JP2011090221A - Microscope, focusing position detecting method, and focusing position detecting program - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は顕微鏡、合焦位置検出方法及び合焦位置検出プログラムに関し、例えば生体サンプルを拡大して観察する分野に適用して好適なものである。 The present invention relates to a microscope, an in-focus position detection method, and an in-focus position detection program.
生体サンプルは、組織切片等をスライドガラスに固定し、必要に応じて染色を施した後に保管される。一般に、保管期間が長期間となると、組織切片の劣化や退色等により生体サンプルに対する顕微鏡での視認性が悪くなる。また、生体サンプルは、作成された病院等の施設以外の施設で診断されることもあるが、該生体サンプルの受け渡しは一般に郵送であり、一定の時間を要する。 The biological sample is stored after fixing a tissue section or the like on a slide glass and staining it as necessary. In general, when the storage period is long, visibility of the biological sample with a microscope is deteriorated due to deterioration or fading of the tissue section. In addition, the biological sample may be diagnosed at a facility other than the created facility such as a hospital. However, the delivery of the biological sample is generally mailed and requires a certain time.
このような実情等に鑑み、生体サンプルを画像データとして保存する装置が提案されている（例えば特許文献１参照）。 In view of such circumstances and the like, an apparatus for storing a biological sample as image data has been proposed (see, for example, Patent Document 1).
ところで、この種の装置では、プレパラートを作製する際、又は作製後において、プレパラートの内部への気泡、塵及び異物など（以下、これらを異物類と呼ぶ）の混入又はプレパラート表面に対する異物類の付着が避けられない。 By the way, in this type of apparatus, when preparing the preparation, or after the preparation, mixing of bubbles, dust and foreign matters (hereinafter referred to as foreign matters) into the inside of the preparation or adhesion of foreign matters to the surface of the preparation. Is inevitable.
このような異物類が存在すると、サンプルに対する合焦位置を検出するオートフォーカス処理において、異物類に対する合焦位置を誤ってサンプル位置に対する合焦位置として誤検出してしまうという問題があった。 When such foreign matters are present, there is a problem in that in-focus processing for detecting the in-focus position with respect to the sample erroneously detects the in-focus position with respect to the foreign matters as the in-focus position with respect to the sample position.
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、合焦位置の誤検出を抑制し得る顕微鏡、合焦位置検出方法及び合焦位置検出プログラムを提案しようとするものである。 The present invention has been made in view of the above points, and intends to propose a microscope, a focus position detection method, and a focus position detection program that can suppress erroneous detection of the focus position.
かかる課題を解決するため本発明の顕微鏡は、サンプルを拡大する対物レンズと、サンプルを保持する保持部と、保持部と対物レンズとの距離を変動させる距離変動部と、対物レンズにより拡大されるサンプルを撮像する撮像素子と、撮像される画像において、部分的に選択された選択領域における画素値から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出部と、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定部とを設けるようにした。 In order to solve such a problem, the microscope of the present invention is magnified by an objective lens for enlarging the sample, a holding unit for holding the sample, a distance varying unit for changing the distance between the holding unit and the objective lens, and the objective lens. When calculating an AF evaluation value representing contrast from an image sensor that captures a sample and a pixel value in a partially selected selection region in the captured image, the sample has a color that deviates from the reference color that the sample should exhibit A calculation unit that evaluates the contrast of the region low and a focus position determination unit that determines a focus position at which the objective lens focuses on the sample based on the AF evaluation value are provided.
これにより、顕微鏡は、サンプルとは異なる色を有する異物類についてのコントラストを低く評価できるため、ＡＦ評価値に対する異物類の影響を低減できる。 Thereby, since the microscope can evaluate the contrast of the foreign matters having a color different from that of the sample low, the influence of the foreign matters on the AF evaluation value can be reduced.
また本発明は、サンプルを保持する保持部と対物レンズとの距離を変動させながらサンプルを撮像する撮像ステップと、撮像された画像において、部分的に選択された選択領域における輝度信号から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出ステップと、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定ステップとを設けるようにした。 The present invention also provides an imaging step for imaging the sample while varying the distance between the holding unit for holding the sample and the objective lens, and a contrast from a luminance signal in a partially selected area in the captured image. When calculating the AF evaluation value to be expressed, a calculation step for evaluating the contrast of a region having a color that deviates from the reference color to be exhibited by the sample, and the focus on which the objective lens is focused on the sample based on the AF evaluation value. And a focus position determining step for determining a focus position.
これにより、合焦位置検出方法は、サンプルとは異なる色を有する異物類についてのコントラストを低く評価できるため、ＡＦ評価値に対する異物類の影響を低減できる。 Thereby, since the focus position detection method can evaluate the contrast about the foreign materials which have a color different from a sample low, it can reduce the influence of the foreign materials on AF evaluation value.
また本発明は、顕微鏡を制御するコンピュータに対して、サンプルを保持する保持部と対物レンズとの距離を変動させながらサンプルを撮像する撮像ステップと、撮像された画像において、部分的に選択された選択領域における輝度信号から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出ステップと、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定ステップとを設けるようにした。 Further, according to the present invention, a computer that controls the microscope is partially selected in an imaging step of imaging the sample while changing the distance between the holding unit that holds the sample and the objective lens, and the captured image. When calculating the AF evaluation value representing the contrast from the luminance signal in the selected region, a calculation step for evaluating the contrast of the region having a color deviating from the reference color to be exhibited by the sample, and the objective lens based on the AF evaluation value And a focus position determining step for determining a focus position for focusing on the sample.
これにより、合焦位置検出プログラムは、サンプルとは異なる色を有する異物類についてのコントラストを低く評価できるため、ＡＦ評価値に対する異物類の影響を低減できる。 Accordingly, the focus position detection program can evaluate the contrast of foreign matters having a color different from that of the sample to be low, so that the influence of foreign matters on the AF evaluation value can be reduced.
本発明では、サンプルとは異なる色を有する異物類についてのコントラストを低く評価できるため、ＡＦ評価値に対する異物類の影響を低減でき、かくして合焦位置の誤検出を抑制し得る顕微鏡、合焦位置検出方法及び合焦位置検出プログラムを実現できる。 In the present invention, since the contrast of foreign matter having a color different from that of the sample can be evaluated low, the influence of the foreign matter on the AF evaluation value can be reduced, and thus the erroneous detection of the focus position can be suppressed. A detection method and a focus position detection program can be realized.
以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
１．実施の形態（異物類の影響を低減した合焦位置の検出）
２．他の実施の形態
Hereinafter, modes for carrying out the invention will be described. The description will be in the following order.
1. Embodiment (Focus position detection with reduced influence of foreign substances)
2. Other embodiments
＜１．実施の形態＞
［１−１．顕微鏡の構成］
図１において、本実施の形態による顕微鏡１を示す。この顕微鏡１は、プレパラートＰＲＴが配される板状のステージ１１を有する。
<1. Embodiment>
[1-1. Microscope configuration]
In FIG. 1, the microscope 1 by this Embodiment is shown. This microscope 1 has a plate-like stage 11 on which a preparation PRT is arranged.
プレパラートＰＲＴは、血液等の結合組織、上皮組織又はそれらの双方の組織などの組織の切片を、所定の固定手法によりスライドガラスＳＧに固定し封入したものであり、該組織切片には必要に応じて染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色と呼ばれる染色などが含まれる。 The preparation PRT is a section of tissue such as connective tissue such as blood, epithelial tissue, or both of them, which is fixed and enclosed in a glass slide SG by a predetermined fixing method. Is dyed. This staining includes staining called general staining represented by HE (hematoxylin and eosin) staining, Giemsa staining, Papanicolaou staining, and the like.
ステージ１１にはステージ駆動機構１２が設けられる。このステージ駆動機構１２は、ステージ面に対して平行となる方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）と、直交する方向（Ｚ軸方向）にステージ１１を駆動するものとされる。ちなみに、プレパラートＰＲＴが配される側のステージ面（以下、これをプレパラート配置面とも呼ぶ）には、一般に、プレパラートＰＲＴを定位置に抑止する抑止部（図示せず）が設けられる。
The stage 11 is provided with a
ステージ１１のプレパラート配置面とは逆の面側には光源１３が配される。光源１３は、一般染色が施された組織切片を照明する光（以下、これを明視野照明光とも呼ぶ）を照射可能なものとされる。ただし、明視野照明光及び特殊染色が施された組織切片を照明する光（以下、これを暗視野照射光と呼ぶ）を切り換えて照射可能なものであってもよい。光源１３とステージ１１との間には、プレパラート配置面における基準位置の法線を光軸とするコンデンサレンズ１４が配される。
A light source 13 is disposed on the side of the stage 11 opposite to the preparation arrangement surface. The light source 13 can irradiate light that illuminates a tissue section subjected to general staining (hereinafter also referred to as bright field illumination light). However, light that illuminates a tissue section subjected to bright field illumination light and special staining (hereinafter referred to as dark field illumination light) may be switched and irradiated. A
ステージ１１のプレパラート配置面側には、ステージ面における基準位置の法線を光軸とする対物レンズ１５が配される。対物レンズ１５は、倍率の異なる複数の対物レンズのなかからレンズ切換機構又は手動により選択される。この対物レンズ１５の後方には、該対物レンズ１５の結像面を撮像面とする撮像素子１６が配される。 On the preparation arrangement surface side of the stage 11, an objective lens 15 having a normal line of a reference position on the stage surface as an optical axis is disposed. The objective lens 15 is selected by a lens switching mechanism or manually from a plurality of objective lenses having different magnifications. Behind the objective lens 15, an image sensor 16 having an imaging surface of the objective lens 15 as an imaging surface is disposed.
この顕微鏡１における制御系として、ステージ駆動機構１２にはステージ駆動制御部２１が、光源１３には照明制御部２２が、撮像素子１６には撮像制御部２３がデータ通信路を介して接続される。
As a control system in the microscope 1, a stage
これら制御系は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)、ＲＯＭ(Read Only Memory)、ＣＰＵのワークメモリとなるＲＡＭ(Random Access Memory)及び演算回路などを含むコンピュータとされる。 These control systems are computers including a central processing unit (CPU), a read only memory (ROM), a random access memory (RAM) serving as a work memory of the CPU, an arithmetic circuit, and the like.
ステージ駆動制御部２１は、ステージ駆動機構１２を駆動制御し、コンデンサレンズ１４によって集められる集光部分にプレパラートＰＲＴの組織切片が割り当てられるようステージ面方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）にステージ１１を移動させる。
The stage
またステージ駆動制御部２１は、ステージ駆動機構１２を駆動制御し、集光部分に割り当てられる組織切片の部位が対物レンズ１５の焦点に合うようステージ面の直交方向（Ｚ軸方向（つまり組織切片の厚み方向））にステージ１１を移動させる。
Further, the stage
照明制御部２２は、明視野像を取得すべきモード（以下、これを明視野モードとも呼ぶ）に応じたパラメータを光源１３に設定し、該光源１３から照明光を照射させる。このパラメータは例えば照明光の強度や光源の切り換えなどである。なお、明視野モードにおける照射光は一般に可視光とされる。
The
光源１３から照明光が照射された場合、その照明光はコンデンサレンズ１４によって、ステージ１１におけるプレパラート配置面の基準位置に集められる。対物レンズ１５の結像面には、プレパラートＰＲＴにおける組織切片のうち、コンデンサレンズ１４によって集光される集光部分の像が拡大されて結像され、その拡大像が対物レンズ１５によって撮像素子１６の撮像面に被写体像として結像される。
When illumination light is emitted from the light source 13, the illumination light is collected by the
撮像制御部２３は、明視野モードに応じたパラメータを撮像素子１６に設定し、該撮像素子１６の撮像面に結像される被写体像のデータを取得する。このパラメータは例えば露光の開始タイミング及び終了タイミングなどである。
The
またこの顕微鏡１における制御系として、該顕微鏡１の全体の制御を司る制御部（以下、これを統括制御部とも呼ぶ）３０があり、これはステージ駆動制御部２１、照明制御部２２及び撮像制御部２３それぞれにデータ通信路を介して接続される。この統括制御部３０は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、演算回路及び記憶媒体などを含むコンピュータとされる。
As a control system in the microscope 1, there is a control unit (hereinafter also referred to as a general control unit) 30 that controls the entire microscope 1, which is a stage
統括制御部３０は、明視野モードの開始命令を待ち受け、該開始命令を受けた場合、撮像処理を開始し、制御を開始すべき指令をステージ駆動制御部２１、照明制御部２２及び撮像制御部２３に与える。
The
このとき、図２に示すように、統括制御部３０は、プレパラートＰＲＴを複数の撮像領域ＣＡに分割し、当該撮像領域ＣＡごとに検出合焦位置を検出するオートフォーカス処理を実行する。統括制御部３０は、撮像領域ＣＡごとに決定された検出合焦位置において撮像を繰り返すことにより、プレパラートＰＲＴのほぼ全域に亘って撮像する。
At this time, as shown in FIG. 2, the
また統括制御部３０は、ステージ駆動制御部２１においてプレパラートＰＲＴの組織切片部位が割り当てるたびに、撮像素子１６によって取得される組織切片部位における拡大像のデータを記憶媒体に記憶する。
In addition, each time the stage
そして統括制御部３０は、表示命令を待ち受け、該表示命令を受けた場合、その表示命令で指定される拡大像に対応するデータを記憶媒体から読み出し、これを表示命令の送出元に与える。
The
このようにこの顕微鏡１は、プレパラートＰＲＴの組織切片を鏡検状態の画像として記憶することで、プレパラートＰＲＴ自体を保存する場合に比べて、固定や染色等の状態を劣化させることなく長期にわたって組織切片を保存できるようになされている。 As described above, the microscope 1 stores the tissue section of the preparation PRT as an image in a microscopic state, so that the tissue can be maintained for a long period of time without deteriorating the state of fixation, staining, or the like as compared with the case of storing the preparation PRT itself. The section can be stored.
［１−２．オートフォーカス処理］
次に、合焦位置を自動的に検出するオートフォーカス処理について説明する。
[1-2. Autofocus processing]
Next, an autofocus process for automatically detecting the focus position will be described.
具体的に、図３に示すように、顕微鏡１の統括制御部３０は、顕微鏡１における各部を制御することにより、撮像領域ＣＡごとに複数の焦点位置で画像を撮像する。このときの、光軸方向の撮像間隔は、例えば被写界深度と同程度、又は被写界深度未満に設定される。
Specifically, as shown in FIG. 3, the
統括制御部３０は、撮像領域ＣＡにおける部分的な領域（例えば中心部分）をＡＦ検波枠ＡＡとする。統括制御部３０は、ＡＦ検波枠ＡＡにおけるコントラスト（画像における明暗の強度）などをＡＦ評価値として比較し、当該ＡＦ評価値の最も高い焦点位置を合焦位置ＦＰとして検出する。
The
一般的に、ＡＦ評価値は、ＡＦ検出枠ＡＡ内のすべての画素についての和として、輝度信号Ｙを用いた２次微分（ラプラシアン）によって算出される。例えば、（１）式に示すように、画像の任意の点(x,y)における上下左右の隣接する画素の輝度値Ｙ同士の２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）が算出される。 In general, the AF evaluation value is calculated by secondary differentiation (Laplacian) using the luminance signal Y as the sum of all the pixels in the AF detection frame AA. For example, as shown in equation (1), the secondary differential value L (x, y) between the luminance values Y of the adjacent pixels in the vertical and horizontal directions at an arbitrary point (x, y) of the image is calculated.
そして、（２）式に従って、ＡＦ検出枠ＡＡ内のすべての画素についての２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）の和として、ＡＦ評価値が算出される。 Then, the AF evaluation value is calculated as the sum of the secondary differential values L (x, y) for all the pixels in the AF detection frame AA according to the equation (2).
一般的に、画像では、合焦していれば隣接画素間の輝度信号Ｙの差分が大きくなり、コントラストが大きくなる。このため、統括制御部３０は、ＡＦ評価値が最大となる焦点位置を検出合焦位置として検出する。
Generally, in an image, if the image is in focus, the difference in the luminance signal Y between adjacent pixels increases, and the contrast increases. For this reason, the
図４に示すように、細胞組織でなるサンプルＳＰは、一般的に、スライドガラスＳＧとカバーガラスＣＧとの間に挟まれ、包理剤ＬＱによって固定されたスライドＳＧとして顕微鏡１のステージ１１上に設置される。 As shown in FIG. 4, a sample SP made of a cell tissue is generally sandwiched between a slide glass SG and a cover glass CG, and is placed on the stage 11 of the microscope 1 as a slide SG fixed by a packing agent LQ. Installed.
このとき、スライドガラスＳＧの表面やカバーガラスＣＧの表面には、肉眼では確認できない微細な塵が多数付着している。また、包理剤ＬＱの内部にも、スライドＳＤの作成時に混入した気泡や微細な塵、異物など（以下、これらをまとめて異物類ＯＤと呼ぶ）が混入してしまう。 At this time, many fine dusts that cannot be confirmed with the naked eye adhere to the surface of the slide glass SG and the surface of the cover glass CG. In addition, bubbles, fine dust, foreign matters and the like (hereinafter collectively referred to as foreign matters OD) mixed in the creation of the slide SD are also mixed inside the packing material LQ.
図５に示すように、ＡＦ検波枠ＡＡ内に異物類ＯＤが混入していた場合、異物類ＯＤによりＡＦ評価値が上昇し、合焦位置を誤検出する可能性が生じる。 As shown in FIG. 5, when the foreign object OD is mixed in the AF detection frame AA, the AF evaluation value increases due to the foreign object OD, and there is a possibility that the in-focus position is erroneously detected.
ところで、一般的に、細胞組織をサンプルＳＰとして顕微鏡観察を行う場合、当該サンプルＳＰに対して染色処理が施されていることが多い。このため、観察対象となるサンプルＳＰそのものを撮像した場合、染色に応じた限定された色域において像が変化する画像となる。 By the way, generally, when performing microscopic observation using a cell tissue as a sample SP, the sample SP is often subjected to a staining process. For this reason, when the sample SP itself to be observed is imaged, the image changes in a limited color gamut according to staining.
一方で、異物類ＯＤは、ほとんど染色されないことから、サンプルＳＰとは異なる色域において像が変化する画像となる。 On the other hand, since the foreign matter OD is hardly dyed, the image changes in a color gamut different from that of the sample SP.
そこで本実施の形態による顕微鏡１では、色差信号Ｃ（Ｃｒ及びＣｂ）を用いて２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を重み付けすることにより、ＡＦ評価値における異物類ＯＤの影響を低減させるようになされている。 Therefore, in the microscope 1 according to this embodiment, the influence of the foreign matter OD on the AF evaluation value is reduced by weighting the secondary differential value L (x, y) using the color difference signals C (Cr and Cb). Has been made.
顕微鏡１の統括制御部３０は、ユーザの操作入力に応じて基準色の設定要求がなされると、基準色設定部４４（図１）に予め記憶されている色テーブルを読み出し、想定される染色種類の一覧を表示部（図示しない）に表示する。この色テーブルには、染色種類と対応づけて色差信号が記憶されている。この色差信号は、染色種類における平均的な色を表すものである。
When a reference color setting request is made in response to a user operation input, the
基準色設定部４４は、ユーザによって染色種類が選択されると、当該染色種類に対応付けられた色差信号Ｃを基準色差信号ＣＳ（ＣｂＳ及びＣｒＳ）に決定し、これをＡＦ処理部４１の補正部４５に供給する。
When the staining type is selected by the user, the reference
図６に示すように、補正部４５は、（３）式に従って、各画素のコントラストを表す２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を算出する。すなわち、補正部４５は、色差信号Ｃｂ及びＣｒから基準色差信号ＣｂＳ及びＣｒＳを減算した差分値を２乗して加算し、平方根をとることにより、差分値を加重し、加重差分値を算出する。色差信号Ｃｂ及びＣｒの最高値が２５５であることから、当該加重差分値を２×２５５の平方根で除算して正規化して正規化値を算出する。当該正規化値を１から減算して補正係数を算出し、算出された補正係数に対し、２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を乗算する。
As shown in FIG. 6, the
２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）に乗算される補正係数は、基準色差信号ＣｂＳ及びＣｒＳを減算した差分値が大きいほど小さくなり、「１」よりも小さくなる。一方、差分値が小さいほど大きくなり、「１」に近づく。すなわち、染色された領域では「１」に近い補正係数が乗算されて補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）が算出されるのに対し、異物では「１」よりもかなり小さい補正係数が乗算され、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）が算出される。 The correction coefficient multiplied by the secondary differential value L (x, y) becomes smaller as the difference value obtained by subtracting the reference color difference signals CbS and CrS becomes larger, and becomes smaller than “1”. On the other hand, the smaller the difference value, the larger the value, and the value approaches “1”. That is, the corrected secondary differential value Lc (x, y) is calculated by multiplying the stained area by a correction coefficient close to “1”, whereas the foreign substance is multiplied by a correction coefficient considerably smaller than “1”. Then, the corrected secondary differential value Lc (x, y) is calculated.
補正部４５は、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）をＡＦ評価値算出部４６に供給する。ＡＦ評価値算出部４６は、（４）式に従って、ＡＦ評価値を算出する。なお、（４）式は、（２）式の２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）に置き換えたものである。
The
すなわち、染色されたサンプルＳＰでは、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）の和であるＡＦ評価値が殆ど補正されない一方、異物類ＯＤの領域では、ＡＦ評価値が小さくなるように補正される。 That is, in the stained sample SP, the AF evaluation value that is the sum of the corrected secondary differential values Lc (x, y) is hardly corrected, while in the region of foreign matter OD, the AF evaluation value is corrected to be small. The
合焦位置決定部４７は、ＡＦ評価値の最も高い画像の撮像された焦点位置を検出合焦位置に決定する。このとき、合焦位置決定部４７は、異物類ＯＤの領域ではＡＦ評価値が小さく補正されているため、サンプルＳＰに対する合焦位置を検出号証位置として適切に決定することができる。
The focus
このように、顕微鏡１は、染色に使用された色から乖離する色を有する領域を異物類ＯＤとみなし、当該異物類ＯＤに対するＡＦ評価値の値を低減することにより、異物類ＯＤがＡＦ評価値に与える影響を小さくすることができる。この結果、顕微鏡１は、異物類ＯＤに合焦したことによってＡＦ評価値が上昇することによる検出合焦位置の誤検出を防止し得るようになされている。 As described above, the microscope 1 regards a region having a color deviating from the color used for staining as the foreign matter OD, and reduces the value of the AF evaluation value for the foreign matter OD so that the foreign matter OD is evaluated by the AF. The influence on the value can be reduced. As a result, the microscope 1 can prevent erroneous detection of the detected focus position due to the AF evaluation value increasing due to focusing on the foreign matter OD.
［１−３．処理手順］
次に、撮像プログラムに従って実行される撮像処理手順について、図７のフローチャートを用いて説明する。
[1-3. Processing procedure]
Next, an imaging processing procedure executed according to the imaging program will be described with reference to the flowchart of FIG.
顕微鏡１は、ユーザの操作入力に応じた明視野モードの開始命令を認識すると、撮像処理手順ＲＴ１を開始し、ステップＳＰ１へ移る。 When the microscope 1 recognizes a bright field mode start command in accordance with a user operation input, the microscope 1 starts an imaging processing procedure RT1 and proceeds to step SP1.
ステップＳＰ１において、顕微鏡１は、一の撮像領域ＣＡにおいて複数の焦点位置で撮像を実行すると、次のステップＳＰ２へ移る。 In step SP1, when the microscope 1 performs imaging at a plurality of focal positions in one imaging area CA, the microscope 1 proceeds to the next step SP2.
ステップＳＰ２において、顕微鏡１は、（３）式に従って色差信号Ｃによる重み付けを行い、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）を算出すると、次のステップＳＰ３へ移る。 In step SP2, the microscope 1 performs weighting by the color difference signal C according to the equation (3) and calculates the corrected secondary differential value Lc (x, y), and then proceeds to the next step SP3.
ステップＳＰ３において、顕微鏡１は、（４）式に従って、ＡＦ検出枠ＡＡ内についてのコントラストの大きさを表すＡＦ評価値を算出すると、次のステップＳＰ４へ移る。 In step SP3, when the microscope 1 calculates an AF evaluation value representing the magnitude of contrast in the AF detection frame AA according to the equation (4), the microscope 1 proceeds to the next step SP4.
ステップＳＰ４において、顕微鏡１は、ＡＦ評価値に基づいて検出合焦位置を決定すると、次のステップＳＰ５へ移る。 In step SP4, when the microscope 1 determines the detection focus position based on the AF evaluation value, the microscope 1 proceeds to the next step SP5.
ステップＳＰ５において、顕微鏡１は、検出合焦位置において撮像を実行すると、次のステップＳＰ６へ移る。 In step SP5, when the microscope 1 executes imaging at the detection focus position, the microscope 1 proceeds to the next step SP6.
ステップＳＰ６において、顕微鏡１は、すべての撮像領域ＣＡに対して撮像処理を実行したか否かについて判別する。ここで否定結果が得られると、顕微鏡１は、ステップＳＰ１へ戻り、次の撮像領域ＣＡに対する処理を実行する。 In step SP6, the microscope 1 determines whether or not the imaging process has been executed for all the imaging areas CA. If a negative result is obtained here, the microscope 1 returns to step SP1 and executes processing for the next imaging area CA.
これに対して、ステップＳＰ７において否定肯定結果が得られると、顕微鏡１は、終了ステップへ移り、撮像処理手順ＲＴ１を終了する。 On the other hand, if a negative result is obtained in step SP7, the microscope 1 moves to an end step and ends the imaging processing procedure RT1.
［１−４．動作及び効果］
以上の構成によれば、顕微鏡１は、サンプルＳＰを保持するステージ１１と対物レンズ１５との距離を変動させ、対物レンズ１５により拡大されるサンプルＳＰを撮像する。顕微鏡１は、撮像される撮像領域ＣＡに対応する画像において、部分的に選択された選択領域であるＡＦ検出枠ＡＡにおける輝度信号Ｙから、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する。このとき、顕微鏡１は、サンプルＳＰが呈すべき基準色（基準色差信号ＣＳ）から乖離する色（色差信号Ｃ）を有する領域のコントラストを低く評価する。そして、顕微鏡１は、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズ１５がサンプルＳＰに対して合焦する合焦位置ＦＰを検出合焦位置として決定する。
[1-4. Operation and effect]
According to the above configuration, the microscope 1 varies the distance between the stage 11 holding the sample SP and the objective lens 15 and images the sample SP enlarged by the objective lens 15. The microscope 1 calculates an AF evaluation value representing contrast from the luminance signal Y in the AF detection frame AA, which is a partially selected selection area, in an image corresponding to the imaging area CA to be imaged. At this time, the microscope 1 evaluates the contrast of a region having a color (color difference signal C) deviating from the reference color (reference color difference signal CS) to be exhibited by the sample SP to be low. Then, based on the AF evaluation value, the microscope 1 determines a focus position FP where the objective lens 15 is focused on the sample SP as a detection focus position.
これにより、顕微鏡１は、サンプルＳＰとは相違する色を呈する異物類ＯＤのコントラストを低く評価することができるため、検出合焦位置の検出精度を向上させることができる。 Thereby, since the microscope 1 can evaluate the contrast of the foreign substances OD exhibiting a color different from that of the sample SP, the detection accuracy of the detection focus position can be improved.
顕微鏡１は、２次微分値を補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）として算出することにより、基準色差信号ＣＳから乖離する色差信号Ｃを有する画素の２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）の値を小さくして補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）を算出する。これにより、顕微鏡１は、基準色差信号ＣＳから乖離する色差信号Ｃを有する領域のコントラストを低く評価する。 The microscope 1 calculates the secondary differential value as the corrected secondary differential value Lc (x, y), thereby obtaining the secondary differential value L (x, y) of the pixel having the color difference signal C that deviates from the reference color difference signal CS. Is corrected to calculate a corrected secondary differential value Lc (x, y). Thereby, the microscope 1 evaluates the contrast of the area having the color difference signal C deviating from the reference color difference signal CS low.
これにより、顕微鏡１は、異物類ＯＤを表す２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）の値を小さくできるため、異物類ＯＤのＡＦ評価値を低減することができる。また、顕微鏡１は、２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を補正するだけの簡易な処理で基準色差信号ＹＳから乖離する色差信号Ｃを有する領域のコントラストを低く評価することができる。 Thereby, since the microscope 1 can reduce the value of the secondary differential value L (x, y) representing the foreign matter OD, the AF evaluation value of the foreign matter OD can be reduced. Further, the microscope 1 can evaluate the contrast of the region having the color difference signal C deviating from the reference color difference signal YS with a simple process that only corrects the secondary differential value L (x, y).
顕微鏡１は、基準色差信号ＣＳからの色差信号Ｃの乖離度合いに応じて、対応する画素の補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）の値を小さくする。これにより、顕微鏡１は、異物類ＯＤか否かを検出することなく、異物類ＯＤである可能性に応じてＡＦ評価値の値を調整でき、ＡＦ評価値の信頼性を向上させることができる。また、顕微鏡１は、２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）に対して補正係数を乗算するだけの簡易な計算により、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）を算出できる。 The microscope 1 reduces the value of the corrected secondary differential value Lc (x, y) of the corresponding pixel in accordance with the degree of deviation of the color difference signal C from the reference color difference signal CS. Thereby, the microscope 1 can adjust the value of the AF evaluation value according to the possibility of the foreign matter OD without detecting whether or not the foreign matter is OD, and can improve the reliability of the AF evaluation value. . Further, the microscope 1 can calculate the corrected secondary differential value Lc (x, y) by a simple calculation by simply multiplying the secondary differential value L (x, y) by the correction coefficient.
顕微鏡１は、ユーザによる操作入力に応じて、基準色差信号ＣＳを設定する。これにより、顕微鏡１は、染色方法に応じた適切な基準色差信号ＣＳを設定することができる。 The microscope 1 sets the reference color difference signal CS according to the operation input by the user. Thereby, the microscope 1 can set an appropriate reference color difference signal CS according to the staining method.
以上の構成によれば、顕微鏡１は、サンプルを保持するステージ１１と対物レンズ１５との距離を変動させながらサンプルＳＰを撮像する。顕微鏡１は、撮像された画像において、部分的に選択されたＡＦ検出枠ＡＡにおける輝度信号Ｙから、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、サンプルＳＰが呈すべき基準色差信号ＣＳから乖離する色差信号Ｃを有する画素に隣接する領域のコントラストを低く評価する。そして、顕微鏡１は、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズ１５がサンプルＳＰに対して合焦する検出合焦位置を決定する。 According to the above configuration, the microscope 1 images the sample SP while changing the distance between the stage 11 holding the sample and the objective lens 15. When the microscope 1 calculates an AF evaluation value representing contrast from the luminance signal Y in the partially selected AF detection frame AA in the captured image, the microscope 1 deviates from the reference color difference signal CS to be presented by the sample SP. The contrast of the area adjacent to the pixel having the signal C is evaluated low. Then, the microscope 1 determines a detection focus position at which the objective lens 15 is focused on the sample SP based on the AF evaluation value.
これにより、顕微鏡１は、異物類ＯＤに起因するＡＦ評価値を低く設定できるため、異物類ＯＤに対する合焦位置ＯＰをサンプルＳＰに対する検出合焦位置として検出することを極力防止できる。かくして、本発明は、合焦位置ＦＰの誤検出を抑制し得る顕微鏡、合焦位置検出方法及び合焦位置検出プログラムを実現できる。 Thereby, since the microscope 1 can set the AF evaluation value caused by the foreign matter OD to be low, it is possible to prevent the focus position OP with respect to the foreign matter OD from being detected as the detected focus position with respect to the sample SP as much as possible. Thus, the present invention can realize a microscope, a focus position detection method, and a focus position detection program that can suppress erroneous detection of the focus position FP.
＜２．他の実施の形態＞
なお、上述した実施の形態においては、ユーザによる操作入力に応じて、基準色差信号ＣＳを設定するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、顕微鏡１が基準色差信号ＣＳを設定するようにしても良い。例えば、顕微鏡１が、サンプルＳＰ１における少なくとも一部の領域の色差信号ＣＳの平均値を算出し、これを基準色差信号ＣＳとして設定するようにとしてもよい。例えば一つの焦点位置において複数の撮像領域ＣＡを撮像し、基準色差信号ＣＳが算出されても良い。
<2. Other embodiments>
In the above-described embodiment, the case where the reference color difference signal CS is set according to the operation input by the user has been described. The present invention is not limited to this, and the microscope 1 may set the reference color difference signal CS. For example, the microscope 1 may calculate an average value of the color difference signals CS of at least a part of the region in the sample SP1 and set this as the reference color difference signal CS. For example, a plurality of imaging areas CA may be imaged at one focal position, and the reference color difference signal CS may be calculated.
これにより、顕微鏡１は、ユーザに染色方法などを指定させるなどの操作をさせることなく、基準色差信号ＣＳを設定でき、ユーザの利便性を向上させ得る。 Accordingly, the microscope 1 can set the reference color difference signal CS without causing the user to designate a staining method or the like, and can improve the convenience for the user.
また、プレパラートの上に貼り付けられたラベルやバーコード情報、もしくはＲＦチップなどから染色種類を自動的に読取り、基準色差信号ＣＳを自動的に設定することも可能である。これにより、プレパラートの経年劣化や退色による影響を基準色差信号ＣＳに対して自動的に反映させることができる。 It is also possible to automatically read the staining type from the label or bar code information affixed on the slide or from the RF chip, and to set the reference color difference signal CS automatically. As a result, it is possible to automatically reflect the effects of the aging deterioration and fading of the preparation on the reference color difference signal CS.
さらに、上述した実施の形態においては、サンプルＳＰが染色されているようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、均一な色の特徴を有するようなすべてのサンプルについて、本発明を適用することができる。もちろん、サンプルとして生体サンプル以外のサンプルを撮像することも可能である。 Furthermore, in the above-described embodiment, the case where the sample SP is stained is described. The present invention is not limited to this, and the present invention can be applied to all samples having uniform color characteristics. Of course, it is also possible to image samples other than biological samples as samples.
また、上述した実施の形態においては、オートフォーカス処理の後、検出合焦位置において、サンプルＳＰを撮像するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、少なくともオートフォーカス処理を実行すれば良く、必ずしも撮像する必要はない。 In the above-described embodiment, the case where the sample SP is imaged at the detection focus position after the autofocus process has been described. The present invention is not limited to this, and it is sufficient to execute at least an autofocus process, and it is not always necessary to perform imaging.
さらに、上述の実施の形態では、生体サンプルＳＰＬにおける所望の部位を撮像範囲に移動させる場合、ステージ１１が追従された。しかしながら追従させるべき対象は、対物レンズ１５とするようにしてもよい。このようにしても上述の実施の形態と同様の効果を得ることができる。 Furthermore, in the above-described embodiment, the stage 11 is followed when a desired part of the biological sample SPL is moved to the imaging range. However, the object to be followed may be the objective lens 15. Even if it does in this way, the effect similar to the above-mentioned embodiment can be acquired.
さらに、上述した実施の形態においては、画素ごとに２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を補正するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えばＡＦ検出枠ＡＡごとにＡＦ評価値を補正しても良い。例えば、ＡＦ検出枠ＡＡにおける基準色差信号ＣＳと色差信号Ｃとの差分の最大値に応じてＡＦ評価値を補正しても良い。 Furthermore, in the above-described embodiment, the case where the secondary differential value L (x, y) is corrected for each pixel has been described. The present invention is not limited to this. For example, the AF evaluation value may be corrected for each AF detection frame AA. For example, the AF evaluation value may be corrected according to the maximum value of the difference between the reference color difference signal CS and the color difference signal C in the AF detection frame AA.
さらに、上述した実施の形態においては、画素値が輝度信号Ｙ及び色差信号Ｃで表されるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、信号ＳＲ、ＳＧ及びＳＢからなるＲＧＢ信号についても本発明を適用することが可能である。 Furthermore, in the above-described embodiment, the case where the pixel value is expressed by the luminance signal Y and the color difference signal C has been described. The present invention is not limited to this, and the present invention can also be applied to RGB signals including signals SR, SG, and SB.
この場合、ＡＦ検波枠ＡＡ内で（５）式に従ってＲＧＢ各信号の相関係数Ｃを算出する。この相関係数Ｃは、ＡＦ検波枠ＡＡ内でのＲＧＢ信号間の相関を表している。次式において、Ａ及びＢはＲＧＢ各信号（ＳＲ、ＳＧ及びＳＢ）の値であり、ＡＳ及びＢＳは、基準色の値であり、例えばＡＦ検波枠ＡＡ内でのＲＧＢ信号の平均値である。すなわち、相関係数Ｃは、各信号（ＳＲ、ＳＧ及びＳＢ）をＡ及びＢにそれぞれ代入した３つの組み合わせそれぞれについて算出される。 In this case, the correlation coefficient C of each RGB signal is calculated according to the equation (5) within the AF detection frame AA. This correlation coefficient C represents the correlation between the RGB signals within the AF detection frame AA. In the following equation, A and B are values of RGB signals (SR, SG, and SB), and AS and BS are reference color values, for example, average values of RGB signals within the AF detection frame AA. . That is, the correlation coefficient C is calculated for each of the three combinations obtained by substituting each signal (SR, SG, and SB) for A and B, respectively.
相関係数Ｃは、ＡＦ検波枠ＡＡ内でのＲＧＢ各信号間の変化（すなわち平均値からの分散度合い）がどの程度の相関関係にあるかを示している。染色されたサンプルＳＰは、特有の色相における濃淡の変化を伴う情報になるため、ＲＧＢ各信号間の変化は相関が弱くなり、相関係数Ｃが小さくなる。 The correlation coefficient C indicates how much the change between the RGB signals within the AF detection frame AA (that is, the degree of dispersion from the average value) is correlated. Since the stained sample SP becomes information accompanied by a change in shading in a specific hue, the change between RGB signals has a weak correlation, and the correlation coefficient C becomes small.
一般に、染色されていない異物類ＯＤによる画像信号間は、濃淡（白黒）の変化を伴うため、ＲＧＢ各信号が強い相関となり、相関値Ｃが大きくなる。 In general, the image signals due to the unstained foreign matter OD are accompanied by a change in shading (black and white), so that the RGB signals have a strong correlation and the correlation value C increases.
例えば顕微鏡１は、各ＲＧＢ信号間の相関係数Ｃが高くなる場合において、ＡＦ評価値が小さくなるように補正をかけることで、ＡＦ評価値における異物類ＯＤによる影響を軽減できる。顕微鏡１は、例えば２つ又は３つの相関値Ｃの平均値が閾値以上であればＡＦ評価値を補正する。 For example, the microscope 1 can reduce the influence of the foreign substance OD on the AF evaluation value by correcting the AF evaluation value to be small when the correlation coefficient C between the RGB signals is high. The microscope 1 corrects the AF evaluation value if, for example, the average value of two or three correlation values C is equal to or greater than a threshold value.
さらに、上述した実施の形態においては、基準色からの乖離に応じてＡＦ評価値を補正するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えば補正された輝度信号Ｙｃに基づいてＡＦ評価値を算出しても良い。 Furthermore, in the above-described embodiment, the case where the AF evaluation value is corrected according to the deviation from the reference color has been described. The present invention is not limited to this. For example, the AF evaluation value may be calculated based on the corrected luminance signal Yc.
この場合、補正部は、基準色差信号ＣＳを（６）式に従って重み付けし、補正輝度信号Ｙｃを算出する。（６）式において、基準色差信号ＣＳと色差信号Ｃの差分を１から引いた値を輝度信号Ｙに乗算するため、基準色差信号ＣＳと異なる色差信号Ｃほど、補正輝度信号Ｙｃが小さくなる。すなわち、染色されている領域については、輝度信号Ｙが殆ど補正されないまま補正輝度信号Ｙｃとして算出される。一方、染色されていない異物類ＯＤについては、輝度信号Ｙが大きく補正され、補正輝度信号Ｙｃの値が小さくなる。 In this case, the correction unit calculates the corrected luminance signal Yc by weighting the reference color difference signal CS according to the equation (6). In equation (6), the luminance signal Y is multiplied by a value obtained by subtracting the difference between the reference color difference signal CS and the color difference signal C from 1. Therefore, the corrected luminance signal Yc is smaller as the color difference signal C is different from the reference color difference signal CS. That is, for the stained region, the luminance signal Y is calculated as the corrected luminance signal Yc with almost no correction. On the other hand, for the unstained foreign matter OD, the luminance signal Y is greatly corrected, and the value of the corrected luminance signal Yc is decreased.
補正部は、補正輝度信号ＹｃをＡＦ評価値算出部４６に供給する。ＡＦ評価値算出部４６は、（７）式に従って、ＡＦ検出枠ＡＡについてのＡＦ評価値を算出し、合焦位置決定部４７に供給する。なお、（７）式は、（１）式の輝度信号Ｙを補正輝度信号Ｙｃに置き換えたものである。
The correction unit supplies the corrected luminance signal Yc to the AF evaluation
合焦位置決定部４７は、ＡＦ評価値の最も高い画像の撮像された焦点位置を検出合焦位置に決定する。
The focus
ここで、補正輝度信号Ｙｃは、異物類ＯＤの値が小さくなるように算出されている。従って、ＡＦ評価値算出部４６は、異物類ＯＤに関する隣接画素間の差分をも小さくすることができるため、異物類ＯＤに関するＡＦ評価値を全体として小さくすることができる。このため、合焦位置決定部４７は、異物類ＯＤに合焦したときの焦点位置ではなく、サンプルＳＰに合焦したときの焦点位置を検出合焦位置に高い精度で決定することができる。
Here, the corrected luminance signal Yc is calculated so that the value of the foreign matter OD becomes small. Therefore, since the AF evaluation
さらに、上述した実施の形態においては、（４）式に従ってＡＦ評価値を算出するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、ＡＦ評価値の算出方法に制限はない。例えば、隣接する上下左右の画素に加えて、斜め上下左右の画素についても差分をとるようにしても良い。この場合であっても、上述した実施の形態と同様の効果を得ることができる。 Further, in the above-described embodiment, the case where the AF evaluation value is calculated according to the equation (4) has been described. The present invention is not limited to this, and the AF evaluation value calculation method is not limited. For example, in addition to the adjacent upper, lower, left, and right pixels, a difference may be calculated for diagonally upper, lower, left, and right pixels. Even in this case, the same effects as those of the above-described embodiment can be obtained.
さらに、上述した実施の形態においては、複数の撮像領域ＣＡごとにオートフォーカス処理が実行されるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、プレパラートＰＲＴを１回で撮像する場合についても、本発明を適用することができる。また、撮像領域ＣＡの全域をＡＦ検出枠ＡＡとしても良い。 Furthermore, in the above-described embodiment, the case where the autofocus process is executed for each of the plurality of imaging areas CA has been described. The present invention is not limited to this, and the present invention can also be applied to a case where the preparation PRT is imaged once. Further, the entire imaging area CA may be used as the AF detection frame AA.
また上述の実施の形態では、１つの対物レンズ１５が用いられた。しかしながら対物レンズは複数であってもよい。また、複数の対物レンズを、レボルバー等を適用して倍率が可変できるようにしてもよい。さらに、対物レンズに加えて、接眼レンズを設けることもできる。 In the above-described embodiment, one objective lens 15 is used. However, there may be a plurality of objective lenses. Further, the magnification of the plurality of objective lenses may be made variable by applying a revolver or the like. Furthermore, an eyepiece lens can be provided in addition to the objective lens.
さらに、上述した実施の形態においては、撮像プログラム等をＲＯＭ又はハードディスクドライブなどに予め格納しているが、本発明はこれに限らず、メモリースティック（ソニー株式会社の登録商標）などの外部記憶媒体からフラッシュメモリなどにインストールするようにしても良い。また、撮像プログラムなどをＵＳＢ（Universal Serial Bus）やＥｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）（Institute of Electrical and Electronics Engineers）８０２．１１ａ／ｂ／ｇなどの無線ＬＡＮ（Local Area Network）を介して外部から取得し、さらに、は地上ディジタルテレビジョン放送やＢＳディジタルテレビジョン放送により配信されるようにしても良い。 Furthermore, in the above-described embodiment, the imaging program or the like is stored in advance in a ROM or a hard disk drive. However, the present invention is not limited to this, and an external storage medium such as a memory stick (registered trademark of Sony Corporation) can be used. You may make it install in flash memory etc. Also, an imaging program or the like is acquired from the outside via a wireless LAN (Local Area Network) such as USB (Universal Serial Bus) or Ethernet (registered trademark) (Institute of Electrical and Electronics Engineers) 802.11a / b / g, Furthermore, it may be distributed by digital terrestrial television broadcasting or BS digital television broadcasting.
また上述の実施の形態では、撮像処理により得られるサンプルデータは、例えば、ローカルエリアネットワークやインターネット、ディジタル衛星放送等の有線又は無線の通信媒体としてもよい。 In the above-described embodiment, the sample data obtained by the imaging process may be a wired or wireless communication medium such as a local area network, the Internet, or digital satellite broadcasting.
さらに、上述した実施の形態においては、対物レンズとしての対物レンズ１５と、位置変動部としてのステージ１１と、撮像素子としての撮像素子１６と、算出部としての補正部４５及びＡＦ評価値算出部４６と、合焦位置決定部としての合焦位置決定部４７とによって顕微鏡としての顕微鏡１を構成するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、その他種々の構成でなる対物レンズと、位置変動部と、撮像素子と、算出部と、合焦位置決定部とによって本発明の顕微鏡を構成するようにしても良い。
Further, in the above-described embodiment, the objective lens 15 as the objective lens, the stage 11 as the position changing unit, the imaging device 16 as the imaging device, the
本発明は、生物実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。 The present invention can be used in the bio-industry such as biological experiments, creation of medicines or patient follow-up.
１……顕微鏡、１１……ステージ、１３……光源、１５……対物レンズ、１６……撮像素子、３０……統括制御部、４１……ＡＦ処理部、４４……基準色設定部、４５……輝度補正部、４６……ＡＦ値算出部、４７……合焦位置決定部、ＰＲＴ……プレパラート、ＳＧ……スライドガラス、ＳＰ……サンプル。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Microscope, 11 ... Stage, 13 ... Light source, 15 ... Objective lens, 16 ... Image sensor, 30 ... General control part, 41 ... AF processing part, 44 ... Standard color setting part, 45 ... Luminance correction unit, 46... AF value calculation unit, 47... Focus position determination unit, PRT... Preparation, SG.
Claims (14)
上記サンプルを保持する保持部と、
上記保持部と上記対物レンズとの距離を変動させる距離変動部と、
上記対物レンズにより拡大されるサンプルを撮像する撮像素子と、
上記撮像される画像において、部分的に選択された選択領域における画素値から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、上記サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出部と、
上記ＡＦ評価値に基づいて、上記対物レンズが上記サンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定部と
を有する顕微鏡。 An objective lens to enlarge the sample;
A holding unit for holding the sample;
A distance varying unit that varies the distance between the holding unit and the objective lens;
An image sensor for imaging a sample enlarged by the objective lens;
In the captured image, when calculating an AF evaluation value representing contrast from pixel values in a partially selected selection area, the contrast of an area having a color deviating from the reference color to be exhibited by the sample is evaluated low A calculating unit to
And a focusing position determination unit that determines a focusing position at which the objective lens is focused on the sample based on the AF evaluation value.
輝度信号から上記ＡＦ評価値を算出する
請求項１に記載の顕微鏡。 The calculation unit is
The microscope according to claim 1, wherein the AF evaluation value is calculated from a luminance signal.
隣接する画素間における上記輝度信号の２次微分値を上記ＡＦ評価値として算出する
請求項２に記載の顕微鏡。 The calculation unit is
The microscope according to claim 2, wherein a second-order differential value of the luminance signal between adjacent pixels is calculated as the AF evaluation value.
上記基準色から乖離する色を有する画素の上記２次微分値をを小さくすることにより、上記基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する
請求項３に記載の顕微鏡。 The calculation unit is
The microscope according to claim 3, wherein the contrast of a region having a color deviating from the reference color is evaluated low by reducing the secondary differential value of a pixel having a color deviating from the reference color.
上記基準色からの色の乖離度合いに応じて、対応する画素の上記２次微分値を小さくする
請求項４に記載の顕微鏡。 The calculation unit is
The microscope according to claim 4, wherein the second-order differential value of the corresponding pixel is reduced in accordance with the degree of color deviation from the reference color.
上記ＡＦ評価値の算出単位ごとに、上記コントラストを補正する
請求項５に記載の顕微鏡。 The calculation unit is
The microscope according to claim 5, wherein the contrast is corrected for each calculation unit of the AF evaluation value.
をさらに有する請求項６に記載の顕微鏡。 The microscope according to claim 6, further comprising a reference color setting unit that sets the reference color in response to an operation input by a user.
をさらに有する請求項７に記載の顕微鏡。 The microscope according to claim 7, further comprising: a reference color setting unit that sets an average value of color difference signals of at least a part of the sample as the reference color.
をさらに有する請求項６に記載の顕微鏡。 The microscope according to claim 6, further comprising: an imaging unit that images the sample at the in-focus position.
ＲＧＢ信号から上記ＡＦ評価値を算出する
請求項１に記載の顕微鏡。 The calculation unit is
The microscope according to claim 1, wherein the AF evaluation value is calculated from RGB signals.
上記ＲＧＢ信号の上記基準色からの差分の分散度合いの相関値に応じて上記コントラストを低く評価するよう補正することにより、上記サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する
請求項１０に記載の顕微鏡。 The calculation unit is
The contrast of a region having a color deviating from the reference color to be exhibited by the sample is evaluated low by correcting the contrast to be evaluated low according to the correlation value of the variance degree of the difference from the reference color of the RGB signal. The microscope according to claim 10.
上記基準色から乖離する色を有する画素の輝度信号の値を小さくすることにより、上記基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する
請求項２に記載の顕微鏡。 The calculation unit is
The microscope according to claim 2, wherein the contrast of a region having a color deviating from the reference color is evaluated by reducing a value of a luminance signal of a pixel having a color deviating from the reference color.
撮像された画像において、部分的に選択された選択領域における輝度信号から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、上記サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出ステップと、
上記ＡＦ評価値に基づいて、上記対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定ステップと
を有する合焦位置検出方法。 An imaging step of imaging the sample while varying the distance between the holding unit that holds the sample and the objective lens;
In the captured image, when calculating the AF evaluation value representing the contrast from the luminance signal in the partially selected selection area, the contrast of the area having a color deviating from the reference color to be exhibited by the sample is evaluated low. A calculation step;
And a focus position determining step of determining a focus position at which the objective lens is focused on the sample based on the AF evaluation value.
サンプルを保持する保持部と対物レンズとの距離を変動させながら上記サンプルを撮像する撮像ステップと、
撮像された画像において、部分的に選択された選択領域における輝度信号から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、上記サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出ステップと、
上記ＡＦ評価値に基づいて、上記対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定ステップと
を実行させる合焦位置検出プログラム。 For the computer that controls the microscope,
An imaging step of imaging the sample while varying the distance between the holding unit that holds the sample and the objective lens;
In the captured image, when calculating the AF evaluation value representing the contrast from the luminance signal in the partially selected selection area, the contrast of the area having a color deviating from the reference color to be exhibited by the sample is evaluated low. A calculation step;
An in-focus position detection program for executing an in-focus position determining step for determining an in-focus position for focusing on the sample based on the AF evaluation value.
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