JP2011118265A

JP2011118265A - Microscope device

Info

Publication number: JP2011118265A
Application number: JP2009277354A
Authority: JP
Inventors: 和浩 ▲高▼砂; Kazuhiro Takasago
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2011-06-16

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a microscope device which can achieve the miniaturization thereof, and which is usable while switching between a confocal microscope and a total reflection microscope. <P>SOLUTION: The microscope device 1 includes: a two-dimensional scanner 34; and a condenser lens 203 having positive refractive power; wherein, in the state where the condenser lens 203 is deviated from the optical axis, a sample 12 can be scanned and illuminated by the two-dimensional scanner 34, while, in the state where the condenser lens 203 is inserted to the optical axis, the total reflection illumination of the sample 12 can be achieved. The condenser lens 203 is configured to move vertically with respect to the optical axis in the state where the condenser lens 203 is inserted to the optical axis, and upon the total reflection illumination of the sample 12, the principle rays of the laser luminous flux passing through the condenser lens 203 are moved vertically with respect to the optical axis by deflecting the laser luminous flux emitted from the laser light source to be made incident on the condenser lens 203 by the two-dimensional scanner 34, alternatively, moving the condenser lens 203 inserted to the optical axis vertically with respect to the optical axis, accordingly, the light condensing position in the pupil position P of the objective lens 16 becomes adjustable. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、共焦点顕微鏡と全反射顕微鏡とを切り換えて使用可能な顕微鏡装置に関する。 The present invention relates to a microscope apparatus that can be used by switching between a confocal microscope and a total reflection microscope.

共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡は、生体細胞等の観察に広く利用されている。両者は共にレーザ光源を使用する点で一致しており、共焦点顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡とを切り換えて使用することができる顕微鏡装置が提案されている。 Confocal microscopes and total reflection fluorescence microscopes are widely used for observing living cells and the like. Both of them match in that a laser light source is used, and a microscope apparatus that can be used by switching between a confocal microscope and a total reflection fluorescence microscope has been proposed.

特開２００５−１２１７９６号公報JP 2005-121796 A

従来の顕微鏡では、共焦点顕微鏡から全反射顕微鏡に切り換える際に、対物レンズの瞳位置の全反射領域にレーザ光を集光させるための光学部材を照明光学系内に挿入しなければならず、この切り換えのために大掛かりな切り換え機構が必要となり、顕微鏡装置の大型化に繋がるという問題があった。 In the conventional microscope, when switching from the confocal microscope to the total reflection microscope, an optical member for condensing the laser light on the total reflection area at the pupil position of the objective lens must be inserted into the illumination optical system. For this switching, a large switching mechanism is required, which leads to an increase in the size of the microscope apparatus.

本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、装置の小型化を図った、共焦点顕微鏡と全反射顕微鏡とを切り換えて使用可能な顕微鏡装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such problems, and an object of the present invention is to provide a microscope apparatus that can be used by switching between a confocal microscope and a total reflection microscope, which is miniaturized.

このような目的を達成するため、本発明は、レーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光束を対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、前記レーザ光源と前記対物レンズとの間に配置され、前記レーザ光源からのレーザ光を偏向する偏向手段と、前記偏向手段と前記対物レンズとの間に挿脱可能に設けられ、前記偏向手段を介した前記レーザ光源からのレーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の所定領域に集光するための、正の屈折力を有する集光レンズと、前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系とを備え、前記集光レンズが光軸から外されている場合に、前記偏向手段により前記標本の走査照明が可能であり、前記集光レンズを光軸に挿入した場合に、前記標本の全反射照明が可能である顕微鏡装置において、前記集光レンズを、光軸に挿入した場合に、光軸に対して垂直移動可能に構成し、前記標本の全反射照明時において、前記集光レンズに入射させる前記レーザ光源からのレーザ光束を前記偏向手段により偏向させるか、または、光軸に挿入した前記集光レンズを光軸に対して垂直移動させるか、少なくともどちらか一方を行うことにより、前記集光レンズを通過したレーザ光束の主光線を光軸に対して垂直方向に移動させ、前記対物レンズの瞳位置における集光位置を調整可能にした。 In order to achieve such an object, the present invention provides a laser light source, an illumination optical system that irradiates a specimen with a laser beam from the laser light source via an objective lens, and a gap between the laser light source and the objective lens. And a deflecting means for deflecting the laser light from the laser light source, and detachably provided between the deflecting means and the objective lens, and the laser beam from the laser light source via the deflecting means is A condensing lens having a positive refractive power for condensing on a predetermined region of the pupil position of the objective lens, and a fluorescence detection optical system for detecting fluorescence from the specimen, wherein the condensing lens is In the microscope apparatus in which the specimen can be scanned and illuminated by the deflecting means when the lens is removed, and the specimen can be totally reflected when the condenser lens is inserted into the optical axis. Hikari When the lens is inserted into the optical axis, the deflecting means is configured to be able to move vertically with respect to the optical axis so that the laser beam from the laser light source incident on the condenser lens during total reflection illumination of the specimen The principal ray of the laser light beam that has passed through the condenser lens is converted into light by deflecting the condenser lens inserted in the optical axis or moving the condenser lens inserted perpendicularly to the optical axis. The focusing position at the pupil position of the objective lens can be adjusted by moving in the direction perpendicular to the axis.

なお、前記集光レンズは、楔プリズムと、凸レンズとの貼り合わせから構成してもよい。 The condensing lens may be formed by bonding a wedge prism and a convex lens.

また、前記集光レンズと前記対物レンズとの間に設けられ、前記集光レンズを通過し前記対物レンズの瞳位置に集光されるレーザ光が通るように構成された複数の反射部材と、
光路長を変化させつつ、前記反射部材を通過した前記レーザ光の主光線が光軸に対して平行になるように、前記複数の反射部材のうち少なくとも一つを移動させる移動機構とを備え、前記移動機構を用いて前記複数の反射部材のうち少なくとも一つを移動させることにより、前記複数の反射部材を通過したレーザ光の主光線を光軸に対して垂直方向に移動させ、前記対物レンズの瞳位置における集光位置を調整可能にしてもよい。 A plurality of reflecting members provided between the condenser lens and the objective lens, configured to pass laser light that passes through the condenser lens and is condensed at a pupil position of the objective lens;
A moving mechanism that moves at least one of the plurality of reflecting members so that the principal ray of the laser light that has passed through the reflecting member is parallel to the optical axis while changing the optical path length; By moving at least one of the plurality of reflecting members using the moving mechanism, the chief ray of the laser light that has passed through the plurality of reflecting members is moved in a direction perpendicular to the optical axis, and the objective lens The condensing position at the pupil position may be adjustable.

また、前記集光レンズと前記対物レンズとの間に設けられ、前記集光レンズを通過し前記対物レンズの瞳位置に集光されるレーザ光が通るように構成された平行平板と、前記平行平板を光軸に対して回転させる回転機構とを備え、前記回転機構を用いて前記平行平板を光軸に対して回転させることにより、前記平行平板を通過したレーザ光の主光線を光軸に対して垂直方向に移動させ、前記対物レンズの瞳位置における集光位置を調整可能にしてもよい。 A parallel plate provided between the condenser lens and the objective lens and configured to pass a laser beam that passes through the condenser lens and is condensed at a pupil position of the objective lens; A rotation mechanism for rotating the flat plate with respect to the optical axis, and by using the rotation mechanism to rotate the parallel plate with respect to the optical axis, the principal ray of the laser beam that has passed through the parallel plate is used as the optical axis. On the other hand, it may be moved in the vertical direction so that the focusing position at the pupil position of the objective lens can be adjusted.

また、前記照明光学系として、落射照明光学系を有することが好ましい。 Moreover, it is preferable to have an epi-illumination optical system as the illumination optical system.

本発明によれば、装置の小型化を図った、共焦点顕微鏡と全反射顕微鏡とを切り換えて使用可能な顕微鏡装置を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a microscope apparatus that can be used by switching between a confocal microscope and a total reflection microscope, in which the apparatus is miniaturized.

本実施形態に係る顕微鏡装置の概略断面図である。It is a schematic sectional drawing of the microscope apparatus which concerns on this embodiment. 本実施形態に係る顕微鏡装置の光学系を示した図である。It is the figure which showed the optical system of the microscope apparatus which concerns on this embodiment. 本実施形態に係る顕微鏡装置において、全反射顕微鏡に切り換えた際の顕微鏡装置の光学系を示した図である。It is the figure which showed the optical system of the microscope apparatus at the time of switching to the total reflection microscope in the microscope apparatus which concerns on this embodiment. 本実施形態に係る顕微鏡装置を構成する集光レンズの作用を説明する図であり、（ａ）は共焦点走査照明状態または落射照明状態を、（ｂ）は全反射照明状態を説明する図である。It is a figure explaining the effect | action of the condensing lens which comprises the microscope apparatus which concerns on this embodiment, (a) is a confocal scanning illumination state or epi-illumination state, (b) is a figure explaining a total reflection illumination state. is there. 本実施形態に係る顕微鏡装置において、光軸上に集光レンズを挿入した際の顕微鏡装置の光学系を示した図である。It is the figure which showed the optical system of the microscope apparatus at the time of inserting the condensing lens on the optical axis in the microscope apparatus which concerns on this embodiment. 本実施形態に係る顕微鏡装置において、集光レンズを光軸方向に垂直移動可能に構成した際の顕微鏡装置の光学系を示した図である。It is the figure which showed the optical system of the microscope apparatus at the time of comprising the condensing lens so that vertical movement to an optical axis direction was possible in the microscope apparatus which concerns on this embodiment. 本実施形態に係る顕微鏡装置において、集光レンズの代わりに、楔プリズムと凸レンズとの貼り合わせからなる光学部材を用いた際の顕微鏡装置の光学系を示した図である。It is the figure which showed the optical system of the microscope apparatus at the time of using the optical member consisting of bonding of a wedge prism and a convex lens instead of a condensing lens in the microscope apparatus which concerns on this embodiment. 本実施形態に係る顕微鏡装置において、反射部材を設けた際の顕微鏡装置の光学系を示した図である。It is the figure which showed the optical system of the microscope apparatus at the time of providing the reflective member in the microscope apparatus which concerns on this embodiment. 本実施形態に係る顕微鏡装置において、平行平板を設けた際の顕微鏡装置の光学系を示した図である。In the microscope apparatus which concerns on this embodiment, it is the figure which showed the optical system of the microscope apparatus at the time of providing a parallel plate.

以下、本発明に係る実施形態について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る顕微鏡装置の概略断面図である。図２は、本実施形態に係る顕微鏡装置の光学系を示した図である。図３は、本実施形態に係る顕微鏡装置において、全反射顕微鏡に切り換えた際の顕微鏡装置の光学系を示した図である。図４は、本実施形態に係る顕微鏡装置を構成する集光レンズの作用を説明する図である。なお、図２、図３では、後述する透過照明光学系の記載を省略している。 Hereinafter, embodiments according to the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of the microscope apparatus according to the present embodiment. FIG. 2 is a diagram showing an optical system of the microscope apparatus according to the present embodiment. FIG. 3 is a diagram illustrating an optical system of the microscope apparatus when the microscope apparatus according to the present embodiment is switched to the total reflection microscope. FIG. 4 is a diagram for explaining the operation of the condenser lens constituting the microscope apparatus according to the present embodiment. In FIG. 2 and FIG. 3, description of a transmission illumination optical system to be described later is omitted.

図１から図４において、顕微鏡装置１は、倒立型蛍光顕微鏡本体２と、顕微鏡本体２に搭載されている各種装置を制御するパーソナルコンピュータ等を有する制御装置（以下、ＰＣと記す）３とから構成される。 1 to 4, the microscope apparatus 1 includes an inverted fluorescent microscope main body 2 and a control device (hereinafter referred to as a PC) 3 having a personal computer or the like that controls various devices mounted on the microscope main body 2. Composed.

まず、顕微鏡装置１を透過型顕微鏡として使用する場合について、図１及び図２を用いて説明する。 First, the case where the microscope apparatus 1 is used as a transmission microscope will be described with reference to FIGS. 1 and 2.

顕微鏡本体２は、ステージ１１と、ステージ１１に載置された標本１２に透過照明光源１３からの光を照射する透過照明光学系１４と、標本１２を透過した光を集光する対物レンズ１６と、対物レンズ１６を複数搭載したリボルバ１５と、結像光学系１７と、レンズ１９ａを備えた接眼鏡筒１９と、不図示の接眼レンズとを有する。結像光学系１７は、対物レンズ１６側から順に、結像レンズ１８と、ミラーＭ１と、リレーレンズ１７ｂと、ミラーＭ２と、リレーレンズ１７ｃと、ミラーＭ３とを備える。 The microscope main body 2 includes a stage 11, a transmission illumination optical system 14 that irradiates the specimen 12 placed on the stage 11 with light from the transmission illumination light source 13, and an objective lens 16 that condenses the light transmitted through the specimen 12. And a revolver 15 equipped with a plurality of objective lenses 16, an imaging optical system 17, an eyepiece tube 19 provided with a lens 19a, and an eyepiece (not shown). The imaging optical system 17 includes an imaging lens 18, a mirror M1, a relay lens 17b, a mirror M2, a relay lens 17c, and a mirror M3 in order from the objective lens 16 side.

なお、顕微鏡本体２は、対物レンズ１６と結像光学系１７との間に、後述の照明光学系５１を構成する蛍光キューブボックス２０を備えている。蛍光キューブボックス２０は、内部に複数の蛍光キューブを装着可能であり、必要に応じて光路上から該当する蛍光キューブを光路上から挿脱可能に構成されている。なお、今回のように透過型顕微鏡として使用する場合、蛍光キューブボックス２０内の蛍光キューブは、いずれも光路上から外されている。 The microscope body 2 includes a fluorescent cube box 20 that constitutes an illumination optical system 51 described later between the objective lens 16 and the imaging optical system 17. The fluorescent cube box 20 can be equipped with a plurality of fluorescent cubes, and is configured so that the corresponding fluorescent cube can be inserted and removed from the optical path as needed. In addition, when using as a transmission microscope like this time, all the fluorescent cubes in the fluorescent cube box 20 are removed from the optical path.

また、顕微鏡本体２は、結像光学系１７を構成する結像レンズ１８とミラーＭ１との間に、プリズム２２を備えている。プリズム２２は、光路上から挿脱可能に構成されており、標本１２の透過像を観察する場合には光路上から外す。 The microscope body 2 includes a prism 22 between the imaging lens 18 constituting the imaging optical system 17 and the mirror M1. The prism 22 is configured to be detachable from the optical path, and is removed from the optical path when a transmission image of the specimen 12 is observed.

透過型顕微鏡として使用する場合、透過照明光源１３から射出した光は透過照明光学系１４を介してステージ１１上の標本１２に照射され、標本１２を透過した光は対物レンズ１６により集光される。そして、対物レンズ１６により集光された光は、結像光学系１７に入り、結像レンズ１８と、ミラーＭ１とを介して、一次像面１７ａに結像される。一次像面１７ａに結像された標本１２の像は、リレーレンズ１７ｂと、ミラーＭ２と、リレーレンズ１７ｃと、接眼鏡筒１９のレンズ１９ａ及びミラーＭ３を介して二次像面１８ｂに結像され、不図示の接眼レンズを介して観察者に観察される。このように、顕微鏡装置１を、透過型顕微鏡として使用することができる。 When used as a transmission microscope, the light emitted from the transmission illumination light source 13 is irradiated onto the specimen 12 on the stage 11 via the transmission illumination optical system 14, and the light transmitted through the specimen 12 is collected by the objective lens 16. . The light condensed by the objective lens 16 enters the imaging optical system 17, and forms an image on the primary image surface 17a via the imaging lens 18 and the mirror M1. The image of the specimen 12 formed on the primary image surface 17a forms an image on the secondary image surface 18b via the relay lens 17b, the mirror M2, the relay lens 17c, the lens 19a of the eyepiece tube 19, and the mirror M3. And observed by an observer through an eyepiece (not shown). Thus, the microscope apparatus 1 can be used as a transmission microscope.

また、本実施形態において、顕微鏡本体２には、共焦点走査観察系３１と、落射照明系４１とが、共通の照明光学系５１を介して配置されている。 In the present embodiment, the microscope main body 2 is provided with a confocal scanning observation system 31 and an epi-illumination system 41 via a common illumination optical system 51.

次に、顕微鏡装置１を走査型顕微鏡（走査型蛍光顕微鏡、共焦点走査型顕微鏡）として使用する場合について、図２を参照しつつ説明する。 Next, the case where the microscope apparatus 1 is used as a scanning microscope (scanning fluorescence microscope, confocal scanning microscope) will be described with reference to FIG.

共焦点走査観察系３１は、不図示のレーザ光源と、このレーザ光源からのレーザ光を導く光ファイバ３２と、光ファイバ３２の端面から射出されたレーザ光を略平行光に変換するコレクタレンズ３３と、コレクタレンズ３３によって変換された略平行光を標本１２上で二次元に走査させる二次元スキャナ３４と、二次元スキャナ３４を通った略平行光を集光して像面ＩＰ１に結像させる瞳リレーレンズ３５と、コレクタレンズ３３と二次元スキャナ３４との間に設けられたダイクロイックミラー３６と、ダイクロイックミラー３６により反射された光をピンホール３８を介してＰＭＴ等の受光素子３９に結像させる結像レンズ３７とを備える。 The confocal scanning observation system 31 includes a laser light source (not shown), an optical fiber 32 that guides the laser light from the laser light source, and a collector lens 33 that converts the laser light emitted from the end face of the optical fiber 32 into substantially parallel light. And the two-dimensional scanner 34 that scans the specimen 12 in two dimensions with the substantially parallel light converted by the collector lens 33, and the substantially parallel light that has passed through the two-dimensional scanner 34 is condensed to form an image on the image plane IP1. The pupil relay lens 35, a dichroic mirror 36 provided between the collector lens 33 and the two-dimensional scanner 34, and the light reflected by the dichroic mirror 36 are imaged on a light receiving element 39 such as a PMT through a pinhole 38. The imaging lens 37 is provided.

照明光学系５１は、像面ＩＰ１で瞳リレーレンズ３５により結像された像を光軸に略平行なレーザ光に変換する結像レンズ５２と、蛍光キューブボックス２０内の蛍光キューブ２１と、対物レンズ１６とを備える。 The illumination optical system 51 includes an imaging lens 52 that converts an image formed by the pupil relay lens 35 on the image plane IP1 into laser light substantially parallel to the optical axis, the fluorescent cube 21 in the fluorescent cube box 20, the objective A lens 16.

走査型顕微鏡として使用する場合、光路上に配置する上記蛍光キューブ２１として、波長選択フィルタ２１ａ、ダイクロイックミラー２１ｂ、及び、エミッションフィルタ２１ｃを内蔵したものを、蛍光キューブボックス２０内から選択し、光路上に配置する。 When used as a scanning microscope, the fluorescent cube 21 arranged on the optical path is selected from the fluorescent cube box 20 with the wavelength selection filter 21a, the dichroic mirror 21b, and the emission filter 21c built-in. To place.

なお、顕微鏡本体２は、共焦点走査観察系３１（具体的には瞳リレーレンズ３５）と照明光学系５１（具体的には結像レンズ５２）との間に、後述する落射照明系４１を構成するダイクロイックミラー４４を備えているが、共焦点走査観察系３１を使用する場合には照明光学系５１の光軸上から外す。 The microscope body 2 includes an epi-illumination system 41 (to be described later) between the confocal scanning observation system 31 (specifically, the pupil relay lens 35) and the illumination optical system 51 (specifically, the imaging lens 52). The dichroic mirror 44 is provided, but is removed from the optical axis of the illumination optical system 51 when the confocal scanning observation system 31 is used.

また、顕微鏡本体２は、結像光学系１７を構成する結像レンズ１８とミラーＭ１との間に、光路上から挿脱可能に設けたプリズム２２を、共焦点走査観察系３１を使用する場合には光路上に配置する。 In the case where the microscope main body 2 uses the confocal scanning observation system 31, the prism 22 provided so as to be insertable / removable from the optical path between the imaging lens 18 constituting the imaging optical system 17 and the mirror M <b> 1. Is placed on the optical path.

走査型蛍光顕微鏡として使用する場合、共焦点走査観察系３１において、不図示のレーザ光源から射出されたレーザ光は、光ファイバ３２によりコレクタレンズ３３に導かれ、このコレクタレンズ３３により略平行光に変換された後、二次元スキャナ３４を経て、瞳リレーレンズ３５に入射し、この瞳リレーレンズ３５により像面ＩＰ１にて結像される。続いて、像面ＩＰ１から射出したレーザ光は、照明光学系５１において、結像レンズ５２により略平行光にされた後、蛍光キューブ２１に入射する。蛍光キューブ２１に入射したレーザ光は、波長選択フィルタ２１ａにより所定の励起波長のレーザ光が選択された後、ダイクロイックミラー２１ｂにより対物レンズ１６の方向に反射され、対物レンズ１６に入射して標本１２に集光される。 When used as a scanning fluorescence microscope, in the confocal scanning observation system 31, laser light emitted from a laser light source (not shown) is guided to a collector lens 33 by an optical fiber 32, and is converted into substantially parallel light by the collector lens 33. After the conversion, the light enters the pupil relay lens 35 through the two-dimensional scanner 34, and is imaged on the image plane IP1 by the pupil relay lens 35. Subsequently, the laser light emitted from the image plane IP 1 is made substantially parallel light by the imaging lens 52 in the illumination optical system 51 and then enters the fluorescent cube 21. The laser light incident on the fluorescent cube 21 is reflected in the direction of the objective lens 16 by the dichroic mirror 21b after the laser light having a predetermined excitation wavelength is selected by the wavelength selection filter 21a, enters the objective lens 16 and enters the sample 12 It is condensed to.

レーザ光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６により集光されて蛍光キューブ２１に入射し、蛍光キューブ２１を構成するダイクロイックミラー２１ｂを透過し、エミッションフィルタ２１ｃにより所定の蛍光が選択された後、結像レンズ１８によりプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され、撮像素子２３により蛍光像が撮像される。そして、撮像素子２３により撮像された蛍光像は、図１に示すＰＣ３により画像処理され、モニター３ａに表示される。このように、顕微鏡装置１は、走査型蛍光顕微鏡として使用することができる。 The fluorescence excited by the laser light and expressed in the specimen 12 is collected by the objective lens 16, enters the fluorescent cube 21, passes through the dichroic mirror 21b constituting the fluorescent cube 21, and a predetermined fluorescence is selected by the emission filter 21c. After that, the imaging lens 18 forms an image on the image sensor 23 via the prism 22, and a fluorescence image is captured by the image sensor 23. And the fluorescence image imaged with the image pick-up element 23 is image-processed by PC3 shown in FIG. 1, and is displayed on the monitor 3a. Thus, the microscope apparatus 1 can be used as a scanning fluorescence microscope.

一方、共焦点走査型顕微鏡として使用する場合、標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６により集光され、蛍光キューブ２１内のダイクロイックミラー２１ｂにより反射され、照明光学系５１の結像レンズ５２と共焦点走査観察光学系３１の瞳リレーレンズ３５とを逆行し、二次元スキャナ３４に入射してデスキャンされ、ダイクロイックミラー３６により反射され、結像レンズ３７とピンホール３８とを介して、ＰＭＴ等の受光素子３９に入射し、該素子３９上の各点での光の強度に基づきＰＣ３により二次元像が生成され、モニター３ａに表示される。このように、顕微鏡装置１は、共焦点走査型顕微鏡として使用することができる。 On the other hand, when used as a confocal scanning microscope, the fluorescence expressed in the specimen 12 is collected by the objective lens 16, reflected by the dichroic mirror 21 b in the fluorescent cube 21, and the imaging lens 52 of the illumination optical system 51. Reverses the pupil relay lens 35 of the confocal scanning observation optical system 31, enters the two-dimensional scanner 34, is descanned, is reflected by the dichroic mirror 36, and passes through the imaging lens 37 and the pinhole 38, and the PMT or the like. A two-dimensional image is generated by the PC 3 based on the light intensity at each point on the element 39 and displayed on the monitor 3a. Thus, the microscope apparatus 1 can be used as a confocal scanning microscope.

なお、顕微鏡装置１では、撮像素子２３により撮像された蛍光画像と、受光素子３９により受光された共焦点画像とを、モニター３ａに重ねて表示させるなどして観察することが可能である。 In the microscope apparatus 1, it is possible to observe the fluorescent image captured by the image sensor 23 and the confocal image received by the light receiving element 39 by displaying them on the monitor 3a.

次に、顕微鏡装置１を落射蛍光顕微鏡として使用する場合について、図２を参照しつつ説明する。 Next, the case where the microscope apparatus 1 is used as an epifluorescence microscope will be described with reference to FIG.

顕微鏡本体２は、落射照明系４１として、不図示の光源と、この光源からの光を導く光ファイバ４２と、光ファイバ４２の端面から射出された光を略平行光に変換するコレクタレンズ４３と、視野絞り４５と、照明光学系５１の光軸上から挿脱可能に構成されたダイクロイックミラー４４とを備える。なお、不図示の光源には、レーザ光源、高圧水銀ランプ、あるいはキセノンランプ等が使用可能である。 The microscope main body 2 includes, as an epi-illumination system 41, a light source (not shown), an optical fiber 42 that guides light from the light source, and a collector lens 43 that converts light emitted from the end face of the optical fiber 42 into substantially parallel light. The field stop 45 and the dichroic mirror 44 configured to be detachable from the optical axis of the illumination optical system 51 are provided. As a light source (not shown), a laser light source, a high-pressure mercury lamp, a xenon lamp, or the like can be used.

落射蛍光顕微鏡として使用する場合、照明光学系５１内に配置する蛍光キューブ２１として、波長選択フィルタ２１ａ、ダイクロイックミラー２１ｂ、及び、エミッションフィルタ２１ｃを内蔵したものを、蛍光キューブボックス２０内から選択し、光路上に配置する。 When used as an epi-illumination fluorescence microscope, a fluorescent cube 21 arranged in the illumination optical system 51 is selected from the fluorescent cube box 20 with a wavelength selection filter 21a, a dichroic mirror 21b, and an emission filter 21c built-in. Place on the optical path.

落射蛍光顕微鏡として使用する場合、落射照明系４１において、不図示の光源から射出した光は、光ファイバ４２によりコレクタレンズ４３に導かれ、このコレクタレンズ４３により略平行に変換された後、視野絞り４５を介し、照明光学系５１の光軸上に配置されたダイクロイックミラー４４により反射され、照明光学系５１の結像レンズ５２により集光され、照明光学系５１の光軸に対して略平行な光として光路上に配置された蛍光キューブ２１に入射する。蛍光キューブ２１に入射した光は、波長選択フィルタ２１ａにより所定の励起波長のレーザ光が選択され、ダイクロイックミラー２１ｂにより対物レンズ１６の方向に反射され、対物レンズ１６に入射して標本１２に集光される。 When used as an epi-illumination fluorescent microscope, in the epi-illumination system 41, light emitted from a light source (not shown) is guided to a collector lens 43 by an optical fiber 42, converted into substantially parallel by the collector lens 43, and then a field stop. 45, reflected by a dichroic mirror 44 disposed on the optical axis of the illumination optical system 51, condensed by an imaging lens 52 of the illumination optical system 51, and substantially parallel to the optical axis of the illumination optical system 51. The light enters the fluorescent cube 21 disposed on the optical path. The light incident on the fluorescent cube 21 is selected as laser light having a predetermined excitation wavelength by the wavelength selection filter 21 a, reflected by the dichroic mirror 21 b in the direction of the objective lens 16, incident on the objective lens 16, and condensed on the specimen 12. Is done.

この光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６により集光され、蛍光キューブ２１を構成するダイクロイックミラー２１ｂを透過し、エミッションフィルタ２１ｃにより所定の蛍光が選択された後、結像レンズ１８により結像光学系１７内に配置されたプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され、撮像素子２３により蛍光像が撮像される。そして、撮像素子２３により撮像された蛍光像は、図１に示すＰＣ３により画像処理され、モニター３ａに表示される。このように、顕微鏡装置１は、落射蛍光顕微鏡として使用することができる。 The fluorescence excited by this light and expressed in the specimen 12 is collected by the objective lens 16, passes through the dichroic mirror 21b constituting the fluorescent cube 21, and after the predetermined fluorescence is selected by the emission filter 21c, the imaging lens 18 forms an image on the image sensor 23 via the prism 22 disposed in the imaging optical system 17, and a fluorescence image is captured by the image sensor 23. And the fluorescence image imaged with the image pick-up element 23 is image-processed by PC3 shown in FIG. 1, and is displayed on the monitor 3a. Thus, the microscope apparatus 1 can be used as an epifluorescence microscope.

続いて、顕微鏡装置１を全反射顕微鏡として使用する場合について、図３及び図４（ｂ）を参照しつつ説明する。 Next, the case where the microscope apparatus 1 is used as a total reflection microscope will be described with reference to FIGS. 3 and 4B.

全反射顕微鏡として使用する場合、照明として、上述の共焦点走査観察系３１を使用する。また、蛍光キューブボックス２０内から、遮光板２０２、集光レンズ２０３、ダイクロイックミラー２１ｂ、及び、エミッションフィルタ２１ｃを内蔵した蛍光キューブ２０１を選択し、光路上に配置する。 When used as a total reflection microscope, the above-described confocal scanning observation system 31 is used as illumination. In addition, the fluorescent cube 201 including the light shielding plate 202, the condensing lens 203, the dichroic mirror 21b, and the emission filter 21c is selected from the fluorescent cube box 20, and disposed on the optical path.

集光レンズ２０３は、正の屈折力を持つレンズ群であり、対物レンズ１６の瞳位置Ｐに集光する焦点距離ｆを有しており、その光軸は照明光学系５１の光軸から距離「ｄ」だけ偏心して配置されている（図４（ｂ）参照）。遮光板２０２は、集光レンズ２０３の外側を通るレーザ光線を遮光するものであり、集光レンズ２０３とほぼ同じ大きさの開口が形成されており、集光レンズ２０３の外側を囲うように設置する。 The condensing lens 203 is a lens group having a positive refractive power, and has a focal length f for condensing at the pupil position P of the objective lens 16, and its optical axis is a distance from the optical axis of the illumination optical system 51. They are arranged eccentrically by “d” (see FIG. 4B). The light shielding plate 202 shields the laser beam that passes outside the condenser lens 203, has an opening of almost the same size as the condenser lens 203, and is installed so as to surround the outside of the condenser lens 203. To do.

蛍光キューブ２０１に入射したレーザ光は、その主光線が集光レンズ２０３によって照明光学系５１の光軸に対して略平行となり、対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおいて照明光学系５１の光軸に対して距離「ｄ」の位置に集光される。この距離「ｄ」は、対物レンズ１６の全反射条件となる開口数（ＮＡ）の位置に対応している。 The chief ray of the laser light incident on the fluorescent cube 201 becomes substantially parallel to the optical axis of the illumination optical system 51 by the condenser lens 203, and the optical axis of the illumination optical system 51 at the pupil position P of the objective lens 16. Then, the light is condensed at the position of the distance “d”. This distance “d” corresponds to the position of the numerical aperture (NA) that is the total reflection condition of the objective lens 16.

全反射顕微鏡として使用する場合、共焦点走査観察系３１の不図示のレーザ光源から射出されたレーザ光は、光ファイバ３２によりコレクタレンズ３３に導かれ、このコレクタレンズ３３により略平行な光に変換され、二次元スキャナ３４に入射する。なお、二次元スキャナ３４を構成するＸＹ各ミラーの傾斜角度は、レーザ光を対物レンズ１６の瞳位置Ｐの全反射条件領域に集光させるため、ＰＣ３の制御部（図１参照）により所定の角度に制御されている。このような二次元スキャナ３４から射出した光軸シフト後のレーザ光は、瞳リレーレンズ３５により像面ＩＰ１で結像された後、照明光学系５１の結像レンズ５２を介して、光路上に配置された蛍光キューブ２０１に入射する。 When used as a total reflection microscope, laser light emitted from a laser light source (not shown) of the confocal scanning observation system 31 is guided to a collector lens 33 by an optical fiber 32 and converted into substantially parallel light by the collector lens 33. And enters the two-dimensional scanner 34. Note that the tilt angles of the XY mirrors constituting the two-dimensional scanner 34 are predetermined by the control unit (see FIG. 1) of the PC 3 in order to focus the laser light on the total reflection condition region at the pupil position P of the objective lens 16. The angle is controlled. The laser beam after the optical axis shift emitted from the two-dimensional scanner 34 is imaged on the image plane IP1 by the pupil relay lens 35, and then enters the optical path via the imaging lens 52 of the illumination optical system 51. The light enters the arranged fluorescent cube 201.

蛍光キューブ２０１に入射したレーザ光は、集光レンズ２０３を通ってその主光線が照明光学系５１の光軸に対して略平行となった後、ダイクロイックミラー２１ｂにより対物レンズ１６の方向に反射され、対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおいて照明光学系５１の光軸から距離「ｄ」の位置にある輪帯状の全反射条件領域に集光される。全反射条件領域に集光されたレーザ光は、標本１２とこれを支持する不図示のガラス基板との境界面にて全反射を起こす入射角で、対物レンズ１６から標本１２に入射する。全反射角で標本１２に入射したレーザ光は、境界面にエバネッセント波を発生し、標本１２の境界面近傍では、このエバネッセント波により励起された蛍光が発生する。 The laser light incident on the fluorescent cube 201 passes through the condensing lens 203 and its principal ray becomes substantially parallel to the optical axis of the illumination optical system 51, and is then reflected by the dichroic mirror 21b in the direction of the objective lens 16. At the pupil position P of the objective lens 16, the light is condensed on the annular total reflection condition region located at a distance “d” from the optical axis of the illumination optical system 51. The laser beam focused on the total reflection condition region enters the sample 12 from the objective lens 16 at an incident angle that causes total reflection at the boundary surface between the sample 12 and a glass substrate (not shown) that supports the sample 12. The laser light incident on the sample 12 at the total reflection angle generates an evanescent wave at the boundary surface, and fluorescence excited by the evanescent wave is generated near the boundary surface of the sample 12.

エバネッセント波で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６により集光されて蛍光キューブ２０１に入射し、蛍光キューブ２０１を構成するダイクロイックミラー２１ｂを透過し、エミッションフィルタ２１ｃにより所定の蛍光が選択された後、結像レンズ１８によりプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され、撮像素子２３により蛍光像が撮像される。そして、撮像素子２３により撮像された蛍光像は、図１に示すＰＣ３により画像処理され、モニター３ａに表示される。 The fluorescence excited by the evanescent wave and expressed in the specimen 12 is collected by the objective lens 16 and enters the fluorescence cube 201, passes through the dichroic mirror 21b constituting the fluorescence cube 201, and a predetermined fluorescence is selected by the emission filter 21c. After that, the imaging lens 18 forms an image on the image sensor 23 via the prism 22, and a fluorescence image is captured by the image sensor 23. And the fluorescence image imaged with the image pick-up element 23 is image-processed by PC3 shown in FIG. 1, and is displayed on the monitor 3a.

このように、顕微鏡装置１は、前述の蛍光キューブ２１を蛍光キューブ２０１に交換し、この蛍光キューブ２０１内の集光レンズ２０３と二次元スキャナ３４とを用いて、レーザ光の光軸Ｉ１を照明光学系５１の光軸から距離「ｄ」だけ略平行に移動させ、対物レンズ１６の瞳位置Ｐの全反射時条件領域に集光させることによって、全反射蛍光顕微鏡として使用することができる。 As described above, the microscope apparatus 1 replaces the fluorescent cube 21 described above with the fluorescent cube 201, and illuminates the optical axis I1 of the laser beam using the condensing lens 203 and the two-dimensional scanner 34 in the fluorescent cube 201. The optical system 51 can be used as a total reflection fluorescent microscope by moving it approximately parallel to the distance “d” from the optical axis of the optical system 51 and condensing it in the total reflection condition region at the pupil position P of the objective lens 16.

なお、全反射照明時において、対物レンズ１６の瞳位置Ｐの輪帯状の全反射条件領域をレーザ光がスキャンするように、二次元スキャナ３４を構成するＸＹ各ミラーの傾斜角度を制御することも可能である。このように輪帯状の全反射条件領域をレーザ光がスキャンすることにより、良好な全反射照明を行うことが可能である。 Note that the tilt angle of each XY mirror constituting the two-dimensional scanner 34 may be controlled so that the laser beam scans the annular total reflection condition region at the pupil position P of the objective lens 16 during total reflection illumination. Is possible. As described above, the laser beam scans the annular total reflection condition region, so that it is possible to perform satisfactory total reflection illumination.

図４を参照して、全反射照明への移行について詳説する。図４（ａ）は走査型顕微鏡又は落射蛍光顕微鏡として使用する場合の照明状態を示し、図４（ｂ）は全反射顕微鏡として使用する場合の照明状態を示している。 With reference to FIG. 4, the transition to total reflection illumination will be described in detail. FIG. 4A shows an illumination state when used as a scanning microscope or an epifluorescence microscope, and FIG. 4B shows an illumination state when used as a total reflection microscope.

図４（ａ）に示すように、走査型顕微鏡あるいは落射蛍光顕微鏡として使用する場合、結像レンズ５２に入射したレーザ光束は、点線で示す（＋）最大画角光束、実線で示す像中心光束、及び、破線で示す（−）最大画角光束のいずれの場合も対物レンズ１６の瞳位置Ｐでは集光されていない、照明光学系５１の光軸５１ａに対して略平行な光束である。 As shown in FIG. 4A, when used as a scanning microscope or an epifluorescence microscope, a laser beam incident on the imaging lens 52 is a (+) maximum field angle beam indicated by a dotted line and an image center beam indicated by a solid line. In addition, in any case of the (−) maximum field angle light beam indicated by a broken line, the light beam is not collected at the pupil position P of the objective lens 16 and is substantially parallel to the optical axis 51a of the illumination optical system 51.

一方、図４（ｂ）に示す、全反射顕微鏡として使用する場合、レーザ光束は、二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーによりその主光線が照明光学系５１の光軸５１ａから紙面上方に距離「ｄ」シフトされ、次に入射した結像レンズ５２によりその光軸Ｉ１が照明光学系５１の光軸５１ａに対して略平行にされ、続いて入射した集光レンズ２０３により照明光学系５１の光軸５１ａから距離「ｄ」の位置にある対物レンズ１６の瞳位置Ｐの輪体状の全反射条件領域に集光されるようになっている。この結果、全反射照明が可能となる。なお、集光レンズ２０３の外側を通るレーザ光は、遮光板２０２によって遮光されるようになっている。 On the other hand, when the laser beam is used as a total reflection microscope shown in FIG. 4B, the principal ray of the laser beam is separated from the optical axis 51a of the illumination optical system 51 by a distance “d” by the XY mirrors of the two-dimensional scanner 34. The optical axis I1 of the imaging lens 52 that has been shifted and then incident is made substantially parallel to the optical axis 51a of the illumination optical system 51, and the optical axis of the illumination optical system 51 is subsequently incident by the incident condensing lens 203. The light is condensed on a ring-shaped total reflection condition region at the pupil position P of the objective lens 16 at a distance “d” from 51a. As a result, total reflection illumination is possible. The laser light passing outside the condenser lens 203 is shielded by the light shielding plate 202.

以上のように、顕微鏡装置１は、蛍光キューブボックス２０内から対物レンズ１６に応じた焦点距離ｆを持つ集光レンズを備えた蛍光キューブ２０１に選択して光路上に配置し、この蛍光キューブ２０１内の集光レンズ２０３と二次元スキャナ３４とを用いて、レーザ光の光軸Ｉ１を照明光学系５１の光軸から距離「ｄ」だけ略平行に移動させ、対物レンズ１６の瞳位置Ｐの全反射時条件領域に集光させることによって、容易に全反射照明を達成することが可能である。 As described above, the microscope apparatus 1 selects the fluorescent cube 201 including the condenser lens having the focal length f corresponding to the objective lens 16 from the fluorescent cube box 20 and arranges the fluorescent cube 201 on the optical path. The optical axis I1 of the laser beam is moved substantially in parallel with the distance “d” from the optical axis of the illumination optical system 51 by using the condensing lens 203 and the two-dimensional scanner 34, and the pupil position P of the objective lens 16 is It is possible to easily achieve total reflection illumination by condensing light in the total reflection condition area.

本実施形態においては、図５に示すように、光路上に挿入された対物レンズ１６に応じて二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの傾きを制御して、集光レンズ２０３への入射光に傾きαを持たせることで、対物レンズ１６や蛍光キューブ２０１の切り替えに応じたレーザ光の光軸位置Ｉ１、換言すると対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおける集光位置を設定することも可能である。 In the present embodiment, as shown in FIG. 5, the tilt of the XY mirrors of the two-dimensional scanner 34 is controlled according to the objective lens 16 inserted on the optical path to tilt the incident light to the condenser lens 203. By giving α, it is possible to set the optical axis position I1 of the laser light according to switching of the objective lens 16 and the fluorescent cube 201, in other words, the condensing position at the pupil position P of the objective lens 16.

例えば、前述の図４（ｂ）に示すように、集光レンズ２０３に入射するレーザ光の光軸Ｉ１が照明光学系５１の光軸５１ａに対して略平行のとき、該レーザ光は対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおいて照明光学系５１の光軸５１ａに対して距離「ｄ」の位置に集光していたが、二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの傾きを制御して、図５に示すように、レーザ光の光軸Ｉ１が照明光学系５１の光軸５１ａに対して傾きαを持って集光レンズ２０３に入射するようにすれば、該レーザ光の集光位置を距離「ｄ’」に変更することができる。この場合、照明光学系５１の光軸５１ａに対して傾きαを持って集光レンズ２０３に入射したレーザ光束は、この集光レンズ２０３によって、その傾きαがほぼゼロにされ、その光軸は照明光学系５１の光軸５１ａに対して距離「ｄ’」離れて略平行となって、対物レンズ１６の瞳位置Ｐの輪帯状の全反射条件領域に集光される。この結果、全反射照明が可能となる。 For example, as shown in FIG. 4B, when the optical axis I1 of the laser light incident on the condenser lens 203 is substantially parallel to the optical axis 51a of the illumination optical system 51, the laser light is an objective lens. Although the light is condensed at a position of a distance “d” with respect to the optical axis 51a of the illumination optical system 51 at 16 pupil positions P, the inclination of the XY mirrors of the two-dimensional scanner 34 is controlled and shown in FIG. As described above, when the optical axis I1 of the laser light is incident on the condensing lens 203 with an inclination α with respect to the optical axis 51a of the illumination optical system 51, the condensing position of the laser light is set to the distance “d ′”. Can be changed. In this case, the laser beam incident on the condenser lens 203 with an inclination α with respect to the optical axis 51 a of the illumination optical system 51 is made almost zero by the condenser lens 203, and the optical axis is The light is focused on the annular total reflection condition region at the pupil position P of the objective lens 16 so as to be substantially parallel to the optical axis 51a of the illumination optical system 51 by a distance “d ′”. As a result, total reflection illumination is possible.

また、本実施形態においては、顕微鏡装置１に、集光レンズ２０３及び集光レンズ２０３の外周を囲うように配置され遮光板２０２を、共に照明光学系５１の光軸５１ａに対して垂直な方向にシフトさせる駆動機構（不図示）を設け、図６に示すように、集光レンズ２０３及び遮光板２０２の位置を照明光学系５１の光軸５１ａに対して垂直な方向に移動させることにより、対物レンズ１６や蛍光キューブ２０１の切替えに応じたレーザ光の光軸位置Ｉ１（対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおける集光位置）を設定することも可能である。 Further, in the present embodiment, the microscope apparatus 1 is arranged so as to surround the condenser lens 203 and the outer periphery of the condenser lens 203, and the light shielding plate 202 is in a direction perpendicular to the optical axis 51 a of the illumination optical system 51. A drive mechanism (not shown) for shifting to the position shown in FIG. 6 is provided, and as shown in FIG. It is also possible to set the optical axis position I1 (condensing position of the objective lens 16 at the pupil position P) according to the switching of the objective lens 16 and the fluorescent cube 201.

例えば、図６の実線で示す位置に集光レンズ２０３及び遮光板２０２がある場合、二次元スキャナ３４及び結像レンズ５２を通過して、その光軸が、照明光学系５１の光軸５１ａから紙面上方にシフトされ、且つ、照明光学系５１の光軸５１ａに対して略平行となったレーザ光は、実線で示す位置にある集光レンズ２０３を通過することにより、対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおいて照明光学系５１の光軸５１ａから距離「ｄ」離れた全反射条件領域に集光される。この結果、全反射照明が可能となる。前記対物レンズ１６が交換されて、全反射条件領域が照明光学系５１の光軸５１ａから距離「ｄ”」離れたものに変更された場合、不図示の駆動機構を駆動して、集光レンズ２０３及び遮光板２０２を図６の実線で示す位置から点線で示す位置に垂直シフトすることにより、その場合にも全反射照明を行うことが可能となる。このように集光レンズ２０３及び遮光板２０２のシフト量を制御することで、レーザ光の光軸位置Ｉ１（瞳位置Ｐにおける集光位置）を調整することが可能となる。 For example, when the condensing lens 203 and the light shielding plate 202 are located at the position indicated by the solid line in FIG. 6, the optical axis passes from the optical axis 51 a of the illumination optical system 51 through the two-dimensional scanner 34 and the imaging lens 52. The laser beam shifted upward in the drawing and substantially parallel to the optical axis 51a of the illumination optical system 51 passes through the condenser lens 203 at the position indicated by the solid line, so that the pupil position of the objective lens 16 is reached. In P, the light is focused on the total reflection condition region that is a distance “d” away from the optical axis 51a of the illumination optical system 51. As a result, total reflection illumination is possible. When the objective lens 16 is replaced and the total reflection condition area is changed to a distance “d” ”from the optical axis 51a of the illumination optical system 51, a driving mechanism (not shown) is driven to collect the condensing lens. By vertically shifting 203 and the light shielding plate 202 from the position indicated by the solid line in FIG. 6 to the position indicated by the dotted line, total reflection illumination can be performed even in this case. By controlling the shift amounts of the condensing lens 203 and the light shielding plate 202 in this way, it becomes possible to adjust the optical axis position I1 (condensing position at the pupil position P) of the laser light.

さらに、顕微鏡装置１では、二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの傾きと、集光レンズ２０３及び遮光板２０２の照明光学系５１の光軸５１ａに対して垂直な方向へのシフト量とを同時に制御することにより、レーザ光の光軸位置Ｉ１（瞳位置Ｐにおける集光位置）を調整することも可能である。このように両者を同時に制御することによって、二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの傾きの変化量や、集光レンズ２０３及び遮光板２０２のシフト量を小さい値に留めることができ、ひいてはレーザ光の光軸位置Ｉ１をより高い精度で調整することが可能となる。 Further, in the microscope apparatus 1, the tilt of each XY mirror of the two-dimensional scanner 34 and the shift amount of the condenser lens 203 and the light shielding plate 202 in the direction perpendicular to the optical axis 51 a of the illumination optical system 51 are simultaneously controlled. By doing so, it is also possible to adjust the optical axis position I1 (condensing position at the pupil position P) of the laser light. By controlling both of them in this way, it is possible to keep the amount of change in the tilt of the XY mirrors of the two-dimensional scanner 34 and the amount of shift of the condensing lens 203 and the light shielding plate 202 to a small value. It becomes possible to adjust the optical axis position I1 with higher accuracy.

このように、顕微鏡装置１では、標本１２の全反射照明時において、集光レンズ２０３に入射させるレーザ光源からのレーザ光束を二次元スキャナ３４により偏向させるか、または、照明光学系５１の光軸５１ａに挿入した集光レンズ２０３を該光軸に対して垂直移動させるか、少なくともどちらか一方を行うことにより、集光レンズ２０３を通過したレーザ光束の主光線Ｉ１を光軸に対して垂直方向に移動させ、対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおける集光位置を調整可能にした。 As described above, in the microscope apparatus 1, during the total reflection illumination of the specimen 12, the laser beam from the laser light source incident on the condenser lens 203 is deflected by the two-dimensional scanner 34, or the optical axis of the illumination optical system 51 is used. The condensing lens 203 inserted in 51a is moved vertically with respect to the optical axis, or at least one of them is performed so that the principal ray I1 of the laser beam passing through the condensing lens 203 is perpendicular to the optical axis. The focusing position at the pupil position P of the objective lens 16 can be adjusted.

なお、上記のように、レーザ光の光軸Ｉ１が、照明光学系５１の光軸５１ａから紙面上方にシフトされて結像レンズ５２に入射し、結像レンズ５２を通過後、照明光学系５１の光軸５１ａに対して傾きαを持って集光レンズ２０３に入射する場合、該レーザ光は集光レンズ２０３の下端に入射させる必要がある（図５参照）。そのため、集光レンズ２０３の有効径は、この集光レンズ２０３に入射するレーザ光の光束径よりも十分大きくする必要がある。 As described above, the optical axis I1 of the laser light is shifted upward from the optical axis 51a of the illumination optical system 51 to enter the imaging lens 52, and after passing through the imaging lens 52, the illumination optical system 51. When the light enters the condenser lens 203 with an inclination α with respect to the optical axis 51a, the laser light needs to be incident on the lower end of the condenser lens 203 (see FIG. 5). Therefore, the effective diameter of the condensing lens 203 needs to be sufficiently larger than the beam diameter of the laser light incident on the condensing lens 203.

そこで、顕微鏡装置１では、集光レンズ２０３の代わりに、図７に示すように、頂角δ₁を有する楔プリズム２０４ａと、対物レンズ１６の瞳位置Ｐに集光する焦点距離ｆを持つ凸レンズ２０４ｂとを貼り合わせた光学部材２０４を使用することで、装置の小型化を図ることが可能である。なお、楔プリズム２０４ａの頂角δ₁は、対物レンズ１６の開口数（ＮＡ）に合わせて調整されているレーザ光の光軸Ｉ１の傾斜角αに対応しており、楔プリズム２０４ａを構成する媒質の屈折率をｎとしたとき、条件式 δ₁＝α／（ｎ−１）で表すことができる。 Therefore, in the microscope apparatus 1, instead of the condensing lens 203, as shown in FIG. 7, a wedge prism 204 a having an apex angle δ ₁ and a convex lens having a focal length f that condenses on the pupil position P of the objective lens 16. By using the optical member 204 bonded with 204b, it is possible to reduce the size of the apparatus. The apex angle δ ₁ of the wedge prism 204a corresponds to the inclination angle α of the optical axis I1 of the laser light adjusted according to the numerical aperture (NA) of the objective lens 16, and constitutes the wedge prism 204a. When the refractive index of the medium is n, it can be expressed by the conditional expression δ ₁ = α / (n−1).

例えば、図７に示すように、二次元スキャナ３４及び結像レンズ５２を通過して、その光軸が照明光学系５１の光軸５１ａから紙面上方にシフトされ且つ照明光学系５１の光軸５１ａに対して傾きαを持ったレーザ光は、光学部材２０４に入射すると、該部材を構成する楔プリズム２０４ａによって、その傾きαがほぼゼロにされ、主光線が照明光学系５１の光軸５１ａに対して距離「ｄ」だけ離れて略平行にされた後、同じく光学部材２０４を構成する凸レンズ２０４ｂによって対物レンズ１６の瞳位置Ｐの輪帯状の全反射条件領域に集光される。この結果、全反射照明が可能となる。なお、光学部材２０４の外側を通るレーザ光は、遮光板２０２によって遮光されるようになっている。 For example, as shown in FIG. 7, the optical axis of the illumination optical system 51 passes through the two-dimensional scanner 34 and the imaging lens 52 and is shifted upward from the optical axis 51 a of the illumination optical system 51 and the optical axis 51 a of the illumination optical system 51. Is incident on the optical member 204, the wedge prism 204a constituting the member makes the inclination α substantially zero, and the principal ray enters the optical axis 51a of the illumination optical system 51. On the other hand, after being made substantially parallel by being separated by a distance “d”, the light is condensed on the annular total reflection condition region at the pupil position P of the objective lens 16 by the convex lens 204b that also forms the optical member 204. As a result, total reflection illumination is possible. The laser light that passes outside the optical member 204 is shielded by the light shielding plate 202.

さらに、顕微鏡装置１では、光学部材２０４及びこのレンズの外周を囲う遮光板２０２を共に照明光学系５１の光軸５１ａに対して垂直な方向にシフトさせる駆動機構（不図示）を設け、光学部材２０４及び遮光板２０２の位置を照明光学系５１の光軸５１ａに対して垂直な方向に移動させることにより、対物レンズ１６や蛍光キューブ２０１の切替えに応じたレーザ光の光軸位置Ｉ１を設定することも可能である。 Further, the microscope apparatus 1 is provided with a drive mechanism (not shown) for shifting both the optical member 204 and the light shielding plate 202 surrounding the outer periphery of the lens in a direction perpendicular to the optical axis 51a of the illumination optical system 51. By moving the position of 204 and the light shielding plate 202 in a direction perpendicular to the optical axis 51a of the illumination optical system 51, the optical axis position I1 of the laser light corresponding to the switching of the objective lens 16 and the fluorescent cube 201 is set. It is also possible.

また、顕微鏡装置１は、図８に示すように、集光レンズ２０３と対物レンズ１６の瞳位置Ｐとの間に配置された第１〜第３の反射部材２０７〜２０９と、第２の反射部材２０８を照明光学系５１の光軸５１ａに対して平行移動させる移動機構（不図示）とを備え、集光レンズ２０３を通り対物レンズ１６の瞳位置Ｐに集光される光が第１〜第３の反射部材２０７〜２０９を順に通過するように構成し、移動機構を用いて第２の反射部材２０８を前記光軸Ｉ１に対して対物レンズ１６に応じた移動量δ₂平行移動させることで、対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおける集光位置を変動させることができる。その結果、対物レンズ１６や蛍光キューブ２０１の切替えに応じて、レーザ光の光軸位置Ｉ１（瞳位置Ｐにおける集光位置）を適宜設定することが可能である。 Further, as shown in FIG. 8, the microscope apparatus 1 includes first to third reflecting members 207 to 209 arranged between the condenser lens 203 and the pupil position P of the objective lens 16, and a second reflection. A moving mechanism (not shown) that translates the member 208 with respect to the optical axis 51a of the illumination optical system 51 is provided, and light that passes through the condenser lens 203 and is condensed at the pupil position P of the objective lens 16 is first to first. The third reflecting members 207 to 209 are configured to pass through in order, and the second reflecting member 208 is moved in parallel by the movement amount δ ₂ corresponding to the objective lens 16 with respect to the optical axis I1 using a moving mechanism. Thus, the condensing position at the pupil position P of the objective lens 16 can be changed. As a result, it is possible to appropriately set the optical axis position I1 (condensing position at the pupil position P) of the laser light in accordance with the switching of the objective lens 16 and the fluorescent cube 201.

例えば、図８において、反射部材２０７〜２０９が図中の実線の位置にある場合、その光軸が照明光学系５１の光軸５１ａから紙面上方にシフトされて結像レンズ５２に入射したレーザ光は、結像レンズ５２を通過してその光軸が照明光学系５１の光軸５１ａに対して略平行にされた後、集光レンズ２０３に入射する。次いで、レーザ光は、図中の実線で示す位置にある反射部材２０７〜２０９で順に反射され、その光軸Ｉ１が再び照明光学系５１の光軸５１ａに対して略平行にされた後、対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおいて照明光学系５１の光軸５１ａから距離「ｄ」離れた輪帯状の全反射条件領域に集光される。この結果、全反射照明が可能となる。このような対物レンズ１６を交換し、全反射条件領域が、瞳位置Ｐにおいて照明光学系５１の光軸５１ａから距離「ｄ−２δ₂」離れたものに変更された場合、不図示の移動機構により、第２の反射部材２０８を実線で示す位置から点線で示す位置へと光軸方向にδ₂だけ瞳側に平行移動させることにより、レーザ光の光軸位置Ｉ１（集光位置）が先程よりも光軸側に距離「２δ₂」ずれた、照明光学系５１の光軸５１ａから距離「ｄ−２δ₂」離れた所望の位置となり、全反射照明が達成される。 For example, in FIG. 8, when the reflecting members 207 to 209 are at the positions of the solid lines in the drawing, the laser light whose optical axis is shifted from the optical axis 51 a of the illumination optical system 51 to the upper side of the drawing and incident on the imaging lens 52. Passes through the imaging lens 52, and its optical axis is made substantially parallel to the optical axis 51 a of the illumination optical system 51 and then enters the condenser lens 203. Next, the laser light is sequentially reflected by the reflecting members 207 to 209 at the positions indicated by solid lines in the drawing, and the optical axis I1 is made substantially parallel to the optical axis 51a of the illumination optical system 51 again, and then the objective light is reflected. At the pupil position P of the lens 16, the light is condensed on an annular total reflection condition region separated by a distance “d” from the optical axis 51 a of the illumination optical system 51. As a result, total reflection illumination is possible. When such an objective lens 16 is exchanged and the total reflection condition area is changed to a distance “d−2δ ₂ ” from the optical axis 51a of the illumination optical system 51 at the pupil position P, a moving mechanism (not shown) Thus, the optical axis position I1 (condensation position) of the laser light is previously moved by translating the second reflecting member 208 from the position indicated by the solid line to the position indicated by the dotted line by δ _{2 in the} optical axis direction. As a result, a distance “2δ ₂ ” is shifted from the optical axis 51a of the illumination optical system 51 to a desired position that is a distance “d−2δ ₂ ” away from the optical axis, and total reflection illumination is achieved.

なお、上記において、反射部材は、第１の反射部材（ミラー２０７）と、第２の反射部材（折り返しミラー２０８）と、第３の反射部材（ミラー２０９）との計３つの部材からなり、第２の反射部材２０８を光軸に対して平行移動可能に構成したが、これに限定されるわけではなく、該反射部材を通過したレーザ光の光軸位置Ｉ１（瞳位置Ｐにおける集光位置）が調整できればよいため、その構成部材や数、移動させる部材や数及び移動方向など、顕微鏡装置１やニーズに沿って設定することが可能である。 In the above, the reflecting member is composed of a total of three members, a first reflecting member (mirror 207), a second reflecting member (folding mirror 208), and a third reflecting member (mirror 209). Although the second reflecting member 208 is configured to be movable in parallel with respect to the optical axis, the present invention is not limited to this, and the optical axis position I1 of the laser beam that has passed through the reflecting member (the condensing position at the pupil position P) is not limited thereto. ) Can be adjusted, it is possible to set the constituent members and the number thereof, the members to be moved, the number and the moving direction, etc. according to the microscope apparatus 1 and needs.

また、顕微鏡装置１は、図９に示すように、集光レンズ２０３と対物レンズ１６の瞳位置Ｐとの間に配置された平行平板２１０と、平行平板２１０を照明光学系５１の光軸５１ａに対して回転させる回転機構（不図示）とを備え、集光レンズ２０３を通り対物レンズ１６の瞳位置Ｐに集光される光が平行平板２１０を通過するように構成し、対物レンズ１６に応じて回転機構を用いて平行平板２１０を前記光軸に対して傾けることで、平行平板２１０中を通過するときの光の屈折作用を利用して、対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおける集光位置を変動させることができる。その結果、対物レンズ１６や蛍光キューブ２０１の切替えに応じて、レーザ光の光軸位置Ｉ１（瞳位置Ｐにおける集光位置）を適宜設定することが可能である。 In addition, as shown in FIG. 9, the microscope apparatus 1 includes a parallel plate 210 disposed between the condenser lens 203 and the pupil position P of the objective lens 16, and the parallel plate 210 including the optical axis 51 a of the illumination optical system 51. A rotation mechanism (not shown) that rotates with respect to the light, and is configured such that light that passes through the condenser lens 203 and is condensed at the pupil position P of the objective lens 16 passes through the parallel plate 210. Accordingly, the parallel plate 210 is tilted with respect to the optical axis using a rotation mechanism, and the light condensing position at the pupil position P of the objective lens 16 is utilized by utilizing the refraction action of light when passing through the parallel plate 210. Can be varied. As a result, it is possible to appropriately set the optical axis position I1 (condensing position at the pupil position P) of the laser light in accordance with the switching of the objective lens 16 and the fluorescent cube 201.

例えば、図９において、照明光学系５１の光軸５１ａから紙面上方にシフトされて結像レンズ５２に入射したレーザ光は、その光軸Ｉ１が結像レンズ５２を通過して照明光学系５１の光軸５１ａに対して略平行な光線となった後、平行平板２１０を介して、対物レンズ１６の瞳位置Ｐにおいて照明光学系５１の光軸５１ａから距離「ｄ」離れた輪帯状の全反射条件領域に集光する。この結果、全反射照明が可能となる。次いで、この対物レンズ１６を交換し、全反射条件領域が瞳位置Ｐにおいて照明光学系５１の光軸５１ａから距離「ｄ'''」離れたものに変更された場合、不図示の回転機構により、平行平板２１０を照明光学系５１の光軸５１ａに対して傾けると、その場合にも全反射照明が可能となる。 For example, in FIG. 9, the laser light that is shifted from the optical axis 51 a of the illumination optical system 51 to the upper surface of the paper and enters the imaging lens 52 passes through the imaging lens 52 with the optical axis I 1 of the illumination optical system 51. After the light beam becomes substantially parallel to the optical axis 51 a, an annular total reflection with a distance “d” away from the optical axis 51 a of the illumination optical system 51 at the pupil position P of the objective lens 16 through the parallel plate 210. Focus on the condition area. As a result, total reflection illumination is possible. Next, when the objective lens 16 is exchanged and the total reflection condition area is changed to a distance “d ′ ″” from the optical axis 51a of the illumination optical system 51 at the pupil position P, a rotation mechanism (not shown) is used. If the parallel plate 210 is tilted with respect to the optical axis 51a of the illumination optical system 51, total reflection illumination is possible even in that case.

以上述べたように、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、共焦点走査観察系３１の二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの傾斜角度を所定の傾きに制御し、蛍光キューブボックス２０内から対物レンズ１６の瞳位置Ｐに集光する焦点距離ｆを持った集光レンズ２０３を備えた蛍光キューブ２０１を選択して光路上に配置することにより、全反射蛍光観察を可能にすることができる。また、透過観察、走査型蛍光観察、共焦点走査型観察、落射蛍光観察等の顕微鏡としても使用可能な顕微鏡装置１を提供することができる。 As described above, according to the microscope apparatus 1 according to the present embodiment, the tilt angle of each of the XY mirrors of the two-dimensional scanner 34 of the confocal scanning observation system 31 is controlled to a predetermined tilt, so that the fluorescence cube box 20 By selecting a fluorescent cube 201 having a condensing lens 203 having a focal length f for condensing at the pupil position P of the objective lens 16 and placing it on the optical path, total reflection fluorescence observation can be made possible. . Further, it is possible to provide a microscope apparatus 1 that can be used as a microscope for transmission observation, scanning fluorescence observation, confocal scanning observation, epifluorescence observation, and the like.

以上、本発明を分かりやすくするために、実施形態の構成要件を付して説明したが、本発明がこれに限定されるものではないことは言うまでもない。 As mentioned above, in order to make this invention intelligible, it demonstrated with the component requirement of embodiment, However, It cannot be overemphasized that this invention is not limited to this.

１顕微鏡装置
２倒立型蛍光顕微鏡（顕微鏡本体）
３制御装置（ＰＣ）
１１ステージ
１２標本
１３透過照明光源
１４透過照明光学系
１５リボルバ
１６対物レンズ
１７結像光学系
１８結像レンズ
１９接眼鏡筒
２０蛍光キューブボックス
２１蛍光キューブ
２２プリズム
２３撮像素子
３１共焦点走査観察系
３２光ファイバ
３３コレクタレンズ
３４二次元スキャナ（偏向手段）
３５瞳リレーレンズ
４１落射照明系
４２光ファイバ
４３コレクタレンズ
４４ダイクロイックミラー
５１照明光学系
５２結像レンズ
２０１蛍光キューブ
２０２遮光板
２０３集光レンズ
２０４光学部材
２０４ａ楔プリズム
２０４ｂ凸レンズ
２０７〜２０９反射部材
２１０平行平板
Ｐ対物レンズの瞳位置
Ｉ１レーザ光の光軸 1 Microscope device 2 Inverted fluorescence microscope (microscope body)
3 Control device (PC)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 Stage 12 Specimen 13 Transmission illumination light source 14 Transmission illumination optical system 15 Revolver 16 Objective lens 17 Imaging optical system 18 Imaging lens 19 Eyepiece tube 20 Fluorescence cube box 21 Fluorescence cube 22 Prism 23 Imaging device 31 Confocal scanning observation system 32 Optical fiber 33 Collector lens 34 Two-dimensional scanner (deflection means)
35 pupil relay lens 41 epi-illumination system 42 optical fiber 43 collector lens 44 dichroic mirror 51 illumination optical system 52 imaging lens 201 fluorescent cube 202 light shielding plate 203 condensing lens 204 optical member 204a wedge prism 204b convex lens 207 to 209 reflecting member 210 parallel Flat plate P Pupil position of objective lens I1 Optical axis of laser beam

Claims

レーザ光源と、
前記レーザ光源からのレーザ光束を対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、
前記レーザ光源と前記対物レンズとの間に配置され、前記レーザ光源からのレーザ光を偏向する偏向手段と、
前記偏向手段と前記対物レンズとの間に挿脱可能に設けられ、前記偏向手段を介した前記レーザ光源からのレーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の所定領域に集光するための、正の屈折力を有する集光レンズと、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系とを備え、
前記集光レンズが光軸から外されている場合に、前記偏向手段により前記標本の走査照明が可能であり、
前記集光レンズを光軸に挿入した場合に、前記標本の全反射照明が可能である顕微鏡装置において、
前記集光レンズを、光軸に挿入した場合に、光軸に対して垂直移動可能に構成し、
前記標本の全反射照明時において、前記集光レンズに入射させる前記レーザ光源からのレーザ光束を前記偏向手段により偏向させるか、または、光軸に挿入した前記集光レンズを光軸に対して垂直移動させるか、少なくともどちらか一方を行うことにより、前記集光レンズを通過したレーザ光束の主光線を光軸に対して垂直方向に移動させ、前記対物レンズの瞳位置における集光位置を調整可能にしたことを特徴とする顕微鏡装置。 A laser light source;
An illumination optical system for irradiating a specimen with a laser beam from the laser light source via an objective lens;
A deflecting unit disposed between the laser light source and the objective lens and deflecting the laser light from the laser light source;
A positive beam is provided between the deflecting unit and the objective lens so as to be detachable, and condenses a laser beam from the laser light source via the deflecting unit in a predetermined region of the pupil position of the objective lens. A condenser lens having refractive power;
A fluorescence detection optical system for detecting fluorescence from the specimen,
When the condensing lens is removed from the optical axis, scanning illumination of the sample is possible by the deflecting unit,
When the condenser lens is inserted in the optical axis, a microscope apparatus capable of total reflection illumination of the specimen,
When the condensing lens is inserted into the optical axis, it is configured to be vertically movable with respect to the optical axis,
At the time of total reflection illumination of the specimen, a laser beam from the laser light source incident on the condenser lens is deflected by the deflecting means, or the condenser lens inserted into the optical axis is perpendicular to the optical axis. By moving or at least one of them, the principal ray of the laser beam that has passed through the condenser lens can be moved in the direction perpendicular to the optical axis, and the condensing position at the pupil position of the objective lens can be adjusted. The microscope apparatus characterized by having made it.

前記集光レンズは、楔プリズムと、凸レンズとの貼り合わせからなることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。 The microscope apparatus according to claim 1, wherein the condenser lens is formed by bonding a wedge prism and a convex lens.

前記集光レンズと前記対物レンズとの間に設けられ、前記集光レンズを通過し前記対物レンズの瞳位置に集光されるレーザ光が通るように構成された複数の反射部材と、
光路長を変化させつつ、前記反射部材を通過した前記レーザ光の主光線が光軸に対して平行になるように、前記複数の反射部材のうち少なくとも一つを移動させる移動機構とを備え、
前記移動機構を用いて前記複数の反射部材のうち少なくとも一つを移動させることにより、前記複数の反射部材を通過したレーザ光の主光線を光軸に対して垂直方向に移動させ、前記対物レンズの瞳位置における集光位置を調整可能にしたことを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡装置。 A plurality of reflecting members provided between the condenser lens and the objective lens, configured to pass laser light that passes through the condenser lens and is condensed at the pupil position of the objective lens;
A moving mechanism that moves at least one of the plurality of reflecting members so that the principal ray of the laser light that has passed through the reflecting member is parallel to the optical axis while changing the optical path length;
By moving at least one of the plurality of reflecting members using the moving mechanism, the chief ray of the laser light that has passed through the plurality of reflecting members is moved in a direction perpendicular to the optical axis, and the objective lens The microscope apparatus according to claim 1, wherein the condensing position at the pupil position of the lens is adjustable.

前記集光レンズと前記対物レンズとの間に設けられ、前記集光レンズを通過し前記対物レンズの瞳位置に集光されるレーザ光が通るように構成された平行平板と、
前記平行平板を光軸に対して回転させる回転機構とを備え、
前記回転機構を用いて前記平行平板を光軸に対して回転させることにより、前記平行平板を通過したレーザ光の主光線を光軸に対して垂直方向に移動させ、前記対物レンズの瞳位置における集光位置を調整可能にしたことを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡装置。 A parallel plate provided between the condenser lens and the objective lens and configured to pass a laser beam that passes through the condenser lens and is condensed at a pupil position of the objective lens;
A rotation mechanism for rotating the parallel plate with respect to the optical axis,
By rotating the parallel plate with respect to the optical axis using the rotation mechanism, the chief ray of the laser light that has passed through the parallel plate is moved in a direction perpendicular to the optical axis, and at the pupil position of the objective lens The microscope apparatus according to claim 1, wherein the condensing position is adjustable.

前記照明光学系として、落射照明光学系を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。 The microscope apparatus according to claim 1, wherein the illumination optical system includes an epi-illumination optical system.