JP2011089813A - Biological sample fixing device for microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞など生きた状態の生体試料におけるさまざまな生命現象を高精度の光学顕微鏡で追尾し、その時系列画像を動画として連続的に記録しつつ、任意の時点で生体試料を固定して電子顕微鏡用生体試料として供し、特定の瞬間における同一部分の微細構造を高分解能で観察・記録するための顕微鏡用生体試料固定装置に関するものである。 The present invention tracks various life phenomena in a living biological sample such as a cell with a high-precision optical microscope, and continuously records the time-series image as a moving image while fixing the biological sample at an arbitrary time point. The present invention relates to a biological sample fixing device for a microscope which is used as a biological sample for an electron microscope and which observes and records the fine structure of the same portion at a specific moment with high resolution.
生命活動はさまざまな構成分子間の相互作用により生じるが、各々の現象の顕微鏡観察により、分子複合体や細胞内小器官などの分子構築のさまざまな動きがしばしば検出される。それらの分子構築の動態と微細構造を解析、記録することは生命現象の分子機序を理解するための強力な手段である。観察のための顕微鏡として光学顕微鏡と電子顕微鏡が多用されるが、生きたままの状態で生体試料を観察できる光学顕微鏡では現象の時系列の連続的な追跡はできるが空間分解能が低く、一方、空間分解能に優れる透過型電子顕微鏡では試料を高真空中に配置する必要があるため、生きた生体試料中で起きる現象をそのまま観察することは不可能で、何らかの固定操作が必須である。従来、それらの観察はそれぞれの顕微鏡法に適した処理を施した試料について個別に行われてきたため、それらの観察で真に同一の現象を解析している保証はなく、その解析結果については常にそのような疑念が付きまとうものであった。そこで、類似の視野ではなく真に同一の対象を、光学・電子顕微鏡法により並行して観察できる手段や装置が望まれてきた。 Although life activity is caused by interactions between various constituent molecules, microscopic observation of each phenomenon often detects various movements of molecular construction such as molecular complexes and intracellular organelles. Analyzing and recording the dynamics and microstructure of these molecular structures is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of life phenomena. Optical microscopes and electron microscopes are often used as observation microscopes, but optical microscopes that can observe biological samples in a living state can continuously track the time series of phenomena but have low spatial resolution, In a transmission electron microscope with excellent spatial resolution, it is necessary to place the sample in a high vacuum, so it is impossible to observe the phenomenon occurring in a living biological sample as it is, and some kind of fixing operation is essential. Traditionally, these observations have been made individually for samples that have been processed for each microscopy, so there is no guarantee that these observations will analyze the exact same phenomenon, and the results of the analysis are always consistent. Such a suspicion was attached. Therefore, there has been a demand for a means and apparatus that can observe the same object, not a similar field of view, in parallel by optical / electron microscopy.
これに対し、透過型電子顕微鏡を用いて生物試料を観察するための試料を作成するために、生物試料を液体ヘリウム温度に冷却した金属ブロックに短時間押し付けて急速凍結固定する急速凍結装置が開示されている（例えば、特許文献１）。これにより、特許文献１では、生のままの細胞・組織の微細構造を生体活動の動的な状態で凍結固定可能なものとすることができる、と記されている。 On the other hand, in order to create a sample for observing a biological sample using a transmission electron microscope, a quick freezing apparatus that rapidly freezes and fixes a biological sample by pressing it against a metal block cooled to liquid helium temperature is disclosed. (For example, Patent Document 1). As a result, Patent Document 1 describes that a fine structure of a living cell / tissue can be frozen and fixed in a dynamic state of biological activity.
上記特許文献１では、生体試料を予め観察することなく固定するが、活動中の生体試料においては時々刻々に状態が変化するため、その動的な構造変化に関する情報を得ることができない、という問題があった。 In the above-mentioned Patent Document 1, a biological sample is fixed without observing it in advance. However, since the state of an active biological sample changes every moment, information on the dynamic structural change cannot be obtained. was there.
そこで本発明は、時間経過と共に変化する生体試料の状態を光学顕微鏡で経時的に観察・記録しながら任意の時点で電子顕微鏡用固定操作を行い、上記の観察領域と同一視野を電子顕微鏡観察に供することを可能とする顕微鏡用生体試料固定装置の作製を目的とする。 Accordingly, the present invention performs an electron microscope fixing operation at an arbitrary time while observing and recording the state of a biological sample that changes over time with an optical microscope, and allows the same field of view as the above observation region to be observed with an electron microscope. The purpose is to produce a biological sample fixing device for a microscope that can be used.
本発明の請求項１に係る発明は、生体試料中で起きる特定の現象の経時変化を観察対象として略水平方向から照明する照明光学系と、前記生体試料から反射される反射光を、略水平方向を光軸とする対物レンズを介して受光して、前記生体試料の像を拡大する観察光学系とを有する水平型光学顕微鏡と、前記生体試料を前記対物レンズの焦点位置で略鉛直方向に立てて保持すると共に、任意の時点で前記生体試料を固定する試料固定部とを備えることを特徴とする。 The invention according to claim 1 of the present invention provides an illumination optical system that illuminates from a substantially horizontal direction a change in a specific phenomenon occurring in a biological sample as an observation target, and a reflected light reflected from the biological sample substantially horizontally. A horizontal optical microscope having an observation optical system that receives light through an objective lens whose direction is an optical axis and enlarges the image of the biological sample; and the biological sample is placed in a substantially vertical direction at a focal position of the objective lens. And a sample fixing unit that holds the biological sample at an arbitrary time.
本発明の請求項２に係る発明は、前記照明光学系は、前記対物レンズを介して前記生体試料を照明する落射照明を行うことを特徴とする。 The invention according to claim 2 of the present invention is characterized in that the illumination optical system performs epi-illumination for illuminating the biological sample via the objective lens.
本発明の請求項３に係る発明は、前記対物レンズは、液浸対物レンズであることを特徴とする。 The invention according to claim 3 of the present invention is characterized in that the objective lens is an immersion objective lens.
本発明の請求項４に係る発明は、前記対物レンズと前記生体試料との間に、前記浸液を貯留する液溜り部を設けたことを特徴とする。 The invention according to claim 4 of the present invention is characterized in that a liquid reservoir for storing the immersion liquid is provided between the objective lens and the biological sample.
本発明の請求項５に係る発明は、前記試料固定部は、カバーガラスの一側表面上に前記生体試料を載置して略鉛直方向に保持し、前記カバーガラスは、前記試料を載置する載置部を除いて一側表面に疎水性膜が形成され、表面張力によって前記載置部に形成された浸液による液溜り内に、前記生体試料を保持することを特徴とする。 In the invention according to claim 5 of the present invention, the sample fixing portion places the biological sample on one side surface of the cover glass and holds the biological sample in a substantially vertical direction, and the cover glass places the sample. A hydrophobic film is formed on the surface of one side except for the mounting portion to be held, and the biological sample is held in a liquid reservoir by immersion liquid formed on the mounting portion by surface tension.
本発明の請求項６に係る発明は、前記試料固定部は、前記生体試料を保持する保持部と、前記生体試料を凍結固定するための冷媒を収容した凍結槽とを備え、前記凍結槽は、前記保持部に保持された前記生体試料の下方に配置され、前記保持部から前記生体試料を任意の時点で落下させ、前記冷媒に前記生体試料を浸漬させる落下機構を設けたことを特徴とする。 The invention according to claim 6 of the present invention is characterized in that the sample fixing part includes a holding part for holding the biological sample and a freezing tank containing a refrigerant for freezing and fixing the biological sample. A dropping mechanism disposed below the biological sample held by the holding unit, dropping the biological sample from the holding unit at an arbitrary time, and immersing the biological sample in the refrigerant, To do.
本発明の請求項７に係る発明は、前記試料固定部は、前記生体試料に対し任意の時点で化学固定剤を添加する添加手段を備えることを特徴とする。 The invention according to claim 7 of the present invention is characterized in that the sample fixing part includes an adding means for adding a chemical fixing agent to the biological sample at an arbitrary time.
本発明によれば、時間と共に変化する生体試料の活動状態を観察しながら、任意の時点で電子顕微鏡用固定操作を行い、上記の観察領域と同一視野を電子顕微鏡観察に供することができる。 According to the present invention, it is possible to perform an electron microscope fixing operation at an arbitrary time point while observing the activity state of a biological sample that changes with time, and use the same field of view as the observation region for electron microscope observation.
以下、図面を参照して本発明の実施形態について詳細に説明する。
１．第１実施形態
（１）全体構成
図1に示す顕微鏡用生体試料固定装置（以下、「固定装置」という）１は、水平型光学顕微鏡２と、試料固定部３とを備える。ここで試料とは、時間の経過と共に状態が変化する対象であって、種々のものが考えられるが、例えば、細胞からなる試料（以下、「生体試料」という）とすることができる。固定装置１は、全体として、観察者が水平型光学顕微鏡２で試料固定部３に保持された生体試料の活動状態を水平型光学顕微鏡２で観察しながら、任意の時点で前記生体試料を固定し得るように構成されている。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
1. First Embodiment (1) Overall Configuration A biological sample fixing device for a microscope (hereinafter referred to as “fixing device”) 1 shown in FIG. 1 includes a horizontal optical microscope 2 and a sample fixing unit 3. Here, the sample is a target whose state changes with the passage of time, and various types are considered. As a whole, the fixing device 1 fixes the biological sample at an arbitrary time point while an observer observes the activity state of the biological sample held by the sample fixing unit 3 with the horizontal optical microscope 2 with the horizontal optical microscope 2. It is configured to be able to.
水平型光学顕微鏡２は、落射照明光学系４と、観察光学系５と、撮像部６とを備えている。この水平型光学顕微鏡２は、落射照明光学系４から出射された略水平方向の照明光により生体試料の表面（以下、「標本面」という）に対し照明を行い、生体試料を固定するために、観察光学系５を通じて当該標本面で反射した反射光を拡大して撮像部６で撮像して画像として出力し得るように構成されている。 The horizontal optical microscope 2 includes an epi-illumination optical system 4, an observation optical system 5, and an imaging unit 6. The horizontal optical microscope 2 illuminates the surface of a biological sample (hereinafter referred to as “specimen surface”) with illumination light emitted from the epi-illumination optical system 4 in a substantially horizontal direction, and fixes the biological sample. The reflected light reflected from the sample surface through the observation optical system 5 is enlarged, picked up by the image pickup unit 6 and output as an image.
落射照明光学系４は、光源７と、レンズ８と、開口絞り９と、視野絞り１０と、視野レンズ１１と、ハーフミラー１２と、対物レンズ１３とを有し、同軸落射照明で照明光を照射し得るように構成されている。このうち、光源７と、レンズ８と、開口絞り９と、視野絞り１０と、視野レンズ１１と、ハーフミラー１２は、同一軸上に配置されている。光源７は、例えば、ランプ光源を用いることができる。本実施形態の場合、落射照明光学系４は、標本面に対し同軸落射照明を行い得るように構成されている。 The epi-illumination optical system 4 includes a light source 7, a lens 8, an aperture stop 9, a field stop 10, a field lens 11, a half mirror 12, and an objective lens 13, and emits illumination light with coaxial epi-illumination. It is comprised so that it can irradiate. Among these, the light source 7, the lens 8, the aperture stop 9, the field stop 10, the field lens 11, and the half mirror 12 are arranged on the same axis. For example, a lamp light source can be used as the light source 7. In the case of this embodiment, the epi-illumination optical system 4 is configured to perform coaxial epi-illumination on the sample surface.
ハーフミラー１２は、入射した光の約半分を反射して、残りの約半分を透過する。このハーフミラー１２は、前記光軸Ｌに対し４５度の角度で配置されている。そして、ハーフミラー１２と対物レンズ１３とは、光軸Ｌ上に配置されている。 The half mirror 12 reflects about half of the incident light and transmits the remaining half. The half mirror 12 is disposed at an angle of 45 degrees with respect to the optical axis L. The half mirror 12 and the objective lens 13 are disposed on the optical axis L.
観察光学系５は、対物レンズ１３、ハーフミラー１２、およびフィールドレンズ１４が略水平方向に延びる光軸Ｌ上に順に配置されている。すなわち、対物レンズ１３およびハーフミラー１２は、落射照明光学系４と観察光学系５とにそれぞれ含まれており、共通の光学要素となる。対物レンズ１３は、落射照明光学系４において、コンデンサレンズとして機能する。 In the observation optical system 5, the objective lens 13, the half mirror 12, and the field lens 14 are sequentially arranged on the optical axis L extending in the substantially horizontal direction. That is, the objective lens 13 and the half mirror 12 are respectively included in the epi-illumination optical system 4 and the observation optical system 5 and are common optical elements. The objective lens 13 functions as a condenser lens in the epi-illumination optical system 4.
撮像部６は、図示しないが、受光面を有する画像センサを備え、図示しない表示部に前記画像センサで撮像された画像を表示し得るように構成されている。この撮像部６は、フィールドレンズ１４によって標本面の像が結像される位置に前記受光面を配置してなる。画像センサは、ＣＣＤ等の撮像素子で構成される。 Although not shown, the imaging unit 6 includes an image sensor having a light receiving surface, and is configured to display an image captured by the image sensor on a display unit (not shown). The imaging unit 6 is configured by arranging the light receiving surface at a position where an image of the specimen surface is formed by the field lens 14. The image sensor is composed of an image sensor such as a CCD.
試料固定部３は、前記生体試料を前記対物レンズ１３の焦点位置で略鉛直方向に立てて保持し、任意の時点で前記生体試料を固定し得るように構成されている。本実施形態の場合、試料固定部３は、保持部１８と、落下機構１９と、凍結部２０とを備える。この試料固定部３は、落下機構１９により、保持部１８で保持された生体試料を凍結部２０へ落下させ得るように構成されている。 The sample fixing unit 3 is configured to hold the biological sample upright in a substantially vertical direction at the focal position of the objective lens 13 and fix the biological sample at an arbitrary time. In the present embodiment, the sample fixing unit 3 includes a holding unit 18, a dropping mechanism 19, and a freezing unit 20. The sample fixing unit 3 is configured such that the biological sample held by the holding unit 18 can be dropped onto the freezing unit 20 by the dropping mechanism 19.
保持部１８は、生体試料を載置したグリッドまたはカバーガラス（以下の説明では、主にグリッドとして説明する）２１を挟持するピンセット２２を保持し得るように構成されている。この保持部１８は、前記ピンセット２２を所定の高さ（上死点）で保持すると共に、落下機構１９によって落下したピンセット２２を下死点で保持する。 The holding unit 18 is configured to hold a tweezers 22 that holds a grid or a cover glass (mainly described as a grid in the following description) 21 on which a biological sample is placed. The holding unit 18 holds the tweezers 22 at a predetermined height (top dead center), and holds the tweezers 22 dropped by the dropping mechanism 19 at the bottom dead center.
落下機構１９は、種々のものが考えられるが、例えば、図示しないが、前記ピンセット２２の基端側に貫通穴を形成し、当該貫通穴に挿入されるプランジャーを前記貫通穴に対し出入可能とする電磁アクチュエータにより構成することができる。 Various dropping mechanisms 19 are conceivable. For example, although not shown, a through hole is formed on the proximal end side of the tweezers 22 so that a plunger inserted into the through hole can enter and exit the through hole. The electromagnetic actuator can be configured as follows.
この落下機構１９は、貫通穴にプランジャーが挿入されることにより、上死点でピンセット２２が保持される。また、落下機構１９は、任意のタイミングで電磁アクチュエータが作動されることにより、プランジャーを退行方向へ移動させる。そうすると、貫通穴とプランジャーとの係合が解除されることにより、ピンセット２２は、自重により自由落下し、下死点で保持される。 The drop mechanism 19 holds the tweezers 22 at the top dead center by inserting a plunger into the through hole. Moreover, the dropping mechanism 19 moves the plunger in the retraction direction by operating the electromagnetic actuator at an arbitrary timing. Then, the engagement between the through hole and the plunger is released, so that the tweezers 22 freely falls by its own weight and is held at the bottom dead center.
凍結部２０は、生体試料を凍結固定し得るように構成されている。本実施形態の場合、凍結部２０は、上部に開口２５を有する凍結槽２３と、前記開口２５を開閉可能とする蓋部２４とを備える。 The freezing unit 20 is configured to be able to freeze and fix a biological sample. In the case of the present embodiment, the freezing unit 20 includes a freezing tank 23 having an opening 25 in the upper portion and a lid 24 that can open and close the opening 25.
凍結槽２３は、保冷材（図示しない）が内部に充填されており、当該凍結槽２３内に冷媒２６が収容されている。この凍結槽２３は、前記ピンセット２２に保持された生体試料の下方に配置され、前記ピンセット２２が自由落下して下死点に到達した時点において、ピンセット２２の先端に挟持されたグリッド２１が冷媒２６に浸漬し得るように構成されている。 The freezing tank 23 is filled with a cold insulating material (not shown), and the refrigerant 26 is accommodated in the freezing tank 23. This freezing tank 23 is arranged below the biological sample held by the tweezers 22, and when the tweezers 22 freely falls and reaches the bottom dead center, the grid 21 held at the tip of the tweezers 22 is a refrigerant. 26 so that it can be dipped in H.26.
保冷材は、特に限定されるものではないが、本実施形態の場合、液体窒素が用いられる。また、冷媒２６は、種々のものが選択できるが、例えば、液化プロパンやエタンなどを用いることができる。このように構成された凍結槽２３は、保冷材により、冷媒２６を低温に保持し得るようになされている。 The cold insulating material is not particularly limited, but in the case of this embodiment, liquid nitrogen is used. Various refrigerants can be selected as the refrigerant 26. For example, liquefied propane or ethane can be used. The freezing tank 23 configured as described above can keep the refrigerant 26 at a low temperature by a cold insulating material.
蓋部２４は、開口２５に対しスライド移動することにより、開口２５を開閉可能とし得るように設けられている。この蓋部２４は、前記電磁アクチュエータの作動に連動して、落下機構１９がピンセット２２を落下させるタイミングに先立って、開口２５を開放し得るように構成されている。 The lid portion 24 is provided so that the opening 25 can be opened and closed by sliding relative to the opening 25. The lid 24 is configured to open the opening 25 prior to the timing when the drop mechanism 19 drops the tweezers 22 in conjunction with the operation of the electromagnetic actuator.
（２）作用および構成
次に、上記のように構成された固定装置１の作用および効果について説明する。なお、保持部１８は、先端にグリッド２１を挟持したピンセット２２を、上死点で保持している。ここで、ピンセット２２は、グリッド２１上に載置された生体試料を対物レンズ１３の焦点位置に配置した状態で保持されている。
(2) Operation and Configuration Next, the operation and effect of the fixing device 1 configured as described above will be described. In addition, the holding part 18 is holding | maintaining the tweezers 22 which clamped the grid 21 at the front-end | tip at a top dead center. Here, the tweezers 22 are held in a state in which the biological sample placed on the grid 21 is disposed at the focal position of the objective lens 13.
水平型光学顕微鏡２の各部の作用から説明する。光源７から出射された照明光は、レンズ８により開口絞り９の位置に光源像を結ぶ。この光源像を２次光源として、照明光は、視野絞り１０および視野レンズ１１を経て、前記ハーフミラー１２に入射する。これにより、ハーフミラー１２は、入射した照明光の一部を９０度曲げる。 The operation of each part of the horizontal optical microscope 2 will be described. The illumination light emitted from the light source 7 forms a light source image at the position of the aperture stop 9 by the lens 8. With this light source image as a secondary light source, the illumination light enters the half mirror 12 through the field stop 10 and the field lens 11. Thereby, the half mirror 12 bends a part of the incident illumination light by 90 degrees.
ハーフミラー１２によって９０度曲げられた照明光は、光軸Ｌ上を伝播し、対物レンズ１３の瞳位置に光源像を結ぶ。この光源像を３次光源として、対物レンズ１３がコンデンサとして機能し、照明光が光軸Ｌと平行とみなせるテレセントリックな照明が標本面に行われる。 The illumination light bent 90 degrees by the half mirror 12 propagates on the optical axis L and forms a light source image at the pupil position of the objective lens 13. Using this light source image as a tertiary light source, the objective lens 13 functions as a condenser, and telecentric illumination in which the illumination light is regarded as parallel to the optical axis L is performed on the sample surface.
標本面は、照明されたことによって反射光を反射する。当該反射光は、対物レンズ１３で屈折されてハーフミラー１２に入射する。ハーフミラー１２に入射した反射光の一部はハーフミラー１２を透過してフィールドレンズ１４に入射する。このフィールドレンズ１４は、当該反射光により、標本面の像を撮像部６の受光面に結像する。撮像部６は、図示しない表示部に撮像した標本面の画像を表示する。 The sample surface reflects the reflected light when illuminated. The reflected light is refracted by the objective lens 13 and enters the half mirror 12. Part of the reflected light incident on the half mirror 12 passes through the half mirror 12 and enters the field lens 14. The field lens 14 forms an image of the sample surface on the light receiving surface of the imaging unit 6 by the reflected light. The imaging unit 6 displays the captured sample surface image on a display unit (not shown).
これにより、観察者は、表示部において標本面の様子を観察することができる。この場合の生体試料と凍結部２０との位置関係を図2(A)に示す。観察者は、生体試料の活動状態を表示部で観察しながら、任意の時点で生体試料を固定するため図示しないスイッチを投入する。 Thus, the observer can observe the state of the sample surface on the display unit. FIG. 2A shows the positional relationship between the biological sample and the frozen part 20 in this case. While observing the activity state of the biological sample on the display unit, the observer turns on a switch (not shown) to fix the biological sample at an arbitrary time.
そうすると、蓋部２４はスライド移動して開口２５を開放する図2(B)。次いで、落下機構１９は、電磁アクチュエータを作動してプランジャーを退行方向に移動させる。これにより、ピンセット２２の貫通穴とプランジャーとの係合が解除されることにより、ピンセット２２は自重によって自由落下する。 Then, the lid part 24 slides to open the opening 25 (B). Next, the dropping mechanism 19 operates the electromagnetic actuator to move the plunger in the retracting direction. Thereby, when the engagement between the through hole of the tweezers 22 and the plunger is released, the tweezers 22 freely falls by its own weight.
ピンセット２２が下死点に到達する前に、ピンセット２２の先端に挟持されたグリッド２１が冷媒２６に浸漬される図2(C)。同時に、グリッド２１上に載置された生体試料も冷媒２６に浸漬し、当該生体試料は凍結固定される。なお、実際には、落下させる前にろ紙やマイクロピペットなどにより生体試料の水分を除去する。 Before the tweezers 22 reaches the bottom dead center, the grid 21 sandwiched between the tips of the tweezers 22 is immersed in the refrigerant 26 (C). At the same time, the biological sample placed on the grid 21 is also immersed in the refrigerant 26, and the biological sample is frozen and fixed. In practice, the moisture of the biological sample is removed with a filter paper or a micropipette before dropping.
このようにして、凍結固定された生体試料は、目的に応じたさまざまな後処理を経た後に、図示しない電子顕微鏡により高分解能で観察され得る。図3は、本実施形態に係る固定装置１により観察した固定前の標本面を撮影した画像（同図(A)）と、固定後、電子顕微鏡で同じ標本面を撮影した画像（同図(B)）である。これらの画像は、当装置を用いることにより、任意の時点で確実に生体試料を固定できると共に、当該生体試料を固定して得られた固定生体試料を電子顕微鏡により高分解能で観察できることを示している。 In this way, the frozen and fixed biological sample can be observed with high resolution by an electron microscope (not shown) after various post-treatments depending on the purpose. FIG. 3 shows an image obtained by photographing the specimen surface before fixation observed by the fixing device 1 according to the present embodiment (FIG. 3A), and an image obtained by photographing the same specimen surface with an electron microscope after fixation (FIG. B)). These images show that by using this device, a biological sample can be reliably fixed at an arbitrary time, and a fixed biological sample obtained by fixing the biological sample can be observed with an electron microscope at high resolution. Yes.
固定装置１では、観察者が、時間と共に変化する生体試料の活動状態を観察しながら、生体試料を固定することができる構成とした。これにより、固定装置１は、生体試料を任意の時点で固定することができる。したがって、固定装置１は、生体試料を時系列で観察して、電子顕微鏡で観察し得る状態の固定生体試料を作製することができる。 The fixing device 1 is configured such that the observer can fix the biological sample while observing the activity state of the biological sample that changes with time. Thereby, the fixing device 1 can fix the biological sample at an arbitrary time. Therefore, the fixing device 1 can produce a fixed biological sample that can be observed with an electron microscope by observing the biological sample in time series.
また、固定装置１は、落射照明光学系４により同軸落射照明を行い得るように構成したことにより、生体試料を挟んで対物レンズ１３に対向する側の構成を省略してスペースを確保することができる。したがって、固定装置１は、透過型の照明を行う場合に比べ、生体試料を挟んで対物レンズ１３に対向する側に配置される凍結部２０の構成を選択する自由度が向上する。 In addition, the fixing device 1 is configured so that the epi-illumination optical system 4 can perform coaxial epi-illumination, so that the configuration on the side facing the objective lens 13 with the biological sample interposed therebetween can be omitted to secure a space. it can. Therefore, the fixing device 1 has a higher degree of freedom in selecting the configuration of the freezing unit 20 disposed on the side facing the objective lens 13 with the biological sample interposed therebetween, as compared with the case where transmissive illumination is performed.
また、固定装置１は、凍結槽２３に収容した冷媒２６内に生体試料を浸漬して、当該生体試料を凍結固定する構成としたことにより、簡単な構成でかつ、より確実に生体試料を固定することができる。 Moreover, the fixing device 1 has a simple configuration and more reliably fixes the biological sample by immersing the biological sample in the refrigerant 26 accommodated in the freezing tank 23 to freeze and fix the biological sample. can do.
因みに、冷媒２６からの冷気で対物レンズ部分が冷却されると、レンズのみならず生体試料も予冷却されて生体試料に悪影響を及ぼし、生理的条件における当該生体試料を観察することが困難になる。本実施形態の場合、凍結槽２３の開口２５は、生体試料を固定する場合を除いて、開閉可能な蓋部２４で閉塞されていることにより、空気中の水分が冷媒２６に入り込むのを抑制することができる。また、生体試料Ｓや対物レンズ１３が冷気によって冷却されることを防ぐため、蓋部２４の上方に図示しない障壁（シュラウド）を設けることとしてもよい。 Incidentally, when the objective lens portion is cooled by the cold air from the refrigerant 26, not only the lens but also the biological sample is precooled, adversely affecting the biological sample, and it becomes difficult to observe the biological sample under physiological conditions. . In the case of the present embodiment, the opening 25 of the freezing tank 23 is blocked by an openable / closable lid portion 24 except when the biological sample is fixed, thereby preventing moisture in the air from entering the refrigerant 26. can do. Further, in order to prevent the biological sample S and the objective lens 13 from being cooled by cold air, a barrier (shroud) (not shown) may be provided above the lid portion 24.
２．第２実施形態
（１）液浸対物レンズ
本実施形態に係る固定装置１は、対物レンズ１３に代えて、液浸対物レンズ３０を用いる点が上記第１実施形態と異なる。本実施形態の場合、図4(A)に示すように、液浸対物レンズ３０は、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間が、空気（屈折率：1.000、０℃）よりも屈折率の高い浸液３１で満たされている。これにより、固定装置１（本図には図示しない）は、開口数を大きくして、分解能を小さくすることができる。この場合、対物レンズ２９は、水浸、もしくは油浸対応の対物レンズである。
2. Second Embodiment (1) Immersion Objective Lens The fixing device 1 according to this embodiment is different from the first embodiment in that an immersion objective lens 30 is used instead of the objective lens 13. In the case of this embodiment, as shown in FIG. 4A, the immersion objective lens 30 has a refractive index between the objective lens 29 and the biological sample S that is higher than that of air (refractive index: 1.000, 0 ° C.). Filled with high immersion liquid 31. Thereby, the fixing device 1 (not shown in the drawing) can increase the numerical aperture and reduce the resolution. In this case, the objective lens 29 is an objective lens compatible with water immersion or oil immersion.
ここで、分解能は、レイリーの分解能の式より、開口数をN.A.、波長をλとすると、式（分解能＝0.61・λ／N.A.）で表すことができる。そうすると、開口数が大きいほど、分解能を小さくする（高分解能）ことができる。 Here, the resolution can be expressed by the equation (resolution = 0.61 · λ / N.A.) From the Rayleigh resolution equation where the numerical aperture is N.A. and the wavelength is λ. Then, the larger the numerical aperture, the smaller the resolution (high resolution).
また、開口数（N.A.）は、標本面と液浸対物レンズ３０間の媒質の屈折率をｎ、光軸Ｌと対物レンズ２９の最も外側に入る光線とがなす角度をθとすると、式（N.A.＝ｎ・ｓｉｎθ）で表される。したがって、理想的な状態では、媒質の屈折率が高いほど、分解能を上げる（高分解能）ことができる。 The numerical aperture (NA) is expressed by the equation (n) where n is the refractive index of the medium between the sample surface and the immersion objective lens 30, and θ is the angle between the optical axis L and the light beam entering the outermost side of the objective lens 29. NA = n · sin θ). Therefore, in an ideal state, the higher the medium refractive index, the higher the resolution (high resolution).
浸液３１としては、例えば、水（屈折率：1.333、２０℃）やオイル（屈折率：1.515、２３℃）を用いることができる。 As the immersion liquid 31, for example, water (refractive index: 1.333, 20 ° C.) or oil (refractive index: 1.515, 23 ° C.) can be used.
また、固定装置１は、図4(B)に示すように、グリッド２１の裏面２１ａに生体試料Ｓを載置し、グリッド２１の表面２１ｂ側から生体試料Ｓを観察することとしてもよい。この場合、固定装置１は、グリッド２１と対物レンズ２９との間、および、生体試料Ｓを載置したグリッド２１の裏面２１ａの両方が浸液３１で満たされることが望ましい。 Further, as shown in FIG. 4B, the fixing device 1 may place the biological sample S on the back surface 21 a of the grid 21 and observe the biological sample S from the front surface 21 b side of the grid 21. In this case, in the fixing device 1, it is desirable that both the grid 21 and the objective lens 29 and the back surface 21 a of the grid 21 on which the biological sample S is placed are filled with the immersion liquid 31.
本実施形態では、液浸対物レンズ３０を用いることにより、生体試料の状態をより詳細に観察しながら、任意の時点で生体試料を固定することができるので、より所望の状態に近い固定生体試料を得ることができる。 In the present embodiment, by using the immersion objective lens 30, it is possible to fix the biological sample at an arbitrary time while observing the state of the biological sample in more detail, so that the fixed biological sample closer to a desired state is obtained. Can be obtained.
（２）液溜り部
上記のように、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を浸液３１で満たす場合、図5(A)に示す液溜り部３５を水平型光学顕微鏡２に設けてもよい。液溜り部３５は、上部が開口してなる箱状の容器で構成され、一端の側壁３６には、切欠き３７が形成されている。当該切欠き３７は、グリッド２１の外形形状と同様に底辺が湾曲したＵ字状に形成されている。
(2) Liquid Reserving Portion As described above, when the space between the objective lens 29 and the biological sample S is filled with the immersion liquid 31, the liquid reserving portion 35 shown in FIG. Good. The liquid reservoir 35 is configured by a box-like container having an upper opening, and a notch 37 is formed in the side wall 36 at one end. The notch 37 is formed in a U shape with a curved base, similar to the outer shape of the grid 21.
この液溜り部３５は、一端の側壁３６が対物レンズ２９の先端２９ａに対向するように対物レンズ２９の下側に配置される（図5(B)）。そして、一端の側壁３６に形成された切欠き３７を閉塞するように上方からグリッド２１が切欠き３７に挿入される（図5(C)）。この状態で、液溜り部３５には、浸液３１が充填される。なお、ピンセット２２は、保持部１８（本図には図示しない）によって保持されている。 The liquid reservoir 35 is disposed below the objective lens 29 so that the side wall 36 at one end faces the tip 29a of the objective lens 29 (FIG. 5B). Then, the grid 21 is inserted into the notch 37 from above so as to close the notch 37 formed in the side wall 36 at one end (FIG. 5C). In this state, the liquid reservoir 35 is filled with the immersion liquid 31. The tweezers 22 are held by a holding portion 18 (not shown in the figure).
このようにして、液溜り部３５は、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を確実に浸液３１で満たすことができる。固定装置１は、液溜り部３５を備えることにより、作動距離が大きく浸液３１の表面張力だけでは対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を浸液３１で満たすことが困難な場合でも、より確実に対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を浸液３１で満たすことができる。ここで、作動距離とは、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの距離をいう。 In this way, the liquid reservoir 35 can reliably fill the space between the objective lens 29 and the biological sample S with the immersion liquid 31. Even if it is difficult to fill the space between the objective lens 29 and the biological sample S with the immersion liquid 31 only by the surface tension of the immersion liquid 31, the fixing device 1 is provided with the liquid reservoir 35. The space between the objective lens 29 and the biological sample S can be reliably filled with the immersion liquid 31. Here, the working distance refers to the distance between the objective lens 29 and the biological sample S.
この場合、落下機構１９（本図には図示しない）は、ピンセット２２を落下させる前に、グリッド２１とピンセット２２、および液溜り部３５が干渉しないように、例えば水平型光学顕微鏡２を生体試料Ｓから離れる方向、すなわち後方へスライド移動させる。なお、本実施形態の場合、蓋部２４の上部に、水平型光学顕微鏡２との一体構成として下からの冷気の浸入を防止する障壁（シュラウド）を設け、当該障壁（シュラウド）を光学顕微鏡２と一体的にスライド移動させることとしてもよい。
これにより、落下機構１９は、ピンセット２２を確実に落下させ、グリッド２１を冷媒２６（本図には図示しない）に浸漬させることができる。したがって、固定装置１は、液溜り部３５を備えた場合でも、より確実に任意の時点でグリッド２１を凍結槽２３に浸漬させて生体試料Ｓを凍結固定することができる。
In this case, the dropping mechanism 19 (not shown in the drawing) uses, for example, the horizontal optical microscope 2 to prevent the grid 21, the tweezers 22, and the liquid reservoir 35 from interfering with each other before dropping the tweezers 22. Slide away from S, that is, backward. In the case of the present embodiment, a barrier (shroud) that prevents cold air from entering from the bottom is provided as an integral configuration with the horizontal optical microscope 2 at the top of the lid 24, and the barrier (shroud) is provided as the optical microscope 2. It is good also as making a slide movement integrally.
Thereby, the dropping mechanism 19 can reliably drop the tweezers 22 and immerse the grid 21 in the refrigerant 26 (not shown in the figure). Therefore, even when the fixing device 1 includes the liquid reservoir 35, the biological sample S can be frozen and fixed by immersing the grid 21 in the freezing tank 23 more reliably at an arbitrary time.
（３）カバーガラス
固定装置１は、グリッド２１に代えて、図6に示すように、一側表面に生体試料Ｓを載置する箇所（以下、「載置部」という）４１を除いて疎水性膜４０が形成されたカバーガラス４２を用いることもできる。
(3) Cover Glass The fixing device 1 is hydrophobic except for the place (hereinafter referred to as “mounting portion”) 41 where the biological sample S is placed on one surface as shown in FIG. A cover glass 42 on which the conductive film 40 is formed can also be used.
この載置部４１には、生体試料Ｓが載置され、浸液３１がカバーガラス４２の一側表面に添加される。そうすると、カバーガラス４２の一側表面には、表面張力によって載置部４１のみに浸液３１による液溜りが形成される。この液溜りに対物レンズ２９（本図には図示しない）を当接することにより、固定装置１（本図には図示しない）は、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を浸液３１で満たした状態で標本面を観察することができる。これにより、固定装置１は、浸液３１の表面張力で水滴を保持することで、上記液溜り部３５を用いずに、鉛直方向に保持された生体試料Ｓを浸液３１中に保持することができる。 The biological sample S is placed on the placement portion 41, and the immersion liquid 31 is added to one surface of the cover glass. Then, a liquid pool by the immersion liquid 31 is formed only on the placement portion 41 due to surface tension on the one side surface of the cover glass 42. By bringing the objective lens 29 (not shown in the figure) into contact with the liquid reservoir, the fixing device 1 (not shown in the figure) fills the space between the objective lens 29 and the biological sample S with the immersion liquid 31. The specimen surface can be observed in the state where Thereby, the fixing device 1 holds the biological sample S held in the vertical direction in the immersion liquid 31 without using the liquid reservoir 35 by holding water droplets with the surface tension of the immersion liquid 31. Can do.
このように、載置部４１を除いて疎水性膜４０を形成したカバーガラス４２を用いることにより、より容易に生体試料Ｓを浸液３１で覆うことができる。また、一つのカバーガラス４２に複数の載置部４１を形成してもよい。この場合、それぞれの載置部４１に生体試料Ｓを載置することにより、複数の生体試料Ｓの中から最適な生体試料Ｓを選択し、当該生体試料Ｓを任意の時点で固定することができる。 Thus, the biological sample S can be more easily covered with the immersion liquid 31 by using the cover glass 42 on which the hydrophobic film 40 is formed except for the placement portion 41. A plurality of placement portions 41 may be formed on one cover glass 42. In this case, it is possible to select an optimal biological sample S from a plurality of biological samples S by mounting the biological sample S on each mounting portion 41 and fix the biological sample S at an arbitrary time point. it can.
３．変形例
本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲内で適宜変更することができる。例えば、上記実施形態の場合、凍結部２０は、凍結により生体試料を固定する場合について説明したが、本発明はこれに限らず、グルタールアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどの化学固定剤を生体試料に添加して化学固定してもよい。
3. Modifications The present invention is not limited to the above-described embodiment, and can be appropriately changed within the scope of the gist of the present invention. For example, in the above-described embodiment, the case where the freezing unit 20 fixes the biological sample by freezing has been described. However, the present invention is not limited thereto, and a chemical fixing agent such as glutaraldehyde or paraformaldehyde is added to the biological sample. And may be chemically fixed.
この場合、図7に示すように、生体試料Ｓは、カバーガラス４５の裏面４５ａに生体試料Ｓを載置して、カバーガラス４５の表面４５ｂ側から対物レンズ１３で観察される。固定装置１（本図には図示しない）は、任意の時点で、カバーガラス４５の裏面４５ａ側から生体試料Ｓに対し、図示しない添加手段により化学固定剤（本図中、矢印）を添加して化学架橋により固定する。この場合、カバーガラス４５は、生体試料Ｓと対物レンズ１３との間に配置されるので、化学固定剤が対物レンズ１３へ飛散することを防止する。したがって、固定装置１は、化学固定剤が付着することによる対物レンズ１３の損傷を防ぐことができる。 In this case, as shown in FIG. 7, the biological sample S is observed with the objective lens 13 from the front surface 45 b side of the cover glass 45 by placing the biological sample S on the back surface 45 a of the cover glass 45. The fixing device 1 (not shown in the figure) adds a chemical fixing agent (arrow in the figure) to the biological sample S from the back surface 45a side of the cover glass 45 by an adding means not shown at any time. Fix by chemical crosslinking. In this case, since the cover glass 45 is disposed between the biological sample S and the objective lens 13, the chemical fixing agent is prevented from scattering to the objective lens 13. Therefore, the fixing device 1 can prevent damage to the objective lens 13 due to adhesion of the chemical fixing agent.
上記実施形態の場合、落射照明光学系４において同軸落射照明により観察する場合（落射明視野観察）について説明したが、本発明はこれに限らず、落射暗視野観察、落射微分干渉観察、落射蛍光観察、または落射偏光観察を行うこととしてもよい。 In the case of the above embodiment, the case of observing with coaxial epi-illumination in the epi-illumination optical system 4 (epi-illumination bright field observation) has been described, but the present invention is not limited to this, and epi-illumination dark field observation, epi-illumination differential interference observation, epi-illumination fluorescence Observation or epi-polarization observation may be performed.
落射暗視野観察は、生体試料に対し、対物レンズ１３の外縁側から、リング状の照明光が観察光学系５に直接入らないように斜めから照明し、散乱光、回折光を観察する。これにより、落射暗視野観察は、落射明視野観察に比べ、標本面の小さな凹凸を目立たせて観察することができる。 In the incident dark field observation, a biological sample is illuminated obliquely from the outer edge side of the objective lens 13 so that ring-shaped illumination light does not enter the observation optical system 5 directly, and scattered light and diffracted light are observed. Thereby, the epi-illumination dark field observation can be observed with conspicuous small irregularities on the sample surface compared to the epi-illumination bright field observation.
落射微分干渉観察には、対物レンズ１３の上方にノマルスキープリズムを配置し、照明光を横方向にずらした２つの光線に分離して、生体試料を照明し観察する。これにより、落射微分干渉観察は、微少な段差を立体的に観察することができる。
落射蛍光観察は、励起光で生体試料としての蛍光物質を照明し、当該蛍光物質から放出される蛍光を観察する。蛍光物質とは、励起光を吸収し、当該励起光により励起された状態からもとの基底状態に戻るときに蛍光としてエネルギーを放出する特性を有する物質をいう。この場合、固定装置１は、落射照明光学系４に励起フィルタが設置されていると共に、観察光学系５に吸収フィルタが設置されている。励起フィルタは、光源７としての例えば水銀ランプから蛍光物質を励起させるのに必要な波長の光を抽出し、当該光のみを対物レンズ１３へ入射させる。吸収フィルタは、蛍光物質から発せられた蛍光とその他の光を分離して、蛍光のみをフィールドレンズ１４へ入射させる。これにより、固定装置１は、蛍光部分だけを撮像することができる。
In the epi-illumination differential interference observation, a Nomarski prism is disposed above the objective lens 13, the illumination light is separated into two light beams shifted in the horizontal direction, and the biological sample is illuminated and observed. Thereby, epi-illumination differential interference observation can observe a minute level | step difference in three dimensions.
In the epifluorescence observation, a fluorescent material as a biological sample is illuminated with excitation light, and fluorescence emitted from the fluorescent material is observed. A fluorescent substance refers to a substance that absorbs excitation light and emits energy as fluorescence when returning to the original ground state from the state excited by the excitation light. In this case, in the fixing device 1, an excitation filter is installed in the epi-illumination optical system 4 and an absorption filter is installed in the observation optical system 5. The excitation filter extracts light having a wavelength necessary for exciting the fluorescent substance from, for example, a mercury lamp as the light source 7 and causes only the light to enter the objective lens 13. The absorption filter separates the fluorescence emitted from the fluorescent material and other light and causes only the fluorescence to enter the field lens 14. Thereby, the fixing device 1 can image only the fluorescent part.
落射偏光観察は、落射照明光学系４と観察光学系５の二箇所に配置された２個の偏光板を、互いに直交方向となるように配置する。これにより、固定装置１は、生体試料の偏光特性を可視化し、観察し得る。 In the epi-polarization observation, two polarizing plates arranged at two places of the epi-illumination optical system 4 and the observation optical system 5 are arranged so as to be orthogonal to each other. Thereby, the fixing device 1 can visualize and observe the polarization characteristic of the biological sample.
また、上記実施形態の場合、落下機構１９は、ピンセット２２の自重によりピンセット２２を自由落下させて生体試料を凍結液２６に浸漬させる場合について説明したが、本発明はこれに限らず、ピンセット２２を鉛直下方へ付勢する付勢手段を設け、強制的に落下させることとしてもよい。これにより、落下機構１９は、電磁アクチュエータによりプランジャーとピンセット２２の貫通穴との係合を解除すると、前記付勢手段がピンセット２２を鉛直下方へ押し下げることにより、より確実にピンセット２２を下死点に到達させることができる。 In the case of the above embodiment, the dropping mechanism 19 has been described with respect to the case where the tweezers 22 freely drops by the weight of the tweezers 22 and the biological sample is immersed in the frozen liquid 26. However, the present invention is not limited thereto, and the tweezers 22 It is good also as providing the urging means which urges | biases vertically below and forcibly dropping. As a result, when the drop mechanism 19 releases the engagement between the plunger and the through hole of the tweezers 22 by the electromagnetic actuator, the urging means pushes the tweezers 22 downward vertically, thereby more reliably dying the tweezers 22 downward. A point can be reached.
また、上記実施形態の場合、落下機構１９は、単一のスイッチ（図示しない）により、蓋部２４をスライド移動させると共に、電磁アクチュエータを作動することとしたが、本発明はこれに限らず、蓋部２４をスライド移動させるスイッチと、電磁アクチュエータを作動させるスイッチとを個別に設け、電磁アクチュエータを作動させるタイミングに先立って蓋部２４をスライド移動させることとしてもよい。 Moreover, in the case of the said embodiment, although the dropping mechanism 19 decided to operate the electromagnetic actuator while sliding the cover part 24 with a single switch (not shown), this invention is not limited to this, A switch for sliding the lid portion 24 and a switch for operating the electromagnetic actuator may be provided separately, and the lid portion 24 may be slid and moved prior to the timing of operating the electromagnetic actuator.
１ 固定装置（顕微鏡用生体試料固定装置）
２ 光学顕微鏡
３ 試料固定部
１３ 対物レンズ
１８ 保持部
１９ 落下機構
２０ 凍結部
２３ 凍結槽
２６ 冷媒
２９ 対物レンズ
３０ 液浸対物レンズ
３１ 浸液
３５ 液溜り部
４０ 疎水性膜
４１ 載置部
４２ カバーガラス
４５ カバーガラス
Ｌ 光軸
Ｓ 生体試料
1 Fixing device (biological sample fixing device for microscope)
2 Optical microscope 3 Sample fixing part 13 Objective lens 18 Holding part 19 Dropping mechanism 20 Freezing part 23 Freezing tank 26 Freezing tank 26 Refrigerant 29 Objective lens 30 Immersion objective lens 31 Immersion liquid 35 Liquid reservoir part 40 Hydrophobic film 41 Placement part 42 Cover glass 45 Cover glass L Optical axis S Biological sample
Claims (7)
前記生体試料から反射される反射光を、略水平方向を光軸とする対物レンズを介して受光して、前記生体試料の像を拡大する観察光学系と
を有する水平型光学顕微鏡と、
前記生体試料を前記対物レンズの焦点位置で略鉛直方向に立てて保持すると共に、任意の時点で前記生体試料を固定する試料固定部と
を備えることを特徴とする顕微鏡用細胞試料固定装置。 An illumination optical system that illuminates from a substantially horizontal direction as a subject of observation over time for a specific phenomenon that occurs in a biological sample,
A horizontal optical microscope having an observation optical system that receives reflected light reflected from the biological sample via an objective lens having an optical axis in a substantially horizontal direction, and expands an image of the biological sample;
A cell sample fixing device for a microscope, comprising: a sample fixing unit that holds the biological sample upright in a substantially vertical direction at a focal position of the objective lens and fixes the biological sample at an arbitrary time.
前記カバーガラスは、前記試料を載置する載置部を除いて一側表面に疎水性膜が形成され、
表面張力によって前記載置部に形成された浸液による液溜り内に、前記生体試料を保持する
ことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡用細胞試料固定装置。 The sample fixing part is mounted on the one side surface of the cover glass to hold the biological sample in a substantially vertical direction,
The cover glass is formed with a hydrophobic film on one side surface except for a placement portion on which the sample is placed,
4. The cell sample fixing device for a microscope according to claim 3, wherein the biological sample is held in a liquid pool formed by an immersion liquid formed in the mounting portion by surface tension.
前記生体試料を保持する保持部と、
前記生体試料を凍結固定するための冷媒を収容した凍結槽と
を備え、
前記凍結槽は、前記保持部に保持された前記生体試料の下方に配置され、
前記保持部から前記生体試料を任意の時点で落下させ、前記冷媒に前記生体試料を浸漬させる落下機構を設けた
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡用細胞試料固定装置。 The sample fixing part is
A holding unit for holding the biological sample;
A freezing tank containing a refrigerant for freeze-fixing the biological sample,
The freezing tank is disposed below the biological sample held in the holding unit,
The microscope cell according to any one of claims 1 to 5, further comprising a dropping mechanism that drops the biological sample from the holding unit at an arbitrary time point and immerses the biological sample in the refrigerant. Sample fixing device.
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