された値は、ｋa＝1.01×１０5 (Ｍ-1ｓ-1)、ｋd＝2.75×１０-7 (ｓ-1)、ＫD＝ｋd／ｋa=2.74（ｐＭ）であった。 FIG. 1 shows a single-stranded RNA molecule: TNF-130 and a 3′-terminal poly A-chain-added single-stranded RNA molecule immobilized on a sensor chip and Recombinant Human TNF-α (homotrimer). 1) shows an example of the result of measuring the temporal change of the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and the complex dissociation process. Based on the measurement results for the single-stranded RNA molecule: TNF-130 at a liquid temperature of 25 ° C., the liquid temperature is 25 ° C., and the composition of the binding buffer solution is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl Rate constant of complex formation between immobilized single-stranded RNA molecule and Recombinant Human TNF-α (homotrimer) under the condition of 2 + 5 mM KCl: ka, rate constant of complex dissociation: kd as well as to calculate the dissociation constant K D = k d / k a . Calculated value, k a = 1.01 × 10 5 (M -1 s -1), in k d = 2.75 × 10 -7 ( s -1), K D = k d / k a = 2.74 (pM) there were.

なお、チップ上にRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を固定した状態において、測定される複合体形成の速度定数：ｋa、複合体の解離の速度定数：ｋdから算出される解離定数ＫD＝ｋd／ｋaも、ＫD＝ｋd／ｋa=2.74（ｐＭ）であった。 Incidentally, in Recombinant Human TNF-α fixed state (homotrimer) on the chip, complex formation rate constant measured: k a, dissociation rate constants of the complexes: dissociation calculated from k d constant K D = k d / k a was also K D = k d / k a = 2.74 (pM).

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130は、下記表３に示す塩基配列を有しており、その推定される二次構造を、図２に示す。なお、この一本鎖ＲＮＡ分子における、二次構造の推定には、特開２００８−２８３９４３号公報に開示される手法を適用し、二次構造推定プログラム：ＶＡＬＦＯＬＤを利用した。   Single-stranded RNA molecule: TNF-130 has the base sequence shown in Table 3 below, and its presumed secondary structure is shown in FIG. The secondary structure in this single-stranded RNA molecule was estimated by applying the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-283943 and utilizing the secondary structure estimation program: VALFOLD.

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130の推定される二次構造では、その中心部に、ループ様の構造が構成されている。 In the presumed secondary structure of single-stranded RNA molecule: TNF-130, a loop-like structure is formed at the center.

固定化された一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl)で洗浄した後、センサ・チップ上に、組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAのＥＤＴＡ溶出液を注入し、２ｍｉｎ保持すると、完全に解離される。すなわち、形成された複合体は、Ｍｇ2+カチオンを含有しており、キレート剤ＥＤＴＡを作用させ、Ｍｇ2+カチオンを除去すると、該複合体は速やかに解離している。従って、固定化された一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）は、Ｍｇ2+カチオン依存性の複合体を形成していると、判断される。 Immobilized single-stranded RNA molecule: A complex of TNF-130 and Recombinant Human TNF-α (homotrimer) was washed with HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl), When an EDTA eluate of composition: HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTA is injected onto the chip and kept for 2 min, it is completely dissociated. That is, the formed complex contains Mg 2+ cation, and when the chelating agent EDTA is allowed to act and the Mg 2+ cation is removed, the complex is rapidly dissociated. Therefore, it is determined that the immobilized single-stranded RNA molecule: TNF-130 and Recombinant Human TNF-α (homotrimer) form a Mg 2+ cation-dependent complex.

前記１０回目のラウンドで分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子の一群に対して、さらに、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを２回追加している。具体的には、この追加の選択ラウンドでは、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ ＣＭ４の表面上に、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を固定化し、該固定化されたRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）と複合体を形成する一本鎖ＲＮＡ分子を選別している。   Two additional SELEX selection rounds using a surface plasmon resonance measuring apparatus are added to the group of single-stranded RNA molecules separated and recovered in the tenth round. Specifically, in this additional selection round, a surface plasmon resonance measurement apparatus: BIACORE 3000 is used, and Recombinant Human TNF-α (homotrimer) is immobilized on the surface of the sensor chip CM4. Single-stranded RNA molecules forming a complex with immobilized Recombinant Human TNF-α (homotrimer) are selected.

この追加の選択ラウンドは、表４に示す条件を使用している。   This additional selection round uses the conditions shown in Table 4.

上述するように、１０回目のラウンドにおいて分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製している。調製される二本鎖ｃＤＮＡ分子をテンプレートとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写を行い、１１回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液を作製する。 As described above, a double-stranded cDNA molecule is prepared by applying the RT-PCR method using the single-stranded RNA molecule separated and collected in the 10th round as a template. Using the prepared double-stranded cDNA molecule as a template, in vitro transcription is performed to prepare an “RNA pool” solution used in the eleventh round.

１１回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液は、バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を１μＭ含有している。１１回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液に対して、下記の「Pre-selection」処理を３回施す。「Pre-selection」処理では、センサ・チップ ＣＭ４自体を利用して、該「ＲＮＡプール」液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、前記センサ・チップ ＣＭ４の表面に、非選択的に結合する一本鎖ＲＮＡ分子を結合させる。「Pre-selection」処理において、流出する液中では、センサ・チップ ＣＭ４の表面に対して、非選択的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子の濃度が低減されている。該「Pre-selection」処理を３回繰り返すことで、最終的に得られる「ＲＮＡプール」液中には、センサ・チップ ＣＭ４の表面に対して、非選択的で高い結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子が実質的に含有していない状態となる。   The “RNA pool” solution used in the eleventh round contains 1 μM of single-stranded RNA molecules in the binding buffer solution. The following “Pre-selection” treatment is applied three times to the “RNA pool” solution used in the eleventh round. In the “Pre-selection” process, the sensor chip CM4 itself is used to flow the “RNA pool” solution at a flow rate of 20 μL / min, and non-selectively binds to the surface of the sensor chip CM4. Binds strand RNA molecules. In the “Pre-selection” process, the concentration of single-stranded RNA molecules having non-selective binding ability with respect to the surface of the sensor chip CM4 is reduced in the flowing out liquid. By repeating the “Pre-selection” treatment three times, the final “RNA pool” solution contains a single strand that is non-selective and highly binding to the surface of the sensor chip CM4. The RNA molecule is substantially not contained.

１１回目の選択ラウンドでは、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）が固定化されているセンサ・チップ ＣＭ４上に、該「ＲＮＡプール」液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されているRecombinant Human TNF-αと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡプール」液を流通させる時間は、５ｍｉｎとしている。   In the eleventh round of selection, the “RNA pool” solution was flowed at a flow rate of 20 μL / min onto the sensor chip CM4 on which Recombinant Human TNF-α (homotrimer) had been immobilized. Recombinant Human TNF-α is allowed to form a complex of single-stranded RNA molecules. In this complex formation process, the liquid temperature is 25 ° C., and the time for circulating the “RNA pool” liquid on the sensor chip is 5 min.

洗浄過程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、５ｍｉｎ流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡプール」液を除去する。該洗浄過程において、その液温度は、２５℃としている。   In the washing process, a binding buffer solution not containing RNA molecules is allowed to flow for 5 minutes at a flow rate of 20 μL / min to remove the “RNA pool” solution on the sensor chip. In the washing process, the liquid temperature is 25 ° C.

洗浄過程の終了後、下記の組成のＥＤＴＡ溶出液をセンサ・チップ上に満たし、インキュベーションすることで、固定化されているRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）と複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を溶出させる。この溶出過程で使用されるＥＤＴＡ溶出液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTAである。   After completion of the washing process, the sensor chip is filled with an EDTA eluate having the following composition and incubated to form a complex with the immobilized Recombinant Human TNF-α (homotrimer). Elute single-stranded RNA molecules. The composition of the EDTA eluate used in this elution process is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTA.

該溶出過程では、該溶出液２μＬを、センサ・チップ上に満たし、５ｍｉｎインキュベーションする間に、Ｍｇ2+カチオンをＥＤＴＡ錯体として除去する。その結果、Ｍｇ2+カチオン依存的にRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）と複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択的に解離させている。すなわち、該ＥＤＴＡ溶出液中には、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対して、Ｍｇ2+カチオン依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子が回収されている。 In the elution process, 2 μL of the eluate is filled on the sensor chip, and Mg 2+ cations are removed as EDTA complexes during 5 min incubation. As a result, single-stranded RNA molecules complexed with Recombinant Human TNF-α (homotrimer) in a Mg 2+ cation-dependent manner are selectively dissociated. That is, in the EDTA eluate, single-stranded RNA molecules having the ability to bind Mg 2+ cations to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) are recovered.

１１回目の選択ラウンドにおいて分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製している。調製される二本鎖ｃＤＮＡ分子をテンプレートとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写を行い、１２回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液を作製する。   A double-stranded cDNA molecule is prepared by applying the RT-PCR method using the single-stranded RNA molecule separated and recovered in the eleventh selection round as a template. Using the prepared double-stranded cDNA molecule as a template, in vitro transcription is performed to prepare an “RNA pool” solution used in the 12th round.

１２回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液は、バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を５μＭ含有している。１２回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液に対しても、上記条件で「Pre-selection」処理を３回施す。   The “RNA pool” solution used in the 12th round contains 5 μM of single-stranded RNA molecules in the binding buffer solution. Also for the “RNA pool” solution used in the 12th round, the “Pre-selection” treatment is performed three times under the above conditions.

１２回目の選択ラウンドにおける操作は、前記１１回目の選択ラウンドにおける操作と同じである。   The operation in the 12th selection round is the same as the operation in the 11th selection round.

１２回目の選択ラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。   In the twelfth selection round, double-stranded cDNA molecules are similarly prepared by applying RT-PCR method using the single-stranded RNA molecules separated and recovered as a template.

調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を溶解する液の一部を使用して、含有される二本鎖ｃＤＮＡ分子を、市販のＴＡクローニング・キット（プロメガ株式会社）を利用して、クローニングする。当該キットに添付される標準プロトコルに従って、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物（二本鎖ＤＮＡ分子）群を、クローニングベクター；ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ へ、ライゲーションする。このライゲーション後、クローニングベクターにより、大腸菌株Ｍａｃｈ１（インビトロジェン）を形質転換させる。   Using a part of the solution for dissolving the prepared double-stranded cDNA molecule, the contained double-stranded cDNA molecule is cloned using a commercially available TA cloning kit (Promega Corporation). According to the standard protocol attached to the kit, a group of amplification products (double-stranded DNA molecules) by RT-PCR is ligated to a cloning vector; pGEM-T Easy. After this ligation, E. coli strain Mach1 (Invitrogen) is transformed with the cloning vector.

次いで、前記クローニングベクター由来の選択マーカーを利用し、定法に従って、クローニングベクターを保持する形質転換株をコロニー選別する。コロニー選別された、多数の形質転換株中から、４２株を無作為に選択し、当該クローン株が保持する、ｃＤＮＡ分子の塩基配列を解析した。その結果、前記４２株のクローン中、同じｃＤＮＡを保持するクローンが複数存在する、クローン・ファミリーが含まれることが確認された。   Next, using the selection marker derived from the cloning vector, a transformant carrying the cloning vector is colony selected according to a conventional method. Forty-two strains were randomly selected from the large number of transformed strains selected for colony, and the base sequence of the cDNA molecule held by the clone strain was analyzed. As a result, it was confirmed that among the clones of the 42 strains, a clone family in which multiple clones having the same cDNA exist was included.

具体的には、下記の表５に示す、一本鎖ＲＮＡ分子をコードする部分の塩基配列を有するｃＤＮＡを保持するクローン：TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510は、前記４２株のクローン中、２クローン以上存在している。   Specifically, the clones holding the cDNA having the base sequence of the portion encoding the single-stranded RNA molecule shown in Table 5 below: TNF-485, TNF-505, TNF-508, TNF-510 Two or more clones are present in 42 clones.

該クローン：TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510が保持するｃＤＮＡがコードしている、一本鎖ＲＮＡ分子について、実際に、Recombinant Human TNF-αに対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。この検証では、評価する一本鎖ＲＮＡ分子として、ＲＮＡ鎖を構成する各リボ核酸の２’−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子を使用している。 The clone: the single-stranded RNA molecule encoded by the cDNA held by TNF-485, TNF-505, TNF-508, and TNF-510 is actually capable of binding to Recombinant Human TNF-α. This was verified by using a surface plasmon resonance measuring apparatus. In this verification, the single-stranded RNA molecule to be evaluated has been modified so that the 2′-position hydroxyl group (—OH) of each ribonucleic acid constituting the RNA strand is replaced with a fluorine atom (—F). 'F-modified RNA strand type single stranded RNA molecule is used.

具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップ：Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ４上に、Recombinant Human TNF-αを、１０，０００ＲＵ固定化する。なお、固定化されているRecombinant Human TNF-αは、ホモ３量体の形状を保持していると推断される。   Specifically, the surface plasmon resonance measuring apparatus: BIACORE 3000 is used, and Recombinant Human TNF-α is immobilized on 10,000 RU on the sensor chip: Biacore CM4. The immobilized Recombinant Human TNF-α is presumed to retain the homotrimeric shape.

バインディング・バッファ溶液中に、該２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子を所定の濃度で含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されているRecombinant Human TNF-αと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２ｍｉｎとしている。   An “RNA sample” solution is prepared, which contains the 2′F-modified RNA strand type single-stranded RNA molecule at a predetermined concentration in a binding buffer solution. This “RNA sample” solution is allowed to flow on the sensor chip at a flow rate of 20 μL / min to form a complex of immobilized Recombinant Human TNF-α and single-stranded RNA molecules. In this complex formation process, the liquid temperature is 25 ° C., and the time for circulating the “RNA sample” liquid on the sensor chip is 2 min.

次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、９ｍｉｎ流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。 Next, in the complex dissociation process, a running buffer solution having the following composition containing no RNA molecule is allowed to flow for 9 min at a flow rate of 20 μL / min, and the “RNA sample” solution on the sensor chip is removed. Advance dissociation. In the dissociation process of the complex, the liquid temperature is 25 ° C. The composition of the running buffer solution without RNA molecules is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl + 0.005% Tween20.

液温度２５℃における、該センサ・チップ上に固定化されているRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定する。測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、固定化されたRecombinant Human TNF-αと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋa、複合体の解離の速度定数：ｋdを決定し、解離定数ＫD＝ｋd／ｋaを算出した。 The surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process with the recombinant human TNF-α (homotrimer) immobilized on the sensor chip and the complex dissociation process at a liquid temperature of 25 ° C. Measure changes over time. Based on the measurement results, the immobilized Recombinant Human TNF- was immobilized under the conditions of a liquid temperature of 25 ° C. and a binding buffer solution composition: HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl. α and the rate constant for complex formation with the single-stranded RNA molecule: k a, dissociation rate constants of the complexes: determines k d, were calculated dissociation constant K D = k d / k a .

TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510に由来する２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子について、算出された解離定数ＫDを、表６に示す。 For TNF-485, single-stranded RNA molecules of TNF-505, TNF-508, 2'F modified RNA chain derived from TNF-510, the calculated dissociation constant K D, shown in Table 6.

また、TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510に由来する２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子について、決定された複合体形成の速度定数：ｋa、複合体の解離の速度定数：ｋdを、表７に示す。 Moreover, TNF-485, TNF-505 , TNF-508, the single-stranded RNA molecules of 2'F modified RNA chain derived from TNF-510, determined rate constant of complex formation: k a, complex Table 7 shows rate constants of dissociation: k d .

これらTNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510に由来する２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子も、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130と同様に、Ｍｇ2+カチオン依存的なRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体を形成している。 These TNF-485, TNF-505, TNF-508, single-stranded RNA molecules of 2'F modified RNA chain derived from TNF-510 also single-stranded RNA molecules: Like the TNF-130, Mg 2+ It forms a complex with cation-dependent Recombinant Human TNF-α (homotrimer).

TNF-485、TNF-505、TNF-508、TNF-510に由来する２’Ｆ修飾ＲＮＡ鎖型の一本鎖ＲＮＡ分子とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体の解離の速度定数ｋdは、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体の解離の速度定数ｋdと比較すると、約１０4倍となっている。すなわち、形成された複合体の安定性に、顕著な差異があると判断される。 Dissociation rate of 2'F-modified single-stranded RNA molecules derived from TNF-485, TNF-505, TNF-508, and TNF-510 and Recombinant Human TNF-α (homotrimer) complex constant k d is single-stranded RNA molecule: compared with TNF-130 and Recombinant Human TNF-α rate constant k d dissociation of the complex (homotrimer), which is about 104 times. That is, it is judged that there is a significant difference in the stability of the formed complex.

（第二の形態）
本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、Recombinant Human TNF-α（ホモ三量体）と複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子の一群中から、上記「ＲＮＡアプタマー」TNF-130に特徴的は塩基配列、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」のモチーフと類似する塩基配列を具えるものとして、選別されたものである。 (Second form)
The aptamer having the binding ability to human TNF-α according to the second aspect of the present invention is selected from the group of single-stranded RNA molecules that can form a complex with Recombinant Human TNF-α (homotrimer). The RNA aptamer “TNF-130” is characterized by having a base sequence similar to the motif of “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′”. is there.

具体的には、上記のＳＥＬＥＸ法を適用して、選択されたRecombinant Human TNF-α（ホモ三量体）と複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子の一群中において、上記「ＲＮＡアプタマー」TNF-130において、複合体形成に関与すると推定される構造的特徴と、類似する構造を示す可能性が高い一本鎖ＲＮＡ分子を、前記の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」のモチーフと類似する塩基配列の有無の判定によって、選別したものである。   Specifically, in the group of single-stranded RNA molecules that can form a complex with the selected Recombinant Human TNF-α (homotrimer) by applying the SELEX method, the “RNA aptamer” TNF -130, the structural features presumed to be involved in complex formation and single-stranded RNA molecules that are likely to show a similar structure are represented by the above-mentioned "5'-UUUUCACCGG-3 '" and "5'- It was selected by determining the presence or absence of a base sequence similar to the motif “CUAGACAGG-3 ′”.

（第二の実施態様）
第二の実施態様では、本発明の第二の形態にかかるRecombinant Human TNF-α（ホモ三量体）に対する結合能を有するアプタマーを選別する工程の一例を以下に説明する。 (Second embodiment)
In the second embodiment, an example of a process for selecting an aptamer having binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) according to the second aspect of the present invention will be described below.

上記の第一の実施態様においは、１２回目の選択ラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製している。   In the first embodiment described above, double-stranded cDNA molecules are similarly prepared by applying RT-PCR method using the single-stranded RNA molecules separated and recovered in the 12th selection round as a template. is doing.

この二本鎖ｃＤＮＡ分子の一群中は、先にクローニングした、４３株のクローン以外に、塩基配列が異なる多数種のｃＤＮＡ分子が含まれている。   In this group of double-stranded cDNA molecules, in addition to the 43 clones previously cloned, many kinds of cDNA molecules having different base sequences are included.

本第二の実施態様では、これら塩基配列が異なる多数種のｃＤＮＡ分子に関して、Genome sequencer FLX systemを応用した、高速シークエンス解析を利用して、その塩基配列解析を実施した。解析された３１５３のｃＤＮＡ分子中には、同一の塩基配列を有するｃＤＮＡ分子が複数存在する「ファミリー」が相当数存在していた。   In the second embodiment, the base sequence analysis was performed using high-speed sequence analysis to which the Genome sequencer FLX system was applied for many kinds of cDNA molecules having different base sequences. In the analyzed 3153 cDNA molecules, there were a considerable number of “family” in which a plurality of cDNA molecules having the same base sequence exist.

ＳＥＬＥＸ法を適用する「ＲＮＡアプタマー」の選択工程では、選択ラウンドを重ねる毎に、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子の一群中では、解離定数ＫDの値が小さな一本鎖ＲＮＡ分子の含有比率が上昇する。従って、上記の塩基配列解析がなされた３１５３のｃＤＮＡ分子の一群中に、高い頻度で存在している「クローン・ファミリー」に由来する一本鎖ＲＮＡ分子が示す解離定数ＫDの値は、相対的に小さな値となっている。 Applying the SELEX process in the selection process of the "RNA aptamer", each overlapping selection rounds were separated and recovered, during a group of single-stranded RNA molecules, the value of the dissociation constant K D of small single-stranded RNA molecules The content ratio increases. Thus, in a group of cDNA molecules 3153 which the nucleotide sequence analysis is performed, the value of the dissociation constant, K D, indicated by the single-stranded RNA molecules from "clone family" that exists at a high frequency, the relative The value is small.

実際、第一の実施態様において、１０回目のラウンドが終了した時点において、ＫD≦１０ｐＭの「クローン・ファミリー」として選別されている、クローン：TNF-130と同じ塩基配列を有するｃＤＮＡ分子は、28/3153の頻度で存在していることが確認された。 In fact, in the first embodiment, at the end of the 10th round, a cDNA molecule having the same base sequence as clone: TNF-130, which has been selected as a “clone family” with K D ≦ 10 pM, It was confirmed to exist at a frequency of 28/3153.

図２に示す「ＲＮＡアプタマー」TNF-130の推定二次構造は、その中心部に、ループ様の構造を含むという特徴を示す。そのループ様の構造の構成には、５’末端側の固定領域：5'- GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G -3'の“AG CCU”と“A AGAGG G”の部分が、それぞれＲＮＡ二本鎖を形成する配置を採ることを利用している。換言しますと、TNF-130中のランダム配列部分に存在する、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の部分が、関与している。 The putative secondary structure of “RNA aptamer” TNF-130 shown in FIG. 2 is characterized by including a loop-like structure at the center. In the structure of the loop-like structure, the 5′-terminal fixed region: “AG CCU ” and “ A AGA GG G” of 5′-GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G-3 ′ are each RNA double-stranded. Taking advantage of the arrangement to form. In other words, the “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” portions present in the random sequence portion in TNF-130 are involved.

TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えている「ＲＮＡアプタマー分子」は、その中心部に、ループ様の構造を含む二次構造を示す可能性が高いと推断される。上記の塩基配列解析がなされた３１５３のｃＤＮＡ分子の一群中に、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えている「ＲＮＡアプタマー分子」が、他にも含まれているか、否かを調査した。その結果、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を具え、解析されたｃＤＮＡの群中に、「32／3153」の頻度で含有されている「ｃＤＮＡ」として、下記の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のｃＤＮＡが見出された。この「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のｃＤＮＡを、大腸菌に導入して、クローン化を行った。   The “RNA aptamer molecule” comprising a partial sequence similar to “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” in TNF-130 at the same relative position is It is presumed that there is a high possibility of showing a secondary structure including a loop-like structure in the part. In a group of 3153 cDNA molecules subjected to the above base sequence analysis, a partial sequence having similarity to “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” in TNF-130, It was investigated whether or not other “RNA aptamer molecules” having similar relative positions were included. As a result, it has a partial sequence similar to “5′-TTTTCACCGG-3 ′” and “5′-CTAGACAGG-3 ′” and is contained in the analyzed cDNA group at a frequency of “32/3153”. As the "cDNA", the following "RNA aptamer molecule" TNF-100 cDNA was found. The cDNA of this “RNA aptamer molecule” TNF-100 was introduced into E. coli and cloned.

Clone：TNF-100中に保持されるｃＤＮＡの塩基配列：
5’-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
ATAAGTTCGGATCACCGGCCCAAAGCCTAGACCTAGGGGCTATAAATAC
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3’ （配列番号：２１）
「ＲＮＡアプタマー分子」 TNF-100：
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100について、推定される二次構造を、「ＲＮＡアプタマー」TNF-130の推定二次構造と対比させて、図３に示す。「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100のランダム配列部分に見出された、「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」は、その推定二次構造中において、その中心部の、ループ様の構造の構成に関与している。 Clone: nucleotide sequence of cDNA retained in TNF-100:
5'-GGAAGACCAGCCTTAAGAGGG
ATAAGTTCGGATCACCGGCCCAAAGCCTAGACCTAGGGGCTATAAATAC
CTAGTATCCGGAACGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 21)
"RNA aptamer molecule" TNF-100:
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 9)
The predicted secondary structure of the “RNA aptamer molecule” TNF-100 is shown in FIG. 3 in contrast to the predicted secondary structure of the “RNA aptamer” TNF-130. “5′-UCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGAC-3 ′”, found in the random sequence portion of “RNA aptamer molecule” TNF-100, Is involved in the construction of the loop-like structure.

また、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100は、上記バインディング・バッファ溶液中における解離定数ＫDが、ＫD≦１０ｎＭの条件は満たしていないが、その解離定数ＫDが、ＫD≦２０ｎＭの範囲であった。 Further, the “RNA aptamer molecule” TNF-100 does not satisfy the condition of K D ≦ 10 nM in the dissociation constant K D in the binding buffer solution, but the dissociation constant K D is in the range of K D ≦ 20 nM. Met.

塩基配列解析を行った３１５３のｃＤＮＡの群中に、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と類似性を示す部分配列を、同様な相対位置で具えているものが、TNF-100のｃＤＮＡ以外にも、下記の三種：TNF-673,TNF-674,TNF-675が見出された。この三種のｃＤＮＡも、大腸菌に導入して、クローン化を行った。表８に、三種のクローン：TNF-673,TNF-674,TNF-675と、クローン：TNF-100、ならびに、クローン：TNF-130に関して、一本鎖ＲＮＡ分子をコードする塩基配列を対比して示す。表８に、各クローンについて、３１５３のｃＤＮＡの群中における存在頻度（重複度）も記載している。   In the group of 3153 cDNAs subjected to base sequence analysis, partial sequences showing similarity to “5′-TTTTCACCGG-3 ′” and “5′-CTAGACAGG-3 ′” are provided at similar relative positions. In addition to TNF-100 cDNA, the following three types were found: TNF-673, TNF-674, and TNF-675. These three kinds of cDNAs were also introduced into E. coli and cloned. Table 8 compares the base sequences encoding single-stranded RNA molecules for three clones: TNF-673, TNF-674, TNF-675, clone: TNF-100, and clone: TNF-130. Show. Table 8 also describes the frequency of presence (redundancy) in the group of 3153 cDNAs for each clone.

クローン：TNF-673のランダム配列部分に見出された、「５’−TCTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」は、クローン：TNF-130中の「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と、その相対的な位置も高い類似性を有している。また、クローン：TNF-675のランダム配列部分に見出された、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」は、クローン：TNF-130中の「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と、その相対的な位置も高い類似性を有している。 Clone: “5′-TCTTCACCGG-3 ′” and “5′-CTAGACAGG-3 ′” found in the random sequence part of TNF-673 are “5′-TTTTCACCGG-3” in clone: TNF-130. “” And “5′-CTAGACAGG-3 ′” and their relative positions are also highly similar. In addition, “5′-TTTTCACCGG-3 ′” and “5′-CTAGACAGG-3 ′” found in the random sequence portion of clone: TNF-675 are “5′-TTTTCACCGG” in clone: TNF-130. -3 ′ ”and“ 5′-CTAGACAGG-3 ′ ”and their relative positions are also highly similar.

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100に関して、そのRecombinant Human TNF-αに対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した。   A single-stranded RNA molecule: TNF-100 was evaluated for its ability to bind to Recombinant Human TNF-α using a surface plasmon resonance measuring apparatus.

表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE 3000を利用し、そのセンサ・チップＳＡ上に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100を、約２，０００ＲＵ固定化する。実際には、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100の３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)24を作製する。該TNF-100+(A)24のPolyA鎖を利用して、センサ・チップＳＡ上に固定化されているStreptavidinタンパク質と結合している、ｂｉｏｔｉｎ修飾したPolydU鎖とハイブリダイズさせることで、固定化する。 Using a surface plasmon resonance measuring apparatus: BIACORE 3000, a single-stranded RNA molecule: TNF-100 is immobilized on the sensor chip SA at about 2,000 RU. In practice, a 3'-end PolyA chain-added RNA molecule: TNF-100 + (A) 24 is prepared by adding a PolyA chain to the 3 'end of a single-stranded RNA molecule: TNF-100. Immobilization by using the PolyA chain of TNF-100 + (A) 24 and hybridizing with the biotin-modified PolydU chain that is bound to the Streptavidin protein immobilized on the sensor chip SA. To do.

バインディング・バッファ溶液中にRecombinant Human TNF-αを、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭの２倍希釈系列で含有している、３種類の「ターゲット・タンパク質」溶液を調製する。センサ・チップ上に、この「ターゲット・タンパク質」溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されている一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)24とRecombinant Human TNF-αの複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ターゲット・タンパク質」溶液を流通させる時間は、２ｍｉｎとしている。 Three types of “target protein” solutions containing Recombinant Human TNF-α in a binding buffer solution in a 2-fold dilution series of 250 nM, 125 nM, and 62.5 nM are prepared. This “target protein” solution is flowed on the sensor chip at a flow rate of 20 μL / min, and the immobilized single-stranded RNA molecule: TNF-100 + (A) 24 and Recombinant Human TNF-α complex To form. In this complex formation process, the liquid temperature is 25 ° C., and the time for circulating the “target protein” solution on the sensor chip is 2 min.

次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、Recombinant Human TNF-αを含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、３ｍｉｎ流し、センサ・チップ上の「ターゲット・タンパク質」溶液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。Recombinant Human TNF-αを含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。 Next, in the complex dissociation process, a running buffer solution containing the following composition, which does not contain Recombinant Human TNF-α, is allowed to flow for 3 min at a flow rate of 20 μL / min to remove the “target protein” solution on the sensor chip. And dissociate the complex. In the dissociation process of the complex, the liquid temperature is 25 ° C. The composition of the running buffer solution without Recombinant Human TNF-α is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl + 0.005% Tween20.

センサ・チップ上に固定化されている、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)24について、Recombinant Human TNF-αとの複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定する。液温度２５℃における、該一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100+(A)24に対する測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、固定化された該一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成の速度定数：ｋa、複合体の解離の速度定数：ｋd、ならびに、解離定数ＫD＝ｋd／ｋaを算出した。 Surface plasmon in complex formation process and complex dissociation process with Recombinant Human TNF-α for single-stranded RNA molecule: TNF-100 + (A) 24 immobilized on sensor chip The temporal change in resonance signal intensity is measured. Based on the measurement results for the single-stranded RNA molecule: TNF-100 + (A) 24 at a liquid temperature of 25 ° C., the liquid temperature is 25 ° C., and the composition of the binding buffer solution is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl. ) + 5 in conditions mM MgCl 2 + 5 mM KCl, and immobilized the single-stranded RNA molecule, Recombinant Human TNF-α (rate constant for complexation with homotrimer): k a, complex body dissociation rate constant: k d, and was calculated dissociation constants K D = k d / k a .

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100に加えて、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-674、TNF-675、ならびに、TNF-130に関しても、同様にセンサ・チップＳＡ上に固定化した上で、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定する。液温度２５℃における、当該一本鎖ＲＮＡ分子に対する測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、固定化された当該一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成の速度定数：ｋa、複合体の解離の速度定数：ｋd、ならびに、解離定数ＫD＝ｋd／ｋaを算出した。 In addition to single-stranded RNA molecules: TNF-100, single-stranded RNA molecules: TNF-674, TNF-675, and TNF-130 are similarly immobilized on the sensor chip SA, The time-dependent change of the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process with human TNF-α (homotrimer) and the complex dissociation process is measured. Based on the measurement results for the single-stranded RNA molecule at a liquid temperature of 25 ° C., the liquid temperature is 25 ° C., and the composition of the binding buffer solution is: HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM in conditions of KCl, and immobilized the single-stranded RNA molecule, Recombinant Human TNF-α the rate constant for complexation with (homotrimer): k a, dissociation rate constants of the complexes: k d as well as to calculate the dissociation constant K D = k d / k a .

表９に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100、TNF-674、TNF-675、ならびに、TNF-130について、上記の条件における測定結果に基づき、算出した解離定数ＫD＝ｋd／ｋaの値を示す。 Table 9, single-stranded RNA molecules: TNF-100, TNF-674 , TNF-675, as well as for TNF-130, on the basis of the measurement results of the above conditions, the calculated dissociation constant K D = k d / k a Indicates the value of.

また、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100、TNF-674、TNF-675、ならびに、TNF-130について、上記の条件における測定結果に基づき、決定された複合体形成の速度定数：ｋa、複合体の解離の速度定数：ｋdを、表１０に示す。 Furthermore, single-stranded RNA molecules: TNF-100, TNF-674 , TNF-675, as well as for TNF-130, on the basis of the measurement results of the above conditions, determined the rate constant for complex formation: k a, complex Table 10 shows the rate constant of dissociation of the body: k d .

これら一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100、TNF-674、TNF-675も、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130と同様に、Ｍｇ2+カチオン依存的なRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体を形成している。 These single-stranded RNA molecules: TNF-100, TNF-674, and TNF-675 are also similar to the single-stranded RNA molecule: TNF-130, in the form of Mg 2+ cation-dependent Recombinant Human TNF-α (homotrimer). ).

一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100、TNF-674、TNF-675とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体の解離の速度定数ｋdは、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体の解離の速度定数ｋdと比較すると、１０2倍以上となっている。すなわち、形成された複合体の安定性に、顕著な差異があると判断される。 Single-stranded RNA molecule: TNF-100, TNF-674, TNF-675 and Recombinant Human TNF-α (homotrimer) complex dissociation rate constant k d , single-stranded RNA molecule: TNF-130 And the rate constant k d of dissociation of the complex of Recombinant Human TNF-α (homotrimer) is 10 2 times or more. That is, it is judged that there is a significant difference in the stability of the formed complex.

（第三の形態）
本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、上記の一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130、TNF-100の推定二次構造における、特徴的な構造を保持しつつ、小型化を図るため、第一の形態、第二の形態にかかる「ＲＮＡアプタマー」に基づき、設計された小型化「ＲＮＡアプタマー」である。 (Third form)
The aptamer having binding ability to human TNF-α according to the third aspect of the present invention retains the characteristic structure in the putative secondary structure of the above single-stranded RNA molecules: TNF-130 and TNF-100. On the other hand, a miniaturized “RNA aptamer” designed based on the “RNA aptamer” according to the first form and the second form for miniaturization.

具体的には、第一の形態、第二の形態にかかる「ＲＮＡアプタマー」の塩基配列と、推定される二次構造を参照し、上記の一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130、TNF-100の推定二次構造における、特徴的な構造を構成する上で必須でない部分塩基配列を除去し、小型化を図ったものである。前記の設計指針に基づき、例えば、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100を基礎として設計された、小型化「ＲＮＡアプタマー」TNF-m0113は、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100の示す二次構造を保持することで、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能も保持したものとなっている。   Specifically, referring to the base sequence of the “RNA aptamer” according to the first form and the second form and the presumed secondary structure, the above single-stranded RNA molecules: TNF-130, TNF-100 In the presumed secondary structure, a partial base sequence that is not essential for constituting a characteristic structure is removed to achieve miniaturization. Based on the above design guidelines, for example, the miniaturized “RNA aptamer” TNF-m0113 designed based on the single-stranded RNA molecule: TNF-100 is a secondary structure shown by the single-stranded RNA molecule: TNF-100. By holding this, the binding ability to human TNF-α is also retained.

（第三の実施態様）
第三の実施態様では、本発明の第三の形態にかかるRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有するアプタマーを作製する工程を以下に説明する。 (Third embodiment)
In the third embodiment, a process for producing an aptamer having binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) according to the third aspect of the present invention will be described below.

図３に示す、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-130とTNF-100の推定される二次構造において、共通して見出される、中心部に形成される、ループ様の構造が、実際に、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成に関与することの検証を行った。すなわち、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100に基づき、その中心部に形成される、ループ様の構造の構成が可能な部分塩基配列からなる、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013を設計し、該TNF-m013のRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を測定した。図４に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013の推定される二次構造を、TNF-100の推定される二次構造と対比して示す。   In the putative secondary structure of single-stranded RNA molecule: TNF-130 and TNF-100 shown in FIG. 3, a loop-like structure formed in the center, which is found in common, is actually a Recombinant It was verified that it was involved in complex formation with human TNF-α (homotrimer). That is, based on the single-stranded RNA molecule: TNF-100, a single-stranded RNA molecule: TNF-m013 consisting of a partial base sequence that can be formed into a loop-like structure formed at the center thereof is designed. The binding ability of the TNF-m013 to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) was measured. FIG. 4 shows the predicted secondary structure of the single-stranded RNA molecule: TNF-m013 in comparison with the predicted secondary structure of TNF-100.

実際には、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013の３’末端にPolyA鎖を付加してなる、３’末端PolyA鎖付加型ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)24を作製した。作製されたTNF-m013+(A)24のPolyA鎖を利用して、センサ・チップＳＡ上に固定化されているStreptavidinタンパク質と結合している、ｂｉｏｔｉｎ修飾したPolydU鎖とハイブリダイズさせることで、固定化する。 Actually, a 3'-end polyA chain-added RNA molecule: TNF-m013 + (A) 24 was prepared by adding a PolyA chain to the 3 'end of a single-stranded RNA molecule: TNF-m013. Using the prepared PolyA chain of TNF-m013 + (A) 24 , it is immobilized by hybridizing with a biotin-modified PolydU chain that is bound to the Streptavidin protein immobilized on the sensor chip SA. Turn into.

表１１に、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013とTNF-m013+(A)24、ならびに、TNF-100とTNF-100+(A)24の塩基配列を対比して示す。 Table 11 shows a comparison of the base sequences of single-stranded RNA molecules: TNF-m013 and TNF-m013 + (A) 24 , and TNF-100 and TNF-100 + (A) 24 .

バインディング・バッファ溶液中にRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）を、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭの２倍希釈系列で含有している、３種類の「ターゲット・タンパク質」溶液を調製する。センサ・チップ上に、この「ターゲット・タンパク質」溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで流し、固定化されている一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)24とRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ターゲット・タンパク質」溶液を流通させる時間は、２ｍｉｎとしている。 Three types of “target protein” solutions containing Recombinant Human TNF-α (homotrimer) in a binding buffer solution in a 2-fold dilution series of 250 nM, 125 nM, and 62.5 nM are prepared. This “target protein” solution is flowed onto the sensor chip at a flow rate of 20 μL / min, and the immobilized single-stranded RNA molecules: TNF-m013 + (A) 24 and Recombinant Human TNF-α (homo trimeric) Body). In this complex formation process, the liquid temperature is 25 ° C., and the time for circulating the “target protein” solution on the sensor chip is 2 min.

次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、Recombinant Human TNF-αを含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/ｍｉｎで、３ｍｉｎ流し、センサ・チップ上の「ターゲット・タンパク質」溶液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。Recombinant Human TNF-αを含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KCl + 0.005% Tween20である。 Next, in the complex dissociation process, a running buffer solution containing the following composition, which does not contain Recombinant Human TNF-α, is allowed to flow for 3 min at a flow rate of 20 μL / min to remove the “target protein” solution on the sensor chip. And dissociate the complex. In the dissociation process of the complex, the liquid temperature is 25 ° C. The composition of the running buffer solution without Recombinant Human TNF-α is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl + 0.005% Tween20.

センサ・チップ上に固定化されている、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)24について、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定する。液温度２５℃における、該一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)24に対する測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 5 mM MgCl2 + 5 mM KClの条件において、固定化された該一本鎖ＲＮＡ分子と、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成の速度定数：ｋa、複合体の解離の速度定数：ｋd、ならびに、解離定数ＫD＝ｋd／ｋaを算出した。 Complex formation process of single-stranded RNA molecule: TNF-m013 + (A) 24 immobilized on sensor chip with Recombinant Human TNF-α (homotrimer) and dissociation of the complex The time change of the surface plasmon resonance signal intensity in the process is measured. Based on the measurement results for the single-stranded RNA molecule: TNF-m013 + (A) 24 at a liquid temperature of 25 ° C., the liquid temperature is 25 ° C., and the composition of the binding buffer solution is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl). + in 5 mM condition MgCl 2 + 5 mM KCl, and immobilized the single-stranded RNA molecule, Recombinant Human TNF-α the rate constant for complexation with (homotrimer): k a, complex dissociation rate constant: k d, and was calculated dissociation constants K D = k d / k a .

図５に、センサ・チップ上に固定化されている、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)24について、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成過程、ならびに、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した結果を示す。 FIG. 5 shows a process of forming a complex with Recombinant Human TNF-α (homotrimer) for single-stranded RNA molecule: TNF-m013 + (A) 24 immobilized on the sensor chip, and The result of having measured the time change of the surface plasmon resonance signal intensity in the dissociation process of a complex is shown.

表１２に、固定化された一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)24ならびに、TNF-100+(A)24について、上記の条件における測定結果に基づき、決定された複合体形成の速度定数：ｋa、複合体の解離の速度定数：ｋd、ならびに、算出した解離定数ＫD＝ｋd／ｋaの値を対比して示す。 Table 12 shows the rate of complex formation determined for the immobilized single-stranded RNA molecules: TNF-m013 + (A) 24 and TNF-100 + (A) 24 based on the measurement results under the above conditions. constants: k a, dissociation rate constants of the complexes: k d, and shows by comparing the calculated value of the dissociation constant K D = k d / k a .

その結果、固定化された一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013+(A)24と、TNF-100+(A)24で測定された、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成・解離過程における、結合速度定数ｋa、解離速度定数ｋd、平衡解離定数ＫD＝ｋd/ｋaは、ほぼ等しい値であることが確認される。従って、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013と、TNF-100は、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成に関与する立体構造は、本質的に同じであると判断される。すなわち、TNF-m013と、TNF-100は、図４に示す推定二次構造、特には、その中心部に形成される、ループ様の構造を形成することで、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成を可能としていると、判断される。また、図２に示す推定二次構造を考慮すると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100においては、共通して見出される、中心部に形成される、ループ様の構造を構成することで、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体形成を可能としていると、推断された。 As a result, a complex of immobilized single-stranded RNA molecule: TNF-m013 + (A) 24 and Recombinant Human TNF-α (homotrimer) measured with TNF-100 + (A) 24 in the formation and dissociation processes, association rate constant k a, dissociation rate constants k d, the equilibrium dissociation constant K D = k d / k a is confirmed to be approximately equal. Therefore, it is judged that the three-dimensional structure involved in the complex formation of single-stranded RNA molecule: TNF-m013 and TNF-100 with Recombinant Human TNF-α (homotrimer) is essentially the same. The That is, TNF-m013 and TNF-100 form a putative secondary structure shown in FIG. 4, in particular, a loop-like structure formed at the center thereof, so that Recombinant Human TNF-α (homo-3 It is determined that the complex formation with the polymer is possible. In addition, considering the presumed secondary structure shown in FIG. 2, “RNA aptamer molecule” TNF-130 and TNF-100 should form a loop-like structure formed in the central part, which is commonly found. Thus, it was presumed that complex formation with Recombinant Human TNF-α (homotrimer) is possible.

勿論、第三の形態にかかるRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有するアプタマーの一例である、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-m013は、その設計の基となっている、一本鎖ＲＮＡ分子：TNF-100と全く同じ形態で、Recombinant Human TNF-α（ホモ３量体）との複合体を形成していることが判る。   Of course, the single-stranded RNA molecule: TNF-m013, which is an example of an aptamer having binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) according to the third form, is the basis of its design. It can be seen that single-stranded RNA molecule: in exactly the same form as TNF-100, forms a complex with Recombinant Human TNF-α (homotrimer).

本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用する方法に関して、より詳細に説明する。   The method using the “RNA aptamer molecule” having the binding ability to human TNF-α according to the present invention will be described in more detail.

上記の本発明の第一の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第二の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマー、本発明の第三の形態にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーは、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出に利用することが可能である。   The aptamer having the binding ability to human TNF-α according to the first aspect of the present invention, the aptamer having the binding ability to human TNF-α according to the second aspect of the present invention, and the third form of the present invention. Such aptamers having binding ability to human TNF-α can be used for detection of human TNF-α (homotrimer).

例えば、血液中に含まれる目標タンパク質の検出を行う場合、血液中に含まれる種々の可溶性タンパク質や、脂質分子の影響を排除する必要がある。例えば、目標タンパク質に対する特異的なモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡ法による検出方法では、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法が利用される。すなわち、固相表面に捕獲用モノクローナル抗体を固定化し、目標タンパク質に対する該捕獲用モノクローナル抗体の特異的反応性を利用して、固定化された捕獲用モノクローナル抗体に目標タンパク質を選択的に結合させる。その後、捕獲用モノクローナル抗体に結合されている、目標タンパク質に検出用モノクローナル抗体を反応させる。この目標タンパク質に結合している検出用モノクローナル抗体を検出することで、間接的に目標タンパク質を検出している。   For example, when detecting a target protein contained in blood, it is necessary to eliminate the influence of various soluble proteins and lipid molecules contained in blood. For example, the detection method by ELISA using a specific monoclonal antibody against the target protein utilizes the Sandswitch ELISA. That is, the capture monoclonal antibody is immobilized on the solid surface, and the target protein is selectively bound to the immobilized capture monoclonal antibody using the specific reactivity of the capture monoclonal antibody to the target protein. Thereafter, the target monoclonal antibody bound to the capture monoclonal antibody is reacted with the detection monoclonal antibody. The target protein is indirectly detected by detecting the detection monoclonal antibody bound to the target protein.

このＳａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法をヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出に適用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用モノクローナル抗体と、検出用モノクローナル抗体を利用する。   When this Sandswitch ELISA method is applied to the detection of human TNF-α (homotrimer), a capture monoclonal antibody having reactivity specific to human TNF-α (homotrimer), and a detection monoclonal antibody Use antibodies.

前記のＳａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法を適用するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出に利用される、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用モノクローナル抗体と、検出用モノクローナル抗体の一方に代えて、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出を行うことが可能である。   A capture monoclonal antibody having reactivity specific to human TNF-α (homotrimer), which is used for detection of human TNF-α (homotrimer) to which the Sandwich ELISA method is applied; Human TNF-α (homotrimer) similar to the Sandswitch ELISA method can be obtained by using the “RNA aptamer molecule” having the binding ability to human TNF-α according to the present invention instead of one of the detection monoclonal antibodies. Can be detected.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第一の態様は、前記検出用モノクローナル抗体に代えて、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出用の検出用キットを構成する形態に相当している。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用モノクローナル抗体と、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用している、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製する方法に相当している。   In the first aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention, the detection monoclonal antibody is used instead. The detection kit for detecting human TNF-α (homotrimer) similar to the Sandswitch ELISA method is constructed by using the “RNA aptamer molecule” capable of binding to human TNF-α according to the present invention. It corresponds to the form to do. That is, as a capture monoclonal antibody having reactivity specific to human TNF-α (homotrimer) and a “RNA aptamer molecule” for detection, it has the binding ability to human TNF-α according to the present invention. This corresponds to a method for preparing a kit for detecting human TNF-α using an “RNA aptamer molecule”.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第一の態様では、
作製する該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、捕獲用モノクローナル抗体と利用する、ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを組み合わせている。 In the first aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention,
The kit for detecting human TNF-α to be produced comprises a monoclonal antibody having a specific reactivity with human TNF-α and an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α, which is used as a capture monoclonal antibody. Are combined.

対応する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第一の態様は、
捕獲用モノクローナル抗体として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、検出用「ＲＮＡアプタマー」として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを組み合わせて、検出用キットを構成している。 The corresponding first aspect of the “kit for detecting human TNF-α produced by using an aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention,
A combination of a monoclonal antibody having reactivity specific to human TNF-α used as a monoclonal antibody for capture and an RNA aptamer having binding ability to human TNF-α used as a “RNA aptamer” for detection Constitutes a detection kit.

該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを利用して、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出する際、
前記モノクローナル抗体を利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを結合させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに結合した、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを検出する方式を採用する。 When detecting human TNF-α (homotrimer) using the human TNF-α detection kit,
Immobilizing human TNF-α using the monoclonal antibody,
An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α is bound to the immobilized human TNF-α;
A method of detecting an RNA aptamer that binds to the immobilized human TNF-α and has a binding ability to human TNF-α is adopted.

検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
(I-2) TNF-485
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：７）
(II-3) TNF-675
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
(II-4) TNF-100
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する。 As an “RNA aptamer molecule” for detection,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013
5'-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3 '(SEQ ID NO: 10)
An aptamer selected from the group consisting of:

なお、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、その検出に利用可能な標識を付した形態とすることが好ましい。例えば、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。   The RNA aptamer having the ability to bind to human TNF-α used as a “RNA aptamer molecule” for detection is preferably in a form with a label that can be used for its detection. For example, a form in which a label is attached to the end of a single-stranded nucleic acid constituting the RNA aptamer can be selected.

検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と該ＲＮＡアプタマーで形成される複合体の解離定数ＫDは、少なくとも、ＫD≦１００ｎＭ、通常、ＫD≦１０ｎＭの範囲であることが好ましい。特には、ＫD≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが、より好ましい。 When used as a “RNA aptamer molecule” for detection, the dissociation constant K D of a complex formed with human TNF-α (homotrimer) and the RNA aptamer is at least K D ≦ 100 nM, usually K D ≦ 10 nM is preferable. In particular, it is more preferable to use an “RNA aptamer molecule” estimated to have K D ≦ 10 pM.

実際の検出操作では、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を結合させた後、結合していない検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を洗浄により、除去する。また、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に結合している検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を検出する際には、通常、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を含まない液中に浸された状態とされる。この洗浄工程、あるいは、検出工程中、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離が進行する。このヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離は、該複合体の解離の速度定数：ｋdにより支配される。従って、複合体の解離の速度定数：ｋdが、ｋd≧１０-3 ｓ-1である場合、洗浄工程と検出工程に要する時間が１０００秒間に達すると、形成された複合体の（１−1/e）は、その間に解離することになる。 In the actual detection operation, the detection “RNA aptamer molecule” is bound to human TNF-α (homotrimer), and then the unbound detection “RNA aptamer molecule” is removed by washing. In addition, when detecting a “RNA aptamer molecule for detection” bound to human TNF-α (homotrimer), it is usually immersed in a liquid not containing the “RNA aptamer molecule” for detection. It is said. During this washing step or detection step, the dissociation of the complex of human TNF-α (homotrimer) and the “RNA aptamer molecule for detection” proceeds. The dissociation of the complex of human TNF-α (homotrimer) and “RNA aptamer molecule for detection” is governed by the dissociation rate constant of the complex: k d . Therefore, when the rate constant of dissociation of the complex: k d is k d ≧ 10 −3 s −1 , when the time required for the washing step and the detection step reaches 1000 seconds, (1 -1 / e) will dissociate during that time.

洗浄工程と検出工程の要する時間に進行する、複合体の解離を無視できる水準（例えば、1/10以下）に留めるためには、複合体の解離の速度定数：ｋdが、通常、ｋd≦２×１０-4 ｓ-1の範囲、より好ましくは、ｋd≦１０-4 ｓ-1の範囲である、「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが望ましい。 In order to keep the dissociation of the complex proceeding in the time required for the washing process and the detection process at a negligible level (for example, 1/10 or less), the dissociation rate constant of the complex: k d is usually k d It is desirable to use an “RNA aptamer molecule” in the range of ≦ 2 × 10 −4 s −1 , more preferably in the range of k d ≦ 10 −4 s −1 .

すなわち、複合体の解離定数ＫDは、ＫD≦１０ｎＭの範囲であり、複合体の解離の速度定数：ｋdは、ｋd≦１０-4 ｓ-1の範囲であるという二つの条件を満足する、「ＲＮＡアプタマー分子」を、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用することが、好ましい。 That is, the dissociation constant K D of the complex is in the range of K D ≦ 10 nM, and the rate constant of dissociation of the complex: k d is in the range of k d ≦ 10 −4 s −1. It is preferable to use a satisfactory “RNA aptamer molecule” as a “RNA aptamer molecule” for detection.

勿論、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用モノクローナル抗体と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と、選択的に結合する必要がある。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用モノクローナル抗体との結合によって、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対する結合能が阻害を受けないことが必要である。加えて、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用モノクローナル抗体に対して、結合能を示さないことも必要である。   Of course, the “RNA aptamer molecule” for detection needs to selectively bind to human TNF-α (homotrimer) bound to the monoclonal antibody for capture. That is, it is necessary that the binding ability to human TNF-α (homotrimer) is not inhibited by the binding between human TNF-α (homotrimer) and the monoclonal antibody for capture. In addition, it is necessary that the “RNA aptamer molecule” for detection does not exhibit binding ability to the monoclonal antibody for capture.

また、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用モノクローナル抗体と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対して、定量的に結合する必要がある。すなわち、捕獲用モノクローナル抗体と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに結合する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の分子数の比率は、一定であることが望ましい。具体的には、捕獲用モノクローナル抗体と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」が一分子結合する比率であることが望ましい。   Further, the “RNA aptamer molecule” for detection needs to be quantitatively bound to human TNF-α (homotrimer) bound to the capture monoclonal antibody. That is, it is desirable that the ratio of the number of “RNA aptamer molecules for detection” that bind to human TNF-α (homotrimer) bound to the capture monoclonal antibody is constant. Specifically, the ratio is preferably such that one molecule of “RNA aptamer molecule for detection” binds to each human TNF-α (homotrimer) bound to the monoclonal antibody for capture.

その他、固体表面に捕獲用モノクローナル抗体を固定化する際に利用される、抗体の定常領域に結合性を有するタンパク質、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇなどに対して、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、高い結合能を有するものでないことも必要である。   In addition, for detection of proteins having a binding property to a constant region of an antibody, such as Protein A, Protein A / G, or Protein G, which is used when a capture monoclonal antibody is immobilized on a solid surface. It is also necessary that the “RNA aptamer molecule” does not have a high binding ability.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第二の態様は、上記の捕獲用モノクローナル抗体に代えて、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出用の検出用キットを構成する形態に相当している。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、検出用モノクローナル抗体と、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用している、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製する方法に相当している。   The second aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention is replaced with the above-described capture monoclonal antibody. By using the “RNA aptamer molecule” capable of binding to human TNF-α according to the present invention, a detection kit for detecting human TNF-α (homotrimer) similar to the Sandswitch ELISA method is obtained. This corresponds to the configuration. That is, the detection monoclonal antibody having reactivity specific to human TNF-α (homotrimer) and the capture “RNA aptamer molecule” have the binding ability to human TNF-α according to the present invention. This corresponds to a method for preparing a kit for detecting human TNF-α using an “RNA aptamer molecule”.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第二の態様では、
作製する該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、検出用モノクローナル抗体として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを組み合わせている。 In the second aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention,
The human TNF-α detection kit to be prepared is a monoclonal antibody having specific reactivity to human TNF-α and an RNA aptamer having binding ability to human TNF-α, which are used as a monoclonal antibody for detection. Are combined.

対応する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第二の態様は、
検出用モノクローナル抗体として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対して特異的な反応性を有するモノクローナル抗体と、捕獲用「ＲＮＡアプタマー」として利用する、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを組み合わせて、検出用キットを構成している。 The corresponding second aspect of the “kit for detecting human TNF-α produced by using an aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention,
A combination of a monoclonal antibody having reactivity specific to human TNF-α used as a monoclonal antibody for detection and an RNA aptamer having binding ability to human TNF-α used as a capture “RNA aptamer” Constitutes a detection kit.

該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを利用して、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を検出する際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、前記モノクローナル抗体を反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと反応し、抗原抗体複合体を形成した、前記モノクローナル抗体を検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う方式を採用する。 When detecting human TNF-α (homotrimer) using the human TNF-α detection kit,
Using the RNA aptamer capable of binding to human TNF-α, human TNF-α is immobilized,
Reacting the monoclonal antibody with immobilized human TNF-α,
A method is employed in which human TNF-α is detected by detecting the monoclonal antibody that has reacted with the immobilized human TNF-α to form an antigen-antibody complex.

捕獲用「ＲＮＡアプタマー」として、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する。 As "RNA aptamer" for capture,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130 (SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485 (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F) (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F) (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F) (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F) (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674 (SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675 (SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100 (SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013 (SEQ ID NO: 10)
An aptamer selected from the group consisting of:

その際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー」を固体表面に固定化するため、例えば、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。すなわち、固体表面に、予め、PolydU鎖を固定化しておき、一本鎖核酸の3’−末端に連結されているPolyA鎖とハイブリダイズさせ、形成される核酸二本鎖によって、ＲＮＡアプタマーの固定化を行うことができる。付加されるPolyA鎖の塩基長は、２０塩基以上、３０塩基以下の範囲に選択することが望ましい。 At that time, in order to immobilize the capture "RNA aptamer" on the solid surface, for example, the RNA aptamer having the binding ability to the human TNF-α,
A 3'-terminal PolyA chain-added RNA aptamer, which is used to immobilize the aptamer molecule on a carrier, and is formed by linking a PolyA chain to the 3'-end of a single-stranded nucleic acid constituting the RNA aptamer. It is preferable to select a certain form. That is, a PolydU chain is immobilized on a solid surface in advance, hybridized with a PolyA chain linked to the 3′-end of a single-stranded nucleic acid, and RNA aptamer immobilized by the nucleic acid duplex formed. Can be made. The base length of the added PolyA chain is preferably selected in the range of 20 to 30 bases.

捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と該ＲＮＡアプタマーで形成される複合体の解離定数ＫDは、少なくとも、ＫD≦１００ｎＭ、通常、ＫD≦１０ｎＭの範囲であることが好ましい。特には、ＫD≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが、より好ましい。 When used as a “RNA aptamer molecule” for capture, the dissociation constant K D of the complex formed by human TNF-α (homotrimer) and the RNA aptamer is at least K D ≦ 100 nM, usually K D ≦ 10 nM is preferable. In particular, it is more preferable to use an “RNA aptamer molecule” estimated to have K D ≦ 10 pM.

実際の検出操作では、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」を結合させた後、結合していないヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を洗浄により、除去する。次いで、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合させた、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に、検出用モノクローナル抗体を反応させる。さらに、結合していない検出用モノクローナル抗体を洗浄により、除去する。   In the actual detection operation, human TNF-α (homotrimer) is bound to a capture “RNA aptamer molecule” and then unbound human TNF-α (homotrimer) is removed by washing. . Next, a detection monoclonal antibody is reacted with human TNF-α (homotrimer) bound to a capture “RNA aptamer molecule”. Further, unbound detection monoclonal antibody is removed by washing.

また、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に結合している検出用「モノクローナル抗体」を検出する工程でも、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を含まない液中に浸された状態とされる。   Further, even in the step of detecting the “monoclonal antibody” for detection that is bound to human TNF-α (homotrimer), it is immersed in a liquid not containing human TNF-α (homotrimer). Is done.

捕獲操作後の洗浄工程、あるいは、検出工程中、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離が進行する。このヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離は、該複合体の解離の速度定数：ｋdにより支配される。従って、複合体の解離の速度定数：ｋdが、ｋd≧１０-3 ｓ-1である場合、捕獲操作後の洗浄工程と検出工程に要する時間が１０００秒間に達すると、形成された複合体の（１−1/e）は、その間に解離することになる。 Dissociation of the complex of human TNF-α (homotrimer) and capture “RNA aptamer molecule” proceeds during the washing step after the capture operation or the detection step. The dissociation of the complex of human TNF-α (homotrimer) and the capture “RNA aptamer molecule” is governed by the dissociation rate constant of the complex: k d . Therefore, when the complex dissociation rate constant k d is k d ≧ 10 −3 s −1 , the complex formed when the time required for the washing step and the detection step after the capture operation reaches 1000 seconds. The (1-1 / e) of the body will dissociate during that time.

捕獲操作後の洗浄工程と検出工程の要する時間に進行する、複合体の解離を無視できる水準（例えば、1/10以下）に留めるためには、複合体の解離の速度定数：ｋdが、通常、ｋd≦２×１０-4 ｓ-1の範囲、より好ましくは、ｋd≦１０-4 ｓ-1の範囲である、「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが望ましい。 In order to keep the dissociation of the complex proceeding in the time required for the washing process and the detection process after the capture operation to a level that can be ignored (for example, 1/10 or less), the dissociation rate constant of the complex: k d is Usually, it is desirable to use an “RNA aptamer molecule” that has a range of k d ≦ 2 × 10 −4 s −1 , more preferably a range of k d ≦ 10 −4 s −1 .

すなわち、複合体の解離定数ＫDは、ＫD≦１０ｎＭの範囲であり、複合体の解離の速度定数：ｋdは、ｋd≦１０-4 ｓ-1の範囲であるという二つの条件を満足する、「ＲＮＡアプタマー分子」を、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用することが、好ましい。 That is, the dissociation constant K D of the complex is in the range of K D ≦ 10 nM, and the rate constant of dissociation of the complex: k d is in the range of k d ≦ 10 −4 s −1. It is preferable to use a satisfactory “RNA aptamer molecule” as a capture “RNA aptamer molecule”.

勿論、検出用モノクローナル抗体は、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と、選択的に結合する必要がある。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」との結合によって、検出用「モノクローナル抗体」のヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対する結合能が阻害を受けないことが必要である。加えて、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」は、検出用モノクローナル抗体に対して、高い結合能を有するものでないことも必要である。   Of course, the detection monoclonal antibody needs to selectively bind to human TNF-α (homotrimer) bound to the capture “RNA aptamer molecule”. That is, the binding of human TNF-α (homotrimer) and capture “RNA aptamer molecule” does not inhibit the binding ability of detection “monoclonal antibody” to human TNF-α (homotrimer). It is necessary. In addition, it is necessary that the capture “RNA aptamer molecule” does not have a high binding ability to the detection monoclonal antibody.

また、検出用「モノクローナル抗体」は、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対して、定量的に結合する必要がある。すなわち、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに結合する、検出用「モノクローナル抗体」の分子数の比率は、一定であることが望ましい。具体的には、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに、検出用「モノクローナル抗体」が一分子結合する比率であることが望ましい。   In addition, the “monoclonal antibody” for detection needs to bind quantitatively to human TNF-α (homotrimer) bound to the “RNA aptamer molecule” for capture. That is, it is desirable that the ratio of the number of molecules of the detection “monoclonal antibody” to be bound per human TNF-α (homotrimer) bound to the capture “RNA aptamer molecule” is constant. Specifically, the ratio is preferably such that one molecule of detection “monoclonal antibody” binds to each human TNF-α (homotrimer) bound to the capture “RNA aptamer molecule”.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第三の態様は、上記の捕獲用モノクローナル抗体と検出用モノクローナル抗体に代えて、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出用の検出用キットを構成する際、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用する形態に相当している。すなわち、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用し、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と組み合わせることで、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製する方法に相当している。その際、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」とは異なる、ヒトＴＮＦ−αに対する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することができる。   The third aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention is the detection of the above-described monoclonal antibody for capture and detection. For detection of human TNF-α (homotrimer) similar to the Sandswitch ELISA method by using “RNA aptamer molecule” for capture and “RNA aptamer molecule” for detection instead of monoclonal antibody for detection When constructing the kit, this corresponds to a form in which the “RNA aptamer molecule” having binding ability to human TNF-α according to the present invention is used as the “RNA aptamer molecule” for detection. That is, as the “RNA aptamer molecule” for detection, the “RNA aptamer molecule” having the binding ability to human TNF-α according to the present invention is used, and the reactivity specific to human TNF-α (homotrimer) is exhibited. This method corresponds to a method for producing a human TNF-α detection kit by combining with a capture “RNA aptamer molecule”. At that time, as an "RNA aptamer molecule" for capture having a reactivity specific to human TNF-α (homotrimer), an "RNA aptamer molecule" having binding ability to human TNF-α according to the present invention, Can use different “RNA aptamer molecules” for human TNF-α.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第三の態様では、
作製する該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」である、第一のＲＮＡアプタマーと、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」である、第二のＲＮＡアプタマーを組み合わせており、その第二のＲＮＡアプタマーとして、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を利用する。 In the third aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention,
The human TNF-α detection kit to be produced is a combination of a first RNA aptamer that is a capture “RNA aptamer molecule” and a second RNA aptamer that is a “RNA aptamer molecule” for detection, As the second RNA aptamer, an “RNA aptamer molecule” having binding ability to human TNF-α according to the present invention is used.

対応する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第三の態様は、
検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」と、捕獲用「ＲＮＡアプタマー」として利用する、別の「ヒトＴＮＦ−αに対する特異的な結合能を有するＲＮＡアプタマー」を組み合わせて、検出用キットを構成している。 The corresponding third aspect of the “kit for detecting human TNF-α produced by using an aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention,
“RNA aptamer having binding ability to human TNF-α” according to the present invention used as “RNA aptamer molecule” for detection and another “specific for human TNF-α” used as “RNA aptamer” for capture In combination, an RNA aptamer having an appropriate binding ability ”constitutes a detection kit.

該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを利用して、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を検出する際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、第二のＲＮＡアプタマーを反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと結合して、複合体を形成した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う方式を採用する。 When detecting human TNF-α (homotrimer) using the human TNF-α detection kit,
Immobilizing human TNF-α using the first RNA aptamer having binding ability to human TNF-α,
A second RNA aptamer is reacted with the immobilized human TNF-α,
A method of detecting human TNF-α by detecting the second RNA aptamer that has formed a complex by binding to immobilized human TNF-α is adopted.

検出用「ＲＮＡアプタマー」である、第二のＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する。 As a second RNA aptamer that is an “RNA aptamer” for detection,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130 (SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485 (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F) (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F) (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F) (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F) (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674 (SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675 (SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100 (SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013 (SEQ ID NO: 10)
An aptamer selected from the group consisting of:

なお、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、その検出に利用可能な標識を付した形態とすることが好ましい。例えば、該第二のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。   The RNA aptamer having the ability to bind to human TNF-α used as a “RNA aptamer molecule” for detection is preferably in a form with a label that can be used for its detection. For example, a form in which a label is attached to the end of a single-stranded nucleic acid constituting the second RNA aptamer can be selected.

検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と該第二のＲＮＡアプタマーで形成される複合体の解離定数ＫDは、少なくとも、ＫD≦１００ｎＭ、通常、ＫD≦１０ｎＭの範囲であることが好ましい。特には、ＫD≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが、より好ましい。 When used as a “RNA aptamer molecule” for detection, the dissociation constant K D of the complex formed by human TNF-α (homotrimer) and the second RNA aptamer is at least K D ≦ 100 nM, usually , K D ≦ 10 nM. In particular, it is more preferable to use an “RNA aptamer molecule” estimated to have K D ≦ 10 pM.

実際の検出操作では、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を結合させた後、結合していない検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を洗浄により、除去する。また、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に結合している検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を検出する際には、通常、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を含まない液中に浸された状態とされる。この洗浄工程、あるいは、検出工程中、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離が進行する。このヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離は、該複合体の解離の速度定数：ｋdにより支配される。従って、複合体の解離の速度定数：ｋdが、ｋd≧１０-3 ｓ-1である場合、洗浄工程と検出工程に要する時間が１０００秒間に達すると、形成された複合体の（１−1/e）は、その間に解離することになる。 In the actual detection operation, the detection “RNA aptamer molecule” is bound to human TNF-α (homotrimer), and then the unbound detection “RNA aptamer molecule” is removed by washing. In addition, when detecting a “RNA aptamer molecule for detection” bound to human TNF-α (homotrimer), it is usually immersed in a liquid not containing the “RNA aptamer molecule” for detection. It is said. During this washing step or detection step, the dissociation of the complex of human TNF-α (homotrimer) and the “RNA aptamer molecule for detection” proceeds. The dissociation of the complex of human TNF-α (homotrimer) and “RNA aptamer molecule for detection” is governed by the dissociation rate constant of the complex: k d . Therefore, when the rate constant of dissociation of the complex: k d is k d ≧ 10 −3 s −1 , when the time required for the washing step and the detection step reaches 1000 seconds, (1 -1 / e) will dissociate during that time.

洗浄工程と検出工程の要する時間に進行する、複合体の解離を無視できる水準（例えば、1/10以下）に留めるためには、複合体の解離の速度定数：ｋdが、通常、ｋd≦２×１０-4 ｓ-1の範囲、より好ましくは、ｋd≦１０-4 ｓ-1の範囲である、「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが望ましい。 In order to keep the dissociation of the complex proceeding in the time required for the washing process and the detection process at a negligible level (for example, 1/10 or less), the dissociation rate constant of the complex: k d is usually k d It is desirable to use an “RNA aptamer molecule” in the range of ≦ 2 × 10 −4 s −1 , more preferably in the range of k d ≦ 10 −4 s −1 .

すなわち、複合体の解離定数ＫDは、ＫD≦１０ｎＭの範囲であり、複合体の解離の速度定数：ｋdは、ｋd≦１０-4 ｓ-1の範囲であるという二つの条件を満足する、「ＲＮＡアプタマー分子」を、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用することが、好ましい。 That is, the dissociation constant K D of the complex is in the range of K D ≦ 10 nM, and the rate constant of dissociation of the complex: k d is in the range of k d ≦ 10 −4 s −1. It is preferable to use a satisfactory “RNA aptamer molecule” as a “RNA aptamer molecule” for detection.

勿論、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と、選択的に結合する必要がある。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」との結合によって、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対する結合能が阻害を受けないことが必要である。   Of course, the “RNA aptamer molecule” for detection needs to selectively bind to human TNF-α (homotrimer) that is bound for capture. That is, it is necessary that the binding ability to human TNF-α (homotrimer) is not inhibited by the binding between human TNF-α (homotrimer) and the capture “RNA aptamer molecule”.

また、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対して、定量的に結合する必要がある。すなわち、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに結合する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の分子数の比率は、一定であることが望ましい。具体的には、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」が一分子結合する比率であることが望ましい。   In addition, the “RNA aptamer molecule” for detection needs to bind quantitatively to human TNF-α (homotrimer) that is bound to the “RNA aptamer molecule” for capture. That is, the ratio of the number of molecules of the “RNA aptamer molecule for detection” that binds to the human “TNF-α (homotrimer)” that binds to the “RNA aptamer molecule” for capture is desirably constant. Specifically, the ratio is preferably such that one detection “RNA aptamer molecule” binds to one human TNF-α (homotrimer) bound to the capture “RNA aptamer molecule”.

また、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」を利用することもできる。その際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」のうちから、互いに異なる部位に結合する「ＲＮＡアプタマー分子」を選択して、組み合わせる。   Moreover, the “RNA aptamer having binding ability to human TNF-α” according to the present invention can be used as the “RNA aptamer molecule” for capture. At that time, the “RNA aptamer molecule” for capture and the “RNA aptamer molecule” for detection are “RNA aptamers capable of binding to human TNF-α” according to the present invention, which bind to different sites. Select and combine aptamer molecules.

また、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」は、該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。すなわち、固体表面に、予め、PolydU鎖を固定化しておき、一本鎖核酸の3’−末端に連結されているPolyA鎖とハイブリダイズさせ、形成される核酸二本鎖によって、ＲＮＡアプタマーの固定化を行うことができる。付加されるPolyA鎖の塩基長は、２０塩基以上、３０塩基以下の範囲に選択することが望ましい。   In addition, the “RNA aptamer molecule” for capture is formed by linking a PolyA chain used for immobilizing the aptamer molecule to a carrier to the 3′-end of a single-stranded nucleic acid constituting the RNA aptamer. It is preferable to select a form that is a 3′-terminal PolyA strand-added RNA aptamer. That is, a PolydU chain is immobilized on a solid surface in advance, hybridized with a PolyA chain linked to the 3′-end of a single-stranded nucleic acid, and RNA aptamer immobilized by the nucleic acid duplex formed. Can be made. The base length of the added PolyA chain is preferably selected in the range of 20 to 30 bases.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第四の態様は、上記の捕獲用モノクローナル抗体と検出用モノクローナル抗体に代えて、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することで、Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ ＥＬＩＳＡ法に類似するヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出用の検出用キットを構成する際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用する形態に相当している。すなわち、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用し、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」と組み合わせることで、ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製する方法に相当している。その際、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に特異的な反応性を有する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」とは異なる、ヒトＴＮＦ−αに対する「ＲＮＡアプタマー分子」を使用することができる。   The fourth aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention includes the above-described capture monoclonal antibody and detection For detection of human TNF-α (homotrimer) similar to the Sandswitch ELISA method by using “RNA aptamer molecule” for capture and “RNA aptamer molecule” for detection instead of monoclonal antibody for detection When constructing the kit, this corresponds to a form in which the “RNA aptamer molecule” having the binding ability to human TNF-α according to the present invention is used as the capture “RNA aptamer molecule”. That is, as the “RNA aptamer molecule” for capture, the “RNA aptamer molecule” having the binding ability to human TNF-α according to the present invention is used, and the reactivity specific to human TNF-α (homotrimer) is exhibited. This method corresponds to a method for preparing a detection kit for human TNF-α by combining with a “RNA aptamer molecule” for detection. At that time, as an “RNA aptamer molecule” for detection, which has reactivity specific to human TNF-α (homotrimer), “RNA aptamer molecule” having binding ability to human TNF-α according to the present invention; Can use different “RNA aptamer molecules” for human TNF-α.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを作製するために、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを使用する方法」の第四の態様では、
作製する該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットは、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」である、第一のＲＮＡアプタマーと、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」である、第二のＲＮＡアプタマーを組み合わせており、その第一のＲＮＡアプタマーとして、本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を利用する。 In the fourth aspect of the “method of using an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α to produce a human TNF-α detection kit” according to the present invention,
The human TNF-α detection kit to be produced is a combination of a first RNA aptamer that is a capture “RNA aptamer molecule” and a second RNA aptamer that is a “RNA aptamer molecule” for detection, As the first RNA aptamer, an “RNA aptamer molecule” having binding ability to human TNF-α according to the present invention is used.

対応する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するアプタマーを使用することで作製される、ヒトＴＮＦ−αの検出用キット」の第四の態様は、
捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用する、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」と、検出用「ＲＮＡアプタマー」として利用する、別の「ヒトＴＮＦ−αに対する特異的な結合能を有するＲＮＡアプタマー」を組み合わせて、検出用キットを構成している。 The corresponding fourth aspect of the “kit for detecting human TNF-α produced by using an aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention,
The “RNA aptamer having binding ability to human TNF-α” according to the present invention, which is used as an “RNA aptamer molecule” for capture, and another “specific for human TNF-α”, which is used as an “RNA aptamer” for detection. In combination, an RNA aptamer having an appropriate binding ability ”constitutes a detection kit.

該ヒトＴＮＦ−αの検出用キットを利用して、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）の検出する際、
前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する、第一のＲＮＡアプタマーを利用して、ヒトＴＮＦ−αを固定化し、
固定化されたヒトＴＮＦ−αに、第二のＲＮＡアプタマーを反応させ、
固定化されたヒトＴＮＦ−αと結合して、複合体を形成した、前記第二のＲＮＡアプタマーを検出することで、ヒトＴＮＦ−αの検出を行う方式を採用する。 When detecting human TNF-α (homotrimer) using the human TNF-α detection kit,
Immobilizing human TNF-α using the first RNA aptamer having binding ability to human TNF-α,
A second RNA aptamer is reacted with the immobilized human TNF-α,
A method of detecting human TNF-α by detecting the second RNA aptamer that has formed a complex by binding to immobilized human TNF-α is adopted.

捕獲用「ＲＮＡアプタマー」である、第一のＲＮＡアプタマーとして、
下記I-1〜I-5の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(I-1) TNF-130 （配列番号：１）
(I-2) TNF-485 （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 （配列番号：５）
下記I-2〜I-5の塩基配列からなる一本鎖修飾ＲＮＡ分子：
(I-2) TNF-485 (2'F) （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F) （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F) （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F) （配列番号：５）
下記II-2〜II-4の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(II-2) TNF-674 （配列番号：７）
(II-3) TNF-675 （配列番号：８）
(II-4) TNF-100 （配列番号：９）
下記IIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子：
(III) TNF-m013 （配列番号：１０）
からなる群から選択されるアプタマーを使用する。 As the first RNA aptamer, which is a “RNA aptamer” for capture,
Single-stranded RNA molecules consisting of the following I-1 to I-5 base sequences:
(I-1) TNF-130 (SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485 (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded modified RNA molecule consisting of the following I-2 to I-5 base sequences:
(I-2) TNF-485 (2'F) (SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F) (SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F) (SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F) (SEQ ID NO: 5)
Single-stranded RNA molecules consisting of the following II-2 to II-4 base sequences:
(II-2) TNF-674 (SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675 (SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100 (SEQ ID NO: 9)
Single-stranded RNA molecule consisting of the following III nucleotide sequence:
(III) TNF-m013 (SEQ ID NO: 10)
An aptamer selected from the group consisting of:

その際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー」を固体表面に固定化するため、例えば、前記ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーは、
該アプタマー分子を担体に固定化するために利用される、PolyA鎖を、該ＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の3’−末端に連結してなる、3’−末端PolyA鎖付加ＲＮＡアプタマーである形態を選択することが好ましい。すなわち、固体表面に、予め、PolydU鎖を固定化しておき、一本鎖核酸の3’−末端に連結されているPolyA鎖とハイブリダイズさせ、形成される核酸二本鎖によって、ＲＮＡアプタマーの固定化を行うことができる。付加されるPolyA鎖の塩基長は、２０塩基以上、３０塩基以下の範囲に選択することが望ましい。 At that time, in order to immobilize the capture "RNA aptamer" on the solid surface, for example, the RNA aptamer having the binding ability to the human TNF-α,
A 3'-terminal PolyA chain-added RNA aptamer, which is used to immobilize the aptamer molecule on a carrier, and is formed by linking a PolyA chain to the 3'-end of a single-stranded nucleic acid constituting the RNA aptamer. It is preferable to select a certain form. That is, a PolydU chain is immobilized on a solid surface in advance, hybridized with a PolyA chain linked to the 3′-end of a single-stranded nucleic acid, and RNA aptamer immobilized by the nucleic acid duplex formed. Can be made. The base length of the added PolyA chain is preferably selected in the range of 20 to 30 bases.

捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する場合、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と該ＲＮＡアプタマーで形成される複合体の解離定数ＫDは、少なくとも、ＫD≦１００ｎＭ、通常、ＫD≦１０ｎＭの範囲であることが好ましい。特には、ＫD≦１０ｐＭと見積もられる「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが、より好ましい。 When used as a “RNA aptamer molecule” for capture, the dissociation constant K D of the complex formed by human TNF-α (homotrimer) and the RNA aptamer is at least K D ≦ 100 nM, usually K D ≦ 10 nM is preferable. In particular, it is more preferable to use an “RNA aptamer molecule” estimated to have K D ≦ 10 pM.

実際の検出操作では、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」を結合させた後、結合していないヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を洗浄により、除去する。次いで、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合させた、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を反応させる。さらに、結合していない検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を洗浄により、除去する。   In the actual detection operation, human TNF-α (homotrimer) is bound to a capture “RNA aptamer molecule” and then unbound human TNF-α (homotrimer) is removed by washing. . Next, the “RNA aptamer molecule” for detection is reacted with human TNF-α (homotrimer) combined with the “RNA aptamer molecule” for capture. Furthermore, undetected “RNA aptamer molecules” for detection are removed by washing.

また、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に結合している検出用「ＲＮＡアプタマー分子」を検出する工程でも、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）を含まない液中に浸された状態とされる。   Further, even in the step of detecting the “RNA aptamer molecule for detection” bound to human TNF-α (homotrimer), it is immersed in a liquid not containing human TNF-α (homotrimer). It is said.

捕獲操作後の洗浄工程、あるいは、検出工程中、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離が進行する。このヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」の複合体の解離は、該複合体の解離の速度定数：ｋdにより支配される。従って、複合体の解離の速度定数：ｋdが、ｋd≧１０-3 ｓ-1である場合、捕獲操作後の洗浄工程と検出工程に要する時間が１０００秒間に達すると、形成された複合体の（１−1/e）は、その間に解離することになる。 Dissociation of the complex of human TNF-α (homotrimer) and capture “RNA aptamer molecule” proceeds during the washing step after the capture operation or the detection step. The dissociation of the complex of human TNF-α (homotrimer) and the capture “RNA aptamer molecule” is governed by the dissociation rate constant of the complex: k d . Therefore, when the complex dissociation rate constant k d is k d ≧ 10 −3 s −1 , the complex formed when the time required for the washing step and the detection step after the capture operation reaches 1000 seconds. The (1-1 / e) of the body will dissociate during that time.

捕獲操作後の洗浄工程と検出工程の要する時間に進行する、複合体の解離を無視できる水準（例えば、1/10以下）に留めるためには、複合体の解離の速度定数：ｋdが、通常、ｋd≦２×１０-4 ｓ-1の範囲、より好ましくは、ｋd≦１０-4 ｓ-1の範囲である、「ＲＮＡアプタマー分子」を利用することが望ましい。 In order to keep the dissociation of the complex proceeding in the time required for the washing process and the detection process after the capture operation to a level that can be ignored (for example, 1/10 or less), the dissociation rate constant of the complex: k d is Usually, it is desirable to use an “RNA aptamer molecule” that has a range of k d ≦ 2 × 10 −4 s −1 , more preferably a range of k d ≦ 10 −4 s −1 .

すなわち、複合体の解離定数ＫDは、ＫD≦１０ｎＭの範囲であり、複合体の解離の速度定数：ｋdは、ｋd≦１０-4 ｓ-1の範囲であるという二つの条件を満足する、「ＲＮＡアプタマー分子」を、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」として利用することが、好ましい。 That is, the dissociation constant K D of the complex is in the range of K D ≦ 10 nM, and the rate constant of dissociation of the complex: k d is in the range of k d ≦ 10 −4 s −1. It is preferable to use a satisfactory “RNA aptamer molecule” as a capture “RNA aptamer molecule”.

勿論、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と、選択的に結合する必要がある。すなわち、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）と捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」との結合によって、ヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対する結合能が阻害を受けないことが必要である。   Of course, the “RNA aptamer molecule” for detection needs to selectively bind to human TNF-α (homotrimer) that is bound for capture. That is, it is necessary that the binding ability to human TNF-α (homotrimer) is not inhibited by the binding between human TNF-α (homotrimer) and the capture “RNA aptamer molecule”.

また、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）に対して、定量的に結合する必要がある。すなわち、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに結合する、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」の分子数の比率は、一定であることが望ましい。具体的には、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と結合しているヒトＴＮＦ−α（ホモ３量体）当たりに、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」が一分子結合する比率であることが望ましい。   In addition, the “RNA aptamer molecule” for detection needs to bind quantitatively to human TNF-α (homotrimer) that is bound to the “RNA aptamer molecule” for capture. That is, the ratio of the number of molecules of the “RNA aptamer molecule for detection” that binds to the human “TNF-α (homotrimer)” that binds to the “RNA aptamer molecule” for capture is desirably constant. Specifically, the ratio is preferably such that one detection “RNA aptamer molecule” binds to one human TNF-α (homotrimer) bound to the capture “RNA aptamer molecule”.

また、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」を利用することもできる。その際、捕獲用「ＲＮＡアプタマー分子」と、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」は、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」のうちから、互いに異なる部位に結合する「ＲＮＡアプタマー分子」を選択して、組み合わせる。   In addition, “RNA aptamer having binding ability to human TNF-α” according to the present invention can be used as the “RNA aptamer molecule” for detection. At that time, the “RNA aptamer molecule” for capture and the “RNA aptamer molecule” for detection are “RNA aptamers capable of binding to human TNF-α” according to the present invention, which bind to different sites. Select and combine aptamer molecules.

なお、検出用「ＲＮＡアプタマー分子」として使用する、第一のＲＮＡアプタマーは、その検出に利用可能な標識を付した形態とすることが好ましい。例えば、該第一のＲＮＡアプタマーを構成する一本鎖核酸の末端に標識が付されている形態を選択することができる。   The first RNA aptamer used as the “RNA aptamer molecule” for detection is preferably in a form with a label that can be used for the detection. For example, a form in which a label is attached to the end of a single-stranded nucleic acid constituting the first RNA aptamer can be selected.

次に、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」に関して、より詳細に説明する。   Next, the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention will be described in more detail.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」は、下記の着想に基づき、「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能」の発揮に関与する部位（例えば、内部ループ様の構造）の構成に、特定のモチーフ配列を利用すると推定される「ＲＮＡアプタマー」を効率的に選別する方法に相当している。   The “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention is based on the following idea, and is a site (for example, an internal loop-like region) involved in exerting “binding ability to human TNF-α”. This structure corresponds to a method for efficiently selecting “RNA aptamers” presumed to use a specific motif sequence.

まず、図２に示す、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に、内部ループ様の構造が構成されている点、特に、TNF-130の「ランダム配列」領域において、この内部ループ様の構造の構成に関与している部分として、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域に着目した。   First, in the estimated secondary structure of TNF-130 shown in FIG. 2, an internal loop-like structure is formed at the center, particularly in the “random sequence” region of TNF-130. Attention was paid to two regions, “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′”, as the parts involved in the structure of the loop-like structure.

さらに、上述の二種の「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100について、その推定される二次構造を比較すると、図３に示すように、中心部に、内部ループ様の構造が構成されているという共通性が見出されることに着目した。この内部ループ様の構造の構成に関与する部分塩基配列を対比したところ、TNF-130中の「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」と、TNF-100中の「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」との間で、明確な類似性が見出されることに着目した。   Further, when comparing the presumed secondary structures of the above-mentioned two types of “RNA aptamer molecules” TNF-130 and TNF-100, an internal loop-like structure is formed at the center as shown in FIG. We focused on finding the commonality of being done. When the partial base sequences involved in the structure of this internal loop-like structure were compared, “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” in TNF-130 and TNF-100 It was noted that a clear similarity was found between “5′-UCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGAC-3 ′”.

なお、図３に示すように、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100の推定される二次構造において、その中心部に見出される、内部ループ様の構造では、三つの二本鎖構造によって、該内部ループ様の構造が保持されていると推断される。   In addition, as shown in FIG. 3, in the presumed secondary structure of “RNA aptamer molecules” TNF-130 and TNF-100, the inner loop-like structure found in the central part has three double-stranded structures. Therefore, it is assumed that the internal loop-like structure is held.

通常、一本鎖ＲＮＡが二本鎖構造を形成すると、該二本鎖構造を構成する二つの部分に挟まれる領域は、何らかのループ構造を構成する。従って、内部ループ様の構造の形成に付随する、三つの二本鎖構造のうち、二つは、その先端部に、ループ構造を含む二次構造に由来する必要がある。「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100の推定される二次構造においては、その内部ループ様の構造中に、「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」が含まれ、その間に、ループ構造を含む二次構造の形成に関与する領域が存在している。特に、「５’−CUAGAC−３’」の５’末端側に、「５’−UCACCGG−３’」が存在することで、「５’−CUAGAC−３’」の５’末端のＣと、「５’−UCACCGG−３’」の３’末端のＧの間で、塩基対の形成が可能となっている。   Usually, when a single-stranded RNA forms a double-stranded structure, a region sandwiched between two parts constituting the double-stranded structure forms some loop structure. Therefore, two of the three double-stranded structures accompanying the formation of an internal loop-like structure need to be derived from a secondary structure including a loop structure at the tip. In the predicted secondary structure of “RNA aptamer molecule” TNF-130 and TNF-100, “5′-UCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGAC-3 ′” are included in the inner loop-like structure. In the meantime, there is a region involved in the formation of a secondary structure including a loop structure. In particular, the presence of “5′-UCACCGG-3 ′” on the 5 ′ end side of “5′-CUAGAC-3 ′” allows C at the 5 ′ end of “5′-CUAGAC-3 ′” Base pairing is possible between Gs at the 3 ′ end of “5′-UCACCGG-3 ′”.

その点を考慮すると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130とTNF-100の推定される二次構造において、その中心部に見出される、内部ループ様の構造を形成する上で、前記の相対配置と、ループ構造を含む二次構造の形成に関与する領域の存在の二つの条件を満たすことが望ましい。   Considering this point, in the presumed secondary structure of the “RNA aptamer molecule” TNF-130 and TNF-100, in forming the inner loop-like structure found in the center, It is desirable to satisfy the two conditions of existence of a region involved in the formation of a secondary structure including a loop structure.

具体的には、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域に相当する部分塩基配列を有し、その部分塩基配列を利用して、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130の推定された二次構造において、中心部に見出される、内部ループ様の構造と同等の構造が形成されると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-130と類似する結合部位を具える「ＲＮＡアプタマー分子」である可能性が高いと推断した。   Specifically, it has a partial base sequence corresponding to two regions of “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′”, and using the partial base sequence, “RNA aptamer” In the presumed secondary structure of the “molecule” TNF-130, when a structure equivalent to the inner loop-like structure found in the center is formed, it has a binding site similar to that of the “RNA aptamer molecule” TNF-130. It was inferred that there is a high possibility of being an “RNA aptamer molecule”.

例えば、クローン：TNF-673のランダム配列部分に見出された、「５’−TCTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」は、クローン：TNF-130中の「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と、その相対的な位置も高い類似性を有している。また、クローン：TNF-675のランダム配列部分に見出された、「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」は、クローン：TNF-130中の「５’−TTTTCACCGG−３’」と「５’−CTAGACAGG−３’」と、その相対的な位置も高い類似性を有している。   For example, “5′-TCTTCACCGG-3 ′” and “5′-CTAGACAGG-3 ′” found in the random sequence portion of clone: TNF-673 are “5′-TTTTCACCGG” in clone: TNF-130. -3 ′ ”and“ 5′-CTAGACAGG-3 ′ ”and their relative positions are also highly similar. In addition, “5′-TTTTCACCGG-3 ′” and “5′-CTAGACAGG-3 ′” found in the random sequence portion of clone: TNF-675 are “5′-TTTTCACCGG” in clone: TNF-130. -3 ′ ”and“ 5′-CTAGACAGG-3 ′ ”and their relative positions are also highly similar.

また、「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」と同じ部分塩基配列を有し、その部分塩基配列を利用して、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100の推定された二次構造において、中心部に見出される、内部ループ様の構造と同等の構造が形成されると、「ＲＮＡアプタマー分子」TNF-100と類似する結合部位を具える「ＲＮＡアプタマー分子」である可能性が高いと推断した。   Moreover, it has the same partial base sequence as “5′-UCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGAC-3 ′”, and “RNA aptamer molecule” TNF-100 is estimated using the partial base sequence. In the secondary structure, when an equivalent structure to the inner loop-like structure found in the central part is formed, it is an “RNA aptamer molecule” that has a binding site similar to TNF-100. I guessed that the possibility is high.

例えば、表８に示す、三種のクローン：TNF-673,TNF-674,TNF-675と、クローン：TNF-100、ならびに、クローン：TNF-130に関して、何れも、「５’−TCACCGG−３’」と「５’−CTAGAC−３’」と同じ部分塩基配列を内在している。   For example, regarding the three clones shown in Table 8, TNF-673, TNF-674, TNF-675, clone: TNF-100, and clone: TNF-130, all of them are “5′-TCACCGG-3 ′”. ”And“ 5′-CTAGAC-3 ′ ”have the same partial base sequence.

例えば、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングに利用する、
５’末端の固定領域：GGAAGACCAG CCUUAAGAGGG；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGUAUCCG GAACGUGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
を具える、全長９０塩基長の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」中から、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製し、この第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーに対して、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、スクリーニングを行うことで、より効率的に、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされることに想到した。 For example, it is used for screening that applies the SELEX method.
5 'terminal fixed region: GGAAGACCAG CCUUAAGAGGG; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
3 'terminal fixed region: CUAGUAUCCG GAACGUGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
From the "random single-stranded RNA molecule library" with a total length of 90 bases,
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), a first partial base sequence and a second motif sequence: 5 ′ corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, respectively. A single-stranded RNA molecule containing a second partial base sequence corresponding to -CUAGACAGG-3 'is selected to create a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules. By screening the partial library of candidate single-stranded RNA molecules of, based on the ability to bind to human TNF-α, it corresponds to the first motif sequence and the second motif sequence more efficiently. Thus, it was conceived that an RNA aptamer having two partial base sequences and capable of binding to human TNF-α could be selected.

すなわち、上記の第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’を利用することで、予めスクリーニング対象の絞り込みを行うことで、より効率的なスクリーニングを行うことが可能となることに想到した。   That is, by using the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ as described above, screening targets can be narrowed down in advance for more efficient operation. I came to realize that it would be possible to perform simple screening.

あるいは、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製し、この第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーに対して、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、スクリーニングを行うことで、より効率的に、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされることに想到した。 Alternatively, in the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), the third partial base sequence and the fourth motif sequence: 5 are the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, respectively. A single-stranded RNA molecule containing the fourth partial base sequence, the same as '-CUAGAC-3', is selected to create a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules. The partial library of candidate single-stranded RNA molecules is screened based on the ability to bind to human TNF-α, so that it is more efficiently the same as the third motif sequence and the fourth motif sequence. Thus, it was conceived that an RNA aptamer having two partial base sequences and capable of binding to human TNF-α was selected.

従って、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の形態は、上記の第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’を利用することで、「５’−UUUUCACCGG−３’」と「５’−CUAGACAGG−３’」の二つの領域が、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に存在する内部ループ様の構造を構成する可能性を有する一本鎖ＲＮＡ分子の集団に、予めスクリーニング対象の絞り込みを行うことで、より効率的なスクリーニングを行う方法に相当している。   Therefore, the first form of the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention is the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second motif. By using the sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′, two regions of “5′-UUUUCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGACAGG-3 ′” are the predicted secondary structure of TNF-130. In this case, the screening target is narrowed down in advance to a group of single-stranded RNA molecules having a possibility of constituting an internal loop-like structure present in the central portion, which corresponds to a method for performing more efficient screening. Yes.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の形態は、例えば、下記の工程１と工程２とを具える選別方法とすることができる。   The first mode of the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention can be, for example, a selection method comprising the following step 1 and step 2.

（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法においては、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる。 (Process 1)
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), a first partial base sequence and a second motif sequence: 5 ′ corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, respectively. -Selecting a single-stranded RNA molecule comprising a second partial base sequence corresponding to CUAGACAGG-3 'to create a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules, Sorting process;
(Process 2)
From the partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule, comprising two partial base sequences corresponding to the first motif sequence and the second motif sequence based on the binding ability to human TNF-α, A second selection step of selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α;
In this selection method, an RNA aptamer having two partial base sequences corresponding to the first motif sequence and the second motif sequence and capable of binding to human TNF-α is selected.

図２に示す、TNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造が、選別されるＲＮＡアプタマーの予測される二次構造中に存在するためには、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列との間に、ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域が存在することが好ましい。   The structure similar to the inner loop-like structure found in the center of the predicted secondary structure of TNF-130 shown in FIG. 2 is present in the predicted secondary structure of the RNA aptamer to be selected. Includes a first partial base sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and a second partial base corresponding to the second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ It is preferable that a region capable of forming a hairpin loop structure exists between the sequences.

ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域は、８塩基以上の塩基長である必要がある。その点を考慮すると、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが好ましい。 The region where the hairpin loop structure can be formed needs to have a base length of 8 bases or more. Considering this point, in the step 1,
At least 8 bases, for example, 8 bases or more and 25 bases or less, between the first partial base sequence and the second partial base sequence contained in the 51 base long random sequence part (N 51 ) It is preferable to select a form in which a partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule is prepared by selecting a single-stranded RNA molecule in which the region exists.

また、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、図２に示す、TNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造を構成する上では、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在していることが望ましいと考えられる。すなわち、内部ループ様の構造の一部に、５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG Gの一部が利用される態様では、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在していることが望ましい。その点を考慮すると、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが望ましい。 The first partial nucleotide sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second partial nucleotide sequence corresponding to the second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ Thus, in constructing a structure similar to the internal loop-like structure found in the central part of the estimated secondary structure of TNF-130 shown in FIG. It is considered that it is desirable to exist at the 5 ′ end side rather than the second partial base sequence. That is, in a mode in which a part of the 5′-terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G is used as part of the internal loop-like structure, the first partial base sequence is the second partial base sequence. It is desirable that it is present on the 5 ′ end side. Considering this point, in the step 1,
The first partial base sequence contained in the 51-base-long random sequence portion (N 51 ) is present on the 5 ′ end side of the second partial base sequence, single-stranded RNA It is desirable to select a molecule to select a form that creates a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules.

また、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第一の形態は、上記の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の形態で利用される「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」に相当している。   The first form of the “candidate single-stranded RNA molecule partial library” according to the present invention is the first aspect of the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention. It corresponds to “a partial library of candidate single-stranded RNA molecules” used in one form.

すなわち、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第一の形態は、下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである。 That is, the first form of the “candidate single-stranded RNA molecule partial library” according to the present invention is the following 5′-end fixed region and 3′-end fixed region, and a 51-base-length random sandwiched between them. From a random single-stranded RNA molecule library (RNA pool) composed of single-stranded RNA molecules having a sequence portion (N 51 ),
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), a first partial base sequence and a second motif sequence: 5 ′ corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, respectively. -A partial library prepared by selecting a single-stranded RNA molecule containing a second partial base sequence corresponding to CUAGACAGG-3 '.

図２に示す、TNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造が、予測される二次構造中に存在する、候補一本鎖ＲＮＡ分子を高い頻度で含むためには、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列との間に、ループ構造を形成可能な領域が存在することが好ましい。   A candidate single-stranded RNA molecule in which a structure similar to the internal loop-like structure found in the center of the predicted secondary structure of TNF-130 shown in FIG. 2 is present in the predicted secondary structure In order to contain a high frequency, the first partial nucleotide sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second motif sequence: corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ It is preferable that a region capable of forming a loop structure exists between the second partial base sequence.

ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域は、８塩基以上の塩基長である必要がある。その点を考慮すると、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが好ましい。 The region where the hairpin loop structure can be formed needs to have a base length of 8 bases or more. Considering this point, at least 8 bases, for example, 8 bases, are included between the first partial base sequence and the second partial base sequence contained in the 51 base long random sequence portion (N 51 ). It is preferable to select a form in which a partial library of candidate single-stranded RNA molecules is prepared by selecting a single-stranded RNA molecule in which a region of 25 to 25 bases is present.

また、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、図２に示す、TNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造を構成する上では、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在していることが望ましいと考えられる。すなわち、内部ループ様の構造の一部に、５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG Gの一部が利用される態様では、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在していることが望ましい。その点を考慮すると、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが望ましい。 The first partial nucleotide sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second partial nucleotide sequence corresponding to the second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ Thus, in constructing a structure similar to the internal loop-like structure found in the central part of the estimated secondary structure of TNF-130 shown in FIG. It is considered that it is desirable to exist at the 5 ′ end side rather than the second partial base sequence. That is, in a mode in which a part of the 5′-terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G is used as part of the internal loop-like structure, the first partial base sequence is the second partial base sequence. It is desirable that it is present on the 5 ′ end side. Considering this point, the first partial base sequence contained in the 51-base-long random sequence portion (N 51 ) is present on the 5 ′ end side of the second partial base sequence. It is desirable to select a single-stranded RNA molecule and select a form for creating a partial library of candidate single-stranded RNA molecules.

また、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の形態は、上記の第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’を利用することで、「５’−UCACCGG−３’」と「５’−CUAGAC−３’」の二つの領域が、TNF-100、あるいは、TNF-130の推定された二次構造において、中心部に存在する内部ループ様の構造を構成する可能性を有する一本鎖ＲＮＡ分子の集団に、予めスクリーニング対象の絞り込みを行うことで、より効率的なスクリーニングを行う方法に相当している。   The second form of the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention is the above third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′ and the fourth motif. By using the sequence: 5′-CUAGAC-3 ′, two regions of “5′-UCACCGG-3 ′” and “5′-CUAGAC-3 ′” can be converted to TNF-100 or TNF-130. In the presumed secondary structure, screening targets can be narrowed down in advance to a group of single-stranded RNA molecules that have the possibility of constituting an internal loop-like structure in the center, thereby enabling more efficient screening. It corresponds to the method to do.

本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の形態は、例えば、下記の工程１と工程２とを具える選別方法とすることができる。   The second form of the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention can be, for example, a selection method comprising the following step 1 and step 2.

（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法によって、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる。 (Process 1)
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), the third partial base sequence and the fourth motif sequence: 5′-, which are the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, respectively. A first selection step of selecting a single-stranded RNA molecule containing the fourth partial base sequence, which is the same as CUAGAC-3 ′, and creating a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules ;
(Process 2)
From the partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule, based on the binding ability to human TNF-α, comprising two partial base sequences that are the same as the third motif sequence and the fourth motif sequence, A second selection step of selecting RNA aptamers capable of binding to TNF-α;
By this selection method, RNA aptamers having two partial base sequences, which are the same as the third motif sequence and the fourth motif sequence, and capable of binding to human TNF-α are selected.

図３に示す、TNF-100やTNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造が、選別されるＲＮＡアプタマーの予測される二次構造中に存在するためには、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’に相当する、第四の部分塩基配列との間に、ループ構造を形成可能な領域が存在することが好ましい。   The structure similar to the internal loop-like structure found in the center of the predicted secondary structure of TNF-100 and TNF-130 shown in FIG. 3 is the predicted secondary structure of the RNA aptamer to be selected. To be present in the third motif sequence: the same as the 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence and the fourth motif sequence: corresponding to the fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′, It is preferable that a region capable of forming a loop structure is present between the partial base sequence of.

ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域は、８塩基以上の塩基長である必要がある。その点を考慮すると、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが好ましい。 The region where the hairpin loop structure can be formed needs to have a base length of 8 bases or more. Considering this point, in the step 1,
At least 8 bases, for example, 8 bases or more and 25 bases or less, between the first partial base sequence and the second partial base sequence contained in the 51 base long random sequence part (N 51 ) It is preferable to select a form in which a partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule is prepared by selecting a single-stranded RNA molecule in which the region exists.

さらに、「ＲＮＡアプタマー」TNF-673,TNF-674,TNF-675、ならびに、TNF-100、TNF-130に相当する「候補一本鎖ＲＮＡ分子」を含むものとするためには、上述する第一の形態と同様に、前記工程１において、
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。 Furthermore, in order to include “candidate single-stranded RNA molecules” corresponding to “RNA aptamers” TNF-673, TNF-674, TNF-675, and TNF-100, TNF-130, the above-mentioned first As with the form, in step 1 above,
Single-stranded RNA in which the third partial base sequence contained in the 51 base-long random sequence portion (N 51 ) is present on the 5 ′ end side of the fourth partial base sequence A molecule can be selected to select a form of generating a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules.

また、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第二の形態は、上記の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の形態で利用される「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」に相当している。   The second form of the “candidate single-stranded RNA molecule partial library” according to the present invention is the second aspect of the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention. It corresponds to “a partial library of candidate single-stranded RNA molecules” used in two forms.

すなわち、本発明にかかる「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」の第二の形態は、下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’に相当する、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである。 That is, the second form of the “candidate library of candidate single-stranded RNA molecules” according to the present invention is a random region having a length of 51 bases sandwiched between a fixed region at the 5 ′ end and a fixed region at the 3 ′ end described below. From a random single-stranded RNA molecule library (RNA pool) composed of single-stranded RNA molecules having a sequence portion (N 51 ),
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), the third partial base sequence and the fourth motif sequence: 5′-, which are the same as the third motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, respectively. It is a partial library prepared by selecting a single-stranded RNA molecule containing a fourth partial base sequence corresponding to CUAGAC-3 ′.

図３に示す、TNF-100やTNF-130の推定された二次構造の中心部に見出される、内部ループ様の構造と同様な構造が、選別されるＲＮＡアプタマーの予測される二次構造中に存在するためには、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’に相当する、第四の部分塩基配列との間に、ループ構造を形成可能な領域が存在することが好ましい。   The structure similar to the internal loop-like structure found in the center of the predicted secondary structure of TNF-100 and TNF-130 shown in FIG. 3 is the predicted secondary structure of the RNA aptamer to be selected. To be present in the third motif sequence: the same as the 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence and the fourth motif sequence: corresponding to the fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′, It is preferable that a region capable of forming a loop structure is present between the partial base sequence of.

ヘアピン・ループ構造を形成可能な領域は、８塩基以上の塩基長である必要がある。その点を考慮すると、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することが好ましい。 The region where the hairpin loop structure can be formed needs to have a base length of 8 bases or more. Considering this point, at least 8 bases, for example, 8 bases, are included between the first partial base sequence and the second partial base sequence contained in the 51 base long random sequence portion (N 51 ). It is preferable to select a form in which a partial library of candidate single-stranded RNA molecules is prepared by selecting a single-stranded RNA molecule in which a region of 25 to 25 bases is present.

さらに、「ＲＮＡアプタマー」TNF-673,TNF-674,TNF-675、ならびに、TNF-100、TNF-130に相当する「候補一本鎖ＲＮＡ分子」を含むものとするためには、上述する第一の形態と同様に、前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する形態を選択することができる。 Furthermore, in order to include “candidate single-stranded RNA molecules” corresponding to “RNA aptamers” TNF-673, TNF-674, TNF-675, and TNF-100, TNF-130, the above-mentioned first Similarly to the form, the third partial base sequence contained in the random base portion (N 51 ) having a length of 51 bases is present on the 5 ′ end side with respect to the fourth partial base sequence. The form of selecting a single-stranded RNA molecule and creating a partial library of candidate single-stranded RNA molecules can be selected.

さらに、本発明者らは、上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」を適用することで、下記の「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」を選別することは可能であることに想到した。   Furthermore, the present inventors applied the “method for selecting an RNA aptamer having the ability to bind to human TNF-α” according to the present invention described above, whereby the following “RNA having the ability to bind to human TNF-α”. It came to mind that it is possible to select “aptamers”.

すなわち、その塩基配列中に含まれる、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成され、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーである。あるいは、その塩基配列中に含まれる、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成され、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーである。   That is, the first partial base sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ included in the base sequence The second partial base sequence is an RNA aptamer having an internal loop structure and having a binding ability to human TNF-α. Alternatively, the third motif sequence included in the base sequence: the same as 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence, and the fourth motif sequence: the same as 5′-CUAGAC-3 ′, The fourth partial base sequence is an RNA aptamer having an internal loop structure and binding ability to human TNF-α.

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第一の態様は、上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の態様を適用することで選別されるＲＮＡアプタマーである。   That is, an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α, characterized by “first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′” and second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ according to the present invention. The first aspect of "is an RNA aptamer selected by applying the first aspect of the" method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α "according to the present invention described above.

該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。 The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a 51-base sequence portion sandwiched between the 5′-end and 3′-end fixed regions,
In the 51 base-length sequence portion, the first motif sequence: corresponding to 5′-UUUUCACCGG-3 ′, the second partial motif sequence: corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ Including a second partial base sequence,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the first partial base sequence and the second partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
The first partial base sequence contained in the 51 base-length sequence portion can be selected in a form existing on the 5 ′ end side with respect to the second partial base sequence.

さらに、前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases is present between the first partial base sequence and the second partial base sequence, which are included in the 51 base length sequence portion. Can be selected.

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第一の態様は、上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第二の態様を適用することで選別されるＲＮＡアプタマーである。   The RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, characterized by the “third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′” and the fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′ according to the present invention. The first aspect of "is an RNA aptamer selected by applying the second aspect of the" method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α "according to the present invention described above.

該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。 The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a 51-base sequence portion sandwiched between the 5′-end and 3′-end fixed regions,
In the 51 base-length sequence portion, the third motif sequence: the same as 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence, and the fourth motif sequence: the same as 5′-CUAGAC-3 ′, Containing the fourth partial base sequence,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the third partial base sequence and the fourth partial base sequence exist as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
A form in which the third partial base sequence contained in the 51 base-length sequence portion is present on the 5 ′ end side with respect to the fourth partial base sequence can be selected.

さらに、前記５１塩基長の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases is present between the third partial base sequence and the fourth partial base sequence, which are included in the 51 base length sequence portion. Can be selected.

上述の本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の態様、第二の態様では、利用される「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」では、前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子の集合となっている。その５１塩基長の配列部分の塩基長を若干変更し、前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子の集合を、「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」として利用することでも、同様な「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の選別が可能であることに想到した。   In the first aspect and the second aspect of the “method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention described above, a “partial library of candidate single-stranded RNA molecules” is used. Then, it is a set of single-stranded RNA molecules having a sequence portion of 51 base length sandwiched between the fixed region at the 5 ′ end and the fixed region at the 3 ′ end. A set of single-stranded RNA molecules having a sequence portion of an intermediate region sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region, with the base length of the 51-base sequence portion slightly changed, It was conceived that the same “RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” can also be selected by using it as “a partial library of candidate single-stranded RNA molecules”.

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第二の態様は、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の態様に準じて、前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子の集合を、「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」として利用することで選別されるＲＮＡアプタマーに相当している。   That is, an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α, characterized by “first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′” and second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ according to the present invention. The second embodiment of “5′-end fixing region and 3′-end” according to the first embodiment of “Method for selecting RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention. Corresponds to RNA aptamers that are selected by using a set of single-stranded RNA molecules sandwiched between the fixed regions and having the sequence portion of the intermediate region as a “partial library of candidate single-stranded RNA molecules” .

該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。 The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a sequence portion of an intermediate region sandwiched between the fixed region at the 5 ′ end and the fixed region at the 3 ′ end;
In the sequence part of the intermediate region, the first partial nucleotide sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second motif sequence: corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ A second partial base sequence,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the first partial base sequence and the second partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
The first partial base sequence contained in the sequence portion of the intermediate region can be selected in a form existing on the 5 ′ end side with respect to the second partial base sequence.

さらに、前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, there is a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases, between the first partial base sequence and the second partial base sequence contained in the sequence part of the intermediate region. Can be selected.

なお、上記中間領域の配列部分の塩基長は、通常、４０塩基〜６０塩基の範囲、好ましくは、４５塩基〜５５塩基の範囲に選択することが望ましい。   The base length of the sequence portion of the intermediate region is usually selected in the range of 40 to 60 bases, preferably in the range of 45 to 55 bases.

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第二の態様は、本発明にかかる「ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法」の第一の態様に準じて、前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子の集合を、「候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー」として利用することで選別されるＲＮＡアプタマーに相当している。   The RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, characterized by the “third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′” and the fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′ according to the present invention. The second embodiment of “5′-end fixing region and 3′-end” according to the first embodiment of “Method for selecting RNA aptamer capable of binding to human TNF-α” according to the present invention. Corresponds to RNA aptamers that are selected by using a set of single-stranded RNA molecules sandwiched between the fixed regions and having the sequence portion of the intermediate region as a “partial library of candidate single-stranded RNA molecules” .

該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。 The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a sequence portion of an intermediate region sandwiched between the fixed region at the 5 ′ end and the fixed region at the 3 ′ end;
In the sequence portion of the intermediate region, the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence, the same as the fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′, Contains four partial base sequences,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the third partial base sequence and the fourth partial base sequence exist as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
The third partial base sequence contained in the sequence portion of the intermediate region can be selected in a form existing on the 5 ′ end side with respect to the fourth partial base sequence.

さらに、前記中間領域の配列部分中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases is present between the third partial base sequence and the fourth partial base sequence contained in the sequence part of the intermediate region. Can be selected.

なお、上記中間領域の配列部分の塩基長は、通常、４０塩基〜６０塩基の範囲、好ましくは、４５塩基〜５５塩基の範囲に選択することが望ましい。   The base length of the sequence portion of the intermediate region is usually selected in the range of 40 to 60 bases, preferably in the range of 45 to 55 bases.

さらに、図４に示すRecombinant Human TNF-α（ホモ３量体）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−ｍ０１３と「ＲＮＡアプタマー分子」ＴＮＦ−１００の推定される二次構造の対比結果に着目した。具体的には、その塩基配列中に含まれる、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成されると、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を発揮できることに想到した。また、その塩基配列中に含まれる、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列によって、内部ループ構造が構成されると、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を発揮できることに想到した。   Furthermore, the comparison result of the estimated secondary structure of “RNA aptamer molecule” TNF-m013 and “RNA aptamer molecule” TNF-100 having binding ability to Recombinant Human TNF-α (homotrimer) shown in FIG. Pay attention. Specifically, the first partial base sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ contained in the base sequence and the second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 It was conceived that when an internal loop structure is constituted by the second partial base sequence corresponding to ', the binding ability to human TNF-α can be exhibited. Also, the third motif sequence included in the base sequence: the same as 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence, and the fourth motif sequence: the same as 5′-CUAGAC-3 ′, It was conceived that the ability to bind to human TNF-α can be exhibited when an internal loop structure is constituted by the fourth partial base sequence.

すなわち、本発明にかかる「第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’と第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第三の態様は、下記の構成を有する「ＲＮＡアプタマー分子」である。   That is, an RNA aptamer having a binding ability to human TNF-α, characterized by “first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′” and second motif sequence: 5′-CUAGACAGG-3 ′ according to the present invention. The third aspect of "" is an "RNA aptamer molecule" having the following constitution.

該ＲＮＡアプタマーは、
第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。 The RNA aptamer is
First motif sequence: includes a first partial base sequence corresponding to 5′-UUUUCACCGG-3 ′, and a second motif sequence: second partial base sequence corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ A single-stranded RNA molecule consisting of a base sequence consisting of
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the first partial base sequence and the second partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第一の部分塩基配列は、前記第二の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
A form in which the first partial base sequence contained in the single-stranded RNA molecule is present on the 5 ′ end side with respect to the second partial base sequence can be selected.

さらに、前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第一の部分塩基配列と、第二の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, there is a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases, between the first partial base sequence and the second partial base sequence contained in the single-stranded RNA molecule. Can be selected.

なお、上記のＲＮＡアプタマーの塩基長は、通常、１２０塩基以下の範囲、好ましくは、１００塩基以下の範囲に選択することが望ましい。   The base length of the RNA aptamer is usually selected to be in the range of 120 bases or less, preferably in the range of 100 bases or less.

また、本発明にかかる「第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’によって特徴付けられる、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマー」の第三の態様は、下記の構成を有する「ＲＮＡアプタマー分子」である。   The RNA aptamer having the binding ability to human TNF-α, characterized by the “third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′” and the fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′ according to the present invention. The third aspect of "" is an "RNA aptamer molecule" having the following constitution.

該ＲＮＡアプタマーは、
第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している。 The RNA aptamer is
Third motif sequence: same as 5′-UCACCGG-3 ′, third partial base sequence, and fourth motif sequence: same as 5′-CUACCAC-3 ′, fourth partial base sequence A single-stranded RNA molecule consisting of a base sequence,
In the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the third partial base sequence and the fourth partial base sequence exist as elements constituting an internal loop structure.

その際、
前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第三の部分塩基配列は、前記第四の部分塩基配列よりも、５’末端側に存在している形態を選択することができる。 that time,
The third partial base sequence contained in the single-stranded RNA molecule can be selected to be present on the 5 ′ end side with respect to the fourth partial base sequence.

さらに、前記一本鎖ＲＮＡ分子中に含まれる、前記第三の部分塩基配列と、第四の部分塩基配列との間に、少なくとも８塩基、例えば、８塩基以上２５塩基以下の領域が存在している形態を選択することができる。   Furthermore, there is a region of at least 8 bases, for example, 8 bases to 25 bases, between the third partial base sequence and the fourth partial base sequence contained in the single-stranded RNA molecule. Can be selected.

なお、上記のＲＮＡアプタマーの塩基長は、通常、１２０塩基以下の範囲、好ましくは、１００塩基以下の範囲に選択することが望ましい。   The base length of the RNA aptamer is usually selected to be in the range of 120 bases or less, preferably in the range of 100 bases or less.

本発明にかかるヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、ホモ３量体を構成している、ヒトＴＮＦ−αタンパク質について、その循環血液中の濃度を定量する目的に利用可能である。   The “RNA aptamer molecule” capable of binding to human TNF-α according to the present invention can be used for the purpose of quantifying the concentration in the circulating blood of human TNF-α protein constituting a homotrimer. It is.

Claims (16)

ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のI-1〜I-5の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
(I-1) TNF-130
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：１）
(I-2) TNF-485
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences I-1 to I-5:
(I-1) TNF-130
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCCCAUAUGGAUCCCUUUUCACCGGUACCAAUAGCAAAUACCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 1)
(I-2) TNF-485
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
An aptamer characterized by that. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、各リボ核酸の２’−位のヒドロキシル基（−ＯＨ）をフッ素原子（−Ｆ）で置き換える修飾が施されている、下記のI-2〜I-5の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖修飾ＲＮＡ分子である
(I-2) TNF-485 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：２）
(I-3) TNF-505 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：３）
(I-4) TNF-508 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：４）
(I-5) TNF-510 (2'F)
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：５）
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is composed of the following base sequences I-2 to I-5 which are modified to replace the 2′-position hydroxyl group (—OH) of each ribonucleic acid with a fluorine atom (—F). A single-stranded modified RNA molecule with a base sequence selected from the group
(I-2) TNF-485 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UGAGAUAUCGCUCCAUUUUCAAAUUUAUCUAUACAAACACUUUGAUUCG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
(I-3) TNF-505 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UACAAUAUCUAUCACCUUUUACUGGCUACGAGGAGCAAGUACCCAGACAUG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 3)
(I-4) TNF-508 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CUCCAUAUGGAUCUCUGUUCCCCGCACCUGAGAGCCAAUACCUUGACAUC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
(I-5) TNF-510 (2'F)
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCACAUAUGGAUCCCUUUUCAACGGUACCAAUAGCUUGCAGUUAAAUACA
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
An aptamer characterized by that. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のII-2〜II-4の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
(II-2) TNF-674
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：７）
(II-3) TNF-675
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：８）
(II-4) TNF-100
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3’ （配列番号：９）
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences II-2 to II-4:
(II-2) TNF-674
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
CGUUAAAUCCUAAGCGGAUGGCCCCUUCACCGAUCAUAGGAUCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
(II-3) TNF-675
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
UCGAAAUAUUACCCUUUUCACCGGCGAAAGUCGCAUGACCGCCUAGACAGG
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 8)
(II-4) TNF-100
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC-3 '(SEQ ID NO: 9)
An aptamer characterized by that. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、下記のIIIの塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
(III) TNF-m013
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3’ （配列番号：１０）
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule consisting of the following base sequence III:
(III) TNF-m013
5'-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC-3 '(SEQ ID NO: 10)
An aptamer characterized by that. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、3’−末端にPolyA配列が付加された、下記のII-4’の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
(II-4’) TNF-100+(A)24
5’-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3’ （配列番号：１１）
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule consisting of the following II-4 ′ base sequence with a PolyA sequence added to the 3′-end:
(II-4 ') TNF-100 + (A) 24
5'-GGAAGACCAGCCUUAAGAGGG
AUAAGUUCGGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCCGGAACGUGAC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3 '(SEQ ID NO: 11)
An aptamer characterized by that. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、3’−末端にPolyA配列が付加された、下記のIII’の塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子である
(III’) TNF-m013+(A)24
5’-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3’ （配列番号：１２）
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule consisting of the following III ′ base sequence with a PolyA sequence added to the 3′-end:
(III ') TNF-m013 + (A) 24
5'-GGAUCACCGGCCCAAAGCCUAGACCUAGGGGCUAUAAAUAC
CUAGUAUCC
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAA-3 '(SEQ ID NO: 12)
An aptamer characterized by that. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法であって、
該選別方法は、下記の工程１と工程２とを具えており、
（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法によって、前記第一のモチーフ配列と第二のモチーフ配列に相当する、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる
ことを特徴とするアプタマーの選別方法。 A method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α, comprising:
The screening method includes the following step 1 and step 2,
(Process 1)
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), a first partial base sequence and a second motif sequence: 5 ′ corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, respectively. -Selecting a single-stranded RNA molecule comprising a second partial base sequence corresponding to CUAGACAGG-3 'to create a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules, Sorting process;
(Process 2)
From the partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule, comprising two partial base sequences corresponding to the first motif sequence and the second motif sequence based on the binding ability to human TNF-α, A second selection step of selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α;
According to the selection method, an RNA aptamer having two partial base sequences corresponding to the first motif sequence and the second motif sequence and capable of binding to human TNF-α is selected. Aptamer selection method. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する方法であって、
該選別方法は、下記の工程１と工程２とを具えており、
（工程１）
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーを作製する、第一の選別工程；
（工程２）
前記第一の候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーから、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能に基づき、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーを選別する、第二の選別工程；
該選別方法によって、前記第三のモチーフ配列、第四のモチーフ配列と同じ、二つの部分塩基配列を具え、ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別がなされる
ことを特徴とするアプタマーの選別方法。 A method for selecting an RNA aptamer capable of binding to human TNF-α, comprising:
The screening method includes the following step 1 and step 2,
(Process 1)
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), the third partial base sequence and the fourth motif sequence: 5′-, which are the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, respectively. A first selection step of selecting a single-stranded RNA molecule containing the fourth partial base sequence, which is the same as CUAGAC-3 ′, and creating a partial library of first candidate single-stranded RNA molecules ;
(Process 2)
From the partial library of the first candidate single-stranded RNA molecule, based on the binding ability to human TNF-α, comprising two partial base sequences that are the same as the third motif sequence and the fourth motif sequence, A second selection step of selecting RNA aptamers capable of binding to TNF-α;
An aptamer characterized in that, by the selection method, an RNA aptamer having two partial base sequences, which are the same as the third motif sequence and the fourth motif sequence, and capable of binding to human TNF-α is selected. Sorting method. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別に利用される、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーであって、
該部分ライブラリーは、
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである
ことを特徴とする候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー。 A partial library of candidate single-stranded RNA molecules used to select RNA aptamers capable of binding to human TNF-α,
The partial library is
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), a first partial base sequence and a second motif sequence: 5 ′ corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′, respectively. -A candidate single-stranded RNA molecule characterized in that it is a partial library prepared by selecting a single-stranded RNA molecule containing a second partial base sequence corresponding to CUAGACAGG-3 ' Partial library. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーの選別に利用される、候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリーであって、
該部分ライブラリーは、
下記の５’末端の固定領域と３’末端の固定領域、それに挟まれる、５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）中から、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）
５１塩基長のランダム配列部分：（Ｎ51）；
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）
前記５１塩基長のランダム配列部分（Ｎ51）中に、それぞれ、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでいる、一本鎖ＲＮＡ分子を選択して、作製される部分ライブラリーである
ことを特徴とする候補一本鎖ＲＮＡ分子の部分ライブラリー。 A partial library of candidate single-stranded RNA molecules used to select RNA aptamers capable of binding to human TNF-α,
The partial library is
Random single-stranded RNA molecule live consisting of a single-stranded RNA molecule with a 51-base-long random sequence portion (N 51 ) sandwiched between the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region described below From the rally (RNA pool)
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29)
51 base-long random sequence portion: (N 51 );
Fixed region at the 3 ′ end: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30)
In the 51 base-long random sequence portion (N 51 ), the third partial base sequence and the fourth motif sequence: 5′-, which are the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, respectively. A partial live of a candidate single-stranded RNA molecule, which is a partial library prepared by selecting a single-stranded RNA molecule containing the fourth partial base sequence, the same as CUAGAC-3 ′ Rally. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a 51-base sequence portion sandwiched between the 5′-end and 3′-end fixed regions,
In the 51 base-length sequence portion, the first motif sequence: corresponding to 5′-UUUUCACCGG-3 ′, the second partial motif sequence: corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ Including a second partial base sequence,
An aptamer characterized in that, in the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the first partial base sequence and the second partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、５１塩基長の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記５１塩基長の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a 51-base sequence portion sandwiched between the 5′-end and 3′-end fixed regions,
In the 51 base-length sequence portion, the third motif sequence: the same as 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence, and the fourth motif sequence: the same as 5′-CUAGAC-3 ′, Containing the fourth partial base sequence,
An aptamer characterized in that, in the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the third partial base sequence and the fourth partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a sequence portion of an intermediate region sandwiched between the fixed region at the 5 ′ end and the fixed region at the 3 ′ end;
In the sequence part of the intermediate region, the first partial nucleotide sequence corresponding to the first motif sequence: 5′-UUUUCACCGG-3 ′ and the second motif sequence: corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ A second partial base sequence,
An aptamer characterized in that, in the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the first partial base sequence and the second partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
５’末端の固定領域：GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G；（２１塩基） （配列番号：２９）と、
３’末端の固定領域：CUAGU AUCCG GAACG UGAC；（１９塩基） （配列番号：３０）と、
前記５’末端の固定領域と３’末端の固定領域に挟まれる、中間領域の配列部分を具えた一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記中間領域の配列部分中に、第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでおり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
5 'terminal fixed region: GGAAG ACCAG CCUUA AGAGG G; (21 bases) (SEQ ID NO: 29);
3 'terminal fixed region: CUAGU AUCCG GAACG UGAC; (19 bases) (SEQ ID NO: 30);
A single-stranded RNA molecule comprising a sequence portion of an intermediate region sandwiched between the fixed region at the 5 ′ end and the fixed region at the 3 ′ end;
In the sequence portion of the intermediate region, the same as the third motif sequence: 5′-UCACCGG-3 ′, the third partial base sequence, the same as the fourth motif sequence: 5′-CUAGAC-3 ′, Contains four partial base sequences,
An aptamer characterized in that, in the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the third partial base sequence and the fourth partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
第一のモチーフ配列：５’−UUUUCACCGG−３’に相当する、第一の部分塩基配列と、第二のモチーフ配列：５’−CUAGACAGG−３’に相当する、第二の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第一の部分塩基配列と第二の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
First motif sequence: includes a first partial base sequence corresponding to 5′-UUUUCACCGG-3 ′, and a second motif sequence: second partial base sequence corresponding to 5′-CUAGACAGG-3 ′ A single-stranded RNA molecule consisting of a base sequence consisting of
An aptamer characterized in that, in the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the first partial base sequence and the second partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure. ヒトＴＮＦ−αに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
該ＲＮＡアプタマーは、
第三のモチーフ配列：５’−UCACCGG−３’と同じ、第三の部分塩基配列と、第四のモチーフ配列：５’−CUAGAC−３’と同じ、第四の部分塩基配列を含んでなる塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡ分子であり、
前記一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造中において、前記第三の部分塩基配列と第四の部分塩基配列は、内部ループ構造を構成する要素として存在している
ことを特徴とするアプタマー。 An RNA aptamer capable of binding to human TNF-α,
The RNA aptamer is
Third motif sequence: same as 5′-UCACCGG-3 ′, third partial base sequence, and fourth motif sequence: same as 5′-CUACCAC-3 ′, fourth partial base sequence A single-stranded RNA molecule consisting of a base sequence,
An aptamer characterized in that, in the secondary structure of the single-stranded RNA molecule, the third partial base sequence and the fourth partial base sequence are present as elements constituting an internal loop structure.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014531031A (en) * 2011-10-21 2014-11-20 デシマドックス， エルエルシー Point-of-care immunoassay for quantitative detection of small analytes
JPWO2013141291A1 (en) * 2012-03-23 2015-08-03 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 Streptavidin analysis device and analysis method
US9880174B2 (en) 2012-03-23 2018-01-30 Nec Solution Innovators, Ltd. Device and method for analyzing target
WO2018079864A1 (en) * 2016-10-24 2018-05-03 김성천 TNF-α-BINDING APTAMER, AND THERAPEUTIC USE FOR SAME
JP2019041672A (en) * 2017-09-01 2019-03-22 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 Nucleic acid molecules and uses thereof
WO2019203904A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Academia Sinica Tnf-targeting aptamers and uses thereof for treatment or diagnosing tnf-related inflammatory diseases

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11506756A (en) * 1995-06-07 1999-06-15 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド Capped synthetic RNAs, analogs and aptamers
JP2005130855A (en) * 2003-10-06 2005-05-26 National Institute Of Advanced Industrial & Technology Method for detecting influenza virus
JP2006516288A (en) * 2003-01-21 2006-06-29 アーケミックス コーポレイション Aptamer therapeutics useful in ophthalmic drug therapy
JP2007501615A (en) * 2003-08-08 2007-02-01 （オーエスアイ）アイテツク・インコーポレーテツド 5'- and 3'-capped aptamers and their use
JP2007513618A (en) * 2003-12-11 2007-05-31 シト トゥールス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Anti-apoptotic active aptamer
JP2007129992A (en) * 2005-11-14 2007-05-31 Univ Of Tokyo Ribonucleic acid binding to runt domain
JP2007525177A (en) * 2003-04-21 2007-09-06 アーケミックス コーポレイション Stabilized aptamers against platelet-derived growth factor and their use as tumor therapeutics
JP2007532662A (en) * 2004-04-13 2007-11-15 （オーエスアイ）アイテツク・インコーポレーテツド Nucleic acid aptamers conjugated to high molecular weight steric groups
WO2008059877A1 (en) * 2006-11-14 2008-05-22 Ribomic Inc. Aptamer against midkine and use thereof
JP2008167688A (en) * 2007-01-11 2008-07-24 Ribomic Inc Ribonucleic acid combined with mtg8 taf domain

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11506756A (en) * 1995-06-07 1999-06-15 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド Capped synthetic RNAs, analogs and aptamers
JP2006516288A (en) * 2003-01-21 2006-06-29 アーケミックス コーポレイション Aptamer therapeutics useful in ophthalmic drug therapy
JP2007525177A (en) * 2003-04-21 2007-09-06 アーケミックス コーポレイション Stabilized aptamers against platelet-derived growth factor and their use as tumor therapeutics
JP2007501615A (en) * 2003-08-08 2007-02-01 （オーエスアイ）アイテツク・インコーポレーテツド 5'- and 3'-capped aptamers and their use
JP2005130855A (en) * 2003-10-06 2005-05-26 National Institute Of Advanced Industrial & Technology Method for detecting influenza virus
JP2007513618A (en) * 2003-12-11 2007-05-31 シト トゥールス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Anti-apoptotic active aptamer
JP2007532662A (en) * 2004-04-13 2007-11-15 （オーエスアイ）アイテツク・インコーポレーテツド Nucleic acid aptamers conjugated to high molecular weight steric groups
JP2007129992A (en) * 2005-11-14 2007-05-31 Univ Of Tokyo Ribonucleic acid binding to runt domain
WO2008059877A1 (en) * 2006-11-14 2008-05-22 Ribomic Inc. Aptamer against midkine and use thereof
JP2008167688A (en) * 2007-01-11 2008-07-24 Ribomic Inc Ribonucleic acid combined with mtg8 taf domain

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6014023054; Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌ．４６, 1995, ｐｐ．１３５-１４１ *
JPN6014023055; ＡＲＣＨＩＶＥＳ　ＯＦ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＡＮＤ　ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＳ ｖｏｌ．２９６　ｎｏ．１, 1992, ｐｐ．１３７-１４３ *
JPN6014023059; Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．３５, 1996, ｐｐ．８２１６-８２２５ *
JPN6014023060; ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ｖｏｌ．２６８　ｎｏ．１７, 1993, ｐｐ．１２５２６-１２５２９ *
JPN6014023061; 平成２０年度地球シミュレータ産業戦略利用プログラム利用成果報告書 , 2009, ｐｐ．１１３-１２１ *
JPN6014023062; Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌ．１６９, 1994, ｐｐ．９３-９９ *
JPN6015004413; ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ｖｏｌ．２７５　ｎｏ．２８, 2000, ｐｐ．２１２８７-２１２９４ *
JPN6015004415; Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．４１, 2002, ｐｐ．２４９２-２４９９ *
JPN6015004416; Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ ｖｏｌ．１００５, 2003, ｐｐ．１２３-１３０ *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014531031A (en) * 2011-10-21 2014-11-20 デシマドックス， エルエルシー Point-of-care immunoassay for quantitative detection of small analytes
JP2017138325A (en) * 2011-10-21 2017-08-10 デシマドックス， エルエルシー Point-of-care immunoassay for quantitative detection of small analytes
JPWO2013141291A1 (en) * 2012-03-23 2015-08-03 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 Streptavidin analysis device and analysis method
US9880174B2 (en) 2012-03-23 2018-01-30 Nec Solution Innovators, Ltd. Device and method for analyzing target
US9880161B2 (en) 2012-03-23 2018-01-30 Nec Solution Innovators, Ltd. Device and method for analyzing streptavidin
US11028395B2 (en) 2016-10-24 2021-06-08 Biois Co., Ltd. TNF-alpha-binding aptamer, and therapeutic use for same
WO2018079864A1 (en) * 2016-10-24 2018-05-03 김성천 TNF-α-BINDING APTAMER, AND THERAPEUTIC USE FOR SAME
JP2019041672A (en) * 2017-09-01 2019-03-22 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 Nucleic acid molecules and uses thereof
WO2019203904A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Academia Sinica Tnf-targeting aptamers and uses thereof for treatment or diagnosing tnf-related inflammatory diseases
CN112567037A (en) * 2018-04-20 2021-03-26 中央研究院 TNF targeting aptamer for treating or diagnosing TNF related inflammatory diseases and application thereof
EP3781688A4 (en) * 2018-04-20 2021-06-23 Academia Sinica Tnf-targeting aptamers and uses thereof for treatment or diagnosing tnf-related inflammatory diseases
TWI733071B (en) * 2018-04-20 2021-07-11 中央研究院 Tnf-targeting aptamers and uses thereof for treatment or diagnosing tnf-related inflammatory diseases
JP2021521806A (en) * 2018-04-20 2021-08-30 中央研究院Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ TNF-directed aptamers and their use for treating or diagnosing TNF-related inflammatory diseases
US11447778B2 (en) 2018-04-20 2022-09-20 Academia Sinica TNF-targeting aptamers and uses thereof for treatment or diagnosing TNF-related inflammatory diseases
JP7397446B2 (en) 2018-04-20 2023-12-13 中央研究院 TNF-directed aptamers and their uses for treating or diagnosing TNF-related inflammatory diseases

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