JP2011153096A - Fluorescent sugar-chain probe - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、凝集誘起発光特性を有する蛍光性糖鎖プローブとその製造方法、およびその蛍光性糖鎖プローブを用いたウイルス及び／又は毒素等の糖鎖結合能評価方法に関する。 The present invention relates to a fluorescent sugar chain probe having aggregation-induced luminescence characteristics, a method for producing the same, and a method for evaluating the ability to bind sugar chains such as viruses and / or toxins using the fluorescent sugar chain probe.
近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。 In recent years, research on sugar chains has progressed rapidly, and the search for industrial use has also been promoted. In particular, new facts about the involvement of sugar chains in cell differentiation, canceration, immune reaction, etc. are being revealed. For example, sugar chains on the cell surface are involved in important processes such as cell differentiation, canceration, and immune reaction in vivo by interacting with proteins and lipids. In addition, it has become clear that sugar chains play an important role in cell recognition, adhesion and signal transduction in the cell surface layer.
重症急性呼吸器症候群（SARS）、エイズ、ならびに、インフルエンザ等の感染性ウイルス、O-157など病原性微生物が生産するタンパク質毒素（ベロ毒素、コレラ毒素、炭素菌毒素等）、BSEプリオン蛋白質による感染症が大きな社会問題となっている。これらウイルスや毒素は、ホスト細胞の表面を被う特定の糖鎖を認識して結合することで、ヒトに感染することが知られている。このことは、糖鎖がウイルスの感染予防薬や毒素の捕捉材料、或いは検出用のプローブとして機能することを意味している。 Severe acute respiratory syndrome (SARS), AIDS, and infectious viruses such as influenza, protein toxins produced by pathogenic microorganisms such as O-157 (verotoxin, cholera toxin, carbon fungus toxin, etc.), infection by BSE prion protein Is a major social problem. These viruses and toxins are known to infect humans by recognizing and binding to specific sugar chains covering the surface of host cells. This means that the sugar chain functions as a virus infection preventive agent, a toxin capturing material, or a detection probe.
糖鎖の生体内における様々な重要なプロセスにおけるメカニズムを分子レベルで解析しようと、糖鎖アレイが利用されている。例えば、24種類の糖脂質をブチルシランでコーティングしたスライドガラス上にスポットし、糖脂質の脂質部分とガラス表面の疎水的相互作用を利用して固定化した糖脂質アレイがタカラバイオ株式会社より販売されている。また、酵素、レクチンなどの生体物質と基質アナログ、オリゴ糖鎖間の親和力を評価する方法として、ビアコアがよく用いられているが、いずれも測定精度、簡便さ、あるいは経済性などの点が問題である。 Glycan arrays are used to analyze the mechanisms of various important processes in the body of a sugar chain at the molecular level. For example, Takara Bio Co., Ltd. sells a glycolipid array in which 24 types of glycolipids are spotted on a glass slide coated with butylsilane and immobilized using the hydrophobic interaction between the lipid portion of the glycolipid and the glass surface. ing. In addition, Biacore is often used as a method for evaluating the affinity between biological substances such as enzymes and lectins, substrate analogs, and oligosaccharide chains. However, all have problems with measurement accuracy, simplicity, and economy. It is.
また、近年、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー（非特許文献１）やエバネッセント波励起型レクチンアレイシステム（非特許文献２）が開発された。エバネッセント波励起型レクチンアレイシステムは、DNA アレイや抗体アレイで行われている洗浄工程が不要で結合力が比較的弱い糖鎖とレクチン間の結合力を検出することができる。しかしながら、これらは測定精度や測定の簡便さは向上したものの、糖鎖との相互作用を検出するリガンドをカラム担体やアレイへ固定化する必要があることや経済性の問題がある。 In recent years, frontal affinity chromatography (Non-patent Document 1) and evanescent wave excitation type lectin array system (Non-patent Document 2) have been developed. The evanescent wave-excited lectin array system can detect the binding force between a sugar chain and a lectin having a relatively weak binding force without the washing step performed in a DNA array or antibody array. However, these have improved measurement accuracy and ease of measurement, but have a problem in that it is necessary to immobilize a ligand for detecting an interaction with a sugar chain on a column carrier or an array, and in terms of economy.
現在用いられている酵素、レクチンなどの生体物質や毒素、又はウイルスと糖鎖の相互作用を検出する方法では、洗浄工程により弱い結合を検出しにくいという問題や、分析対象となるリガンドをカラム担体やアレイへの固定化する工程が煩雑であるという問題や、高価な測定機器が必要であるといった経済性の問題がある。このような背景から、簡便でかつ安価な糖鎖との相互作用検出技術の開発が強く望まれている。 The currently used methods for detecting biological substances such as enzymes, lectins, and toxins, or the interaction between viruses and sugar chains are difficult to detect weak bonds in the washing process, and the ligand to be analyzed is a column carrier. In addition, there is a problem that the process of fixing to the array is complicated, and there is an economical problem that an expensive measuring instrument is required. From such a background, development of a simple and inexpensive technique for detecting an interaction with a sugar chain is strongly desired.
そこで、本発明の課題は、糖鎖との相互作用を高感度に簡便かつ安価に測定する方法及び、その測定のために用いる蛍光性糖鎖プローブの製造方法、更には、特定の糖鎖に特異的に結合するウイルスや細菌毒素の検出方法を提供することとした。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for easily and inexpensively measuring the interaction with a sugar chain, a method for producing a fluorescent sugar chain probe used for the measurement, and a specific sugar chain. It was decided to provide a method for detecting specifically bound viruses and bacterial toxins.
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、凝集誘起発光特性を有する化合物に糖鎖を結合させることで、結合させた糖鎖との相互作用を高感度でありながら、簡便かつ安価に分析できることを見出し、本発明を完成するに到った。 As a result of extensive research, the present inventor can analyze the interaction with the bound sugar chain easily and inexpensively by binding the sugar chain to a compound having aggregation-induced emission characteristics. As a result, the present invention has been completed.
本発明の特徴の一つは、蛍光性化合物と1以上の単糖又は糖鎖が結合してなる蛍光性糖鎖プローブである。 One of the features of the present invention is a fluorescent sugar chain probe formed by binding a fluorescent compound to one or more monosaccharides or sugar chains.
本発明の別の特徴の一つは、蛍光性化合物と1以上の単糖又は糖鎖が、トリアゾール環を含むスペーサーを介して結合してなる、上記の蛍光性糖鎖プローブである。 Another feature of the present invention is the above-described fluorescent sugar chain probe in which a fluorescent compound and one or more monosaccharides or sugar chains are bound via a spacer containing a triazole ring.
本発明の別の特徴の一つは、蛍光性化合物と２以上の単糖又は糖鎖が結合してなる、上記の蛍光性糖鎖プローブである。 Another feature of the present invention is the above-described fluorescent sugar chain probe formed by binding a fluorescent compound and two or more monosaccharides or sugar chains.
本発明の別の特徴の一つは、式（Ｉ）：（Ｇ１）ｘ（Ｇ２）ｙ（Ｇ３）ｚ−Ｌ−Ｎ3［式中、（Ｇ１）ｘ、（Ｇ２）ｙ及び（Ｇ３）ｚは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体が互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており、ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、；（Ｇ１）ｘと（Ｇ２）ｙ、及び、（Ｇ２）ｙと（Ｇ３）ｚもまた互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2）ｍ−、−Ｓ−（ＣＨ2）ｍ−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2）ｍ−から選択される連結基であり、ｍは８〜２０の整数である］で表される糖鎖とトリアゾール環を含む置換基が、蛍光性化合物に結合してなる、上記の蛍光性糖鎖プローブである。 One another aspect of the present invention have the formula (I) :( G1) x ( G2) y (G3) z-L-N 3 [ wherein, (G1) x, (G2 ) y and (G3) z is independently a glycosidic bond such that a monosaccharide residue or derivative thereof having a cyclic structure forms a sugar chain with each other, and x, y, and z are each independently an integer of 0 to 10 And (G1) x and (G2) y, and (G2) y and (G3) z are also glycoside-bonded to form a sugar chain with each other; L is —O— (CH 2 ) m -, - S- (CH 2 ) m-, and -NH- (CH 2) a linking group selected from m-, sugar m is represented by a is] 8-20 integer triazole In the above fluorescent sugar chain probe, a substituent containing a ring is bonded to a fluorescent compound.
本発明の別の特徴の一つは、前記糖鎖が、動物細胞に糖鎖プライマーを加えて培養することで得られ、該糖鎖プライマーが、アジド基を有したアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物である、上記の蛍光性糖鎖プローブである。 Another feature of the present invention is that the sugar chain is obtained by adding a sugar chain primer to an animal cell and culturing, and the sugar chain primer converts an alkyl chain having an azide group into an oligosaccharide chain. This is a fluorescent sugar chain probe, which is a bound compound.
本発明の別の特徴の一つは、前記糖鎖が、複数の同一または異なる種類の糖鎖を含む、上記の蛍光性糖鎖プローブである。 Another feature of the present invention is the fluorescent sugar chain probe described above, wherein the sugar chain includes a plurality of the same or different types of sugar chains.
本発明の別の特徴の一つは、前記糖鎖が、ラクトース、α2,3−シアリルラクトース、及び、α2,6−シアリルラクトースからなる群から選ばれる１以上の糖鎖である、上記の蛍光性糖鎖プローブである。 Another feature of the present invention is that the sugar chain is one or more sugar chains selected from the group consisting of lactose, α2,3-sialyllactose, and α2,6-sialyllactose. It is a sex sugar chain probe.
本発明の別の特徴の一つは、前記蛍光性化合物がテトラフェニルエチレンを基本骨格として有する蛍光性化合物である、上記の蛍光性糖鎖プローブである。 Another feature of the present invention is the fluorescent sugar chain probe as described above, wherein the fluorescent compound is a fluorescent compound having tetraphenylethylene as a basic skeleton.
本発明の別の特徴の一つは、上記の蛍光性糖鎖プローブを用いたウイルス及び／又は毒素の検出方法である。 Another feature of the present invention is a method for detecting viruses and / or toxins using the fluorescent sugar chain probe.
本発明の別の特徴の一つは、上記の蛍光性糖鎖プローブを用いて、シアル酸の結合様式の違いによるウイルス及び／又は毒素の結合能を評価する方法である。 Another feature of the present invention is a method for evaluating the binding ability of a virus and / or a toxin due to the difference in the binding mode of sialic acid, using the fluorescent sugar chain probe.
本発明の別の特徴の一つは、上記の蛍光性糖鎖プローブを用いて、ウイルス及び／又は毒素のヒトへの感染性及び／又は毒性を評価する方法である。 Another feature of the present invention is a method for evaluating the infectivity and / or toxicity of a virus and / or toxin to a human using the fluorescent sugar chain probe.
本発明の別の特徴の一つは、上記の蛍光性糖鎖プローブを用いて、ウイルス及び／又は毒素と糖鎖の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法である。 Another feature of the present invention is a method for screening a compound that inhibits the binding of a virus and / or toxin to a sugar chain, using the fluorescent sugar chain probe.
本発明の別の特徴の一つは、蛍光性糖鎖化合物に、糖鎖を合成する酵素を作用させて糖鎖を伸長させることにより作製することを特徴とする、上記の蛍光性糖鎖プローブの製造方法である。 Another feature of the present invention is that the fluorescent sugar chain probe is produced by extending a sugar chain by allowing an enzyme that synthesizes a sugar chain to act on the fluorescent sugar chain compound. It is a manufacturing method.
本発明を適用することによって、糖鎖との相互作用を高感度でありながら、簡便かつ安価に分析できることができる。本発明の蛍光性糖鎖プローブを用いた糖鎖との相互作用解析においては、洗浄工程がないため、比較的弱い結合も検出できる特徴を有する。よって、糖鎖とレクチンのような比較的弱い結合の検出に非常に効果的に使用できる。また、本発明は、ヒト型糖鎖を導入した蛍光性糖鎖プローブを用いることにより毒素のヒトへの毒性の評価や、あるいは、α2,6結合のシアル酸とα2,3結合のシアル酸への結合力を比較することで、ウイルスのヒトへの感染性の評価をする上で非常に有用であると考えられる。また、ウイルスや毒素と糖鎖の結合を阻害する化合物をスクリーニングするのに有用なものである。 By applying the present invention, the interaction with a sugar chain can be analyzed easily and inexpensively with high sensitivity. In the interaction analysis with the sugar chain using the fluorescent sugar chain probe of the present invention, since there is no washing step, it has a feature that a relatively weak bond can be detected. Therefore, it can be used very effectively to detect relatively weak bonds such as sugar chains and lectins. In addition, the present invention uses a fluorescent sugar chain probe into which a human-type sugar chain is introduced to evaluate the toxicity of a toxin to humans, or to α2,6-linked sialic acid and α2,3-linked sialic acid. It is thought that it is very useful in evaluating the infectivity of a virus to humans by comparing the binding strength of each other. It is also useful for screening compounds that inhibit the binding of viruses and toxins to sugar chains.
以下、本発明の実施の形態について説明する。 Embodiments of the present invention will be described below.
本発明の蛍光性糖鎖プローブは、テトラフェニルエチレンやホスホールオキシド化合物など凝集することにより蛍光が誘起される化合物に、ウイルスや毒素など糖鎖に特異的に結合する糖鎖を導入したものである。テトラフェニルエチレンは、Org. Lett., 10, 4581-4584, 2008.（Liu, L.ら）や、Chem. Commun., 2006, 3705-3707.（Tong, H.ら）に記載の公知の化合物である。ホスホールオキシド化合物は、Appl. Mater. Interfaces. 1, 270-273, 2009. （Sanji, T.ら）に記載の公知の化合物である。 The fluorescent sugar chain probe of the present invention is a compound in which a sugar chain that specifically binds to a sugar chain, such as a virus or a toxin, is introduced into a compound that induces fluorescence by aggregation such as tetraphenylethylene or a phosphoroxide compound. is there. Tetraphenylethylene is a known compound described in Org. Lett., 10, 4581-4584, 2008. (Liu, L. et al.) And Chem. Commun., 2006, 3705-3707. (Tong, H. et al.). A compound. The phosphole oxide compound is a known compound described in Appl. Mater. Interfaces. 1, 270-273, 2009. (Sanji, T. et al.).
導入する糖鎖としては、ベロ毒素と結合するＧｂ３、コレラ毒素と結合するＧＭ１、破傷風毒素と結合するＧＤ1ｂ、ボツリヌス毒素と結合するＧＴ１ｂやＧＱ１ｂ、ウエルシュ菌のデルタ毒素と結合するＧＭ２、或いは、ヒトインフルエンザウイルスと結合するα2,6結合のシアル酸、トリインフルエンザウイルスと結合するα2,3結合のシアル酸、ノロウイルスと結合する血液型抗原であるH(O)、A、Leb型抗原などが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものではない。 Examples of sugar chains to be introduced include Gb3 that binds to verotoxin, GM1 that binds to cholera toxin, GD1b that binds to tetanus toxin, GT1b and GQ1b that bind to botulinum toxin, GM2 that binds to delta toxin of Clostridium perfringens, or human include α2,6 bond of sialic acid to bind to the influenza virus, sialic acid binding α2,3 bond with avian influenza virus is a blood group antigens that bind norovirus H (O), a, etc. Le b antigens are However, it is not necessarily limited to these.
テトラフェニルエチレンなどの凝集誘起発光特性を有する化合物に糖鎖を導入する方法としては、公知の方法で人工的に合成することもできるが、糖鎖プライマー法により合成される糖鎖化合物を用いることや、予め１つ以上の糖を導入しておき糖鎖を合成する酵素により糖を付加することにより、より複雑な糖鎖を導入することが可能である。 As a method for introducing a sugar chain into a compound having aggregation-induced emission characteristics such as tetraphenylethylene, it can be synthesized artificially by a known method, but a sugar chain compound synthesized by a sugar primer method is used. Alternatively, it is possible to introduce more complex sugar chains by introducing one or more sugars in advance and adding the sugar with an enzyme that synthesizes sugar chains.
糖鎖プライマー法により合成される糖鎖化合物は、アグリコンにアジド基が導入されているため、アルキン基を持つ凝集誘起発光性化合物を合成すれば、クリックケミストリーやStaudinger反応により、容易に蛍光性糖鎖プローブを作製することができる。 Since glycan compounds synthesized by the saccharide primer method have an azide group introduced in the aglycon, if an aggregation-inducing luminescent compound having an alkyne group is synthesized, it can be easily synthesized by click chemistry or Staudinger reaction. Chain probes can be made.
糖鎖プライマー法による糖鎖合成は、動物細胞を糖鎖が得られるような条件下にて培養することで行うことができる。動物細胞は特に限定されず、所望の糖鎖化合物の種類に応じて様々な動物細胞が用いられ得る。動物細胞の例としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、特にＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞などが好適に用いられ得る。培養は、通常の動物細胞の培養条件に従って行う。 Sugar chain synthesis by the sugar chain primer method can be performed by culturing animal cells under conditions such that sugar chains can be obtained. Animal cells are not particularly limited, and various animal cells can be used depending on the type of the desired sugar chain compound. Examples of animal cells include mammalian cells such as human origin, mouse origin, monkey origin, rat origin and the like, in particular B16 mouse melanoma cells, rat PC12 cells, mouse Neuro2a cells, rat RBL-2H3 cells, human MOLT- 4 cells, human HL-60 cells, monkey kidney-derived Vero cells and the like can be suitably used. Culturing is performed according to normal animal cell culture conditions.
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間で血清が加えられたＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培養培地で前培養した後、無血清の糖鎖プライマーを添加した培地に置換してさらに培養を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。 The conditions under which the sugar chain compound can be obtained include, for example, DMEM / F12 in which serum is added to the above animal cells at a temperature between room temperature and 45 ° C. for a period of 1 hour to 70 hours, etc. For example, after pre-culturing in the above-mentioned culture medium, the medium is replaced with a medium supplemented with serum-free sugar chain primers, followed by further culturing and performing a sugar chain elongation reaction.
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：（Ｇ１）ｘ（Ｇ２）ｙ（Ｇ３）ｚ−Ｌ−Ｎ3［式中、（Ｇ１）ｘ、（Ｇ２）ｙ及び（Ｇ３）ｚは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体が互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており、ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、；（Ｇ１）ｘと（Ｇ２）ｙ、及び、（Ｇ２）ｙと（Ｇ３）ｚもまた互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2）ｍ−、−Ｓ−（ＣＨ2）ｍ−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2）ｍ−から選択される連結基であり、ｍは８〜２０の整数である］で表される化合物が挙げられる。ここで、式中の単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。式中のｘ、ｙ、及びｚは、好ましくは０〜５の整数、さらに好ましくは０〜３の整数であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。式中のｍは、好ましくは８〜１６の整数、特に好ましくは１２である。 Here, the sugar chain primer can be arbitrarily selected depending on the cell type used and the desired sugar chain structure. Examples of preferred sugar chain primers include the formula (I): (G1) x (G2) y (G3) z-LN 3 [wherein (G1) x, (G2) y and (G3) z are Each independently has a glycosidic bond so that a monosaccharide residue or derivative thereof having a cyclic structure forms a sugar chain with each other, and x, y, and z are each independently an integer of 0 to 10, (G1) x and (G2) y, and (G2) y and (G3) z are also glycoside-bonded to form a sugar chain with each other; L is —O— (CH 2 ) m— , —S— (CH 2 ) m—, and —NH— (CH 2 ) m—, wherein m is an integer of 8 to 20.]. Here, the monosaccharide in the formula is not limited, but it is preferable to use pentose and hexose. Either aldose or ketose can be used. X, y, and z in the formula are preferably integers of 0 to 5, more preferably integers of 0 to 3, and all of x, y, and z are not 0 at the same time. M in the formula is preferably an integer of 8 to 16, particularly preferably 12.
このような糖鎖プライマーを各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。付加される糖は、細胞により異なる。 When such a sugar chain primer is added to the culture medium of various cells and the cells are cultured, the cells take up the primer, add sugar to the sugar chain part to glycosylate, and introduce the sugar addition product into the cell. Secretes extracellularly without accumulating. The added sugar varies depending on the cell.
得られる細胞培養物または細胞培養物から細胞を除いた上清は、糖鎖プライマーから伸長して得られた生成物である糖鎖を含有する。この細胞培養物または細胞培養物の上清をそのまま、あるいは上清を固体吸着剤等と接触させるなどして濃縮および／または精製工程に供した後に、クリックケミストリーライゲーション反応により本発明の蛍光性糖鎖プローブの作製に使用することができる。 The resulting cell culture or the supernatant obtained by removing cells from the cell culture contains a sugar chain that is a product obtained by extending from the sugar chain primer. The cell culture or the supernatant of the cell culture is used as it is or after it is subjected to a concentration and / or purification step by contacting the supernatant with a solid adsorbent or the like, and then subjected to a click chemistry ligation reaction to perform the fluorescent sugar of the present invention. It can be used to create a chain probe.
アジド基とアルキン基との反応は、クリックケミストリーライゲーション反応において行い得る。例えば、Ｃｕ（ＰＰｈ3）3Ｂｒを触媒として用いる方法や、電子線照射による方法等が知られており、好適に用いることができる。 The reaction between an azide group and an alkyne group can be performed in a click chemistry ligation reaction. For example, a method using Cu (PPh 3 ) 3 Br as a catalyst and a method using electron beam irradiation are known and can be suitably used.
より詳細には、トリアゾール環が形成されるように、還流溶媒（トルエン等）中において生成物がもたらされるのに充分な時間（例えば、３０〜４０時間）にてアジド基とアルキン基とを反応させる方法を例示できる。反応混合物に触媒（銅等）を添加することによって、反応を室温にて水性溶媒中で進行させ、トリアゾール環を有する生成物を得ることができる。用いる触媒（銅等）としてＣｕ（ＩＩ）を好適に用いることができる。Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下で触媒量のＣｕ（ＩＩ）を添加する方法により、反応は好適に触媒される。Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤には、アスコルビン酸塩、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ１、グルタチオン、システイン、Ｆｅ2+、Ｃｏ2+、印加電位、および、金属等が含まれ、これらを好適に組み合わせて用いることもできる。金属としては、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、および、Ｚｎからなる群より選択される１以上の金属が挙げられ、これらの金属は特に好ましい還元剤として好適に用いることができる。 More specifically, the azide group and alkyne group are reacted in a refluxing solvent (such as toluene) for a time sufficient to provide the product (eg, 30-40 hours) so that a triazole ring is formed. The method of making it can be illustrated. By adding a catalyst (such as copper) to the reaction mixture, the reaction can proceed in an aqueous solvent at room temperature to obtain a product having a triazole ring. Cu (II) can be suitably used as a catalyst (copper or the like) to be used. The reaction is suitably catalyzed by a method in which a catalytic amount of Cu (II) is added in the presence of a reducing agent to reduce Cu (II) to Cu (I). Reducing agents for reducing Cu (II) to Cu (I) include ascorbate, copper metal, quinone, hydroquinone, vitamin K1, glutathione, cysteine, Fe 2+ , Co 2+ , applied potential, and A metal etc. are contained and these can also be used in suitable combination. Examples of the metal include one or more metals selected from the group consisting of Al, Be, Co, Cr, Fe, Mg, Mn, Ni, and Zn, and these metals are suitably used as particularly preferable reducing agents. be able to.
アジド基とアルキン基とのクリックケミストリーライゲーション反応は、金属銅と接触している溶液中で反応を行うことによっても触媒され得る。金属銅は、そのクリックケミストリーライゲーション反応に対する触媒作用に直接的または間接的に寄与する。好ましい方式では、前記溶液は、水溶液である。この場合アジド基を有する糖鎖とアルキン基を有する反応化合物とは、等モル量で存在しうる。 The click chemistry ligation reaction between an azide group and an alkyne group can also be catalyzed by conducting the reaction in a solution in contact with metallic copper. Metallic copper contributes directly or indirectly to catalysis for its click chemistry ligation reaction. In a preferred manner, the solution is an aqueous solution. In this case, the sugar chain having an azide group and the reaction compound having an alkyne group can be present in equimolar amounts.
あるいは、アジド基とアルキン基とのクリックケミストリーライゲーション反応は、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、ＲｈおよびＷから成る群より選択される金属のイオンを有する触媒量の金属塩を添加することにより触媒される。このようなクリックケミストリーライゲーション反応は、前記金属イオンを触媒活性形に還元するための還元剤の存在下で行われる。好ましい還元剤には、アスコルビン酸塩、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ１、グルタチオン、システイン、Ｆｅ2+、Ｃｏ2+、印加電位、ならびにＡｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、ＮｉおよびＺｎから成る群より選択される金属等が含まれる。 Alternatively, the click chemistry ligation reaction between an azide group and an alkyne group may be performed using metal ions selected from the group consisting of Au, Ag, Hg, Cd, Zr, Ru, Fe, Co, Pt, Pd, Ni, Rh and W. It is catalyzed by adding a catalytic amount of a metal salt having Such a click chemistry ligation reaction is performed in the presence of a reducing agent for reducing the metal ion to a catalytically active form. Preferred reducing agents include ascorbate, quinone, hydroquinone, vitamin K1, glutathione, cysteine, Fe 2+ , Co 2+ , applied potential, and Al, Be, Co, Cr, Fe, Mg, Mn, Ni and Zn A metal selected from the group consisting of:
予め、化学合成により導入することが容易な、単糖や二糖を蛍光性化合物に導入しておき、糖鎖を合成する酵素により糖鎖を伸長させて、目的の糖鎖を持つ蛍光性糖鎖プローブを作製することもできる。糖鎖を伸長させるのに利用できる酵素として、α1,3−ガラクトース転移酵素、α1,3−N−アセチルガラクトサミン転移酵素、β1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素、β1,4−ガラクトース転移酵素、α1,2−マンノース転移酵素、フコース転移酵素、β1,4−N−アセチルグルコサミン転移酵素、α2,3−シアル酸転移酵素、α2,6−シアル酸転移酵素、α2,8−シアル酸転移酵素等の糖転移酵素や、セレブロシド硫酸基転移酵素などの硫酸基転移酵素などが挙げられる。 A fluorescent sugar having a target sugar chain is prepared by introducing a monosaccharide or disaccharide, which can be easily introduced by chemical synthesis, into a fluorescent compound in advance and then extending the sugar chain with an enzyme that synthesizes the sugar chain. Chain probes can also be made. Enzymes that can be used to extend sugar chains include α1,3-galactosyltransferase, α1,3-N-acetylgalactosaminetransferase, β1,3-N-acetylglucosaminetransferase, β1,4-galactosyltransferase, α1,2-mannose transferase, fucose transferase, β1,4-N-acetylglucosamine transferase, α2,3-sialyltransferase, α2,6-sialyltransferase, α2,8-sialyltransferase, etc. Glycosyltransferases, and sulfotransferases such as cerebroside sulfate transferase.
このようにして、式（ＩＩ）：（Ｇ１）ｘ（Ｇ２）ｙ（Ｇ３）ｚ−Ｌ−Ｘ−［式中、（Ｇ１）ｘ、（Ｇ２）ｙ及び（Ｇ３）ｚは、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体が互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており、ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、；（Ｇ１）ｘと（Ｇ２）ｙ、及び、（Ｇ２）ｙと（Ｇ３）ｚもまた互いに糖鎖を形成するようにグリコシド結合しており；Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2）ｍ−、−Ｓ−（ＣＨ2）ｍ−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2）ｍ−から選択される連結基であり、ｍは８〜２０の整数であり；Ｘはトリアゾール環を含む任意のスペーサーである］で表される糖鎖とトリアゾール環を含む置換基が、蛍光性化合物に結合した、ウイルス及び／又は毒素検出用蛍光性糖鎖プローブを調製することができる。 Thus, the formula (II): (G1) x (G2) y (G3) z-LX- [wherein (G1) x, (G2) y and (G3) z are independent of each other. And a monosaccharide residue having a cyclic structure or a derivative thereof is glycosidically bonded to each other to form a sugar chain, and x, y, and z are each independently an integer of 0 to 10; and (G1) x and (G2) y, and (G2) y and (G3) z are also glycoside-bonded to form a sugar chain with each other; L is —O— (CH 2 ) m—, —S—. (CH 2) m-, and -NH- (CH 2) a linking group selected from m-, m is 8 to 20 integer; X is an optional spacer comprising triazole ring] Table Fluorescent sugar for detecting viruses and / or toxins, in which a substituent containing a sugar chain and a triazole ring is bound to a fluorescent compound It can be prepared probe.
糖鎖との相互作用を調べるサンプルを混合した緩衝液中に０．１μＭから１ｍＭの終濃度になるように蛍光糖鎖プローブを添加して混合し、数秒から２時間反応させた後、目視により確認できる。また、蛍光光度計を用いることにより、高感度な検出や定量的な解析も可能となる。 A fluorescent sugar chain probe is added and mixed so that the final concentration of 0.1 μM to 1 mM is added to a buffer mixed with a sample to be examined for interaction with a sugar chain, reacted for several seconds to 2 hours, and then visually observed. I can confirm. Further, by using a fluorometer, highly sensitive detection and quantitative analysis are possible.
なお、反応液を調製する際に結合を阻害する化合物を添加したり、或いは、反応後、凝集により蛍光が確認された溶液に結合を阻害する化合物を添加することにより、阻害効果を評価することが可能である。 In addition, a compound that inhibits binding is added when preparing a reaction solution, or the inhibitory effect is evaluated by adding a compound that inhibits binding to a solution in which fluorescence is confirmed by aggregation after the reaction. Is possible.
また、ニトロセルロース膜などにサンプルをスポットした後、０．０１から１００μＭの蛍光性糖鎖プローブ溶液中に１０秒から２時間浸し、乾燥させた後、紫外線を照射することにより糖鎖との相互作用を検出することもできる。 In addition, after spotting a sample on a nitrocellulose membrane or the like, the sample is immersed in a fluorescent sugar chain probe solution of 0.01 to 100 μM for 10 seconds to 2 hours, dried, and then irradiated with ultraviolet rays to interact with sugar chains. The action can also be detected.
（実施例１）
活性化した亜鉛０．９２ｇを窒素雰囲気下にて、反応フラスコに計り入れ、テトラヒドロフラン３５ｍｌを加えた。次いで、窒素雰囲気下でマイナス１０℃以下に冷却した後、塩化チタン０．７８ｍｌを滴下して加え、２時間還流した。その後、４，４´−ジヒドロキシベンゾフェノン１．５ｇをテトラヒドロフラン１５ｍｌに溶解し加え、更に４時間還流した。その後、室温まで冷却し、５０ｍｌの１０％炭酸カリウム水溶液を加え、５分間激しく撹拌し、ろ過し、有機相を回収した。水相より酢酸エチル５ｍｌで３回抽出した。有機相と、酢酸エチルによる抽出液を合わせ、溶媒留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）で単離して、下記化学式（１）に示した化合物を得た（０．４０ｇ、収率２８．６％）。1H NMR (600MHz, CD3OD):6.79(d, 8H), 6.78(d, 8H); 13C NMR(600MHz, CD3OD):155.3, 138.3, 136.1, 132.4, 114.0。
Example 1
0.92 g of activated zinc was weighed into a reaction flask under a nitrogen atmosphere, and 35 ml of tetrahydrofuran was added. Next, after cooling to minus 10 ° C. or less under a nitrogen atmosphere, 0.78 ml of titanium chloride was added dropwise and refluxed for 2 hours. Thereafter, 1.5 g of 4,4′-dihydroxybenzophenone was dissolved in 15 ml of tetrahydrofuran and added, and the mixture was further refluxed for 4 hours. Then, it cooled to room temperature, 50 ml of 10% potassium carbonate aqueous solution was added, and it stirred vigorously for 5 minutes, filtered, and collect | recovered organic phases. The aqueous phase was extracted 3 times with 5 ml of ethyl acetate. The organic phase and the extract with ethyl acetate were combined, the solvent was distilled off, and the residue was isolated by silica gel column chromatography (hexane / ethyl acetate = 1: 1) to obtain the compound represented by the following chemical formula (1) (0. 40 g, yield 28.6%). 1 H NMR (600 MHz, CD 3 OD): 6.79 (d, 8H), 6.78 (d, 8H); 13 C NMR (600 MHz, CD 3 OD): 155.3, 138.3, 136.1, 132.4, 114.0.
窒素雰囲気下、反応フラスコに、化学式（１）に示した化合物（０．１ｇ）、３−ブロモ−１−プロピン（０．１５ｇ）、炭酸カリウム（０．３５ｇ）、ジメチルホルムアミド（５ ｍｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、反応溶液よりクロロホルムによる抽出を行い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒留去し、シリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン／ジクロロメタン＝１：１）で単離して、下記化学式（２）に示した化合物を得た（０．０９ｇ、収率６６．３％）。1H NMR (600MHz, CDCl3):6.93(d, 8H), 6.70(d, 8H), 4.62(s, 8H), 2.51(s, 4H); 13C NMR(600MHz, CDCl3):156.1, 138.7, 137.5, 132.6, 114.1, 78.7, 75.5, 55.9; ESI MS： m/z 548.2 ([M+H]+: 549.207)。 In a nitrogen atmosphere, the compound (0.1 g), 3-bromo-1-propyne (0.15 g), potassium carbonate (0.35 g), and dimethylformamide (5 ml) shown in chemical formula (1) were placed in a reaction flask. In addition, the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. Thereafter, the reaction solution was extracted with chloroform, dried over sodium sulfate, evaporated, and isolated by silica gel chromatography (hexane / dichloromethane = 1: 1) to obtain a compound represented by the following chemical formula (2). (0.09 g, 66.3% yield). 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ): 6.93 (d, 8H), 6.70 (d, 8H), 4.62 (s, 8H), 2.51 (s, 4H); 13 C NMR (600 MHz, CDCl 3 ): 156.1, 138.7, 137.5, 132.6, 114.1, 78.7, 75.5, 55.9; ESI MS: m / z 548.2 ([M + H] + : 549.207).
触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)を用いて、アジド基を導入したアルコールのグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、１２−アジドドデシル−β−ラクトシドを得た（Murozuka, Y.ら, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063(2005)、Kasuya, M. C.ら, Carbohydr. Res., 329, 755. (2000)参照)。 By using a boron acid, boron trifluoride etherate (BF 3 · OEt 2 ) as a catalyst, glycosylation of an alcohol introduced with an azide group, followed by deacetylation reaction, 12-azidododecyl-β- Lactosides were obtained (see Murozuka, Y. et al., Chemistry and Biodiversity, 2, 1063 (2005), Kasuya, MC et al., Carbohydr. Res., 329, 755. (2000)).
（実施例２）
１００枚の１００ｍｍのディッシュに、細胞数２×１０6ｃｅｌｌｓのマウスメラノーマB１６細胞を７ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）に懸濁して播き、ＣＯ2インキュベターの中で３７℃にて４８時間、前培養を行った。
(Example 2)
Mouse 100 melanoma B16 cells having 2 × 10 6 cells were suspended in 100 ml of DMEM / F12 medium (Invitrogen) containing 10% FBS and seeded at 37 ° C. in a CO 2 incubator. For 48 hours.
前培養後、終濃度５０μＭになるように１２−アジドドデシル−β−ラクトシド及び１％のＩＴＳＸ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ2インキュベターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。 After pre-culture, the medium was replaced with DMEM / F12 medium supplemented with 12-azidododecyl-β-lactoside and 1% ITSX (GIBCO) to a final concentration of 50 μM, and further 37 in a CO 2 incubator. Culturing was carried out at 0 ° C. for 48 hours to carry out a sugar chain elongation reaction.
糖鎖伸長反応後、培地を回収し、更にディッシュ表面をＰＢＳで洗浄することにより、培地上清全量を回収した。 After the sugar chain elongation reaction, the medium was collected, and the dish surface was washed with PBS to collect the whole medium supernatant.
得られた培地上清に、２５ｇのスチレン系合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学社製）を加え、１６時間振盪し、糖鎖化合物を吸着剤に吸着させた。次に、１００ｍｌの水で５回洗浄した後、メタノール１００ｍｌで４回溶出した。その後、溶媒留去させ、強陰イオン交換カラム（ＳＡＸ（ＧＬサイエンス社製））に供し、Sep-Pakカラム（Waters社製）を用いて脱塩を行うことにより精製し、１２−アジドドデシル−α2,3−シアリルラクトシドを得た（Kato, T.ら、J. Chromatogr. A, 1178, 154（2008）参照）。 To the obtained culture supernatant, 25 g of a styrene synthetic adsorbent Diaion HP20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) was added and shaken for 16 hours to adsorb the sugar chain compound to the adsorbent. Next, after washing 5 times with 100 ml of water, it was eluted 4 times with 100 ml of methanol. Then, the solvent was distilled off, and it was purified by subjecting it to a strong anion exchange column (SAX (manufactured by GL Science)) and desalting using a Sep-Pak column (manufactured by Waters). α2,3-Sialyllactoside was obtained (see Kato, T. et al., J. Chromatogr. A, 1178, 154 (2008)).
（実施例３）
１００ｍＭ １２−アジドドデシル−β−ラクトシド、０．０２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）（９７５μｌ）、５０ｍｇ／ｍｌ ＣＭＰ−ＮｕｅＡｃ（５０μｌ）、０．０５ｕｎｉｔ α2,6−シアリルトランスフェラーゼをエッペンドルフチューブ中で混合し、３０℃で１６時間静置した。その後、強陰イオン交換カラム（ＳＡＸ）に供し、Sep-Pakカラムを用いて脱塩を行うことにより精製し、１２−アジドドデシル−α2,6−シアリルラクトシドを得た。
(Example 3)
100 mM 12-azidododecyl-β-lactoside, 20 mM Bis-Tris (pH 6.0) (975 μl) containing 0.02% Triton X-100, 50 mg / ml CMP-NueAc (50 μl), 0.05 unit α2,6-sialyl The transferase was mixed in an Eppendorf tube and allowed to stand at 30 ° C. for 16 hours. Then, it applied to a strong anion exchange column (SAX) and refine | purified by performing desalting using a Sep-Pak column, and obtained 12-azido dodecyl- (alpha) 2, 6- sialyl lactoside.
（実施例４）
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ及びアスコルビン酸ナトリウムを触媒とするアジド／アルキンの
連結反応による、化学式（２）に示した化合物へのラクトース、α2,3−シアリルラクトース、α2,6−シアリルラクトースを導入および生成は、以下の条件で行った。
Example 4
Introducing lactose, α2,3-sialyllactose, α2,6-sialyllactose into the compound represented by chemical formula (2) by a coupling reaction of azide / alkyne catalyzed by CuSO 4 · 5H 2 O and sodium ascorbate The generation was performed under the following conditions.
１０ｍＭアジド糖鎖化合物、２．５ｍＭ化学式（２）に示した化合物、５０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏを、ＤＭＳＯ(又は、アセトン)／水＝1：1に溶解し、室温で２４時間撹拌した。その後、シリカゲルクロマトグラフィ（クロロホルム／メタノール／水＝５：４：１）で単離した。 10 mM azido sugar chain compound, 2.5 mM compound represented by chemical formula (2), 50 mM sodium ascorbate, 10 mM CuSO 4 .5H 2 O are dissolved in DMSO (or acetone) / water = 1: 1 at room temperature. Stir for 24 hours. Thereafter, the product was isolated by silica gel chromatography (chloroform / methanol / water = 5: 4: 1).
（実施例５）
ニトロセルロースメンブレンに、ＭＡＭレクチン及び、ＳＳＡレクチンを１０μｇスポットし、風乾させた後、２０μＭのα2,3−シアリルラクトース付加蛍光性糖鎖プローブ、及びα2,6−シアリルラクトース付加蛍光性糖鎖プローブを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に浸し、１０分間静置した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄し、３６５nmのＵＶを照射した。その結果、図１に示したように、α2,3−シアリルラクトース付加蛍光性糖鎖プローブ及び、α2,6−シアリルラクトース付加蛍光性糖鎖プローブは、それぞれＭＡＭレクチン、ＳＳＡレクチンへの特異的な結合による蛍光シグナルが得られた（励起：３１９ｎｍ；検出：４６０ｎｍ）。また、ラクトース付加蛍光性糖鎖プローブにおいては、ＭＡＭレクチン、ＳＳＡレクチンへの結合は見られず、ＲＣＡ１２０への特異的な結合が認められた。以上のことから、これらの蛍光性糖鎖プローブは糖鎖との相互作用を調べる上で活用できることが示された。
(Example 5)
After 10 μg of MAM lectin and SSA lectin are spotted on a nitrocellulose membrane and air-dried, 20 μM α2,3-sialyllactose-added fluorescent sugar chain probe and α2,6-sialyllactose-added fluorescent sugar chain probe are added. The sample was immersed in 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) and allowed to stand for 10 minutes, washed with 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), and irradiated with 365 nm UV. As a result, as shown in FIG. 1, the α2,3-sialyllactose-added fluorescent sugar chain probe and the α2,6-sialyllactose-added fluorescent sugar chain probe were specific to MAM lectin and SSA lectin, respectively. A fluorescent signal due to binding was obtained (excitation: 319 nm; detection: 460 nm). Further, in the lactose-added fluorescent sugar chain probe, binding to MAM lectin and SSA lectin was not observed, and specific binding to RCA120 was observed. From the above, it was shown that these fluorescent sugar chain probes can be used for examining the interaction with sugar chains.
（実施例６）
104ｐｆｕ、105ｐｆｕ、106ｐｆｕのインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３株を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（１００μｌ）に、終濃度１μＭになるようにラクトース付加蛍光性糖鎖プローブとα2,6−シアリルラクトース付加蛍光性糖鎖プローブをそれぞれ添加し、比較した。その結果、図２に示すように、α2,6−シアリルラクトース付加蛍光性糖鎖プローブに特異的に検出された（励起：３１９ｎｍ；検出：４６０ｎｍ）。
(Example 6)
10 4 pfu, 10 5 pfu, 10 6 pfu of influenza virus A / WSN / 33 strain containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) (100 μl) and lactose-added fluorescent sugar chain probe to a final concentration of 1 μM And α2,6-sialyl lactose-added fluorescent sugar chain probe were added and compared. As a result, as shown in FIG. 2, it was specifically detected by the α2,6-sialyl lactose-added fluorescent sugar chain probe (excitation: 319 nm; detection: 460 nm).
（実施例７）
106ｐｆｕのインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３株を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（１００μｌ）に、終濃度１μＭになるようにα2,6−シアリルラクトース蛍光性糖鎖プローブを添加し、ウイルスを含まない液と比較した。図３において、ウイルスを加えた場合を実線（α2,6ＳＬ-ＴＰＥ＋ＷＳＮ）、加えてない場合を点線（α2,6ＳＬ-ＴＰＥ）で示しているが、ウイルスを含む液の場合、蛍光性を示した（励起：３１９ｎｍ；検出：４６０ｎｍ）。
(Example 7)
To 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) (100 μl) containing 10 6 pfu of influenza virus A / WSN / 33 strain, α2,6-sialyl lactose fluorescent sugar chain probe was added to a final concentration of 1 μM, Comparison with a solution containing no virus. In FIG. 3, the case where the virus is added is indicated by a solid line (α2,6SL-TPE + WSN), and the case where the virus is not added is indicated by a dotted line (α2,6SL-TPE). (Excitation: 319 nm; detection: 460 nm).
（実施例８）
106ｐｆｕのインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３株およびＡ／Ｄｕｃｋ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／１０２１８／８４を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（１００μｌ）に、終濃度２．５μＭになるようにラクトース付加蛍光性糖鎖プローブ、α2,3−シアリルラクトース付加蛍光性糖鎖プローブとα2,6−シアリルラクトース付加蛍光性糖鎖プローブをそれぞれ添加し、ウイルスを含まない液と比較した。図４に示すようにウイルスを含む液の場合、蛍光性を示した（励起：３３５ｎｍ；検出：４６０ｎｍ）。
(Example 8)
10 6 pfu of influenza virus strain A / WSN / 33 and A / Duck / Pennsylvania / 10218/84 containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) (100 μl) with lactose addition fluorescence to a final concentration of 2.5 μM Glycan probe, α2,3-sialyl lactose-added fluorescent sugar chain probe and α2,6-sialyl lactose-added fluorescent sugar chain probe were added, respectively, and compared with a solution containing no virus. As shown in FIG. 4, the liquid containing the virus showed fluorescence (excitation: 335 nm; detection: 460 nm).
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