JP2011141190A - Fluorescence measuring instrument and fluorescence measuring method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、所定の方向に移動する測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光を受光する蛍光測定装置及び蛍光測定方法に関する。 The present invention relates to a fluorescence measuring apparatus and a fluorescence measuring method for receiving fluorescence emitted when a measurement object moving in a predetermined direction is irradiated with laser light.
測定対象物にレーザ光を照射し、測定対象物が発する蛍光を受光して、測定対象物の情報を取得する蛍光測定装置が知られている。
蛍光測定装置を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素は蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を受光することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
There is known a fluorescence measuring apparatus that irradiates a measurement object with laser light, receives fluorescence emitted from the measurement object, and acquires information on the measurement object.
A flow cytometer using a fluorescence measuring apparatus allows a measurement object such as a cell, DNA, RNA, enzyme, protein, etc. labeled with a fluorescent reagent to flow through a sheath liquid. By irradiating the measurement object with laser light, the fluorescent dye applied to the measurement object emits fluorescence. The flow cytometer can acquire information on the measurement object by receiving the fluorescence.
また、レーザ光を測定対象物に照射し測定対象物が発する蛍光を受光することにより蛍光緩和時定数を取得する蛍光測定装置が知られている（特許文献１）。 There is also known a fluorescence measurement device that acquires a fluorescence relaxation time constant by irradiating a measurement object with laser light and receiving fluorescence emitted from the measurement object (Patent Document 1).
測定対象物が発する蛍光を受光する蛍光測定装置においては、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度が高いほど、測定対象物の情報をより正確に取得することができる。そのため、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を高めることができる蛍光測定装置が求められている。 In a fluorescence measuring apparatus that receives fluorescence emitted from a measurement object, information on the measurement object can be acquired more accurately as the fluorescence intensity emitted when the measurement object is irradiated with laser light is higher. Therefore, there is a demand for a fluorescence measuring device that can increase the intensity of fluorescence emitted when a measurement object is irradiated with laser light.
本発明は、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を従来よりも高めることができる蛍光測定装置及び蛍光測定方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the fluorescence measuring apparatus and fluorescence measuring method which can raise the fluorescence intensity emitted when a measuring object is irradiated with a laser beam rather than before.
本発明の蛍光測定装置は、所定の方向に移動する測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光を受光する蛍光測定装置であって、前記測定対象物に電界を印加する電界印加部と、前記電界印加部が前記測定対象物に電界を印加する位置よりも、前記所定の方向の下流の位置において、前記測定対象物に直線偏光のレーザ光を照射するレーザ光照射部と、前記測定対象物が前記レーザ光を照射された際に発せられる蛍光を受光する受光部と、を備えることを特徴とする。 The fluorescence measurement apparatus of the present invention is a fluorescence measurement apparatus that receives fluorescence emitted when a measurement object moving in a predetermined direction is irradiated with laser light, and an electric field application unit that applies an electric field to the measurement object A laser beam irradiation unit that irradiates the measurement object with linearly polarized laser light at a position downstream of the position in which the electric field application unit applies an electric field to the measurement object in the predetermined direction; And a light receiving unit that receives fluorescence emitted when the measurement object is irradiated with the laser beam.
また、前記レーザ光照射部は、レーザ光の偏光方向を変える波長板を含むことが好ましい。 Moreover, it is preferable that the said laser beam irradiation part contains the wavelength plate which changes the polarization direction of a laser beam.
また、前記受光部が受光した蛍光に基づいて、前記測定対象物が発する蛍光強度を求めるデータ処理部と、前記データ処理部が求めた蛍光強度に基づいて、前記レーザ光照射部が前記測定対象物に照射するレーザ光の偏光方向を制御する制御部と、を備えることが好ましい。 Further, a data processing unit that obtains the fluorescence intensity emitted from the measurement object based on the fluorescence received by the light receiving unit, and the laser beam irradiation unit that measures the measurement object based on the fluorescence intensity obtained by the data processing unit. And a control unit that controls the polarization direction of the laser light applied to the object.
また、前記受光部が受光した蛍光に基づいて、前記測定対象物が発する蛍光強度を求めるデータ処理部と、前記データ処理部が求めた蛍光強度に基づいて、前記電界印加部が前記測定対象物に印加する電界の方向を制御する制御部と、を備えることが好ましい。 Further, a data processing unit that obtains the fluorescence intensity emitted from the measurement object based on the fluorescence received by the light receiving unit, and the electric field application unit that measures the measurement object based on the fluorescence intensity obtained by the data processing unit. And a controller for controlling the direction of the electric field applied to the.
また、前記電界印加部は、異なる複数の方向に電界を印加するように配列された複数の電極を含むことが好ましい。 Moreover, it is preferable that the said electric field application part contains the some electrode arranged so that an electric field may be applied to a several different direction.
また、本発明の蛍光測定方法は、所定の方向に移動する測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光を受光する蛍光測定方法であって、前記測定対象物に電界を印加する電界印加工程と、前記電界印加工程の後に、前記測定対象物に直線偏光のレーザ光を照射する照射工程と、前記測定対象物が前記レーザ光を照射された際に発せられる蛍光を受光する受光工程と、を有することを特徴とする。 Further, the fluorescence measurement method of the present invention is a fluorescence measurement method for receiving fluorescence emitted when a measurement object moving in a predetermined direction is irradiated with laser light, and applying an electric field to the measurement object. An application step; an irradiation step of irradiating the measurement object with linearly polarized laser light after the electric field application step; and a light receiving step of receiving fluorescence emitted when the measurement object is irradiated with the laser light. It is characterized by having.
また、前記受光工程において受光した蛍光に基づいて、前記測定対象物が発する蛍光強度を求めるデータ処理工程と、前記データ処理工程において求めた蛍光強度に基づいて、前記測定対象物に照射する前記レーザ光の偏光方向を制御する制御工程と、を有することが好ましい。 Further, a data processing step for obtaining a fluorescence intensity emitted from the measurement object based on the fluorescence received in the light receiving step, and the laser for irradiating the measurement object based on the fluorescence intensity obtained in the data processing step And a control step of controlling the polarization direction of the light.
また、前記受光工程において受光した蛍光に基づいて、前記測定対象物が発する蛍光強度を求めるデータ処理工程と、前記データ処理工程において求めた蛍光強度に基づいて、前記測定対象物に電界を印加する方向を制御する制御工程と、を有することが好ましい。 Further, a data processing step for obtaining a fluorescence intensity emitted from the measurement object based on the fluorescence received in the light receiving step, and an electric field is applied to the measurement object based on the fluorescence intensity obtained in the data processing step. And a control step of controlling the direction.
本発明の蛍光測定装置、蛍光測定方法によれば、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を従来よりも高めることができる。 According to the fluorescence measuring apparatus and the fluorescence measuring method of the present invention, the fluorescence intensity emitted when the measurement object is irradiated with the laser light can be increased as compared with the conventional case.
以下、本発明の蛍光測定装置、蛍光測定方法を適用したフローサイトメータについて、実施形態に基づいて説明する。
＜第１の実施形態＞
（フローサイトメータの構成）
まず、図１を参照して、本実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図１は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。フローサイトメータは、測定対象物にレーザ光を照射し、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光を受光することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
図１に示されるように、本実施形態のフローサイトメータは、液体供給装置１０と、フローセル２２と、電界印加部４０と、レーザ光照射部５０と、受光部６０、６２と、データ処理部７０と、制御部８０と、を備える。
Hereinafter, a flow cytometer to which a fluorescence measuring apparatus and a fluorescence measuring method of the present invention are applied will be described based on embodiments.
<First Embodiment>
(Configuration of flow cytometer)
First, with reference to FIG. 1, the structure of the flow cytometer of this embodiment is demonstrated. FIG. 1 is a schematic configuration diagram illustrating an example of a flow cytometer according to the present embodiment. The flow cytometer can acquire information on the measurement target by irradiating the measurement target with laser light and receiving fluorescence emitted from the measurement target irradiated with the laser light.
As shown in FIG. 1, the flow cytometer of the present embodiment includes a liquid supply apparatus 10, a flow cell 22, an electric field application unit 40, a laser beam irradiation unit 50, light receiving units 60 and 62, and a data processing unit. 70 and a control unit 80.
液体供給装置１０は、サンプル液タンク１２と、シース液タンク１４と、を備える。サンプル液タンク１２は、細胞などの測定対象物を含むサンプル液を収容する。後述するように、レーザ光照射部５０において測定対象物にレーザ光を照射し、その際に発せられる蛍光から測定対象物の情報を取得するため、サンプル液タンク１２に収容されるサンプル液に含まれる細胞３０には、予め蛍光色素３２が付与されている。蛍光色素３２は、例えば、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）などが用いられる。
シース液タンク１４はシース液を収容する。サンプル液タンク１２とサンプル液管１８とは、配管１６で接続されている。また、シース液タンク１４とシース液管２０とは、配管１６で接続されている。
The liquid supply apparatus 10 includes a sample liquid tank 12 and a sheath liquid tank 14. The sample solution tank 12 stores a sample solution containing a measurement object such as a cell. As will be described later, the laser light irradiation unit 50 irradiates the measurement target with laser light, and acquires the information on the measurement target from the fluorescence emitted at that time, so that it is included in the sample liquid stored in the sample liquid tank 12. The cells 30 are preliminarily provided with a fluorescent dye 32. As the fluorescent dye 32, for example, CFP (Cyan Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent Protein) or the like is used.
The sheath liquid tank 14 stores the sheath liquid. The sample liquid tank 12 and the sample liquid pipe 18 are connected by a pipe 16. The sheath liquid tank 14 and the sheath liquid pipe 20 are connected by a pipe 16.
液体供給装置１０は、不図示のエアポンプを備える。エアポンプを用いてサンプル液タンク１２に収容されているサンプル液を加圧することにより、液体供給装置１０は、配管１６を介してサンプル液管１８にサンプル液を供給する。また、エアポンプを用いてシース液タンク１４に収容されているシース液を加圧することにより、液体供給装置１０は、配管１６を介してシース液管２０にシース液を供給する。
液体供給装置１０がサンプル液やシース液を加圧する大きさは、制御部８０により制御される。
The liquid supply apparatus 10 includes an air pump (not shown). By pressurizing the sample liquid stored in the sample liquid tank 12 using an air pump, the liquid supply apparatus 10 supplies the sample liquid to the sample liquid pipe 18 via the pipe 16. Further, the liquid supply apparatus 10 supplies the sheath liquid to the sheath liquid pipe 20 via the pipe 16 by pressurizing the sheath liquid stored in the sheath liquid tank 14 using an air pump.
The control unit 80 controls the size with which the liquid supply apparatus 10 pressurizes the sample liquid and the sheath liquid.
サンプル液管１８の吐出口から吐出されたサンプル液は、シース液に囲まれ、フローセル２２の内部を流れる。フローセル２２の内部では、シース液に囲まれたサンプル液は流体力学的絞り込みを受け、サンプル液は細い液流となる。サンプル液の速度を調整することにより、細い液流のサンプル液の中に細胞を一列に流すことができる。このようにして、フローセル２２の内部を測定対象物が所定の方向に移動する。 The sample liquid discharged from the discharge port of the sample liquid pipe 18 is surrounded by the sheath liquid and flows through the flow cell 22. Inside the flow cell 22, the sample liquid surrounded by the sheath liquid is subjected to hydrodynamic narrowing, and the sample liquid becomes a thin liquid flow. By adjusting the speed of the sample liquid, the cells can be flowed in a line in the sample liquid of a thin liquid flow. In this way, the measurement object moves in the predetermined direction inside the flow cell 22.
電界印加部４０は、フローセル２２の内部を流れる測定対象物に電界を印加する。本実施形態の電界印加部４０は、２つの電極４２ａ，４２ｂを備える。２つの電極４２ａ，４２ｂの間に電圧を印加することにより、測定対象物に電界を印加することができる。
図１に示されるように、電界印加部４０は制御部８０と接続されている。後述するように、電界印加部４０が測定対象物に印加する電界の方向は、制御部８０により制御される。
The electric field applying unit 40 applies an electric field to the measurement object flowing inside the flow cell 22. The electric field application unit 40 of this embodiment includes two electrodes 42a and 42b. By applying a voltage between the two electrodes 42a and 42b, an electric field can be applied to the measurement object.
As shown in FIG. 1, the electric field applying unit 40 is connected to the control unit 80. As will be described later, the direction of the electric field applied to the measurement object by the electric field application unit 40 is controlled by the control unit 80.
レーザ光照射部５０は、測定対象物に直線偏光のレーザ光を照射する。図１に示されるように、レーザ光照射部５０が測定対象物にレーザ光を照射する位置は、電界印加部４０が測定対象物に電界を印加する位置よりも、フローセル２２の下流に位置する。
レーザ光照射部５０は制御部８０と接続されている。後述するように、レーザ光照射部５０が測定対象物に照射するレーザ光の偏光方向は制御部８０により制御される。
The laser light irradiation unit 50 irradiates the measurement target with linearly polarized laser light. As shown in FIG. 1, the position where the laser beam irradiation unit 50 irradiates the measurement target with the laser beam is located downstream of the flow cell 22 than the position where the electric field application unit 40 applies the electric field to the measurement target. .
The laser beam irradiation unit 50 is connected to the control unit 80. As will be described later, the control unit 80 controls the polarization direction of the laser light that the laser light irradiation unit 50 irradiates the measurement object.
ここで、図２を参照して、レーザ光照射部５０の詳細な構成について説明する。図２は、本実施形態のレーザ光照射部５０の一例を示す概略構成図である。図２に示されるように、レーザ光照射部５０は、レーザ光源部５２と、波長板５４と、を含む。レーザ光源部５２は、例えば、直線偏光のレーザ光を発する半導体レーザである。
波長板５４は、例えば、直線偏光の偏光方向を変える半波長板である。図２に矢印で示されるように、波長板５４は、レーザ光源部５２から照射されたレーザ光の光軸の周りに回転することができる。波長板５４の角度は、制御部８０により制御される。
Here, with reference to FIG. 2, the detailed structure of the laser beam irradiation part 50 is demonstrated. FIG. 2 is a schematic configuration diagram illustrating an example of the laser beam irradiation unit 50 of the present embodiment. As shown in FIG. 2, the laser light irradiation unit 50 includes a laser light source unit 52 and a wave plate 54. The laser light source unit 52 is, for example, a semiconductor laser that emits linearly polarized laser light.
The wave plate 54 is, for example, a half-wave plate that changes the polarization direction of linearly polarized light. As indicated by an arrow in FIG. 2, the wave plate 54 can rotate around the optical axis of the laser light emitted from the laser light source unit 52. The angle of the wave plate 54 is controlled by the control unit 80.
次に、図１に戻り、受光部６０，６２について説明する。
受光部６０は、フローセル２２にレーザ光が照射される位置を基準として、レーザ光照射部５０と反対側に配置される。受光部６０は、測定対象物にレーザ光が照射された際に生じる前方散乱光を受光する。受光部６０は、例えば、フォトダイオードなどの光電変換器を備える。受光部６０は、受光した前方散乱光を電気信号に変換して出力する。
受光部６０が出力する電気信号は、フローセル２２にレーザ光が照射される位置を測定対象物が通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
Next, returning to FIG. 1, the light receiving units 60 and 62 will be described.
The light receiving unit 60 is disposed on the opposite side of the laser beam irradiation unit 50 with reference to the position where the flow cell 22 is irradiated with the laser beam. The light receiving unit 60 receives forward scattered light generated when the measurement target is irradiated with laser light. The light receiving unit 60 includes, for example, a photoelectric converter such as a photodiode. The light receiving unit 60 converts the received forward scattered light into an electrical signal and outputs it.
The electrical signal output from the light receiving unit 60 is used as a trigger signal that notifies the timing at which the measurement object passes through the position where the flow cell 22 is irradiated with the laser light.
受光部６２は、フローセル２２にレーザ光が照射される位置を基準として、レーザ光照射部５０からレーザ光が照射される方向とフローセル２２内を測定対象物が流れる方向の相互に垂直な方向に配置される。受光部６２は、測定対象物にレーザ光が照射された際に発せられる蛍光を受光する。受光部６２は、例えば、光電子倍増管などの光電変換器を備える。受光部６２は、受光した蛍光を電気信号に変換して出力する。
受光部６２が出力する電気信号は、フローセル２２にレーザ光が照射される位置を通過する測定対象物を特定するための信号として用いられる。
The light receiving unit 62 is set in a direction perpendicular to the direction in which the laser light is irradiated from the laser light irradiation unit 50 and the direction in which the measurement object flows in the flow cell 22 with reference to the position at which the flow cell 22 is irradiated with the laser light. Be placed. The light receiving unit 62 receives fluorescence emitted when the measurement target is irradiated with laser light. For example, the light receiving unit 62 includes a photoelectric converter such as a photomultiplier tube. The light receiving unit 62 converts the received fluorescence into an electrical signal and outputs it.
The electric signal output from the light receiving unit 62 is used as a signal for specifying a measurement object that passes through a position where the flow cell 22 is irradiated with laser light.
次に、データ処理部７０について説明する。データ処理部７０は、受光部６２が受光した蛍光の情報を用いて、レーザ光を照射された測定対象物の情報を取得する。データ処理部７０は、受光部６０，６２から出力される電気信号の入力を受け、この電気信号をデジタル信号に変換する。また、データ処理部７０は、変換されたデジタル信号を用いて、測定対象物が発する蛍光の強度を求める。また、データ処理部７０は、変換されたデジタル信号を用いて、レーザ光を照射された測定対象物の情報を取得する。データ処理部７０により求められた各種データは、制御部８０に出力される。 Next, the data processing unit 70 will be described. The data processing unit 70 acquires information on the measurement object irradiated with the laser light using the fluorescence information received by the light receiving unit 62. The data processing unit 70 receives an electric signal output from the light receiving units 60 and 62 and converts the electric signal into a digital signal. Further, the data processing unit 70 obtains the intensity of the fluorescence emitted from the measurement object using the converted digital signal. In addition, the data processing unit 70 acquires information on the measurement target irradiated with the laser light using the converted digital signal. Various data obtained by the data processing unit 70 is output to the control unit 80.
次に、制御部８０について説明する。制御部８０は、フローサイトメータの全体の動作タイミングなどの制御を行う。
図１に示されるように、制御部８０は、液体供給装置１０がサンプル液やシース液を加圧する大きさを制御する。また、制御部８０は、レーザ光照射部５０が測定対象物に照射するレーザ光の偏光方向を制御する。
測定された測定対象物は、容器９０に回収される。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
Next, the control unit 80 will be described. The controller 80 controls the overall operation timing of the flow cytometer.
As shown in FIG. 1, the control unit 80 controls the size with which the liquid supply apparatus 10 pressurizes the sample liquid and the sheath liquid. In addition, the control unit 80 controls the polarization direction of the laser light that the laser light irradiation unit 50 irradiates the measurement object.
The measured object to be measured is collected in the container 90.
The above is the schematic configuration of the flow cytometer of the present embodiment.
本実施形態の蛍光測定装置によれば、電界印加部４０により電界を印加された測定対象物に対し、レーザ光照射部５０が直線偏光のレーザ光を照射するため、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を高めることができる。 According to the fluorescence measuring apparatus of this embodiment, since the laser beam irradiation unit 50 irradiates the linearly polarized laser beam to the measurement object to which the electric field is applied by the electric field application unit 40, the laser beam is applied to the measurement object. The fluorescence intensity emitted when irradiated can be increased.
（蛍光測定方法）
次に、図３を参照して、本実施形態のフローサイトメータを用いた蛍光測定方法について説明する。図３は、本実施形態の蛍光測定方法の一例を示すフローチャートである。
まず、電界印加部４０が、フローセル２２の内部を流れる測定対象物に電界を印加する（ステップＳ１０１）。
(Fluorescence measurement method)
Next, a fluorescence measurement method using the flow cytometer of the present embodiment will be described with reference to FIG. FIG. 3 is a flowchart illustrating an example of the fluorescence measurement method of the present embodiment.
First, the electric field applying unit 40 applies an electric field to the measurement object flowing inside the flow cell 22 (step S101).
ここで、図４を参照して、電界印加部４０が測定対象物に電界を印加することによる測定対象物の状態の変化について説明する。図４（ａ）は、電界を印加される前の細胞３０の状態を示す図であり、図４（ｂ）は、電界を印加された後の細胞３０の状態を示す図である。
上述したように、細胞３０には予め蛍光色素３２が付与されている。一般に、蛍光色素３２は双極子モーメントを有している。図４に示される矢印は双極子モーメントの方向を示す。図４（ａ）に示されるように、電界を印加される前の細胞３０の蛍光色素３２の双極子モーメントは、ランダムな方向を向いていると考えられる。細胞３０に印加される電界の方向と蛍光色素３２の双極子モーメントの方向の関係は定かではないが、図４（ｂ）に示されるように、電界印加部４０が細胞３０に電界を印加することにより、蛍光色素３２の双極子モーメントの方向は一定の方向を向くと考えられる。
Here, with reference to FIG. 4, the change of the state of the measurement object by the electric field application part 40 applying an electric field to a measurement object is demonstrated. 4A is a diagram illustrating a state of the cell 30 before an electric field is applied, and FIG. 4B is a diagram illustrating a state of the cell 30 after the electric field is applied.
As described above, the fluorescent dye 32 is provided to the cell 30 in advance. In general, the fluorescent dye 32 has a dipole moment. The arrows shown in FIG. 4 indicate the direction of the dipole moment. As shown in FIG. 4A, the dipole moment of the fluorescent dye 32 of the cell 30 before the electric field is applied is considered to be in a random direction. Although the relationship between the direction of the electric field applied to the cell 30 and the direction of the dipole moment of the fluorescent dye 32 is not certain, the electric field applying unit 40 applies an electric field to the cell 30 as shown in FIG. Thus, the direction of the dipole moment of the fluorescent dye 32 is considered to be in a certain direction.
図３に戻り、次に、レーザ光照射部５０が、測定対象物に直線偏光のレーザ光を照射する（ステップＳ１０２）。レーザ光照射部５０が照射するレーザ光の直線偏光の方向は、予め定められている。
次に、受光部６２が、測定対象物にレーザ光が照射された際に発せられる蛍光を受光する（ステップＳ１０３）。
次に、データ処理部７０が、受光部６２が受光した蛍光の情報を用いて、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光の強度を取得する（ステップＳ１０４）。
次に、制御部８０が、所定数の蛍光強度を取得したか否かを判別する（ステップＳ１０５）。
Returning to FIG. 3, next, the laser beam irradiation unit 50 irradiates the measurement target with linearly polarized laser beam (step S102). The direction of linearly polarized light of the laser light irradiated by the laser light irradiation unit 50 is determined in advance.
Next, the light receiving unit 62 receives the fluorescence emitted when the measurement target is irradiated with the laser light (step S103).
Next, the data processing unit 70 uses the fluorescence information received by the light receiving unit 62 to acquire the intensity of the fluorescence emitted by the measurement object irradiated with the laser light (step S104).
Next, the control unit 80 determines whether or not a predetermined number of fluorescence intensities have been acquired (step S105).
ステップＳ１０５において、制御部８０が、所定数の蛍光強度を取得していないと判別した場合、制御部８０は、レーザ光照射部５０が測定対象物に照射するレーザ光の偏光方向を変更する（ステップＳ１０６）。具体的には、制御部８０が、波長板５４を回転させることにより、レーザ光の偏光方向を変更する。
次に、ステップＳ１０１に戻り、以後、ステップＳ１０５において、制御部８０が、所定数の蛍光強度を取得したと判別するまで、上述したステップＳ１０１〜Ｓ１０６を繰り返す。
When the control unit 80 determines in step S105 that the predetermined number of fluorescence intensities has not been acquired, the control unit 80 changes the polarization direction of the laser light that the laser light irradiation unit 50 irradiates the measurement object ( Step S106). Specifically, the control unit 80 changes the polarization direction of the laser light by rotating the wave plate 54.
Next, the process returns to step S101, and thereafter, in step S105, the above-described steps S101 to S106 are repeated until the control unit 80 determines that a predetermined number of fluorescence intensities have been acquired.
測定対象物に電界を印加した際における蛍光色素３２の双極子モーメントの方向と、直線偏光のレーザ光の偏光方向とが所定の角度になると、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光強度は強くなる。例えば、測定対象物に電界を印加した際における蛍光色素３２の双極子モーメントの方向と、直線偏光のレーザ光の偏光方向とが一致するときに、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光強度は強くなると考えられる。そのため、レーザ光の偏光方向を変更した後にステップＳ１０４において測定対象物が発する蛍光強度を取得すると、レーザ光の偏光方向に応じた蛍光強度が取得される。 When the direction of the dipole moment of the fluorescent dye 32 when the electric field is applied to the measurement object and the polarization direction of the linearly polarized laser beam are at a predetermined angle, the fluorescence intensity emitted from the measurement object irradiated with the laser beam Become stronger. For example, when the direction of the dipole moment of the fluorescent dye 32 when an electric field is applied to the measurement object coincides with the polarization direction of the linearly polarized laser beam, the fluorescence emitted by the measurement object irradiated with the laser beam is emitted. The strength is considered to increase. Therefore, when the fluorescence intensity emitted from the measurement object is acquired in step S104 after changing the polarization direction of the laser light, the fluorescence intensity corresponding to the polarization direction of the laser light is acquired.
ステップＳ１０５において、制御部８０が、所定数の蛍光強度を取得したと判別した場合、制御部８０は、蛍光強度が大きくなる方向にレーザ光の偏光方向を制御する（ステップＳ１０７）。例えば、制御部８０は、ステップＳ１０４においてデータ処理部７０が取得した蛍光強度が最大となる位置に、波長板５４を回転させる。 If the control unit 80 determines in step S105 that a predetermined number of fluorescence intensities have been acquired, the control unit 80 controls the polarization direction of the laser light in the direction in which the fluorescence intensity increases (step S107). For example, the control unit 80 rotates the wave plate 54 to a position where the fluorescence intensity acquired by the data processing unit 70 in step S104 is maximized.
以上説明したように、本実施形態の蛍光測定方法によれば、電界印加部４０により電界を印加された測定対象物に対し、レーザ光照射部５０が直線偏光のレーザ光を照射するため、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を高めることができる。 As described above, according to the fluorescence measurement method of the present embodiment, the measurement is performed because the laser beam irradiation unit 50 irradiates the linearly polarized laser beam to the measurement object to which the electric field is applied by the electric field application unit 40. The fluorescence intensity emitted when the object is irradiated with laser light can be increased.
＜第２の実施形態＞
（フローサイトメータの構成）
第１の実施形態のフローサイトメータは、レーザ光照射部５０が照射する直線偏光のレーザ光の偏光方向を変えることにより、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を高めるものである。本実施形態のフローサイトメータは、レーザ光照射部５０が照射する直線偏光のレーザ光の偏光方向は一定であるが、電界印加部４０が測定対象物に印加する電界の方向を変えることにより、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を高めるものである。
<Second Embodiment>
(Configuration of flow cytometer)
The flow cytometer of the first embodiment increases the fluorescence intensity emitted when the laser beam is irradiated on the measurement object by changing the polarization direction of the linearly polarized laser beam irradiated by the laser beam irradiation unit 50. It is. In the flow cytometer of the present embodiment, the polarization direction of the linearly polarized laser light irradiated by the laser light irradiation unit 50 is constant, but by changing the direction of the electric field applied to the measurement object by the electric field application unit 40, It increases the intensity of fluorescence emitted when the measurement object is irradiated with laser light.
本実施形態のフローサイトメータの構成は、基本的に図１を参照して説明したフローサイトメータの構成と同様である。以下の説明では、第１の実施形態のフローサイトメータと同様の部分の説明は省略し、本実施形態のフローサイトメータが第１の実施形態と異なる部分について主に説明する。
図１に示されるように、本実施形態のフローサイトメータは、液体供給装置１０と、フローセル２２と、電界印加部４０と、レーザ光照射部５０と、受光部６０、６２と、データ処理部７０と、制御部８０と、を備える。液体供給装置１０の構成は第１の実施形態と同様である。
The configuration of the flow cytometer of this embodiment is basically the same as the configuration of the flow cytometer described with reference to FIG. In the following description, the description of the same part as the flow cytometer of the first embodiment is omitted, and the part of the flow cytometer of the present embodiment that is different from the first embodiment will be mainly described.
As shown in FIG. 1, the flow cytometer of the present embodiment includes a liquid supply apparatus 10, a flow cell 22, an electric field application unit 40, a laser beam irradiation unit 50, light receiving units 60 and 62, and a data processing unit. 70 and a control unit 80. The configuration of the liquid supply apparatus 10 is the same as that of the first embodiment.
電界印加部４０は、フローセル２２の内部を流れる測定対象物に電界を印加する。ここで、図５を参照して、本実施形態の電界印加部４０の具体的な構成について説明する。図５は、測定対象物がフローセル２２の内部を流れる方向と直交する方向における電界印加部４０の断面図の一例である。
図５に示されるように、本実施形態の電界印加部４０は、４つの電極４２ａ，４２ｂ，４２ｃ，４２ｄを備える。例えば、２つの電極４２ａ，４２ｂの間に電圧を印加することにより、図５の左右方向に電界を印加することができる。また、２つの電極４２ｃ，４２ｄの間に電圧を印加することにより、図５の上下方向に電界を印加することができる。
The electric field applying unit 40 applies an electric field to the measurement object flowing inside the flow cell 22. Here, with reference to FIG. 5, a specific configuration of the electric field application unit 40 of the present embodiment will be described. FIG. 5 is an example of a cross-sectional view of the electric field applying unit 40 in a direction orthogonal to the direction in which the measurement object flows through the flow cell 22.
As shown in FIG. 5, the electric field application unit 40 of the present embodiment includes four electrodes 42a, 42b, 42c, and 42d. For example, an electric field can be applied in the left-right direction in FIG. 5 by applying a voltage between the two electrodes 42a and 42b. Further, an electric field can be applied in the vertical direction of FIG. 5 by applying a voltage between the two electrodes 42c and 42d.
図１に示されるように、電界印加部４０は制御部８０と接続されている。具体的には、４つの電極４２ａ，４２ｂ，４２ｃ，４２ｄは、それぞれ制御部８０と接続されている。これにより、４つの電極４２ａ，４２ｂ，４２ｃ，４２ｄに印加される電位は個別に制御される。 As shown in FIG. 1, the electric field applying unit 40 is connected to the control unit 80. Specifically, the four electrodes 42a, 42b, 42c, and 42d are connected to the control unit 80, respectively. Thereby, the potential applied to the four electrodes 42a, 42b, 42c, and 42d is individually controlled.
レーザ光照射部５０の構成は、第１の実施形態と同様である。但し、本実施形態においては、レーザ光照射部５０が照射する直線偏光のレーザ光の偏光方向は一定であるため、直線偏光の偏光方向を変える波長板５４は必ずしも必要ではない。
受光部６０，６２、データ処理部７０の構成は、第１の実施形態と同様である。
The configuration of the laser beam irradiation unit 50 is the same as that of the first embodiment. However, in this embodiment, since the polarization direction of the linearly polarized laser light emitted by the laser light irradiation unit 50 is constant, the wave plate 54 that changes the polarization direction of the linearly polarized light is not necessarily required.
The configurations of the light receiving units 60 and 62 and the data processing unit 70 are the same as those in the first embodiment.
次に、制御部８０について説明する。制御部８０は、フローサイトメータの全体の動作タイミングなどの制御を行う。
図１に示されるように、制御部８０は、液体供給装置１０がサンプル液やシース液を加圧する大きさを制御する。また、制御部８０は、電界印加部４０が測定対象物に印加する電界の方向を制御する。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
Next, the control unit 80 will be described. The controller 80 controls the overall operation timing of the flow cytometer.
As shown in FIG. 1, the control unit 80 controls the size with which the liquid supply apparatus 10 pressurizes the sample liquid and the sheath liquid. The control unit 80 controls the direction of the electric field applied to the measurement object by the electric field application unit 40.
The above is the schematic configuration of the flow cytometer of the present embodiment.
本実施形態の蛍光測定装置によれば、電界印加部４０により電界を印加された測定対象物に対し、レーザ光照射部５０が直線偏光のレーザ光を照射するため、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を高めることができる。 According to the fluorescence measuring apparatus of this embodiment, since the laser beam irradiation unit 50 irradiates the linearly polarized laser beam to the measurement object to which the electric field is applied by the electric field application unit 40, the laser beam is applied to the measurement object. The fluorescence intensity emitted when irradiated can be increased.
（蛍光測定方法）
次に、図６を参照して、本実施形態のフローサイトメータを用いた蛍光測定方法について説明する。図６は、本実施形態の蛍光測定方法の一例を示すフローチャートである。
まず、電界印加部４０が、フローセル２２の内部を流れる測定対象物に電界を印加する（ステップＳ２０１）。例えば、制御部８０が、２つの電極４２ａ，４２ｂの間に電圧を印加することにより、図５の左右方向に電界を印加する。
次に、レーザ光照射部５０が、測定対象物に直線偏光のレーザ光を照射する（ステップＳ２０２）。レーザ光照射部５０が照射するレーザ光の直線偏光の方向は、予め定められている。
次に、受光部６２が、測定対象物にレーザ光が照射された際に発せられる蛍光を受光する（ステップＳ２０３）。
次に、データ処理部７０が、受光部６２が受光した蛍光の情報を用いて、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光強度を取得する（ステップＳ２０４）。
次に、制御部８０が、所定数の蛍光強度を取得したか否かを判別する（ステップＳ２０５）。
(Fluorescence measurement method)
Next, a fluorescence measurement method using the flow cytometer of the present embodiment will be described with reference to FIG. FIG. 6 is a flowchart illustrating an example of the fluorescence measurement method of the present embodiment.
First, the electric field applying unit 40 applies an electric field to the measurement object flowing inside the flow cell 22 (step S201). For example, the control unit 80 applies an electric field in the left-right direction in FIG. 5 by applying a voltage between the two electrodes 42a and 42b.
Next, the laser light irradiation unit 50 irradiates the measurement object with linearly polarized laser light (step S202). The direction of linearly polarized light of the laser light irradiated by the laser light irradiation unit 50 is determined in advance.
Next, the light receiving unit 62 receives the fluorescence emitted when the measurement target is irradiated with the laser light (step S203).
Next, the data processing unit 70 uses the information on the fluorescence received by the light receiving unit 62 to acquire the fluorescence intensity emitted by the measurement object irradiated with the laser light (step S204).
Next, the control unit 80 determines whether or not a predetermined number of fluorescence intensities have been acquired (step S205).
ステップＳ２０５において、制御部８０が、所定数の蛍光強度を取得していないと判別した場合、制御部８０は、レーザ光照射部５０が測定対象物に印加する電界の方向を変更する（ステップＳ２０６）。例えば、図５の上下方向に電界を印加するために、制御部８０が、２つの電極４２ｃ，４２ｄを選択する。
次に、ステップＳ２０１に戻り、以後、ステップＳ２０５において、制御部８０が、所定数の蛍光強度を取得したと判別するまで、上述したステップＳ２０１〜Ｓ２０６を繰り返す。
In step S205, when the control unit 80 determines that the predetermined number of fluorescence intensities have not been acquired, the control unit 80 changes the direction of the electric field applied by the laser light irradiation unit 50 to the measurement object (step S206). ). For example, the controller 80 selects the two electrodes 42c and 42d in order to apply an electric field in the vertical direction of FIG.
Next, the process returns to step S201, and thereafter, in step S205, the above-described steps S201 to S206 are repeated until the control unit 80 determines that a predetermined number of fluorescence intensities have been acquired.
上述したように、測定対象物に電界を印加した際における蛍光色素３２の双極子モーメントの方向と、直線偏光のレーザ光の偏光方向とが一致するほど、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光強度は強くなると考えられる。そのため、測定対象物に印加する電界の方向を変更した後にステップＳ２０４において測定対象物が発する蛍光強度を取得すると、電界を印加する方向に応じた蛍光強度が取得される。 As described above, as the direction of the dipole moment of the fluorescent dye 32 when the electric field is applied to the measurement object matches the polarization direction of the linearly polarized laser beam, the measurement object irradiated with the laser light becomes more consistent. It is considered that the fluorescence intensity emitted becomes strong. Therefore, when the fluorescence intensity emitted from the measurement object is acquired in step S204 after changing the direction of the electric field applied to the measurement object, the fluorescence intensity corresponding to the direction in which the electric field is applied is acquired.
ステップＳ２０５において、制御部８０が、所定数の蛍光強度を取得したと判別した場合、制御部８０は、蛍光強度が大きくなる方向に電界を印加する方向を制御する（ステップＳ２０７）。例えば、制御部８０は、ステップＳ２０４においてデータ処理部７０が取得した蛍光強度が最大となる方向に電界を印加するように、電圧を印加する電極を選択する。
以上説明したステップにより求めた条件で測定を行うことにより、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を高めることができる。
If the control unit 80 determines in step S205 that a predetermined number of fluorescence intensities have been acquired, the control unit 80 controls the direction in which the electric field is applied in the direction in which the fluorescence intensity increases (step S207). For example, the control unit 80 selects an electrode to which a voltage is applied so that an electric field is applied in a direction in which the fluorescence intensity acquired by the data processing unit 70 in step S204 is maximized.
By performing the measurement under the conditions obtained by the steps described above, the fluorescence intensity emitted when the measurement object is irradiated with laser light can be increased.
以上説明したように、本実施形態の蛍光測定方法によれば、電界印加部４０により電界を印加された測定対象物に対し、レーザ光照射部５０が直線偏光のレーザ光を照射するため、測定対象物にレーザ光を照射した際に発せられる蛍光強度を高めることができる。 As described above, according to the fluorescence measurement method of the present embodiment, the measurement is performed because the laser beam irradiation unit 50 irradiates the linearly polarized laser beam to the measurement object to which the electric field is applied by the electric field application unit 40. The fluorescence intensity emitted when the object is irradiated with laser light can be increased.
（変形例１）
上述した実施形態においては、レーザ光源部５２が直線偏光のレーザ光を発する半導体レーザである場合の例について説明したが、レーザ光源部５２は直線偏光のレーザ光を発するレーザ光源に限定されるものではない。
レーザ光源部５２は、円偏光のレーザ光を発するレーザ光源であってもよい。図７は、本変形例のレーザ光照射部５０の一例を示す概略構成図である。図７に示される例では、レーザ光照射部５０は、円偏光のレーザ光を発するレーザ光源部５２と、偏光子５６と、を備える。偏光子５６は、円偏光から直線偏光を生成する。
本変形例のようなレーザ光照射部５０においても、測定対象物に直線偏光のレーザ光を照射することができる。
(Modification 1)
In the embodiment described above, an example in which the laser light source unit 52 is a semiconductor laser that emits linearly polarized laser light has been described. However, the laser light source unit 52 is limited to a laser light source that emits linearly polarized laser light. is not.
The laser light source unit 52 may be a laser light source that emits circularly polarized laser light. FIG. 7 is a schematic configuration diagram illustrating an example of the laser beam irradiation unit 50 of the present modification. In the example shown in FIG. 7, the laser light irradiation unit 50 includes a laser light source unit 52 that emits circularly polarized laser light, and a polarizer 56. The polarizer 56 generates linearly polarized light from circularly polarized light.
Also in the laser beam irradiation unit 50 as in the present modification, the measurement object can be irradiated with linearly polarized laser beam.
以上説明したように、本変形例のように、レーザ光照射部５０が円偏光のレーザ光を発するレーザ光源部５２と、偏光子５６とを備える場合であっても、本発明を適用することができる。 As described above, the present invention is applied even when the laser light irradiation unit 50 includes the laser light source unit 52 that emits circularly polarized laser light and the polarizer 56 as in the present modification. Can do.
（変形例２）
上述した実施形態においては、測定対象物がフローセル２２の内部を流れる方向と直交する方向に、電界印加部４０が電界を印加する例について説明したが、電界印加部４０が電界を印加する方向はこれに限定されるものではない。
電界印加部４０は、測定対象物がフローセル２２の内部を流れる方向の成分を持つ電界を印加する構成であってもよい。図８は、本変形例において、測定対象物がフローセル２２の内部を流れる方向に沿った電界印加部４０の一例を示す断面図である。図８に示される例では、電界印加部４０は、４つの電極４２ａ，４２ｂ，４２ｃ，４２ｄを備える。
(Modification 2)
In the above-described embodiment, the example in which the electric field applying unit 40 applies the electric field in the direction orthogonal to the direction in which the measurement object flows inside the flow cell 22 has been described, but the direction in which the electric field applying unit 40 applies the electric field is It is not limited to this.
The electric field applying unit 40 may be configured to apply an electric field having a component in a direction in which the measurement object flows inside the flow cell 22. FIG. 8 is a cross-sectional view showing an example of the electric field applying unit 40 along the direction in which the measurement object flows inside the flow cell 22 in this modification. In the example shown in FIG. 8, the electric field application unit 40 includes four electrodes 42a, 42b, 42c, and 42d.
電界印加部４０は制御部８０と接続されている。具体的には、４つの電極４２ａ，４２ｂ，４２ｃ，４２ｄは、それぞれ制御部８０と接続されている。これにより、４つの電極４２ａ，４２ｂ，４２ｃ，４２ｄに印加される電位は個別に制御される。
例えば、２つの電極４２ａ，４２ｂの間に電圧を印加することにより、測定対象物がフローセル２２の内部を流れる方向と直交する方向に電界を印加することができる。また、２つの電極４２ａ，４２ｄの間に電圧を印加することにより、測定対象物がフローセル２２の内部を流れる方向の成分を持つ電界を印加することができる。
The electric field applying unit 40 is connected to the control unit 80. Specifically, the four electrodes 42a, 42b, 42c, and 42d are connected to the control unit 80, respectively. Thereby, the potential applied to the four electrodes 42a, 42b, 42c, and 42d is individually controlled.
For example, by applying a voltage between the two electrodes 42a and 42b, an electric field can be applied in a direction orthogonal to the direction in which the measurement object flows through the flow cell 22. Further, by applying a voltage between the two electrodes 42a and 42d, an electric field having a component in the direction in which the measurement object flows through the flow cell 22 can be applied.
以上説明したように、本変形例のように、測定対象物がフローセル２２の内部を流れる方向の成分を持つ電界を電界印加部４０が印加する構成であっても、本発明を適用することができる。 As described above, the present invention can be applied even when the electric field applying unit 40 applies an electric field having a component in the direction in which the measurement object flows through the flow cell 22 as in the present modification. it can.
以上、本発明の蛍光測定装置及び蛍光測定方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。以上説明した実施形態や変形例は、適宜、組み合わせることができ、また、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。 Although the fluorescence measuring apparatus and the fluorescence measuring method of the present invention have been described in detail above, the present invention is not limited to the above embodiment. Of course, the embodiments and modifications described above can be combined as appropriate, and various improvements and modifications may be made without departing from the spirit of the present invention.
１０ 液体供給装置
１２ サンプル液タンク
１４ シース液タンク
１６ 配管
１８ サンプル液管
２０ シース液管
２２ フローセル
３０ 細胞
３２ 蛍光色素
４０ 電界印加部
４２ａ，４２ｂ，４２ｃ，４２ｄ 電極
５０ レーザ光照射部
５２ レーザ光源部
５４ 波長板
５６ 偏光子
６０，６２ 受光部
７０ データ処理部
８０ 制御部
９０ 容器
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Liquid supply apparatus 12 Sample liquid tank 14 Sheath liquid tank 16 Piping 18 Sample liquid pipe 20 Sheath liquid pipe 22 Flow cell 30 Cell 32 Fluorescent dye 40 Electric field application part 42a, 42b, 42c, 42d Electrode 50 Laser beam irradiation part 52 Laser light source part 54 Wave Plate 56 Polarizer 60, 62 Light Receiving Unit 70 Data Processing Unit 80 Control Unit 90 Container
Claims (8)
前記測定対象物に電界を印加する電界印加部と、
前記電界印加部が前記測定対象物に電界を印加する位置よりも、前記所定の方向の下流の位置において、前記測定対象物に直線偏光のレーザ光を照射するレーザ光照射部と、
前記測定対象物が前記レーザ光を照射された際に発せられる蛍光を受光する受光部と、を備えることを特徴とする蛍光測定装置。 A fluorescence measuring device that receives fluorescence emitted when a measurement object moving in a predetermined direction is irradiated with laser light,
An electric field applying unit for applying an electric field to the measurement object;
A laser beam irradiation unit configured to irradiate the measurement target with linearly polarized laser light at a position downstream of the predetermined direction from a position where the electric field application unit applies an electric field to the measurement target;
A fluorescence measuring apparatus comprising: a light receiving unit that receives fluorescence emitted when the measurement object is irradiated with the laser beam.
前記データ処理部が求めた蛍光強度に基づいて、前記レーザ光照射部が前記測定対象物に照射するレーザ光の偏光方向を制御する制御部と、
を備える、請求項１又は２に記載の蛍光測定装置。 Based on the fluorescence received by the light receiving unit, a data processing unit for obtaining the fluorescence intensity emitted by the measurement object;
Based on the fluorescence intensity obtained by the data processing unit, a control unit that controls the polarization direction of the laser beam that the laser beam irradiation unit irradiates the measurement object;
The fluorescence measuring device according to claim 1, comprising:
前記データ処理部が求めた蛍光強度に基づいて、前記電界印加部が前記測定対象物に印加する電界の方向を制御する制御部と、
を備える、請求項１乃至３のいずれかに記載の蛍光測定装置。 Based on the fluorescence received by the light receiving unit, a data processing unit for obtaining the fluorescence intensity emitted by the measurement object;
Based on the fluorescence intensity obtained by the data processing unit, a control unit for controlling the direction of the electric field applied to the measurement object by the electric field application unit,
The fluorescence measuring device according to claim 1, comprising:
前記測定対象物に電界を印加する電界印加工程と、
前記電界印加工程の後に、前記測定対象物に直線偏光のレーザ光を照射する照射工程と、
前記測定対象物が前記レーザ光を照射された際に発せられる蛍光を受光する受光工程と、
を有することを特徴とする蛍光測定方法。 A fluorescence measurement method for receiving fluorescence emitted when a measurement target moving in a predetermined direction is irradiated with laser light,
An electric field application step of applying an electric field to the measurement object;
An irradiation step of irradiating the measurement object with linearly polarized laser light after the electric field application step;
A light receiving step for receiving fluorescence emitted when the measurement object is irradiated with the laser beam;
A fluorescence measuring method characterized by comprising:
前記データ処理工程において求めた蛍光強度に基づいて、前記測定対象物に照射する前記レーザ光の偏光方向を制御する制御工程と、
を有する、請求項６に記載の蛍光測定方法。 Based on the fluorescence received in the light receiving step, a data processing step for obtaining the fluorescence intensity emitted by the measurement object;
Based on the fluorescence intensity obtained in the data processing step, a control step for controlling the polarization direction of the laser light irradiated on the measurement object;
The fluorescence measurement method according to claim 6, comprising:
前記データ処理工程において求めた蛍光強度に基づいて、前記測定対象物に電界を印加する方向を制御する制御工程と、
を有する、請求項６又は７に記載の蛍光測定方法。 Based on the fluorescence received in the light receiving step, a data processing step for obtaining the fluorescence intensity emitted by the measurement object;
Based on the fluorescence intensity obtained in the data processing step, a control step for controlling the direction in which an electric field is applied to the measurement object;
The fluorescence measurement method according to claim 6 or 7, comprising:
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