JP2011103884A - ヒトの肝臓前駆細胞およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】培養物中で増殖を可能にするCD117およびCD34に対して免疫反応性であり;そして肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へインビボで分化する、肝臓前駆細胞が、提供される。この培養物は、多数の継代にわたって消費され得、そして移植の後、成人の肝臓にうまく結合し得る。本発明のインビトロ細胞培養物は、ヒトの肝臓組織由来の細胞を含み、この培養物中の細胞は、CD117+、CD34+、およびLin−であり、培養物中で増殖し得、そしてインビトロで肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へ分化し得る細胞である。
【選択図】なし
Description
本発明は、前駆細胞に関する。
急性肝不全は、依然として高い死亡率を有する重大な問題である。肝機能障害および肝不全を生じる疾患の発症率が高いにもかかわらず、内科的治療における主な進歩は、現在、特定の形態のウィルス性肝炎の予防および処置に限られている。急性および慢性の肝疾患は、治療的なアプローチよりも対症的なアプローチで、依然として処置されている。同所性肝移植は、今までのところ、末期の肝疾患を有する患者のための唯一利用可能な治療である。残念なことに、ドナーの臓器のアベイラビリティは制限されているので、多くの患者が、肝臓移植を待ちながら毎年亡くなっている。最近では、正常肝細胞を罹患した肝臓へと移植することが、代替治療として用いられている。しかし、臓器ドナーの不足が、肝細胞移植の臨床適用を制限している。
本発明は、肝臓前駆細胞の発見に基づいている。前駆細胞は、多分化能細胞である。前駆細胞は、(例えば、インビボまたはインビトロで)肝細胞(例えば、肝細胞、胆管細胞、または肝臓内皮細胞(すなわち、類洞細胞))へと分化することが可能である。従って、本発明は、肝臓前駆細胞培養物(例えば、インビトロ培養物)を特色とする。この培養物は、付着培養物である。あるいは、培養物中の細胞は、懸濁液中にある。この細胞は、肝臓組織(例えば、胎児肝臓組織)由来である。上記組織は、哺乳動物(例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ)由来である。上記細胞は、CD117およびCD34に対して免疫反応性であり、Linには免疫反応しない。上記細胞は、インビトロで増殖する。上記細胞は、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、15回、20回、25回またはそれ以上倍加することが可能であり、そして肝細胞、胆管細胞、または肝臓内皮細胞へと分化する能力を保持する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒトの肝臓組織由来の細胞を含むインビトロ細胞培養物であって、該培養物中の該細胞は、
a.CD117 + 、CD34 + 、およびLin − であり;
b.培養物中で増殖し得;そして
c.インビトロで肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へ分化し得る、
細胞である、培養物。
(項目2)
項目1に記載の培養物であって、前記培養物は、少なくとも6回、倍加し得る、培養物。
(項目3)
項目1に記載の培養物であって、前記培養物は、少なくとも12回、倍加し得る、培養物。
(項目4)
項目1に記載の培養物であって、前記培養物は、付着培養物である、培養物。
(項目5)
インビトロでヒトの肝類洞細胞を生成する方法であって、該方法は、
a.CD117 + 、CD34 + 、およびLin − の細胞を含む細胞懸濁物を提供する工程;
b.該細胞懸濁液を培養する工程;ならびに
c.血管内皮成長因子を含有する培地中で該細胞の子孫を分化させる工程
を包含する、方法。
(項目6)
ヒトの肝臓の肝細胞または胆管細胞をインビトロで生成する方法であって、該方法は、
a.CD117 + 、CD34 + 、およびLin − の細胞を含む細胞懸濁物を提供する工程;
b.該細胞懸濁液を培養する工程;ならびに
c.EGFおよびHGFを含有する培地中で該細胞の子孫を分化させる工程
を包含する、方法。
(項目7)
インビボで肝細胞、または胆管細胞または類洞細胞へ分化する、ヒトの肝臓前駆細胞の集団を生成する方法であって、CD117 + 、CD34 + 、およびLin − である細胞を、ヒトの肝臓由来細胞の集団から選択する工程を包含する、方法。
(項目8)
多分化能肝臓前駆細胞の子孫を宿主へ移植する方法であって、該方法は、
a.多分化能のCD117 + 、CD34 + 、およびLin − のヒト肝臓前駆細胞を含む、インビトロ細胞培養物を提供する工程であって、該細胞は、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へ分化させる多分化能力を維持する、工程;ならびに
b.該細胞を該宿主中に移植する工程
を包含する、方法。
(項目9)
肝細胞の増殖、分化、または生存をもたらす化合物についてスクリーニングする方法であって、該方法は、
a.多分化能のCD117 + 、CD34 + 、およびLin − のヒト肝臓前駆細胞を含む、インビトロ細胞培養物を提供する工程であって、該細胞は、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へ分化ための多分化能力を維持する、工程;
b.該培養物を試験化合物に接触させる工程;ならびに
c.該化合物が、肝細胞の増殖、分化、または生存をもたらすかどうかを決定する工程;
を包含する、方法。
(項目10)
項目9に記載の方法であって、該方法は、工程bを実施する前に、前記培養物の分化を誘導する工程をさらに包含する、方法。
(項目11)
試験化合物の代謝産物を決定するインビトロでの方法であって、該方法は、
a.多分化能のCD117 + 、CD34 + 、およびLin − のヒト肝臓前駆細胞を含む、インビトロ細胞培養物を提供する工程であって、該細胞は、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へ分化させる多分化能力を維持する、工程;
b.該培養物を試験化合物に接触させる工程;ならびに
c.該培養物とインキュベーションした後に、該試験化合物由来の代謝産物を同定する工程;
を包含する、方法。
(項目12)
項目11に記載の方法であって、工程bを実施する前に、前記培養物の分化を誘導する工程を包含する、方法。
(項目13)
試験化合物の抗ウィルス活性を決定するインビトロでの方法であって、該方法は、
a.多分化能のCD117 + 、CD34 + 、およびLin − のヒト肝臓前駆細胞を含む、インビトロ細胞培養物を提供する工程であって、該細胞は、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へ分化させるための多分化能力を維持する、工程;
b.該培養物をウィルスおよび試験化合物に接触させる工程;ならびに
c.該培養物の生存率をコントロール細胞培養物と比較する工程;
を包含し、該コントロール培養物と比較された該培養物の生存率の増加が、該試験化合物の抗ウィルス活性を示している、方法。
(項目14)
項目13に記載の方法であって、該方法は、工程bを実施する前に、前記培養物の分化を誘導する工程をさらに包含する、方法。
(項目15)
項目13に記載の方法であって、前記ウィルスは、肝臓栄養性ウィルスである、方法。
(項目16)
項目15に記載の方法であって、前記肝臓栄養性ウィルスは、A型肝炎ウィルス、B型肝炎ウィルス、またはC型肝炎ウィルスである、方法。
(項目17)
ウィルスの感染性を決定するインビトロでの方法であって、該方法は、
a.多分化能のCD117 + 、CD34 + 、およびLin − のヒト肝臓前駆細胞を含む、インビトロ細胞培養物を提供する工程であって、該細胞は、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へ分化させる多分化能力を維持する、工程;
b.該培養物をウィルスに接触させる工程;ならびに
c.該ウィルスが、該培養物中の該細胞の増殖または生存に対する効果を有するかどうかを決定する工程;
を包含する、方法。
(項目18)
項目17に記載の方法であって、該方法は、工程bを実施する前に、前記培養物の分化を誘導する工程をさらに包含する、方法。
(項目19)
項目17に記載の方法であって、前記ウィルスは、肝臓栄養性ウィルスである、方法。
(項目20)
項目19に記載の方法であって、前記肝臓栄養性ウィルスは、A型肝炎ウィルス、B型肝炎ウィルス、またはC型肝炎ウィルスである、方法。
(項目21)
項目8に記載の方法であって、胎児肝臓間質細胞または胎児肝臓間葉細胞を前記宿主中に共移植する工程をさらに包含する、方法。
(項目22)
項目8に記載の方法であって、前記宿主に肝細胞成長因子を投与する工程をさらに包含する、方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および上記特許請求の範囲から明かである。
本発明は、数世代の間インビトロで拡張しかつ祖先の表現型を維持する、ヒト胎児肝臓内の非造血性前駆細胞の規定された集団における予想外の発見に基づいている。これらの細胞は、急性肝損傷を有する動物へと移植される際に、肝細胞、胆管細胞、および類洞細胞への機能的な分化を示した。
本発明は、ヒト肝臓前駆細胞(本明細書中でLPCと呼ばれる)を提供する。LPC細胞は、本発明の方法を用いて増殖させるために誘導され得る未分化細胞である。LPCは、各細胞***において、少なくとも1つの娘細胞がまたLPC細胞であるように、自己保持することが可能である。LPCは、100倍、250倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍以上、拡張されることが可能である。
LPCは、本明細書中に記載された方法を用いて増殖される。細胞は、ドナー組織の連結している細胞外マトリクスから個々の細胞を分離することによって、その組織から入手される。胎児からの組織は、滅菌手順を用いて除去され、そして細胞は、酵素(例えば、トリプシン、コラゲナーゼなど)を用いる処置を含む当該分野で公知の任意の方法を用いてか、または例えば鈍器もしくはホモジナイザーを用いる物理的な分離方法を用いて、分離される。胎児細胞の分離は、組織培養培地中で行われ得る。
(ヒト肝臓前駆細胞の分化)
培養条件に依存して、LPCは、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へと分化され得る。
新しい細胞の損傷した肝臓への移植は、損傷した肝臓組織を修復し、それによって肝臓機能を回復する可能性を有する。必要に応じて胎児間質細胞および/またはHGFは、LPCとともに共移植される。しかし、移植目的に適する細胞の欠如は、この手順が満たすべき最大の可能性を妨げている。「適切な」細胞とは、以下の基準:(1)大量に入手され得ること;(2)必要に応じて、遺伝物質の挿入を可能とするためにインビトロで増殖され得ること;(3)無制限に生存することが可能であり、肝臓における移植に対する肝臓修復を促進することが可能であること;そして(4)非免疫原性であり、好ましくは、患者自身の組織からかまたは適合し得るドナーから入手されることを、満たす細胞である。
LPCは、形質転換されてない初代細胞であるが、それらは、連続的な細胞株の特徴を保有する。未分化の状態において、LPCは、連続的に***し、そしてそれ故に、遺伝子改変の標的となる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞は、上述の任意の方法によって、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へと分化されるように誘導される。
LPC培養物は、潜在的な治療組成物のスクリーニングのために使用され得る。例えば、LPCは、肝臓細胞の増殖、分化、または生存をもたらす化合物を同定するために使用される。加えて、LPCは、抗ウィルス化合物を同定しウィルスの感染性を決定するためか、または、試験化合物の代謝産物を同定するために、使用される。これらの試験組成物は、種々の投与量で培養物中の細胞に適用され得る。そして細胞の応答が、種々の期間、モニタリングされる。細胞の物理的特徴は、顕微鏡を用いて細胞の成長および形態を観察することによって分析され得る。タンパク質(例えば、酵素、レセプター、および他の細胞表面分子)または神経伝達物質、アミノ酸、神経ペプチド、および生体アミンの新たな発現レベルまたは増加した発現レベルの誘導は、このような分子のレベルの変化を同定し得る当該分野で公知の任意の技術を用いて、分析され得る。このような技術としては、このような分子に対する抗体を使用する免疫組織化学、または生化学的分析が挙げられる。このような生化学的分析としては、タンパク質アッセイ、酵素的アッセイ、レセプター結合アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)、電気泳動分析、高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)による分析、ウェスタンブロット、および放射免疫アッセイ(RIA)が挙げられる。核酸分析(例えば、ノーザンブロット)は、これらの分子またはこれらの分子を合成する酵素をコードするmRNAのレベルを検査するために使用され得る。
(ヒト胎児肝細胞の単離)
本研究の許可は、Huddinge大学病院にある現地の倫理委員会から認可された。ヒトFL組織を、スウェーデンの手引きに従って、妊娠の6〜9.5週間目に中絶された胎児から入手した。研究プロトコルは、現地の倫理委員会によって認可された。改変された吸引掻爬術を行った(33)。在胎齢を、妊娠期間の12週間未満の胎児においては特有の解剖学的マーカー(34)に従って推定し、そしてそれより後の胎児においては、超音波大横径測定によって推定した(35)。妊娠齢は、最終月経から算出した妊娠期間として与えられる。中絶を、明らかな異常がない妊娠において行った(つまり、異常がある胎児を含まなかった)。FLを、解体し、そしてRPMI 1640培地(Gibco,Invitrogen Corp.UK)を含む滅菌チューブ中に配置した。次いで、肝臓を、70μmの金属メッシュを通すことによって、単一の細胞の懸濁液へと分解した。単一の細胞の懸濁液を、200gで10分間遠心して、細胞をペレットにした。胎児組織を提供するすべての女性は、梅毒、トキソプラスマ症、風疹、HIV−1、サイトメガロウイルス、B型肝炎、およびC型肝炎、パロウィルス、ならびに1型単純ヘルペスおよび2型単純ヘルペスについて血清学的にスクリーニングされている。
単一の細胞の懸濁液を、妊娠7〜9週目における胎児肝細胞から調製した。細胞をヒト原始前駆細胞濃縮単離キット(Stem cell technologies,Vancouver,Canada)を用いて、その後に、磁気活性化細胞分離磁気ビーズシステム(Stem cell technologies)によって単離した。この方法は、この集団のネガティブ選択に基づいている。この選択には、12個の系統特異的な細胞表面抗原に対する抗体(抗CD2、抗CD3、抗CD14、抗CD16、抗CD19、抗CD24、抗CD36、抗CD38、抗CD45RA、抗CD56、抗CD66b、抗グリコホリンA)を含む枯渇カクテル(depletion cocktail)を使用する。この手順を、販売元によって説明されているように実行した。すべての場合において、回収した前駆細胞を、直ちにフローサイトメトリーによって分析し、lin+細胞の汚染が存在しないことを確かめ、かつ細胞の前駆体の表現型(CD117+/CD34+/lin−)を確認した。手順の最後に、回収された前駆細胞を生存度について試験した。この後で、この細胞を、I型コラーゲンで被覆されたプラスチックのペトリ皿(Biocoat,Becton and Dickinson,New Jersey,USA)に播種した。そして、10%不活化胎児子ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン、5%L−グルタミン、5%最小必須アミノ酸、50ng/mlのHGF(R&D Systems,Abingdon,England)、20ng/mlのEGF(R&D Systems)、および10ng/mlの塩基性繊維芽細胞成長因子(R&D Systems)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(GIBCO,Invitrogen,Stockholm,Sweden)中で培養した。三日ごとに毎回、培地を回収し、遠心分離し、滅菌ろ過処理し、そして条件培地(CM)として使用した。その後の全ての継代培養を、20%CMを使用して行った。いくつかの実験において、前駆細胞を、20ng/mlのHGF、10ng/mlのEGF、および50ng/mlのVEGF(R&D Systems)を含有するDMEM培地中で成長させ、そして培養物中で***させた。増殖を検出するために、培養物中の細胞を、チミジンアナログBrdU(30mM)とともに30分間、インキュベートした。細胞を洗浄し、そして、ヒトのアルブミンに対するFITC結合ヤギ抗体(Natutec,Frankfurt,Germany)、非結合抗ヒトサイトケラチン19(Neomarker,USA)、および非結合抗BrdU抗体(Sigma,Stockholm,Sweden)を使用して、アルブミン、サイトケラチン19、およびBrdU(30mM)で染色した。表現型決定のために使用された他の抗体は、抗CD45、抗CD14、抗CD90、抗CD117、抗CD34(Pharmingen,USA)、抗Flk−1(ReliaTech,Germany)、ならびに二次サブクラス特異的抗体であるヤギ抗マウスIgG1(FITC/Texas red)およびヤギ抗マウスIgG2a(FITC/Texas red)であった。フローサイトメトリーおよび免疫細胞化学を、前駆細胞を表現型決定するために使用した。この手順を記載されているように行った(36)。
動物を世話し、Huddinge病院にあるThe animal care and use committeが認可した動物プロトコルを使用する。肝障害を、部分的な肝切除の24時間前に、体重1kgあたり0.7gの腹腔内への、GalN(Sigma Chemicals Co.,Stockholm,Sweden)の投与によって、C57ブラック/ヌードマウス(n=16)に誘導した。GalNを、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に、100mg/mlにて溶解した。部分的な肝切除(PH)を、以前に説明されたように行った(37)。GalNの投与を、PHの後、10日間続けた。
マウスを、移植の4週間後に殺し、そして肝臓、脾臓および肺を切除した。約2mm2の肝臓の各々から2つか3つの生検を、液体窒素中でショック凍結し、そしてRT−PCR分析を行うためのRNAの単離のために使用した。残りの肝臓組織を、蛍光分析および免疫組織化学的分析のためにショック凍結した。5μmの厚さの凍結切片を風乾し、そして、メタノール中で10分間、冷30%アセトンで固定し、そして免疫組織化学によってさらに分析した。
本発明者らはまず、マウスの実質中のヒト細胞の検出のために2つの方法を試験した;a)ジゴキシゲニン標識総ヒトDNAプローブ(Cytocell,Oxfordshire UK)を使用するインサイチュハブリダイゼーション技術(38)、およびb)マウス抗ヒト核モノクローナル抗体(Chemicon,CA,USA)の後に、ビオチン化ウマ抗マウス二次抗体で染色する。免疫ペルオキシダーゼ手順を、製造元によって説明されているように、Vectastain Elite ABCキット(ImmunKemi,Stockholm,Sweden)を使用して行った。ジアミノベンジジン三塩酸塩(DAB)−ニッケル基質キットを、色展開剤として使用した。二重染色について、DAB(茶色に染色する)および/またはDAB−Ni(黒)および/またはVector NovaRedキットの組み合わせを使用した。使用した他の一次抗体は、ヒトのアルブミンに対する(マウスとは交差反応しない)FITC結合ヤギ抗体(Natutec,Frankfurt,Germany)、非結合抗ヒトサイトケラチン19(Neomarker,USA)、および(ジペプチジルペプチダーゼIVを検出する)非結合マウス抗ヒトCD26(Pharmingen,USA)であった。GGT、G−6−Pおよびグリコーゲンを、以前に説明されたようにインサイチュで示した(39,40)。切片をヘマトキシリンで対比染色し、マウント培地(ImmunKemi,Stockholm,Sweden)中でマウントした。
各マウスの肝臓の60枚の連続切片を、DAB−Ni−ポジティブなヒト細胞についてスクリーニングした。移植された細胞の数を、3つのサイズのクラスター(すなわち、単独で配置する細胞、または2以上〜20の細胞のクラスターまたは20より多い細胞のクラスター)で決定した。本発明者らは、移植された動物の全て由来の組織において最低限100の高倍率視野で分析した。
全RNAを、4匹のヒト−マウスキメラマウスの肝臓組織から、および1匹の正常マウスの肝臓組織から、Micro−FastTrack RNA単離キット(Invitrogen,Groningen,The Netherlands)を使用して、抽出した。本発明者らは、マウスの肝臓における、ヒトのアルブミン、CK19、α−フェトプロテインおよびα1−抗トリプシンの発現を検出するために、ヒト特異的プライマーを使用した。プライマーを、Primer Expressソフトウェア バージョン2.0(Applied Biosystems)を使用することにより、CK−19、α−フェトプロテイン、アルブミン、抗トリプシン、およびグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PD)について選択した。プライマーセットの各々を、DNAで汚染されずに、cDNAのみを標的とするために設計した。プライマーセットは、CyberGene(Huddinge,Sweden)によって商業的に合成された。
データを、平均値±SDのように示す。差異の有意性を、スチューデントt検定および分散分析(ANOVA)を用いて分析した。0.05未満のp値は、有意であるとみなした。
原始造血前駆体を単離するために設計されたキットを使用して、ヒト胎児肝臓由来の細胞集団(gw6〜9)を、任意の関係付けられた造血マーカーを発現しなかった集団から得た。この集団のさらなる表現型決定は、幹細胞マーカーCD117およびCD34の発現を示したが、肝臓マーカー(例えば、アルブミン(肝臓マーカー)およびCK19(胆管細胞マーカー))の発現は示さなかった。Thy−1(CD90)もCD45もまた発現しなかった(図1a)。この集団は、妊娠6〜9週目における全体の胎児肝臓の約0.5%〜0.7%を表す。CD45およびCD90の発現は、細胞の継代培養の間には観察されなかった。培養の際に、これらの細胞が、付着性の集団(約85%)(図1b)と非付着性集団(約15%)の両方の混合物であることを見出した。非付着性集団は、以下で与えられた培養条件の下で、さらに拡張され得なかった。CD117+/CD34+/Lin−細胞およびそれらの子孫は、コロニー中で成長する傾向がある(図1b)。培養物中で2日後に付着前駆細胞によって発現される最初のマーカーは、c−Met(肝細胞成長因子レセプター)であった(図1b)。肝細胞成長因子(HGF)および上皮成長因子(EGF)を含有する培養培地中で2週間、これらの細胞をインビトロで培養することは、4つタイプの細胞の存在を示した:i)アルブミンおよびCK19を発現する約85%のダブルポジティブ細胞、ii)約4%のダブルネガティブ細胞、iii)アルブミンのみを発現する約6%のシングルポジティブ細胞、iv)約5%のCK19のみを発現するシングルポジティブ細胞(図1c)。この表現型は、培養の間、数継代にわたって維持された(図1c)。しかし、P11以降から、ダブルポジティブ細胞(約60%)およびタブルネガティブ(約3%)の数においてわずかな減少があった。一方で、アルブミンまたはCK19についてのシングルポジティブ細胞は増加した。これらのデータは、発生早期の肝臓由来の非造血性原始前駆細胞がインビトロで肝細胞および胆管細胞へと分化し得ることを実証する。
(実施例3 CD117+/CD34+/LIN−肝臓前駆細胞は、血管内皮成長因子の存在下で肝臓類洞内皮細胞へと分化する)
興味深いことに、付着性CD117+/CD34+/Lin−細胞を、50ng/mlの血管内皮成長因子(VEGF)を含有する培養培地中で分化させた場合、本発明者らは、内皮様の形態を有する細胞の大きな集団を観察した。胎児肝臓内皮前駆体に発現されることが公知であるFlk−1を含む肝細胞マーカーを使用する、この細胞集団のさらなる特徴付けは、4つの集団を明らかにした:a)レセプターFlk−1を発現する内皮細胞(約50%)、b)肝細胞(約13%)、c)胆管細胞(約17%)(図1d)、および、d)これらのマーカーのうちのいずれも発現しなかった細胞集団(約20%)(データは示さず)。Flk−1+細胞の類洞表現型を、抗体の大きなパネルを使用して確認した(表1)。ヒト臍静脈内皮細胞を、血管内皮細胞と類洞内皮細胞との間の表現型の差を実証するために使用した(表1)。電子顕微鏡分析は、類洞内皮細胞に特徴的な窓(fenestrne)の存在、およびの基底膜の欠如を明らかにした(データは示さず)。これらのデータは、発生早期の肝臓由来の非造血性原始前駆細胞が、肝細胞、胆管細胞、および内皮細胞へとインビトロで分化し得ることを示す。
肝臓前駆体の増殖は、培養の間、20%の条件培地(CM)の恒常的な使用に依存した。20%のCMを使用すると、これらの細胞を、少なくとも12継代まで継代し得る。CMを除去すると、得られる細胞継代の数が有意に減少した(p<0.001;図2a)。このことは、細胞の増殖における減少を反映する。高い増殖能力が、BrdUの取り込みによって検出されたように、ダブルポジティブ細胞(ALB+CK19+)およびアルブミンのシングルポジティブ(ALB+CK19−)において観察されたことが見出された(図2bおよび図2c)。この細胞は、安定な表現型を長期間の間、維持され得る。すべてのFLが、急速に増殖し、そして数継代の間、培養物中で維持され得る細胞を生成したわけでないことを言及することは重要である(表2)。長期間、増殖の成功は、得られたFL組織の質に依存した。しかし、試験されたすべてのFLから単離されたCD117+/CD34+/LIN−細胞が肝細胞へと分化したことを見出した。インビトロ研究からのデータは、CD117+/CD34+/LIN−細胞およびそれらの子孫が、広範な複製能力を有し、そして安定な表現型で長期間の間維持され得ることを実証した。
新たに単離されたCD117+/CD34+/Lin−細胞(P0)、および培養物中で拡張された細胞(P6およびP12)が、分化する可能性を有しインビボで機能するかどうかを試験するために、これらの細胞を、最初に部分的に肝切除されたマウスへと移植し、次いでDガラアクトサミン(GalN)で処置して急性肝損傷を誘導した。このプロトコルは、急性肝損傷を誘導し、肝臓再分化を促進させる(21)。コントロールの2匹マウスおよび試験グループの2匹は、処置の24時間後に死亡した。細胞移植の4週間後にマウスが生存していた結果が示される。脾臓内の移植の後、初代P0細胞、ならびにP6およびP12継代培養細胞は、GalN処置マウスの肝臓において生存した。移植された細胞を位置決めするための、ヒトのセントロメアプローブおよび抗ヒト核抗体を使用して得られた結果を比較する実験は、同様の結果を示した。ヒトDNAプローブの種特異性(図3aおよび図3b)および抗ヒト核抗体は、ヒト肝臓によるポジティブな結果(図3c)、およびヌードマウスからの偽移植された肝臓によるネガティブな免疫組織化学(図3d)によって実証される。新たに単離されたCD117+/CD34+/Lin−細胞は、移植した場合、移植の4週間後にて、肝細胞(図3e)、胆管細胞(図3f)、および形成された胆管(図3g)へと分化した。P6およびP12における肝臓前駆細胞は、移植した場合、移植され、そして急性的に損傷した肝臓を再構成した(図3h−j)。移植された細胞を、マウスの肝臓中で見出したが(図3k)、例えば、脾臓(図3l)および肺(図3m)のような他の組織において、そして偽移植された動物(図3n)においては見出されなかった。移植されたヒト細胞は、肝臓マーカー(例えば、グルコース6リン酸(G−6−P)(図4a)およびグリコーゲン(図4b))、ならびに胆管マーカー(例えば、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)(図4c)およびγグルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)(図4d))を発現した。3匹のマウスでは、ヒト肝細胞によって90%再増殖した、再分化する組織の切片が見出された(図4e)。ヒト前駆体によって完全に再増殖したヒト胆管の透明な領域もまた、観察された。これらの細胞は、CK19およびそして抗ヒト核抗体に対してポジティブに染色した(図4f)。マウスのアルブミンとは交差反応しないヒトのアルブミンに対するモノクローナル抗体を、移植された細胞におけるヒトのアルブミンの発現を検査するために使用した。ヌードマウスからの偽移植された肝臓によるネガティブな免疫組織化学(図4g)は、抗体の種特異性を示した。移植されたマウス10匹すべてにおいて、いくつかのアルブミンポジティブ構造(図4h−j)が見出されたが、偽移植されたマウス(n=2)においてヒトのアルブミン発現する病巣は、同一の条件を使用しても観察されなかった。ヒトのアルブミンは、マウスの肝臓中のみで検出され、しかし脾臓または肺においては観察されなかった。興味深く注目するものとしては、分析されたマウスのいずれにおいても、腫瘍の形成が観察されなかったことである。
植え付けられた細胞の移植は、移植されたマウスにおけるヒト遺伝子の発現を決定することによって確認した。屠殺したマウス肝臓を、ヒト肝臓特異的遺伝子(アルブミン、α1−抗トリプシン、CK19、およびAFPを含む)について特異的なプライマーを使用するRT−PCRによって、ヒト胎児肝臓前駆細胞の移植の1ヵ月後に、分析した。偽移植されたヌードマウスの肝臓からのRNAは、RNAの完全性のためのコントロールとして使用されたG6PDについて増幅を結果としてもたらした。CK19、アルブミン、およびAFPプライマーは、プライマーが個々のマウス遺伝子を増幅しなかったので、ヒトに特異的な種であった。しかし、α1−抗トリプシンが種特異的であることは見出されなかった(図4k)。これらの結果は、新たに単離された(P0)細胞、および種々の継代(P6およびP12)における細胞の両方が、損傷したマウス肝臓に移植することを示す。
ヒト第VIII因子のレベルは、化学的に肝臓を損傷したマウスおよび肝切除したマウスにおいては極僅かであり、同様に、同じ様式で処置された、そしてさらに成長因子HGFおよび/または間質細胞を受容したマウスにおいても、同様に極僅かである。しかし、ヒト肝臓前駆細胞のみ、またはHGF+間質細胞+前駆細胞の組み合わせを受容する化学的に肝臓を損傷したマウスおよび肝切除したマウスは、それらの血漿においてヒト第VIII因子の高いレベルを実証した(図6)。
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは、例示目的のために例として開示されており、前に添付された特許請求の範囲に関して限定することは意図されていない。具体的には、種々の置換、変更、および修正が、請求項に規定されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対して行われ得ることが、本発明者らによって企図される。核酸の出発物質、所定のクローン、またはライブラリーのタイプの選択が、本明細書中に記載された実施形態の知識を有する当業者にとって、日常的なことであると考えられる。他の局面、利益、および修正は、上述の特許請求の範囲内にあるとみなした。
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